DE1096850B - Verfahren zur Gewinnung eines dextranaehnlichen Polysaccharids aus Pullularia pullulans - Google Patents

Description

• Verfahren zur Gewinnung eines dextranähnlichen Polysaccharids aus Pullularia pullulans Von den extracellulären Schleimsubstanzen, die von Mikroorganismen gebildet werden, haben in neuerer Zeit die Dextrane besondere Bedeutung erlangt. Als wasserlösliche Hochpolymere haben sie medizinische sowie technische Anwendung gefunden. Es können auch wasserunlösliche polymere Derivate hergestellt werden.
• Die als Dextran bezeichneten Polysaccharide sind charakterisiert durch ihren einheitlichen Aufbau aus D-Glucose, durch das hohe spezifische Drehungsvermögen ([a] 2D = + 180 bis t 2100), die vorwiegende Verknüpfung der Glucoseeinheiten über a-1,6-Bindungen mit Verzweigungen durch a-1,4- und/oder a-1,3-Verknüpfungen sowie durch ihre Bildung auf dem Wege der enzymatischen Übertragung der D-Glucosereste mittels transglycosidierenden Enzymen. Als Substrat für die auch extracellulär wirksamen Enzyme dient vorwiegend Saccharose, daneben wurde die transglycosidierende Dextranbildung auch bei der Spaltung von Dextrin beobachtet. Die Enzyme) die zur Dextranbildung führen, sind als Dextran-Sucrase bzw. Dextran-Dextrinase bekannt.
• Die Mikroorganismen, welche diese Enzyme produzieren gehören vorwiegend der Leuconostocgruppe an (Leuconostoc mesenteroides, Leuconostoc dextranicus und Leuconostoc citrovorus). Dextranbildung ist ferner beschrieben für Betacoccus arabinosaceous, Microccus gumosus, Betabacterium vermiforme (Literatur siehe A. G. Foster und M.Stacey: »The Polysaccharides from Lower Plants such as Bacteria, Algae, Fungi and Lichens etc., and the Related Enzymes« im Handbuch der Pflanzenphysiologie, Bd. VI, S. 331, Springer-Verlag, Berlin, Göttingen, Heidelberg, 1958).
• Es wurde nun gefunden, daß man ein neues dextranähnliches Polysaccharid aus Kohlehydraten mittels Mikroorganismen in der Weise gewinnen kann, daß man den Pilz Aureobasidium pullulans (de Bary) Arnoud [Syn.
• Pullularia pullulans (de Bary) Berkhout], einen zu den Rußtaupilzen gehörenden Mikroorganismus, verwendet und das gebildete dextranähnliche Polysaccharid in an sich bekannter Weise aus dem Kulturfiltrat isoliert.
• Dieses Polysaccharid, das im folgenden auch als Pullulan bezeichnet wird, liefert bei der vollständigen Hydrolyse ebenso wie Dextran als einziges Spaltprodukt Glucose Unter geeigneten Kulturbedingungen verwandelt der Pilz die Kohlenstoffquelle des Nährsubstrates in hoher Ausbeute, gegebenenfalls etwa 5001, und darüber, in das dextranähnliche Polysaccharid.
• Von den bekannten Dextranen unterscheidet sich das durch Pullularia pullulans gebildete Polysaccharid in mehrfacher Hinsicht: 7Die spezifische Drehung ist um etwa 20 bis 30° geringer als bei den zahlreichen beschriebenen Leuconostoc-Dextranen (A. Jean es, W. C. H nyn es, C. A.Wilham, I. C.Rankin, E. H. Melvin, M. J.
• Austin, 1. E. Cluskey, B. E. Fisher, M. W.
• Tschuiya, C. E. Rist, 3. Am. Chem. Soc., 76, s. 5041 [1954]).
• Nach den genannten Autoren besteht eine Korrelation zwischen der Höhe der Drehung und dem Gehalt an a-1,3-Verknüpfungen bei Dextranen. Bei dem von Pullularia gebildeten Produkt können demnach a-t,3-Bindungen ausgeschlossen werden.
