CZ411797A3 - Nové peptidy odvozené z lidského proteinu tepelného šoku 60 pro léčbu diabetes mellitus, farmaceutické přípravky, způsoby léčení a diagnostické soupravy - Google Patents

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká nových peptidů, které jsou epitopy lidského proteinu tepelného šoku o velikosti 60 kD (heat shock protein 60 - hsp60) a farmaceutických přípravků, které je Obsahují, pro diagnózu a léčbu diabetes mellitus závislého na inzulínu <inzulín-dependentní diabetes mellitus - IDDM).

Dosavadní stav techniky

Diabetes mellitus I. typu, nebo IDDM, je autoimunitní nemoc způsobená T buňkami, které napadají a ničí β buňky produkující inzulín lokalizované v ostrůvcích pankreatu (Castáno a Eisenbarth, 1990). Autoimunitní proces vrcholící v IDDM začíná a progrcduje bez příznaků. Nemoc se klinicky projeví pouze tehdy, když kumulativní ztráta β buněk přesáhne kapacitu reziduálních β buněk krýt potřebu • inzulínu. Vskutku se předpokládá, že kolaps glukózové homeostazy a klinicky IDDM nastane pouze tehdy, když je *

imunitním systémem inaktivováno 80 až 90 % β buněk. Takže pacienti, u kterých je rozpoznáno onemocnění IDDM, jsou v pokročilém stadiu autoimunitní destrukce svých β buněk.

Φ Φ φ φ · φ

Navíc diagnóza počínajícího preklinického diabetů detekcí imunologických markérů autoimunity proti β buňkám se může provádět až po propuknutí autoimunitního procesu. Proto je požadavek léčby nalézt bezpečný, specifický a účinný způsob, jak zastavit autoimunitní proces, který je již v běhuPředkladatelé tohoto vynálezu zkoumali již předtím tuto otázku studiem spontánního diabetů vyvíjejícího se u myší kmene NOD, který je považován za věrný model lidského IDDM (Castano a Eisenbarth, 1990). U myší NOD se vyvíjí přibližně ve 4 týdnech věku inzulitida, která začíná jako mírný infiltrát v okolí ostrůvků a progreduje do vážného zánětu uvnitř ostrůvků. U samic naší kolonie začíná ve věku 14 až 17 týdnů hyperglykémie, která svědčí pro inzulínovou nedostatečnost. Ve věku 35 až 40 týdnů se téměř u všech samic myší NOD vyvinul vážný diabetes a při nepřítomnosti léčby inzulínem většina zemřela. U samců myší NOD je nižší výskyt nemoci z ne zcela známých důvodů- Bylo prokázáno, že diabetes myší NOD je způsoben autoimunitními T buňkami (Bendelac a kol., 1987).

U lidských pacientů s IDDM stejně jako u myší NOD byla detekována T buněčná reaktivita a autoprotilátky na různé antigeny (Elias, 1994) a není jasné, zda primární příčinou nemoci je imunita na každý jednotlivý z možných cílových antigenů. Za otázkou příčiny se skrývá otázka léčby.

Bylo dokázáno, že se může zabránit zahájení autoimunitního procesu u myší NOD, jestliže se myš předtím,

9999 než se projeví diabetes, podrobí různým ošetřením jako je restrikční dieta, virové infekce nebo nespecifická stimulace imunitního systému (Bovman a kol., 1994). U prediabetických myší NOD je také možno předejít diabetů navozením imunologické tolerance k antigenu - dekarboxy1áze glutamové kyseliny (Kaufman a kol., 1993, Tisch a kol., 1993).

Diabetes mellitus závislý na inzulínu (IDDM), který se vyvíjí spontánně u samic myší NOD, je spojován s imunitní reaktivitou na různé druhy vlastních antigenů (Bach, 1994).

Mezi těmito antigeny je význačný peptid p277 ze sekvence molekuly savčího proteinu tepelného šoku o velikosti 60 kD (heat shock protein - hsp60). To odpovídá zbytkům 437 až 460 v lidské molekule hsp60 (Elias a kol., 1991, patentová přihláška Izraele č. 94241, patentová publikace PCT V090/10449). Lidský peptid p277 má následující sekvenci:

Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Cys-ftla-Leu-Leu-ftrg-Cys-Ile-Profila-Leu-Asp-Ser-Leu-Thr-Pro-Ala-Asn—Glu-Asp (aminokyseliny 437 až 460 ze sekvence s identifikačním číslem 1).

Před i abet i cké myši NOD projevují spontánní diabetogenní T buněčné reakce na hsp60 a na lidské (2) nebo myší varianty peptidu p277 (3). Myší a lidské peptidy se liší o jednu aminokyselinu a imunologicky zkříženě reagují (3). U některých kmenů myší, k diabetů, jako je C57BL/6, které nejsou náchylné se vyvíjí přechodná hyperglykémie a inzulitida, když jsou imunizovány p277 kovalentně konjugovaným s cizorodou imunogenní nosičskou ·· ···· molekulou (4). A u myší kmene C57BLZKsJ se vyvíjí spontánní T buněčné reakce na hsp60 a na p277 po ošetření velmi nízkou dávkou toxinu pro β buňky streptozotocinu <STZ), který vyvolává autoimunitní diabetes <5).

Kromě toho, že je zapojen do projevů nemoci, peptid p277 se jeví funkční v hojení autoimunitního procesu; subkutánní podávání p277 v neúplném Freundove adjuvans (IFA, minerální olej) vedlo k zastavení postupu nemoci u mladých myší NOD C2) nebo u myší NOD starých 12 až 17 týdnů s pokročilou inzulitidou C6, 7). Byly účinné obě varianty p277, jak lidská <6, 7), tak myší Í3). Myši NOD transgenní pro myší gen hsp60 na promotoru MHC třídy II vykazovaly utlumení svých spontánních T buněčných proliferačních odpovědí na p277 a významný podíl myší byl ušetřen vývoje diabetů (8). Kromě toho podávání p277 myším C57BL/KSJ přerušilo vývoj autoimunitního diabetů u myší, které dříve obdržely velmi nízkou dávku STZ, ošetření těchto myší peptidem molekuly GAD65 nebylo účinné (9).

Varianty peptidu p277, ve kterých byly jeden nebo oba cystěinové zbytky v pozicích 6a 11 nahrazeny zbytky val inu, označené jako p277(Val⁶), p277(Val¹¹) a p277(Val⁶-Val¹¹), byly popsány v odpovídající patentové přihlášce Izraele č. 112094, a bylo prokázáno, že jsou v léčbě diabetů aktivní stejnou měrou jako p277.

Předmětem předkládaného vynálezu je poskytnout další peptidy lidského hsp60. které jsou použitelné pro diagnózu a léčbu IDDM.

Podstata vynálezu

Při studiu fragmentů a peptidfl molekuly lidského hsp60 bylo nečekaně shledáno, že pacienti s IDDM a myši NOD jsou responzivní na další T buněčné epitopy hsp60, které mohou být použity pro diagnózu a léčbu IDDM. Tyto epitopy samy nebo ve spojení s p277 nebo variantou p277 vybranou z p277(Val⁶), p277(Val¹¹) a p277(Val⁶-Val¹¹), mohou zlepšit účinnost léčby Tyto nové peptidy jsou uvedeny v tabulce 1.

Tabulka 1

Syntetické peptidy hsp60 a jejich sekvence

Peptidy	Čísla zbytků ze sekvence s i.č. 1
p3	31-50
P10	136-155
pil	151-170
P12	166-185
P14	195-214
pl8	255-274
p20	286-305
P24	346-365
p29	421-440
P30	436-455
P32	466-485
p35	511-530
p39	343-366

Aminokyselinová sekvence <jednopísmenný kód)

KFGADARALMLQGVDLLADA NPVEIRRGVM1.AVDAVIAEL VIAELKKQSKPVTTPEEIAQ EEIAQVATISANGDKEIGNI RKGVITVKDGKTLNDELEII QSIVPALEIANAHRKPLVIIA LVLNRLKVGLQVVAVKAPGF GEVIVTKDDAMLLKGKGDKA VTDALNÁTRAAVEEGIVLGG IVLGGGCALLRCIPALDSLT ElIKRTLKIPAMTIAKNAGV VNMVEKGI1DPTKVVRTALL GKVGEVIVTKDDAM

Ukázalo se, že další peptidy hsp60, včetně těch označených p278 (odpovídá pozicím 458 až 474 v sekvenci lidského hsp60), pl9 (odpovídá pozicím 271 až 290 v sekvenci lidského hsp60) a p21 (odpovídá pozicím 301 až 320

9· 99 ΦΦΦΦ 9999

9 9 9 9 9 9 9 99

9 999 9 9 9 9 999 φ φφ φφφ Φ ΦΦ ΦΦΦ Φ Φ

ΦΦΦΦ ΦΦΦΦ Φ ·· v sekvenci lidského hsp60), nebyly tak účinné. Za povšimnutí stojí, že amino- koncová část p278 se překrývá s účinným peptidem p277 třemi zbytky (NED) a karboxy- koncová část p278 se překrývá s účinným peptidem p32 devíti zbytky (EIIKRTLKI). Tedy je kritických zbývajících 11 zbytků p32 (PAMTIAKNAGV).

Předkládaný vynález se tedy týká peptidů uvedených v tabulce 1 a jejich solí a funkčních derivátů.

