DE10008619A1

DE10008619A1 - Mikroorganismenfreies IgG-Präparat, Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung in der Tieraufzucht und in der Tiermast

Info

Publication number: DE10008619A1
Application number: DE10008619A
Authority: DE
Inventors: Ole Theilvig; Otto Klug
Original assignee: KLUG OTTO J; IMMUNO VET AS LYNGE
Current assignee: KLUG OTTO J; IMMUNO VET AS LYNGE
Priority date: 2000-02-24
Filing date: 2000-02-24
Publication date: 2001-09-06

Abstract

Es wird ein mikroorganismenfreies IgG-Präparat zur Verwendung in der Tieraufzucht und in der Tiermast beschrieben. Das aus Tierblut gewonnene Präparat kann in oraler oder parenteraler Darreichungsform vorliegen.

Description

In der Massentierhaltung, z. B. von Schweinen, Rindern und Geflügel, ist derzeit die Verwendung von antibiotischen Zusatzstoffen, die auch als Leistungsförderer bezeichnet wer den, übliche Praxis. Durch den prophylaktischen Einsatz von Antibiotika soll das Auftreten von bakteriellen Infektionen zurückgedrängt werden. Dadurch soll die Mortalität der Tiere verringert und allgemein eine schnellere Gewichtszunahme der Tiere erreicht werden.

Ein generelles Problem beim Einsatz von Antibiotika be steht aber im Auftreten von Resistenzen. Resistente Mikroor ganismen gelangen über Fleisch, Abwässer, Gemüse und dergl. in die menschliche Nahrung, mit der Folge, daß durch diese resistenten Mikroorganismen verursachte Infektionen beim Men schen nur mehr schwer mit den verfügbaren Antibiotika be kämpft werden können.

Eine logische Folge davon ist, daß bereits die Verwen dung einiger Antibiotika in der Tiermast gesetzlich verboten ist und starke Tendenzen zu einem allgemeinen Verbot von An tibiotika in der Tiermast bestehen.

Andererseits ist es aber allgemein anerkannt, daß in der Massentierhaltung trotz aller möglichen hygienischen Vor sichtsmaßnahmen das Auftreten von Infektionen, insbesondere von infektiösen Durchfallerkrankungen, nicht immer verhindert werden kann und somit der Wunsch nach prophylaktischen Maß nahmen gegen derartige Infektionen bestehen bleibt.

J. D. Quigley et al., J. Dairy Sci., Bd. 79 (1996), S. 2032-2037, haben den Einfluß von gereinigten Ig-Präparaten auf das Gedeihen von Kälbern untersucht. Dabei wurden aus Rinderblut durch Säulenchromatographie und Fällung mit Ammo niumsulfat IgG-Präparate gewonnen und in Form einer Lösung (mit einem Gehalt an etwa 10% IgG) subkutan oder intravenös an Kälber verabreicht. Durch diese Verabreichung stiegen die IgG-Konzentrationen im Serum der Kälber zwar an, es konnten aber keine günstigen Einflüsse in bezug auf Morbidität und Mortalität der Tiere festgestellt werden.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Mittel bereitzustel len, mit dem in der Tieraufzucht und -mast das Auftreten von bakteriell und viral bedingten Infektionen möglichst weitge hend vermieden werden kann, ohne daß dabei Antibiotika ein gesetzt werden und die Gefahr der Ausbreitung von resistenten Mikroorganismen in Kauf genommen wird. Mit dem Mittel sollen eine deutliche Besserung in bezug auf Mortalität und Morbidi tät der Tiere sowie eine raschere Körpergewichtszunahme er zielbar sein.

Die Erfinder haben aufgrund umfangreicher Untersuchungen festgestellt, daß es in der Massentierhaltung möglich ist, gezielt homologe Antikörper, die frei von Mikroorganismen sind, einzusetzen und damit eine immunisierende prophylakti sche Wirkung zu erzielen. Dadurch können Verluste durch In fektionen auf ein Minimum beschränkt werden, wobei sich eine beschleunigte Körpergewichtszunahme ergibt.

