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Verfahren zur Isolierung von Gibberellinsäure aus wäßrigen Fermentationsmedien
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Isolationsverfahren und insbesondere
auf ein verbessertes Verfahren zur Isolierung von Gibberellinsäure aus wäßrigen
Fermentationsmedien.
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Es ist bekannt, bei mikrobiologischen Verfahren einen gewünschten
Stoff aus dem Nährmedium durch Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel zu
gewinnen, wie es beispielsweise in der deutschen Patentschrift 619977 für die Herstellung
von Zitronensäure durch Gärung und ihre Gewinnung aus den Gärlaugen mit Hilfe eines
geeigneten Extraktionsmittels, z. B. ein Gemisch von Alkohol und Äther, sowie in
der deutschen Patentschrift 81.4 890 für die Herstellung von Butandiol-(2,3)
oder weiterhin für die Penicillingewinnung beschrieben ist. Ein solches Extraktionsverfahren
läßt sich jedoch keineswegs auf ein beliebiges anderes Gärverfahren übertragen,
da die Eigenschaften des Nährmediums bzw. der Gärlaugen und des anderen gewünschten
Produkts ganz andere und nicht verwechselbar sind.
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Für die Gewinnung von Gibberellinsäure aus einer wäßrigen Lösung derselben,
beispielsweise aus einem Fermentationsmedium, ist es bekannt, diese durch Adsorption
an Holzkohle zu isolieren und anschließend die Gibberellinsäure daraus zu eluieren
und aus dem Eluat zu gewinnen. Dieses Verfahren bedingt jedoch mehrere Stufen und
die Gewinnung größerer Mengen an teurem Material, wie Holzkohle, und von Spezialapparaturen.
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Es wurde nun gefunden, daß Gibberellinsäure aus einer wäßrigen Fermentationslösung
derselben isoliert werden kann, indem diese wäßrige Fermentationslösung mit einem
geeigneten organischen Lösungsmittel extrahiert wird, wie beispielsweise mit Athylacetat,
worauf dann die Gibberellinsäure aus diesem Lösungsmittel gewonnen wird.
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Erfindungsgemäß wird ein verbessertes Verfahren zur Isolierung von
Gibberellinsäure aus einem wäßrigen Fermentationsmedium vorgeschlagen, welches dadurch
gekennzeichnet ist, daß das wäßrige Fermentationsmedium mit einem mit Wasser nicht
oder nur teilweise mischbaren organischen Lösungsmittel aus der Gruppe der Ester,
Alkohole und Ketone mit nicht mehr als 8 Kohlenstoffatomen extrahiert und die Gibberellinsäure
danach aus dem Lösungsmittel mit bekannten Mitteln gewonnen wird.
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Das wäßrige Fermentationsmedium, welches die Gibberellinsäure enthält
und das als Ausgangsmaterial verwendet wird, kann in bekannter Weise erhalten werden,
beispielsweise kann dies aus einem wäßrigen Filtrat bestehen, das aus einem Gibberellinsäure
enthaltenden Fermentationsmedium besteht und das durch den Wuchs eines Gibberellinsäure
erzeugenden Pilzes auf einem geeigneten wäßrigen Nährmittelmedium erhalten wird.
Für diesen Zweck ist der Pilz Gibberella fujikuroi geeignet, jedoch können auch
andere Gibberellinsäure erzeugenden Pilze oder entsprechende Mutationen derselben
verwendet werden.
