CZ266695A3

CZ266695A3 - Insulintropic peptide analogs of glucane type, pharmaceutical preparation and use

Info

Publication number: CZ266695A3
Application number: CZ952666A
Authority: CZ
Inventors: Victor John Chen; Richard Dennis Dimarchi; Aidas Vladas Kriauciunas; David Lee Smiley; Russell Dean Stucky
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 1994-10-18
Filing date: 1995-10-12
Publication date: 1996-05-15
Also published as: ZA958723B; EP0708179A2; EP0708179B1; HUT73413A; CN1129224A; EP0708179A3; AU3432295A; BR9504452A; FI954941A0; FI954941L; ES2232820T3; NO954055D0; PL310961A1; KR960013384A; PE47096A1; DE69533868T2; US5512549A; NO954055L; IL115583A0; CO4480109A1

Description

Předložen aplikované do poskytuje nové použitelné pro ý vynález se tyká organické a pcptidové chemie farmaceutického výzkumu a vývoje. Vynález peptidové deriváty a kompozice, které jsou zvýšení exprese inzulínu u savců a pro léčbu diabetes.

Dosavadní stav techniky

Endokrinní sekrece pankreatických ostrůvků jsou regulovány komplexním kontrolním mechanismem prováděným nejen v krvi se nacházejícími metabolitv jako je glukóza, aminokyseliny a katecholaminy, ale také lokálními parakrinními vlivy. Hlavni pankreatický ostrúvkový hormon, glukagon, inzulín a somatostatin, interagují se specifickými typy pankreatických buněk (A,B a D buňky) pro modulaci* sekretorní odezvy. I když je sekrece inzulínu převážně kontrolována hladinami krevní glukózy, inhibuje somatostatin glukózou zprostředkovanou inzulínovou sekreci·. Navíc k parakrinní regulaci inzulínové sekrece je zde zřejmá podpora existence inzulinotropních faktorů v intestinu. Tento koncept vychází z pozorování, že glukóza podávaná orálně je mnohem potentnějším stimulantem sekrece inzulínu ve srovnání s množstvím glukózy podané intravenozně.

Lidský hormon glukagon je 29-aminckyse1inový hormon produkovaný v pankreatických A-buňkách. Hormon patři k' multigenové třídě strukturně příbuzných peptidů, které zahrnují sekretin, gastrický inhibiční peptid, vasoaktivni intestinálni peptid a gliceníin. Tyto peptidy různé reguluj i karbohydrátový metabolismus, gastrointestinálni mobilitu a sekreci. Nicméně základní uznávaná působeni pankreatickéhc glukagonu jsou ta, že premotuje hepatickou glykoger.olýzu a glykogenesis. co? vede ke zvýšeným hladinám cukru v krvi. Z tohoto hlediska působí glukagon proti působení inzulínu a múze přispívat k hyperglykemii, která je spojena s diabetes mellitus (Lund P.K. a spol.. Proč.Nat1.Acad.Sci.USA,

79:3 45-34 9 (19S2)) .

. Když se glukagon váže ke svým receptorům na inzulín produkujících buňkách, zvyšuje se cAMP produkce, která naopak stimuluje expresi inzulinu (Korman L.Y. a spol.. Diabetes. 34:717-722 (1985)). Navíc vysoké hladiny inzulinu potlačují glykagonovou syntézu mechanismem zpětné vazby inhibice (Ganong W.F., Review of Medical Physíolbgy, Lange . Publications, Los Altos. Kalifornie, str. 273 (1979)).

Exprese glukagonu je pečlivé regulována inzulínem a naposledy hladinami sérové glukózy.

Preproglukagon, prekurzorová forma glukagonu, je kodován genem o 350 párech bází a je opracováván do formy proglukagonu (Lund a spol.. Proč.Nat1.Acad . Sci , USA 79:345-349 (1982)). Patzelt a spol . (Nátuře, 282:260-266( 1979)) deraons.t ruj e, že proglukagon je dále opracováván na glukagon a druhý peptid. Pokusy zposledni doby demonstrují, že proglukagon je štěpený karboxyi na Lys-Arg nebo Arg-Arg zbytky (Lund P.K. a spol,. Lcpez L.C. , a spol.,

Proč.Nati.Acad.Sci. USA. 80:5485-5489 (1983) a Bell G.I. a spol., Nátuře 302:716-718 (1983)).Bell G.I. a spol. také objevili, že progLukagon obsahuje tři oddělené a vysoce homologní peptidové regiony, které byly označeny glukagon, glukagonu podobný peptid 1 (g1ucagon-1 i ke peptide 1 GLP-l) a glukagonu podobný peptid 2 (glucagon-1ike peptide 2 GLP-2). Lopez a spol. dokládají, že GLP-1 je 37-aminokysellnový peptid a GLP-2 je 34-aminokyselinový peptid. Analogické studie struktury krysího preproglukagonu uvolněného podobným způsobem proteolytickým štěpením zbytků Lys-Arg nebo Arg-Arg,vedly ke tvorbě glukagonu, GLP-1 a GLP-2 (Heinrich G. a spol., Endocrinol., 115:2176-2181 (1984)). Nakonec lidské, krysí, prasečí a křečci sekvence CLP-1 byly shledány identickými (Chiglione M., a spol., Diabetologia, 27:599- 600 (1984)).

Závěry učiněné Lopezem a spol. ohledně velikosti GLP-1 byly potvrzeny studiem molekulárních forem GLP-1 nalezených v. lidské slinivce (Uttenthal. L.O. a spol.,

J.Clin.Endocrinol.Metabol., 6 1:472-479 (1985)). Tento výzkum ukazuje, Že GLP-1 a GLP-2 jsou přítomny ve slinivce jako 37a 34-aminokyselinové peptidy.

Podobnost mezi GLP-1 a glukagonem naznačovala dřívějším výzkumníkům, že GLP-1 by mohl mít biologickou aktivitu. I když někteří výzkumníci- zjistili, že GLP-1 by mohl'indukovat buňkykrysího mozku k syntéze cAMP (Hoosein N.M. a spol., Febs Lett. 178:83-86 (1984), nenalezli jiní výzkumníci jakoukoliv fyziologickou roli pro GLP-1 (Lopez L.C. a spolsupra). Selhání identifikace jakékoliv fyziologické úlohy pro GLP-1 přivedlo 'některé výzkumníky k otázce,’ je-li GLP-1 skutečně hormon a zda vztah'mezi glukagonem a GLP-1 by mohl být umělý.

Nyní bylo. nale.zeno, že biologicky-opracované- formy GLP-1 mají inzulinotropní vlastnosti a mohou odsouvat Žaludeční vyprázdnění. GLP-1(7-34) a GLP-1(7-35) jsou popsány v US patentu č. 5118666, zahrnutém zde jako odkaz. GLP-1(7-37) je popsán v US patentu č. 5120712, který je zde zahrnut jako odkaz .

Varianty a analogy GLP-l jsou v oboru známé. Tyto varianty a analogy zahrnují, například, GLP-l(7-36),

Gln⁹-GLP-1(7-37), D-Gln⁹-GLP-1(7-37), acetyl-Lys^-GLP-l(7-37), Thrl&-Lys»8-GLP-1(7-37) a Lys¹⁸-GLP-l(7-37). Deriváty GLP-l zahrnují, například, adiční soli s kyselinami., karboxy1átové soli, nižší alkylestery a amidy (viz např. WO91/1I457). Obecně jsou známy různé popsané formy CLP—1 pro stimulaci inzulínové sekrece (inzulinotropní působení) a cAMP formace (viz např. Mojsov S., Int.J.Peptide Protein Research, 40:333-343 (1992)).

Důležitější je, že řada výzkumníků demonstrovala předpověditelný vztah mezi různými in vitro laboratorními pokusy a savčími, zejména lidskými odezvami na exogenní podání GLP-l, GLP-l(7-36)amidu a GLP-1(7-3 7)kyše 1iny (viz např. Nauck M.A, a spol., Diabetologia, 36: 741-744 (1993)59 Gutniak M. a spol., New England J.of Medicine, , 326(20):1316-1322 (1992);Nauck M.A. a spol., J.Clin.Invest.f 91:301-307 (1993) a Thorens B. a spol., Diabetes,

42:1219-1225 (1993)).

Základní defekty odpovědné za způsobení hyperglykemie ve zralém počátku diabetů zahrnují zhoršenou sekreci endogenního inzulinu a rezistenci k účinkům inzulinu u svalové a jaterní tkáně (Galluway J.S., Diabetes care, 13:1209-1239 (1990)). POslední z uvedených defektu vede k přebytku produkce glukózy v játrech. Zatímco normální jednotlivec uvolňuje glukózu rychlostí přibližně 2 rag/kg/minuta, pacient se zralým začátkem diabetů uvolňuje glukózu rychlostí přesahující 2,5 mg/kg/minutu, což vede k čistému přebytku alespoň 70 gramů glukózy za¹ 24 hodin.

Protože existují neobyčejné vysoké korelace mezi produkci hepatickě glukózy, hladinami krevní glukózy při půstu a celkovou metabolickou kontrolou jak je indikováno při g 1 ykohemoglobinových měřeních (Galloway J.A.. supra: a Galloway J.A. a spol., Cl in.Therap., 12:460-472 (1990)), je snadno zjevné, že kontrola krevní glukózy při pustu je podstatná pro dosažení celkové normalizace metabolismu, dostačující pro prevenci hyperglykemických komplikaci.

Protože existující inzulínové terapie vzácné normalizují hepatickou produkci glukózy bez produkce významné hyperinzulinemie a hypoglykemie (Galloway J.A a Galloway J.A. a spol., upra), jsou potřebná alternativní řešení.

Terapie založená na podání GLP-1 analogů je jednou z takových možnosti, a je- objektem předloženého vynálezu.

Dosud terapie, zahrnující použití molekul typu GLP-1, představovaly významný, problém, protože sérový poločas životnosti takových peptidů je velmi krátký.. Například.

GLP-1(7-37) má sérový poločas životnosti pouze 3 až 5 minut. Dosud byla aktivita dipeptidy1-peptidasy IV (DPP IV) považována za snadno ináktivující GLP-1(7-37) navíc k rychlé absorpci a clearenci po parenterálním podání. Existuje zde tedy kritická potřeba biologicky aktivních analogů GLP-1(7-37), které by vykazovaly vynikající farmakodynamické profily po parenterálním podání·.