Dieser Befund ist insofern überraschend, als der vorge nannte Artikel von J. D. Quigley et al. ausdrücklich zu dem Ergebnis kommt, daß mit IgG-Präparaten die Morbiditäts- und Mortalitätswerte nicht beeinflußt werden. Der Grund hierfür ist nicht klar ersichtlich. Möglicherweise waren die gewonne nen Präparate zu unspezifisch für bestimmte, bei Kälbern auf tretende Erkrankungen, insbesondere Durchfallerkrankungen. Ein weiterer Grund für das Versagen der Präparate könnte darin bestehen, daß nicht auf die Bereitstellung eines virus- und bakterienfreien Produkts geachtet wurde, so daß eine ei nerseits erzielte Immunisierungswirkung auf der anderen Seite durch in den Präparaten enthaltene bakterielle oder virale Erreger zunichte gemacht wurden.

Erfindungsgemäß wurde nunmehr festgestellt, daß es bei einem derartigen, in der Massentierhaltung einzusetzenden IgG-Präparat insbesondere darauf ankommt, daß keine Mikroor ganismen, insbesondere keine Bakterien und Viren, darin ent halten sind.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein mikroorganismen freies IgG-Präparat als Futtermittelzusatz zur prophylakti schen oralen Anwendung in der Aufzucht von Schweinen, Kälbern und anderen Nutztieren.

Gegenstand der Erfindung sind auch mikroorganismenfreie IgG-Präparationen, die aus Blut bzw. Plasma von spezifisch immunisierten Sauen oder Kühen hergestellt und anschließend hochgereinigt sind, die parenteral zur Prophylaxe und zur Therapie bakterieller und viraler Aufzuchtkrankheiten einge setzt werden.

Gegenstand der Erfindung sind ferner die entsprechenden Herstellverfahren derartiger Präparate. Das Basisverfahren umfaßt folgende Stufen:

a) Zentrifugieren von Tierblut zur Gewinnung von Plasma,
b) Ausfällen einer Roh-IgG-Fraktion durch Zusatz von Ethylalkohol bei -3°C bis 5°C bis zu 25 Vol.-%,
c) Gewinnen der rohen IgG-Fraktion durch Zentrifugieren unter Bildung eines Präzipitats, das tiefgefroren gelagert und transportiert werden kann,
d) Lösen des gemäß Stufe (c) erhaltenen Roh-IgG in Was ser und und Einstellen eines pH-Werts von 5,0 bis 5,8 bei -3°C, Zugeben von Alkohol bis zu 12 bis 16 Vol.-%, Abtrennen der α- und β-Globuline, Einstellen des Überstands bei -5°C auf einen pH-Wert von 7 bis 7,5 und Zugeben von Alkohol bis 25 Vol.-% zur Ausfällung der Gammaglobuline (IgG) und
e) Zugeben von Stabilisierungsmittel zur IgG-Lösung, Sterilfiltrieren und Hitzeinaktivieren sowie Entfernen des Alkohols durch geeignete, schonende Verfahren

Zur Herstellung eines Präparats für die orale Verabrei chung wird das nach (d) hergestellte Präparat schonend ge trocknet und in sterile Behältnisse zur oralen Anwendung ab gefüllt

Zur Herstellung eines Präparats für die parenterale Ver abreichung wird das nach (d) hergestellte Präparat erneut in destilliertem Wasser gelöst und über eine affinitätschromato graphische Methode hochgereinigt. Das gereinigte IgG wird z. B. in physiologischer NaCl-Lösung gelöst, mit einem geeigneten Konservierungsmittel versetzt, steril filtriert und steril abgefüllt.

Ein entsprechendes IgG-Präparat für die orale oder pa renterale Verabreichung kann somit beispielsweise 20% Serum albumin, 10% IgG und 1 mg/ml Caprylsäure als Stabilisatoren und Konservierungsmittel enthalten. Der pH-Wert wird vorzugs weise durch Zugabe von physiologisch verträglichen Puffe rungsmitteln auf etwa 7 eingestellt.

