CZ20023677A3

CZ20023677A3 - ortho-Substituované anthranilamidy a jejich použití k potlačení angiogeneze

Info

Publication number: CZ20023677A3
Application number: CZ20023677A
Authority: CZ
Inventors: Martin Krüger; Andreas Huth; Orlin Petrov; Dieter Seidelmann; Karl-Heinz Thierauch; Martin Haberey; Andreas Menrad; Alexander Ernst
Original assignee: Schering Aktiengesellschaft
Priority date: 2000-05-09
Filing date: 2001-05-08
Publication date: 2003-02-12
Also published as: BG107261A; PL358204A1; DE50101364D1; RU2264399C2; WO2001085719A9; DK1280799T3; CN1427837A; DE10023486C1; HK1056728A1; US7081468B2; NO20025358D0; CN1237062C; TR200400912T4; KR20020094024A; ZA200209896B; AU7400101A; BR0110621A; US20040102441A1; HUP0301954A2; AU2001274001B2

Description

ortho-Substituované anthranilamidy a jejich použití k potlačen angiogeneze

Oblast techniky

Vynález se týká ortho-substituovaných anthranilamidů a jejich použití jako léčiv k terapii onemocnění, která jsou vyvolána perzistentní angiogenezí.

Dosavadní stav techniky

Perzistentní angiogeneze může být příčinou různých onemocnění, mezi které patří psoriáza, artritida jako je reumatoidní artritida, hemangiom, angiofibrom, oční onemocnění jako je diabetická retinopatie, neovaskulární glaukom, onemocnění ledvin jako je glomerulonefritida, diabetická nefropatie, maligní nefroskleróza, trombické mikroangiopatické syndromy, odmítání transplantátu a glomerulopatie, fibrotická onemocnění jako je cirhóza jater, onemocnění způsobená proliferací mesangiálních buněk a arterioskieróza, nebo může vést ke zhoršení těchto onemocnění

K léčbě takových onemocnění i jiných VEGF -indukovaných patologických angiogenezí a vaskulárních permeabilních stavů, jako je vaskularizace nádorů, je možno použít přímou nebo nepřímou inhibici VEGF-receptoru. Tak například je známo, že rozpustné receptory a protilátky proti VEGF mohou inhibovat růst nádorů.

Perzistentní angiogeneze je vyvolána faktorem VEGF přes jeho receptor. K tomu, aby se tento účinek VEGF rozvinul, je nutné, aby se VEGF vázal na receptor a vyvolala se fosforylace tyrosinu.

Jsou již známy fenyl-anthranilamidové deriváty, které se používají jako antagonisté angiotensinu II (EP 564 356) a jako látky s protizánětlivým a antiulcerogenním účinkem (US 3,409,668) .

Podstata vynálezu

Nyní bylo nalezeno, • ·

že sloučeniny obecného vzorce I

kde

-ve—kte-r-é—R-—je atom . chl oru, . a tom. ..bromu, nebo skupina OCH₃,

skupina

ve které R⁷ je skupina CH₃ nebo atom chloru,

skupina

F

ve které R⁸ je skupina CH₃, atom fluoru, atom chloru nebo skupina CF₃, skupina

ve které R⁴ je atom fluoru, atom chloru, atom bromu, skupina -CF₃, skupina -N=C, skupina CH₃-, skupina -OCF₃ nebo skupina -CH₂OH, skupina

nebo atom chloru,

-4R² je pyridylová skupina, skupina

a

R³ je atom vodíku nebo atom fluoru, právě tak jako jejich izomery a soli, zabraňují fosforylaci tyrosinu, eventuelně perzistentní angiogenezi, čímž zabraňují růstu a šíření nádorů.

Existují různé tyrosinkinasy (website: S. Hauk, A.M.Quinn,

Meth. in Enzymol. 200, 38-62 (1991), specielně v katalytické doméně, podskupina PTK, skupina XIV, web str:

http://www.sdsc.edu/Kinases/pkr/pk catalvtic/pk hanks seq align long.html, a Mc Tigue a spol., Structure 7, 319-330 (1999)), které mohou být inhibovány podobným způsobem. Tyrosinkinasa C, která se nachází mezi jiným i v kmenových buňkách, je obvykle rovněž inhibována sloučeninami, inhibujícími VEGF (vascular endothelial growth factor). Je tedy žádoucí mít k dispozici sloučeniny, které -s-eie-kt-i-v-ně-ú.-nhibuj-í_VE.G.E-._______'__________________

Sloučeniny podle vynálezu se vyznačují tím, že mají tyto selektivní vlastnosti a proto představují cenné sloučeniny, zabraňující růstu a šíření nádorů.

Sloučeniny obecného vzorce I podle vynálezu zahrnují i možné tautomerní formy i E- nebo Z-izomery nebo, pokud je přítomno chirální centrum, rovněž racemáty a enantiomery.