Podstata vynálezu 'Primárním obj ektem'tohoto vyňal ěz'u‘j e poskytnutí nových, chemicky modifikovaných peptidů, které nejen pouze stimulují sekreci inzulnu v diabetů typu LI, ale také produkují jiné blahodárné inzulínotropnf odezvy. Sloučeniny podle předloženého vynálezu přetrvávají v seru po delší periody než nativní GLP-1(7-37) bud tím, že vykazují rezistenci k DPP IV nebo tím, že jsou absorbovány a vylučovány pomaleji než nativní GLP—l(7—37) po parenterálním podáni. Nejvíce překvapující je, že některé sloučeniny podle předloženého vynálezu demonstruji synergický efekt,když se individuální změny GLP—1(7—37) nepodaří, přičítaný k biologické účinnosti sloučenin, které obsahují všechny změny.

Předložený vynález poskytuje sloučeniny obecného vzorce

R ú-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-SerTy r-Leu-G 1u-G1y-G1y-A1 a-A1a-Xaa-G1u-Phe-11eAla-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Ag-P³ (vzorec 1) 7* kde R¹ je vybrán ze skupiny, zahrnující

4-imidazopropiony1(des-amino-histidy1), 4-imidazoacety1, nebo 'Sř

4-imidazo-a,a-dimethyl-acetyl,

R² je vybrán ze skupiny, zahrnující Cs-Cio nerozvětvený acyl, nebo není přítomen,

R³ je vybrán ze skupiny, zahrnující Gly-OH nebo NH2 a

Xaa j e Lys nebo Arg.

.Předložený vynález také poskytuje farmaceutické přípravky, obsahující sloučeninu podle předloženého vynálezu v kombinaci s farmaceuticky přijatelným nosičem, ředidlem nebo přísadou. Předložený vynález dále.poskytuje způsob léčby na inzulínu nezávislé diabetes mellitus u savce v případě potřeby takové léčby, zahrnující podáni účinného množství sloučeniny podle předloženého vynálezu uvedenému savci.

V jednom provedení poskytuje předložený vynález analogy přirozeně se vyskytujícího GLP-1(7-37), které vznikají z adice různých R skupin přes peptidovou vazbu k aminokonci peptidového podílu ve vzorci 1. Popřípadě mohou být další sloučeniny podle vynálezu vyrobeny acylací epsilon amonoskupinv Lysⁱ⁴ zbytku a vyrobením limitovaných aminokyselinových substitucí v poloze 6 nebo změnou karboxykonce. Proto je příprava polypeptidového řetězce vzorce 1 logicky prvním stupněm přípravy sloučenin podle předloženého vynálezu.

Je třeba uvést, Že tento popis používá nomenklaturní schéma, které bylo vyvinuto přo opracování forem GLP-1-. V tomto schématu byl aminokonec známého. GLP-1(7-37) označen číslem 7 a karboxykonec číslem 37. Proto první Ala zbytek vzorce 1 odpovídá zbytku 8 GLP-1(7—37)OH. Podobně Xaa ve vzorci 1 odpovídá zbytku 26 GLP-1(7-37)OH a tak dále.

Podle sekvenčních informací- zde popsaných a stavu techniky v oboru syntézy proteinů v pevné, fázi, může být’ proteinová část vzorce 1 připravena chemickými- syntézami. Pro expresi proteinového vzorce 1 mohou být také použity rekombinantní DNA -techniky.

Principy chemické syntézy peptidů v pevné fázi jsou v oboru dobře známé a mohou být nalezeny v základní literatuře jako je Dugas H. a Penney C., Bioorganic Chemistry (1981)

Spr.ing.er-Ver.lag , ..New ..York., s.t r. .54-92.,. Mer.r i f.i eld .. J.M...........

Chem.Soc., 85.:..2 149- ( 1.962) a Stewarda Yong, Solid Phase. . Peptide Svnthesis, str. 24-66, Freeman (San Francisco, 1969).

Například proteinová část vzorce 1 může být syntetizována postupem v pevné fázi za použití 430A peptidového syntezátoru (PE-Applied Biosystems, lne., 850 Lincoln Center Drive, Foster City, CA 94404) a cyklu syntézy dodávaných PE-Applied Biosystems. Boc aminokyseliny a jiná činidla jsou dostupná od PE-Applied Biosystems a jiných chemických dodavatelů..Postupné Boc chemie používající protokoly dvojité kondenzace jsou aplikovány k výchozím p-methylbenzhydrylaminovým pryskyřicím pro-výrobu

C-koncových karboxamidů. Pro výrobu C-koncových kyselin se použije odpcvídající'PAM pryskyřice.' Asn, Gin a Arg jsou kondenzovány za použití předem vytvořených hydroxybenzotriazolových esterů. Mohou být použity následující vedlejší řetězec chránící skupiny:

Arg	t o s y 1
Asp	cyklohexyl
Glu«	cyklohexy1
Ser	benzyl
Thr	benzyl
Tyr	4-bromkarbobenzoxy
Boc	odchránění může být	provedeno kyselinou
trifluoroctovou v methylenchloridu . Po ukončení syntézy
mohou být	peptidy odchráněny	a odštěpeny z pryskyřice
bezvodým	fluorovodíkem (HF),	obsahujícím 10 % meta-kresolu
Odštěpení	chránící skupiny (skupin) vedlejšího řetězce a

peptidu z pryskyřice se provádí při -5 °C až 5 °C, výhodně na ledu po 60 minut. Po odstranění HF se peptid/pryskyřice promyjí etherem á peptid se extrahuje ledovou kyselinou' octovou a Iyofilizuje.

Příprava chráněných, nechráněných a částečně chráněných GLP-1 molekul byla v oboru popsána . Viz US patent č. 5120712 a 5118666, zahrnuté zde jako odkazy a Orskov C. a spol.,

J.Biol.Che.. 264(22):12826-12829) a WO 91/11457 (Buckley D.I. a spol., publikováno S,srpna 19991).

Stav techniky v oboru molekulární biologie, poskytuje odborníkům v oboru jiné způsoby, kterými může být získána proteinová část vzorce l. I když peptidy mohou být produkovány syntézou v pevné fázi nebo rekornbinantními metodami, jsou preferovány rekombinantní metody protože, jsou možné vyšší výtěžky. Základní stupně rekombinantní produkce jsou:

a) izolace přírodní DNA sekvence,kódující GLP-1 nebo konstrukcí sytetické nebo polosyntetické DNA, kódující GLP-1, .

b) umístění kódující sekvence do expresního vektoru způsobem vhodným pro expresi proteinů bud samotných nebo jako fuzní «

- proteiny,

c) transformaci vhodných eukaryotických nebo prokaryotických hostitelských buněk s expresním vektorem,

d) - kul t ivaci transformované hostitelské buňky za podmínek, .

které budou umožňovat expresi GLP-1 meziproduktu a

e) získání a čištění rekombinantně produkovaného· proteinu.

Jak již bylo uvedeno, kódující sekvence mohou být plně syntetické nebo být výsledkem modifikací větších, nativní glukagon kódujících DNA. DNA sekvence která kóduje preprog1ukagon je uvedena Lundem a spol., Proč.Nat1.Acad.Sci. USA 79:345-349 (1982) a může být použita-jako výchozí materiál v po losynte.t ické p.r.o.d.ukci sloučenin .p.odle , ......... „ předloženého vynál.ezu při. změnění nativní sekvence pro......

dosažení požadovaných výsledků.

Syntetické geny, jejich in vitro nebo in vivo transkripce a translace vede k produkci proteinové části vzorce 1 mohou být konstruovány technikami, které jsou dobře známé v oboru. Vzhledem k přirozené degeneraci genetického kódu bude odborníkům v oboru zřejmé, Že může být zkonstruován poměrně velký počet DNA sekvencí, které všechny kódují polypeptid vzorce 1.

Metodika konstrukce syntetického genu je v oboru dobře známá. Viz Brown a spol.(1979) Methods in Enzymology,

Academie Press, N.Y., sv.68, str. 109-151. DNA sekvence, které kódují proteinový řetězec vzorce 1 mohou být navrženy na bázi zde popsaných aminokyselinových sekvencí. Jakmile je navržena, může být sekvence samogenerována použitím konvenčních DNA syntetizujících zařízení jako je Model 380A nebo 380B DNA syntezátorů (PE-Applied Biosystems, Inc., 850'· Lincoln Center Drive, Poster City, CA 94404).

Pro účinnou expresi polypeptidu vzorce 1 se inzertuje inženýrovaná syntetická DNA sekvence do jakékokoliv ze vhodných rekombinatní DNA expresních vektorů použitím vhodných restrikčních endonukleás. Viz obecné Maniatis a spol. ( 1 989) Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Cols Springs Harbor Laboratory Press, N.Y., sv.1-3.Restrikční nukleasová štěpící místa jsou inženýrována bucf na konec GLP-1 meziprodukt-kodující DNA pro usnadněni izolace z a integrace do, známých amplifikačních a expresních vektorů. Jednotlivé použité endonukleásy budou diktovat průběh restrikčního štěpení nukleásami použitého rodičovského expresního vektoru. Volba restrikčních míst je provedena tak, že správně orientují kódující sekvenci s kontrolními sekvencemi pro dosažení správného čtecího rámce a exprese zájmového proteinu. Kódující sekvence musí být umístěna tak, aby byla ve správném čtecím rámečku s promotorem a ribosomovým vazebným místem expresního vektoru, které jsou oba funkční v

1 hostitelské buňce, ve které má být protein exprimován.

K dosažení účinné transkripce syntetického genu je nutné jeho operativní spojení s oblasti promotor-operátor. Proto promotor-operátorová oblast syntetického genu je umístěna ve stejné sekvenční orientaci vzhledem k ATG start kodonu syntetického genu.