Ferner ist es möglich die flüssigen Präparate durch ge eignete, schonende Verfahren, z. B. durch Lyophilisation, zu einem Pulver zu verarbeiten, das erst vor der Anwendung durch eine sterile, physiologisch verträgliche Flüssigkeit re konstituiert wird.

Die erfindungswesentliche Hitzebehandlung zur Virus- und Bakterieninaktivierung wird vorzugsweise durch 10-stündiges Erhitzen auf 60°C vorgenommen. Gegebenenfalls kann die Hitze behandlung durch eine gleichwertige Inaktivierungsbehandlung, z. B. durch Bestrahlung mit gamma-Strahlen, ersetzt. Gegebe nenfalls können Verfahren mit dem sogenannten Caprylsäurever fahren kombiniert werden können. Durch Zusatz von Caprylsäure lassen sich nämlich umhüllte Viren inaktivieren. Dieser Schritt der Caprylsäure-Inaktivierung wird bei der Plas mafraktionierung vor der Hitzeinaktivierung zwischen zwei Al koholfällungsschritten oder Polyethylenglykolfällungsschrit ten eingeschoben.

Eine mögliche Dosis bei parenteraler Verabreichung be trägt etwa 100 bis 200 mg IgG pro Liter Blutvolumen des zu behandelnden Tieres. Bei einer angenommenen Blutmenge eines neugeborenen Ferkels von 0,2 Liter ergäbe sich somit eine pa renteral zu verabreichende IgG-Dosis von 20 bis 60 mg. Bei Annahme einer Halbwertszeit für das verabreichte IgG von 20 bis 25 Tagen würde eine Startdosis von 0,1 g IgG einen aus reichenden Schutz während der für die Mast entscheidenden er sten Lebenswochen ergeben.

Auch bei oraler Verabreichung der IgG-Präparate ergibt sich eine Schutzwirkung, die insbesondere während der ersten Lebenstage der Tiere, in denen die Blut-Darm-Schranke noch für Antikörper durchlässig ist, gegeben ist. Demgemäß betrifft die Erfindung auch ein Tieraufzuchtverfahren, das durch Verfütterung eines Futtermittelzusatzes mit einem Ge halt an dem erfindungsgemäßen mikroorganismenfreien IgG- Präparat gekennzeichnet ist.

Sowohl die parenteral zu verabreichenden IgG-Präparate als auch ein oral zu verabreichenden Futtermittelzusatz mit einem Gehalt an dem IgG-Präparat wurden im Rahmen von experi mentellen Studien Tiermastversuchen an Kälbern und Schweinen untersucht. Dabei wurde festgestellt, daß sich durch beide Verabreichungsformen sowohl eine Verbesserung des allgemeinen Gesundheitszustandes als auch eine raschere Körpergewichtszu nahme erzielen läßt. Daraus läßt sich schließen, daß durch die IgG-Verabreichung eine passive Immunisierung der Tiere erzielt wird, wodurch das Auftreten von Infektionskrankhei ten, insbesondere der bei Schweinen und Kälbern gefürchteten Durchfallerkrankungen, in erheblichem Maße verringert werden kann. Dabei verhindert die gezielt verwirklichte mikroorga nismenfreie Beschaffenheit das Auslösen von Infektionen durch das Präparat selbst und trägt somit zu einem gesunden Auf wachsen der Tiere und zu einer raschen Körpergewichtszunahme bei.

Nachstehend wird die Erfindung anhand von Beispielen nä her erläutert.

Grundsätzlich gilt, daß die in den Beispielen erhaltenen Präparate aus Schweineblut oral bzw. parenteral an Ferkel verabreicht werden, während für die Behandlung von Kälbern die aus Rinderblut gewonnenen Präparate eingesetzt werden. Außerdem sei noch darauf hingewiesen, daß anstelle des Fällungsmittels Ethylalkohol auch Polyethylenglykol (PEG) eingesetzt werden kann.

