[go: up one dir, main page]

CZ20013562A3 - Konjugáty barviv s peptidy s krátkým řetězcem a jejich pouľití jako optických diagnostik - Google Patents

Konjugáty barviv s peptidy s krátkým řetězcem a jejich pouľití jako optických diagnostik Download PDF

Info

Publication number
CZ20013562A3
CZ20013562A3 CZ20013562A CZ20013562A CZ20013562A3 CZ 20013562 A3 CZ20013562 A3 CZ 20013562A3 CZ 20013562 A CZ20013562 A CZ 20013562A CZ 20013562 A CZ20013562 A CZ 20013562A CZ 20013562 A3 CZ20013562 A3 CZ 20013562A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
kylnsiln
hsdavftdny
trlrkqmavk
dye
peptide
Prior art date
Application number
CZ20013562A
Other languages
English (en)
Inventor
Kai Licha
Andreas Becker
Wolfhard Semmler
Bertram Wiedenmann
Carsten Hessenius
Rudolf Volkmer-Engert
Jens Schneider-Mergener
Sarah Bhargava
Original Assignee
Institut Für Diagnostikforschung Gmbh An Der Freie
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institut Für Diagnostikforschung Gmbh An Der Freie filed Critical Institut Für Diagnostikforschung Gmbh An Der Freie
Publication of CZ20013562A3 publication Critical patent/CZ20013562A3/cs

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/005—Fluorescence in vivo characterised by the carrier molecule carrying the fluorescent agent
    • A61K49/0056—Peptides, proteins, polyamino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/0019—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules
    • A61K49/0021—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules the fluorescent group being a small organic molecule
    • A61K49/0032—Methine dyes, e.g. cyanine dyes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
    • C07K1/1072—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups
    • C07K1/1077—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups by covalent attachment of residues other than amino acids or peptide residues, e.g. sugars, polyols, fatty acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/57563—Vasoactive intestinal peptide [VIP]; Related peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/655—Somatostatins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • C07K7/083—Neurotensin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09B—ORGANIC DYES OR CLOSELY-RELATED COMPOUNDS FOR PRODUCING DYES, e.g. PIGMENTS; MORDANTS; LAKES
    • C09B23/00—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes
    • C09B23/02—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes the polymethine chain containing an odd number of >CH- or >C[alkyl]- groups

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Macromolecular Compounds Obtained By Forming Nitrogen-Containing Linkages In General (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By Optical Means (AREA)
  • Indole Compounds (AREA)
  • Electrochromic Elements, Electrophoresis, Or Variable Reflection Or Absorption Elements (AREA)
  • Testing Of Optical Devices Or Fibers (AREA)
  • Optical Modulation, Optical Deflection, Nonlinear Optics, Optical Demodulation, Optical Logic Elements (AREA)

Description

Konjugáty barviv s peptidy s krátkým řetězcem a jejich použití jako optických diagnostik
Oblast techniky
Vynález se týká sloučenin pro diagnostiku nádorů, založených na konjugátech barviva s peptidy s krátkým řetězcem, které jsou odvozené od vasoaktivniho intestinálního peptidů, somatostatinu nebo neurotensinu, dále se týká použiti těchto sloučenin jako optických diagnostik a diagnostických přípravků obsahujících tyto sloučeniny.
Dosavadní stav techniky
Změny vyvolané nemocí se odráží na buněčné úrovni často v odlišné distribuci receptorů nebo exprese ve srovnání s normálním stavem. Tyto rozdíly mohou být jak kvantitativní povahy (např. množství transferinových receptorů u proliferujících buněk) tak i kvalitativní povahy (např. exprese vaskulárních endotheliálních růstových faktorů, VEGF). Až dosud byla pro zobrazení patologické exprese receptorů nebo receptorové distribuce potřebná citlivost detekčních metod obzvláště v radiodiagnostice.
Heptahelikální receptory jsou cílovými molekulami mnoha farmakologických látek (např. β-blokátorů, blokátorů H2kyselin, antihistaminik). Vedle terapeutického působení jsou převážně radioaktivně označené agonistické ligandy těchto receptorů používány pro diagnostiku při receptorové scintigrafii v in-vivo detekci a lokalizaci nádorů. Přitom je využíván mechanismus receptory zprostředkované endocytosy, např. prostřednictvím somatostatinových receptorů, které jsou zvýšeně exprimovány na neuroendokrinních nádorech. Klinicky
povolená rutinní scintigrafická technika je somatostatinanalogon luIn-DTPA-pentetreotid (Octreoscan ®); Literatura: J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 37, 1079-82, 1990,
J. Nucl. Med. 32, 1184-9, 1991,; J. Nucl. Med. 33, 652-8, 1992; Digestion 3, 54-9, 1994, J. Clin. Invest. 93, 1321-5, 1994, Metabolism 45, 21-3, 1996.
Další přístup tkví ve využití radoaktivně značeném VIP a VIP analogách, které se váží na VIP receptor. VIP receptor je zvýšeně exprimován u širokého spektra tumorů (mimo jiné u adenokarcinomů).
WO 96/30055 popisuje radiodiagnostické a radioterapeutické sloučeniny, speciální peptidy vážící se k VIP receptoru, které jsou radioaktivně značené a mohou být použity pro radiodiagnostiku a radioterapii. S obzvláštní výhodou jsou popsány peptidy vážící se k VIP receptorům, značené s Tc-99m, vhodné pro scintigrafii. Další literatura: Cancer Research 54, 690-700, 1994; Endocrynology 136, 2662-80, 1994, J. Nucl. Med.
40, 353-361, 1999.
Všechny popsané diagnostické přístupy, založené na použití somatostatinových receptorů a VIP receptorů, jsou radiodiagnostické metody (scintigraf ie s 123I, 125I, 11:LIn nebo 99mTc značenými peptidy) .
Literatura: EP 588754, US 5650134, US 5620675, US 5225180, WO 96/23527, J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 37, 1083-87, 1990; Lancet 242-4, 1989, J. Nucl. Med. 39, 1913-17, 1998.
Až dosud ale nebyly známy peptidy s fluorescenční značkou, které by byly konjugovány s barvivém a které by umožňovaly in vivo fluorescenční detekci tumorů (Photochem. Photobiol. 68, 603-632, 1998) .
Vynález se zabývá vyřešením úkolu zajištěni nových sloučenin, které by bylo možné použít pro citlivou diagnosu tumorů pomocí detekce s využitím fluorescenčního záření sloučenin, které se specificky váží k receptorům. K tomu jsou třeba speciální molekuly barviv, které jsou připojeny k biomolekulám, a které by poskytovaly fluorescenční signál detekovatelný s vysokou citlivostí.
Tento úkol je vyřešen pomocí přípravy sloučenin, obsahujících fluorescenční barviva, která jsou kovalentně připojená k peptidům s krátkým řetězcem. Tyto konjugáty mají vysokou vázací afinitu k heptahelikálním receptorům, obzvláště k somatostatinovému receptoru, VIP receptoru (vasoaktivní intestinální peptid) a k neurotensinovému receptoru a jsou intracelulárně zahrnuty v receptory zprostředkované endocytose. Sloučeniny podle tohoto vynálezu jsou tedy vhodné pro technicky jednoduchou, neškodnou optickou diagnostiku nádorových buněk a nádorových tkání, které ve srovnání se zdravými buňkami zvýšeně exprimují somatostatinové receptory, VIP receptory nebo neurotensinové receptory. Obzvláště vhodné jsou tyto sloučeniny pro fluorescenční endoskopickou diagnostiku různých typů nádorů (adenokarcinom, neuroendokrinní nádory nebo duktální pankreatický tumor) dutých orgánů jako jsou třeba esofágus, cervix, tlusté střevo a bronchy.
Obzvláště výhodné se ukazují být barviva, která splňují určité fotofyzikální a chemické nároky. Z fotofyzikálního hlediska musí barviva vykazovat vysoké absorpční koeficienty a vysoké kvantové výtěžky fluorescence, které vedou k efektivnímu signálu i u velmi malých koncentrací ve tkáních. Absorpční maxima musí být volitelná a musí pokrývat široké spektrální rozmezí. Pro detekci hlubších vrstev tkáni (několik centimetrů pod povrchem) je nezbytná spektrální oblast mezi 600 až 900 nm, zatímco pro povrchovou detekci postačují absorpční vlnové délky mezi 400 až 600 nm. Z chemického hlediska musi vykazovat barviva vysokou fotostabilitu a nesmí vykazovat žádný rozklad světlem (photobleaching) při ozářeni. Barviva musí být použitelná jako syntetické stavební kameny při syntéze peptidů v tuhé fázi a musí být tedy stabilní za běžných podmínek syntézy, přičemž zaručují jednoduchý vznik dostatečného množství strukturně definovaného konjugátu mezi barvivém a peptidem. Tento požadavek nejlépe splňují polymethinová barviva, obzvláště cyaniny, merocianiny, oxonoly a squariliová barviva.
Podstata vynálezu
Předmětem vynálezu jsou tedy konjugáty peptidu s polymethinovými barvivý obecného vzorce I
A1 - (X) m - A2 (I) kde
X je α, β, nebo γ-aminokyselina s D- nebo L- konfigurací a m je číslo od 5 do 30, přičemž vzniklá sekvence aminokyselin (X)iu má rovný řetězec nebo může být cyklizována prostřednictvím disulfidických můstků mezi dvěma molekulami cysteinu nebo homocysteinu nebo amidickými vazbami mezi N- a C-koncem a přičemž aminokyselinová sekvence odpovídá vasoaktivnímu intestinálnímu peptidu (VIP), somatostatinu nebo neurotensinu, nebo jejich fragmentům, částem sekvence, derivátům nebo analogům VIP, somatostatinu nebo neurotensinu.
A1 označuje vodíkový atom, acetylový zbytek nebo alkylový zbytek mající až 10 uhlíkových atomů, který může být případně substituován a 1 až 3 karboxyskupinami a/nebo 1 až 6 hydroxyskupinami, nebo póly(oxyethylenový) zbytek mající 2 až 30 -CH2CH2O- jednotek nebo molekulu barviva, vybraného ze skupiny polymethinových barviv, jejichž alespoň jedno absorpční maximum leží v oblasti od 380 do 1200 nm,
A2 je hydroxyksupina, aminoskupina nebo molekula barviva vybraného ze skupiny polymethinových barviv, jejichž alespoň jedno absorpční maximum leží v oblasti od 380 do 1200 nm, s tou podmínkou, že alespoň jeden zbytek A1 nebo A2 představuje molekulu barviva vybraného ze skupiny polymethinových barviv, jejichž alespoň jedno absorpční maximum leží v oblasti od 380 do 1200 nm, přičemž v případě, že A1 a/nebo A2 představuje molekulu barviva vybraného ze skupiny polymethinových barviv, jejichž alespoň jedno absorpční maximum leží v oblasti od 380 do 1200 nm, jsou A1 připojené na N-koncové aminokyselině a A2 na aminoskupině lysinu nebo hydroxyskupině aminokyseliny šeřinu libovolné pozici uvnitř aminokyselinové sekvence (X)m, a jejich fyziologicky přijatelné soli.
Fragmenty, části sekvencí, jmenovaného peptidu jsou mimo jiné sekvence, sekvence s jednotlivými deriváty nebo analoga zkrácené aminokyselinové nebo úplnými odpovídajících aminokyselin za D-aminokyseliny, záměnami s jednotlivými záměnami aminokyselin za jiné, sekvence a kombinace jmenovaných znaků.
sekvence obrácené
Fragmenty, části sekvencí, deriváty nebo analoga jmenovaného peptidu mohou také obsahovat nepřírodní aminokyseliny, jako například naftalanin, cyklohexylalanin, norleucin, norvalin, α-aminoadipovou kyselinu, a-aminomáselnou kyselinu, β-alanin, β-cyklohexylalanin, ornithin, sarkosin nebo δ-hydroxylysin.
Obzvláště výhodné provedení tohoto vynálezu představují sloučeniny obecného vzorce I, vyznačující se tím, že molekula barviva A1 a/nebo A2 je kyaninové, squariliové, krokoniové, merokyaninové nebo oxonolové barvivo. Tato barviva patří do skupiny polymethinových barviv a vykazují výše popsané výhody.
Další výhodné provedení tohoto vynálezu představují sloučeniny obecného vzorce I, vyznačující se tím, že molekula barviva A1 a/nebo A2 je kyaninové popř. squariliové barvivo obecného vzorce II
kde D označuje fragment odpovídající obecnému vzorci III až
VI, kde je spojení s B provedeno v pozici označené hvězdičkou,
B je fragment obecného vzorce VII až XII
X
XI
XII
R1 a R2 je E1, R3 je fluor, chlor, brom, jod nebo nitroskupina nebo zbytek -COOE1, -CONEXE2, -NHCOE1, -NHCONHE1, -NEXE2, -0E1, OSO3E1, -SO3E1, -SO2NHE1, -E1, kde E1 a E2 jsou nezávisle na sobě vodík, Cl až C4 sulfoalkylový řetězec, nasycený nebo nenasycený, rovný nebo rozvětvený Cl až C50 alkylový řetězec, kde řetězec nebo část tohoto řetězce může mít formu jedné nebo více aromatických nebo nasycených cyklických C5 až C6 jednotek nebo bicyklických C10 jednotek, a kde Cl až C50 alkylový řetězec může být přerušen s 0 až 15 kyslíkovými atomy a/nebo s 0 až 3 karbonylovými skupinami a/nebo může být substituován s 0 až 5 hydroxyskupinami.
R4 je vodíkový atom, fluor, chlor, brom, jod nebo rozvětvený nebo přímý Cl až C10 alkylový řetězec, b je číslo 2 nebo 3,
X a Y jsou nezávisle na sobě 0, S, Se, -CH=CH- nebo C(CH3)2a
L je skupina odpovídající obecným, vzorcům
kde n je číslo 1 až 10.
—(CH,)n
(U výše uvedených vzorců označuje připojeni molekuly ke zbytku barviva plná vazba, zatímco přerušovaná vazba označuje připojení molekuly k peptidu.)
Ze skupiny polymethinových barviv jsou obzvláště výhodná kyaninová barviva, např. barviva založená na indolových strukturách jako jsou indokarbo-, indodikarbo- a indotrikarbokyaninová barviva. Tyto struktury vykazují vysokou chemickou a fotochemickou stabilitu. Synteticky jsou dosažitelné deriváty, které absorbují a fluoreskují mezi 400 a 1000 nm, díky substituci s různými linkery a funkčními skupinami, s výhodou s karboxylovými skupinami, mohou být spojovány s peptidy a mohou vykazovat vysokou rozpustnost ve vodě, přednostně pomocí substituce se sulfonovými skupinami. Oproti kyaninovým barvivům známým z literatury vykazují sloučeniny podle tohoto vynálezu pouze jednu reaktivní skupinu, která umožňuje stechiometricky definované připojení v rámci syntézy konjugátu na pevné fázi.
Obzvláště výhodné provedení tohoto vynálezu představují sloučeniny obecného vzorce I, kde molekula barviva Al a/nebo A2 je indokarbokyaninové, indodikarbokyaninové nebo indotrikarbokyaninové barvivo, t φ molekula barviva A1 a/nebo A2 je indokarbokyaninové, indodikarbokyaninové nebo indotrikarbokyaninové barvivo obecného vzorce XIII nebo XIV
XIII
N--(CH2
H
XIV p je 1, 2 nebo 3, n je číslo 1, 2, 3, 4 nebo 10,
R1 a R2 jsou nezávisle na sobě 4-sulfobutyl-, 3-sulfopropyl-,
2-sulfoethyl-, 3-methyl-3-sulfopropyl-, methyl- nebo propylový zbytek a
R3 je vodík, chlor, brom, jod nebo nitroskupina nebo zbytek -COOE1, -CONE1E2, -NHCOE1, -NHCONHE1, -NEXE2, -OE1, -OSO3E1, SO3E1, -SO2NHE1, kde E1 a E2 jsou nezávisle na sobě vodíkový atom nebo methyl, ethyl nebo C3 až C6 alkylový zbytek, který může být přerušen s až 2 kyslíkovými atomy a/nebo 0 až 1 karbonylovou skupinou a/nebo může být substituován s 0 až 5 hydroxylovými skupinami nebo může být póly (oxyethylen) glykolový zbytek se 2 až 30 jednotkami -CH2CH2O-, molekula barviva A1 a/nebo
A2 je indokarbokyaninové, indodikarbokyaninové nebo indotrikarbokyaninové barvivo obecného vzorce XIII nebo XIV
XIII
XIV kde p je 1, 2 nebo 3, n je 1, 2 nebo 4,
R1 a R2 jsou nezávisle na sobě 4-sulfobutylový nebo 3sulfopropylový zbytek,
R3 je vodík nebo zbytek -COOE1 nebo -CONHE1, kde E1 je vodíkový atom nebo methyl, ethyl nebo C3 až C6 alkylový zbytek, který může být přerušen s 0 až 2 kyslíkovými atomy a/nebo 0 až 1 karbonylovou skupinou a/nebo může být substituován s 0 až 5 hydroxylovými skupinami,
- molekula barviva A1 a/nebo A2 je indotrikarbokyaninové barvivo obecného vzorce XV nebo XVI • · ··· ·
kde n j e
R1 a
sobě 4-sulfobutyl-, 3-sulfopropyl-
nebo nebo
R2 jsou nezávisle
2-sulfoethylový zbytek,
R3 je zbytek -CONH-peptid, -CONH-(CH2)m-CONH-peptid, -CONH-(CH2) n-NH-CS-NH-peptid sm=lažl0an=2 nebo 3, nebo -CONH-(CH2) n-NHCO-CH2-peptid nebo představuje následující skupinu ··♦·
R4 a R5 jsou nezávisle na sobě vodíkový atom, methylový zbytek nebo hydroxylovaný alkylový zbytek jako třeba 2-hydroxyethyl,
3-hydroxypropyl, 2,3-dihydroxypropyl, 1,3-dihydroxy-2-propyl,
2,3,4-trihydroxybutyl, 1,3,4-trihydroxy-2-butyl, 2,3,4,5,6pentahydroxyhexyl,
R6 je jedna z následujících skupin:
- (CH2)m-CONH-peptid kde m = 0 až 2,
-(CH2) m-NH-CS-NH-peptid kde m = 0 až 2, a X je kyslíkový atom nebo atom síry;
molekula barviva A1 a/nebo A2 je indotrikarbokyaninové barvivo obecného vzorce XVII:
R1 a R2 jsou nezávisle na sobě
4-sulfobutylový nebo 3 sulfopropylový zbytek,
R3 je zbytek -CONH-peptid, -CONH-(CH2)m-CONH-peptid,
-CONH- (CH2) n-NH-CS-NH-peptid nebo -CONH- (CH2) n-NHCO-CH2-peptid kde m=lažl0an=2 nebo 3, nebo představuje následující skupinu:
• « ··· ·
a R4 a R5 jsou nezávisle na sobě vodíkový atom, methylový zbytek nebo hydroxylovaný alkylový zbytek jako třeba 2hydroxyethyl, 3-hydroxypropyl, 2,3-dihydroxypropyl, 1,3dihydroxy-2-propyl, 2,3,4-trihydroxybutyl, 1,3,4-trihydroxy-2butyl, 2,3,4,5,6-pentahydroxyhexyl
Použití protilátek značených barvivém pro detekci nádorů je známé z literatury (J. Cell. Pharmacol. 3, 141-145, 1992; Cancer Immunol. Immunother. 41, 257-63, 1995; Cancer Research 54, 2643-9, 1994, Biotechnol. Prog. 13, 649-658, 1997).
