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Verfahren zur Herstellung von reinem Cyanocobalamin Die Erfindung
betrifft ein Verfahren zur Herstellung von reinem Cyanocobalamin aus einem Vitamin-Bl2-Konzentrat
mit einem Gehalt von weniger als 95 °/o.
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Das Verfahren zeichnet sich durch sehr große Einfachheit der Ausführung
aus und ist deshalb für die Anwendung in technischem Maßstab geeignet.
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Das neue Verfahren läßt sich zur Isolierung von reinem Vitamin2 aus
Konzentraten dieses Produkts anwenden, wie man sie nach bekannten Vorextraktions-und
Vorreinigungsverfahren aus natürlichen Quellen, wie Kulturnüssigkeiten von Mikroorganismen,
Abwässern und Leberextrakten mit einem Gehalt von mindestens 0, 5 °/oo Vitamin erhält.
Die vorliegende Erfindung besteht darin, daß man eine wäßrige Lösung des Cyanocobalamins
mit einem Gehalt von mindestens 0, 5 # Cyanocobalamin mit einer Menge eines Phenols,
insbesondere eines Mono-, Di-oder Triphenols, die 2 bis 3 °/0 des Volumens der Lösung
für Phenol selbst beträgt, behandelt, den hydratisierten, wohldefinierten Cyanocobalamin-Phenol-Komplex
der allgemeinen Formel C63H88N14O14PCo-(R)n-(H2O)x in der n 2 oder 4, x eine Zahl
zwischen 4 und 11 und R ein Phenol, insbesondere ein Mono-, Di-oder Triphenol, bedeutet,
kristallisieren läßt, ihn absaugt, durch Auflösen in Wasser zerlegt und das Cyanocobalamin
durch Zugabe eines mit Wasser mischbaren Lösungsmittels, wie Dioxan oder Aceton,
ausfällt.
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Die Fähigkeit verschiedener Phenole, entweder als solche oder im
Gemisch mit verschiedenen Lösungsmitteln Cyanocobalamin aus wäßrigen Lösungen zu
extrahieren, ist bekannt.
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Aus Arbeiten von Friedrich und Bernhauer (Angewandte Chemie, 66,
S. 776 bis 780 [1954] ; Z. fiir Naturforschung, 1954, S. 755 bis 761, entsprechend
deutsche Auslegeschrift 1 016 898) ist es z. B. bekannt, daß das Behandeln einer
wäßrigen Cyanocobalaminlösung mit einem monocyclischen Phenol, dessen Menge so zu
wählen ist, daß die entstandene Lösung den Phenolsättigungsgrad fast erreicht oder
sogar überschreitet, zu einer ölartigen Fällung führt, die aus einem Gemisch aus
Cyanocobalamin und veränderlichen Phenolmengen besteht.
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Diese nicht definierten Gemische, deren Zusammensetzung je mit den
verwendeten Phenolmengen wechselt und die man als » Komplexe « vermutet hatte, dürften
wahrscheinlicher gemäß der von Klo s a (»Die Pharmazie«, 1955, S. 102, 103) geäußerten
ansicht und der durch eigene Untersuchungen beigebrachten Bestätigung, als adsorptive
Fällungen betrachtet werden.
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Bei Anwendung des Phenols beginnt die Fällung bei einer Mindestkonzentration
von 6"/o. Die Änderungen der Zusammensetzung der oligen Fällung bei zunehmenden
Phenolkonzentrationen ergeben sich wie
folgt, wenn man von einer Cyanocobalaminlösung,
die 10 mg Cyanocobalamin pro cm3 enthält, ausgeht.
| °/0 Phenol Zusammensetzung der öligen Fällung |
| Cyanocobalamin (Phenol |
| 6. 34, 80/0 550/o |
| 7 27, 8 °/0 57 olo |
| 8 23-"/. 67% |
Die so erhaltene ölige Fällung liefert, mit Aceton gewaschen, durch Lösen des Phenols,
das Ausgangs-Cyanocobalamin.