• 2. Im Ultraspektrum zeigt sich, daß wie in Dextran a-glycosidische Bindungen vorliegen (Typ 2 a peak bei 845 cm-1 [vgl. 3. Chem. Soc., 1954, S. i71]). Im Gegensatz zu zahlreichen Dextranen, insbesondere einem Glucan, das durch den Schimmelpilz Aspergillus niger produziert wird und Nigeran genannt wurde, finden sich keine 1,3-Verknüpfungen. Neben a-1,6-Bindungen liegen in größerem Umfange a-1,4-Bindungen vor (Typ 1 und 3 Absorption bei 925 cm-l und 750 cm-l, kleine Absorptionsbande bei 768 cm-l).
• 3. In serologischer Beziehung zeigt sich, daß von menschlichem Antidextran nur ein Teil durch das Pullularia Polysaccharid gefällt wird und daß hierzu wesentlich größere Mengen benötigt werden als von normalem Dextran mit langen a-1,6-Ketten. In der Kreuzreaktion mit Typ 2 Antipneumokokkenserum fällt das Pullularia Polysaccharid wesentlich mehr Antikörper als normale Dextrane.
• 4. Molekulargewicht und -gestalt, gemessen an der Viskosität von Lösungen, sind von den Kulturbedingungen abhängig. So läßt sich z. B. durch Zusatz von 0,01 0/o Maltose zum glucosehaltigen Medium ein Produkt besonders hoher Viskosität gewinnen, während ohne Zusatz von Maltose Polysaccharide erhalten werden, die in Lösung geringere Viskosität als die Leuconostoc-Dextrane zeigen.
• 5. Das Produkt besteht, wie die Hydrolyse und Papierchromatographie zeigen, so wie Dextran -ausschließlich aus Glucose Partialhydrolysate mit verdünnter Säure bei 1000 C oder mit konzentrierter Säure bei tiefer Temperatur (0° C) zeigen, daß, wie bei diesen, eine erhebliche Menge Isomaltose gebildet wird, im Gegensatz zur Partialhydrolyse von Dextran aber nur sehr wenig oder gar kein Obligosaccharid größerer Kettenlänge. Dies spricht dafür, daß im Pullularia-Polysaccharid neben nur sehr kurzen 1,6-Ketten in größerer Menge säure--labile Verknüpfungen anderer Struktur vorhanden sind.
• 6. Der chemische Mechanismus der Polysaccharidbildung muß bei Aureobasidium pullulans auf einem völlig anderen Prinzip beruhen, als er für die bisher beschriebenen Dextrane bekannt ist. Als Substrat für die Polysaccharidbildung können nämlich verschiedene Monosaccharide dienen, vor allem Glucose und Fructose, oder es kann mit ähnlicher Ausbeute auch Saccharose verwendet werden. Dieses Disaccharid wird vermutlich primär zu Monosacchariden gespalten, welche dann dem Pilz als Ausgangsmaterial -für das Polyglucosan dienen. Diese Fähigkeit zur Polyglucosansynthese aus Monosacchariden unterscheidet Aureobasidium pullulans von den bisher untersuchten dextranbildenden Bakterien und macht einen Bildungsmechanismus über eine primäre Phosphorylierung bzw. über Uridindiphosphatglucose wahrscheinlich.
• Es handelt sich sowohl um einen neuen Typ von Polyglucosan als auch um einen neuen Typ einer enzymatischen Glucosansynthese. Das neue Polysaccharid wurde nach seinem Vorkommen in Pullularia pullulans mit dem Namen »Pullulan« bezeichnet.
• Das Maximum der Pullulanbildung ist im allgemeinen nach 120 Stunden erreicht. Im Durchschnitt werden nach dieser Zeit etwa 2201, der vorgelegten Glucose oder 2001o der Saccharose zu Pullulan polymerisiert. Durch Zugabe von 1,2y-Thiamin je Milliliter läßt sich das Pilzwachstum noch stimulieren, was mit einer Steigerung der -Pullulanbildung bis zu etwa 3001, der vorgelegten Kohlenstoffquelle verbunden ist.