V oboru je známo mnoho expresních vektorů vhodných pro transformaci prokaryotických a eukaryotických bnuněk. Viz The Promega Biological Research Products Catalogue (1992)(Promega Corp., 2800 Woods Hollow Road, Madison,WI, 53711-5399); a The Stratagena Cloning Systems Catalogue (1992)(Stratagene Corp., 11011 North Torrey Pines Road, La Jolla, CA,. 92037) Také US patent č. 4710473 popisuje cirkulární DNA plasmidové transformační vektory vhodné pro expresi exogenních genů v E.coli ve vysokých hladinách. Tyto plasmidy jsou vhodné jako transformační vektory v rekombinantních DNA postupech a (a) udělují plasmidu kapacitu pro autonomní replikaci v hostitelské buňce, (b) regulují autonomní plasmidovou replikaci ve vztahu k teplotě, ve které je kultura hostitelské buňky udržována, (c) stabilizují zachování plasmidu v populacích hostitelské buňky, (d) přímá syntéza proteinu z proteinu prod. udává udržení plasmidu v populaci hostitelské buňky, (e) poskytují v sériích restrikční. endonukleásou rozpoznávaná místa jedinečná pro plasmid a ί 4 (f) ukončují mPNA transkripci.

Tyto cirkulární DNA plasmidy jsou vhodné jako vektory v rekombinantních DNA postupech pro zajištění vysokých hladin exprese exogenních genu.

Po zkonstruování expresního vektoru pro protein vzorce l je dalším stupněm umístění vektoru do vhodné buňky a tím konstruovat rekombinantní hostitelskou buňku vhodnou pro expresi polypeptidu. Techniky pro transformaci buněk rekombinantními DNA vektory jsou dobře známé v oboru a je možno je nalézt v takových základních odkazech jako je Maniatis a spol., supra. Hostitelské buňky mohou být konstruovány bud z eukaryotických nebo prokaryotických buněk.

Prokaryotické hostitelské buňky obecně produkují protein vyššími rychlostmi a je snadnější je kultivovat. Proteiny, které jsou exprimovány v bakteriálních expresních systémech s vysekou hladinou, charakteristicky agregují na granule nebo inkluzní tělesa, která obsahují vysoké hladiny nadměrně exprimovaného proteinu. Takové proteinové agregáty typicky musí být solubi1izovánv, denaturovány a znovu složeny za použití technik, které jsou v oboru dobře známé. Viz Kreuger a spol.(1990) v Protein Folding, Gierasch a King.eds., »

str.136-142, American Association for the Advancement of Science Publication No.89-18S, Washington D.C. a US patent č. 4923967.

Po přípravě polypept idového řetězce vzorce 1 se přidá imidazol, jak je de.finóvári výše v Podstatě vynálezu k aminokonci pro získání různých provedení předloženého vynálezu. Kondenzace imidazolové skupiny k polypeptidu vzorce 1 se provede syntetickými způsoby. Protože všechny z různých organických skupin zahrnutých v tomto vynálezu obsahují karboxylovou kyselinu, může být imidazolová skupina přidána syntézou proteinu v pevné fázi analogicky adicí aminokyseliny k N-konci polypeptidu. Alternativně muže být přidán aktivovaný ester imidazo1ové skupiny standardními chemickými reakcemi. .

Preferované imidazo1ové skupiny podle předloženého vynálezu jsou:

4-imidazopropionyl (des-amino-hi s t i dy1)

4-imidazoacety1

4-imidazo-a,adimethyl-acetyl

Nejpreferovanější skupinou je 4-imidazopropionyl.

Další provedení předloženého vynálezu se uskuteční

I 4 acylací epsilon aminoskupiny Lvs^J4 zbytku. Jsou preferovány adice acylu s přímým řetězcem, obsahujícím mezi 6 a 10 atomy uhlíku a nejvíce je preferován nerozvětvený Ca.

Další provedení předloženého vynálezu zahrnuje aminokyselinové substituce v poloze 26 (Xaa) vzorce 1. Lys a Arg jsou v této poloze přijatelné i když preferován je Arg.

Modifikace karboxykonce jsou také zahrnuty v předloženém vynálezu. R³ může být Gly-OH nebo NH2; Gly-OH je preferován proti karboxyterminálním amidovým provedením.

Adice acylové skupiny k epsilon aminoskupiné Lys^í4 může být provedena za použití jakékoliv z různých metod, které jsou známé v oboru. Viz Bioconjugate Chem.Chemical Modificatíons of Proteins:History and Applications str.1,2-12(1990); Hashimoto a spo1Pharmaceutical Res. Synthesis of Palraitoyl Derivatives of Insulin and their Biological Activity, sv.6,č. 2, str.171—176 (1989).

Například N-hydroxy-sukcinimidester oktanové kyseliny může být adován k lysyl-epsi Ion aminu použitím 50% acetonitrilu v boritanovém pufru. Peptid muže být acylován bud před nebo po té, co je adována imidazolové skupina.

Navíc, je-li peptid připraven rekombinantně, je možná acylace před enzymatickým štěpením.

Předložený vynález také zahrnuje solné formy GLP-1(7-37)analogů. Sloučeniny podle vynálezu mohou být dostatečně kyselé nebo dostatečně bázické, aby reagovaly s jakoukoliv z mnoha anorganických bází a anorganických a organických kyselin za vzniku soli. Kyseliny běžně používané pro tvorbu adičních solí s kyselinami jsou anorganické kyseliny jako je kyselina chlorovodíková, kyselina bromovodíková, kyselina jodovodíková, kyselina sírová, kyselina fosforečná a podobně a organické kyseliny jako je kyselina p-toluensulfonová, kyselina methansulfonová, kyselina šťavelová, kyselina p-bromfenylsulfonová, kyselina uhličitá, kyselina jantarová, kyselina citrónová, kyselina benzoová, kyselina octová a podobně. Příklady takových solí zahrnují sulfáty, pyrosulfáty, bisulfáty, , sulfi ty,bisulfi ty, fosfáty, monhydrogenfosfáty, dihydrogenfosfáty, metafosfáty, pyrofosfáty, chloridy, bromidy, jodidy, octany, propionáty, dekanoáty, kapryláty, akryláty, mravenčeny, isobutyrátv, kaproáty, heptanoáty, propioláty, oxaláty, malonáty, sukcináty, suberáty, sebakáty, fumaráty, maleáty, butin-l,4-dioláty, hexin-1,6-dioáty, benzoáty, chlo.rbenzoáty, methylbenzoáty, dinitrobenzoáty, hydroxybenzoáty, methoxybenzoáty, ftaláty,· sulfonáty, xylensulfonáty, fenylacetáty, fenylpropionáty, fenylbut.yráty, citráty, laktáty, gama-hydroxybutyráty, glykoláty, tartráty, methansulfonáty, propansulfonáty, naftalen-l-sulfonáty, naftalen-2-sulfonáty, mánděl.áty a podobně. Preferované adiční soli s kyselinou jsou ty, které jsou vytvořeny s minerálními kyselinami jako je kyselina chlorovodíková a kyselina bromovodíková a zejména kyselina chlorovodíková.

Adiční soli s bázemi zahrnují ty, které jsou odvozeny od

Λ anorganických bází jako je amoniak nebo hydroxidy alkalických kovů nebo kovů alkalických zemin, uhličitanů, hydrogenuhl ič i_tanů ..a podobně. Takové.báze .vhodné _pro....pří právu solí podle tohoto. vyná.l ezu tak zahrnuji hydroxid sodný, hydroxid draselný, hydroxid amonný, uhličitan draselný a podobně. Solné formy GLP-1(7-37) analogů jsou zvláště . preferovány. Jestliže, se sloučeniny podle vynálezu používají pro terapeutické účely mohou tyto sloučeniny rovněž být ve formě soli, ale sůl musí byt farmaceuticky přijatelná.

GLP-I(7-37) analogy podle předloženého vynálezu demonstrují inzulinotropní aktivitu. Výraz inzulinotropní aktivita označuje schopnost substance stimulovat, nebo «

vyvolávat stimulaci, systézy nebo exprese hormonu inzulínu.

Inzulinotropní vlastnost sloučeniny může být stanovena' tak, že je sloučenina poskytnuta k živočišným buňkám, nebo injikováním takové sloučeniny do živočicha a sledováním uvolňování imunoreaktivního inzulínu (IRI) do media nebo oběhového systému živočicha. Přítomnost ISI je detegována použitím radioiminozkoušky, která může specificky delegovat inzulin.

I když může být použita rádioimunozkouška schopná detekce přítomnosti IRI, může být také použita modifikace této zkoušky. Viz J.D.M. a spol. Acta Endocronol., 70:487-509 (1972). Inzulinotropní vlastnost sloučeniny může být stanovena pankreatickou infuzí. Viz Penhos J.C. a spol., Diabetes, 18:733-738 ( 1969). ...

Předložený vynález také poskytuje farmaceutické přípravky, obsahující sloučeninu podle vynálezu v kombinaci s farmaceuticky přijatelným nosičem, ředidlem nebo přísadou. Takové farmaceutické přípravky jsou připraveny způsobem dobře známým ve farmaceutickém oboru a jsou podávány individuálně nebo v kombinaci s jinými terapeutickými činidly, výhodně parenterálním způsobem. Zvláště preferovaným způsobem je subkutánní podání.

Parenterální dávky mohou být v rozmezí od asi 1 pg/kg do asi 1000 pg/kg tělesné hmotnosti, i když mohou být podávány, i

I / dávky nižší nebo vyšší. Potřebná dávka bude záviset na obtížnosti stavu pacienta a na takových kriteriích jako je pacientova hmotnost, výška, pohlaví, věk a dosud podávaná medikaee.

Při výrobě přícravkú pod 1e předloženého vynálezu se účinná složka, která obsahuje alespoň jednu sloučeninu podle předloženého vynálezu, obvykle smísí s přísadou nebo se zředí přísadou. Jestliže se přísada použije jako ředidlo, může to být polopevný nebo kapalný materiál, který působí jako vehikulum, nosič nebo medium pro účinnou složku. Preferovány jsou·kapalné přísady.

Při přípravě přípravků může být nezbytné mlít účinnou sloučeninu za získání vhodné velikosti částic před spojením s jinými složkami. Je-li účinná sloučenina v podstatě nerozpustná, je obvykle mleta na velikost částic menší než asi 200 mesh. Jestliže je účinná sloučenina v podstatě/ rozpustná ve vodě, upraví se velikost částic normálně mletím tak, aby v přípravku byla poskytnuta v podstatě homogenní distribuce, např. asi .40 mesh.