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Zum Vergleich des kristallisierten Komplexes nach der Erfindung mit
der öligen Fällung nach der deutschen Auslegeschrift 1 016 898 wurden beide mit
Aceton gewaschen und vor und nach der Behandlung mit Aceton analysiert. Die erhaltenen
Resultate sind im folgenden. wiedergegeben : 1. Kristallisierter Komplex nach der
Erfindung Der nach Beispiel 1 der vorliegenden Erfindung erhaltene Komplex wurde
in Aceton bei Raumtemperatur suspendiert, mit Aceton gewaschen und im Vakuum getrocknet.
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Analyse : 1 Cyanocobalamin 4 CsH50H 5 H20 Gehalt an Vitamin B12, spektrophotometrisch
gemessen, vor Behandlung mit Aceton : berechnet............. 74, 4 °/0, gefunden.............
74, 6 °/o ; nach Behandlung mit Aceton : berechnet............. 74, 4°/0, gefunden.............
75,1% ; Gehalt an Phenol, colorimetrisch bestimmt, vor Behandlung mit Aceton : berechnet.............
20, 650/,, gefunden ........................... 18, 7 °/o ; nach Behandlung mit
Aceton : berechnet............. 20, 65 °/o, gefunden............. 19, 0 °/0.
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2. Produkt nach der deutschen Auslegeschrift 1 016 898 106 mg an kristallisiertem
Vitamin B12 werden in 15 ccm Wasser gelost. Man fügt 8% Phenol (1, 5 ccm einer 80%
igen Lösung) hinzu. Das sich abscheidende rote Ö1 wird durch Zentrifugieren isoliert
(Gewicht 490mg) und dann in 10 ccm Aceton suspendiert. Man beobachtet eine sofortige
Auflösung des Öles und das Auftreten eines roten, mikrokristallinen Festkörpers.
Man wäscht zweimal mit 10 ccm Aceton und trocknet im Vakuum.
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Analyse : Gehalt an VitaminBl2, spektrophotometrisch gemessen, vor
Behandlung mit Aceton......... 23 °/o nach Behandlung mit Aceton ..............
97, 2 °/0 Gehalt an Phenol, colorimetrisch gemessen, vor Behandlung mit Aceton...........
67 °/o nach Behandlung mit Aceton......... 0 °/0 Es ergibt sich ein grundlegender
Unterschied zwischen beiden Produkten.
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Das Produkt nach der vorliegenden Erfindung ist gegen Aceton stabil
; es handelt sich um einen Komplex mit Bindungen zwischen dem Vitamin B12 und dem
Phenol.
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Das Produkt nach der deutschen Auslegeschrift 1016 898 dissoziiert
durch Zusatz von Aceton ; es handelt sich nicht um einen Komplex und es existieren
keine Bindungen zwischen dem Vitamin B12 und dem Phenol.
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Das Produkt verhält sich wie eine Lösung von Vitamin B12 in Phenol,
die sich aus einer gesättigten Lösung von Phenol in Wasser ausscheidet. Dieses Ol
ist in mit Wasser nicht mischbaren chlorhaltigen Lösungsmitteln, wie beispielsweise
Chloroform, Trichloräthylen oder Tetrachloräthan, in Gegenwart von Phenol leicht
löslich.
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Auf Grund seines physikalischen Zustandes weist es den Nachteil auf,
keine ausreichend wirksame Reinigungsstufe zu sein, da es die Rolle eines dritten
Lösungsmittels spielt und somit einen großen Teil der Verunreinigungen mit sich
führt.
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Abgesehen von ihrem physikalischen Zustand sind die erfindungsgemäßen
Kristallisate klar durch ihre Löslichkeitsverhältnisse gekennzeichnet. So sind beispielsweise
die Komplexe mit Phenol selbst in Wasser mit 2 °/o Phenol, in Dichloräthan bzw.
Trichloräthylen und selbst in Dichloräthan bzw. Trichloräthylen mit 10% Phenol unlöslich,
von Aceton werden sie nicht zerlegt, was die Komplexbildung zwischen Phenol und
Cyanocobalamin, i n Gegensatz zu den früheren öligen Fällungen, bestätigt.