Dále je předmětem předkládaného vynálezu poskytnout způsoby a diagnostické soupravy pro časnou diagnózu IDDM za použití peptidů vynálezu. V průběhu rozvoje IDDM zvířata exprimují molekuly hsp60 nebo molekuly, které reagují zkříženě, a které najdou cestu do krve a moči zvířat. Exprimují také protilátky a T buňky specificky nasměrované k takovým molekulám. Tak výskyt hsp60 (nebo molekul, které reagují zkříženě) nebo protilátek nebo T buněk k němu specifických v krvi nebo moči slouží jako test pro detekci procesu IDDM předtím, než je ukončena destrukce β buněk a jedinec je odsouzen k celoživotnímu diabetů.

Výskyt nebo počátek diabetů u pacienta může být diagnostikován testováním pacientovy krve nebo moči na přítomnost proti 1átek nebo T buněk, které jsou imunologicky reaktivní s lidským hsp60, při použití jako antigenu peptid P12 nebo p32 podle vynálezu.

Předkládaný vynález tudíž poskytuje diagnostický způsob rozpoznání výskytu nebo počátku IDDM u pacienta, tento způsob zahrnuje testování uvedeného pacienta na • « · · · · přítomnost protilátek anti-hsp60 nebo T bulíky. která

Imunologicky reaguje s hsp60, způsob používá peptid předkládaného vynálezu jako antigen, pomocí něhož výsledek uvádějící pozitivní výskyt protilátek anti-hsp60 nebo

T buňky, která imunologicky reaguje s hsp60. ukazuje vysokou pravděpodobnost výskytu nebo počátku IDDM.

V diagnostickém způsobu rozpoznání IDDM je pacient testován na přítomnost protilátek anti-hsp60, kde uvedený způsob testování zahrnuje imunoradiologický test nebo test ELISA.

Pacient může být také testován na výskyt T buňky, která imunologicky reaguje s hsp60. V jednom provedení Způsob testování zahrnuje test buněčné proliferace T buněk, který obsahuje kroky:

(i) příprava frakce mononukleárních buněk obsahující

T buňky ze vzorku krve získaného od uvedeného pacienta, (ii) přidání antigenu vybraného z peptidfi vynálezu k uvedené frakci mononukleárních buněk.

(iii) inkubace uvedené buněčné frakce v přítomnosti uvedeného antigenu po vhodné časové období a za vhodných kultivačních podmínek, (iv) přidání značeného nukleotidu k inkubované buněčné kultuře (Iii) ve vhodnou dobu před koncem uvedeného inkubačního období tak, aby se zajistila inkorporace uvedeného značeného nukleotidu do DNA proliferujících T buněk, a (v) určení množství proliferujících T buněk analýzou množství značeného nukleotidu inkorporovaného do uvedených T buněk.

V kroku Civ) výše je nukleotid výhodně ³H-thymidin. Určení množství proliferujících T buněk se provádí vypočtením stimulačního indexu T buněk standardními metodám i.

V dalším provedení této stránky vynálezu způsob testování zahrnuje cytokinový responzivní test T buněk, ve kterém jsou kroky (i) až (iii) jako ve výše uvedeném proliferačním testu T buněk a ve čtvrtém kroku (iv) se detekuje standardním způsobem komerčně dostupnými soupravami přítomnost cytokinú, jako je IFN-gama, IL-2, IL-6, IL-10, TNF<x nebo TNF<3, které jsou secernovány odpovídajícími lymfocyty do média.

Z dalšího hlediska vynález poskytuje in v Ivo způsob, kde je antigen vybraný z peptidů vynálezu injikován subkutánně pacientovi a sleduje se výskyt detekovate1né kožní reakce (typ reakce pozdní přecitlivělosti, DTH).

Předkládaný vynález se také týká prostředků pro provádění těchto testů, a také diagnostických souprav (kitů) pro provádění takových testů. Kity jsou připraveny pro provádění jakéhokoliv z různých testů používaných pro uskutečnění předkládaného vynálezu. Každý takový kit obsahuje všechen materiál nezbytný pro provedení jedlnoho testu nebo určitý počet testů. Například kit na určování přítomnosti protilátek anti-hsp60 obsahuje peptid vynálezu imobi1izovaný na pevné fázi a označenou protilátku schopnou rozpoznat nevariabilní oblast protilátky anti-hsp60, která má být detekována, jako je označený anti-lidský Fab. Kit také obsahuje návody pro použití kitu a nádobky obsahující materiál kitu. Může být použito jakékoliv obvyklé značení nebo značka, jako je radioizotop, enzym, chromofor nebo fluorofor. Typický radioizotop je jód-125 nebo síra-35. Enzymy typické pro tento účel zahrnují křenovou peroxidazu, křenovou galaktosidázu a alkalickoufosfatázu.

Diagnostická souprava pro rozpoznávání výskytu IDDM testováním na přítomnost protilátek anti-hsp60 obsahuje:

(i) antigen vybraný z peptidů vynálezu, a (i i) označenou protilátku schopnou rozpoznat nevariabilní oblast uvedených protilátek anti-hsp60, které ma j í být detekovány.

Diagnostická souprava pro rozpoznávání výskytu IDDM testováním na přítomnost T buňky, která imunologicky reaguje s hsp60 obsahuje^ (i) antigen vybraný z peptidů vynálezu, (i i) živné médium vhodné pro kultivaci lymfocytfi (T buněk), a (iii) buď značený nukleotid pro prolifeřační test T buněk, nebo cytokin, např. interferon-gama, pro cytokinový test.

Pro test in vivo bude kit obsahovat pouze peptid vyná1ezu ve vhodné formě pro i n j ekc i.

Předkládaný vynález se dále týká prostředků pro prevenci nebo léčbu IDDM. Vakcinace peptidovým antigenem

• »		• 0	00		0 0 0 0	0 0		99
•	0	0	O	0	0	0 9	9	9
•	•	• 00	9	0	0	9 9		9 9
•	•	• 0	0 «	0	0	0 999	9	9
•		0 0	0	0	0 9	9	9	9
00		0 0	0 0		• 0	9 9		99

předkládaného vynálezu mfiže poskytnout specifické utlumení autoimunity k antigenu a účinně vytváří rezistenci na autoimunitní proces IDDM. Totéž je pravdou s ohledem na vakcinaci T buňkami specifickými pro takové antigeny, v oslabené nebo nevirulentní formě nebo poté, co byly ošetřeny tak, aby se zlepšila jejich antigeničnost, nebo jejich fragmenty či aktivními částmi. Jestliže se prokáže, že pacient je již v preklinických počátečních stadiích IDDM, mfiže injekce takového antigenu nebo T buňky (nebo části) vyvolat utlumení autoimunity pro tento antigen, a tak zastavit autoimunítní proces předtím, než nastane významné stálé poškození. Peptid mfiže být také použit jako léčebný přípravek k zastavení autoimunitního procesu dokonce i poté, co je dalece pokročilý, jak bylo nedávno ukázáno v laboratoři předkladatelů vynálezu, co se týče léčení myší NOD peptldem p277 (Elias a Cohen, 1994).

Předkládaný vynález tudíž poskytuje přípravek pro prevenci a léčbu diabetes mellitus závislého na inzulínu (IDDM), obsahující- (a) T buňky, které mají vyvinutou specifitu pro protein nebo peptid, který imunologicky zkříženě reaguje s peptidem vynálezu, tyto buňky jsou aktivovány inkubací v přítomnosti uvedeného peptidu, (b) uvedené T buňky, které byly ozářeny nebo jinak oslabeny, (c) uvedené T buňky, které byly tlakově ošetřeny pomocí hydrostatického tlaku, ošetřeny chemickým zesilovacím agens a/nebo ošetřeny vazebným/zesíťovacím agens k cytoskeletu, (d) fragmenty nebo celé povrchové proteiny uvolňované z (a), ·· φφ • · φ· • ····· • · ·· 9 · • · Φ· Φ ·· φφφφ

Φ· ·ί Φ Φ · · · Φ • · · · ·· • · · ΦΦΦΦ · • · · · · · <b) nebo (c), nebo <e) peptid skládající se vpodstatě z variabilní oblasti receptoru Ca) specifického pro uvedený protein nebo jeho sfil, funkční derivát, prekurzor nebo akt i vn í f rakci.

Ve výhodném provedení vynálezu přípravek obsahuje lidské T buňky, u kterých se vyvinula specifita in vitro kontaktem s uvedeným peptidem vynálezu.

Předkládaný vynález také poskytuje farmaceutický přípravek pro prevenci nebo léčbu IDDM obsahující farmakologicky přijatelný nosič a, jako aktivní základ, účinné množství peptidu vynálezu, jeho sfil nebo funkční derivát.

Vynález se dále týká způsobu prevence nebo léčby IDDM, který zahrnuje podávání pacientovi, který to potřebuje, farmaceutický přípravek obsahující peptid vynálezu, jeho sůl nebo funkční derivát, nebo přípravek obsahující T buňky, u kterých je vyvinuta specifita k uvedenému peptidu vynálezu.

Kdekoliv je v předkládané specifikaci a patentových nárocích zmíněn peptid vynálezu” nebo jakékoliv z individuálních označení, jako je peptid pl2” nebo peptid p32, uvažuje se také o jejích solích a funkčních derivátech, pokud je zachována biologická aktivita peptidu s ohledem na diabetes.