Narozdíl od sloučenin podle tohoto vynálezu, tedy biomolekul nízkomolekulárních peptidů nebo peptidových derivátů, využívají tyto sloučeniny výhody protilátek jako je vysoká schopnost vázání na cílové struktury, ale jejich diagnostický potenciál je omezen tím, že nemají dostatečnou farmakokinetiku (dlouhé poločasy rozpadu v krvi, alergické vedlejší efekty (Imunogenita)).
Biologické a farmakologické požadavky na peptidové sekvence tedy odpovídají dostatečné stabilitě v krevní plasmě a tím rychlejšímu dosažení cílové tkáně a zároveň rychlejší eliminaci z těla, výhodně prostřednictvím vylučování pomocí ledvin.
Překvapivě bylo zjištěno, alespoň 5 aminokyselin, jejichž a které mají připojeno barvivo že peptidové sekvence mající C-konec obsahuje VIP sekvenci pro fluorescenční diagnostiku • · · · ♦ · ·
• · · ·· ·· • · ·« • * ♦ · • · · · vykazuji u nádorových buněk působení srovnatelné s přírodním VIP. Dále bylo shledáno, že připojením alespoň jedné Daminokyseliny nebo výměnou alespoň jedné D-aminokyseliny může být značně zvýšeny stabilita v plasmě. Například, úplná záměna všech L-aminokyselin za D-aminokyseliny u VlP-vázaném peptidovém konjugátu s barvivém lze ukázat, že vlastnosti vázáni a přijetí buňkami se nezmění.
Další obzvláště výhodné provedení tohoto vynálezu vykazují sloučeniny obecného vzorce I,
-kde (X)m odpovídá aminokyselinovou sekvenci přírodního, přirozeně se vyskytujícího lidského vasoaktivního intestinálního peptidů
HSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILN nebo označuje fragment, částečnou sekvenci, derivát nebo analog vasoaktivního intestinálního peptidů, složený z 5 až 30 aminokyselin.
AGCKNFFWKTFTSC
-kde (X)m odpovídá aminokyselinové sekvenci somatostatinu nebo označuje fragment, částečnou sekvenci, derivát nebo analog somatostatinu, složený z 5 až 20 aminokyselin.
-kde (X)m odpovídá aminokyselinové sekvenci neurotensinu
Pyroglutaminová kyselina-LYENKPRRPYIL
999999 * 999 9 • 9 9 9 9 9 9 9 99
9 9 9 9 9 99
9 9 9 9 9 9 99
9 9 999 9999 nebo označuje fragment, částečnou sekvenci, derivát nebo analog neurotensinu, složený z 5 až 20 aminokyselin.
-kde jako fragment, částečná sekvence, derivát nebo analog vasoaktivniho intestinálniho peptidu (VIP) jsou vybrány následující aminokyselinové sekvence:
RLRKQMAVKKYLNSILN LRKQMAVKKYLNSILN RKQMAVKKYLNSILN KQMAVKKYLNSILN QMAVKKYLNSILN MAVKKYLNSILN AVKKYLNSILN
RLRKQMAVKKYLNS LRKQMAVKKYLNS RKQMAVKKYLNS
KQMAVKKYLNS
QMAVKKYLNS
MAVKKYLNS
AVKKYLNS
RLRKQMAVKKYLNSIL LRKQMAVKKYLNSIL RKQMAVKKYLNSIL KQMAVKKYLNSIL QMAVKKYLNSIL MAVKKYLNSIL AVKKYLNSIL
RLRKQMAVKKYLN LRKQMAVKKYLN RKQMAVKKYLN
KQMAVKKYLN
QMAVKKYLN
MAVKKYLN
AVKKYLN
RLRKQMAVKKYLNSI
LRKQMAVKKYLNSI
RKQMAVKKYLNSI
KQMAVKKYLNSI
QMAVKKYLNSI
MAVKKYLNSI
AVKKYLNSI
RLRKQMAVKKYL
LRKQMAVKKYL
RKQMAVKKYL
KQMAVKKYL
QMAVKKYL
MAVKKYL
AVKKYL,
-kde jako analoga
VIP jsou vybrány následující aminokyselinové sekvence:
FSDAVFTDNY
ISDAVFTDNY
LSDAVFTDNY
HFDAVFTDNY
HHDAVFTDNY
HIDAVFTDNY
HLDAVFTDNY
TRLRKQMAVK
TRLRKQMAVK
TRLRKQMAVK
TRLRKQMAVK
TRLRKQMAVK
TRLRKQMAVK
TRLRKQMAVK
KYLNSILN
KYLNSILN
KYLNSILN
KYLNSILN
KYLNSILN
KYLNSILN
KYLNSILN
9 9 99 9
9 9
9 9 • *9 9 • 9 99
HMDAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILN
HQDAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILN
HTDAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILN
HVDAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILN
HWDAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILN
HYDAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILN
HSAAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILN
HSEAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILN
HSFAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILN
HSHAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILN
HSIAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILN
HSLAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILN
HSMAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILN
HSWAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILN
HSDFVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILN
HSDGVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILN
HSDMVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILN
HSDQVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILN
HSDSVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILN
HSDWVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILN
HSDYVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILN
HSDAFFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILN
HSDAIFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILN
HSDALFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILN
HSDAMFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILN
HSDATFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILN
HSDAWFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILN
HSDAYFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILN
HSDAVKTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILN
HSDAVFVDNY TRLRKQMAVK KYLNSILN
HSDAVFWDNY TRLRKQMAVK KYLNSILN
HSDAVFTDNW TRLRKQMAVK KYLNSILN
HSDAVFTDNY TRRRKQMAVK KYLNSILN
HSDAVFTDNY TRWRKQMAVK KYLNSILN
HSDAVFTDNY TRLRFQMAVK KYLNSILN
HSDAVFTDNY TRLRLQMAVK KYLNSILN
HSDAVFTDNY TRLRMQMAVK KYLNSILN
HSDAVFTDNY TRLRRQMAVK KYLNSILN
HSDAVFTDNY TRLRKAMAVK KYLNSILN
HSDAVFTDNY TRLRKFMAVK KYLNSILN
HSDAVFTDNY TRLRKIMAVK- -KYLNSILN
HSDAVFTDNY TRLRKKMAVK KYLNSILN
HSDAVFTDNY TRLRKLMAVK KYLNSILN
HSDAVFTDNY TRLRKMMAVK KYLNSILN
HSDAVFTDNY TRLRKRMAVK KYLNSILN
HSDAVFTDNY TRLRKVMAVK KYLNSILN
HSDAVFTDNY TRLRKWMAVK KYLNSILN
HSDAVFTDNY TRLRKYMAVK KYLNSILN
HSDAVFTDNY TRLRKQFAVK KYLNSILN
HSDAVFTDNY TRLRKQIAVK KYLNSILN
HSDAVFTDNY TRLRKQKAVK KYLNSILN
HSDAVFTDNY TRLRKQLAVK KYLNSILN
HSDAVFTDNY TRLRKQQAVK KYLNSILN
HSDAVFTDNY TRLRKQRAVK KYLNSILN
HSDAVFTDNY TRLRKQWAVK KYLNSILN
HSDAVFTDNY TRLRKQMFVK KYLNSILN
HSDAVFTDNY TRLRKQMIVK KYLNSILN
HSDAVFTDNY TRLRKQMKVK KYLNSILN
HSDAVFTDNY TRLRKQMLVK KYLNSILN
HSDAVFTDNY TRLRKQMMVK KYLNSILN
HSDAVFTDNY TRLRKQMQVK KYLNSILN
HSDAVFTDNY TRLRKQMRVK KYLNSILN
• ·
HSDAVFTDNY TRLRKQMVVK KYLNSILN
HSDAVFTDNY TRLRKQMWVK KYLNSILN
HSDAVFTDNY TRLRKQMYVK KYLNSILN
HSDAVFTDNY TRLRKQMAAK KYLNSILN
HSDAVFTDNY TRLRKQMAIK KYLNSILN
HSDAVFTDNY TRLRKQMALK KYLNSILN
HSDAVFTDNY TRLRKQMAVR KYLNSILN
HSDAVFTDNY TRLRKQMAVK RYLNSILN
HSDAVFTDNY TRLRKQMAVK WYLNSILN
HSDAVFTDNY TRLRKQMAVK KFLNSILN
HSDAVFTDNY TRLRKQMAVK KWLNSILN
HSDAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLASILN
HSDAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLFSILN
HSDAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLISILN
HSDAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLMSILN
HSDAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLSSILN
HSDAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLVSILN
HSDAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLWSILN
HSDAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNNILN
HSDAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNRILN
HSDAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNWILN
HSDAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNYILN
HSDAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSLLN
HSDAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSSLN
HSDAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSWLN
HSDAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSYLN
HSDAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSIFN
HSDAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSIIN
HSDAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSIWN
HSDAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILW
kde jako analog VIP je vybrána sloučenina následujícího vzorce:
HSDAVFTX1X2Y X3RLRKQMAVK KYLNSILN, kde X1, X2 a X3 mohou představovat libovolnou aminokyselinu,
- kde mohou být 2 až m aminokyselin nezávisle na sobě vyměněno za D-aminokyselinu nebo jinou L- nebo D-aminokyselinu, kde m má výše zmíněný význam,
- kde alespoň jedna aminokyselina (X)m nezávisle na dalších může být vyměněna za jinou nepřírodní aminokyselinu nebo aminokyselinový derivát,
- kde alespoň jedna aminokyselina (X)m nezávisle na dalších může být vyměněna za jinou nepřírodní aminokyselinu nebo aminokyselinový derivát, jako třeba naftalanin, cyklohexylalanin, norleucin, norvalin, a-aminoadipová kyselina, α-aminomáselná kyselina, β-alanin, β-cyklohexylalanin, ornithin, sarkosin nebo δ-hydroxylysin,
- kde jako analog VIP může být vybrána sloučenina následující struktury:
X1SDAVX2TDNX3 TRLRKQMAVK KX4LNSILN, kde X1, X2, X3 a X4 jsou nepřírodní aminokyseliny nebo aminokyselinové deriváty, jako třeba naftalanin, cyklohexylalanin, norleucin, norvalin, aaminoadipová kyselina, α-aminomáselná kyselina, β-alanin, βcyklohexyl-alanin, ornithin, sarkosin nebo δ-hydroxylysin,
- kde všechny aminokyseliny (X)m jsou vyměněny za odpovídající D-aminokyseliny,
• ·
- kde jako fragmenty, části sekvence, deriváty nebo analoga vasoaktivního intestinálniho peptidů jsou vybrány retrosyntetické aminokyselinové sekvence,
- kde jako fragmenty, části sekvence, deriváty nebo analoga vasoaktivního intestinálniho peptidů jsou vybrány retrosyntetické aminokyselinové sekvence, u nichž jsou 2 až m aminokyselin zaměněno za odpovídající D-aminokyseliny, kde m má výše uvedený význam,
- kde jako fragmenty, částečné sekvence, deriváty nebo analoga vasoaktivního intestinálniho peptidů jsou vybrány následující aminokyselinové sekvence:
rlrkqmavkkylnsiln lrkqmavkkylnsiln rkqmavkkylnsiln kqmavkkylnsiln qmavkkyinsiln mavkkylnsiln avkkylnsiln
RLRKQMAvKKyLNSILN LRKQMAvKKyLNSILN RKQMAvKKyLNSILN KQMAvKKyLNSILN QMAvKKyLNSILN MAvKKyLNSILN AvKKyLNSILN rlrkqmavkkylnsil lrkqmavkkylnsil rkqmavkkylnsil kqmavkkylnsil qmavkkylnsil mavkkylnsil avkkylnsil
RLRKQMAvKKyLNSIL LRKQMAvKKyLNSIL RKQMAvKKyLNSIL KQMAvKKyLNSIL QMAvKKyLNSIL MAvKKyLNSIL AvKKyLNSIL rlrkqmavkkylnsi lrkqmavkkylnsi rkqmavkkylnsi kqmavkkylnsi qmavkkylnsi mavkkylnsi avkkylnsi
RLRKQMAvKKyLNSI LRKQMAvKKyLNSI RKQMAvKKyLNSI KQMAvKKyLNSI QMAvKKyLNSI MAvKKyLNSI
AvKKyLNSI
- kde jako fragmenty, částečné sekvence, deriváty nebo analoga somatostatinu jsou vybrány následující aminokyselinové sekvence:
wKTFTSy AGgKNFFwKTFTSy yKNFFwKTFTSy fFYwKVFT
f^FwKvyT fCYwKVCT iJ fCFwKTCT II fCYwKTCT
II
D-NaI- CYwKVC li f CywK-Abu-C-NaI fcFwKVCT I_________________________________I fcYwKVCT I1 fCFwKTCT lI fcYwKTCT l|
D-Nal-cYwKVC
II f cywK-Abu-C - N a I
- kde jako fragmenty, částečné sekvence, deriváty nebo analoga neurotensinu jsou vybrány následující aminokyselinové sekvence:
pGlu-LYQNKPRRPFIL pGlu-LYENKPRRPYI pGlu-LYENKPRRPylL pGlu-LYQNKPRRPYIL pGlu-LYQNKPRRPylL pGlu-LYENKPRRPFIL pGlu-LYENKPRRPfIL pGlu-LYQNKPRRPfIL pGlu-LYENKPRRPWIL pGlu-LYENKPRRPwIL pGlu-LYQNKPRRPWIL pGlu-LYQNKPRRPwIL pGlu-LYENKPRRPY pGlu-LYENKPRRP pGlu-LYENKPRR pGlu-LYENKPR pGlu-LYENKP
NKPRRPYIL
KPRRPYIL
PRRPYIL
RRPYIL
NKPRRPylL
KPRRPylL PRRPylL RRPylL
NKPRRPfIL
KPRRPfIL
PRRPfIL
RRPfIL
NKPRRPwIL
KPRRPwIL
PRRPwIL
RRPwIL
Terminologie obecného vzorce I zahrnuje obvyklý způsob zápisu aminokyselinových sekvencí. N-konec stojí vlevo a C-konec je umístěn vpravo (nesubstituovaný odpovídá H-(X)m-OH nebo v případě amidů,
H-(X)m-NH2) ·
Použité jednopísmenné zkratky aminokyselin mohou být nalezeny
Ά practical Verlag Heidelberg 1993, aminokyseliny s L-konfigurací zatímco malá písmena označují můstky (cyklické peptidy) chemistry textbook, j sou
3.
v M. Bodanszky, vydání,
Peptide druhé
Velká písmena
Springeroznačuj i aminokyseliny), D-aminokyseliny, disulfidické (přírodní označeny spojovacími čárkami mezi příslušnými písmeny (C - cystein nebo homocystein). P.etrosynteticky se označují sekvence, u nichž je během syntézy přehozeno pořadí aminokyselin ve srovnání s přirozenou sekvencí, to jest syntéza se začíná' zprvu na N-terminální aminokyselině a zhotovujeme sekvenci směrem k C-terminální aminokyselině.
Analoga VIP byly vyrobeny pomocí substituční analýzy (viz příklad 43). Obzvláště výhodná analoga VIP jsou následující sloučeniny:
His-Trp-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg20 LysGln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-1 .uu -Asn-Ser-Ile-Leu-Asrí (Identifikační číslo sekvence: 1)
His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Phe-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-ArgLysGln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn 25 (Identifikační číslo sekvence: 2) « ·
His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Lys-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-ArgLysGln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn (Identifikační číslo sekvence: 3)
His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Gln-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-ArgLysGln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn (Identifikační číslo sekvence: 4)
His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Arg-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-ArgLysGln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn (Identifikační číslo sekvence: 5)
His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Trp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-ArgLysGln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn (Identifikační číslo sekvence: 6)
His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Arg-Arg-Leu-ArglO LysGln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn (Identifikační číslo sekvence: 7)
His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-ArgLysGln-Met-Arg-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn 15 (Identifikační číslo sekvence: 8).