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Als geeignete organische Lösungsmittel, welche aus der Ester, Ketone,
Alkohole und Äther enthaltenden Gruppe ausgewählt werden und die bei dem Extraktionsverfahren
gemäß der Erfindung angewandt werden können, seien beispielsweise genannt: Äthylacetat,
n-Butylacetat, Isoamylacetat, Diäthylcarbonat, Äthylpropionat, Äthyln-butyrat, n-Butyllactat,
Isopropylacetat, ß-Äthoxyäthylacetat, Methoxybutylacetat, Methyl-n-propylketon,
Cyclohexänon, Diäthylketon, Methylisobutylketon, Methylcyclohexanon, Methyläthylketon,
Benzylalkohol, sec.-Butanol, Cyclohexanol und n-Butanol. Es ist darauf hinzuweisen,
daß dieses Lösungsmittel auch aus einer Mischung von Lösungsmitteln bestehen kann,
wie beispielsweise einer Mischung aus n-Butanol und n-Butylacetat oder einer Mischung
aus Isoamylacetatundn-Amylacetat, wie sie im technischen Amylacetat vorliegt.
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Bevorzugte Lösungsmittel sind Athylacetat, Isoamylacetat, Methyl-n-propylketon
und Methylisobutylketon. Das filtrierte wäßrige Fermentationsmedium, welches Gibberellinsäure
enthält und das als Ausgangsmaterial verwendet wird, wird vorzugsweise vor dem Extrahieren
mit dem entsprechenden organischen Lösungsmittel auf
einen pH-Wert
zwischen 1,5 und 4,0 eingestellt. Die Gibberellinsäure kann aus dem so erhaltenen
organischen Lösungsmittelextrakt in bekannter Weise isoliert werden, indem beispielsweise
dieser Extrakt konzentriert werden kann und das so erhaltene Rohprodukt dann in
bekannter Weise gereinigtwird, um reine Gibberellinsäure zu ergeben.
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Ein geeignetes Verfahren zum Reinigen der Gibberellinsäure besteht
darin, daß die Gibberellinsäure aus dem organischen Lösungsmittel-- mittels einer
Pufferlösung eines pH-Wertes von 6 _bis 8-.extrahiert wird. Der Pufferextrakt wird
dann auf einen pH-Wert von 3 bis 4 angesäuert, und die hierbei frei werdende Gibberellinsäure
wird dann mit Äthylacetat-extrahiert. Das Äthylacetat wird dann mit Natriumsulfat
getrocknet und auf eine kleine Menge verringert, wodurch fast reine Gibberellinsäure
auskristallisiert. Um eine vergrößerte Ausbeute an dem erwünschten Material zu erhalten,
kann Leichtbenzin zugesetzt werden, -Die Erfindung ist in den folgenden Beispielen
erläutert, ohne darauf beschränkt zu sein. Beispiel 1 31 eines Kulturfiltrats, das
etwa 117 mg Gibberellinsäure enthält, werden auf einen pH-Wert von 3 eingestellt
und -dreimal mit Athylacetat.extrahiert, wobei jedesmal 1,51. verwendet werden.
Die ersten und zweiten Extrakte werden vereinigt und auf eine Menge von 100 ccm
eingedampft und dann zweimal mit einem Phosphatpuffer extrahiert, wobei jedesmal--25
ccm angewandt werden. Der Phosphatpuffer besteht aus 136 g primärem Kaliumphosphat
und 24 g Kaliumhydroxyd, die mit destilliertem Wasser auf 11 aufgefüllt---werden;
der pn-Wert dieser Lösung beträgt 6,3. Die Pufferextrakte werden vereinigt, auf
einen pn-Wert von 3,5 bis 3,8 eingestellt und zweimal mit je 70 ccm Äthylacetat
extrahiert. Die vereinigten Äthylacetatextrakte werden dann auf ein kleines Volumen
eingedampft und Leichtbenzin zugesetzt, wobei Gibberellinsäure auskristallisiert.