Soli” peptidfi vynálezu, o kterých se uvažuje ve vynálezu, jsou fyziologicky přijatelné organické a anorganické soli.

• · · · · ·

Pojem funkční deriváty peptidů vynálezu, jak se v tomto textu používá, pokrývá deriváty, které jsou připraveny prostředky známými v oboru z funkčních skupin, které se vyskytují jako postranní řetězce na zbytcích nebo koncových částech N- či C-, a jsou do vynálezu zahrnuty pokud zůstávají farmaceuticky přijatelné, tj. neničí aktivitu peptidu, neudělují toxické vlastnosti přípravkům, které je obsahují, a nepůsobí nepříznivě na antigenní vlastnosti peptidu.

Tyto deriváty mohou například zahrnovat alifatické estery karboxylových skupin, amidy karboxy1ových skupin tvořené reakcí se čpavkem nebo s primárními nebo sekundárními aminy, N-acylové deriváty volných aminoskupin aminokyselinových zbytků tvořených reakcí s acylovými skupinami (např. alkanoylové nebo karbocyklické aroylové skupiny) nebo O-acýlové deriváty volné hydroxylové skupiny (například serylových nebo threonylových zbytků) tvořené reakcí s acylovými skupinami.

Peptidy vynálezu mohou být použity jako imunogen ve farmaceutických přípravcích, zejména vakcínách, pro zmírnění a léčbu IDDM, a také jako antigen v diagnostických prostředcích pro diagnózu IDDM. Tyto farmaceutické a diagnostické prostředky, které mohou být připraveny způsobem známým v oboru, tvoří také část předkládaného vyná1ezu.

Léčebný přípravek podle předkládaného vynálezu je možné podávat perorálně nebo parenterálně, jako subkutánně, • :... ... · · ·· : i....... · ;

* · · · · · · · · · · .· ·· ·· ·· ·· ·· intramuskulárně, intravenózně, intranazálně nebo i ntrarektá1ně.

Vynález bude nyní ilustrován neomezujícím způsobem následujícími příklady a doprovodnými obrázkyPopis obrázků

Obr. 1 ukazuje pozice peptidů, na které se v tomto textu poukazuje, přirazené k celkové sekvenci molekuly 1 i dského hsp60.

Obr. 2 ukazuje T buněčnou proliferaci na peptidy lidského hsp60 pl2, p32, p277 (Val⁶ až Val¹¹} a p278 u myší NODObr. 3 je graf ukazující pro1 iferaČní odpovědi

T buněk na peptidy u myší NOD- Skupiny tří myší NOD byly ošetřeny peptidy - myším pl2, myším p277, GAD-35 a MT-p278 v neúplném Freundově adjuvans - IFft v dávce 25 jug v IFft. Odvodně lymfatické uzliny byly odstraněny 10 dní později a testovaly se proliferační odpovědi na odpovídající peptidy v koncentracích 5, 10, 20 a 50 jig/m l. Je ukázána stimulace v optimální koncentraci 20 pg/ml. U kontrol se živným médiem byly získány následující rozpětí cpm= myší pl2 - 881, myší P277 - 1243, MT~p278 - 698 a GftD-p35 - 1430. Myší peptid p38 je peptid pocházející z myšího hšp60 (556 až 573), který nemá žádnou sekvenční homologii s testovanými peptidy a slouží jako negativní kontrola specifity. Tyto výsledky jsou reprezentativní pro tři provedené pokusy. Každý test • · • · byl proveden ve třech opakováních, pro které jsou směrodatné odchylky (SD) vyznačeny úsečkou. Mezi peptidy nebyla žádná zkřížená reaktivita (neukázáno).

Obr. 4 je graf ukazující účinek podávání peptidů na diabetes. Skupiny 10 až 20 myší NOD byly ošetřeny ve věku 10 týdnů 100 pg myšího pl2, p277, _P35-GAD nebo MT-p278 v IFA, nebo samotným IFA. Myším se jednou měsíčně odebírala krev a sledoval se počátek hyperglykémie. Při srovnání s kontrolní skupinou ošetřenou IFA byly myši ošetřené pl2 a p277 významně Chráněné, P<0,05.

Obr. 5 ukazuje proti látkové izotypy IgGl, IgG2a a IgG2b v odpovědi na ošetření peptidem. Myši byly ošetřeny, jak popsáno v legendě k obrázku 4. Jednotlivé vzorky byly analyzovány na protilátky k myšímu pl2 A, p277 B, GAD-p35 C, a MT-P278 D, z izotypů IgGl, IgG2a a IgG2b.

byly získány podobné výsledky. Výsledky jako absorbance ve 405 nm (OD) od deseti

Ve dvou pokusech j sou prezentovány jednot1 ivých myší v každé skupině.

Hladina významnosti prevalence protilátek

IgGl a IgG2b ve skupinách A a

B ve srovnání s

C a D je

P<0,001.

Odchylky mezí hladinami protilátek IgGl a

IgG2b ve srovnání s protilátkami IgG2a ve skupinách A a B byly významné (P<0,001). Mezi protilátkami nebyla žádná zkřížená reakt i v i ta (neukázáno).

Obr. 6 ukazuje negativní korelaci mezi protilátkami a glukózou v krvi. Skupina samic myší NOD byla ošetřena pl2 (10 myší) nebo samotným IFA (9 myší), jak popsáno v legendě k obrázku 4. Množství specifické protilátky anti-pl2 ( jednotky OD ELISA v séru nareděném

1--50 měsících věku) je vyneseno do glukózy v krv i ve veku 7 • · · · · · ·· ·* ·· měřeno v ♦ · • · ··· grafu spolu s koncentracemi měsíců- Stupeň korelace mezi • · •♦ • · •· •· vysokými protilátkami a glukózou v krvi je P<0,002.

Obr. 7 je graf ukazující proliferační odpovědi T buněk (SI) jednoho dárce s IDDM na pamětové antigeny, na protein hsp60 a na syntetické peptidy hsp60.

Obr. 8 je graf ukazující proliferační odpovědi T buněk (SI) zdravého dárce na pamětové antigeny, na protein hsp60 a na syntetické peptidy hsp60.

Obr. 9 je graf ukazující proliferační odpovědi T buněk (SI) dalšího dárce s IDDM na pamětové antigeny, na protein hsp60 a na syntetické peptidy hsp60.

Obr. 10A a 10B jsou grafy ukazující proliferační odpovědi T buněk (SI) dvou dárců s IDDM na syntetické peptidy hsp60.

Příklady provedení vynálezu

Materiál a metody (i) Myši. Inbrední samice myší kmene NOD/Lt byly dodávány z Animal Breeding Center z Veizmann Institute of Science, Rehovot, Izrael, nebo z Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME- U těchto myší se spontánně vyvíjí autoimunitní diabetes ve věku 14 až 17 týdnů, který napodobuje IDDM u lidí.

(ii)

AntigenyPeptidy byly syntetizovány ·* ····

v Department of Organic Chemistry z Veizmann Institute of Science za použití automatického syntetizátoru peptidů (model Abimed AMS 422, Langenfeld, Germany) podle firemních návodů pro Ν-α-fluorenmethoxykarbonylovou (Fmoc) syntézu. Hrubé produkty byly čištěny HPLC s reverzní fází na semipreparátivní koloně C8 (Lichrosorb RP-8, 7 mm, 250 x 10 mm, Měrek, Darmstadt, Germany). Eluce peptidů bylo dosaženo lineárními gradienty ustanovenými mezi 0,1% kyselinou trifluoroctovou ve vodě a 0,1% kyselinou trifluoroctovou v 75% acetonitrilu ve vodě (objem/objem)Čistota jednotlivých peptidových produktů byla zjištována analytickou HPLC s reverzní fází a aminokyselinovou analýzou- Peptid MT-p278 je ze sekvence mykobakteriálního hsp60 (431 až 447). p277 je substituován v pozicích 6 a 11 valinem (V) na místě cysteinu (C) v nativní sekvenci. Substituce dvou C zbytků V zvyšuje značně stabilitu peptidů bez ovlivnění jeho imunologické aktivity, V-substituovaný peptid reaguje plně zkříženě s nativním peptidem v proti látkových a T buněčných testech- Kdykoliv není blíže specifikováno, má se na mysli lidská sekvence. Myší peptidy pl2 a p38 pocházejí z molekuly myšího hsp60 a odpovídají pozicím 168 až 188, 437 až 460 a 556 až 573 jeho sekvence. Peptid GAD-p35 je z molekuly GAD65 (524 až 543). Aminokyselinové sekvence všech používaných peptidů jsou ukázány v tabulce 2.