Sloučeniny podle tohoto vynálezu mají různé výhody ve srovnání s radioaktivně značenými látkami. Fluorescenční barviva mohou být libovolně často přivedeny k fluorescenční emisi. Ta nedává žádný kontinuální signál, když přechází s odpovídající dobou života do základního stavu.
Podle toho je čas diagnózy libovolně volitelný a libovolně často opakovatelný a není limitován poločasem isotopu.
Pacient není vystaven ionizujícímu záření, použité záření je v použitých dávkách
neškodné. Technika optické detekce dovoluje vysoce citlivou detekci menšího počtu fotonů a je tedy pokud jde o citlivost srovnatelná s radiodiagnostikou.
Diagnostické použití blízkého infračerveného záření (NIRzáření) s využitím konjugátů biomolekul s barvivý bylo popsáno (WO 96/17628). Jako obzvláště výhodné se v případě tohoto vynálezu ukázalo, že peptidové konjugáty jsou připravitelné v dostatečných výtěžcích a vysoké čistotě pomocí zavedení automatizované syntézy v pevné fázi. Překvapivě bylo shledáno, že mohou být nasazeny různé indokyaninové sloučeniny nesoucí karboxylovou funkci jako analoga aminokyselin a tedy mohou být spojovány s aminoskupinou lysinu na tuhé fázi (pryskyřici). Po odštěpení od pryskyřice se získávají konjugáty peptidů s barvivý v čistotě > 95%. Nové techniky spojování dovolují spojování halogenacetylovaných barviv s aminokyselinou cysteinem nebo homocysteinem, které mohou nahradit libovolnou aminokyselinu přirozené VIP sekvence.
světla, která je omezená schopnost pronikání
Podstatný problém při používání světla k vyvolání fluorescence v případě submilimetrové, zatímco u
NIR může činit centimetr. Pokud jde o hloubku proniknutí, neproblematické je detekování nemocných tkání na povrchu, stejně jako u měkkých tkání. Předmět vynálezu tedy je a intraoperativní mammografická metoda, endoskopická metoda metoda, u nichž lze s použitím sloučenin podle tohoto vynálezu diagnostikovat nemocné tkáně detekcí fluorescence nebo detekcí neabsorbovaného záření. Zvláštním předmětem tohoto vynálezu je použití sloučenin podle tohoto vynálezu v endoskopických metodách, např. koloskopii, bronchoskopii, esofagialendoskopii, u nichž se diagnostikují změny tkání * φ blízkých povrchu. Použiti bílého světla se směrovaným sledováním je v diagnostice široce rozšířené. Sloučeniny podle tohoto vynálezu vytváří díky tkáňově specifickému signálu podstatné zlepšení metody, obzvláště u diagnostikování časných, vizuálně neviditelných tkáňových změn (např. dysplazie tlustého střeva).
Bylo zjištěno, že sloučeniny na bázi konjugátů barviv podle tohoto vynálezu vedou ve střevech krys s chemicky indukovanou dysplazií a karcinomem tlustého střeva, následném vymytí a provedení endoskopické fluorescenční diagnostiky (ozáření 740 nm, detekce nad 760 nm) k obohacení ve tkáních a tím ke zvýšené fluorescenci v tlustém střevu.
Předmětem vynálezu je také způsob provedení endoskopického fluorescenčního diagnostikování, obzvláště gastrointestinálniho traktu, s využitím sloučenin podle tohoto vynálezu. Přitom se do tkáně zavede jedna nebo více látek, s výhodou intravenózně nebo topicky, a světlo z odpovídajícího spektrálního rozsahu vede k elektronickému vybuzení záření použitého barviva. Barvivém odražené nebo emitované fluorescenční záření se registruje. Preferovány jsou metody, kde se ozařují velké plochy povrchových tkání a místně emitované fluorescenční záření se zobrazuje pomocí sledování s CCD kamerou nebo se zobrazovaný areál tkáně rastruje pomocí světlovodičů a získaný signál se přepočítá na umělý obrázek. Přitom může být fluorescenční signál detekován a vyhodnocován spektrálně a/nebo fázově selektivně stejně jako stacionárně a/nebo s časovým rozlišením. Získané fluorescenční obrázky mohou být simultánně zpracovány s obrázky získanými s bílým světlem a mohou být zpracovány v jeden překrývající se obrázek.
Syntéza sloučenin podle tohoto vynálezu byla dosažena s využitím metod známých z literatury. Peptidy byly vytvořeny syntézou v pevné fázi na polymerní pryskyřici. Pryskyřice jsou známy odborníkům v oboru.
Literatura: Peptide chemistry - A practical textbook (M. Bodanszky), 2. vydáni, Springer-Verlag Heidelberg 1993; AntiCancer Drug Design 12, 145-167; 1997; J. Am. Chem. Soc. 117, 11821-2, 1995.
Barviva se připravují odděleně a poté se během syntézy peptidu v pevné fázi připojí k peptidu a sloučeniny podle tohoto vynálezu se odštěpí od pryskyřice, čímž se po čištěni získají vysoce čisté sloučeniny.
Preferována jsou taková barviva, která obsahují karboxylové skupiny, které lze po aktivaci s příslušnými činidly spojovat s aminoskupinami peptidu, obzvláště s ε-aminoskupinou lysinu nebo N-terminální skupinou peptidu. Dále jsou preferována barviva s halogenalkylovými nebo halogenacetylovými zbytky, které mohou být spojovány s thiolovými skupinami peptidů, obzvláště aminoskupinou cysteinu nebo homocysteinu.
Literatura o syntéza polymethinových barviv: Bioconjugate Chem. 4, 105-111, 1993; Bioconjugate Chem. 7, 35662, 1996; Bioconjugate Chem. 8, 751-56, 1997; Cytometry 10, 11-19, 1989 a 11, 418-30, 1990; J. Heterocycl. Chem. 33, 1871-6, 1996; J. Org. Chem. 60, 2391-5, 1995; Dyes and Pigments 17, 19-27, 1991, Dyes and Pigments 21, 227-34, 1993; J. Fluoresc. 3, 153155, 1993; Anal. Biochem. 217, 197-204, 1994; US 4981977; US 5688966; US 5808044; WO 97/42976; WO 97/42978; WO 98/22146; WO
98/26077; EP 0800831.
Obzvláště vhodné pro spojováni s peptidy na pevné fázi jsou barviva, která obsahují přesně jednu karboxylovou skupinu, obzvláště výhodně kyaninová barviva obecného vzorce XVIII
kde p je 1, 2 nebo 3, n je číslo 1, 2, 3, 4 nebo 10,
R1 a R2 jsou nezávisle na sobě 4-sulfobutyl-, 3-sulfopropyl-, 2-sulfoethyl-, 3-methyl-3-sulfopropyl~, methylový, ethylový nebo propylový zbytek a
R3 je vodík nebo zbytek -COOE1, -ΟΟΝΕΧΕ2, -NHCOE1, -NHCONHE1, -NE1E2, -OE1, -OSO3E1, -SO3E1, -SO2NHE1, kde E1 a E2 jsou nezávisle na sobě vodíkový atom nebo methyl, ethyl nebo C3 až C6 alkylový zbytek, který může být přerušen s 0 až 2 kyslíkovými atomy a/nebo 0 až 1 karbonylovou skupinou a/nebo může být substituován s 0 až 5 hydroxylovými skupinami, nebo kyaninová barviva obecného vzorce XIX nebo XX
(XIX) • 9
kde n je 2 nebo 3,
R1 a R2 jsou nezávisle na sobě 4-sulfobutyl-, 3-sulfopropylnebo 2-sulfoethylový zbytek,
R3 označuje skupinu -COOH nebo jednu z následujících skupin:
-CONH-(CH2)n-COOH kde n = 2 nebo 3,
-CONH-(CH2) n-NCS kde n = 2 nebo 3,
-CONH-(CH2) n-NHCO-CH2-X1 kde n = 2 nebo 3 a X1 = Cl, Br, I
R4 a R5 jsou nezávisle na sobě vodíkový atom, methylový zbytek nebo hydroxylovaný alkylový zbytek jako třeba 2-hydroxyethyl, 3-hydroxypropyl, 2,3-dihydroxypropyl, 1,3-dihydroxy-2-propyl,
2,3,4-trihydroxybutyl, 1,3,4-trihydroxy-2-butyl, 2,3,4,5,6pentahydroxyhexyl,
R6 je jedna z následujících skupin:
- (CH2) m-COOH kde m = 0 až 2,
-(CH2)m-NCS kde m = 0 až 2, a X je kyslíkový atom nebo atom síry;
nebo kyaninové barvivo obecného vzorce XXI
kde
R1 a R2 jsou nezávisle na sobě 4-sulfobutyl-, 3-sulfopropylnebo 2-sulfoethylový zbytek,
R3 označuje skupinu -COOH nebo jednu z následujících skupin:
-CONH-(CH2) n~COOH kde n = 2 nebo 3,
-CONH-(CH2) n-NCS kde n = 2 nebo 3,
-CONH-(CH2) n-NHCO-CH2-X1 kde n = 2 nebo 3 a X1 = Cl, Br, I
R4 a R5 jsou nezávisle na sobě vodíkový atom, methylový zbytek nebo hydroxylovaný alkylový zbytek jako třeba 2-hydroxyethyl, 3-hydroxypropyl, 2,3-dihydroxypropyl, 1,3-dihydroxy-2-propyl,
2,3,4-trihydroxybutyl, 1,3,4-trihydroxy-2-butyl, 2,3,4,5,6pentahydroxyhexyl.
Výhoda jedné skupiny schopné aktivace, jako třeba jedna karboxylová skupina nebo, nebo jedné již aktivované skupiny jako třeba isothiokyanát, halogenalkylová skupina nebo halogenacetylová skupina, spočívá v tom, že může dojít k chemicky jednotnému připojení. Halogenacetylová skupina je obzvláště výhodná v tom, že může dojít k chemicky jednoznačnému připojení na merkaptoskupinu cysteinu nebo homocysteinu. Toto připojení může být provedeno v roztoku na nevázaném peptidu zbaveném chránících skupin. Pomocí aktivovaných skupin je možné spojení bez výskytu vedlejších reakcí. Pro zvýšení rozpustnosti ve vodě vykazují konjugáty peptidu a barviva zvýšený počet hydroxylových skupin na barvivu. Kromě toho, pomocí vhodné polohy připojení linkeru na indolovém systému barviva můžeme dosáhnout dostatečné hydrofilicity díky zbytkům obsahujícím sulfonátové skupiny na dusíkových atomech indolového systému. Tím mohou být provedeny strukturně jednoznačné spojovací reakce s peptidy (viz Příklady 4 až 38 a 44 až 49).
Dalším předmětem tohoto vynálezu je optické diagnostikům pro in vivo diagnostikaci nemocných tkání, vyznačující tím, že obsahuje alespoň jednu sloučeninu obecného vzorce I společně s obvyklými pomocnými látkami a/nebo nosiči popř. ředidly.
Příklady provedeni vynálezu
Následující příklady vysvětlují tento vynález:
Příklady 1 až 3: Syntéza indokyaninových barviv 1 až 3 ke spojování s aminoskupinami peptidu (N-terminální nebo ε-lysin) v syntéze na pevné fázi
Syntéza byla obecně provedena vycházejíc z l-(4sulfobutyl)-2,3,3-trimethyl-3H-indoleninu a 1-(4-sulfobutyl)• · · · · φφ φ φ φφφ • φ φ φ φ φφφ φ φ φ • ΦΦ φφ φφ ···
2.3.3- trimethyl-5-karboxy-3H-indoleninu (Cytometry 10, 11-19,
1989, Talanta 39, 505-510, 1992) .
Příklad Syntéza sodné soli 1,1'-Bis(4-sulfobutyljindokarbokyanin-5-karboxylové kyseliny (1)
0,8 g ( 4,0 mmol) N,N-difenylformamidinu bylo předloženo do 15 mů anhydridu kyseliny octové a poté bylo při laboratorní teplotě po částech přidáno 1,4 g (4,2 mmol) 1-(4-sulfobutyl)-
2.3.3- trimethyl-5-karboxy-3H-indolenin. Směs byla poté 30 min míchána při 120 °C a poté pomocí vodní lázně ochlazena na laboratorní teplotě. Poté bylo přidáno 1,2 g (4,1 mmol) l-(4sulfobutyl)-2,3,3-trimethyl-3H-indoleninu, 1,2 g (14,6 mmol) bezvodého acetátu sodného, 15 ml anhydridu kyseliny octové a 6 ml kyseliny octové. Reakční směs byla 1 h zahřívána na 120 °C, tmavě červený roztok byl ochlazen a bylo přidáno 100 ml etheru. Vzniklá sraženina byla odfiltrována a byla podrobena chromatografickému čištění na RP-silikagelu EUROPREP 60-30 C18, 60A, 20-45 m (Eluent: voda/MeOH, gradient od 0 do 70 %
MeOH). Frakce obsahující produkt byly rotační vakuové odparce zbaveny methanolu a na závěr byly lyofilizovány, výtěžek: 1,5 g (58%), červený lyofilizát).
Příklad 2:
Syntéza sodné soli 1,1'-Bis(4-sulfobutyl)indodikarbokyanin-5karboxylové kyseliny (2)
1,2 g (4,1 mmol) 1-(4-Sulfobutyl)-2,3,3-trimethyl-3Hindoleninu a 1,0 g ( 3,9 mmol) malonaldehyd-bis-fenyliminhydrochloridu bylo mícháno v 15 ml acetanhydridu 30 min při teplotě .120 °C a poté pomocí- vodní, lázně ochlazeno na laboratorní teplotu. Poté bylo · postupně. přidáno 1,4 g (4,2 mmol) .... ... .1-(4-sulfobutyl)-2,3,3-trimethyl-5-karboxy-3H32 ···· » · » «·* • · «* ·♦ · ·· ·· ··· indoleninu, 1,2 g (14,6 mmol) bezvodého acetátu sodného, 15 ml anhydridu kyseliny octové a 6 ml kyseliny octové. Reakční směs byla 1 h zahřívána na teplotu 120 °C, modrý roztok byl ochlazen a bylo přidáno 100 ml etheru. Zpracování a čištění bylo provedeno stejně jako v Příkladu 1, výtěžek: 1,8 g (66 %), modrý lyofilizát.
Příklad 3
Syntéza sodné soli 1,1'-bis(4-sulfobutyl)indotrikarbokyanin-5karboxylové kyseliny (3)
1,2 g (4,1 mmol) 1-(4-sulfobutyl)-2,3,3-trimethyl-3Hindoleninu a 1,1 g (3,9 mmol) glutakonaldehyddianilhydrochlorid byla míchána 30 min v 15 ml anhydridu kyseliny octové při teplotě 120 °C a poté byla s vodní lázní ochlazena na laboratorní teplotu. Poté bylo přidáno 1,4 g (4,2 mmol) 1(4-sulfobutyl)-2,3,3-trimethyl-5-karboxy-3H-indolenin, 1,2 g (14,6 mmol) bezvodého acetátu sodného, 15 ml anhydridu kyseliny octové a 6 ml kyseliny octové. Reakční směs byla 1 h zahřívána na 120 °C, modrý roztok byl ochlazen a bylo přidáno 100 ml etheru. Zpracování a čištění bylo provedeno stejně jako v Příkladu 1, výtěžek: 1,8 g (60 %), modrý lyofilizát.
Struktury sloučenin z příkladů 1 až 3 jsou zobrazeny na obrázku 1.
Příklady 4 až 6: Syntéza indokyaninových barviv 4 až 6 ze sloučenin 1 až 3 ke spojování s aminoskupinami peptidů (Nterminální nebo ε-lysin) v syntéze na pevné fázi
Syntéza byla provedena amidací barviv 1 až 3 s β-alanin-tercbutylesterem a kyselým štěpením trec-butylesterové skupiny
Roztok 0,5 mmol· barviva 1 až 3 a 0,1 g (1,0 mmol) triethylaminu ve 20 ml dimethylformamidu byl při 0 °C smíchán s 0,5 mmol TBTU v 10 ml dimethylformamidu a směs byla 15 min míchána při teplotě 0 °C. Poté byl k reakční směsi přikapán roztok 0,11 g (0,6 mmol) β-alanin-t-butylester hydrochloridu a 0,6 mmol triethylaminu v 5 ml dimethylformamidu a reakční směs byla míchána 2 h při pokojové teplotě. Po přidání 100 ml diethyletheru byla sraženina odfiltrována, rozpuštěna ve 20 ml dichlormethanu, bylo přidáno 10 ml trifluoroctové kyseliny a směs byla míchána 24 h při laboratorní teplotě. Směs byla odpařena ve vakuu a zbytek byl podobně jako bylo popsáno v Příkladu 1 podroben chromatografickému čištění a lyofilizaci; výtěžek: 0,21 g (58%) 4, 0,29 g (76%) 5, 0,28 g (72%) 6.
Příklady 7 až 9: Syntéza indokyaninových barviv 4 až 6 ze sloučenin 1 až 3 ke spojování s aminoskupinami peptidu (Nterminálni nebo ε-lysin) v syntéze na pevné fázi
Syntéza byla provedena analogicky k příkladům 4 až 6 s využitím 0,1 g (0,6 mmol) glycin-t-butylester hydrochloridu, Výtěžky: 0,25 g (68%) 4, 0,30 g (80%) 5, 0,32 g (83%) 6.