Pro svou inhibiční aktivitu vůči fosforylaci VEGF-receptoru jsou sloučeniny vzorce I i jejich fyziologicky přijatelné soli použitelné jako léčiva. Na základě svého profilu účinnosti se sloučeniny podle vynálezu hodí k léčbě onemocnění, vyvolaných perzistentní angiogenezí.

-5Protože sloučeniny vzorce I byly identifikovány jako inhibitory tyrosinkinasy KDR a FLT, jsou vhodné zvláště k terapii onemocněni, vyvolaných perzistentní angiogenezi, indukovanou přes VEGF-receptor, nebo zvýšením cévní permeability.

Předložený vynález se týká rovněž použití sloučenin podle vynálezu jako inhibitorů tyrosinkinasy KDR a FLT.

Předložený vynález se tedy rovněž týká léčiv pro terapii nádorů, eventuelně jejich použití.

Sloučeniny podle vynálezu se mohou použít, buď samotné nebo ve formulacích, jako léčiva k terapii psoriázy, artritidy jako je reumatoidní artritida, hemangiomu, angiofibromu, očních onemocnění jako je diabetická retinopatie, neovaskulární glaukom, nemocí ledvin jako je glomerulonefritida, diabetická nefropatie, maligní nefroskleróza, trombické mikroangiopatické syndromy, odmítání transplantátu a glomerulopatie, fibrotických onemocnění jako je cirhóza jater, onemocnění způsobených proliferací mesangiálních buněk, arteriosklerózy a poškození nervové tkáně.

Sloučeniny podle vynálezu je též možno použít pro zamezení reokTůze'cév“po zákroku balónkovým kálet.rem,—ρ-ř-i— eé-v-n-í------------protetice nebo po použití mechanických prostředků pro udržení průchodnosti cév jako jsou například stenty.

Při terapii poškození nervové tkáně je možno působením sloučenin podle vynálezu zabránit rychlé tvorbě jizev na místech poškození, t.j. tvorbě jizev se zabrání než dojde k opětnému spojení axonů. Tím se usnadní znovuvytvoření nervových spojů.

Dále je možno působením sloučenin podle vynálezu potlačit u pacientů tvorbu ascitu. Právě tak se dají potlačit i VEGF-podmíněné edémy.

Taková léčiva a jejich formulace a použití jsou rovněž předmětem předloženého vynálezu.

Vynález se dále týká použití sloučenin obecného vzorce I pro přípravu léčiva k terapii nádorů, psoriázy, artritidy jako je reumatoidní artritida, hemangiomu, angiofibromu, očních onemocnění jako je diabetická retinopatie, neovaskulární glaukom, nemocí ledvin jako je glomerulonefrítida, diabetická nefropatie, maligní nefroskleróza, trombické mikroangiopatické syndromy, odmítání transplantátu a glomerulopatie, fibrotických onemocnění jako je cirhóza jater, onemocnění způsobených proliferací mesangiálních buněk, arteriosklerózy a poškození nervové tkáně, k zamezení reokluze cév po zákroku balónkovým katetrem, při cévní protetice nebo po použití mechanických prostředků k udržení průchodnosti cév, jako jsou například stenty.

Pro použití sloučenin vzorce I jako léčiv se tyto sloučeniny převedou na formu farmaceutického prostředku, který vedle účinné látky obsahuje organické nebo anorganické inertní farmaceutické nosiče, vhodné pro enterální nebo parenterální aplikaci, jako například vodu, želatinu, arabskou gumu, mléčný cukr, škrob, stearát hořečnatý, talek, rostlinné oleje, polyalkylenglykoly atd. Farmaceutické preparáty mohou být v tuhé formě, například jako tablety, dražé, čípky nebo tobolky, nebo v kapalné formě, například jako roztoky, suspenze nebo emulze. Mohou popřípadě navíc obsahovat pomocné látky jako konzervační látky, stabilizátory, síťovadla nebo emulgátory, soli pro změnu osmotického tlaku nebo pufry.

Pro parenterální aplikaci jsou vhodné zvláště injekční roztoky nebo suspenze, obzvláště vodné roztoky aktivních sloučenin v polyhydroxyethoxylovaném ricinovém oleji.

Jako nosné systémy je možno použít také povrchově aktivní pomocné látky jako jsou soli žlučových kyselin nebo živočišné nebo rostlinné fosfolipidy, ale i jejich směsi, právě tak jako liposomy nebo jejich složky.

Pro orální aplikaci jsou vhodné zvláště tablety, dražé nebo tobolky s talkem a/nebo sacharidovým nosičem nebo pojivém, jako

-Ί-

je například laktosa nebo kukuřičný nebo bramborový škrob. Aplikace je možná i v tekuté formě, jako například ve formě šťávy, ke které se popřípadě přidá sladidlo.

Dávkování účinných látek závisí na formě podávání, na stáří a hmotnosti pacienta, na druhu a závažnosti léčené nemoci a na podobných faktorech. Denní dávka obnáší 0,5-2000 mg, s výhodou 50-1000 mg, přičemž lze tuto dávku podat jednorázově nebo rozdělenou do dvou nebo několika dílčích dávek.