• Die Kultivierung von Pullularin pullulans in einem Medium, das durch Filtration sterilisierte Glucose enthält, liefert etwa ein Drittel der Menge an Polysaccharid, die man bei Hitzesterilisation unter Thiaminzusatz erhalten kann. Es ist anzunehmen, daß während der Erhitzung der Glucose ein stimulierender Faktor eventuell ein Starter für die Pullulansynthese gebildet wird. Durch Abtrennung der freien Glucose aus hitzesterilisiertem -Zucker durch Fällung mit Aceton und Extraktion des Niederschlages mit Methanol läßt sich eine Fraktion gerinnen, die, in relativ kleiner Menge dem steriiiltrierten Ansatz zugesetzt, eine starke Fördeirung der Glucosepolymerisation bewirkt. In solchen Ansätzen können bis zu -5001, Polysaccharid, berechnet auf eingesetzte Glucose, erhalten werden.
• Pullulan läßt sich ebenso wie die bereits bekannten Dextrane als Infusionsflüssigkeit, z.B. zur Verhütung des Operationsschocks, allgemein zur Erhaltung des normalen colloid-osmotischen Drucks in Blutkreislauf und Gewebe verwenden. Bei geeigneter Kultur des Organismus ist im Gegensatz zu Dextranen eine Partialhydrolyse nicht notwendig, da das Produkt in leicht löslicher Form anfällt und 2- bis 40loige Lösungen noch leicht fließend - sind und durch Filtration sterilisiert werden können.
• Streicht man konzentrierte Pullulanlösungen auf glatten Oberflächen aus und läßt sie trocknen, so entstehen - insbesondere bei Weichmacherngeschmeidige durchsichtige Folien, die in Wasser augenblicklich quellen und in Lösung gehen. Das Verfahren kann sinngemäß auch zur Herstellung wasserlöslicher Kapseln oder Hüllen für Heilmittel angewendet werden.
• Beispiel 1 1 l der Nährlösung nach Czapek-Dox, der3gNaNO3, 1g K2HPO4, 0,5 g MgSO4-7H2O, 0,5 g 0,5g KCl, 0,01 g Fe SO4 7H2O und 30 g Glucose enthält und dessen p,-Wert 7,2 beträgt, wird 30 Minuten bei 112 atü autoklaviert. Nach dem Erkalten wird die Nährlösung mit 50 ml einer 48 Stunden alten Vorkultur von Aureobasidium pullulans in Czapek-Dox-Medium (6 108 Zellen je Milliliter) beimpft und unter Belüftung 120 Stunden bei 27° C bebrütet. Nach beendeter Inkubation werden die Zellen bei 6000 Ulmin abzentrifugiert und das Kulturmedium bei 20000 U/min vorgereinigt. Das Polysaccharid wird mit dem 1 ,2fachen Volumen Aceton ausgefällt. Die Ausbeute beträgt 6,6 g = 220in der vorgelegten Glucose.
• Zur Reinigung wird das Rohprodukt wiederholt in Wasser gelöst und unter starkem Rühren mit Aceton gefällt. Nach 4- bis Smaligem Umfällen wird ein reinweiß es, körniges Produkt mit einem Drehwert von [a]2D = + 168° erhalten.
• Beispiel 2 Zu 11 Czapek-Dox-Nährlösung entsprechend Beispiel 1 werden vor der Sterilisation noch 1,20 mg Thiamin in Form des Hydrochlorids hinzugefügt. Nach der Beimpfung mit 50 ml einer 48 Stunden alten Vorkultur von Aureobasidium pullulans in Czapek-Dox-Medium wird unter Belüftung 120 Stunden bei 27° C bebrütet. Anschließend werden die Zellen bei 6000U/min abzentrifugiert. Nach der Vorreinigung durch scharfes Zentrifugieren bei 20 000 Ulmin wird das Polysaccharid mit dem 1,2fachen Volumen Aceton ausgefällt. Die Ausbeute beträgt 9 g = 300in der vorgelegten Glucose. Nach der Reinigung durch wiederholtes Lösen in Wasser und Fällen mit Aceton erhält man ein reinweißes und körniges Produkt mit einem Drehwert von [a]2D0 = + 168".
• Beispiel 3 Zu 11 Czapek-Dox-Nährlösung entsprechend Beispiel 1 werden an Stelle von Glucose Saccharose bzw. Fructose gegeben. Nach der Beimpfung mit jeweils 50 ml einer 48 Stunden alten Vorkultur von Aureobasidium in Czapek-Dox-Medium wird unter Belüftung 120 Stunden bei 27° C bebrütet. Anschließend werden die Zellen bei 6000 U/min abzentrifugiert, das Kulturmedium durch scharfes Zentrifugieren bei 20 000 U/min vorgereinigt und das Polysaccharid durch Zugabe des 1,2fachen Volumens Aceton ausgefällt. Die Ausbeute beträgt mit Saccharose als Kohlenstoffquelle 6 g = 200in der vorgelegten Saccharose, mit Fructose als Kohlenstoffquelle 3,3 g = 11 010 der vorgelegten Fructose.