Příklady 10 až 12: Syntéza indokyaninových barviv 10 až 12 ze sloučenin 1-3 ke spojování s thiolovou skupinou cysteinu v syntéze peptidu na pevné fázi
Syntéza byla provedena amidací sloučenin 1 až 3 se 3aminopropanolem a nakonec převedením alkoholické skupiny na bromid.
Roztok 0,5 mmol barviva 1 až 3 a 0,1 g 10 (1,0 mmol) triethylaminu ve 20 ml dimethylformamidu byl nechán při 0 °C reagovat s 0,5 mmol TBTU v 10 ml dimethylformamid a směs byla ·· ···· · ·· ·· ♦ ♦ · · · · · ·
9 0 ······
9 0 9 0 9 0 0 9 0 O
O O Ο O 0 9 9 O O O
00 999 99 09 999 min míchána při O °C. Pak byl přidán roztok 850 mg (1,2 mmol) 3-aminopropanolu a bylo přikapáno 1,2 mmol triethylaminu v 5 ml dimethylformamidu a reakční směs byla 6 h míchána při laboratorní teplotě. Po přídavku 100 ml diethyletheru byla sraženina zfiltrována a podrobena chromatografickému čištění a lyofilizaci podle popisu v Příkladu 1.
Převedení na bromidy 10 až 12 bylo provedeno mícháním 0,3 mmol meziproduktu s 55 mg (0,5 mmol) N-bromsukcinimidu a 130 mg (0,5 mmol) trifenylfosfinu ve směsi 4 ml dichlormethanu a 4 ml dimethylformamidu 48 h při teplotě 4 °C. Přídavkem 3 ml etheru byl produkt vysrážen, zfiltrován a jako surový produkt byl použit pro spojovací reakci s peptidem.
Příklady 14 až 16 a 18 až 27: Syntéza peptidových konjugátů na pevné fázi z peptidu vázajících VlP-receptory a barviv 1 až 9 a 13.
a) Syntéza peptidu na pevné fázi: Na 50 μιηοΐ TentaGel-Srampryskyřice (Rapp Polymere, Tubingen) byla provedena syntéza peptidu Fmoc-strategií analogicky podle standardního Fmocautomatizovaného protokolu (Pept. Res. , 36 (1990) 225) s využitím kaplovacích činidel PyBOP (benzotriazol-l-yloxy-trispyrrolidionofosfonium hexafluorofosfát) a N-methylmorfolinu. Byly využity následující chránící skupiny postranního řetězce: trityl pro Cys, His, Asn a Gin; t-butyl pro Asp, Glu, Ser a Thr; t-butyloxykarbonyl pro Lys a Trp a pentamethylchromansulfonyl pro Arg.
Spojování ε-aminoskupiny lysinu (Příklad 24) bylo provedeno pomocí techniky orthogonálních chránících skupin. Jako lysinový stavební kámen byl použit Fmoc-Lys(Dde)-OH a peptid byl syntetizován podle výše uvedeného popisu. Po acetylaci Nkonce bylo selektivně provedeno odštěpení Dde-chránící skupiny prostřednictvím 3% hydrazinhydrátu.
• ·
b) Spojováni s barvivém: Na peptid vázaný na pevné fázi bylo k N-konci popřípadě na lysin připojeno barvivo. Přitom bylo rozpuštěno 75 μτηοΐ odpovídajícího barviva 1 až 9 a 13 (1,5 ekv.) v 600 μΐ dimethylformamidu a bylo přidáno 83 μπιοί TBTU (2- (lH-benzotriazol-l-yl)-1, 1,3,3-tetramethyluroniumtetrafluoroborát) a 150 μιηοΐ N,N-diisopropylethylaminu. Po 2 min byla reakční směs přidána k odpovídající pryskyřici a byla nechána reagovat přes noc. Na závěr byla pryskyřice promyta 5x s dimethylformamidem a 3x s dichlormethanem a byla sušena na vzduchu.
c) Odstranění chránících skupin a odštěpení konjugátu barviva s peptidem:
1,5 ml směsi obsahující 750 mg fenolu,
250 μΐ ethandithiolu,
500 μΐ kyseliny konjugát s peptidem byl promyt se thioanisolu a 500 bylo přidáno k a byla ponechána μΐ vody v pryskyřici hod působit.
ml trifluoroctové obsahující peptidový
Konjugát barviva studeným t-butylmethyletherem, 6x promyt se studeným diethyletherem, byl rozpuštěn v 5% roztoku kyseliny octové a byl lyofilizován. Čištění pomocí RP-HPLC na sloupci Vydac-C18 (gradient: voda+0,05% TFA/acetonitril, 5% až
60% acetonitril během 20 min, detekce: 214 a 750 nm).
Struktury syntetizovaných konjugátů barviv s peptidy jsou shrnuty v následujícím přehledu:
Konjugáty barviva s peptidem vázajícím VlP-receptor I
Příklad 14 až 16: Konjugáty barviv 1 až 3 s VIP (1-28)
•Μ Φ··Φ · *·* »* φ · φ Φ Φ Φ · ΦΦΦ * Φ · φ···· • ΦΦΦ ΦΦΦ ΦΦΦ ·« φφ »ΦΦ ΦΦ ΦΦ ΦΦΦ η = 1 : Indokarbokyanin-VIP (1-28) -konjugát 14 η = 2: Indodikarbokyanin-VIP(1-28)-konjugát 15 η = 3: Indotrikarbokyanin-VIP(1-28)-konjugát 16
Přiklad 17: Konjugát barviva 12 s Cys17-VIP (1-28)
HSDAVFTDNYTRLRKQ-Cys-AVKKYLNSILN
Indotrikarbokyanin-Cys17-VIP (1-28) - konjugát 17
Příklad 18 až 20: Konjugát barviva 1 až 3 s VIP(14-28)
n = 1: Indokarbokyanin-VIP(14-28)-konjugát 18 n = 2: Indodikarbokyanin-VIP(14-28)-konjugát 19 n = 3: Indotrikarbokyanin-VIP(14-28)-konjugát 20
Příklad 21 až 23: Konjugát barviva 4 až 6 s VIP(14-24)
4» • · • · ···· • • ·· * · 9 9 9 99 9 9 9 9 9 9
• · • · 9 9 9 9 9
·« ♦ · 999 99 99
η = 1: Indokarbokyanin-p-Alanin-VIP(14-24)-konjugát 21 η = 2: Indodikarbokyanin-p-Alanin-VIP(14-24)-konjugát 22 n = 3: Indotrikarbokyanin-p-Alanin-VIP(14-24)-konjugát 23 Přiklad 17:
Syntéza v pevné fázi (na pryskyřici) peptidových konjugátů složených z peptidu vázajících VlP-receptor a barvivo 10 až 12
Barviva 10-12, nesoucí brom v molekule, chemoselektivní při tvorbě thioetherové vazby na peptid, musí být v peptidu zaveden na cystein nebo homocystein s orthogonálními chránícími skupinami. Syntéza v pevné fázi byla provedena podobně jako bylo popsáno v příkladu 14-16/18-27 a byl nasazen stavební kámen Fmoc-cys(Mmt)-OH. Monomethoxytritylová skupina (Mmt) byla odštěpena za přítomnosti ostatních chránících skupin postranního řetězce pomocí 1% TFA/5% triisobutylsilanu v dichlormethanu. Poté byla pryskyřice třikrát inkubována s 1 ml výše získaného roztoku po dobu 10 minut. Po promytí pryskyřice s dichlormethanem (3x), DMF (5x) a ethanolem (3x) byla pryskyřice 2 min inkubována s 20% roztokem uhličitanu česného a na závěr byla promyta s vodou (2x) , ethanol (2x) a DMF (2x) . Pak bylo 75 μτηοΐ odpovídajícího barvivo 10-12 (1,5 ekv.) rozpuštěno v 600 μΐ dimethylformamidu a bylo přidáno k pryskyřici a proces byl po 30 minut opakován. Na závěr byla pryskyřice promyta dimethylformamidem (5x) a s dichlormethanem (2x). Po vysušení pryskyřice na vzduchu bylo provedeno odštěpení chránících skupin a bylo provedeno odštěpení od nosiče podle výše uvedeného popisu.
Struktury dalších syntetizovaných konjugátů barviva s peptidy jsou uvedeny v následujícím přehledu:
Konjugáty barviva s peptidem vázajícím VlP-receptor I
Příklad 24: Konjugát barviva 6 s Lys25-VIP(14-25)
(ε-amino-indotrikarbokyanin)-Lys25-VIP(14-25)-konjugát 24
Příklad 25: Konjugát barviva 3 s D-VIP(14-24)
N-rkqmavkkyln H
Indotrikarbokyanin-D-VIP(14-24)-konjugát 25
Příklad 26: Konjugát barviva 13 s D-VIP(14-24)
N-rkqmavkkyln H
Glukamid indotrikarbokyanin-5-karboxylové kyseliny D-VIP(1424)-konjugát 26
Příklad 27: Konjugát barviva 13 s retro-D-VIP(14-24)
Glukamid indotrikarbokyanin-5-karboxylové kyseliny retro-DVIP(14-24)-konjugát 27
Přiklad 28 až 32: Syntéza v pevné fázi (na pryskyřici) peptidových konjugátů složených z peptidů vázajících somatostatinový receptor a barvivo 1 až 9 a 13.
Obecný předpis:
Syntéza byla provedena na 500 mg TCP-Thr(But)-fmoc-pryskyřice (Firma Pepchem Tubingen) s násadou 0,49 mmol/g. Peptid byl syntetizován „krok za krokem s využitím následujících dočasných chránících skupin: terc-butyl pro Thr a Ser, Trityl pro Cys a Asp, Boc pro Trp a Lys. Jako kondenzační činidlo bylo použito HBTU.
Po odštěpení N-koncové Fmoc chránící skupiny byla ve zvláštním reakčním kroku přikondenzována barviva 1 až 9 a 13. Kvůli tomu bylo suspendováno 255 mg pryskyřice v přibližně 2 ml DMF a bylo přidáno 0,5 mmol barviva, 0,5 mmol HBTU a 0,17 ml DIEA. Směs byla míchána 18 h za laboratorní teploty, pryskyřice byla odsáta, promyta dichlormethanem a sušena. Odštěpení konjugátu barviva s peptidem bylo provedeno pomocí 95% trifluoroctové kyseliny s přídavkem triisopropylsilanu a následnou lyofilizací z 10% kyseliny octové. Surový produkt byl cyklizován pomocí aktivního uhlí a čištěn chromatograficky (50 x 300 mm, VYDAC RP-18, Gradient: voda/acetonitril).
Struktury syntetizovaných konjugátů peptidu a barviva jsou shrnuty v následujícím přehledu:
Konjugáty barviva s peptidem vázajícím somatostatinový receptor
Příklad 28 až 30: Konjugát barviva 1 až 3 s pentetreotidem (CH2)4SO3· (CH2)4SO3* Na* n = 1: indokarbokyanin-pentetreotid 28 n = 2: indodikarbokyanin-pentetreotid 29 n = 3: indotrikarbokyanin-pentetreotid 30
Příklad 31: Konjugát barviva 3 se somatostatinem-14 (CH2)4SO3· (CH2)4SO3· Na*
Indotrikarbokyanin-sómatostatin-14-konjugát 31
Příklad 32: Konjugát barviva 13 se somatostatinem-14
O O
H1
HOH
Glukamid indotrikarbokyanin-5-karboxylové kyselinysomatostatin-14 konjugát 32
Příklady 33 až 38: Syntéza peptidových konjugátů z neurotensinových peptidů a barviva 3
Syntéza látek byla provedena analogicky podle již popsaných příkladů 14 až 27, obecnými postupy.
Struktury syntetizovaných konjugátů peptidů a barviva jsou shrnuty v následujícím přehledu:
Konjugáty barviv s peptidy vázajícími naurotensinový receptor
Příklady 33 až 35:
Konjugát barviv 7 až 9 s D-Tyr11neurotensinem (7-13)
n = 1: indokarbokyanin-D-Tyr11-neurotensin(7-13) - konjugát 33 n = 2: indodikarbokyanin-D-Tyr11-neurotensin(7-13) - konjugát n = 3: indotríkarbokyanin-D-Tyrn-neurotensin(7-13) - konjugát
Příklad 36: Komjugát barviva 2 s D-Tyrn-neurotensinem • ·
pGlu LYENKPRRPylL (ε-Amino-Lys6 Indodikarbokyanin)-DPřiklad 37 až 38:
Konjugát barviva 10-11 s D-Tyr11neurotensinem(5-13)-Cys
NKPRRPylLC n = 1: indokarbokyanin-D-Tyr1:L-neurotensin (5-13)-Cys konjugát n = 2: indokarbokyanin-D-Tyr11-neurotensin(5-13)-Cys konjugát
Příklad 39: Absorpční a fluorescenční vlastnosti syntetizovaných konjugátů barvivo-peptid
Absorpční maxima a extinkčni koeficienty byly určeny v PBS a v hovězí plasmě (Perkin Elmer Lambda 2). Fluorescenční emisní spektra byla získána v PBS ozářením na krátkovlnné straně (cca 40 nm od absorpčního maxima) (SPEX Fluorolog, R928 PMT) .
•· · • · · • · ·9
9999
Absorpční a fluorescenční data jsou shrnuta Na obrázku 5 jsou uvedeny příklady typických fluorescenčních emisních spekter.
na Obrázku 4.
absorpčních a
Příklad 40: Určení vnímavosti buněk pomocí fluorescenční mikroskopie
Vázání a příjem sloučenin podle tohoto vynálezu bylo zkoumáno exprimování receptorů in vitro v lidských nádorových buňkách, pro vasoaktivní intestinální peptid a/nebo somatostatin a/nebo neurotensin. K tomu bylo 5 x 105 nádorových buněk inkubováno v
1,5 ml média, obsahujícího testovanou sloučeninu. Byly použity různé koncentrace látky (10 nM až 10 μΜ) a byla měněna doba inkubace (1 min až hod). Po inkubaci byly buňky zfiltrovány a byly zhotoveny mikroskopické preparáty.
Vyhodnocení bylo provedeno na vybaveném s Cy dělič paprsků
Zeiss Axiovert 135-fluorescenčním
7- (excitace HQ
50 nm LP) , Cy5660-710 nm BP,
Be-rozdělovač 645 (excitace 546/12 nm, emitor 590
710/70 nm, emitor nm, emitor nm) a Cy3-filtrační nm LP, dělič paprsků soupravou světle a
U všech preparátů byly snímány obrázky v bílém
CCD kamery (Visitron RTE/CCD-576) obrázky fluorescenční pomocí a byly digitálně uloženy.
Vybrané výsledky jsou popsány v následujícím textu:
Bylo provedeno snímkování buněk HT29 v bílém světle a v oblasti fluorescence po minutové inkubaci s 10 mM indotrikarbokyanin-VIP(1-28) konjugátu 16.
Ve fluorescenčních snímcích byla detekována rozsáhlá fluorescence homogenně rozdělená po celé buňce. Kromě toho byly pozorovatelné oblasti se zvýšeným signálem, což může být spojeno s vesikulárními
útvary. Buňky na fluorescenčních obrázcích korelují s prostorovým vzhledem na obrázcích v bílém světle.
S následujícími sloučeninami bylo analogicky provedeno snímkování v bílém a fluorescenčním (Cy7 filtrační set) světle:
Indotrikarbokyanin-VIP(14-28) konjugát 20, 10 μΜ, HT29 buňky. Fluorescence homogenně rozptýlená po celé buňce, dobrá korelace s obrázky získanými v bílém světle.
Indotrikarbokyanin-retro-D-VIP(24-14) konjugát 25, 10 μΜ, HT29 buňky. Fluorescence homogenně rozptýlená po celé buňce, dobrá korelace s obrázky získanými v bílém světle.
Indotrikarbokyanin-pentetreoid konjugát 30, 10 μΜ, RIN38-VIP1 buňky. Fluorescence kopíruje vesikuly v oblasti membrány, dobrá korelace s obrázky získanými v bílém světle.
S následujícími sloučeninami bylo analogicky provedeno snímkování ve fluorescenční oblasti:
(ε-Aminoindotrikarbokyanin) -Lys25-VIP (14-25) konjugát 24, 10 μΜ, RIN38-VIP1 buňky, Cy7 filtrační set. Fluorescenční obrázky ukazují homogenní intracelulární fluorescenci blízko buněčného j ádra.
Indotrikarbokyanin-VIP(1-28) konjugát 15, 10 μΜ, RIN38-VIP1 buňky, Cy5 filtrační set. Fluorescenční obrázky ukazují intracelulární fluorescenční místa kopírující vesikuly v oblasti buněčné membrány.
Indokarbokyanin-VIP(1-28) konjugát 14, 10 μΜ, RIN38-VIP1 buňky, Cy3 filtrační set. Fluorescenční obrázky ukazují intracelulární fluorescenční místa kopírující vesikuly v oblasti buněčné membrány.
Přiklad 41: Sledování růstu nádorů pomocí in vivo fluorescenčního snímkování myší s nádorem
Schopnost sloučenin podle tohoto vynálezu poskytovat obrázek byl zkoumán in vivo injekcí u holých myší nesoucích nádor.
K tomu bylo aplikováno 0,1 gmol/kg až 2 μιηοΐ/kg substance a byl sledován růst nádorové oblasti v čase 0 až 48 hodin.