Výšepopsané formulace a aplikační formy jsou rovněž předmětem předloženého vynálezu.

Sloučeniny podle vynálezu se připravují o sobě známými metodami. Tak například sloučeniny vzorce I se připraví tak, že

kde R⁴ až R⁷ mají výšeuvedený význam, T je atom vodíku nebo, chránící skupina, a A je atom halogenu nebo skupina OR¹³, přičemž R¹³ je atom vodíku, Ci_₄-alkylová skupina nebo Ci-4-acylová skupinan nebo tvoří s T kruh, se napřed alkyluje na aminové skupině a pak se skupina COA převede na amid, načež se popřípadě odštěpí chránící skupiny, nebo se napřed převede na amid a následně N-alkyluje;

nebo

b) sloučenina vzorce III kde R⁴ až R⁷ mají výšeuvedený význam a T je atom vodíku nebo chránící skupina, se metaluje v ortho-poloze a pak se za zachycení elektrofilem převede na amid, odštěpí se chránící skupina a aminová skuina se alkyluje;

• · · · · · · · ·· · ··· ··· ·»' ·»·· nebo

c) sloučenina vzorce IV kde R⁴ až R⁷ mají výšeuvedený význam, T je atom vodíku nebo chránící skupina, a B je atom halogenu, O-triflát, O-tosylát nebo O-mesylát, se převede na amid, odštěpí se chránící skupina a aminová skupina se alkyluje.

Pořadí kroků lze ve všech třech případech zaměnit.

Příprava amidů se provádí metodami, známými z literatury. Amidy lze připravit z příslušného esteru. Ester se popsaným způsobem (J. Org. Chem. 8414 (1995)) podrobí reakci s odpovídajícím aminem v přítomnosti trimethylaluminia v rozpouštědle jako je toluen, při teplotě 0 °C až do teploty varu rozpouštědla. Tato metoda je použitelná i u nechráněných esterů kyseliny anthranilové. Jestliže molekula obsahuje dvě esterové skupiny, převedou se obě na stejný amid.

Při použití nitrilů místo esterů získají se za analogických podmínek amidiny.

Amidy je však možno připravit i všemi postupy,__známými _z„chemie_______ pěptidů. Tak například se může odpovídající kyselina v aprotickém polárním rozpouštědle, jako je například dimethylformamid, převést na aktivovaný derivát, který například vznikne reakcí s hydroxybenzotriazolem a karbodiimidem, jako je například diisopropylkarbodiimid, nebo také reakcí s předem připraveným činidlem, jako je například HATU (Chem. Commun. 201 (1994)) nebo BTU, a tento aktivovaný derivát se podrobí reakci s aminem při teplotě mezi 0 °C a teplotou varu rozpouštědla, s výhodou při 80 °C, v případě HATU s výhodou při laboratorní teplotě. Tyto metody se dají použít i u nechráněných anthranilových kyselin. Amidy je možno připravit i přes smíšený anhydrid kyseliny, přes imidazolid nebo přes azid. Ve všech těchto případech předběžné chránění aminové skupiny, například ve formě amidu, není nutné, může však reakci

	•	4 4 *444 • 4	• • 4	4 4 4	•	•4 4'	• 4 4
—	•	• ·	•	4	4	4	4
	•	• 4	4	4	•	4	•
		♦ « 4 .	444	'4 4·		4 4	4*4 4

příznivě ovlivnit. Jako výchozí sloučeniny mají zvláštní postavení anhydridy kyseliny isatinové, ve kterých je chráněna aminová skupina a současně je aktivována kyselinová funkce.

Jestliže se amin předtím převede na BOC-chráněnou sloučeninu, je ji možno v ortho-poloze metalovat reakcí s organokovovými sloučeninami, jako je například n-butyllithium, a následně ji reakcí s isokyanáty nebo isothiokyanáty převést na anthranilamidy resp. anthranilthioamidy. Přítomnost atomu bromu nebo atomu jodu v této ortho-poloze usnadňuje tuto ortho-metalaci díky výměně halogen-kov. Jako rozpouštědla jsou vhodné ethery, jako je diethylether nebo tetrahydrofuran, nebo uhlovodíky, jako je je hexan, ale také jejich směsi. Je výhodné přidat komplexotvorné sloučeniny jako tetramethylethylendiamin (TMEDA). Reakční teplota se pohybuje mezi -78 °C a laboratorní teplotou. Štěpení BOC-amidů se provádí působením kyselin jako je kyselina trifluoroctová, bez rozpouštědel nebo v rozpouštědlech jako je methylenchlorid, při teplotách od 0 °C až do teploty varu rozpouštědla, nebo reakcí s vodnou kyselinou solnou, s výhodou s 1 N kyselinou solnou, v rozpouštědlech jako ethanol nebo dioxan při teplotách od laboratorní teploty až do t-eploty varu rozpouštědla_.-----------------Amidová skupina se však může zavést i karbonylací. Při tom se vychází z odpovídajících sloučenin vzorce IV (o-jodanilinů, o-bromanilinů nebo o-triflyloxyanilinů), které se podrobí reakci s kysličníkem uhelnatým za atmosférického, nebo také zvýšeného tlaku, a s aminem v přítomnosti katalyzátorů na bázi přechodového kovu, jako je například chlorid palladnatý, octan palladnatý, nebo také palladiumtetrakistrifenylfosfin, v rozpouštědle jako je dimethylformamid. S výhodou se může přidat ligand jako je trifenylfosfin a báze jako je tributylamin (viz například J. Org. Chem. 3327 (1974); J. Org. Chem. 7482 (1996); Synth. Comm. 367 (1997); Tetrahedron Lett. 2835 (1998)).