• · • ··

Tabulka 2	- syntetické peptidy a jejich sekvence
Pept i dy	Sekvence s identif-	Ami nokyseli nová sekvence
	číslem:	(j ednop ísměnný kód)
Ρ3	1	(31-50)	KFGADARALMLQGVDLLADA
P10	1	(136-155)	NPVEIRRGVMLAVDAVIAEL
Pil	1	(151-170)	VIAELKKQSKPVTTPEEIAQ
P12	1	(166-185)	EEIAQVATISANGDKEIGNI
P14	1	(195-214)	RKGVITVKDGKTLNDELEII
P18	1	(255-274)	qsivpaleianahrkplviia
P20	1	(286-305)	LVLNRLKVGLQVVAVKAPGF
P24	1	(346-365)	GEVIVTKDDAMLLKGKGDKA
p29	1	(421-440)	VTDALNATRAAVEEGIVLGG
p30	1	(436-455)	IVLGGGCALLRCIPALDSLT
p32	1	(466-485)	ElIKRTLKIPAMT1AKNAGV
p35	1	(511-530)	VNMVEKGIIDPTKVVRTALL
p39	1	(343-366)	GKVGEVIVTKDDAM
P19	1	(271-290)	LVI 1 AEDVDGEALSTLVI.NR
p21	1	(301-320)	KAPGFGDNRKNQLKDMAIAT
P278	1	(458-474)	NEDQKIGIElIKRTLKI
P277(Val)		2	VLGGGVALLRVIPALDSLTPANED
myší pl2		3	EEIAQVATISANGDKDIGNÍ
MT-p278		4	EGDÉATGANIVKVALEA
GAD-P35		5	SRLSKVAPVIKARMMEYGTT
myší p38		6	PGMGAMGGMGGGMGGGMF

(iii) T buněčná proliferace na peptidy

Myši- Devět týdnů staré myši NOD nebo myši jiných kmenů byly imunizovány na chodidle zadní nohy 0,1 ml emulze obsahující 25 jig peptidu v kompletním Freundově adjuvans (CFA, Difco, Detroit, MI) smíšeném se stejným objemem fyziologického roztoku pufrovaného fosfátem (PBS). Odvodně popliteální lymfatické uzliny byly odstraněny 10 dnů později a suspenze lymfocytŮ v tkáňových kulturách ve třech opakováních byly testovány na proliferaci v přítomnosti různých peptidů <5 jmg/ml) za použití inkorporace ³H-thymidinu, jak popsáno (Elias a kol-, 1991). Výsledky jsou ukázány jako stimulační index (SI): poměr průměrného počtu impulzů za minutu (counts per m i nutě cpm)

···· ·· ·· • ♦ · · · • · · ♦· • · ···· · • · · · · ·· ·· ·· v přítomnosti testovaného peptidů k průměrnému cpm kontrolních kultur bez peptidů. Střední chyba průměru byla vždy méně než 10 % průměrů.

(iv) Ošetření a další sledování. Peptidy, 100 mg, v PBS, byly emulgovány se stejným objemem IFft a subkutánně injikovány do 10 týdnů starých samic NOD, jak popsáno (Elias a Eohen, 1995). Kontrolní myši obdržely stejný objem PBS emulgovaný v IFft. U nehladovějících myší se měsíčně sledovala hladina glukózy v krvi v 10 hod dopoledne za použití Blood Glucose Sensor (MediSense, lne., Valtham, Mfl). Myši s hladinou glukózy v krvi vyšší než 11,1 mmol/1 se považovaly za diabetické, tato koncentrace glukózy byla vyšší než 3 standardní odchylky od průměrné koncentrace glukózy v krvi měřené u nediabetických myší (Elias a Cohen, 1995). Histologické vyšetření ostrůvků pankreatu bylo provedeno na řezech barvených hematoxy1 inem a eosinem. Řezy byly posuzovány nezávisle dvěma pozorovateli, kteří si nebyli vědomi příslušnosti řezů ke skupinám. Pro zjišťování statistických odchylek mezi různými ošetřeními byl použit statistický chi kvadrát test.

(V) Sérové protilátky. Myším se měsíčně odebírala krev pro detekci proti látkové odpovědi. Prováděl se test ELISft, jak popsáno (Elias a kol., 1991). Ve stručnosti, destičky Maxisorb s plochým dnem (Nunc, Roskilde, Dánsko) byly pro detekci anti-peptidových protilátek povlečeny 100 jul/jamku peptidů v PBS v koncentraci 10 mg/ml po 2 hodiny při teplotě místnosti, což bylo následováno ·· ···· inkubací ve 4°C pres noc. Po inkubaci s peptidem byly destičky promyty a blokovány 7% BSA (Sigma) v PBS po 2 hodiny při 37°C. Poté byla přidána na 2 hodiny při 37°C séra naředěná 1:50, následovala inkubace po 2 hodiny při 37°C se 100 μΐ na jamku kozího anti-myšího IgG (specifický řetězec gamma Fc) konjugovaného s alkalickou fosfatázou (Jackson, Philadelphia, PA). Po promytí byly destičky inkubovány se substrátem, dietanolaminem (Sigma) a hodnoceny za použití čtecího zařízení pro testy ELISA ve 405 nm.

Příklad 1

Mapování epitopfl hsp60 u myší NOD

Byla testována imunogeničnost hsp60 peptidfi pl2, p32, p277(Val⁶-Val¹¹) a p278 u myší NOD imunizací myší peptidy emulgovanými v CFA do chodidla zadní nohy a testováním proliferačních odpovědí buněk z odvodných lymfatických uzlin po 10 dnech, jak popsáno výše v sekci iii(a). Jak je ukázáno na obr. 2, peptidy p277(Val⁶-Val¹¹), pl2 a p32 byly silně imunogenní, zatímco p278 byl neimunogenní.

Příklad 2

Ošetření myší NOD p277(Val⁶-Val¹¹), pl2 nebo p32

Aby se otestovalo, zda mohou peptidy pl2 a p32 blokovat vývoj diabetů jako p277(Val⁶-Val¹¹), byly subkutánně podávány peptídy ..pí^yCValfc-Val¹¹) , pl2 nebo p32 (100 pg v 0,1 cm³ emulze IFA) skupinám 10 až 12 týdnů starých samic myší NOD/Lt z Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME- Diabetes, určený jako stálé hladiny glukózy v krvi přes 11,1 mmol/1, byl testován ve věku 25 týdnů. Kontrolní myši byly neošetřeny nebo byly ošetřeny s p278.

Jak je ukázána v tabulce 1, p277(Val⁶-Val¹¹), pl2 a p32 byly účinné v léčbě diabetů, incidence diabetů u neošetřených myší nebo u myší ošetřených p278 byla 90 %, zatímco myši ošetřené p277(Val⁶-Val¹¹), p!2 a p32 ukazují incidenci 10 20 % a 30 %. Na druhé straně kontrolní peptid p278 neměl žádný léčebný účinek.

Tabulka 3

Léčebný účinek peptidů hsp60

peptid	diabetes (^)	mortalita (%)	počet příjemců
žádný	90	50	100
P278	90	45	100
P277(Val6	-Val11) 10	5	100
P12	20	10	10
p32	50	25	20

PC0.05

Je možné, že kombinace dvou nebo tří epitopových peptidů hsp60 bude účinnější než pouze jeden peptid, protože bude léčbou ovlivněno více T buněčných populací.

Příklad 3

Nově diagnostikovaní pacienti s IDDM vykazují proliferační ·· ·· odpovědi T buněk na hsp60, p277<Val⁶-Val¹¹), pl2 a p32

Aby se určily T buněčné odpovědi na různé peptidy hsp60, byly testovány v proliferačním testu lymfocyty z periferní krve nově diagnostikovaných <2 týdny až 4 měsíce) pacientů s IDDM. Odebíralo se 10 až 20 ml krve do sterilní zkumavky obsahující heparin jako antikoagulans a krev se ředila 1:2 PBS. Periferní mononukleární buňky (PBMC) se izolovaly odstředěním krve přes vrstvu prostředku na separaci lymfocytů (lymfoprep). PBMC se testovaly na proliferaci ve třech opakováních, v přítomnosti různých antigenů (10 jug/ml) po 6 dnů za použití inkorporace ³H-thymidinu jako měřítka proliferace. Testované antigeny byly lidský hsp60 nebo hsp60 peptidy p277(Val⁶-Val¹¹), pl2, p32 a kontrolní peptid p278. T buněčná proliferační odpověď je popsána stimulačním indexem (SI): poměr mezi inkorporací thymidinu T buňkami stimulovanou peptidem a inkorporací thymidinu T buňkami pozadí (bez přidání antigenu).

Výsledky jsou shrnuty v tabulce 4.

Tabulka 4

Proliferativní odpověď T buněk (SI)

Pacient	hsp60	p277(V)	pl2	P32	p278
1	5,6	4,5	4,0	1.1	0,5
2	7,5	5,0	4,5	1,3	0,8
3	8,0	5,6	1,2	7,1	0,7
4	3,4	1,0	1.9	2,9	0,9
5	1.2	1,1	1.7	1,0	n.u.
6	6,7	1,3	5,2	4,5	n.u.
7	10,3	3,9	1,2	6,0	n.u.
8	1,3	1,2	1,5	1,1	n.u.
Stimulační	index	(SI) větší	než 2,0	se považuje	za pozitivní

odpověď.

n.u. = neurčeno, p277(V) — p277(Val⁶-Val¹¹) ···· • 444

44 • ·· ··

4 4 ♦♦

4 4·

4444 • ·♦

44

4 ·♦

4 4·

44··

4444

4 44

444

4 4 44

4·

4444

Je vidět, že většina pacientů odpovídala na hsp60 (6/8) a že všichni ze šesti, kteří odpovídali na hsp60, odpovídali také na alespoň jeden ze tří peptidů hsp60: pl2, p32 nebo p277(Val⁶-Val¹¹)- Tedy odpověď na skupinu peptidů může sloužit k vyznačení jednotlivců odpovídajících na celou molekulu hsp60.

