DD232066A1

DD232066A1 - Verfahren zur chemischen bindung von biologischen materialien an feste phasen

Info

Publication number: DD232066A1
Application number: DD26989584A
Authority: DD
Inventors: Thomas Montag; Hans-Juergen Tietz; Werner Schoessler; Wolfgang Guenther
Original assignee: Univ Berlin Humboldt
Priority date: 1984-11-27
Filing date: 1984-11-27
Publication date: 1986-01-15

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Immobilisation von biologischen Zellen, Geweben sowie Viren an siliziumdioxidhaltige Oberflaechen. Dabei wird die siliziumdioxidhaltige Oberflaeche mit Silanhaftmitteln und gegebenenfalls zusaetzlich mit anderen geeigneten Reagenzien chemisch modifiziert. An die solcherart veraenderte siliziumdioxidhaltige Oberflaeche koennen die biologischen Materialien ueber auf ihnen enthaltene funktionelle Gruppen chemisch konvalent gebunden werden. Der Vorteil des Verfahrens besteht darin, dass bei dieser Art der Immobilisation weder morphologische noch funktionelle Beeintraechtigungen der Zellen, Gewebe und Viren eintreten.

Description

Dabei kann die chemische Bindung zwischen den biologischen Materialien und der modifizierten siliziumdioxidhaltigen festen Phase in Abhängigkeit von der Art der Modifikation und/oder des biologischen Materials bei pH-Werten zwischen 2,5 und 11,5 erfolgen. Andere Zusätze können notwendig sein, um Veränderungen der biologischen Materialien vorzubeugen oder zu verhindern. Die Konzentration der biologischen Materialien in der Dispersion wird zweckmäßigerweise so gewählt, daß eine vollständige Bindung an die modifizierte siliziumdioxidhaltige feste Phase erfolgen kann. Die biologischen Materialien können tierische oder/und pflanzliche Zellen und/oder Gewebe und/oder Mikroorganismen

jj.n_d/oderyiren sein. - -

Die Größe der Formkörper hat keinen Einfluß auf das Verfahren, sollte sich aber zweckmäßigerweise zwischen 0,01 cm³ und 100 m³ bzw. zwischen 0,001 cm² und 1 m² bewegen. Die Gestalt der Formkörper kann alle nur denkbaren geometrischen Konfigurationen annehmen, dabei offen oder geschlossen sein. Die Modifikation der Formkörper-Oberflächen erfolgt auf an sich bekannte Weise mit Silanhaftmitteln und/oder hetero- oder homobifunktionellen Reagenzien.

Die Bindung der Zellen und Gewebe und Viren an die feste Phase erfolgt überfunktioneile Gruppen auf den Oberflächen der biologischen Materialien. Dabei werden Puffer, Elektrolyte und/oder andere Zusätze (Beispiel: phosphatgepufferte Kochsalzlösung = PBS) verwendet, die weder die funktionellen Gruppen der biologischen Materialien noch die der modifizierten

festen Phasen blockieren. ~

Die solcherart gebundenen Zellen, Gewebe und Viren können ohne weitere Nachbehandlung bei erhaltener biologischer Funktion sowie ihrer Struktur für diagnostische, wissenschaftliche und biotechnologische Zwecke eingesetzt werden.

Überraschenderweise erfolgt eine so starke Fixierung, daß Nachfolgeschritte wie mehrere Waschvorgänge nicht zum Ablösen der Zellen führen.

Denkbar ist auch ein Einsatz des erfindungsgemäßen Verfahrens für den künstlichen Organersatz.

Ausführungsbeispiel 1

Handelsübliche Objektträger aus Glas (20 x 80mm) werden in eine 1%ige Lösung von Aminopropyläthoxysilan in Äthanol/ Wasser (1:1) getaucht und bei 5O⁰C für 4 Stunden inkubiert. Nach dreimaligem Waschen in PBS, pH 7,2, werden die Objektträger in eine 2%ige Glutardialdehyd-Lösung in PBS getaucht, für weitere 2 Stunden bei 37⁰C inkubiert und wiederum dreimal in PBS gewaschen. Nach dem Trocknen werden auf jeden Objektträger 0,1 ml einer Suspension humaner Lymphozyten (1,5 x 10⁶ Zellen/ml, auf üblichem Wege durch Gradientenzentrif ugation aus Vollblut isoliert) aufgebracht. Anschließend läßt man die Zellen 15 Minuten bei 37⁰C in einer feuchten Kammer sedimentieren. Beim Auftreffen der Zellen auf die modifizierten Glasoberflächen erfolgt kovalente Bindung zwischen Aminogruppen der Zelloberflächen und dem an das Glas gebundene Glutardialdehyd. Nach Abspülen der Objektträger wird ohne weitere Behandlung auf üblichem Wege gefärbt. Als Kontrollen dienen einmal unmodifizierte, intensiv gereinigte Objektträger sowie analog o. g. Verfahren modifizierte Objektträger, deren Aldehydgruppen mit Glycin abgesättigt wurden. Diese Träger werden mit derselben Lymphozytensuspension in o. g. Art und Weise beschickt. Die folgende Tabelle zeigt die Zahl der gebundenen Zellen in den drei angegebenen Verfahren:

Zahl dergebundenen Zahl der gebundenen Zahl dergebundenen

Zellen auf erfindungs- Zellen auf erfindungs- Zellen auf normalen,

gemäß modifizierten gemäß modifizierten intensiv gereinigten

Objektträgern Objektträgern, Aldehyd- Objektträgern

gruppen abgesättigt

χ s χ s xs

73,05 8,24 21,40 8,70 29,90 5,67

(lichtmikroskopische Auswertung von jeweils 5 Gesichtsfeldern auf 5 Präparaten pro Ansatz)

Ausführungsbeispiel 2

Analog Beispiel 1 modifizierte Glasobjektträger werden mit einer Suspension aus Brucella mellitensis in PBS, pH 7,2, (10⁶ Zellen pro ml) beschichtet und für 15 Minuten bei 37⁰C in einer feuchten Kammer inkubiert. Anschließend erfolgt die Färbung nach GRAM in der üblichen Methodik. Im Gegensatz zu konventionell hergestellten Kontrollpräparaten (Hitzefixierung) zeigen sich Bakterien, die sowohl bezüglich morphologischer Struktur als auch Farbbrillanz bessere Parameter aufweisen.

Ausführungsbeispiel 3

Handelsübliche Petrischalen (010cm) werden mit 25ml einer 1%igen Lösung Glycidoxysilan in Äthanol/Wasser (1:1) beschickt und für 18 Stunden bei 4°C inkubiert, danach gewaschen und anschließend hitzesterilisiert. Danach werden 25ml einer Suspension von Escherichia coli K12 in PBS, pH 5,5, Keimzahl 10⁸/ml, eingegeben und wiederum für 4 Stunden bei Zimmertemperatur inkubiert. Nach Waschen unter sterilen Kautelen mit PBS, pH 7,2, werden die am Boden der Petrischale gebundenen Bakterien mit Nähragar überschichtet und anschließend bei 37°Cfür 18 Stunden bebrütet. Im Ergebnis zeigt sich dichtes Koloniewachstum."

Claims

Erfindungsanspruch:

1. Verfahren zur chemischen Bindung von biologischen Materialien, vorzugsweise von Zellen, Geweben sowie Viren, an feste Phasen, gekennzeichnet dadurch, daß als feste Phase Formkörper verwendet werden, die siliziumdioxidhaltige, chemisch modifizierte Oberflächen aufweisen und daß diese Formkörper mit einer wäßrigen Dispersion in Kontakt gebracht werden, welche die biologischen Materialien, Elektrolyte und/oder Puffer und/oder andere Zusätze enthält, wobei die wäßrige Dispersion organische Lösungsmittel bis zu 50% enthält und das pH der wäßrigen Dispersion zwischen 2,5 und 11,5 beträgt.
2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß als Formkörper gläserne, glasartige sowie keramische und/oder mit vorgenannten Materialien überzogene Körper verwendet werden.
3. Verfahren nach Punkt 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß die eingesetzten 3dimensional nutzbaren Formkörper halbkugelförmige, kugelförmige, zylinderförmige, würfelförmige, kegelförmige, spiralförmige und/oder aus vorgenannten Formen kombinierte Gestalt haben, daß sie sowohl Kompakt- als auch Hohlkörper sind, daß die Hohlkörper offen oder geschlossen sind und daß das Volumen der Formkörper 0,01 cm³ bis 100 m³ beträgt.
4. Verfahren nach Punkt 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß die 2dimensional nutzbaren Formkörper planbar sind, deren Oberfläche in regelmäßig abgeteilte Bezirke eingeteilt sein kann, wobei die Fläche der planaren Formkörper 0,001 cm² bis 1 m² beträgt.
5. Verfahren nach Punkt 1 bis 4, gekennzeichnet dadurch, daß die Modifikation der Formkörper mit Silanhaftmitteln und/oder hetero- und homobifunktionellen Reagenzien erfolgt.
6. Verfahren nach Punkt 1 bis 5, gekennzeichnet dadurch, daß die angegebenen Zellen, Gewebe und Viren alle (aber nicht ausschließlich) menschlichen, tierischen und pflanzlichen Zeilen, Gewebe und Viren sowie Bakterien, Parasiten und Pilze sind.
7. Verfahren nach Punkt 1 bis 6, gekennzeichnet dadurch, daß gleichzeitig mehrere und/oder verschiedene Zellen, Gewebe sowie Viren und/oder Kombinationen aus vorgenannten biologischen Materialien gebunden werden.