-10>·«··· · · ·· *· • » * · · ·· · ♦ « • · · · · · · ♦ · · · ♦ · · · ·· · ··· ··· ····

Jestliže se mají do molekuly zavést různé amidové skupiny, musí se například druhá esterová skupina zavést teprve po přípravě první amidové skupiny a pak teprve převede na amid; u molekuly, která obsahuje jednu skupinu ve formě esteru a druhou jako kyselinu, je možno tyto skupiny převést na amidové skupiny jednu po druhé rozdílnými metodami.

Thioamidy je možno získat z anthranilamidů reakcí s difosfadithiany (Bull. Soc. Chim. Belg. 87, 229 (1978)), nebo reakcí s fosforpentasulfidem v rozpouštědlech jako je pyridin, nebo i bez rozpouštědla, při teplotách od 0 °C až do 200 °C.

Jako aromáty, bohaté na elektrony, se produkty mohou podrobit elektrofilní aromatické substituci. K substituci dochází v ortho- nebo para-poloze k aminové skupině nebo k jedné z aminových skupin. Je tak možno provést Friedelovu-Craftsovu acylaci působením chloridů kyselin v přítomnosti FriedelovýchCraftsových katalyzátorů jako je například chlorid hlinitý, v rozpouštědlech jako je nitromethan, sirouhlík, methylenchlorid nebo nitrobenzen, při teplotách mezi 0 °C a teplotou varu rozpouštědla, s výhodou při laboratorní teplotě.

Jednu nebo více nitroskupin je možno zavést podle postupů, známých z—l-i-te-ratury; napTíTklličrpůsobením nitrační směsi, různě koncentrované kyseliny dusičné bez rozpouštědla, nebo působením dusičnanů kovů jako jsou například dusičnan měďnatý nebo dusičnan železitý, v polárních rozpouštědlech jako ethanol nebo kyselina octová, ale také v anhydridu kyseliny octové.

Zavedení halogenů probíhá podle postupů, popsaných v literatuře, například reakcí s bromem, N-bromsukcinimidem, N-jodsukcinimidem nebo urotropinhydrotribromidem, v polárních rozpouštědlech jako je tetrahydrofuran, acetonitril, methylenchlorid, kyselina octová nebo dimethylformamid.

Redukce nitroskupiny se provádí v polárních rozpouštědlech při laboratorní nebo zvýšené teplotě. Jako katalyzátory pro tuto redukci jsou vhodné kovy jako je Raneyův nikl nebo katalyzátory na bázi drahých kovů jako je palladium nebo platina nebo také

44 • •	• 4	4 4 4 4 « 4	4 4 4	4 4 4 4	•4	44 4
4 -4	4 4
4	4	4	4	4	4	4	4
44		4	4 4 4	4 4 4	'4 4		4 4 4

hydroxid palladnatý, popřípadě na nosičích. Místo vodíku je možno známými způsoby použít také například mravenčan amonný, cyklohexen nebo hydrazin. Rovněž se mohou použít redukční činidla jako je chlorid cínatý nebo chlorid titanitý, právě tak jako komplexní hydridy kovů, popřípadě v přítomnosti solí těžkých kovů. Jako redukční činidlo je použitelné i železo. Reakce se pak provádí v přítomnosti kyseliny jako je například kyselina octová nebo chlorid amonný, případně za přídavku rozpouštědla jako je například voda, methanol, nebo v soustavě železo/amoniak, apod. Při delší reakční době může při této variantě docházet k acylaci aminoskupiny.

Pokud je žádoucí alkylovat aminoskupinu, může se alkylace provést obvyklými metodami, například působením alkylhalogenidů, nebo podle Mitsunobuovy varianty reakcí alkoholu v přítomnosti například trifenylfosfinu a azodikarboxylátu.

Amin je možno rovněž podrobit reduktivní alkylaci s aldehydy nebo ketony v přítomnosti redukčního činidla jako je například kyanoborohydrid sodný ve vhodném inertním rozpouštědle jako například v ethanolu, při teplotách od 0 °C do teploty varu rozpouštědla. Když se vychází z primární aminové skupiny, může se popřípadě provést reakce se dvěma . různými-karbon-y-l-ov-vml---sloučeninami po sobě, čímž se získají smíšené deriváty [viz například Verardo a spol., Synthesis 121 (1993); Synthesis 447 (1991); Kawaguchi, Synthesis 701 (1985); Micovic a spol., Synthesis 1043 (1991)]. Může být výhodné napřed připravit Schiffovu bázi reakcí aminu s aldehydem v rozpouštědlech jako je ethanol nebo methanol, popřípadě za přídavku pomocných činidel jako je kyselina octová, a pak teprve přidat redukční činidlo, například kyanoborohydrid sodný.