Příklad 4 buněčné proliferační odpovědi

Detekovaly se přediabetických myší

NOD na myší peptid p277 (Elias

1991

Birk a kol-, 1996) a na větší fragmenty molekuly myšího hsp60, který (Bi rk a

1996). Aby se detekovaly další T buněčné epitopy na molekule myšího hsp60, byly myši NOD ošetřeny skupinami peptidů s překrývající se sekvencí hsp60 a nalezlo se, že všechny myši tvoří silnou odpověď na oba myší p277 a myší pl2 (obrázek 3). Další peptidy imunogenní pro myši NOD jsou peptid MT-p278 (zbytky 458 až 474 v molekule mykobakteriálního hsp60) a GftD-p35 (zbytky 524 až 543 v molekule GAD65). Obrázek 3 ukazuje, že MT-p278 je stejně silné imunogenní jako jsou myší p277 a myší pl2, GAD-p35 je také imunogenní, ale méně.

Průběžná studie samic myší NOD ve věku 3 až 16 týdnů neukazovala spontánní odpovědi na myší pl2 v jejich slezinách (neukázáno), ačkoliv byly pozorovány odpovědi na

• · · • · · · · • · · * · • · · · myší p277 a na cely myší hsp60. Tedy ze čtyř imunogenních peptidfl: pl2 a p277 z molekuly myšího hspGO, GAD-p35 z molekuly GAD65 spojené s diabetem a MT-p278, cizorodého imunogenu, byly detekovány spontánní odpovědi pouze na myší P277 a na MT-p278.

Ošetřen í pept i dem

Podle laboratorního protokolu. který byl účinný u myšího p277 (Elias a kol., 1991, Elias a Cohen, 1994, Elias a Cohen, 1995) byly ošetřovány skupiny 10 týdnfi starých samic myší NOD jednou subkutánní injekcí každého peptidů (100 mg) emulgovaného v IFft. U myší se sledoval vývoj diabetů během 8 měsíců věku. Obrázek 4 ukazuje, že peptidy myší p277 a myší pl2 byly oba účinné v inhibici vývoje diabetů (p<0,05). Naopak ošetření s peptidy MT-p278 nebo GAD-p35 nebylo jiné, než bylo ošetření samotným IFft. Celkově 3 pokusy ukazovaly v podstatě stejné výsledky.

Protilátky

Úspěšné léčení diabetů indukovaného STZ myším peptidem p277 bylo spojeno s výskytem anti-peptidových protilátek převládajících izotypfi IgGl a IgG2b (Elias a Cohen, 1996). Myši NOD ošetřované peptidem byly proto vyšetřovány na sérové protilátky. Obrázek 5 ukazuje, že dva peptidy účinné v zastavení diabetů, myší pl2 a myší p277, byly také účinné v indukci vysokých proti látkových titrfi izotypfi IgGl a IgG2b (p<0,001). V těchto skupinách byly také významně vyšší titry protilátek IgGl a IgG2b než titry protilátek IgG2a (p<0,001). Myši ošetřované peptidy MT-p278 ·« ···· ·♦ ·· • ·· • ·· ·· • · ·· • · ·· ···· nebo GAD-p35 neodpovídaly tak silně, žádná z myší ošetřených GAD-p35 nevytvořila specifické protilátky IgGl a pouze dvě i z deseti myší ošetřených MT-p278 vytvořily protilátky izotypu IgGl- Myši ošetřené MT-p278 nebo GAD-p35 tvořily významně nižší titry protilátek IgG2b (P<0,001). Tedy účinnost inhibice diabetů byla spojena s indukcí proti látkové odpovědi hlavně izotypfi IgGl a IgG2b.

Vztah mezi účinnou léčebnou reakcí a titrém protilátek byl potvrzen srovnáním koncentrace glukózy v krvi s koncentrací protilátek u jednotlivých myší v 7 měsících věku. Obrázek 6 ukazuje, že myši s vyššími titry anti-myších pl2 protilátek měly glukózy v krvi, naopak tvořily málo protilátek k glukóze v krvi (P<0,002).

Výsledky ukázané peptid pl2 molekuly myšího účinný v léčení hyperglykémie. V spontánní proliferaČní prediabetických myší proliferaČní odpověď podmínkou pro to, aby diabetického autoimunitního

Objev, že peptid který může modulovat diabetes myši myš ímu v tomto hsp60, myš í těsně kontrastu s odpověď i T

NOD. Tedy detekoVate1ná by1 pept i d procesu.

p277 není

NOD, je tendenci k nižší koncentraci ošetřené myším pl2, které pl2, měly tendenci k vysoké příkladu naznačují, Že jako peptid p277, mfiže být před propuknutím zjevné p277 nebyly pozorovány buněk na p!2 ve slezinách spontánní anti-peptídová v periferii není účinný v blokování jediný peptid hsp60, významný. Bylo možné, že zapojení hsp60 v diabetů NOD by se mohlo přihodit díky

podobě mezi peptidem p277 z hsp60 a některou neznámou molekulou více specifickou pro β buňky (Cohen, 1991). Avšak je vysoce nepravděpodobné, že by dva různé segmenty hsp60, p277 a pl2, mohly oba napodobovat segmenty předpokládané, ale neznámé molekuly β buněk. Účinnost pl2 v léčení peptidem podporuje závěr, že molekula podobná hsp60 funkční u diabetů je sám hsp60 (Birk a kol., 1996).

Selháni peptidu MT-p278 a GAD-p35 v zástavě vývoje diabetů naznačuje, že nemůže být použit žádný vlastní antigen nebo žádný spontánně T buněčný proliferující antigen, aby přerušil autoimunitní proces- Je zajímavé, že MT-p278 selhal při indukci vysokých titrfi protilátek nebo při ochraně, navzdory faktu, že jeho peptid je silně imunogenní pro T buňky (nepublikované pozorování)- Avšak indukce protilátek jakékoliv specifity neovlivňuje nevyhnutelně diabetes NOD, ošetření myší NOD s BSA, který indukuje vysoké titry protilátek i silné T buněčné odpovědi (neukázáno), nepůsobí na vývoj diabetů (Elias a Cohen, 1994). Ačkoliv jsme neshledali GAD-p35 tak silně imunogenní pro T buňky jako byly ostatní peptidy (obrázek 3), bylo publikováno, že myši NOD projevovaly spontánní T buněčné odpovědi na jeho peptid (Kaufman a kol., 1989)

Konečně spojení účinné léčby s i ndukc í prot i 1átky specifické pro peptid naznačuje, že léčebné účinky pl2 a p277 se mohou vztahovat k aktivaci T buněk typu Th2 odpovědných za napomáhání indukce specifických protilátek

IgGl, protilátek řízených produkcí IL-4 (Mossman a Coffman,

1993). Takové T buňky by mohly o kterých se předpokládá, že jsou ·· «4» • ·· • ·* · · • ·· • ·· ···· potlačit T odpovědné za ···· ·· • ♦ · · • · · · • · · · ··· • · · · · ·· ·· ·· buňky Thl, poškozen í • ··

Φ · •· •· • · β buněk (Katz a kol., 1995, Liblau a kol., 1995). Vskutku bylo nalezeno, že léčba diabetů NOD peptidem p277 je spojena s prudkým nárůstem T buněk produkujících IL-4 a

IL-10 ve slezině a poklesem T buněk produkujících INF-gama ve slezině i ostrůvcích (nepublikované pozorování). Výskyt peptid-specifických protilátek nesoucích izotypy Th2 jako reakce na léčbu peptidem se zdá být indikátorem blahodárné reakce.

Příklad 5

Další peptidy, na které mohou pacienti s IDDM projevit T buněčné odpověd i

Přihlásilo se dvacet šest nově diagnostikovaných (1 až 16 týdnů po diagnóze IĎDM) pacientů s IDDM. Věk pacientů se pohyboval mezi 5 až 60 lety. U pacientů se testovaly proliferační odpovědi T buněk periferní krve na lidský hsp60 a na syntetické peptidy lidského hsp60 ukázané v tabulkách 1 a 5, které jsou části proteinové sekvence lidského hsp60.

U T buněk pacientů se také analyzovaly proliferační odpovědi na standardní pamětové antigeny, jako je toxoid tetanu, Candida -albicarns a chřipka, a odpovědi se bodovaly jako pozitivní, jestliže byl stimulační index (SI) 2 nebo vyšší (viz níže).

2.7 • · ····

Proliferace se testovala za použití následujícího laboratorního protokolu=

Laboratorní protokol pro přípravu buněk a buněčnou proliferaci

Pacientům s IDDM nebo zdravým kontrolám se odebíralo padesát ml periferní krve doplněné 10 m.j./ml heparinu. Přidaly se dva objemy PBS (bez kalcia a magnézia). Preparát krev-PBS se promíchal za použití desetimili 1itrové pipety.

Směs krve se podvrstvila 10 ml fikolu a následovalo odstředění ve 2000 rpm po dobu 30 minut při teplotě místnosti (RT) až 24°C (bez brzdění). T buňky periferní krve ve fázi stočených leukocytfl (buffy coat) byly sebrány za použití desetimi1 i 1itrové pipety a přeneseny do nové testovací zkumavky o objemu 50 ml. K sebraným T buňkám se přidal objem 30 až 40 ml PBS (bez kalcia a magnézia). Po promíchání se směs stočila v 1000 rpm po dobu 20 minut při teplotě místnosti (s brzděním).