Auf diese Weise werden 72 mg Gibberellinsäure erhalten, die bei 233 bis 235°C unter
Zersetzung schmilzt. Beispiel 2 1 1 eines Kulturfiltrats; das schätzungsweise 39
mg Gibberellinsäure enthält, wird auf einen pH-Wert von 3 eingestellt und zweimal
mit je 1 1 Butylacetat extrahiert. Die vereinigten Extrakte werden eingedampft,
und das .Rohprodukt wird in der im Beispiel 1 beschriebenen Weise gereinigt. Auf
diese Weise werden 8 mg Gibberellin--säure erhalten, die bei 233 bis 235°C unter
Zersetzung schmilzt. Beispiel 3 21 eines Kulturfiltrats, das schätzungsweise 378
mg Gibberellinsäure enthält, werden auf einen pH-Wert von -3 eingestellt und zweimal
mit j e 21 Äthylacetat extrahiert. Die vereinigten Extrakte werden eingedampft,
und das erhaltene Rohprodukt wird in der im Beispiell beschriebenen Weise gereinigt.
Auf diese Weise werden "268 mg Gibberellinsäure erhalten, die bei 233 bis 235°C
unter Zersetzung schmilzt.
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Beispiel 4 - 21 eines Kulturfiltrats, das schätzungsweise zwischen
690 und 886 mg Gibberellinsäure enthält, werden auf einen pH-Wert von 3 eingestellt
und dreimal mit Äthylacetat extrahiert, wobei entsprechend 1, 2 und nochmals 1 1
Äthylacetat verwendet werden. Der erste und zweite Extrakt werden vereinigt und
auf 100 ccm eingedampft und dann zweimal mit j e 25 ccm einer Phosphatpufferlösung
extrahiert. Die Phosphatpufferlösung besteht aus 136 g primärem Kaliumphosphat und
24 g Kaliumhydroxyd, die mit destilliertem Wasser auf 1 1 aufgefüllt und auf einen
pg-Wert von 6,3 eingestellt wird. Die Pufferextrakte werden vereinigt, auf einen
pn-Wert von 3,5 bis 3,8 eingestellt und zweimal mit Äthylacetat extrahiert, wobei
jedesmal 70 ccm verwendet werden.
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Die vereinigten Äthylacetatextrakte werden dann auf ein kleines Volumen
eingedampft, und Leichtbenzin wird zugesetzt, wodurch Gibberellinsäure auskristallisiert.
Auf diese Weise werden 708 mg Gibberellinsäure erhalten, die bei 233 bis 235°C unter
Zersetzung schmilzt.
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Wenn der dritte Extrakt des Kulturfiltrats in entsprechender Weise
gereinigt wird, so werden noch weitere 38 mg Gibberellinsäure erhalten. Beispiel
5 7,21 eines Kulturfiltrats, das schätzungsweise 450 mg Gibberellinsäure im Liter
enthält, werden durch Zusatz von Phosphorsäure auf einen pH-Wert von 2,5 eingestellt
und dann dreimal mit je 3,61 Äthylacetat extrahiert. Die vereinigten Extrakte werden
auf eine Menge von -11 eingedampft und dann dreimal mit wäßriger Natriumbicarbonatlösung
extrahiert, so daß der pn-Wert der wäßrigen Phase 7 beträgt. Hierbei werden jeweils
500, 150 und 150 ccm Natriumbicarbonatlösung verwendet. Der wäßrige Extrakt wird
auf einen pH-Wert von 3,5 eingestellt und dann dreimal mit Äthylacetat extrahiert.
Die Extrakte werden vereinigt und unter Vakuum eingedampft. Die auskristallisierende
Gibberellinsäure wird abfiltriert, mit Äthylacetat gewaschen und im Vakuum getrocknet.
Auf diese Weise werden 2,55 g Gibberellinsäure erhalten, die bei 233 bis 234°C unter
Zersetzung schmilzt.