Přípravky podle vynálezu mohou být formulovány tak, že poskytují rychlé, udržované nebo opožděné uvolnění účinné složky po podání pacientovi za použití postupů dobře v oboru známých. Přípravky jsou výhodně formulovány v jednotkové dávkové formě, kde každá dávka normálně obsahuje od asi 50 pg do asi 100 mg, obvykleji od asi 1 mg do asi 10 mg účinné složky. Výraz jednotková dávková forma označuje fyzicky oddělené jednotky vhodné jako jednotkové dávky pro lidské subjekty a jiné savce, kde každá jednotka obsahuje předem stanovené množství účinného materiálu vypočtené pro dosažení požadovaného terapeutického účinku ve spojení se vhodnou o

farmaceutickou přísadou.

Pro parenterální podání jsou přípravky, obsahující sloučeninu podle předloženého vynálezu výhodné kombinovány s *

destilovanou vodou při vhodném pH. Další farmaceutické metody mohou být použity pro řízený průběh působení. Přípravky s řízeným uvolňováním mohou být získány použitím polymerů pro komplexaci nebo absorbování sloučeniny podle předloženého vynálezu. Řízené dodávání může být dosaženo výběrem vhodných makromolekul (například polyesterů, polyaminokyselin, poylvinylpyrrolidonu. ethylvinylacetátu, methylcelulozy, karboxymethylcelulozy a protaminsulfátu) a koncentzrace makromolekul jakož i metod inkorporace za účelem řízeného uvolňování.»

Další možná metoda řízeného průběhu působení přípravků s řízeným uvolňováním je inkorporovat sloučeninu podle předloženého vynálezu do částic polymerního materiálu jako jsou polyestery, polyaminokyseliny, hydrogely, poly(mléčná kyselina) nebo ethylenvinylacetátové kopolymery.

Alternativně je možné místo inkorporace sloučeniny do těchto polymerních částic, uzavřít sloučeninu podle předloženého vynálezu do mikrokapslí připravených například koacervačními technikami nebo interfaciální polymerací, například hydroxymethy1celu1ozových nebo želatinových kapslí, nebo koloidního systému pro doručení léčiva, například liposomů, albuminových mikrokulíček, mikroemulzí, nanočástic a nanokapslí nebo v makroemulz ich. Takové přípravky jsou popsány v Remingtonů Pharmaceutical Sciences (1980).

Sloučeniny podle vynálezu mají inzulinotropní aktivitu. Další aspekt předloženého vynálezu tak poskytuje způsob i X zvýšení exprtese inzulínu poskytnutím savčím buňkám pankreatického B-typu ostrůvků účinného množství sloučeniny podle předloženého vynálezu.

Podobně poskytuje předložený vynález způsob léčby diabetes mellitus u savce, výhodně Člověka, v případě potřeby takové léčby, kde tato léčba zahrnuje podání účinného množství sloučeniny nebo přípravku podle vynálezu takovému savci .

Následující příklady slouží jako ilustrace jak postupovat podle předloženého vynálezu a jeho praktických provedení. Tyto příklady nejsou míněny jako jakýmkoliv způsobem omezující rozsah vynálezu.

Příklady provedení vynálezu . *

Příklad 1 ·..

Syntéza (Arg26)GLP-l(8-37JOH

Polypeptidový podíl vzorce 1, kde Xaa je Arg a R³ je Gly-OH byl připraven syntézou v pevné fázi na peptidovém syntezátoru Model 430A (PE-Applied Biošystems, Poster City, CA) za použití Boc chránící strategie. Postranní řetězec chránící skupiny byly: Asp (Chxl), Glu (OBzl), Ser (Bzl), Thr (Bzl), Lys (Cl-2), His (BOM), Trp (CHO), Tyr (Br-Z), a Arg (Tos) . Všechny kromě Asp (Chxl) (Peptides International) byly získány od PE-Applied Biosystems. Každý.zbytek byl dvojitě kondenzován za použití bud DCC iniciovaného symetrického anhydridu nebo HOBT aktivace. 30zbytkový meziprodukt byl ponechán připojit k pryskyřici.

, JU ,

Příklad 2

N-Cbz-Imidazol-4-yl-propanová kyselina (R.G.Jones,

J.Amer.Chem.Soc., 71. 383 (1949) byla kondenzována k (8-37)peptidytové pryskyřice popsané v příkladu 1 umístěním 0,5 g (1,8 mmol) N-Cbz-imidazol-4-y1-propanové pryskyřice do každé ze dvou histidinových patron a průběhem normálního histidi nového dvojitého kondenzačního cyklu na peptidovém syntezátoru Model 430A..

i

Připravená modifikovaná peptidylová pryskyřice byla zpracována se 20 ml 20% piperidínu v DMF (dimethylformamid) při 4 °C po 1 hodinu pro odstranění Trp(CHO) ochrany.

Přibližně (2,6 g) modifikované peptidylové pryskyřice bylo promyto několikrát CH2CI2, přeneseno do teflonové reakční nádoby a sušeno ve vakuu. Dva ml m-kresolu a magnetická míchací tyčinka byly přidány do nádoby, která byla připojena k HF zařízení (Pennisula.Laborati es, lne.), ochlazena na -78 °C , evakuována a do nádoby bylo nekondenzováno 20 až 25 m’l HF. Reakční směs byla míchána 60 min na ledové lázni a HF. bylodstraněn za vakua. Modifikovaný peptidový zbytek (GLP-1 analog) byl suspendován ve 200 ml ethyletheru a krátce promíchán. Pevný materiál byl pak odfiltrován za použití 60 ml skleněné filtrační nálevky. Po promytí pevných látek dvakrát ethyletherem byl GLP-1 analog solubi1 izován promytím pevných látek vždy 40 ml 50% vodné kyseliny octové a 10% vodné kyseliny octové. Bylo odebráno 100 μΐ spojeného vodného filtrátu a připraveno pro standardní HPLC analýzu použitím následujících podmínek:

Pufry: A) 0,1% TFA

Ko1 ona: Teplota

B) 0,1% TFA/50% CHjCN Vydac C18(0,46 x 15 cm) 45 °C

Průtok: 1,0 ml/min

Detektor: 214 nm

Gradient: 0 ΐ B po 5 min, potom 0 až 100 X B během 60 min

Zbývající vodný filtrát (přibližně 90 ml) byl rozdělen na dvě části a každá byla nanesena na 2,2 x 35 Vydac C18 kolonu a preparativně chromatografována (Pharmacia FPLC) při teplotě místnosti a monitorování při 214 nm. Frakce byly odebírána každých 5 min při průtokové rychlosti 4 ml/min v gradientu, začínajícím 20 X b (A a B byly stejné jako výše) a končícím 100 X b po 790 min při teplotě místnosti.

UV absorbující“frakce byly analyzovány pomocí HPLC a vybrané frakce (61-67) byly spojeny a lyofi 1 izovány za získání 114 mg titulní sloučeniny. Podobným způsobem bylo získáno 175 mg ze druhého podílu. GLP-1 analog byl charakterizován rychlým atomovým bombardováním (FAB), ,, hmotovou spektrální analýzou a aminokyselinovou analýzou. Nalezený pík molekulového iontu (3369,9) byl v souladu s teoretickou molekulovou hmotností (3368,7) .+ I. Aminokyselinové poměry byly v souladu s požadovaným produktem:

Amínokyselina	teorie	na lezeno
Asp	1	1,00
Thr	2	1,84
Ser	3	2,55
Glu .......- -	4	3,.96.. -
G1 y .. ..	4... . ...	3.,98 : .
Ala	4	4,07
Val	2	1 ,95
Ile	1	0,9
Leu	2	1,94

Í.Í.

Tyr l 0,92

Phe 2 1,86

Lys ’ 1 0,96

Arg 2 1,55

Příklad 3

Syntéza

N-imidazopropionyl(Arg26(N -oktanoví(lysy134)))GLP—1(8-37))OH

N-Imidazolpropy1((Arg26)GLP-l(8-37)OH byl acylován N-sukcinimidyl-oktanoátem na N -aminu Lys¹⁴ následujícím způsobem.

N-Imidazopropionyl((Arg26)GLP-l(8-37)OH(70,5 mg, 0,021 mmol), připravený v příkladech 1 a 2 byl rozpuštěn ve 25 ml dimethylsulfoxidu (DMSO). N-Sukcinimidyloktanoát (19,1 mg, 0,079 mmol) byl pak přidán a vmíchán do roztoku. Pro dosažéni plného odchránéní epsilon aminoskupiny byl přidán lOnásobný molární přebytek tetramethylguanidinu (26,2 ml, 0,21 mmol). Reakční směs byla míchána při teplotě okolí a sledována pomocí HPLC. Po 45 minutách byla reakce ukončena 100 ml 0,lN HCl. Želatinové částice byly odstraněny průchodem směsi sloupečkem skelné vlny ve skleněné nálevce.

Oddělení titulního produktu od výchozích materiálů bylo dosaženo na preparativní HPLC koloně s C4 reverzní fází za použití nslédujících podmínek:

Puf ry:	A) 0,1% TFA, 5% acetonitril B) 0,1% TFA/50% CH3CN, 95% acetonitril
Kolona:	Vydac C18(2,2 x 25 cm)
Teplota:	oko 1 í
Průtok:	2,0 ml/min
Detektor:	280 nm

Gradient: 25-55% B během 300 min

Titulní produkt byl eluován při 44,6 až 46,7 % acetonitrilu podle analytické HPLC jednotlivých frakcí.

Vhodné frakce byly spojeny, zmrazený a lyofi 1 izovány. Reakce poskytla 22,7 mg (32 %) výtěžku o čistotě 87 % podle HPLC.