Supernatant se odsál a buněčná peleta se resuspendovala v živném médiu AIM-V bez séra (GIBC0, USA). Živné médium obsahuje AIM-V doplněné 1% pyruvátem sodným,

1% pen i c i 1 i n/streptomyc i n a 2¾ Hepes (1 M, pH 7,3).

doplněné 10% sérem AB poté stočena ve 2000 rpm místnosti (s brzděním). a buněčná peleta se Čerstvého AIM-V (10 až

1¾ L-glutaminem (každý 200 mM), (10 000 j./ml / 10 000 mg/ml)

Alternativně bylo použito RPMI z krevní banky. Buněčná směs byla po dobu 10 minut při teplotě Supernatant byl opět odsát resuspendovala v menším obejmu

α««· ml). Buňky byly resuspendovány a počítány. Počítání buněk a testy životaschopnosti se prováděly za použití trypanové modře. Pro tento krok se používal hemocytometr a světelný mikroskop.

Buněčná koncentrace byla poté upravena na 2x10⁶ buněk/ml média AIM-V. Do každé jamky na 96-ti jamkové mikrotitrační destičce byl přenesen objem 100 jul buněk na jamku. Poté bylo přidáno 100 pl média obsahujícího dvojnásobek doporučené koncentrace antigenu (viz seznam antigenů a koncentrací níže). Test se prováděl ve čtyřnásobném opakování- Čtyři jamky se testovaly s buňkami a médiem bez antigenu jako kontroly. Destičky se kultivovaly ve 37°C ve zvlhčovaném inkubátoru s 5% CO2 po 7 dnů. Šestý den kultivačního období byl přidán 1 jjCi/jamku ³H-thyroidinu. Kultury pokračovaly po 18 hodin a poté byly sbírány. Buněčná proliferace se testovala inkorporací ³H-thymidinu do DNA a určovala se za použití scintilační kapaliny a měřiče záření beta.

Testované antigeny Koncentrace Toxoid tetanu (Connaught Lab. Inc. Pen. USA) 5 g/ml

C-andida -albicans (Míles, WA, USA) 20 pg/ml Rekorobinantní lidský hsp60 (StressGen, Canada) 2-5 jjg/ml Syntetické peptidy lidského hsp60 20 ng/ml

Proliferační odpovědi se měřily podle ³H-thymldinu inkorporovaného do DNA T buněk (Elias a kol., 1991). Počty radioaktivních impulsů za minutu (counts per minuté - cpm) se porovnávaly mezi buňkami pěstovanými s testovanými ·· «· • ·· • ··♦· • · ·* • · ·· ··99 ·· ···· • · antigeny nebo bez antigenu (pouze média) jako kontrolami. Proliferační hodnoty byly reprezentovány jako hodnoty stimulačního indexu (SI)^: průměrný cpm s antigenem dělený průměrným cpm bez antigenu. Hodnoty SI větší než nebo rovné 2 se považovaly za pozitivní.

Výsledky ukázaly, že výskyt jedinců reagujících na lidský hsp60 nebo hspbO-peptíd byl vyšší mezi pacienty IDDM (84 %) než mezi zdravými lidmi (30 %) Hodnota p Fisherova statistického testu rozdílu je 0,0044, což je vysoce významné.

Proliferační odpovědi dvou reprezentativních pacientů s IDDM a jednoho zdravého jedince na lidský protein hsp60, na syntetické peptidy hspbO a na různé paměťové antigeny jsou ukázány na obr. 7, 8 á 9. Tabulka 5 ukazuje dva individuální příklady syntetických peptidů hsp60 (pl9, p21), na které neodpovídal žádný pacient s IDDM (viz také obr- lOfl a 10B) Lze pozorovat, že každý z pacientů odpovídal na paměťové antigeny (Cazřdída, tetanus nebo chřipka) a na lidský protein hsp60 a na různé peptidy lidského hspóOKontrolní osoba odpovídala pouze na kontrolní paměťové antigeny.

Sekvence syntetických peptidů hsp60, na které odpovídal alespoň jeden z pacientů s IDDM, jsou ukázány v tabulce 1. Každý z těchto peptidů ma léčebný potenciál pro léčbu IDDM.

Tabulka 5

Syntetické peptidy hsp60 a pacienti s IDDM neodpovídali jejich sekvence, na které

Peptidy

Čísla zbytků ze sekvence s i.č, 1

Aminokyselinová sekvence (jednopísmenný kód)

P19 271-290

P21 301-320

LVIIAEDVDGEALSTLVLNR KAPGFGDNRKNQLKDMAIAT

Předchozí popis specifických provedení tak plně odhalil povšechnou povahu vynálezu, že ostatní mohou při aplikaci znalostí oboru (včetně obsahu odkazů zde citovaných) tato spec i f i cká proveden í snadno mod i f i kovat a/nebo adaptovat pro různé aplikace, bez nadbytečných pokusů, a aniž by se odchýli 1 i od celkové myšlenky předkládaného vynálezu. Proto je zamýšleno, adaptace a modifikace jsou významem a oblastí rovnocenné vyjeveným provedením založeným na nauce a radách zde uvedených. Je nutné porozumět, že frazeologie nebo terminologie je v tomto textu za účelem popisu a ne omezení takže terminologie nebo frazeologie předkládané specifikace je pro interpretaci zkušeným odborníkem ve světle nauky a rad v tomto textu předložených v kombinaci se znalostí odborníka v daném oboruPrŮmys1ová využ i te1nost

Předkládaný vynález se týká nových peptidů a farmaceutických přípravků, které je obsahují, pro diagnózu • · ···· a léčbu diabetes mellitus závislého na inzulínu. Předkládaný vynález poskytuje diagnostický způsob rozpoznání výskytu nebo počátku IDDM u pacienta, tento způsob zahrnuje testování uvedeného pacienta na přítomnost protilátek anti-hsp60 nebo T buňky, která imunologicky reaguje s hsp60. Předkládaný vynález se také týká prostředků pro provádění těchto diagnostických testů, a také diagnostických souprav pro provádění testů.

• ·

SEZNAM PUBLIKACÍ

Bach JF. (1994) Insulin-Dependent Diabetes Mellitus as an Autoimmune Disease. Endocrine Reviews 15:516-542.

Bendelac A, Carnaud C, Boitard c, Bach JF. (1987) Syngeneic transfer of autoimmune diabetes froro diabetic NOD ice to healthy neonates. Requirement for both L3T4+ and Ly+-2+ T cells. J EXP„Med,_ 166: 823-32.

Birk OS, Elias D, Weiss AS, Rosen A, van-der Zee R, Walker MD, Cohen IR. (1996) NOD mouše diabetes: The ubiquitous mouše hsp60 is a beta-cell target antigen of autoimmune T cells. J. Autoimmun. 9:159-166,

Bowman MA, Leiter EH and Atkinson HA. (1994) Prevention of diabetes in the NOD mouše: implications for therapeutic intervention in human disease. Immunolocrv Todav. 15:115-20.

Castano L, Eisenbarth GS. (1990) Type-I diabetes: a chronic autoimmune disease of human, mouše, and rat. Annu Rev Immunol. 8:647-79.

Cohen IR. (1991) Autoimmunity to chaperónins in the pathogenesis of arthritis and diabetes. Annu Rev Immunol 9:567-589.

Elias, Dana. (1994) The NOD mouše.- A model for autoimmune insulin-dependent diabetes. Autoimmune Disease h SM«tefežP.]Í!L PP 147-61.

Elias D, Cohen IR. (1995) Treatment of autoimmune diabetes and insulitis in NOD mice with heat shock protein 60 peptide p277. Diabetes 44:1132-1138.

Elias D, Reshef T, Birk OS, van der Zee R, Walker MD, Cohen IR. (1991) Vaccination against autoimmune mouše diabetes with a T-cell epitope of the human 65 kDa heat shock protein. Proč. Nati Acad Sci USA. 88:3088-91.

Elias D. and Cohen IR. (1994) Peptide therapy for diabetes in NOd mice. The Lancet. 343:704-706.

Elias D, Cohen IR. (1996) The hsp60 peptide p277 arrests the autoimmune diabetes induced by the toxin streptozocin. Diabetes (in press).

Katz JD, Benoist C, Mathis D. (1995) T helper cell subsets in insulin-dependsnt diabetes. Science 268:1185-1188.

• ·

• ·

Kaufman DL, Clare-Sal21er M. Tian J, Forsthuber T, Ting GSP, Robinson P, Atkinson MA, Sercarz EE, Tobin AJ, Lehrnann pv. (1593) Spontaneous loss of T-cell tolerance co glutamic acid decarboxylase in tmirine insulin-dependent diabetes. Nátuře. 366:69-72.

Liblau RS, Singer SM, McDevitt HO. (1995) Thl and Th2 CD4+ T cells in the pathogenesis of organ-specific autoimmune diseases. Ixnmunol Today 16:34-38.

Mossman TRR, Coffman RL. (1989) TH1 and 7Ή2 cells: Different pacteras of lymphokine secretion lead to different functional properties. Annu Rev Immunol 9:145-173.

Tisch R, Yang XD, Singer SM, Liblay RS, Fuggar L, McDevitt HO. (1993) Immune response to glutámíě acid decarboxylase correlates with insulitis in non-obese diabetic tnice. Nátuře. 366:72-75.