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Man stellt diese neuen hydratisierten phenolischen Komplexe her,
indem man einem Vitamin-B12 Konzentrat mit einem Gehalt von weniger als 95 °/0 in
wäßriger Lösung eine Menge eines Phenols, die unterhalb der Löslichkeitsgrenze des
betreffenden Phenols in Wasser liegt, zusetzt, kristallisieren läßt und filtriert.
Die so erhaltenen Komplexe dissoziieren beim Suspendieren in Wasser, und das in
Freiheit gesetzte VitaminBl2 löst sich. Es genügt dann, dieser Lösung ein mit Wasser
mischbares Lösungsmittel, in dem das Vitamin B12 nicht löslich ist, zuzusetzen,
um kristallisiertes Cyanocobalamin in hohem Reinheitsgrad zu erhalten. Die an Phenol
zuzusetzende Menge beträgt beispielsweise für Phenol selbst weniger als 3 0/, und
vorzugsweise etwa 2"/o des Volumens der wäßrigen Lösung.
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Bekanntlich bestehen wäßrige Lösungen von unreinem Vitamin2 aus einem
Gemisch von Cyanocobalamin, Dicyanocobalamin und Hydroxocobalamin, die zusammen
ausfallen, wenn man nicht den pEI-Wert sehr sorgfältig auswählt. Es wurde nun gefunden,
daß das Dicyanocobalamin keine kristallisierten Hydrate der Phenolkomplexe liefert
und bei dem Verfahren nach der Erfindung gelöst verbleibt, was einen zusätzlichen
Vorteil darstellt.
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Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens genügt es,
zur Erzielung quantitativer Ausbeuten in einem Konzentrat mit einem Gehalt von wenigstens
0, 5°/00 Vitamin B12 das Hydrat des Phenolkomplexes durch Zugabe der gewünschten
Menge des Phenols, z. B. für Phenol selbst etwa 2%, bezogen auf das Volumen des
Konzentrats, zu bilden. Das Verfahren läßt sich selbstverständlich auf reichere
Konzentrate sowie auf Lösungen des reinen Produkts anwenden, das man so wiedergewinnen
will. Wenn man mit Konzentraten mit einem Gehalt unterhalb von 0, 5 # Vitamin B12
arbeitet, ist die Kristallisation schwieriger.
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Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung. Man kann die Quelle
der Vitamin-Bl2-Lösung sowie deren Konzentration, die Konzentration an Phenol, die
zum Lösen des hydratisierten Phenolkomplexes des Vitamins B12 verwendeten Wassermengen
und die Art des für die Ausfällung des Vitamins B12 verwendeten Lösungsmittels oder
die Reihenfolge der Zugabe verändern, ohne aus dem Bereich der Erfindung zu gelangen.
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Beispiel 1 Bildung des hydratisierten Komplexes Vitamin B12-Phenol
aus einer Lösung von reinem Vitamin Bl2 und Wiedergewinnung des Vitamins B12 Eine
Lösung von 100 mg kristallisiertem reinem Vitamin B12 in 10 ccm Wasser versetzt
man mit 0, 2 ccm verflüssigtem Phenol. Es tritt zunächst vollständige Lösung ein.
Falls erforderlich, bringt man die Kristallisation durch Kratzen der Gefäßwandung
mit einem Glasstab in Gang und läßt die Kristallisation dann bis zum nächsten Morgen
bei Zimmertemperatur bis zur Vollständigkeit fortschreiten.