Další čištění bylo provedeno za použití druhého stupně preparativní HPLC při pH=7,,7 s následujícími podmínkami: Pufry: A) 0.1M (NH^HCOa, 10% acetonitril

B) O,1M (NHOHCO3, 50% acetonitril Kolona: Vydac C18(2,2 x 25 cm)

Teplota: okolí

Průtok: 2,0 ml/min

Detektor: 280 nm

Gradient: 50-90 % B během 300 min

Vzorek (22,7 mg) byl rozpuštěn ve 20 ml pufru A) a: nanesen na kolonu. Dělení složek bylo dosaženo za použití výše uvedeného gradientu. Titulní produkt byl eluován mezi

34.8 a 35,6 % acetonitrilu podle stanovení analytickou HPLC. Vhodné frakce byly spojeny a lyofilizovány. Bylo získáno 10,46 mg (46,1 %) titulního produktu o HPLC čistotě přibližně 99 %. Celkem bylo získáno pro oba RP-HPLC stupně hmotnostně

14.8 %.

Přiklad 4

Syntéza N-imidazoacetyl (Arg26)GLP-l (8-37).).011. .. . .. .........

Kyselina [N-(terc.butoxykarbonyl)-imidazol-4-yl]octová byla připravena z kyseliny 4-imidazoloctové chráněním inidazolového kruhu s terč.butoxykarbonylem následujícím způsobem. Di-terc.butyldikarbonát (1,1 ekv./ekv.aminu) byl přidán ke směsi volného aminu, uhličitanu draselného (1,1 ekv.) a 50% vodného dioxanu a celá směs byla míchána při teplotě místnosti 4 hodiny. Výsledná směs byla zředěna diethyletherem a vrstvy odděleny. Vodná vrstva byla okyselena 1, ON vodnou kyselinou citrónovou a extrahována třikrát methylenchloridem. Extrakty byly sušeny (MgSOO a rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu. Výsledný olej byl krystalován ze vhodného rozpouštědla.

»

Kyselina [N-(terč.butoxykarbony 1)-imidazo1-4-yl]octová pak byla kondenzována k (8-37)peptidylové pryskyřici popsané v příkladu 1 umístěním přibližně 0.5 g (1,8 mmol) do každé ze dvou histidinových patron a proběhnutím normálního hi5tidinového dvojitého kondenzačního cyklu na peptidovém syntezátorů Model 430A jak je popsáno v příkladu 2.

Modifikovaná peptidylová pryskyřice byla uvolněna z pryskyřice a čištěna v podstatě tak, jak je uvedeno v příkladu 2. UV absorbující frakce byly analyzovány pomocí HPLC a pak byly spojeny a lyofi 1 izovány za získání přibližné' 100 mg titulní sloučeniny. Vzorky byly pak charakterizovány:* rychlým atomovým bombardováním (FAB) a hmotovou spektrální analýzou. Nalezený molekulový pík je v souladu s teoretickou molekulovou hmotností.

Příklad 5

Syntéza N-[imidazo1-a,a-dimethy1-acetyl]GLP-1(8-37)OH

Kyselina a,σ-dimethy1-a-[N-(terc.butoxykarbony 1)imidazol-4-yl]octová byla připravena z zo

N-trityl-a,a-dimethyl-4-imidazol-acetonitrilu /J.I.DeGraw a spol., JMC, 20. 1671 (1977)/ následovně.

N-tri ty l-α,a-dimethyl-4-imidazol-acetonitri 1 (3,97 g,

10,5 mmol) byl přidán k 5% konc. HCl/methanolovému roztoku (25 ml) a celek byl refluxován tři hodiny před zahuštěním ve vakuu. Zbývají materiál byl rozdělen mezi 5N vod.HCl (25 ml) a ethylacetát (50 ml). Vodná vrstva byla oddělena a refluxována 24 hodin. Po zahuštění ve vakuu byla surová kyselina a,a-dimethyl-4-imidazoloctová rozpuštěna ve vodě a opět zahuštěna. Titulní sloučenina (1,88 g, t.t. 155 °C (rozkl.)) byla připravena ze surově kyseliny obecnou výše popsanou metodou.

Kyselina a,a-dimethy1-a-[N-(terč.butoxykarbony1)- . imidazo1-4-y1]-octová byla pak kondenzována k (8-37)peptidylové pryskyřici v podstatě stejným zpúsob.eni jako v předchozích příkladech.

Příklad 6 i

J.

Syntéza N-imidazoacetyl-GLP-1(8-36)NH2

GLP-1(8-36)ΝΗζ byl vyroben peptidovou chemií v pevné fázi na peptidovém syntezátoru Applied Biosystems (ABI) 460A za použití MBHA pryskyřice (ABI,serie # A1A023, 0,77 mmol/g). Všechny aminokyseliny měly své α-aminoskupiny chráněny terč.butyloxykarbony 1 (t-Boc) skupinou. Sloučeniny, s reaktivními postranními řetězci je měly chráněny, nás 1edovně: Arg(Tos)Ls(Cl-Z) , Trp(CHO) , Glu(CHe) , Tyr(Br-Z), Ser(Bzl) ,< Asp(OBzl), Thr(Bzl).

Chráněné aminokyseliny byly aktivovány v dichlormethanu (DCM) s jednou polovinou ekvivalentu dicyklohexylkarbodiimidu (DCC) na ekvivalent aminokyseliny za získáni symetrického anhydridu aminokyseliny. Nicméně byly argininový, glutaminový a glycinový 2bytek aktivovány při¹ tvorbě

1-hydroxybenzotriazolových (HOBt) esteru těchto aminokyselin (1:1:1 ekvivalenty aminokyseliny, HOBt a DCC v dimethy1formamidu (DMF)) .

Zbytky byly postupně připojeny od C-konce k N-konci sérií kondenzačních a odchraňovacích cyklů. Kondenzační cyklus byl tvořen tím, Že aktivované aminokyseliny procházely nukleofilní substitucí volného primárního aminu předchozí kondenzované aminokyseliny. Odchránění bylo odstranění N-koncové blokující skupiny Boc bezvodou kyselinou trifluoroctóvoú (TFA). Toto generovalo volnou aminoskupinu po neutralizaci diisopropylethylaminem (DIEA).

Skála syntézy byla 0,5 mmol. Koncentrace funkčních míst na MBHA-pryskyřici byla 0,77 mmol/g; užito bylo 649 mg pryskyřice. Pro všechny aminokyseliny byl použit dvojnásobný molární přebytek symetrického anhydridu. C-koncový arginin byl kondenzován k MBHA-pryskyřici podle standardních protokolů. Všechny zbytky byly dvojitě kondenzovány. To znamená, že každý zbytek byl kondenzován k pryskyřici dvakrát. Druhá kondenzace byla provedena bez stupně Boc odchránění před znovu přidáním aminokyseliny. Toto napomáhá úplnému zreagování všech volných aminoskupin na pryskyřici. Tryptofanový zbytek byl čtyřikrát kondenzován.

Titulní sloučenina byla připravena za použití peptidylové pryskyřice a R skupiny z příkladu 4 v podlstatě podle dříve uvedených příkladu. Po té co byla skupina R přidána k aminokonci a formylové skupiny byly odstraněny, byl peptid uvolněn z pryskyřice hydrolýzou kapalnou kyselinou fluorovodíkovou (HF) při 0 °C po 1 hodinu za použití teflonové reakční nádoby. Na každý gram peptidyl-pryskyřice byl přidán 1 tni m-kreso 1 ového pohlcovače a bylo užito 10 ml kapalného HF. Pohlcovač brání znovu napojení vedlejší řetězec blokujících skupin (uvolněny jako karbokationty) k peptidu. PO jedné hodině byl HF odstraněn ve vakuu a zbyla suspenze peptidu, pryskyřice a m-kresolu.

Peptid pak byl vysrážen v HF reakční nádobě ledové chladným diethyletherem. Sraženina byla převedena do 150 ml sintrované skleněné nálevky spolu s několika etherovými výplachy. Fyzická směs peptid/pryskyřice byla několikrát promyty studeným etherem pro odstranění zbytkového HF- a m-kresolu. Druhý stupeň byla extrakce peptidu‘z pryskyřice za použití 10% kyseliny octové ve vodě (obj./obj.). Vakuová, filtrace do čisté baňky s kulatým dnem poskytla roztoka surového peptidu. L l. „)-,,

Příklad 7

In vítro receptor vazebná zkouška (cAMP zkouška)

a) Krysí, GLP-1 receptor, membránový preparát:

Publikovaná DNA sekvence pro krysí. GLP-1 receptor (Thorens B. a spol., Proč.Nati.Acad.Sci.

USA89: 8641-8645 (1.9.92).). a. markér, gen dihydrofO-lát· reduktasové' rezistence byly použity ve spojení s pCR technikami pro konstrukt expresního vektoru. DXB-11 varianta buněčné linie vaječníků čínského křečka (CHO) byla transformována vektorem, což vedlo k rekombinantní CHO buněčné 1inii, která exprimovala krysí GLP-1 membránový receptor.

Buňky byly pěstovány a sklizeny a membránový preparát byl získán prvním proraytim buněk PBS pufrem, potom druhým promytím studeným pufrem (25 mM HEPES, 2 mM MgCl2, 1 nM EDTA, 20 pg/ml Leupeptinu, 1 mM PMSF, 2 pgml Aprotíninu, 50 pg/ml trypsin inhibitoru, pH 8,0) a resuspendovány v pufru. Buněčná suspenze byla lyžována ve skleněném Teflon homogenizéru a výsledný vzorek pak byl odstředován při 35300.x g po 30 minut při 4 °C. Supernatant byl odstraněn a peleta byla resuspendována ve studeném pufru a horaogenizována. PodíLy bvlv nnhnvát/ánv nvi O P r * ‘ ·

b) Cyklická AMP (cAMP) zkouška:

Vzorek membránového preparátu byl predinkubován s testovanou sloučeninou nebo kontrolní sloučeninou v pufru (25 mM HEPES, 0,2% (hmotn./obj.) BSA, pH 7,6) při 32 °C po 10 minut. Byl přidán reakční pufr (konečná koncentrace: 25 mM HEPES, 0,2% (hmotn./obj.)BSA, 2,6 mM Mg, 0,8 mM ATP, 0,1 mM GTP, 5 mM kreatin fosfát, kreatin kinasa 50 j/ml, 0,2 mM IBMX, pH 7,6) a inkubováno po dalších 30 minut. Inkubace byly ukončeny přídavkem 10 mM EDTA.