Fluorescence látky byla pozorována po ozáření zvířete světlem blízké infračervené oblasti vlnové délky
640 nm (indodikarbokyanin) popř.
740 nm (indotrikarbokyanin), které bylo vyzařováno
Nd:YAG laserem.
Fluorescenční záření bylo detekováno při vlnových délkách vyšších než 700 nm popř.
vyšších než 800 nm pomocí CCD kamery a fluorescenční obrázky byly digitálně uloženy.
Vybrané výsledky jsou popsány v následujícím textu:
U holých myší nesoucích nádor (HT29 tumor na pravé zadní straně) byly snímány fluorescenční obrázky celého těla před a 1 h po aplikaci 0,1 μmol/kg indotrikarbokyanin-VIP(14-28) konjugátu 20. Intenzita fluorescence před aplikací byla zanedbatelná (nízká autofluorescence). Hodinu po aplikaci byl získán cca. 2x zvýšený signál tumoru ve srovnání s protilehlým bokem s jinak homogenně rozptýlenou fluorescenční emisí po zbytku těla.
U holých myší nesoucích nádor (RIN38-SSTR2 tumor na pravé zadní straně) byly snímány fluorescenční obrázky celého těla před a 1 h po aplikaci 0,1 μιηοΐ/kg indotrikarbokyaninpentetreotid konjugátu 30. Intenzita fluorescence před aplikací byla zanedbatelná (nízká autofluorescence). Hodinu po aplikaci byl získán cca. 3x zvýšený signál tumoru ve srovnání
s protilehlým bokem s jinak homogenně rozptýlenou fluorescenční emisí po zbytku těla.
U holých myší nesoucích nádor (HT29 tumor na pravé zadní straně) byly snímány fluorescenční obrázky celého těla před a 1 h po aplikaci 0,1 μιηοΐ/kg (ε-amino-indotrikarbokyanin-Lys25VIP(14-25) konjugátu 24. Intenzita fluorescence před aplikací byla zanedbatelná (nízká autofluorescence) . Hodinu po aplikaci byl získán cca. 1,5 x zvýšený signál tumoru ve srovnání s protilehlým bokem. Kromě toho byl v blízkosti detekován zvýšený fluorescenční signál.
U holých myší nesoucích nádor (HT29 tumor na pravé zadní straně) byly snímány fluorescenční obrázky celého těla před a 5 min po aplikaci 0,2 μπιοΐ/kg indotrikarbokyanin-VIP (1-28) konjugátu 15. Intenzita fluorescence před aplikací byla zanedbatelná (nízká autofluorescence). Hodinu po aplikaci byl získán cca. 1,4 x zvýšený signál tumoru ve srovnání s protilehlým bokem. Kromě toho byl v blízkosti detekován zvýšený fluorescenční signál.
Příklad 42: Výzkum stability konjugátu barviva s peptidem v hovězí plasmě
Chemická stabilita sloučenin podle tohoto vynálezu byla zkoumána in vitro v plasmě v závislosti na čase pomocí HPLC. Přitom byl pipetován 1 μΜ roztok peptidu v PBS v hovězí krevní plasmě (Firma Graeber, zmrzlá, pro heparinovou analýzu) až do vzniku 30 μΜ koncentrace a roztok byl inkubován při 37 °C.
V různých časových okamžicích (0,5, 1, 2, 4, 6, 24 h) byly zpracovány vzorky, ve kterých byl 1 ml roztoku plasmy naředěn s 1 ml methanolu a vysrážený protein byl oddělen centrifugaci.
Analýza zbytku byla prováděna pomoci HPLC určením obsahu při 750 nm vztaženém na obsah po 1 min inkubaci při 0 °C (kontrolní vzorek).
HPLC: Beckmann, Diod-array detektor TIDAS (Firma J&M) 350 1000 nm,
Kolona: Chromasil 5 μπι, 250 mm x 4,5 mm
Eluent: A: 90% voda (+ 0,5% TFA)/10% MeOH
B: 10% voda (+ 0,5% TFA)/90% MeOH
Gradient: 10% B na 100% B během 20 minut
Příklady jsou uvedeny na Obrázku 6.
Příklad 43: Substituční analýza pomocí VIP bodové syntézy
1. Syntéza peptidů na celulose
Bodová syntéza peptidů na celulose (spot-syntéza) byla poprvé publikována R. Frankem a R. Dbringem a v roce 1992 byla detailně popsána R. Frankem1. Zde je uvedena metoda zavedená v AG Schneider-Mergener.2
Celulosová membrána byla chemicky modifikována zavedením vhodné kotvící funkční skupiny pro následující peptidovou syntézu. K tomu byla na aminofunkcionalizovanou celulosovou membránu (CAPE-membrána)3 merkapto funkce.4 Na tuto thiolovou funkci byla připojena první aminokyselina ve formě brompropylesteru. Poté byly postupně připojovány všechny aminokyseliny peptidu pomocí Fmoc strategie. Na závěr bylo na N-konec peptidu připojeno indodikarbokyaninové barvivo a konečně byly odštěpeny všechny chránící skupiny postranních řetězců.
U peptidů pro výzkum vázání receptorů musí být peptid odštěpen od celulosy. Proto byla vyvinuta metoda, která poprvé dovoluje odštěpení peptidu s autentickým C-koncem od celulosy.
la. Modifikace ceiulosové membrány * 20 x 30 cm veliká celulosová membrána (Whatman 50) byla inkubována 2 minuty ve směsi methanol/1,2% perchloroctová kyselina a poté byla usušena.
* Po tříhodinové inkubaci s 10% epibromhydrinem ve směsi dioxan/1,2% perchloroctová kyselina byla ponechána reagovat 30 minut s methanolem a poté byla dvakrát promyta s methanolem.
* Na závěr byla membrána promyta třikrát s dimethylformamidem (DMF) a byla inkubována přes noc s 50%
1,3-diaminopropanem (v/v) v DMF. Poté byla postupně promyta 3 x s DMF, 2 x s ethanolem, 2 x s destilovanou vodou, 2 x s ethanolem, 15 minut s 5M ethanolátem sodným, 3 x s methanolem, 4 x s destilovanou vodou, 3 x s ethanolem, 1 x s diethyletherem.
lb. Definice skvrn * Pro definování skvrn bylo pomocí zařízení Auto-Spot Robot 222 XL (Abimed, Langenfeld) dvojnásobně odpipetováno 1,3 μΐ 0,6 M Fmoc-p-Alanin-Opfp roztoku při reakčním čase 15 minut na určené body ceiulosové membrány.
* Membrána byla 2 minuty acetylována s 2% roztokem acetanhydridu a 30 minut s 20% acetanhydridem/10% diisopropylethylaminem.
* Pro odštěpení Fmoc-chránicí skupiny byla membrána 3 x promyta s DMF, inkubována 2 x 10 min s 20% roztokem piperidinu, promyta 5 x s DMF a 1 x s ethanolem. Volné aminoskupiny bylo možné zviditelnit bromfenylovou modří. Po opakovaném promytí s ethanolem byla membrána vysušena.
«9 ··· · • · • 9
9··· • · ·· • ·· lc.
Spojováni
Mmt-merkaptopropionové kyseliny brompropylesterů * 0,6 M Merkaptopropionová kyselina byla při reakčnim čase 15 minut dvojnásobně odpipetována na definované skvrny. Na závěr byla membrána promyta 3 x s DMF a 3 x s dichlormethanem (DCM).
* Odštěpení Mmt chránící skupiny bylo provedeno 2 min inkubací se směsí 10% dichloroctová kyselina/0,5% trifluoroctová kyselina a 3 x 5 min se směsí 10% dichloroctová kyselina/0,5% trifluoroctová kyselina/5% triisobutylsilan. Dále byla promyta 1 x s DCM, 2 x s ethanolem, 1 x s destilovanou vodou, 1-2 min s 10% uhličitanem česným, 1 x s destilovanou vodou, 2 x s ethanolem, 1 x s diethyletherem.
* Fmoc-brompropylestery aminokyselin byly kaplovány 3 x s koncentrací 0,6 M a reakční dobou 15 min. Odštěpení Fmoc chránící skupiny bylo provedeno stejně jako v bodu lb.
ld. Spojování aminokyselin * Peptidy byly vybudovány opakovaným odpipetováním 0,6 M roztoku aminokyseliny v N-methylpyrrolidonu na skvrny a závěrečným odštěpením Fmoc chránící skupiny.
le. Spojování indodikarbokyaninových barviv * 0,3 M roztok indodikarbokyaninového barviva byl aktivován s 0,3 M TBTU a 0,6 M diisopropylethylaminu a byl čtyřikrát odpipetován na skvrny při reakční době 15 min.
lf. Odštěpení chránících skupin vedlejšího řetězce • ·
* Odštěpeni chránících skupin postranního řetězce bylo provedeno postupnou reakcí membrány s 90% trifluoroctovou kyselinou/3% triisobutylsilanen/2% destilovanou vodou/1% fenolem po dobu 30 minut a s 50% trifluoroctovou kyselinou/3% triisobutylsilanem/2% destilovanou vodou/1% fenolem po dobu 2,5 h. Na závěr byla membrána promyta 4 x s dichlormethanem, 3 x s DMF a 1 x s ethanolem.
2. Odštěpení peptidu z celulosové membrány * Skvrny byly vyraženy a promyty s methanolem. Pro odštěpení byly 30 min inkubovány se 70 mM roztokem methanolátu sodného v methanolu. pH bylo upravováno pomocí přídavků 37% kyseliny chlorovodíkové. Na závěr byl peptid sušen v zařízení SpeedVac.
* Po vysušení byl peptid dán do destilované vody a analyzován pomocí HPLC na reverzní fázi a MALDI TOF hmotnostní spektrometrie.
3. Analýza buněk a průtoková cytometrie * Koncentrace VIP derivátů byla měřena fotometricky pomocí barviva. Při analýze buněk byl peptid naředěn na konečnou koncentraci 150 mM. Přitom bylo inkubováno 1 x 105 RIN38 (VAPC1) buněk s VIP derivátem 1 hod při 37 °C v živném pufru (50 mM Tris/HCl, pH 7,5, 5 nM MgCl2, 1 nM CaCl2, 100 mM NaCl, 4% BSA).
* Na závěr byly buňky 2 x promyty s PBS, převedeny přes FACS trubičku a centrifugovány 5 minut při 377 g. Buňky byly znovu suspendovány ve 300 μΐ Cellfixu a byly měřeny na FACS-Calibur (Becton Dickinson) pomocí FL4 optiky.
• · · ♦* · · ·· • 9 · 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9 9 9 9
99 9·9 ·· 99 999
4. Vyhodnoceni * Fluorescenční intenzita naměřená při průtokové cytometrii nativního, přirozeně se vyskytujícího lidského VlP-peptidu byla nastavena na 100%. Standardní odchylky 28 přírodních VIP peptidů byly nižší než 11%. Další VIP deriváty byly 100% podobné.
Obrázek 7 ukazuje relativní intenzitu fluorescence RIN38 VPAC1 buněk po inkubaci v přítomnosti 150 nM peptidu značeného barvivém po dobu 1 h při teplotě 37 °C. Údaje jsou v procentech vztažených na přírodní peptid stávající řady.
Literatura k bodové syntéze (spot syntéza):
1. Frank, R. (1992) Spot synthesis: an easy technique for the positionally addressable, parallel chemical synthesis on a membrane support. Tetrahedron 48, 92179232
2. Kramer, A., Schneider-Mergener, J. (1998) Synthesis and screening of peptide libraries on continuos cellulose membrane supports. Methods in Molecular Biology 87, 25-39 .
3. Volkmer-Engert, R. , Hoffmann, B. , Schneider-Mergener, J. (1997) Tetrahedron Lett. 38, 1029-1032
4. Lichá, K., Bhargava, S., Rheinlánder, C., Becker, A., Schneider-Mergener, J., Volkmer-Engert, R. (in press)
Highly paralles Nano-synthesis of cleavable peptide dye conjugates on cellulose membranes. Tetrahedron Lett.
Příklad 44
a) 5-N-(2,3-Dihydroxypropyl)aminokarbonyl-1-(4-sulfobutyl)-
2,3,3-trimethyl(3H)indolenin
0,9 g (2,6 mmol) 5-Carboxy-l-(4-sulfobutyl)-2,3,3-trimethyl(3H)indoleninu (Anal. Biochem. 217,197, 1994) bylo předloženo ve 30 ml absolutního N,N-dimethylformamidu a 3 ml pyridinu und a bylo přidáno 1,35 g (5,3 mmol) disukcinimidylkarbonátu.
Po třech hodinách bylo přidáno 0,965 g (10,6 mmol)
2,3dihydroxypropylaminu.
laboratorní teplotě,
Směs byla míchána přes noc při byla odpařena do sucha a zbytek byl míchán s diethyletherem.
podrobena čištění pomocí
Pevná látka byla odsáta a byla chromatografie na reverzní fázi.
Výtěžek: 0,82 g (76% teorie). Analýza (vztaženo na látku zbavenou rozpouštědla):
spočteno: C 55, 32 H 6,84 N 6,79 S 7,77 0 23,27
□
nalezeno: C 55,39 H 6,95 N 6, 57 S 7,58
b) 4-[2-[4-Chlor-7-[5-N-(dihydroxypropyl)aminokarbonyl-3,3dimethyl-1-(4-sulfonatobutyl)indolin-2-yliden]-3,5-(propan1, 3-diyl)-1,3,5-heptatrien-l-yl]-5-N-(dihydroxypropyl) aminokarbonyl-3,3-dimethyl(3H)indolio]butansulfonát; sodná sůl
Roztok 360 mg (1 mmol) N-[5-Anilino-3-chlor-2,4-(propan-
1.3- diyl)-2,4-pentadien-l-yliden)aniliniumchloridu, 825 mg (2 mmol) 5-N-(2,3-dihydroxypropyl)aminokarbonyl-1-(4-sulfobutyl)-
2.3.3- trimethyl(3H)indoleninu (příklad 44a) a 330 mg (4 mmol) bezvodého acetátu sodného ve 30 ml ethanolu byl zahříván 2 h k refluxu pod argonovou atmosférou. Nakonec byl oddestilován ethanol a zbytek byl čištěn sloupcovou chromatografií. Výtěžek: 0,58 g (59% teorie)
Analýza (vztaženo na látku zbavenou rozpouštědla): spočteno:C 56,17 H 6,15 Cl 3,60 N 6,79 S 7,77 O 23,27 Na 2,34 nalezeno:C 55,99 H 6,30 Cl 3,41 N 6,87 S 7,64 Na 2,17 ··**·* · *· ·· · φ · · φ · * · · · · · • · φ ······ • · φ « · φ φ φ · · • Φ ·· φ· · »· ·· φ··
c) 4-[2-[4-(4-(2-Karboxyethyl)fenyloxy)-7-[5-N-(dihydroxy- propyl)aminokarbonyl-3,3-dimethyl-l-(4-sulfonatobutyl)indolin2-yliden]-3,5-(propan-1,3-diyl)-1,3,5-heptatrien-l-yl]-5-N(dihydroxypropyl)aminokarbonyl-3,3-dimethyl(3H)indolio]butansulfonát, sodná sůl, N-hydroxysukcinimidester
225 mg (1,4 mmol) 3-(4-Hydroxyfenyl)propionové kyseliny bylo rozúuštěno v 10 ml suchého N,N-dimethylformamidu pod ochranným plynem a bylo přidáno 65 mg (2,7 mmol) hydridu sodného (60% suspenze v oleji). Po 30 min bylo přidáno 138 mg (0,14 mmol) 4-[2-[4-chlor-7-[5-N-(dihydroxypropyl)aminokarbonyl-3,3-dimethyl-l-(4-sulfonatobutyl)indolin-2yliden)-3,5-(propan-1,3-diyl)1,3,5-heptatrien-l-yl]-5-N(dihydroxypropyl)aminokarbonyl-3,3-dimethyl(3H)indolio]butansulfonát, sodná sůl (příklad 44b) a směs byla míchána dalších 30 min. Na závěr byla reakční směs rozložena přídavkem suchého ledu a odpařena do sucha. Zbytek byl čištěn pomocí preparativní HPLC. Ke vzniku aktivního esteru bylo rozpuštěno 14 mg (120 μιηοΐ) N-hydroxysukcinimidu a 2 mg (2,4 μπιοί ) der uhličité kyseliny ve 200 μΐ N,N-dimethylformamidu. Po 10 min bylo přidáno 24 mg (120 μπιοί) dicyklohexylkarbodiimidu a směs byla míchána přes noc při pokojové teplotě. Aktivní ester byl použit bez dalšího čištění v dalším kroku. Analogicky k syntéze podle příkladu 14-16 a 18-27 a (syntéza peptidu v pevné fázi) byl syntetizován VlP-analog HSDAVFWDNY TRLRKQMAVK KYLNSILN pomocí syntézy na pevné fázi. Barvivo 4[2-[4-(4-(2-karboxyethyl)fenyloxy)-7-[5-N-(dihydroxypropyl)aminokarbonyl-3,3-dimethyl-l-(4-sulfonatobutyl)indolin-2yliden]-3,5-(propan-1,3-diyl)-1,3,5-heptatrien-l-yl]-5-N(dihydroxypropyl)aminokarbonyl-3,3-dimethyl(3H)indolio]butansulfonát, sodná sůl bylo podle příkladu 14-16 a 18-27 b (spojování barviv) připojeno na peptid podle příkladu 14-16 a
18-27 c (odštěpeni chránících skupin vedlejšího řetězce a odštěpení konjugátu barviva s peptidem) a poté byl tento konjugát izolován a čištěn.