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Immobilisation von biologischen Zellen, Geweben sowie Viren an siliziumdioxidhaitige Oberflächen, vorzugsweise aus Glas. Diese Technik findet Anwendung in der medizinischen Forschung, Diagnostik und Therapie, der Biotechnologie sowie der biowissenschaftlichen Forschung.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Die Bindung von Zellen und Geweben an Oberflächen wird u. a. für Arbeiten mit Zellkulturen insbesondere bei biotechnologischen sowie diagnostischen Verfahren, für die kultivierte Zellen die Voraussetzung bilden, z. B. Virusvermehrung, Herstellung von monoklonalen Antikörpern, beim künstlichen Organersatz sowie bei morphologischen Untersuchungen (Lichtbzw. Fluoreszenzmikroskopie, Elektronenmikroskopie) eingesetzt. Die Fixation von Mikroorganismen und Viren hat sowohl für diagnostische als auch für biotechnologische Verfahren große Bedeutung.

Die Bindung o. g. Materialien an geeignete Oberflächen wird einmal durch unspezifische Adsorption und nachfolgendes Fixieren gelöst, was zwangsläufig zu Veränderungen und zum Absterben der biologischen Materialien führt. Ein zweiter Weg besteht im Beschichten der entsprechenden Oberfläche mit einer Matrix (Gelatine, Agarose, Dextrane, Proteine u.a.), an die in einem zweiten Schritt die Adsorption oder Bindung erfolgt.

In den beiden Patentanmeldungen DD-WP G 01 N/2499925 und DD-WP G 01 N/2538484 wird die Bindung von Proteinen an Glasoberflächen und deren Einsatz im Immunoassay beschrieben. Mit der dort angegebenen Methodik ist es nicht möglich, biologische Zellen und Gewebe sowie Viren über die auf ihrer Oberfläche befindlichen funktionellen Gruppen kovalent an chemisch modifizierte siliziumdioxidhaltige Materialien zu binden.

Im US-Patent 4357142 wird u.a. die kovalente Bindung von Bakterien und Pilzen an Glasoberflächen beschrieben. Die Autoren verwenden jedoch eine nur adsorptiv an die Glasoberfläche angelagerte Matrix und binden daran Bakterien und Pilze, so daß keine vollständige kovalente Bindung zwischen Glas und biologischem Material vorliegt.

Im DDR-Patent WP C 12 N/262260 wird die kovalente Bindung von Mikroorganismen an Papier beschrieben. Hier wird jedoch kein siliziumdioxidhaltiger Träger verwendet.

Verfahren zur chemisch kovalenten Bindung von biologischen Zellen und Geweben sowie Viren an siliziumdioxidhaltige Oberflächen mit Hilfe von Silanhaftmitteln sind nicht bekannt.

Ziel der Erfindung

Das Ziel der Erfindung besteht darin, biologische Materialien auf einfache Art und Weise an feste Phasen so zu binden, daß diese Materialien bei diagnostischen, therapeutischen, wissenschaftlichen und biotechnologischen Verfahren wiederholt eingesetzt werden können.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Die Aufnabe der Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur chemischen Bindung von biologischen Materialien an siliziumdioxidhaltige feste Phasen zu entwickeln, bei dem strukturelle und funktioneile Beeinträchtigungen der gebundenen Materialien vermieden werden und damit gegebenenfalls die Lebensfähigkeit dieser Materialien erhalten bleibt. Die Vorteile eines solchen Verfahrens bestünden darin, daß

— bei morphologischen Untersuchungen (z.B. Aussagen über Zellmembranrezeptoren mit Hilfe markierter Antikörper) eine exaktere Aussage getroffen werden kann, da Fixation der Objekte Voraussetzung für solche Untersuchungen ist und mit konventionellen Verfahren (z. B. organische Lösungsmittel) eine Veränderung der Materialien erfolgt.

— bei biotechnologischen Verfahren die Fixation der lebenden Zellen (z. B. tierische Zellen oder Bakterien) möglich ist, so daß eine weniger aufwendige Trennung'der Produkte (z. B. gentechnisch produzierte Proteine, monoklonale Antikörper) von ihren Produzenten erfolgen kann.

— in siliziumdioxidhaltigen festen Phasen (z. B. Glas, Keramik) ein nahezu idealer Träger bezüglich mechanischer und chemischer Stabilität einsetzbar wäre, was sowohl eine große Breite der Nachfolgeverfahren als auch die häufige Wiederverwendbarkeit garantiert.

Die Aufgabenstellung der Erfindung wird dadurch gelöst, daß die biologischen Materialien in eine wäßrige Lösung gebracht werden, die Elektrolyte und gegebenenfalls Puffer und/oder andere Zusätze enthält, und diese Dispersion mit Formkörpern in Kontakt gebracht wird, die siliziumdioxidhaltige, chemisch modifizierte Oberflächen aufweisen.