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Man saugt die Kristalle des Hydrats des gebildeten Phenolkomplexes
ab, wäscht sie mit Aceton, im welchem sie unlöslich sind, und trocknet sie bei Zimmertemperatur
im Vakuum. Ausbeute : 105 bis 110 mg hexagonaler, lebhaft roter Kristalle. Das Produkt
ist in Methanol und in 80 °/ igem Phenol lös] ich, in Aceton, Dichloräthan und Dichloräthan
mit 10 °/0 Phenol unlöslich. Seine Löslichkeit in phenolhaltigem Wasser ist in der
Abbildung graphisch dargestellt. Bei Behandlung mit einer wäßrigen Lösung von Kaliumcyanid
löst es sich selbst in Gegenwart eines Überschusses von Phenol auf Grund der Bildung
von Dicyanocobalamin wieder auf. Auch vorher hergestelltes Dicyanocobalamin gibt
keinen Komplex.
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Durch Lösen von 100 mg des erhaltenen Komplexes in 10 ccm Wasser
und Ausfällen mit 100 ccm Dioxan gewinnt man nach Absaugen und Trocknen etwa 90
mg Vitamin Bl2 purissimum.
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Analyse des Hydrats des Phenolkomplexes : 1 Cyanocobalamin : C87H112N14O18PCO#5H2O
Molekulargewicht : 1 821, 89 Berechnet.. C 57, 35%, H 6, 75 °/o, N 10, 76 °/o ;
gefunden.... C 57, 1 °/0, H 6, 7 °/0, N 10, 7 %.
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Vitamini-B12-Gehalt durch Spektrophotometrie : B12 Berechnet..............
74, 4% ; gefunden.............. 74, 6 °/o.
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Phenolgehalt durch Colorimetrie : C. H. OH Berechnet..............
20, 65%, gefunden ........................... 18,7 %.
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Beispiel 2 Herstellung des hydratisierten Komplexes Vitamin B12-Phenol
aus einem Vitamin Bl2 mit einem Gehalt von weniger als 95 °/0 und Gewinnung des
reinen Vitamins B12 Man löst 100 mg Vitamin Bl2 (nach Codex 72 % Gehalt ; H20 9,
6°/0) in 9, 8 ccm Wasser, setzt 0, 2 ccm verflüssigtes Phenol zu, leitet die Kristallisation
durch Impfen mit einigen Kristallen des gemäß Beispiel 1 erhaltenen hydratisierten
Komplexes ein, läßt 24 Stunden bei gewöhnlicher Temperatur kristallisieren und saugt
die Kristalle ab. Diese Kristalle des Hydrats werden in 10 ccm Wasser gelöst und
zur Kristallisation des reinen Cyanocobalamins mit 100 ccm Dioxan versetzt. Man
erhält 73 mg Vitamin B12 mit 12 °/0 Wasser (nach Codex Gehalt 99, 0 °/0), was einer
Ausbeute von 97 entspricht.
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Beispiel 3 Bildung des hydratisierten Komplexes Vitamin B12-Orcin
In 20 ccm einer wäßrigen Lösung von 200 mg Cyanocobalamin bringt man 800 mg Orcin
ein und erwärmt bis zur Lösung ganz schwach. Man läßt über Nacht im Eisbad stehen,
saugt ab und trocknet im Vakuum bei gewöhnlicher Temperatur. Die so erhaltenen Kristalle
werden mit Äther gewaschen, um einen gegebenenfalls vorhandenen Überschuß an Orcin
zu entfernen, und erneut im Vakuum bei gewöhnlicher Temperatur getrocknet. Die so
erhaltenen dunkelroten Kristalle (271 mg) sind in Aceton und Äther unlöslich und
in Alkohol löslich. Sie dissoziieren in Wasser unter Freisetzung von Vitamin Bl2.
Sie enthalten 70, 1°/o Vitamin Bis. Beim Trocknen im Vakuum bei 60°C verlieren sie
9, 9% ihres Gewichts an Wasser. Das so getrocknete Produkt enthält 76 °/0 Vitamin
B12, was darauf hinweist, daß es sich um eine Kombination von 4 Molekülen Orcin
mit einem Molekül Vitamin B12 handelt.
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Analyse : Vitamin B12 Orcin (für das wasserfreie Produkt) Berechnet...
C 59, H 6, 53, N10, 58, B12 73,19%; gefunden.. C 58, 8, H 6, 6, N 11, 1, B12 76
%.