Hydrogenace alkenových nebo alkinových skupin v molekule se provádí obvyklým způsobem, například katalyticky aktivovaným vodíkem. Jako katalyzátory mohou sloužit těžké kovy jako je palladium nebo platina, popřípadě na nosiči, nebo Raneyův nikl. Jako rozpouštědla připadají v úvahu alkoholy jako například

-12»1 « « !« 4 • · · • 4 · • · · • 4 4

ethanol. Pracuje se při teplotách od 0 °C až do teploty varu rozpouštědla a při tlacích až 20 bar, s výhodou při laboratorní teplotě a atmosférickém tlaku. Za použití katalyzátorů, jako je například Lindlarův katalyzátor, je možno parciálně hydrogenovat trojné vazby na vazby dvojné, přičemž vzniká přednostně Z-forma.

Acylace aminoskupiny se provádí obvyklým způsobem, například halogenidem kyseliny nebo anhydridem kyseliny, popřípadě v přítomností báze jako je dimethylaminopyridin, v rozpouštědlech jako methylenchlorid, tetrahydrofuran nebo pyridin, podle Schottenovy-Baumannovy varianty ve vodném roztoku při slabě alkalickém pH, nebo reakcí s anhydridem v kyselině octové.

Halogeny jako chlor, brom nebo jod, nebo azidovou skupinu je možno zavést přes aminovou skupinu například Sandmeyerovou reakcí, přičemž se intermediární diazoniová sůl, připravená reakcí s dusitany, podrobí reakci s chloridem měďným nebo bromidem měďným v přítomnosti odpovídající kyseliny jako je kyselina solná nebo kyselina bromovodíková, nebo v přítomnosti jodidu draselného.

Jestliže se použije organický dusitan, je možno halogeny zavést —např-í-klad-přidáním -methy 1 enjodi-du—nebo-tetrabromme thanu, v------rozpouštědle jako je například dímethylformamid. Aminová skupina se dá odstranit buď reakcí s organickým dusitanem v tetrahydrofuranu nebo diazotací a redukcí diazoniové soli například povařením s fosfornou kyselinou, popřípadě za přídavku oxidu měďného.

Fluor se zavede například Balzovou-Schiemannovou reakcí diazoniumtetrafluoroborátu nebo podle literatury (J. Fluor. Chem. 76, 59-62 (1996)) diazotací za přítomnosti HF.pyridinu a následným varem, popřípadě v přítomnosti zdroje fluoridových iontů jako je například tetrabutylamoniumfluorid.

Azidovou skupinu lze zavést po diazotaci reakcí s azidem sodným při laboratorní teplotě.

-139 « ·« · «

* ·· 99

9

999 999

9 9

9999

Ethery je možno štěpit způsoby, popsanými v literatuře. Přitom lze dosáhnout selektivního štěpení i u více skupin, přítomných v molekule. Tak například se ether podrobí působení bromidu boritého v rozpouštědlech jako je dichlormethan, při teplotách od -100 °C do teploty varu rozpouštědla, s výhodou při -78 °C. Je však také možno štěpit ether thiomethylátem sodným v rozpouštědlech jako je dimethylformamid. Teplota se může pohybovat mezi laboratorní teplotou a teplotou varu rozpouštědla, s výhodou při 150 °C.

N-Alkylace nebo O-alkylace amidů jako je pyrid-2-on nebo 2-hydroxypyridin se provádí podle popsaných postupů. Tak se dosáhne N-alkylace reakcí s alkylhalogenidy jako je methyljodid v přítomnosti bází jako hydrid sodný nebo uhličitan draselný, v rozpouštědlech jako dimethylformamid, zatímco s bázemi jako je uhličitan stříbrný v rozpouštědlech jako tetrahydrofuran nebo toluen, nebo s výhodou v jejich směsích, alkylace alkylhalogenidy jako methyljodid dává O-alkylderiváty. O-Alkylace se dosáhne také trialkyloxoniumtetrafluoroborátem v inertních rozpouštědlech jako je methylenchlorid. Reakcí s diazomethanem nebo trimethylsilyldiazomethanem v rozpouštědlech jako methanol nebo toluen, s výhodou v jejich směsích, při teplotách až do teploty varu rozpouštědla, s výhodou však při laboratorní teplotě, vznikají směsi N-alkyl- a O-alkylderivátů. Tyto metody umožňují selektivní alkylaci pyridonu vedle benzamidu.

Směsi izomerů se mohou dělit na enantiomery nebo E/Z-izomery obvyklými metodami jako například krystalizací, chromatografií nebo tvorbou solí.