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Das beschriebene Verfahren wird mit der Abwandlung wiederholt, daß
hierbei das Äthylacetat durch Amylacetat als Lösungsmittel ersetzt wird. Hierbei
werden in ähnlicher Weise 2,33 g Gibberellinsäure erhalten, welche bei 233 bis 234°C
unter Zersetzung schmilzt. Beispiel 6 11251 eines Kulturfiltrats, welches schätzungsweise
400 mg Gibberellinsäure im Liter enthält, werden unter Verwendung eines Podbielniak-Extraktors
mit Äthylacetat bei einem pH-Wert von 2,8 extrahiert. Der aus 541 bestehende Extrakt
wird im Vakuum auf ein Volumen von 351 eingedampft. Das so erhaltene Konzentrat
wird dann mit einer wäßrigen Pufferlösung dreimal extrahiert und nach dem Mischen
der Extrakte auf einen pH-Wert von 9,5 eingestellt. Zur Extraktion werden 10, 5
und 21 Pufferlösung verwendet. Der erste, aus 101 bestehende Extrakt wird dreimal
mit Äthylacetat, und zwar unter Verwendung von 5, 2,5 und 1,251 extrahiert und nach
dem Vermischen mit dem Lösungsmittel auf einen pH-Wert von 3 eingestellt. Die zweiten
und dritten Pufferlösungsextrakte, die insgesamt 51 ausmachen, werden vereinigt
und zweimal mit 2;5 und 1,51 Äthylacetat extrahiert. Sämtliche Äthylacetatextrakte
werden vereinigt und durch ein Diatomeenerdefilter filtriert und teilweise über
wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Die vereinigten Extrakte werden unter Vakuum
in zwei Portionen konzentriert. Wenn das Volumen der Lösung bis auf 750 ccm verringert
ist, erfolgt eine Kristallisation der Gibberellinsäure, und. die Konzentrierung
wird unterbrochen. Die Mischung wird abgekühlt und filtriert und der feste Rückstand
mit Äthylacetat gewaschen und an der Luft getrocknet. Durch Konzentration der Mutterlaugen
werden weitere Mengen des Feststoffes erhalten. Die Gesamtmenge an in dieser Weise
erhaltener Gibberellinsäure beträgt 313,2 g, und dieses Produkt schmilzt bei 234
bis 235°C unter Zersetzung.
Beispiel 7 Im folgenden wird die Wirksamkeit
der Extraktion der Gibberellinsäure aus einem wäßrigen Fermentationsmedium unter
Anwendung verschiedener Lösungsmittel beschrieben.
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Eine wäßrige Gibberellinsäurelösung, welche durch Auslösen von 0,5
g feinpulverisierter Gibberellinsäure in 250 ccm destilliertem Wasser hergestellt
worden ist, wird filtriert, um nicht gelöstes Material zu entfernen. 25 ccm dieser
Lösung werden dann mit wäßriger N/100-Natriumhydroxydlösung titriert unter Verwendung
von Phenolphthalein als Indikator. Die hierbei verwendete Natriumhydroxydlösung
wird notiert (X).
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25 ccm der Gibberellinsäurelösung werden dann 1 Minute lang mit 25
ccm des zu prüfenden Lösungsmittels in einem mit einem Stopfen versehenen Scheidetrichter
geschüttelt. Die sich absetzende wäßrige Phase wird ablaufen gelassen, mit wäßriger
N/100-Natriumhydroxydlösung unter Verwendung von Phenolphthalein als Indikator titriert
und der festgestellte Titer notiert (Y). Dann wird eine Grundbestimmung unter Verwendung
von 25 ccm destilliertem Wasser und 25 ccm Lösungsmittel durchgeführt. Die wäßrige
Phase wird wiederum ablaufen gelassen und mit wäßriger N/100-Natriumhydroxydlösung
titriert und der kleine Grundtiter (B) notiert.