SEZNAM SEKVENCÍ (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 573 aminokyselin

CB) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché

CD) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM

Met 1

Leu Arg

Leu Pro 5

Thr Val Phe Arg Gin Met Arg Pro Val ser Arg

10

15

Val

Leu

Ala

Pro

His

Leu

Thr

Arg

Ala

Tyr

Ala

Lys

Asp Val

Lys Phe

20

25

30

Gly

Ala

Asp

Ala

Arg

Ala

Leu

Met

Leu

GlnGly Val

Asp Leu

Leu Al a

3S

40

45

Asp

Ala

val

Ala val

Thr

Met

Gly

Pro

Lys

Gly Arg

Thr

Val

Ile Ile

50

55

60

Glu

Gin

Gly Trp Gly

Ser

Pro

Lys

val

Thr

Lys

Asp

Gly

Val

Thr val

€5

70

75

80

Ala

Lys

Ser

Ile Asp

Leu

Lys

ASp

Lys

Tyr

Lys

Asn

Ile

Gly Ala Lys

8S

90

95

Leu

Val

Gin Asp

Val

Ala

Asn

Asn

Thr

Asn

Glu

Glu

Ala

Gly

Asp Gly

100

105

110

Thr

Thr

Thr

Ala

Thr

Val

Leu

Ala

Arg

Ser

Ile

Ala

Lys Glu Gly Phe

115

120

125

Glu

Lys

Zle

Ser

Lys

Gly

Ala

Asn

Pro

Val

Glu

Zle

Arg Arg Gly Val

130

135

140

Met

Leu Ala

val

Asp

Ala

Val

Zle

Ala

Glu

Lev

Lys

Lys Gin

Ser Lys

14S

150

155

160

Pro

Val

Thr

Thr

Pro

Glu

Glu

Zle

Ala

Gin

Val

Ala

Thr

Ile

Ser Ala

165

170

17S

Asn

Gly Asp

Lys

G1U

Ile

Gly

Asn

Ile

Ile

Ser

Asp

Ala

Met

Lys Lys

180

185

190

Val

Gly Arg

Lys

Gly

Val

ile

Thr

Val

Lys

Asp

Gly Lys

Thr

Leu Asn

195

200

205

Asp

Glu

Leu

Glu

Ile

Ile

Glu Gly

Met

Lys

Phe

Asp Arg

Gly Tyr Zle

210

21S

220

Ser

Pro

Tyz

Phe

Ile

Asn

Thr

Ser

Lys

Gly

Gin

Lys

Cys

Glu

Phe Gin

225

230

235

240

Asp

Ala

Tyr

Val

Leu

Leu

Ser

Glu

Lys

Lys

Zle

Šer

Ser

Zle

Gin Ser

245

250

255

Ile

Val

Pro

Ala

Leu

Glu

Zle

Ala

Asn

Ala

His

Arg

Lys

Pro

Leu Val

260

265

270

Ile

Ile

Ala

Glu

Asp

Val

Asp

Gly

Glu

Ala

Leu

Ser

Thr

Leu

val Leu

275

280

285

Asn

Arg

Leu Lys

Val

Gly

Leu

Gin

val

Val

Ala

val

Lys

Ala

Pro Gly

290

295

300

Phe

Gly Asp

Asn

Arg

Lys

Asn

Gin

Leu

Lys Asp

Met

Ala

Zle

Ala Thr

305

310

315

320

Gly

Gly Ala

val

Phe

Gly

Glu

Glu

Gly

Leu

Thr

Leu

Asn

Leu

Glu Asp

325

330

335

Vel

Gin

Pro

His

Asp

Leu

Gly

Lys

Val

Gly

Glu

Val

Ile

Val

Thr Lys

340

34 5

350

• ·

A$p

Asp

Ala

Met

Leu

Leu

Lys Gly Lys

Gly Asp Lys

Ala Gin

Zle Glu

355

360

365

Lys

Arg

lle

Gin

Glu

lle

lle Glu

Gin

Leu Asp

Val

Thr

Thr

Ser Glu

370

375

380

Tyr

Glu

Lys

Glu

Lys

Leu

Asn Glu

Arg

Leu Ala

Lys

Leu

Ser

Asp Gly

385

390

395

400

Val

Ala

Val

Leu

Lys

Val

Gly Gly

Thr

Ser Asp

Val

Glu

Val

Asn Glu

405

410

415

Lys

Lys

Asp

Arg

Val

Thr

Asp Ala

Leu- Asn

Ala

Thr

Arg

Ala

Ala Val

420

425

430

Glu

Glu

Gly

11«

Val

Leu

Gly Gly Gly

Cys

Ala

Leu

Leu

Arg

Cys Zle

435

440

44S

Pro

Ala

Leu

Asp

Ser

Leu

Thr Pro

Ala

Asn

Glu

Asp

Gin

Lys

Zle Cly

450

4S5

460

zle

Glu

lle

Zle

Lys

Arg

Thr Leu Lys

Zle

Pro

Ala

Met

Thr

lle Ala

465

470

475

480

Lys

Asn

Ala Gly Val

Glu

Gly Ser

Leu

Zle

Val

Glu

Lys

Zle

Met Gin

48S

490

495

Ser

Ser

Ser

Glu Val

Gly

Tyr Asp

Ala

Met

Ala

Gly

Asp Phe

Val Asn

500

505

510

Met

Val

GlU

Lys

Gly

lle

Zle Asp

Pro

Thr

Lya

Val

Val

Arg

Thr Ala

515

520

525

Leu

Leu

Asp

Ala

Ala

Gly

Val Ala

Ser

Leu

Leu

Thr

Thr

Ala

Glu Val

S30

535

540

Val

Val

Thr

Glu

lle

Pro

Lys Glu

Glu

Lys

Asp

Pro

Gly

Met

Gly Ala

S45

550

555

560

Met Gly Gly Met Gly Gly Gly Met Gly Gly Gly Met Phe 56S 570 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 2(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 24 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina

CC) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE'- SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 2:

Val Leu Gly Gly Gly Val Ala Leu Leu Arg Val zle Pro Ala Leu Asp 1 5 10 1S

Ser Leu Thr Pro Ala Asn Glu Asp (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 3:

Glu Glu Ile Ala Gin Val Ala Thr Ile Ser Ala Asn Gly Asp Lys Asp

5 10 15

Ile Gly Asn Ile (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 17 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY- peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 4

Glu Gly Asp Glu Ala Thr Gly Ala Asn Ile Val Lys Val Ala Leu Glu . 1 5 10 15

Ala (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 5:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE- (A) DÉLKA: 20 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 5: Ser Arg Leu Ser Lys Val Ala Pro val Ile Lys Ala Arg Met Met Glu 1 5 10 15

Tyr Gly Thr Thr ²⁰ (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 6:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 18 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (O TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (il) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 6Pro Gly Met Gly Ala Met Gly Gly Met Gly Gly Gly Met Gly Gly Gly 1 5 10 15

Met Phe

Claims (1)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Peptid vybraný z peptidfl uvedených v tabulce a jejich solí a funkčních derivátfl.

   2- Peptid podle nároku 1 označený zde jako pl2.

   3. Peptid podle nároku 1 označený zde jako p324- Použití peptidu podle nároku 1 pro diagnózu diabetes mellitus závislého na inzulínu (dále IDDM).

   5. Diagnostický zpfisob pro rozpoznání výskytu nebo začátku IDDM u pacienta, vyznačující se tím, že zahrnuje testování krve nebo moči pacienta s peptidem podle nároku 1 jako antigenem na přítomnost protilátek nebo T buněk, které jsou imunologicky reaktivní s lidským hsp60.

   6. Zpfisob podle nároku 5, vyznačující se tím, že zahrnuje testování pacienta na přítomnost protilátek anti-hsp60 nebo T buňky, která imunologicky reaguje s hsp60, pomocí něhož výsledek uvádějící pozitivní přítomnost protilátek anti-hsp60 nebo T buňky, která imunologicky reaguje s hsp60, ukazuje vysokou pravděpodobnost výskytu nebo počátku IDDM.

   7.

   Způsob podle nároků 5 nebo 6, v y z n a č u j í c í se tím, že pacient se testuje na přítomnost protilátek anti-hsp60-

   8. Způsob podle nároku 7, v y z n a č u j í c í s e t í m, že způsob testování zahrnuje radioimunotest. 9. Způsob podle nároku 7, v y z n a č u j í c í s e t í m, že způsob testování zahrnuje test ELISft. 10. D i agnos t i c ká souprava v y z n a č u j í c í s e

   tím, že rozpoznává výskyt IDDM testováním na přítomnost protilátek anti-hsp60 v souladu se způsobem podle kteréhokoliv z nároků 5 až 9, obsahující(i) antigen, který je peptid o sekvencích podle nároku 1, a

   Cii) označenou protilátku schopnou rozpoznání nevariabilní oblasti protilátek anti-hsp60, které mají být detekovány.

   11. Diagnostická souprava podle nároku 10, v y z načující se tím, že antigen je peptid podle nároku 2. 12- Diagnostická souprava podle nároku 10, v y z načující se tím, že antigen je peptid

   podle nároku 339 · 9 99 9 9

   9 9 · · ♦ • ···· · · ♦ ··99

   9 99

   999

   999 99

   99

   9999

   13- Diagnostická souprava podle kteréhokoliv z nároků 10 až

   12, vyznačující se tím, že antigen je imobi1izován na pevné fázi.