□ □
d) 4-[2-[4-(4-(2-Isothiokyanátoethyl)fenyloxy)-7-[5-N- □
(dihydroxypropyl)aminokarbonyl-3,3-dimethyl-l-(4sulfonátobutyl)indolin-2-yliden]-3,5-(propan-1,3-díyl)-1,3,5heptatrien-l-yl]-5-N-(dihydroxypropyl)aminokarbonyl-3,3dimethyl(3H)indolio]butansulfonát, sodná sůl
K suspenzi 28 mg (0,6 mmol) hydridu sodného (60% suspenze v oleji) ve 4 ml bezvodého N,N-dimethylformamidu bylo přidáno při 0°C 116 mg (0,6 mmol) 2-(4-hydroxyfenyl)ethylisothiokyanátu ve 2 ml N, N-dimethylf ormamidu. Po 30 min byl vzniklý roztok přidán ke 138 mg (0,14 mmol) 4-[2-[4-chlor-7-[5-N(dihydroxypropyl)aminokarbonyl-5-N-(dihydroxypropyl)aminokarbonyl-3,3-dimethyl-l-(4-sulfonátobutyl)indolin-2yliden]-3,5-(propan-1,3-diyl)-1,3,5-heptatrien-l-yl]-3, 3dimethyl(3H)indolio]butansulfonát, sodná sůl (příklad 44b). Reakční směs byla míchána za laboratorní teploty přes noc a poté rozložena přídavkem suchého ledu. Poté byla reakční směs odpařena do sucha a zbytek byl čištěn pomocí preparativní HPLC.
Výtěžek: 85 mg (54% teorie)
Analyse (vztaženo na látku zbavenou rozpouštědla): spočteno: C 58,65 H 6,09 N 6,22 S 8,54 0 18,47 Na 2,04 nalezeno: C 58,53 H 6,17 N 6,11 S 8,63 Na 1,83
·· 3030 * 30 0 3 3
• · 9 33 3 3 • · • 3
• · • · • 3 3 3 3 3 3 3
• · 0 · 3 3 3 ě 0 3
·« • 0 • 0 0 33 • 3 333
Analogicky k syntéze v příkladech 14-16 a 18-27 (syntéza peptidu v pevné fázi) byly syntetizovány VlP-analoga HSDAVFTDNY TRLRFQMAVK KYLNSILN pomocí syntézy v pevné fázi. Barvivo 4-[2-[4-(4-(2-isothiokyanátoethyl)fenyloxy)-7-[5-N(dihydroxypropyl)aminokarbonyl-3,3-dimethyl-l-(4sulfonátobutyl)indolin-2-yliden]-3,5-(propan-1,3-diyl)-1,3,5heptatrien-l-yl]-5-N-(dihydroxypropyl)aminokarbonyl-3,3dimethyl(3H)indolio]butansulfonát, sodná sůl bylo připojeno k N konci peptidu a podle příkladů 14-16 a 18-27 (odstranění chránících skupin vedlejšího řetězce a odštěpení konjugátu barviva s peptidem) byl tento konjugát izolován a čištěn.
Analogickým způsobem mohou . být vystavěna další symetrická hydrofilní barviva z následujících stavebních kamenů: hydrofilní indoleninové deriváty s hydroxyalkylsubstituenty: (připraveny podle příkladu 44a)
a) 5-N-(2,3-Dihydroxypropyl)-N-methylaminokarbonyl-1-(4sulfobutyl)-2,3,3-trimethyl(3H)indolenin
b) 5-N-(Hydroxyethyl)-aminokarbonyl-1-(4-sulfobutyl)-2,3,3trimethyl{3H)indolenin
c) 5-N-{2,3-Dihydroxypropyl)-N-(hydroxyethyl)aminokarbonyl-1(4-sulfobutyl)-2,3,3-trimethyl(3H)indolenin
d) 5-N,N-(bis-Hydroxyethyl)-aminokarbonyl-1-(4-sulfobutyl)-
2,3,3-trimethyl(3H)indolenin
e) 5-N-(2,3,4,5,6-Pentahydroxyhexyl)-aminokarbonyl-1-(4sulfobutyl)-2,3,3-trimethyl(3H)indolenin
f) 5-N-(1,3,4-Trihydroxybut-2-yl)-N-methylaminokarbonyl-1-(4sulfobutyl)-2,3,3-trimethyl(3H)indolenin
Přiklad 45
a) 5-N- (2,3,4,5,6-Pentahydroxyhexyl)aminokarbonyl-1-(4sulfobutyl)-2,3,3-trimethyl(3H)indolenin
0,6 g (1,8 mmol) 5-Karboxy-l-(4-sulfobutyl)-2,3,3trimethyl(3H)indolenin (Anal. Biochem. 217,197, 1994) a 2 ml pyridinu bylo předloženo ve 20 ml absolutního N,Ndimethylf ormamidu a bylo přidáno 0,95 g (3,6 mmol) disukcinimidylkarbonátu. Po dvou hodinách bylo přidáno 1,4 ml (10 mmol) triethylaminu a 322 mg (1,8 mmol) glukaminu. Směs byla míchána přes noc při laboratorní teplotě, odpařena do sucha a zbytek byl rozmíchán s diethyletherem. Pevná látka byla odsáta a byla čištěna chromatografií na reverzní fázi. Výtěžek: 0,67 g (74% teorie)
Analýza (vztaženo na látku zbavenou rozpouštědla): spočteno: C 52,58 H 6,82 N 5,57 S 6,38 O 28,65 nalezeno: C 52,47 H 6,91 N 5,39 S 6,44
b) 4-[2-[4-Chlor-7-[5-N-(2,3,4,5,6-pentahydroxyhexyl)- aminokarbonyl-3,3-dimethyl-l-(4-sulfonátobutyl)indolin-2yliden]-3,5-(propan-1,3-diyl)-1,3,5-heptatrien-l-yl]-3,3dimethyl-5-[N-(2,3,4,5,6-pentahydroxyhexyl)aminokarbonyl] (3H)indolio]butansulfonát, sodná sůl
Roztok 180 mg (0,5 mmol) N-[5-anilino-3-chlor-2,4-(propan-
1,3-diyl)-2,4-pentadien-l-yliden]anilinium-chloridu, 503 mg (1 mmol) 5-N-(2,3,4,5,6-pentahydroxyhexyl)aminokarbonyl-1-(4- sulfobutyl)-2,3,3-trimethyl(3H)indoleninu (příklad 45a) a 165 mg (2 mmol) bezvodého octanu sodného v 10 ml ethanolu bylo
zahříváno pod argonovou atmosférou dvě hodiny k varu. Poté byl oddestilován ethanol a zbytek byl čištěn chromatograficky. Výtěžek: 0,31 g (53% teorie)
Analýza (vztaženo na látku zbavenou rozpouštědla): spočteno:C 54,05 H 6,33 Cl 3,01 N 4,76 S 5,44 O 24,45 Na 1,95 nalezeno:C 53,89 H 6,20 Cl 2,87 N 4,83 S 5,29 Na 1,72
c) 4-[2-[4-(4-Isothiokyanátothiofenyloxy)-7-[5-N-(2,3,4,5,6pentahydroxyhexyl)aminokarbonyl-3,3-dimethyl-l-(4- sulfonátobutyl)indolin-2-yliden]-3,5-(propan-1,3-diyl)-1,3,5heptatrien-l-yl]-3,3-dimethyl-5-[N-(2,3,4,5,6-pentahydroxyhexyl)aminokarbonyl](3H)indolio]butansulfonát, sodná sůl mg (0,4 mmol) 4-Aminothiofenolu bylo rozpuštěno v 10 ml absolutního N,N-dimethylformamidu pod argonovou atmosférou a bylo při pokojové teplotě mecháno reagovat se 165 mg (0,14 mmol) 4-[2-[4-chlor-7-[5-N-(2,3,4,5,6-pentahydroxyhexyl)aminokarbonyl-3,3-dimethyl-l-(4-sulfonátobutyl)indolin-2yliden]-3,5(propan-1,3-diyl)-1,3,5-heptatrien-l-yl]-3,3dimethyl-5-[N-(2,3,4,5,6-pentahydroxyhexyl)aminocarbonyl](3H)indolio]butansulfonát, sodná sůl (příklad 45b). Po 10 minutách byla reakční směs rozložena přídavkem suchého ledu a bylo přidáno 210 mg (1 mmol) thiokarbonyldiimidazolu. Po 45 min bylo barvivo vysráženo přídavkem diethyletheru a pevná látka byla izolována na centrifuze. Látka byla čištěna chromatografií na reverzní fázi.
Výtěžek: 78 mg (43% teorie)
Analýza (vztaženo na látku zbavenou rozpouštědla): spočteno: C 55,07 H 6,01 N 5,35 S 9,80 O 22,01 Na 1,76 nalezeno: C 54,89 H 6,20 N 5;24 S 9,58 Na 1,54
Analogicky k syntéze podle příkladů 14-16 a 18-27 (syntéza peptidů na pevné fázi) byla v pevné fázi syntetizována VIP58
Analoga HSWAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILN. Barvivo 4-[2-[4-(4isothiokyanátothiohenyloxy)-7-[5-N-(2,3,4,5,6-pentahydroxyhexyl)aminokarbonyl-3,3-dimethyl-l-(4-sulfonátobutyl)indolin2-yliden]-3,5-(propan-1,3-diyl)-1,3,5-heptatrien-l-yl]-3,3dimethyl-5-[N-(2,3,4,5,β-pentahydroxyhexyl)aminokarbonyl](3H)indolio]butansulfonát, sodná sůl bylo připojeno na N-konec peptidu podle přikladu 14-16 a 18-27c (odstraněni chránících skupin vedlejšího řetězce a odštěpení konjugátu barviva s peptidem) a konjugát byl izolován a čištěn.
Analogicky mohou být připraveny další symetrické hydrofilní barviva z následujících stavebních kamenů:
Hydrofilní indoleninové deriváty s hydroxyalkylsubstituenty: (vystavěno podle příkladu 44a)
a) 5-N-(2,3-Dihydroxypropyl)-N-methylaminokarbonyl-1-(4sulfobutyl)-2,3,3-trimethyl(3H)indolenin
b) 5-N-(Hydroxyethyl)-aminokarbonyl-1-(4-sulfobutyl)-2,3,3trimethyl(3H)indolenin
c) 5-N-(2,3-Dihydroxypropyl)-N-(hydroxyethyl)aminocarbonyl-1-(4-sulfobutyl)-2,3,3-trimethyl(3H)indolenin
d) 5-N,N-(bis-Hydroxyethyl)-aminokarbonyl-1-(4-sulfobutyl)-
2,3,3-trimethyl(3H)indolenin
e) 5-N-(2,3,4,5,6-Pentahydroxyhexyl)-aminokarbonyl-1-(4sulfobutyl)-2,3,3-trimethyl(3H)indolenin
I • ·
f) 5-N-(1,3,4-Trihydroxybut-2-yl)-N-methylaminokarbonyl-1-(4sulfobutyl)-2,3,3-trimethyl(3H)indolenin
Přiklad 46
7-[5-N-(2,3-Dihydroxypropyl)aminokarbonyl-3,3-dimethyl-l(4sulfonátobutyl)indolin-2-yliden]-1,3,5-heptatrien-l-yl]-3,3dimethyl-5-karboxy(3H)indolio]butansulfonát, sodná sůl
Roztok 2,35 g (5,71 mmol) 5-N-(2,3-dihydroxypropyl)aminokarbonyl-1-(4-sulfobutyl)-2,3,3-trimethyl(3H)indolenin (Příklad 44a) a 1,57 g (5,5 mmol) glutakonaldehyd dianilidhydrochloridu ve 25 ml amhydridu kyseliny octové mícháno 30 min při 120 °C. Na závěr bylo přidáno 2,4 g (7,1 mmol) 5karboxy-1-(4-sulfobutyl)-2,3,3-trimethyl(3H)indolenin, 1,71 g octanu sodného, 22 ml anhydridu kyseliny octové a 8,6 ml kyseliny octové. Reakční směs byla míchána 1 hod při 120 °C, ochlazena na laboratorní teplotu a produkt byl vysrážen s diethyletherem. Surový produkt byl chromatografován na reverzní fázi.
Výtěžek: 1,9 g (40% teorie)
Analýza (vztaženo na látku zbavenou rozpouštědla): spočteno: C 54,47 H 6,03 N 5,03 S 7,67 O 21,05 Na 2,75 nalezeno: C 54,26 H 6,12 N 5,00 S 7,49 Na 2,48
Analogicky k syntéze v příkladech 14-16 a 18-27a (syntéze peptidu v pevné fázi) byla syntetizována VIP analoga HSDAVFTDNY TRLRKKMAVK KYLNSILN na pevné fázi. Barvivo 7-[5-N(2,3-Dihydroxypropyl)aminokarbonyl-3,3-dimethyl-l-(4sulfonátobutyl)indolin-2-yliden]-1,3,5-heptatrien-l-yl]-3,3dimethyl-5-karboxy(3H)indolio]butansulfonát, sodná sůl bylo podle přikladu 14-16 a 18-27b (spojování barviva) připojeno na N-terminus peptidu a konjugát byl podle příkladu 14-16 a 18• · · ·
27c (odstraněni chránících skupin postranního řetězce a odštěpení konjugátu barviva s peptidem) izolován a čištěn pomocí HPLC.
Analogickým způsobem mohou být připraveny další nesymetrická hydrofilní barviva z následujících stavebních kamenů:
Hydrofilní indoleninové deriváty s hydroxyalkylsubstituenty: (vystavěny podle příkladu 44a).
a) 5-N-(2,3-Dihydroxypropyl)-N-methylaminokarbonyl-1-(4sulfobutyl)-2,3,3-trimethyl(3H)indolenin
b) 5-N-(Hydroxyethyl)-aminokarbonyl-1-(4-sulfobutyl)-2,3,3trimethyl(3H)indolenin
c) 5-N-(2,3-Dihydroxypropyl)-N-(hydroxyethyl)aminokarbonyl-1(4-sulfobutyl)-2,3,3-trimethyl(3H)indolenin
d) 5-N,N-(bis-Hydroxyethyl)-aminokarbonyl-1-(4-sulfobutyl)-
2,3,3-trimethyl(3H)indolenin
e) 5-N-(2,3,4,5,β-Pentahydroxyhexyl)-aminokarbonyl-1-(4sulfobutyl)-2,3,3-trimethyl(3H)indolenin
f) 5-N-(1,3,4-Trihydroxybut-2-yl)-N-methylaminokarbonyl-1-(4sulfobutyl)-2,3,3-trimethyl(3H)indolenin
Indoleninové deriváty s karboxylovou skupinou:
a) 5-Karboxy-l-(4-sulfobutyl)-2,3,3-trimethyl (3H) indolenin
b) 5-Karboxymethyl-l-(4-sulfobutyl)-2,3,3-trimethyl- (3H)indolenin
c) 5-Karboxy-l-(3-sulfopropyl)-2,3,3-trimethyl(3H)indolenin
d) 5-Karboxymethyl-l-(3-sulfopropyl)-2,3,3-trimethyl- (3H)indolenin
e) 5-Karboxy-l-(2-sulfoethyl)-2,3,3-trimethyl(3H)indolenin
f) 5-Karboxymethyl-l-(2-sulfoethyl)-2,3,3-trimethyl(3H) indolenin
Dianilové deriváty k reakci s indoleninem za vzniku mono-, dinebo trikarbokyaninů:
a) Glutakonaldehyd dianilid-hydrochlorid □
b) Malonaldehyd-bis-fenylimin-hydrochlorid □
c) N,N-Difenylformamidin □
d) N-[5-Anilino-2,4-(propan-1,3-diyl)-2,4-pentadien-lyliden]anilinium-chlorid □
e) N-[5-Anilino-2,4-(ethan-1,2-diyl}-2,4-pentadien-lyliden]anilinium-chlorid • φ ··· · · · · ·· φφ φ φφφ· · · φ φ φ · · · · · · φφ Φ· φφφ ·♦ φ· φφφ
f) Ν-[5-Anilino-3-chlor-2,4-(propan-1,3-diyl)-2,4-pentadien-lyliden]anilinium-chlorid □
g) N-[5-Anilino-3-chlor-2,4-(ethan-1,2-diyl) -2,4- □
pentadien-l-yliden]anilinium-chlorid □
Příklad 47 □
7-[5-N-(1,3,4-Trihydroxybut-2-yl)-aminokarbonyl-3,3-dimethyl1-(4-sulfonátobutyl)indolin-2-yliden)- 3,5-(2-karboxypropan-
1,3-diyl)-1,3,5-heptatrien-l-yl]-3,3-dimethyl-5-N-(1,3,4trihydroxybut-2-yl)aminokarbonyl(3H)indolio)butansulfonát, sodná sůl, N-hydroxysukcinimidester
a) 4-[2-[4-Chlor-7-[5-N-(1,3,4-trihydroxybut-2-yl)aminokarbonyl-3, 3-dimethyl-l-(4-sulfonátobutyl)indolin-2-yliden]-
3,5-[2-(methoxykarbony1)propan-1,3-diyl]-1,3,5-heptatrien-lyl] -3,3-dimethyl-5-[N-(1,3,4-trihydroxybut-2-yl)aminokarbonyl] (3H)indolio)butansulfonát, sodná sůl
K roztoku 0,8 g (5 mmol) 4-(methoxykarbonyl)cyklohexanonu v 5 ml dichlormethanu bylo přidáno 5,5 ml (10 mmol) fosf oroxychloridu a 6 ml N, N-dimethylformamidu při 0 °C. Poté byla reakční směs zahřívána 1 hod k refluxu. Dichlormethan byl oddestílován a při maximálně 5 °C bylo přidáno 4 ml anilinu v 10 ml methanolu. Reakční směs byla vylita na led, bylo přidáno 5 ml koncentrované kyseliny chlorovodíkové a meziprodukt byl ponechán 5 hod při 0 °C krystalizován. 10 Krystaly byly odsáty a bez dalšího čištění byly použity • · · · · · v v« tt • · · 9 9·· 9 · ·
9· · 9 · 9 9 v další reakci. Krystaly byly rozpuštěny v bezvodém ethanolu a bylo přidáno 4,4 g (10 mmol) 5-N-(1,3,4-trihydroxybut-2-yl)-Nmethylaminokarbonyl-1-(4-sulfobutyl)-2,3,3-trimethyl(3H)indoleninu (příklad 45) a 0,8 g bezvodého octanu sodného. Směs byla zahřívána 1 hod pod refluxem, pevná látka byla zfiltrována a filtrát byl odpařen do sucha. Zbytek byl čištěn chromatograficky.