Byla stanovena produkce cAMP za použití fluorescentní stopovací imunozkouškové metody. Stručně, po ukončení inkubace byla přidána fluorescentní stopovací látka (cAMP-b phycoerythrin konjugát) a pak bylo přidáno afinitně čištěné anti-cAMP králičí antiserum. Po inkubaci při teplotě místnosti po 45 minut byly přidány zkušební perličky potažené anti-krá1 ičím IgG a inkubovány po dalších 15 minut. Plotny pak byly evakuovány a odečtena na Pandex PFCIA čtečce.

V této zkoušce vykazuje známé inzulinotropní činidlo jako je GLP—1(7—37) sníženou fluorescenční intenzitu díky zvýšené cAMP koncentraci. Hodnoty fluorescentní intenzity byly porovnány s rychlostí cAMP produkce (pmol/min/mg).

Naopak činidla nemající žádné inzulinotropní působení selhala při stimulaci produkce cAMP a proto nevykazuji Žádnou zvýšenou fluorescentní intenzitu.

Tabulka 1 cAMP zkouška

Sloučenina

Glp-1(7-37)OH

Arg²⁶-GLP-1(7-37)OH

N-imidazopropi onylGLP-1(8-37)0H

N-imidazopropionyl-Arg²⁵GLP-1(8-37)0H

N-imidazopropionyl-Arg²⁶Lys³⁴-N^-oktanoy1-GLP-l(8-37)OH

GLP-l(7-36)NH₂

N-imida2oacetyl-GLP-1(8-36)NH₂

N-imidazoacety l-Arg.².⁶-.....

GLP-1(8-37)OH a,a-imidazoacety1GLP-1(8-37)OH % relativní účinnosti

100.0 ± 18

140,8 ± 28,7

21,9 + 7,8 •ν,νι

89,0 ±12,6

8,8 ±1,4»

88,4 ±29,4

24,2 ±9,8

95-,0 ±- 14,-3 j

108,1 ± 22,4 ^aAcylované sloučeniny obecně mají uměle nízké hodnoty . účinnosti díky nespecifické vazbě.

Příklad 8

Zkoušky in vivo na psech *

a) Hyperglykemická svorková studie

Pokusy byly provedeny na beaglech (ve stáří 1-2 roky), samcích i samicích,při vědomí, kteří přes noc hladověli, o hmotnosti 8 až 15 kg. Posledních deset dnů před zkouškou byla zvířata anestetizována isofluoranem a byl proveden průřez v levé nebo pravé tříselné oblasti. Silastické katetry. byly zasunutu do femorální arterie a proximální kaudální femorální vény a zajištěny 4-0 hedvábnou suturou. Volné konce katetrů byly subkutánně zasunuty zpět za použití trokarové jehly. Katetry byly naplněny roztokem glycerin/heparin (3:1, obj./obj. konečná heparinová koncentrace 250 KlU/ml) a volné konce byly zavázány a umístěny v subkutánní kapse pro umožnění úplného uzavření kůže. Keflex^R byl podáván jak předoperati vně (20 mg/kg, IV a 20 mg/kg I.M.) a pooperačně (250 mg, p.o. jednou denně po sedm dní) pro zabránění infekcím. Torbugesic (1,5 mg/kg, I.M.) byl podán pooperačně pro potlačení bo1 esti.

Krev byla odebrána těsně před zkouškou pro stanovení zdraví zvířete. Pouze zvířata s hematokritem nad 38 % a počtem leukocytu pod ΙόΟΌΟ/mm³ byla použita.

Odpoledne před pokusem byly volné konce katetrů vyňaty ze subkutánní kapsy pomocí malého řezu provedeného pod místním umrtvením (2% lidokain) a psi byli opatřeni sestavou vesta s dlouhým provazem a límec.

Ráno v den pokusu byl obsah katetrú odsát, katetry byly propláchnuty salinickým roztokem a prodlužovací vedení (chráněná obalem z nerezové oceli) byla připojena ke katetrúm. Ráno byly provedeny IV injekční pokusy, kdy byly volnou jehlou zasunuty teflonové katetry perkutánně do cefalické vény pro přípravu podání IV bolusu testované substance. Pes byl umístěn do metabolické klece a prodlužovací vedení katetru a provaz byly připojeny k pružnému systému tak, aby se pes mohl volně pohybovat po kleci. V této době (-60 minut) započala exogenní infuze glukózy (50% hmotn./obj. ve vodě) trvalým venosním katetrem. Glukóza byla infundována klesajícím postupným způsobem během prvních šesti minut zkoušky pro rychlé zvýšení koncentrace glukózy v plasmě na 150 mg/dl. Koncentrace glukózy v plasmě byly stanovovány každých 2,5 až 7,5 minut po zbytek zkoušky a rychlost infuze byla upravována pro udržení koncentrace glukózy.v plasmě na 150 mg/dl.

Šedesát minut po začátku glukozové infuze (čas 0) byla podána testovaná substance bud intravenozně (1,0, 2,9, 5,0 nebo 10,0 pg/kg, dávka rozpuštěna ve 2 ml salinického roztoku, obsahujícího 0,3% psího albuminu, hmotn./obj.) předem zasunutým teflonovým katetrem nebo subkutánné (10 PS/kg; 150 pM ve fosfátovém pufrovaném salinickém roztoku) v dorzální oblasti krku.

. ..Ar.teriální krevní vzorky (3,5 ml) byly odebírány v době -30, -15, 0, 2,5, 5, 7,5, 10, 12,5, 15, 20, 30, 45, 60, 75,

90, 105 a 120 minut během IV studie a v době -30, -15, 0, 3,

6, 9, 12, 15, 20,- 30, 45, 60, 75, 90, 105 a 120 minut během SC studie. Vzorky byly uloženy do vakuových zkumavek pro odběr krve, obsahujících dvojsodný EDTA a ihned umístěna na led.

Pro zaháněni proteolytickému štěpení GLP-1(7—37) ve vzorcích plasmy, bylo 1,5 ml EDTA, obsahující krve přeneseno do polypropylenové zkumavky, obsahující 40 μΐ aprotininu (10000 KlU/ml) a dobře promícháno. Vzorky byly odstředěny a výsledná plasma byla-přenesena do polypropylenových zkušebních zkumavek a uchovávána na ledu během studie.

Po ukončení pokusu byla zvířata anestetizována (isofluoran), katetry byly promyty čerstvým salinickým ,· roztokem a naplněny směsí glycerin/heparin; volné konce katetrú byly zavázány a umístěny podkožně jak bylo dříve popsáno a bylo podáváno antibiotikum (300 mg Keflex¹¹, I.M.).

Koncentrace glukózy v plasmě byly stanoveny v den studie za použití glukóza oxidasa metody v Beckmanově glukozovém analyzátoru. Vzorky pro jiné pokusy byly uchovávány při -70 °C až do doby.analýzy. Koncentrace inzulínu byly stanoveny za použití komerčního kitu pro radíoiminozkoušku s vepřovým imzulinem jako standardem. Hladiny GLP-1 (7-37) byly stanoveny za použití dvojité protilátkové imínozkoušky.

Změna v inzulínu byla vypočtena jako rozdíl mezi koncentrací inzulínu v době t a průměrnou koncentrací inzulínu před injekcí testované substance (základní linie). Plocha pod křivkou změny inzulínu byla vypočtena za použití pravidla lochoběžníkú. Změna rychlosti infuze glukózy byla vypočtena jako rozdíl mezi rychlostí infuze glukózy během časového intervalu x a průměrnou rychlostí infuze glukózy béhem 30 minut před injekcí testované substance (základní linie). Plocha pod křivkou změny rychlosti infuze byla vypočtena za použití lichoběžníkového pravidla. Hodnoty jsou uvedena jako průměr ± standardní chyby měřeni (SEM).

b) Euglykeraické svorkové studie

Euglykemické svorkové studie byly provedeny způsobem shodným s hyperglykemickými studiemi s tím rozdílem, že koncentrace glukózy v plasmě byla udržována na nebo blízko základních hladin během studioe. Pro uskutečnění toho byly stanoveny koncentrace plasmové glukózy každých 2,5 až 5 minut po injekci testované substance. Jestliže se koncentrace glukózy v plasmě snížila o více než pět mg/dl vzhledem k předem stanoveným hodnotám, byla započata exogenní infuze glukózy (vodný roztok 50% glukózy, hmotn./obj.) přítomným venosnim katatrem pro pokus o udržení koncentrace plasmové glukózy blízko základní hodnoty. Protože venozní vedeni a jeho prodloužení byly naplněny heparinizovaným salinickým roztokem a ne glukózou, byla zde podstatná perioda zpoždění mezi dobou, kdy započala infuze a dobou, kdy se glukóza aktuálně dostala psovi. Z tohoto důvodu koncentrace glukózy se po krátkou dobu po podání léčiva snižují pod základná hodnotu. Pro získání přesně j š'í ho* hodnocení množství glukózy aktuálně infundované. do psů, bylo získáno hodnocení objemu mrtvého prostoru (-930 μΐ) a rychlosti infuze glukózy byly podle toho upraveny.

Změna v inzulínu byla vypočtena jako rozdíl mezi koncentrací inzulínu v době t a časově průměrnou koncentrací inzulínu před injekcí testované substance (základní. hodnota). Plocha pod křivkou změny inzulínu byla vypočtena použitím 1 i choběžn íkovéhp .pravidla... Hodno ty.. j sou-· uvedeny· -j ako průměr * ± standardní chyba průměru .(SEM) . .......

c) Testy orální glukozové tolerance

Testy orální glukozové tolerance byly provedeny ve skupině čtyř přes noc hladovějících, samců a samic beaglu o hmotnosti 12 až 14 kg. Příprava zvířat byla stejná jak je popsána výše. Po umístění do metabolické klece byla zvířata ponechána po dvacet minut v klidu před začátkem pokusu. Na konci této aklimatizačni periody byl odebrán vzorek nula; třiceti palcová, 24 Fr. gumová trubice byla zasunuta esofágem do žaludku zvířete; do žaludku byl touto trubicí injektován bolus glukózy (1,5 g/kg; 50% glukózy hmotn./obj. ve vodě) a pak 20ml bolus destilované vody) a byly spuštěny hodiny. O dvě minuty později byl injektován subkutánní bolus testované substance (3 nmol/kg nebo přibližně 10 pg/kg, 150 pM fosfátového pufrovaného salinického roztoku) do dorzální oblasti krku.