Beispiel 1

Herstellung eines IgG-Präparats aus Rinderblut

Die so erhaltene IgG-Paste (Stufe C oder D) dient sowohl zur Herstellung eines IgG-haltigen Futtermittelzusatzes als orale Darreichungsform als auch zur Herstellung eines paren teral zu verabreichenden IgG-Präparates.

Beispiel 2

Herstellung eines IgG-Präparats aus Schweineblut

Beispiel 3

Herstellung eines parenteral zu verabreichenden IgG-Prä parats aus Rinderblut

Dieses IgG Trockenpulver wird in einer wäßrigen Puffer lösung pH = 7,3 gelöst und über eine affinitätschroma tographische Methode hochgereinigt und lyophilisiert. Die Ausbeute an spezifischen hochgereinigten IgG liegt bei 5% des Gesamt-IgG. Aus 7000 g IgG erhält man 350 g spezifisches IgG.

Daraus lassen sich zum Beispiel
700 Ampullen zur parenteralen Anwendung mit 0,5 g spezi fischem IgG/10 ml herstellen.

Das lyophilisierte Trockenpulver wird in 7000 ml 0,9% NaCl-Lösung, die 2 mg/ml Caprylsäure als Stabilisator und 0,2 mg/ml Thiomersal als Konservierungsmittel enthält, gelöst.

Die Lösung wird sterilfiltriert, in sterile 10 ml-Ampullen ab gefüllt und anschließend hitzebehandelt (10 Stunden bei 60°C). Alternativ kann man diese Lösung auch in 70 Mehrfach dosisbehältnisse (5 g spez. IgG/100 ml) abfüllen.

Beispiel 4 Herstellung eines IgG-haltigen Futtermittels

Das nach Stufe E aus Beispiel 3 hergestellte IgG-Pulver ergibt 140 Portionen à 50 g IgG. Unmittelbar vor der Fütterung werden je 50 g in Kolostralmilch gelöst, und pro Kalb nach 3, 9 und 15 Stunden p. n. gefüttert.

Aus der nach Stufe E aus Beispiel 3 produzierten Menge IgG-Pulver läßt sich alternativ auch eine Lösung zur oralen Applikation herstellen.

Das gesamte Pulver kann man in 70 Liter 0,9%iger NaCl- Lösung lösen, die 70 g Caprylsäure als Stabilisator enthält.

Die Lösung wird sterilfiltriert, abgefüllt in 500 ml- Flaschen und anschließend hitzebehandelt (10 Stunden bei 60°C). Der Ansatz ergibt 140 Flaschen mit folgender Zusammen setzung:
50 g IgG/500 ml 0,9% NaCl-Lösung
500 mg Caprylsäure/500 ml als Stabilisator
Dosierung 3 × 50 g IgG pro Kalb in den ersten 24 Stun den.

Claims

1. Mikroorganismenfreies IgG-Präparat zur Verwendung in der Tieraufzucht und in der Tiermast

2. Präparat nach Anspruch 1 in oraler Darreichungsform als Futtermittelzusatz.

3. Präparat nach Anspruch 1 in parenteraler Darreichungsform als Tierarzneimittel.

4. Futtermittel zur Verwendung in der Tieraufzucht, enthaltend ein IgG-Präparat nach Anspruch 1.

5. Verfahren zur Herstellung des IgG-Präparats nach Anspruch 1, umfassend folgende Stufen:

a) Zentrifugieren von Tierblut zur Gewinnung von Plasma,
b) Ausfällen einer IgG-Fraktion aus dem Plasma durch Zusatz von Alkohol oder Polyethylenglykol,
c) Zugabe von sterilisierem Albuminplasma und von Stabilisierungsmittel zum in Stufe (b) erhaltenen IgG- Präparat,
d) Sterilfiltration der in Stufe (c) erhaltenen Flüssigkeit und
e) Hitzebehandlung der in Stufe (d) erhaltenen Flüssigkeit zur Inaktivierung von Mirkoorganismen.

6. Tieraufzucht- und Tiermastverfahren, gekennzeichnet durch die Verabreichung eines Produkts nach einem der Ansprüche 1-4.