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Hydratation, berechnet nach dem Verlust : 11 H2O Diese Verbindung
ist in der Literatur noch nicht beschrieben worden.
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Durch Lösen in 100 Teilen Wasser und Zugabe von 10 Volumina Dioxan
oder Aceton gewinnt man das kristallisierte Vitamin B12 mit einem Gehalt von über
95 0/, und in praktisch quarititativer Ausbeute zurück.
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Bespiel 4 Bildung des hydratisierten Komplexes Vitamin B12-Phloroglucin
Man arbeitet, wie im Beispiel 3 beschrieben, verwendet jedoch für 20 ccm einer wäßrigen
Lösung von 200 mg Vitamin B12 200 mg Phoroglucin. Man erhält so 113 mg dunkelrote
Kristalle, die in Aceton und Äther unlöslich und in Alkohol löslich sind. Sie dissoziieren
in Wasser unter Freisetzung von Vitamin Bl2 und enthalten 83% Vitamin 812. Beim
Trocknen im Vakuum bei 60°C verlieren sie 8, 8% ihres Gewichts an Wasser. Das so
getrocknete Produkt enthält 90 °/0 Vitamin Bl2, was darauf hinweist, daß es sich
um eine Kombination von 2 Molekülen Phloroglucin und 1 Molekül Vitamin BI. mit einem
Gehalt von 8 bis 9 H2O handelt.
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Analyse : Vitamin B12 Phloroglucin (für das wasserfreie Produkt) Berechnet..
C 56, 03, H 6, 27, N12, 19, B1284,33% ; gefunden.. C 56, H 6, 2, N 11, 9, B12 90
°/0.
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Diese Verbindung ist in der Literatur noch nicht beschrieben worden.
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Beispiel 5 Bildung des hydratisierten Komplexes Vitamin B12-Hydrochinon
Man arbeitet, wie im Beispiel 3 beschrieben, verwendet jedoch für 20ccm einer wäßrigen
Lösung von 200 mg Vitamin B12 1 g Hydrochinon. Man erhält so 142 mg dunkelroter
Kristalle, die in Aceton und Ather unlöslich und in Alkohol löslich sind und in
Wasser unter Freisetzung von Vitamin Bl2 dissoziieren. Sie enthalten 72, 5% Vitamin
B12. Beim Trocknen im Vakuum bei 60°C verlieren sie 7, 6°/o ihres Gewichts an Wasser.
Das enthydratisierte Produkt enthält 78 °/0 Vitamin Bt2, was darauf hinweist, daß
es sich um eine Kombination von 4Molekülen Hydrochinon und 1 Molekül Vitamin B12
handelt.
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Analyse : Vitamin B12 Hydrochinon Berechnet... C 58, 19, H 6, 28,
N10, 92, B12 75,4% ; gefunden.. C 58, H 6,1, N 11, 2, B12 78 %.
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Dieses Produkt ist in der Literatur noch nicht beschrieben worden.
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Bei der Angabe der Formeln sowei der Analysenwerte wurde die neuerdings
von Crowfoot Hodgkin und Mitarb. (Nature, 1956, 178, S. 65) für Vitamin2 aufgestellte
Formel C63h88N14O14PCo zugrunde gelegt.
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Beispiel 6 Zu 40 ccm einer wäßrigen Lösung von 585 y pro ccm reinem
Cyanocobalamin fügt man 2 °/o Phenol hinzu und läßt 48 Stunden bei Raumtemperatur
unter schwachem Animpfen mit einigen Kristallen des Komplexes stehen, worauf man
den Niederschlag abtrennt, mit Aceton wäscht und trocknet. Man erhält 19 mg des
kristallinen Komplexes, der, wie sich aus einer spectrophotometrischen Titrierung
ergibt, 16, 3 mg reines Vitamin B12, d. h. 69 °/o, enthält. Die Mutterlaugen enthalten
noch 180 y pro ccm, d. h. insgesamt 7, 2 mg B12 oder noch 30 °/0.