Soli se připravují běžnými způsoby, a to tak, že se k roztoku sloučeniny vzorce I přidá ekvivalentní množství nebo přebytek báze nebo kyseliny, popřípadě jejího roztoku, a sraženina se oddělí, nebo se roztok zpracuje obvyklým způsobem.

Následující příklady provedení objasňují přípravu selektivních sloučenin podle vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

N-(2-Oxo-2H-l-benzopyran-3-yl)amid kyseliny 2-((4-pyridyl)methyl]aminobenzoové

1) Ke 484 mg 3-amino-2-oxo-2H-l-benzopyranu ve 20 ml methylenchloridu se za chlazení ledem přikape 0,42 ml triethylaminu a 0,40 ml 2-nitrobenzoylchloridu. Směs se míchá 4 hodiny při laboratorní teplotě, rozpouštědlo se oddestiluje, zbytek se smíchá s roztokem hydrogenuhličitanu sodného a produkt se odsaje. Získá se 0,88 g N- (2-oxo-2H-l-benzo-pyran-3-yl)amidu kyseliny 2-nitrobenzoové. 3-Amino-2-oxo-2H-l-benzopyran se připraví podle literatury (Bonsignore a Loy, J. Heterocyclic Chem. 35, 117 (1998)) z kyseliny 2-oxo-2H-l-benzopyran-3-karboxylové (J. Org. Chem. 64, 1033-1035 (1999)).

2) K 880 mg N-(2-oxo-2H-l-benzopyran-3-yl)amidu kyseliny 2-nitrobenzoové ve 30 ml ethanolu se v atmosféře dusíku přidá 11 ml cyklohexenu a 176 mg hydroxidu palladnatého na uhlí a směs se míchá 2 hodiny při 110 °C. Katalyzátor se odfiltruje, filtrát se zahustí téměř k suchu a produkt se odsaje. Získá _________se 593 mg --N^-(-2--ex-o-2Ή—1— be-nzopyran~-3-yl0“amičlu^kyseTiny~

2-aminobenzoové.

3) 645 mg N-(2-oxo-2H-l-benzopyran-3-yl)amidu kyseliny 2-aminobenzoové se smíchá za laboratorní teploty s 50 ml methanolu a 170 ml kyseliny octové. Přidá se 0,38 ml 4-pyridinkarbaldehydu, směs se míchá 15 hodin, pak se přidá 206 mg kyanoborohydridu sodného a v míchání se pokračuje dalších 24 hodin. Vyloučené krystaly se odsají, smísí se se 70 ml methanolu, 40 ml kyseliny octové a 95 μΐ

4-pyridinkarbaldehydu a směs se míchá 48 hodin. Přidá se mg kyano-borohydridu sodného a směs se míchá dalších 15 hodin. Produkt se odsaje, promyje se methanolem a vysuší se. Získá se 521 mg N-(2-oxo-2H-l-benzopyran-3-yl)amidu kyseliny 2-[(4-pyridyl)methyl]aminobenzoové, t.t. 195-197 °C.

í

A.J

-15Příklad 2

N-(6-Chlorindazol-5-yl)amid kyseliny 2-[(4-pyridyl)methyl]aminobenzoové

Ke 194 mg (0,85 mmol) kyseliny 2-(4-pyridylmethyl)aminobenzoové v 8 ml dimethylformamidu se přidá 283 mg (1,69 mmol) 5-amino-6-chlorindazolu. Ke vzniklému roztoku se v atmosféře argonu za nepřístupu vlhkosti přidá 215 mg (2,13 mmol) N-methylmorfolinu a 386 mg (1,02 mmol) 0-(7-azabenzotriazol-l-yl)-l,l,3,3-tetramethyluroniumhexafluorofosfátu. Reakční směs se míchá 4 hodiny při laboratorní teplotě, pak se zředí cca 40 ml vody a extrahuje se třikrát po 30 ml ethylacetátu. Spojené organické fáze se promyjí vodou, vysuší se, zfiltrují a rozpouštědlo se odpaří. Zbytek se podrobí chromatografií na silikagelu v soustavě methylenchlorid-ethanol (10:1). Získá se 97 mg (30,2 %) N-(6-chlorindazol-5-yl]amidu kyseliny 2-[(4-pyridyl)methyl]aminobenzoové, t.t. 222,8 °C.