Výtěžek: 3,25 g (58% teorie) □
Analýza (vztaženo na látku zbavenou rozpouštědla): spočteno: C 54,90 H 6,14 Cl 3,18 N 5,02 S 5,75 O 22,94 Na 2,06 nalezeno: C 54,76 H 6,03 Cl 2,99 N 4,91 S 5,60 Na 1,83
b) 7-[5-N-(1,3,4-Trihydroxybut-2-yl)aminokarbonyl-3,3dimethyl-1-(4-sulfonátobutyl)indolin-2-yliden]- 3,5- (2karboxypropan-1,3-diyl)-1,3,5-heptatrien-l-yl]-3,3-dimethyl-5N-(1,3,4-trihydroxybut-2-yl) aminokarbonyl(3H)indolio]butansulfonát, sodná sůl
Směs 10 mg (0,4 mmol) hydridu sodného a 80 mg (1, 3 mmol) ethanthiolu v 10 ml bezvodého N,N-dimethylformamidu byla pod dusíkovou atmosférou míchána 30 min při laboratorní teplotě. Poté bylo přidáno 112 mg (0,1 mmol) 4-[2-[4-chlor-7-[5-N(2,3,4,5,6-pentahydroxyhexyl)aminokarbonyl-3,3-dimethyl-l-(4sulfonátobutyl)indolin-2-yliden)-3,5-[2-(methoxykarbonyl)propan-1,3-diyl]-1,3,5-heptatrien-l-yl]-3,3-dimethyl-5-[N(2,3,4,5,6-pentahydroxyhexyl)aminokarbonyl](3H)indolio]butansulfonát, sodná sůl (příklad 47a) ve 3 ml N,N-dimethylformamidu. Reakční směs byla zahřívána 2 hod na teplotu 100°C a poté ochlazena na laboratorní teplotu a byl přidán suchý led. Reakční směs byla odpařena do sucha a zbytek byl extrahován s horkým ethanolem. Extrakt byl odpařen a surový produkt byl chromatografován.
Výtěžek: 75 mg (67% teorie)
Analýza (vztaženo na látku zbavenou rozpouštědla): spočteno: C 56,27 H 6,33 N 5,25 S 6,01 O 23,99 Na 2,15 □ nalezeno: C 56,13 H 6,46 N 5,12 S 5,87 Na 1,88 □
c) 7-[ 5-N-(1,3,4-Trihydroxybut-2-yl)-aminokarbonyl-3,3diimethyl-1-(4-sulfonátobutyl)indolin-2-yliden)-3,5-(2karboxypropan-1,3-diyl)-1,3,5-heptatrien-l-yl]-3,3-dimethyl-5N-(1,3,4-trihydroxybut-2-yl)-aminokarbonyl(3H)indolio]butansulfonát-N-hydroxysukcinimidester, sodná sůl
Ke vzniku aktivovaného esteru bylo rozpuštěno 14 mg (0,12 mmol) N-hydroxysukcinimidu a 64 mg (0,06 mmol) karboxylové kyseliny ve 2 ml Ν,Ν-dimethylformamidu. Po 15 minutách bylo přidáno 25 mg (0,12 mmol) dicyklohexylkarbodiimidu a reakční směs byla míchána přes noc při laboratorní teplotě. Aktivovaný ester byl čištěn pomocí preparativní HPLC.
Výtěžek: 60 mg (86% teorie)
Analýza (vztaženo na látku zbavenou rozpouštědla): spočteno: C 55,71 H 6,06 N 6,02 S 5,51 O 24,73 Na 1,97 nalezeno: C 55,59 H 6,21 N 5,93 S 5,37 Na 1,75
Analogicky k syntéze v příkladech 14-16 a 18-27a (syntéza peptidů v pevné fázi) byla syntetizována VIP analoga HSDAVFTDNY TRLRKAMAVK KYLNSILN na pevné fázi. Barvivo 7-[5-N(1,3,4-trihydroxybut-2-yl)aminokarbonyl-3,3-dimethyl-l-(4sulfonátobutyl)indolin-2-yliden]-3,5-(2-karboxypropan-l,3diyl)-1,3,5-heptatrien-l-yl]-3,3-dimethyl-5-N-(1,3,4trihydroxybut-2-yl)aminokarbonyl(3H)indolio]butansulfonát, sodná sůl byla podle příkladu 14-16 a 18-27b (připojení barviva) připojena na N-konec peptidu a podle příkladu 14-16 a
18-27c (odštěpeni chránících skupin postranního řetězce a odštěpení konjugátu barviva s peptidem) byl tento konjugát izolován a čištěn.
Příklad 48 □
7-[5-N-(1,3,4-Trihydroxybut-2-yl)-aminokarbonyl-3,3-dimethyl1-(4-sulfonátobutyl)indolin-2-yliden]-3,5-(2-karboxypropan-
1,3-diyl)-1,3,5-heptatrien-l-yl]-3,3-dimethyl-5-N-(1,3,4trihydroxybut-2-yl)aminokarbonyl(3H)indolio]butansulfonát, sodná sůl
a) 5-N-(11-Aminoundecyl)aminokarbonyl-1-(4-sulfobutyl)-2,3,3trimethyl(3H)indolenin
340 mg (1 mmol) 5-Karboxy-l-(4-sulfobutyl)-2,3,3trimethyl(3H)indoleninu (Anal. Biochem. 217,197, 1994) bylo rozpuštěno v 5 ml absolutního N,N-dimethylformamidu a 1 ml pyridinu a bylo přidáno 0,5 g (2 mmol) disukcinimidylkarbonátu. Po třech hodinách bylo přidáno 0,805 g (4 mmol) 11aminoundekanové kyseliny. Směs byla míchána přes noc při laboratorní teplotě, byla odpařena do sucha a zbytek byl rozmíchán s diethyletherem. Tuhá látka byla odsáta a byla čištěna chromatografií na reverzní fázi.
Výtěžek: 0,37 g (71% teorie)
Analýza (vztaženo na látku zbavenou rozpouštědla):
spočteno: C 62,04 H 8,10 N 5,36 S 6,13 O 18,37 □
nalezeno: C 61,88 H 8,23 N 5,17 S 6,02 □
b) 7-[5-N-(1,3,4-Trihydroxybut-2-yl)-aminokarbonyl-3,3dimethyl-1-(4-sulfonátobutyl)indolin-2-yliden]-3,5-(2- • 9 9 9 · · · · 9 0 • 9 · · · ·9 · « 99 »99 karboxypropan-1,3-diyl)-1,3,5-heptatrien-l-yl]-3,3-dimethyl-5N-(1,3,4-trihydroxybut-2-yl)aminokarbonyl(3H)indolio]butansulfonát, sodná sůl
Roztok 0,35 g (0,67 mmol) 5-N-(11-aminoundecyl.)aminokarbonyl-l-(4-sulfobutyl)-2,3,3-trimethyl(3H)indolenin (přiklad 48a) a 0,18 g (0,645 mmol) glutakonaldehyddianilu byl míchán 20 minut se 3 ml anhydridu kyseliny octové při 110 °C. Poté bylo přidáno 344 mg (0,83 mmol) 5-N-(2,3-dihydroxypropyl)aminokarbonyl-l-(4-sulfobutyl)-2,3,3-trimethyl (3H)indoleninu (příklad 44a), 0,2 g octanu sodného, 3 ml anhydridu kyseliny octové a 1 ml kyseliny octové. Směs byla míchána 2 hod při 110 °C, byla ochlazena na laboratorní teplotu a produkt byl vysrážen s diethyletherem. Surový produkt byl čištěn chromatograficky na reverzní fázi.
Výtěžek: 0,41 g (60% teorie) □
Analýza (vztaženo na látku zbavenou rozpouštědla):
spočteno □ nalezeno : C 60, 10 H 7,02 N 5,50 S 6,29 0 18,84 Na 2,26
: C 59,.96 H 7,14 N 5,33 S 6, 15 Na 2,11
Π
Analogicky k syntéze podle příkladů 14-16 a 18-27a (syntéza peptidu v pevné fázi) byly syntetizovány VIP analoga HSDAVFTDNY TRLRKQMWVK KYLNSILN na pevné fázi. Barvivo 7-[5-N(1,3,4-trihydroxybut-2-yl)amj nokarbonyl-3,3-dimethyl-l-(4sulfonátobutyl)indolin-2-yliden]-3,5-(2-karboxypropan-l,3diyl)-1,3,5-heptatrien-l-yl]-3,3-dimethyl-5-N-(1,3,4trihydroxybut-2-yl)aminokarbonyl(3H)indolio]butansulfonát, sodná sůl bylo podle příkladů 14-16 a 18-27b (spojování barviva) připojeno na N-konec peptidu a podle příkladů 14-16 a 18-27c (odstranění chránících skupin vedlejšího řetězce a odštěpeni konjugátu barviva s peptidem) byl tento konjugát izolována čištěn.
Další barviva podle tohoto vynálezu mohou být připravena podle příkladu 44a a 44b, ve kterém byla použita namísto 11aminoundekanové kyseliny v příkladu 48a následující aminokyseliny a indoleninový derivát uvedený v příkladu 46 byl nahrazen hydroxyalkylsubstituenty a) až f) :
i. Glycin ii. Alanin iii . β-Alanin iv. 4-Aminobutanová kyselina
v. 6-Aminohexanová kyselina vi. H2N- (CH2CH20) 3CH2COOH (TH 53, 20, 6977) vii. H2N- (CH2CH20) 4CH2COOH (JOC 63, 5, 1728, 1998) viii. H2N-CH2CH2C00 (CH2CH20) 4-CO-CH2CH2COOH (Lett. Pept. Sci. 6, 135, 1999) ix. HC1*H2N-PEG-COOH (MW 3400 g/mol; Shearwater Polymers lne., USA)
Příklad 49
4-[2-[4-(4-(N-(4-Aza-6-brom-5-oxohexyl) aminokarbonylethyl)fenyloxy)-7-[5-N-(dihydroxypropyl)aminokarbonyl-3,3-dimethyl1-(4-sulfonátobutyl)indolin-2-yliden]-3,5-(propan-1,3-diyl)1,3,5-heptatrien-l-yl]-5-N-(dihydroxypropyl)aminokarbonyl-3,3dimethyl(3H)indolio]butansulfonát, sodná sůl
a) [3-[N-(terc-Butoxykarbonyl)amino]propyl]-Ν' -(bromacetyl)amid
2,5 g (14,4 mmol) [3-[N-(terc-Butoxykarbonyl)amino]propyl] aminu bylo rozpuštěno v 15 ml dioxanu a po přidání 4,4
ml triethylaminu bylo při 0 °C přidáno 3,2 g (16 mmol) bromacetylbromidu. Směs byla míchána přes noc při laboratorní teplotě a ke směsi bylo přidáno dalších 320 mg bromacetylbromidu. Po dvou hod při laboratorní tepotě byla sraženina odsáta, roztok byl odpařen do sucha a zbytek byl zpracován s ethylacetátem. Organická fáze byla promyta s vodou a sušena nad síranem sodným.
Výtěžek: 3,2 g (75 % teorie)
Analýza (vztaženo na látku zbavenou rozpouštědla):
spočteno : C 40,69 H 6,49 Br 27, 07 N 9,49 0 16,26
nalezeno : C 40,50 H 6,37 Br 26, 89 N 9, 58
b) [3-[N-(Bromacetyl)amino]propyl]amin, hydrochlorid
3,1 g (10,5 mmol) [3-[N-(terc-Butoxykarbonyl)amino]propyl]-Ν'-(bromacetyl)-amid (příklad 49a) bylo mícháno 5 hod s 50 mmol 1M kyseliny chlorovodíkové v ethylacetátu při laboratorní teplotě. Produkt byl odsát a pevná látka byla promyta ethylesterem kyseliny octové.
Výtěžek: 2,3 g (95% teorie)
Analýza (vztaženo na látku zbavenou rozpouštědla): spočteno: C 25,94 H 5,22 Cl 15,31 Br 34,51 N 12,10 O 6,91 nalezeno: C 25,76 H 5,41 Cl 15,55 Br 34,34 N 11,97
c) 4-[2-[4-(4-(N-(4-Aza-6-brom-5-oxo-hexyl) aminokarbonylethyl)-fenyloxy)-7-[5-N-(dihydroxypropyl)aminokarbonyl-3,3dimethyl-1-(4-sulfonátobutyl)indolin-2-yliden]-3,5-(propan-
1,3-diyl)-1,3,5-heptatrien-l-yl]5-N-(dihydroxypropyl)- . aminokarbonyl-3,3dimethyl(3H)indolio]butansulfonát, sodná sůl
121 mg (0,1 mmol) 4-[2-[4-(4-(2-Karboxyethyl)fenyloxy)-7[5—N-(dihydroxypropyl)aminokarbonyl-3,3-dimethyl-l-(4 sulfonátobutyl)indolin-2-yliden]-3,5-(propan-1,3-diyl)-1,3,5heptatrien-l-yl]-5-N-(dihydroxypropyl)aminokarbonyl-3,3dimethyl(3H)indolio]butansulfonát, sodná sůl, N-hydroxysukcinimidester (příklad 44c) bylo rozpuštěno v 0,5 ml N,Ndimethylformamidu, a bylo přidáno 0,06 ml triethylaminu a 70 mg (0,3 mmol) [3-[N-(bromacetyl)amino]propyl]aminu, hydrochloridu (příklad 49b).
Směs byla míchána 4 hod při 60°C, ochlazena na laboratorní teplotu a produkt byl vysrážen s diethyletherem. Tuhá látka byla odsáta a dobře promyta s diethyletherem.
Výtěžek: 0,11 mg (80% teorie)
Analýza (vztaženo na látku zbavenou rozpouštědla):
spočteno: C 56,17 H 6,18 Br 6,13 N 6,44 S 4,92 Na 1,76 O 18,40 nalezeno: C 55,96 H 6,26 Br 6,01 N 6,27 S 4,B1 Na 1,53
Analogicky k syntéze z příkladů 14-16 a 18-27a (syntéza peptidů na pevné fázi) byla připravena VIP analoga HSDAVFTDNY TRLRKQCAVK KYLNSLLN syntézou na pevné fázi.