Navíc ke vzorku nula byly odebrány arteriální krevní vzorky (3,5 ml) v 5. 10,15, 20, 30, 40, 50, 60, 75, 90, 105, 120, 135, ISO., 165, 180, 195, 210, 225 a 240 minutách po podání glukózy. Vzorky byly odebrány do vakuových zkumavek pro odběr krve, obsahujících dvojsodný EDTA a’ zpracovány jak popsáno výše.

Na závěr pokusu byla zvířata anestetizována (isofluran); katetry byly vypláchnuty čerstvým salinickým roztokem a naplněny směsí glycerin/heparin; volné konce katetrú byly zavázány a umístěny subkutánně jak bylo popsáno dříve; a bylo podáváno antibiotikum (300 mg Keflex^R, I.M.).

Každý ze čtyř psu byl studován ve třech oddělených případech: jednou se subkutánním podáním fosfátem pufrovaného salinického roztoku, jednou s GLP-1(7-37) a jednou s N-imidazopropiony1(Arg26(N -oktanoyl(lysyl134)))GLP-1(8-37))OH. Pokusy na zvířatech byly opakovány nejméně o jeden týden později. Počet leukocytu a hematokrit byly stanoveny den před všemi pokusy.

Plocha inzulinu pod křivkou nad základní hodnotou (nulová časová inzulínová hodnota) byla vypočtena za použití lichoběžníkového pravidla. Glukozová plocha pod křivkou nad základní hladinou (nulová časová glukozová hodnota) byla vypočtena za použiti lichoběžníkového pravidla. Hodnoty jsou uvedeny jako průměr ± standardní chyba průměru (SEM).

Tabulka 2

I.V.Hypergiykemický (150 mg/dl) svorkový test na psech

Sloučenina dávka	n	trvání	max	změna	GIR
(Pg/kg)	)	účinku inzulínová inzulínu změna (min)⁴ (ng/ml)^b	inzulin AUC 0-60 min^c	změna AUC 0-60min^d
vehi kulum 0	7	neúč.	0,8+0,2	Ί± 14	23S±46
GLP-1(7-3ó)NH2 1,0	7	2,5	3,4+0,6	32 + 8	414±73
N-imidazopro- 1,0 propionyl- GPL-1(8-37)OH	3	7,5	3,1+0,8	52+18	399+63
N-imidazopro- 1,0 propionyl-Arg^{2 6}- GPL-1(8-37)OH	3	12,5	2,6±0,6	38± 16	419+122
Lys³*-N -oktanoyl-
GLP-1(7-37)OH 1,0	3	15	3,8+1,0	50±2	463+12

N-imidazopropionyl-Arg²⁶«I

Lys³⁴-N -oktanoyl-
GLP-1(7-37)OH 1,0	4 42,5	2,3+0,8	90+40	350+93
5,0	3 72,5	3,8±0,2	132±7	568+12

N-imidazopropionyl-Arg²⁶Ly s³ ^-N^-dekanoy1GLP-1(7-37)OH 5,0 2 neuč. 0,9±0,9 14±I0

236±58 «Trvání účinku inzulínu: Doba po kterou byla průměrná změna v inzulínu konzistentně > 0,5 ng/ml.

^b Max. změna inzulínu: max.zvýšeni v inzulínu nad základní hladinu pozorované během 120 minut periody testu.

^cZměna inzulín AUC: plocha pod křivkou změny inzulinu; představuje celkový inzulinotropní účinek peptidu. ^d GIR změna AUC; plocha pod křivkou změny rychlosti glukozové infuze, představuje celkový metabolický účinek peptidu.

Tabulka 3

S.C..Hyperg1ykemický (150 mg/dl) svorkový test na psech

Sloučenina dávka	n	trvání	max	změna	GIR
CúS/kg)	účinku	inzuli nová	i nzuli n	změna
		inzulinu změna	AUC	AUC
		(mi n)^a	(ng/ml)b	0-60 min^c	0-60min^d
vehikulum 0	5	neuč.	0,4+0,2	11±20	528+224
GLP-l(7-37)OH 10	5	27	1,6±0,8	64±33	696+145
N-imidazopro- 10	4	42	3,6±1,0	'97+39	811 ±2 1 6
propionyl-Arg²⁶-
GPL-1(8-37)OH				•
£ Lys^{3 4}-N-oktanoyl-
GLP-l(7-37)OH 10	5	neúč.	0,6+0,3	29±8	532+112
Arg²⁶-Lys ³⁴-N£ -
oktanoy1-GLP-l
(8-37)OH 10	4	neuč.	0,6±0,4	11 + 26	659+182
N-imidazopropionyl-	-Arg²⁸-
Lys³⁴-N- -oktanoyl-
GLP-l(7-37JOH 10	5	>90	2,0±0,4	113+24	926±26S

^aTrvání účinku inzulinu: Doba po kterou byla průměrná změna v inzulinu konzistentně > 0.5 ng/ml.

^b Max. změna inzulinu: max.zvýšení v inzulinu nad základní hladinu pozorované během 120 minut periody testu. ^cZměna inzulín AUC: plocha pod křivkou změny inzulinu: představuje celkový inzulinotropní účinek peptidu. ^d GIR změna AUC: plocha pod křivkou změny rychlosti glukozové infuze, představuje celkový metabolický účinek peptidu.

Příklad 9

Krysí in vivo zkoušky

a) Testy tolerance glukózy

Byly provedeny pokusy na bdících, přes noc hladovějících samcích Sprague Dawley (Charles River) nebo Zucker Diabetic Fatty (Genetic Models, lne.) krysách o hmotnosti přibližně 250 (krysy Sprague Dawley) nebo 300 (Zucker Diabetic Fatty krysy) gramů. Čtyři až pět dní před studií- byly krysy anestetizavány isofluoranem a polyethylenový (PE50) katetr byl zasunut do pravé jugulární vény. Katetr byl zajištěn svorkou na rány, naplněn salinickým roztokem, obsahujícím heoarin (2% sodný heparin) a uzavřen malou zátkou z nerezové oceli.

Í1 . Po šestnácti hodinách hladovění bylo dvanáct chronicky kanylovaných krys rozděleno do čtyř skupin po třech krysách na skupinu. Z ocasní vény bylo odebráno 0,4 ml krve, umístěno do mikrozkumavky, obsahující lithnou sůl heparinu a ihned umístěno na led (vzorek nulté minuty). Zavedenou jugulární kanýloubyl podán bolus glukózy (1,0 g/kg, 50% glukóza (hmotn./obj. ve vodě) a kanyla byla propláchnuta 200 μΐ salinickěho roztoku. 0 dvacet sekund později byl podán bolus testované substance (100 μΙ/100 g tělesné hmotnosti bud vehikula (salinieký roztok, obsahující 0,3 * (hmotn./obj.) hovězího sérového albuminu) nebo vehikula obsahujícího analog) jugulární kanylou a kanyla byla vypláchnuta jako předtím. Krysám byla odebírána krev z ocasu opět po 2, 5, 10, 20 a 30 minutách po podání bolusu glukózy a vzorky byly zpracovány jak popsáno výše. Na konci pokusu byly vzorky krve odstředěny a plasma byla shromážděna.

Koncentrace glukózy v plasmě byly stanoveny v den pokusu za použití kopulovaného hexokinasového postupu v klinickém chemickém analyzéru. Plasma pro inzulínová stanovení byla zředěna nulovým kalibrátorem a zmrazená na -20 °C do doby analýzy. Inzulínové koncentrace byly stanoveny za použití komerčního, radioimunozkouškového kitu a krysím inzulínem jako standardem. 'ji*'

Inzulínová změna (změna v inzulínu ze základní hodnoty) byla vypočtena jako rozdíl mezi koncentrací inzulínu v. době t a koncentrací inzulínu v době nula. Plocha pod křivkou změny inzulínu byla vypočtena za použití lichoběžníkového pravidla. Změna plasmové glukózy (zvýšení plasmové glukózy nad základní hladinu) byla vypočtena jako rozdíl mezi koncentrací glukózy v plasmě v čase t a koncentrací glukózy v plasmě v čase nula. Plocha pod křivkou změny plasmové glukózy byla vypočtena za použití 1ichběžníkového pravidla. Hodnoty jsou uvedeny jako průměr ±-standardní -chyba průměru (SEM). *...................

b) Hyperglykemická svorková studie

Pokusy byly provedeny na trvale katetrizovaných, normálních, samcích krys Sprague Dawley o hmotnosti asi 350 gramů. Alespoň týden před studií byl proveden chirurgický zákrok na krysách pod anestezií isofluranem. Dva katetry byly implantovány do jugulární vény pro infuze glukózy a peptidu a jeden katetr do arteria carotis pro odběr vzorků krve.

Katetry byla protaženy kůži na temeni hlavy, naplněny roztokem glycerin/heparin (3:1, obj./obj.) a uzavřena jednocentimetrovou zátkou z nerezové oceli. Zvířata byla umístěna jednotlivě v klecích z drátěného pletiva a krmena volně standardní potravou pro krysy a vodou.

Katetrizované krysy nebyly krmeny přes noc před pokusem. Ráno v den pokusu byly krysy zváženy a vzorkovací trubičky byly připojeny k jejich trvalým katetrům. Trubičky byly uzavřeny v lehkých nerezových obalech pro ochranu. Během studie byly krysy udržovány neomezeně v klíckách z plastu (12 x 10 x 12) s asi jednopalcovou podlážkou. Po 15 minutách aklimatizace byly odebrány základní vzorky pro měření hladin inzulínu a glukózy. V době -60 minut byl krysám podán bolus 20% dextrozy pro zvýšení plasmové glukózy na 150 mg/dl. Koncentrace plasmové glukózy byla udržována na této ’ hladině během stidie. meřením koncentrace plasmové glukózy každých pět minut a příslušným upravováním kalibrované variabilní infuzní pumpy. Krevní vzorky byly odebírány v minutě -15 a 0 pro základní měření. Ihned po odebrání nulového vzorku byl injektován peptid (130-155 μΜ koncentrace, ředěn ve fosfátovém salinickém pufru) katetrem v jugulární véně a promyt salinickým roztokem. Vzorky krve byly odebírány pro stanovení glukózy a inzulínu v minutě 2,

4, 6 ,8, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, a 90. Všechny krevní vzorky byly odebrány do stříkaček potažených sodnou solí heparinu, převedeny do mikroodstředivkových zkumavek a umístěny do ledu. Vzorky krve byly pak odstředěny v mikroodstředivce pro oddělení plasmové složky.