-16Analogickým způsobem se připraví následující sloučeniny:

Příklad	R¹	R²	R³	Teplota tání °C
3	*	4-Pyridyl	H	191,2
4			H	„ 232-234
°v°yX	-O
5	» o o—.	4-Pyridyl	H	171-172
6	xa	4-Pyridyl	H	182-184
7		4-Pyridyl	H	198-200

Příklad	R¹	R² !	R³	Teplota tání °c
8		4-Pyridyl	H	185-187
9	γγ\	4-Pyridyl	H	pryskyřice
10	XQ	4-Pyridyl	H	236,7
11	w *	4-Pyridyl	H	224,2
12	4 F	4-Pyridyl	H	pryskyřice
13	I °ΊΡ) F-X	4-Pyridyl	H	135
14		4-Pyridyl	H	105
15	A:	4-Pyridyl	H	i pryskyřice
16	A;	4-Pyridyl	F

• ♦	··«·			·»	• ·
	•	• ·	• ·	• ·	•
• ·	•			• ·	•

• ·	•			• ·	•
• ·	•	• · ·	• · ·	• *'	• · · ·

Příklad'	R¹	R²	R³	Teplota tání °c
17	_F?z			4-Pyridyl	H	68
	^FA		F
		F'	/K_F
18	^FZ		AI	4-Pyridyl	H
	^F 1	A
	1 *
19	A		.Cl	4-Pyridyl	H
	A
20	^θΓ\χ IÍ		AI	4-Pyridyl	H
	*
21	^Cř\	Ά	/Cl	4-Pyridyl	H
	'J
22	Ck		AI	4-Pyridyl	H
	*
23	A	Ά	.Cl	4-Pyridyl	H
	A
24	^Fi		AI	4-Pyridyl	H

25	OH Sr	Ύ	Al	4-Pyridyl	H
	.A

Příklad^!	R¹	R²	R³ ·	Teplota tání °C j
26		4-Pyridyl ;	H ¹	135,8 3
27		4-Pyridyl	f
28		o X	H	172

Následující příklady použití ilustrují biologický účinek a použití selektivních sloučenin podle vynálezu.

Pro enzym:

Použité roztoky

Zásobní roztoky:

Zásobní roztok A: 3mM ATP ve vodě, pH 7,0 (-70 °C)

Zásobní roztok B: γ-33Ρ-ΑΤΡ lmCi/100 μΐ

Zásobní roztok C: póly-(Glu4Tyr) 10 mg/ml ve vodě.

Ředící roztoky

Pro substrát: 10 mM DTT, lOmM chlorid manganatý, 100 mM chlorid hořečnatý

120 mM Tris/HCl, pH 7,5, μΜ natriumvanadiumoxid

Příklad použití 1

Inhibice aktivity KDR kinasy v přítomnosti sloučenin podle vynálezu

Na mikrotitrační destičku s kónickými jamkami (bez navázaného proteinu) se nanese 10 μΐ substrátové směsi (10 μΐ zásobního roztoku ATP (A) + 25 μθί γ-33Ρ-ΑΤΡ (cca 2,5 μΐ zásobního roztoku B) + 30 μΐ zásobního roztoku póly-(Glu4Tyr) (C) + 1,21 ml ředícího roztoku pro substrát), 10 μΐ roztoku inhibitoru (sloučeniny podle zředění, jako kontrola 3% DMSO v ředícím roztoku pro substrát) a 10 μΐ roztoku enzymu (11,25 μς zásobního roztoku enzymu (KDR nebo FLT-1 kinasy) se při 4 °C zředí 1,25 ml ředícího roztoku pro enzym). Po důkladném promíchání se směs inkubuje 10 minut při laboratorní teplotě. Pak se přidá 10 μΐ stop-roztoku (250 mM EDTA, pH 7,0), promíchá se a 10 μΐ roztoku se přenese na fosfocelulózový filtr P 81 a několikrát se promyje 0,1 M kyselinou fosforečnou. Filtrační papír se vysuší, pokryje se Meltilexem a změří se v mikro-betadetektoru.

Hodnoty IC50 se stanoví z koncentrace inhibitoru, nutné k 50% inhibici inkorporace fosfátů, vztaženo na neinhibovanou inkorporaci po _o_de_č-te.ní-.kon-tr-o-ly—(-rea-k-ee-,—zastavená^-EDTA) . Výsledky inhibice kinas (IC50 v μΜ) jsou uvedeny v tabulce.

Příklad použití 2

Test inhibice C-kitem izolované kinasy

Zásobní roztoky:

x rozpouštědlo: 400 mM TrisHCl, pH 7,5; 10 mM DTT, mM chloridu manganatého, 100 mM chloridu horečnatého,

2,5 sj polyethylenglykol 20 000, mM v dimethylsulfoxidu,

Inhibitory:

-21Zásobní roztok pro substrát:

Zásobní roztok ATP:

100 x roztok vanadátu:

Stop-roztok:

Roztok k promytí filtru:

mg/ml póly(Glu4Tyr)n Sigma P275 ve vodě, zmražené podíly,

37,5 μΜ ATP ve vodě, nastaveno na pH 7,5 a zmražené podíly, mM natriumvanadátu ve vodě,

250 mM kyselina ethylentetraminoctová (EDTA), pH 7,0,

0,5% kyselina fosforečná.

Roztoky pro test

Roztoky substrátu pro 125 testů:

μΐ ATP (37,5 μΜ), 25 μϋί γ33Ρ-ΑΤΡ (~+2,5 μΐ Amersham redivue solution) a 10 μΐ póly-(Glu,Tyr) se smíchá s 1,23 ml rozpouštědla (1 x).