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Die prozentuale Wirksamkeit der Extraktion wird nach folgender Formel
errechnet
Die prozentuale Wirksamkeit der Extraktion ergibt sich für eine Reihe von Lösungsmitteln
aus folgender Tabelle:
| Prozentuale |
| Angewandtes Lösungsmittel Wirksamkeit |
| der Extraktion |
| Diäthylketon ...................... 74 |
| Methyl-n-propylketon .............. 79 |
| Methyläthylketon .................. 57 |
| Methylisobutylketon ............... 72 |
| Diäthylcarbonat ................... 39 . |
| Benzylalkohol ...................... 86 |
| sec.-Butanol ...................... 85 |
| n-Amylalkohol .................... 91 |
| Cyclohexanon ..................... 95 |
| Methylcyclohexanon ............... 87 |
| Cyclohexanol...................... 98 |
| Äthylpropionat .................... 54 |
| Äthyl-n-butyrat ................... 39 |
| n-Butyllactat ..................... 89 |
| Äthylacetat ....................... 71 |
| Isopropylacetat.................... 57 |
| ß-Äthoxyäthylacet;£t ............... 88 |
| n-Butylacetat ..................... 54 |
| 3-Methoxybutylacetat .............. 88 |
| n-Butylacetat + 10 °/o n-Butanol .... 73 |
| Amylacetat ....................... 68 |
Beispiel 8 53501 Kulturfiltrat aus einer Fabrikationsfermentierungsanlage, die schätzungsweise
1170 g Gibberellin.-säure enthalten, werden mit Äthylacetat bei einem pH-Wert 2
unter Verwendung eines Podbielniak-Extraktors extrahiert. Der Äthylacetatextrakt
(40501) wird unter verringertem Druck auf 2471 eingedampft. 2431 dieses Konzentrats
werden dann nacheinander mit 22,5, 18 und 181 Wasser extrahiert, die jeweils 1100,
100 und 25 g Kaliumbicarbonat enthalten, so daß die wäßrigen Extrakte einen pH-Wert
von 6,3 aufweisen. Die Menge an Kaliumbicarbonat, welche in der ersten Extraktionsstufe
verwendet wird, wird durch Titrieren eines Teils des konzentrierten Extraktes mit
wäßriger N/10-Natriumhydroxydlösung unter Verwendung von Phenolphthalein als Indikator
bestimmt, und es ergibt sich, daß der konzentrierte Extrakt Säure entsprechend einem
Äquivalent von 0,68 N/10-Säure enthält. Die Menge an Bicarbonat, welche für die
erste Extraktion verwendet wird, ist äquivalent zwei Dritteln der aus der Titration
errechneten Menge. Die drei Bicarbonatextrakte werden getrennt aufbewahrt und von
dem Lösungsmittel mit Hilfe eines Zentrifugalabscheiders getrennt. Der erste Extrakt
wird mit verdünnter Salzsäure angesäuert und zweimal mit 7,61 Äthylacetat extrahiert
und nach dem Vermischen auf einen pH-Wert von 3,3 eingestellt. Der zweite Extrakt
wird dann nacheinander mit den beiden obenerwähnten Äthylacetatextrakten extrahiert,
in gleicher Weise angesäuert und dann mit einer dritten Menge von 4,51 Äthylacetat
extrahiert. Der erste Bicarbonatextrakt wird dann nacheinander mit den drei vorher
verwendeten Athylacetatextrakten extrahiert und dann mit weiteren 4,51 Äthylacetat,
wobei die wäßrige Phase wiederum auf einen pH-Wert von 3,3 eingestellt wird. Die
vereinigten Äthylacetatextrakte, entsprechend 361 einschließlich der Waschflüssigkeiten,
besitzen eine braune Farbe, und sie werden unter verringertem Druck konzentriert,
bis Gibberellinsäure auskristallisiert. Die Gibberellinsäure wird durch Filtrieren
entfernt, nachdem die Lösung einige Stunden stehengelassen wurde, und das Lösungsmittel
wird weiter eingedampft, um mehr Gibberellinsäure zu ergeben. Die erhaltene Gibberellinsäure
wird sorgfältig mit Äthylacetat gewaschen, um die Verfärbung zu entfernen, und als
Endprodukt wird ein weißer kristalliner Feststoff erhalten, der bei 234 bis 235°C
schmilzt. Die Gewichtsmenge des Produktes beträgt nach dem Trocknen im Vakuum bei
40°C 947 g bzw.
810/, des in der Ausgangslösung vorhandenen Materials.