   14- Diagnostická souprava podle kteréhokoliv z nároků 10 až

   13, vyznačující se tím, že dále obsahuje instrukce pro použití diagnostické soupravy v diagnóze IDDM-

   15- Diagnostická souprava podle kteréhokoliv z nároků 10 až

   14, vyznačující se tím, že značení je vybráno ze skupiny skládající se z radioizotopů, enzymů, chromoforfi a fluoroforfl.

   16. Způsob podle nároku 5 nebo 6, vyznačující se tím, že pacient se testuje na přítomnost T buňky, která imunologicky reaguje s hsp60.

   17. Způsob podle nároku 16, vyznačující se tím, že testovací způsob obsahuje proliferační test T buněk zahrnující následující kroky:

   (i) příprava frakce mononukleárních buněk obsahující

   T buňky ze vzorku krve získaného od pacienta, (li) přidání antigenu vybraného z peptidů podle nároku 1 k frakci mononukleárních buněk, (iii) Inkubace buněčné frakce v přítomnosti antigenu po vhodné Časové období a za vhodných kultivačních podmínek, (i-v) přidání značeného nukleotidu k inkubované

   99 99

   9 9 9 9 • · ··· · ·

   9 ♦ 9 · · · • · 9 9 9 9

   9·

   99 99 buněčné kultuře (li i) ve vhodnou dobu před koncem inkubačního období tak, aby se zajistila inkorporace značeného nukleotidu do DNA proliferujících T buněk, a (v) určení množství proliferujících T buněk analýzou množství značeného nukleotidu inkorporovaného do T buněk.

   10- Diagnostickou soupravu vyznačující se tím, že rozpoznává výskyt IDDM testováním na přítomnost T buňky, která imunologicky reaguje s hsp60 podle způsobu podle kteréhokoliv z nároků 5, 6 a 17, obsahující:

   (i) antigen vybraný z peptidů podle nároku 1, (i i) značený nukleotid, a (iii) vhodné živné médium pro kultivaci lymfocytfi.

   19.

   Diagnostická souprava podle nároku vyznačuj í c í tím, že dále obsahuje instrukce pro použití diagnostické soupravy v diagnóze IDDM.

   20. Způsob podle nároku 16, vyznačující se tím, že způsob testování obsahuje cytokinový responzivní test T buněk zahrnující následující kroky;

   (i) příprava frakce mononukleárních buněk obsahující

   T buňky ze vzorku krve získaného od pacienta,

   Cií) přidání antigenu vybraného z peptidů podle nároku 1 k frakci mononukleárních buněk, <lii) inkubace buněčné frakce v přítomnosti antigenu po vhodné časové období a za vhodných kultivačních podmínek, ·· ·» ·»·* <iv) měření přítomnosti cytokinu secernovaného odpovídajícími lymfocyty do média.

   21. Způsob podle nároku 20, v jící se tím, že cytokin

   IL-6, IL-10

   TNFa nebo TNFp.

   22.

   Diagnostická souprava í c í se tím, že rozpoznává výskyt

   IDDM testováním na přítomnost

   T buňky, která imunologicky reaguje s hsp60 podle způsobu podle kteréhokoliv z nároků 5, 6, 20 a 21, obsahující:

   (i) antigen vybraný z peptidů podle nároku 1, (i i) vhodné živné médium pro kultivaci lymfocytů, (iii) testovací soupravu pro měření přítomnosti cytokinu secernovaného odpovídajícími lymfocyty do média.

   23. Diagnostická souprava podle nároku 22, vyznačující se tím, že dále obsahuje instrukce pro použití diagnostické soupravy v diagnóze IDDM.

   24. Způsob podle nároku 16, vyznačující se tím, že antigen vybraný z peptidů podle nároku 1 je subkutánně injikován pacientovi a pozoruje se výskyt detekovatelné kožní reakce.

   25.

   Přípravek pro prevenci vyznačující (a) T buňky, kterých se w· *· · ** •♦ •· nebo ♦ · ♦· ··· 9· • ♦ · ·♦ ♦ 9 ♦·

   9999 ·» »··· éčbu obsahuje^: ·· • ·· • ·· • · ··· • · • φ· ♦

   IDDM vyvinula speciiita na ·· «· • ♦ •· •· • · protein nebo peptid, který imunologicky zkříženě reaguje s peptidem podle nároku 1, tyto buňky jsou aktivovány inkubací v přítomnosti peptidů (b) T buňky, které byly ozářeny nebo jinak oslabeny, (c) T buňky, které byly tlakově ošetřeny pomocí hydrostatického tlaku, ošetřeny chemickým zesilovacím agens a/nebo ošetřeny vazebným/zesíťovacím agens k cytoskeletu, (d) povrchové proteiny nebo jejich fragmenty uvolňované z Ca), Cb) nebo (c), nebo (e) peptid skládající se nezbytně z variabilní oblasti receptoru (a) specifického pro uvedený protein, nebo jeho sfil, funkční derivát, prekurzor nebo aktivní frakci.

   26- Přípravek podle nároku 25, vyznačující se tím, že T buňky (a) jsou lidské T buňky a specifita

   T buněk se vyvinula kontaktem in vitro s peptidem. 27. Přípravek pod 1 e nároku 25 nebo 26, v y z n a č u j í c í set í m, že u T buněk se vyvinula

   in vitro specii ita k peptidů podle nároku 1.

   28. FarmaCeut i cký přípravek vyznaču jí c í tím, že obsahuje peptid podle nároku 1 a farmaceuticky přijatelný nosič.

   ··«· ·* ·· »·

   29.

   Farmaceut ický přípravek podle nároku vyznačující se t í m, že je pro prevenci nebo léčbu IDDM.

   30. Farmaceutický přípravek podle nároku 28 nebo 29, vyznačující se tím, že peptid je peptid podle nároku 2.

   31. Farmaceutický přípravek podle nároku 28 nebo 29, vyznačující se tím, že peptid je peptid podle nároku 3.

   32. Použití peptldu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3 pro přípravu farmaceutického přípravku pro léčbu IDDM- ·· ·· • · · 0 • · ·♦

   MLRLPTVTRQ

   MRPVSRVLAP

   HLTRAYANDV

   IKFGADARALM LOGyPLIADAl

   51 VAVTMGPKGT TVIIEQSWGS PKVTKDGVTV AKSIDLKDKY KNIGAKLVQD D10 101 VANNTNEEAG DGTTTATVLA RSIAKEGFEK ISKGAÍNPVEI RRGVMLAVDA pil pl2 Ί 51 viaeiIkkqsk PVTTPÍEEIAQ- EIGNltlSDAM KKVdRKGVIT

   pl4

   201 VKDGKTLNDE LEIllEGMKEP RGYISPYFIN TSKGQKCEFQ DAYVLLSEKK pl8 pl9 p20

   251

   ISSjoSIVPA LEIANAHRKP LVIIAIeDVDG EALSTfcyLNR LKVGLOWAV p21 p39

   301

   KAPGFÍGDNRK NQLKDMAIAT

   GGAVFGEEGL TLNLEDVQPH digkvIgeviv

   ...P24L_____

   351 IKDDAMLltKS.

   KGDKAblEKR

   IQEIIEQLDV TTSEYEKEKL NERLAKLSDG p30

   401 VAVLKVGGTS DVEVNEKKDR p278

   —...........i r ' ldsltÍpaÍnedí ___________J l-------í.

   QKIGIÍEUKŘ _______ p35

   VGYDAMAGDF I VNMVEKGIID

   p29 p277 VTDALNATRA AVEEG iIVLGG GCALLRCIPA

   p32

   TLKIPAMTIA KNAGVÍEGSLI VEKIMQSSSE ptkwrtall!

   DAAGVASLLT

   TAEVWTEIP

   551 KEEKDPGMGA MGGMGGGMGG GMF

   451

   501 ····

   Ofc»r PROLIFERACE T BUNĚK (SI)

   ANT1GEN

   • Φ ·· • · • 9 9 · 99 99 • • * • · • 9 9 9 99 9 • • ··· • · • 9 9 • • • · • · · • 9 99 9 9 • • • • · • · • · 9 9 99 • «· ·· ·· 9 9 99

   * NEDIABETICKE

   Ofajc* _

   CHtwac* _

   GLUKÓZA (mnol/1) ·· ♦ ···

   ABSORBANCE (OD)

   ABSORBANCE (OD)

   O -* í\)

   O 7* ™

   H tr

   I ui n

   I

   Ul

   ABSORBANCE (OD)

   ABSORBANCE (OD)

   I

   U1 o

   O — ΓΌ ^<40 ·· ·« ···· ·· • · · · · · » · · · • 9 «· · · · 9 « ·· · • · · **· 9 9 9 «·· ·· • 9 9 9 9 9 9 9 9 99

   O — ID — Φ

   OJ OJ .-<is> aowaajnoHd ····

   PROLIFERACE (SI) ·· ·· • · ·· • · 9 · ·· • 9 9 9 99 · ·· ·· ♦· • · · · · · • · 9 999

   9 9 999 99

   9 9 9 99 toxoid chřipka CANDIDAA. hsp60 p277 p32

   TETANU

   ΑΝΤΙGENY ··

   ΓΌ

   PROLIFERACE (SI) ···· • ·

   9999 • «·· • 999

   999 99

   99 • 999

   CANDIDA A. chřipka hsp60 p18 p20 p24 p29 p30