Roztok inhibitoru:

Sloučeniny se rozpustí v rozpouštědle (1 x) na roztoky žádané koncentrace.

Roztok enzymu:

Odpovídající preparát enzymu se rozpustí v rozpouštědle (1 x) na roztok potřebné koncentrace tak, aby se získalo 1,24 ml. Pak se k němu přidá 12,5 μΐ roztoku natriumvanadátu.

Test

Složky se nanesou na mikrotitrační destičku s kulatými nebo tečkovanými jamkami, a to v následujícím pořadí:

μΐ inhibitoru v trojnásobné koncentraci než je výsledná koncentrace, μΐ substrátové směsi.

Po smíchání se reakce nastartuje přídavkem 10 μΐ enzymového preparátu.

Násada se inkubuje 10 minut a pak se přeruší přídavkem 10 μΐ stop-roztoku. 10 μΐ takto zpracované násady se přenese na fosfocelulózový filtr, promyje se kyselinou fosforečnou, vysuší se a pak se zataví v meltilexovém scintilátoru a změří se.

Tabulka

Příklad	KDR IC50 (pmol/l)	C-Kit IC50 (pmol/l)
1	0,003	θ
2	0,2	>10
3	0,03	8
4	0,03	>10
5	0,01	>10
6	0,2	10
7	0,2	>10
9	0,04	10
10	0,01	>10
11	1	>10
13	0,05	5
14	0,001	5
15	0,002	2
17	KH	>10
26	0,001	2
28	0,05	0,5
29	0,2	>10
30	0,02	10

KH žádná inhibice

-23«<=ό2 -

•	·♦ ·'	• 444 4	• • ·	4 • ·	44» 4» 4 · 9'
•	•	•	•	4	4 4 9
	• ·	•	44 4	44 4	44 4444

Claims

NÁROKY

PATENTOVÉ

1. Sloučeniny obecného vzorce I ' kde

R¹ je skupina ve které skupina

R je atom chloru atom bromu nebo skupina OCH₃,

Cl ·· 9···

-24·· (99 9 9 ve které R⁷ j_e skupina CH₃ nebo atom chloru, skupina skupina

Cl ve které R⁴ je atom fluoru, -CF₃, skupina -N=C, skupina -ch₂oh, atom chloru, atom bromu, skupina CH₃-, skupina -OCF₃ nebo skupina skupina ve které R⁶ je skupina -CH₃ nebo atom chloru; R² Í^e pyridylová skupina, skupina a

R³ je atom vodíku nebo atom fluoru, a jejich izomery a soli.
2. Použití sloučenin obecného vzorce I podle nároku 1 pro přípravu léčiva pro terapii nádorů, psoriázy, artritidy jako je reumatoidní artritida, hemangiomu, angiofibromu, očních onemocnění jako je diabetická retinopatie, neovaskulární ____ giáuk*dm, 'nemocí ledvin jako je glomerulonefritida, diabetická nefropatie, maligní nefroskleróza, trombické mikroangiopatické syndromy, odmítání transplantátu a glomerulopatie, fibrotíckých onemocnění jako je cirhóza jater, onemocnění způsobených proliferací mesangiálních buněk, arteriosklerózy, poškození nervové tkáně, k zamezení reokluze cév po zákroku balónkovým katetrem, při cévní protetice nebo po použití mechanických prostředků k udržení průchodnosti cév, jako jsou například stenty.
3. Léčivo, obsahující přinejmenším jednu sloučeninu podle nároku 1.

^:2:’ b %

• • • 4 * · * · r » 44 44 4 *4 • 4 · r • » 4 • • « 4 • • • 4 4 • 4 4 44 4 í* · · 4 4 · 4 · 4 « * <
4. Léčivo podle nároku 3, k terapii nádorů, psoriázy, artritidy jako je reumatoidní artritida, hemangiomu, angiofibromu, očních onemocnění jako je diabetická retinopatie, neovaskulární glaukom, nemocí ledvin jako je glomerulonefritida, diabetická nefropatie, maligní nefroskleróza, trombické mikroangiopatické syndromy, odmítání transplantátu a glomerulopatie, fibrotických onemocnění jako je cirhóza jater, onemocnění způsobených proliferací mesangiálních buněk, arteriosklerózy, poškození nervové tkáně, k zamezení reokluze cév po zákroku balónkovým katetrem, při cévní protetice nebo po použití mechanických prostředků k udržení průchodnosti cév, jako jsou například stenty.
5. Sloučeniny podle nároku 1 a léčiva podle nároků 3 a 4 s vhodnými formulačními přísadami a nosiči.
6. Použití sloučenin vzorce I podle nároku 1 jako inhibitorů tyrosinkinasy KDR a FLT.
7. Použití sloučenin óbec.ného_srzo.r.ce_I_p.o.dle—ná-r-o-k-ů—1^-a-ž—5—v-e— formě farmaceutického preparátu pro enterální, parenterální a orální aplikaci.