• Beispiel 4 11 der Czapek-Dox-Nährlösung entsprechend Beispiel 1 wird durch ein Ganzglasbakterienfilter (Schott 17 G 5) steril filtriert und mit 50 ml einer 48 Stunden alten Vorkultur von Aureobasidium pullulans in sterjijiltriertem Czapek-Dox-Medium beimpft. Nach 120 Stunden langer Bebrütung bei 27° C werden die Zellen bei 6000 U/min abzentrifugiert und das Kulturmedium durch nochmaliges scharfes Zentrifugieren bei 20000 U/min vorgereinigt.
• -Das Polysaccharid wird mit dem 1,2fachen Volumen Aceton ausgefällt. Die Ausbeute beträgt 3 g = 100/o der vorgelegten Glucose. Nach der Reinigung durch wiederholtes Lösen in Wasser und Fällen mit dem 1,2fachen Volumen Aceton erhält man ein reinweißes, körniges Produkt, dessen optische Aktivität [a]2,0 + 1680 beträgt.
• Beispiel 5 50 g Glucose werden bei neutralem pu-Wert in destilliertem Wasser bei 1/2 atü 1/2 Stunde lang autoklaviert.
• Nach dem Abkühlen wird die Glucose durch 4stündige Inkubation bei 27° C mit 100 g Bäckerhefe entfernt und die Flüssigkeit nach Abzentrifugieren der Hefe bei 6000 U/min auf 10 ml eingeengt. Nach Entfernen einer vorwiegend aus Zuckern bestehenden Fraktion mittels Aceton (doppeltes Volumen) und nochmaligem Einengen wird nach einer zweiten Acetonbehandlung (doppeltes Volumen) das erhaltene Präzipitat mit Methanol extrahiert. Das stimulierende Produkt befindet sich in dem nach dem Einengen des methanolischen Extrakts erhaltenen Sirup. 50 mg des Sirups werden vor der Sterilfiltration entsprechend Beispiel 4 zu 11 Czapek-Dox-Nährlösung wie im Beispiel 1 gegeben und mit 50ml einer 48 Stunden alten Vorkultur von Aureobasidium pullulans in sterilfiltriertem Czapek-Dox-Medium beimpft. Nach 120stündiger Bebrütung bei 27° C werden die Zellen bei 6000 Ulmin abzentrifugiert und das Kulturmedium durch nochmaliges scharfes Zentrifugieren bei 20 000 U/min vorgereinigt. Das Polysaccharid wird mit dem 1 ,2fachen Volumen Aceton ausgefällt.
• Die Ausbeute beträgt 14 g = 460in der vorgelegten Glucose. Nach der Reinigung durch wiederholtes Lösen in Wasser und Fällen mit dem 1,2fachen Volumen Aceton erhält man ein reinweißes körniges Produkt, dessen optische Aktivität [a]2D0 = + 168° beträgt.
• PATENTANSPRUCKE: 1. Verfahren zur Gewinnung eines dextranähnlichen Polysaccharids mittels Mikroorganismen aus Kohlehydraten, dadurch gekennzeichnet, daß man Aureobasidium pullulans (de Bary) Arnoud [Syn. Pullularis pullulans (de Bary) berkhout] verwendet und das gebildete dextranähnliche Polysaccharid in an sich bekannter Weise aus dem Kulturfiltrat isoliert.

Claims (1)

1. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Kohlehydrate Glucose, Fructose oder Saccharose zur Herstellung des dextranähnlichen Polysaccharids verwendet.

   3. Verfahren nach Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man Thiamin als wachstumsfördernde Substanz für Aureobasidium pullulans verwendet.

   4. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man einen die Polysaccharidbildung stimulierenden Faktor zusetzt, welcher durch Erhitzung von Glucose oder anderen Kohlehydraten erhalten und gegebenenfalls von der nicht umgesetzten freien Glucose oder den anderen Kohlehydraten abgetrennt wird.

   5. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man Thiamin und den die Polysaccharidbildung stimulierenden Faktor gleichzeitig verwendet.