Hladiny glukózy byly stanoveny v den studie metodou glukosa oxidasa za použití zařízení Beckman Glucose Analyzer 2, zatímco inzulínové koncentrace byly měřeny komerčním kitem (Diagnostic Products Corporation) s krysím inzulínem jako standardem.

Změna inzulínu (změna inzulínu od základní hodnoty) byla vypočtena jako rozdíl mezi koncentrací inzulínu v době t a průměrnou koncentrací inzulínu před injekcí testované substance. Plocha pod křivkou změny inzulínu byla vypočtena za použití lichoběžníkového pravidla. Změna v rychlosti infuze glukózy (procento_:změny v rychlosti infuze .glukózy od základní hodnoty) byla vypočtena jako rozdíl mezi hodnotou rychlosti glukózy v době t a průměrnou, rychlostí infuze glukózy před injekcí testované substance, děleno průměrnou rychlosti infuze glukózy před injekci testované substance, krát 100. Plocha pod křivkou změny rychlosti infuze glukózy byla vypočtena na změnu hodnot absolutní rychlosti glukozové infuze (vypočtené jako rozdíl mezi hodnotou rychlosti infuze glukózy v čase t a rychlostí infuze glukózy v době před injekcí testované substance) za použití lichoběžníkového pravidla. Hodnoty jsou uvedeny jako průměe ± standardní chyba průměru (SEM),

Tabulka 4
IV test tolerance glukózy	(1 g/kg) u	krys
Sloučenina	dávka	n	změna	max.	změna
	mg/kg		inzulinu	změna	inzulinu
			ng/ml,min	inzulinu	za 10 min
			0-15 min*	ng/ml^b	ng/ml^c
vehikulum	0	196	33 + 1	2,9+0,1	2,2±0, 1
GLP-1(7-36)NH₂	0,2	5	34±4	4,0+0,8	1,8±0,5
	0,3	4	50± 13	6,1+0,7	2,2±1,2
	0,4	5	73± 14	7,7±l ,0	3,8+1,0
	0,6	6	67±11	7,7±1,2	3,4+0,9
	0,8	3	97±25	11,3±2,8	4,lil,8
	1,0	8	89+16	11,4±2,3	3,9±0,7
	2,0	5	106+11	11,7±1,3	4,9±0,7
GLP-1(7-3 7)OH	0,6	3	79±8	7,8±t, 1	5,4+1,2
	0,92	2	' 75+12	8,4+0,2	3,5±l'2
	1,2	3	77± 17	8,4+1,6	4,2±1 ?3

N-imidazoacety1-

GLP-1(8-36)NH₂	0,05	3	49±6	4,9±0,9	2,5+0,2
	0, 15	3	55±8	5,9±1,4	2,8+0,1
	0,3	3	98+29	10,5±2,3	5,5+1,4
	0,6	. 3	105 + 4	13,0±0,4	4,8+0,1
	0,92	3	95±11	12,0+1,2	4,0+0,5
	1,2	2	117 + 6 '	13,7±0,5	6,0±0,4
	2,0	5	106+11	11,7+1,3	4,9±0,7
N-imidazoacety 1	-Arg²⁶
GLP-1(8-37)OH	1,2	2	85± 13	9,8±2,5	3,6±0,5

2,4	3	170+16	16,5+3,9	9,8+2.5
N-imidazopropionyl-
GLP-1(8-37)OH 0,1	3	70+4	7,8+0,3	3.2+0,5
0,2	9	92+6	10,2±0.6	5,0+0,6
0,4	6	74±12	7,7+1.6	4,S±0,7
0,8	6	121+16	13,3± 1,8	7,5+1,1
1,0	4-	98+11	12,4+1,6	5,4±0,4
2,0	4	1 27±24	16,1+3,0	5,9+1,1

N-imidazoprop i ony1-Arg^{2 6}-

GLP-1(8-37)OH	0,6 0,92 1,2	2 3 6	114+13 85±7 127+13	11,8+2,1 9,2+1,8 12,9+1,8	7,7+0,8 5,5+0,9 8,2+1,1
Lys³⁴-N -oktanoyl-
GLP-1(7-37)OH	0,6	3	3 3±8	5,0+2,3	1,3+0,2
	1,2	3	136±30	. 13,l±2,0	10-,0 + 2,8

N-imidazopropi ony1-Arg^{2 6}Lys³⁴-N -oktanoyl-

GLP-1(8-37)OH 1,2	6	100+18	8,5±t,7	8,3+1,5
1,6	3	60+11	5,9±1 ,6	4,3±0,7
2,4	3	128±22	12,9±2,5 ‘	• 10,1+1,6

^aInzulinová změna AUC: Plocha pod křivkou změny inzulínu, představuje celkovou inzulinotropní aktivitu peptidů.

^Max změna inzulínu; maximální zvýšení inzulínu nad základní hladinu (obvykle pět minut po injekci).

^cZměna inzulínu po 10 min: Změna v inzulínu od základní linie měřená 10 minut po injekci. V aktivních analogách je tato hodnota bližší max změně inzulínu (v %) , delší doba působení analogu.

Tabulka 5

I.V.Hyperglykemický (150 mg/dl) svorkový test na krysách

S1oučen i na	dávka	n	t rván í	raax	změna	GIR
	(pg/kg)	úč i nku	inzulínová inzulín	změna
			inzulinu změna	AUC	AUC
			(mi n)^a	(ng/ml)^b	0-15 min^c	0-30min^d
veh ikulum	0	4	neuč.	0,l±0, 1	0,5+1,7	39+10
GLP-1(7-37)OH	0,05*	4	6	1,6±0,3	3,0±l.6	48 + 22
	Π 1	4	á	o r _l i ί J # u-i , -	«> -L -Ί O	» r n j_ r
	V _ř i	·	u	f » t □	l J U ϋ J
	0,2	3	6	2,8±0,1	5,8+0,9	154+10
	0,6	4	6	4,9+1,3	14,9±2,9	151±46
	1,0	5	6	7,7±0,8	16,7±4,0	131+29
	2,0	4	6	3,6+0,9	11,5*1,0	152+3-6
	4,0	4	40	2,0±0,4	10,4+5,0	139±27
N-iraidazopro-	1,0	5	15	6,6+2,2	25,6±3,6	324±45

propionyl-Arg²⁶-

GPL-1(8-37)OH
Lys³⁴-N -oktanoyl-
GLP-1(7-37)OH	1,0	4	4	2,4±0,8	13,2±2,5	132±38
N-imidazopropionyl-	Lys	3 4 —
N -oktanoyl-
GLP-1(S-37)OH	1,0	5	5	1,0+0,2	7,6±2,5	183+38
Arg²⁶-Lys ³⁴-N	-oktanoyl-
GLP-1(7-37)OH	0,05	4	30	0,7±0,2	6,3±1 ,4	75+32
	1,0	4	20	5,2+1,8	35,5+10,9	294+25
	2,0	5	10	3,8±Q,9	32,5+10,4	245±58
	4,0	5	20	4,7±0,8	35,7+4,8	274±71

N-imidazopropionvl-Arg²⁶C

Lys ³ *-N -oktanoy1-

GLP-1(8-37)OH 0,05	4	8	0,5+0,2	3,3+1,4	124±34
1,0	5	30	4,2+1,3	26,5+7,8	218±41
2,0	4	60	5,2±2, 1	45,4+15,5	35 I ±66	i
4,0	4	40	6,0+3,0	45,5±13,S	380+40

N-imidazopropiony1-Arg²Lys ^{3 4}-N“-dekanoy1GLP-1(á-37)OH 1,0 4 15

0,8+0,1 4,5±2,0 83 + 17 ^aTrvání účinku inzulínu: Doba po kterou byla průměrná změna v inzulinu >0 ng/ml.

^b Max. změna inzulínu: max.zvýšení v inzulínu nad základní hladinu během 90 minut periody testu. ^cZměna inzulín AUC: plocha pod křivkou změny inzulínu; představuje celkový inzulinotropní účinek.peptidu.

.. . ' -H ^d GIR změna AUC: plocha pod křivkou změny rychlosti glukozové infuze (v mg/kg/min), představuje celkový metabolický účinek peptidu.

Claims

1. Sloučenina obecného vzorce 1

R¹-AIa-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Va1-Ser-SerTyr-Leu-Glu-Gly-G1y-Ala-A1a-Xaa-G1u-Phe-I1e„ r< i .. , - n i a-υι y^-ng-£\^j (vzorec 1) kde R¹ je vybrán ze skupiny, zahrnující

4-imidazopropiony1(des-amino-hístidy1) , 4-imidazoacety1, nebo 4-imidazo-a,a-dimethyl-acetyl,

R² je vybrán ze skupiny, zahrnující C&-Cio nerozvětvený acyl, nebo není přítomen,

R^{3 4 5 6} je. vybrán ze skupiny, zahrnující Gly-OH-nebo NH2 a Xaa je Lys nebo Arg, nebo její farmaceuticky přijatelná sůl *»

2. Sloučenina podle nároku 1, je Ca nerozvětvený acyl.

3. Sloučenina podle nároku 2,

4. Sloučenina podle nároku 1, a R² je Cs nerozvětvený acyl,

5. Sloučenina podle nároku 4,

6. Sloučenina podle nároku 1, kde R¹ je 4-imidazoacety1 a R² kde R² není přítomen.

kde R¹ je 4-imidazopropiony1 R³ je Gly-OH a Xaa je Arg.

kde R² není přítomen.

kde R¹ je 4-imidazo-a,a-acetyl