Barvivo 4-[2-(4-(4-(N-(4-Aza-6-brom-5-oxohexyl)aminokarbonylethyl)fenyloxy)-7-[5-N(dihydroxypropyl)aminokarbonyl-
3,3-dimethyl-l-(4-sulfonátobutyl)indolin-2-yliden]-3,5(propan-1,3-diyl)-1,3,5-heptatrien-l-yl]-5-N(dihydroxypropyl)aminokarbonyl-3,3-dimethyl(3H)indolio]butansulfonát, sodná sůl bylo podle příkladu 17 připojeno na N-konec peptidu a podle příkladu 14-16 a 18-27c (odstranění chránících skupin vedlejšího řetězce a odštěpení konjugátu peptidu s barvivém) byl tento konjugát izolován a čištěn.
t
ΊΟ
Seznam sekvenci (1) OBECNÉ INFORMACE:
(i) PŘIHLAŠOVATEL:
(A) JMÉNO: INSTITUT FÚR DIAGNOSTIKFORSCHUNG GMBH AN DER FREIEN UNIVERSITAT BERLIN (B) ULICE: Spandauer Damm 130 (C) MĚSTO: Berlin (E) STÁT: Německo (F) POŠTOVNÍ SMĚROVACÍ ČÍSLO (ZIP) : D-14050 (G) TELEFON: (030)-30390412 (H) TELEFAX: (030)-30390499 (ii) NÁZEV VYNÁLEZU: Konjugáty barviv s peptidy s krátkým řetězcem a jejich použití jako optických diagnostik (iii) POČET SEKVENCÍ: 8 (iv) POČÍTAČOVĚ ZPRACOVATELNÁ FORMA:
(A) TYP MÉDIA: Floppy diSk (B) POČÍTAČ: IBM PC- KOMPATIBILNÍ (C) OPERAČNÍ SYSTÉM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Refease #1.0, Verze #1.25 (EPO) (v) DATA SOUČASNÉ PŘIHLÁŠKY:
ČÍSLO PŘIHLÍŠKY:
(vi) DATA PŘEDCHOZÍ PŘIHLÁŠKY:
(A) ČÍSLO PŘIHLÁŠKY:
(B) DEN PODÁNÍ:
(2) INFORMACE PRO SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO 1:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 28 aminokyselin (B) TYP: peptid (C) POČET VLÁKEN: jednoduchý (D) TOPOLOGIE:
(ií) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTHETICKÝ: NE (vi) ORIGINÁLNÍ ZDROJ: syntetický (xi) POPIS SEKVENCE IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO 1:
His-Trp-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-LysGlnMet-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn (3) INFORMACE PRO SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO 2:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 28 aminokyselin (B) TYP: peptid (C) POČET VLÁKEN: jednoduchý (D) TOPOLOGIE:
(ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTHETICKÝ: NE (vi) ORIGINÁLNÍ ZDROJ: syntetický (xi) POPIS SEKVENCE IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO 2:
His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Phe-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-LysGlnMet-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn (4) INFORMACE PRO SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO 3:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 28 aminokyselin (B) TYP: peptid (C) POČET VLÁKEN: jednoduchý (D) TOPOLOGIE:
(ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTHETICKÝ: NE (vi) ORIGINÁLNÍ ZDROJ: syntetický (xi) POPIS SEKVENCE IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO 3:
His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Lys-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-LysGlnMet-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn (5) INFORMACE PRO SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO 4:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 28 aminokyselin (B) TYP: peptid (C) POČET VLÁKEN: jednoduchý (D) TOPOLOGIE:
(ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTHETICKÝ: NE (vi) ORIGINÁLNÍ ZDROJ: syntetický (xi) POPIS SEKVENCE IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO 4:
His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Gln-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-LysGlnMet-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-heu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn (6) INFORMACE PRO SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO 5:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 28 aminokyselin (B) TYP: peptid ·♦ ····
(C) POČET VLÁKEN: jednoduchý (D) TOPOLOGIE:
(ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTHETICKÝ: NE (vi) ORIGINÁLNÍ ZDROJ: syntetický (xi) POPIS SEKVENCE IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO 5:
His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Arg-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-LysGlnMet-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn (7) INFORMACE PRO SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO 6:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 28 aminokyselin (B) TYP: peptid (C) POČET VLÁKEN: jednoduchý (D) TOPOLOGIE:
(ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTHETICKÝ: NE (vi) ORIGINÁLNÍ ZDROJ: syntetický (xi) POPIS SEKVENCE IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO 6:
His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Trp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-LysGln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn (8) INFORMACE PRO SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO 7:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 28 aminokyselin (B) TYP: peptid (C) POČET VLÁKEN: jednoduchý (D) TOPOLOGIE:
(ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTHETICKÝ: NE (vi) ORIGINÁLNÍ ZDROJ: syntetický (xi) POPIS SEKVENCE IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO 7:
His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Arg-Arg-Leu-Arg-LysGlnMet-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn (9) INFORMACE PRO SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO 8:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 28 aminokyselin (B) TYP: peptid (C) POČET VLÁKEN: jednoduchý (D) TOPOLOGIE:
(ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTHETICKÝ: NE (vi) ORIGINÁLNÍ ZDROJ: syntetický (xi) POPIS SEKVENCE IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO 8:
His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-LysGlnMet-Arg-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn

Claims (6)

* · • 00 0 • ·· 00 • 0 • «0 * 0 • 0 t • · 0 0 0 0 0 0 • · • · • · 0 0 0 0 * 00 • 0 0*0 ·« 00 0 His-Trp-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg20 LysGln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn (Identifikační číslo sekvence: 1) His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Phe-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-ArgLysGln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn 25 (Identifikační číslo sekvence: 2) His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Lys-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-ArgLysGln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn (Identifikační číslo sekvence: 3) His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Gln-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-ArgLysGln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn (Identifikační číslo sekvence: 4) His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Arg-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-ArgLysGln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn (Identifikační číslo sekvence: 5) His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Trp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-ArgLysGln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn (Identifikační číslo sekvence: 6) His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Arg-Arg-Leu-ArglO LysGln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn (Identifikační číslo sekvence: 7) His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-ArgLysGln-Met-Arg-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn 15 (Identifikační číslo sekvence: 8). Obrázek 1 CM Ο V- CM τ~ τ- χ— Ν> C0 Ο) cď Μ ·* Μ v CM «*> τ~ CM Οθ II II II ccc Obrázek 3 00 · 0 00 0 0 0 00 • · · · 0· • · · 00 ··· Φ0«Φ • 0 00· Β je fragment obecného vzorce VII až XII Vlil IX nebo XII je fluor, chlor, brom, zbytek -COOE1, -CONE^2, -NHCOE1, OSO3E1, -SO3E1, -SO2NHE1, -E1, kde E1 a E2 jsou nezávisle na sobě vodík, Ci až C4 sulfoalkylový jod nebo nitroskupina -NHCONHE1, -NE^2, -0E1, řetězec, nasycený nebo nenasycený, rovný nebo rozvětvený Cx až C50 alkylový řetězec, kde řetězec nebo část tohoto řetězce může mít formu jedné nebo více aromatických nebo nasycených cyklických C5 až C6 jednotek nebo bicyklických C10 jednotek, a kde Ci až C50 alkylový řetězec může být přerušen s 0 až 15 kyslíkovými atomy a/nebo s 0 až 3 karbonylovými skupinami a/nebo může být substituován s 0 až 5 hydroxyskupinami, R4 je vodíkový atom, fluor, chlor, brom, jod nebo rozvětvený nebo přímý Cl až C10 alkylový řetězec, b je číslo 2 nebo 3, X a Y jsou nezávisle na sobě 0, S, Se, -CH=CH- nebo C(CH3)2, L je skupina odpovídající obecným vzorcům kde n je číslo 1 až 10. 00 ·β • ····
1. Konjugát peptidu s polymethinovým barvivém obecného vzorce
I
A1 - (X)m - A2 (I) kde
X je α, β, nebo γ-aminokyselina s D- nebo L- konfigurací a m je číslo od 5 do 30, přičemž vzniklá sekvence aminokyselin (X)m má rovný řetězec nebo může být cyklizována prostřednictvím disulfidických můstků mezi dvěma molekulami cysteinu nebo homocysteinu nebo amidickými vazbami mezi N- a C-koncem a přičemž aminokyselinová sekvence odpovídá vasoaktivnímu intestinálnímu peptidu (VIP), somatostatinu nebo neurotensinu, nebo jejich fragmentům, částem sekvence, derivátům nebo analogům VIP, somatostatinu nebo neurotensinu.
A1 označuje vodíkový atom, acetylový zbytek nebo alkylový zbytek mající až 10 uhlíkových atomů, který může být případně substituován 1 až 3 karboxyskupinami a/nebo 1 až 6 hydroxyskupinami, nebo póly(oxyethylenový) zbytek mající 2 až 30 —CH2CH2O— jednotek nebo molekulu barviva, vybraného ze skupiny polymethinových barviv, jejichž alespoň jedno absorpční maximum leží v oblasti od 380 do 1200 nm,
A2 je hydroxyksupina, aminoskupina nebo molekula barviva vybraného ze skupiny polymethinových barviv, jejichž alespoň jedno absorpční maximum leží v oblasti od 380 do 1200 nm,
• · • ·· « · • ·· ♦ * • · • · 0 · • • · · • · • · • · • · • · 9 • · • <4 • · ··· 4« • · ··
s tou podmínkou, že alespoň jeden zbytek A1 nebo A2 představuje molekulu barviva vybraného ze skupiny polymethinových barviv, jejichž alespoň jedno absorpční maximum leží v oblasti od 380 do 1200 nm, přičemž v případě, že A1 a/nebo A2 představuje molekulu barviva vybraného ze skupiny polymethinových barviv, jejichž alespoň jedno absorpční maximum leží v oblasti od 380 do 1200 nm, jsou A1 připojené na N-koncové aminokyselině a A2 na aminoskupině lysinu nebo hydroxyskupině aminokyseliny šeřinu\ libovolné ' 8 pozici uvnitř aminokyselinové sekvence (X)m, a jejich fyziologicky přijatelné soli.
2,3,4-trihydroxybutyl, 1,3,4-trihydroxy-2-butyl, 2,3,4,5,6pentahydroxyhexyl.
33. Analoga VIP, vyznačující se tím, že jde o následující sekvence:
2. Sloučenina podle nároku 1, vyznačující se tím, že molekula barviva A1 a/nebo A2 je kyaninové, squariliové, krokoniové, merocyaninové nebo oxonolové barvivo.
3-sulfopropylnebo 2-sulfoethylový zbytek,
R3 označuje skupinu -COOH nebo jednu z následujících skupin:
-CONH- (CH2) n-COOH kde n = 2 nebo 3,
-CONH-(CH2) n-NCS kde n = 2 nebo 3,
-CONH-(CH2)n-NHCO-CH2-Xx kde n = 2 nebo 3 a X1 = Cl, Br, I
NCS
R4 a R5 jsou nezávisle na sobě vodíkový atom, methylový zbytek nebo hydroxylovaný alkylový zbytek jako třeba 2-hydroxyethyl, 3-hydroxypropyl, 2,3-dihydroxypropyl, 1, 3-dihydroxy-2-propyl,
3, nebo představuje následující skupinu:
a R4 a R5 jsou nezávisle na sobě vodíkový atom, methylový zbytek nebo hydroxylovaný alkylový zbytek.
9. Sloučenina podle nároků 7 nebo 8, vyznačuj ící se t i m, že hydroxylovaný alkylový zbytek je 2hydroxyethyl, 3-hydroxypropyl, 2,3-dihydroxypropyl, 1,3dihydroxy-2-propyl, 2,3,4-trihydroxybutyl, 1,3,4-trihydroxy-2buty1, 2,3,4,5,6-pentahydroxyhexy1.
• · · · • · φ ·
10. Sloučenina podle nároku 1, vyznačující se tím, že (X)m odpovídá aminokyselinové sekvenci přírodního vasoaktivního intestinálního peptidu
HSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILN nebo označuje fragment, částečnou sekvenci, derivát nebo analog vasoaktivního intestinálního peptidu, složený z 5 až 30 aminokyselin.
11. Sloučenina podle nároku 1, vyznačující se tím, že (X)m odpovídá aminokyselinové sekvenci somatostatinu
AG(j?KNFFWKTFTSC nebo označuje fragment, částečnou sekvenci, derivát nebo analog somatostatinu, složený z 5 až 20 aminokyselin.
12. Sloučenina podle nároku 1, vyznačující se tím, že (X)m odpovídá aminokyselinové sekvenci neurotensinu pyroglutaminová kyselina-LYENKPRRPYIL nebo označuje fragment, částečnou sekvenci, derivát nebo analog neurotensinu, složený z 5 až 20 aminokyselin.
13. Sloučenina podle nároku 10, vyznačující se tím, že kde jako fragment, částečná sekvence, derivát nebo analog vasoaktivního intestinálního peptidu jsou vybrány následující aminokyselinové sekvence:
RLRKQMAVKKYLNSILN RLRKQMAVKKYLNSIL
LRKQMAVKKYLNSILN LRKQMAVKKYLNSIL
RLRKQMAVKKYLNSI
LRKQMAVKKYLNSI • ·
RKQMAVKKYLNSILN KQMAVKKYLNSILN QMAVKKYLNSILN MAVKKYLNSILN AVKKYLNSILN
RLRKQMAVKKYLNS LRKQMAVKKYLNS
RKQMAVKKYLNS KQMAVKKYLNS
QMAVKKYLNS MAVKKYLNS
AVKKYLNS
RKQMAVKKYLNSIL
KQMAVKKYLNSIL
QMAVKKYLNSIL MAVKKYLNSIL AVKKYLNSIL
RLRKQMAVKKYLN
LRKQMAVKKYLN RKQMAVKKYLN KQMAVKKYLN QMAVKKYLN MAVKKYLN
AVKKYLN
RKQMAVKKYLNSI
KQMAVKKYLNSI
QMAVKKYLNSI
MAVKKYLNSI
AVKKYLNSI
RLRKQMAVKKYL
LRKQMAVKKYL
RKQMAVKKYL
KQMAVKKYL
QMAVKKYL
MAVKKYL
AVKKYL
14. Sloučenina podle nároku 10, vyznačuj íci tím, že jako analoga VIP jsou vybrány následující aminokyselinové sekvence:
FSDAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILN ISDAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILN LSDAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILN HFDAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILN HHDAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILN HIDAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILN HLDAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILN HMDAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILN HQDAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILN HTDAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILN HVDAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILN HWDAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILN HYDAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILN HSAAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILN
• · ··· ·
HSEAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILN HSFAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILN HSHAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILN HSIAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILN HSLAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILN HSMAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILN HSWAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILN HSDFVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILN HSDGVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILN HSDMVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILN HSDQVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILN HSDSVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILN HSDWVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILN HSDYVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILN HSDAFFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILN HSDAIFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILN HSDALFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILN HSDAMFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILN HSDATFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILN HSDAWFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILN HSDAYFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILN HSDAVKTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILN HSDAVFVDNY TRLRKQMAVK KYLNSILN
* ♦ 9
HSDAVFWDNY TRLRKQMAVK KYLNSILN HSDAVFTDNW TRLRKQMAVK KYLNSILN HSDAVFTDNY TRRRKQMAVK KYLNSILN HSDAVFTDNY TRWRKQMAVK KYLNSILN HSDAVFTDNY TRLRFQMAVK KYLNSILN HSDAVFTDNY TRLRLQMAVK KYLNSILN HSDAVFTDNY TRLRMQMAVK KYLNSILN HSDAVFTDNY TRLRRQMAVK KYLNSILN HSDAVFTDNY TRLRKAMAVK KYLNSILN HSDAVFTDNY TRLRKFMAVK KYLNSILN HSDAVFTDNY TRLRKIMAVK- -KYLNSILN HSDAVFTDNY TRLRKKMAVK KYLNSILN HSDAVFTDNY TRLRKLMAVK KYLNSILN HSDAVFTDNY TRLRKMMAVK KYLNSILN HSDAVFTDNY TRLRKRMAVK KYLNSILN HSDAVFTDNY TRLRKVMAVK KYLNSILN HSDAVFTDNY TRLRKWMAVK KYLNSILN HSDAVFTDNY TRLRKYMAVK KYLNSILN HSDAVFTDNY TRLRKQFAVK KYLNSILN HSDAVFTDNY TRLRKQIAVK KYLNSILN HSDAVFTDNY TRLRKQKAVK KYLNSILN HSDAVFTDNY TRLRKQLAVK KYLNSILN HSDAVFTDNY TRLRKQQAVK KYLNSILN HSDAVFTDNY TRLRKQRAVK KYLNSILN HSDAVFTDNY TRLRKQWAVK KYLNSILN HSDAVFTDNY TRLRKQMFVK KYLNSILN HSDAVFTDNY TRLRKQMIVK KYLNSILN HSDAVFTDNY TRLRKQMKVK KYLNSILN HSDAVFTDNY TRLRKQMLVK KYLNSILN HSDAVFTDNY TRLRKQMMVK KYLNSILN HSDAVFTDNY TRLRKQMQVK KYLNSILN HSDAVFTDNY TRLRKQMRVK KYLNSILN
• · MM
HSDAVFTDNY
HSDAVFTDNY
HSDAVFTDNY
HSDAVFTDNY
HSDAVFTDNY
HSDAVFTDNY
HSDAVFTDNY
HSDAVFTDNY
HSDAVFTDNY
HSDAVFTDNY
HSDAVFTDNY
HSDAVFTDNY
HSDAVFTDNY
HSDAVFTDNY
HSDAVFTDNY
HSDAVFTDNY
HSDAVFTDNY
HSDAVFTDNY
HSDAVFTDNY
HSDAVFTDNY
HSDAVFTDNY
HSDAVFTDNY
HSDAVFTDNY
HSDAVFTDNY
HSDAVFTDNY
HSDAVFTDNY
HSDAVFTDNY
HSDAVFTDNY
HSDAVFTDNY
HSDAVFTDNY
TRLRKQMVVK
TRLRKQMWVK
TRLRKQMYVK
TRLRKQMAAK
TRLRKQMAIK
TRLRKQMALK
TRLRKQMAVR
TRLRKQMAVK
TRLRKQMAVK
TRLRKQMAVK
TRLRKQMAVK
TRLRKQMAVK
TRLRKQMAVK
TRLRKQMAVK
TRLRKQMAVK
TRLRKQMAVK
TRLRKQMAVK
TRLRKQMAVK
TRLRKQMAVK
TRLRKQMAVK
TRLRKQMAVK
TRLRKQMAVK
TRLRKQMAVK
TRLRKQMAVK
TRLRKQMAVK
TRLRKQMAVK
TRLRKQMAVK
TRLRKQMAVK
TRLRKQMAVK
TRLRKQMAVK
KYLNSILN
KYLNSILN
KYLNSILN
KYLNSILN
KYLNSILN
KYLNSILN
KYLNSILN
RYLNSILN
WYLNSILN
KFLNSILN
KWLNSILN
KYLASILN
KYLFSILN
KYLISILN
KYLMSILN
KYLSSILN
KYLVSILN
KYLWSILN
KYLNNILN
KYLNRILN
KYLNWILN
KYLNYILN
KYLNSLLN
KYLNSSLN
KYLNSWLN
KYLNSYLN
KYLNSIFN
KYLNSIIN
KYLNSIWN
KYLNSILW
9 ·
99 9999
15. Sloučenina podle nároku 10, vyznačující se tím, že jako analog VIP je vybrána sloučenina následujícího vzorce:
HSDAVFTX1X2Y X3RLRKQMAVK KYLNSILN, kde X1, X2 a X3 mohou představovat libovolnou aminokyselinu.
16. Sloučenina podle nároku 1 až 15, vyznačuj ící se t i m, že 2 až m aminokyselin jsou nezávisle na sobě vyměněny za odpovídající D-aminokyselinu nebo jinou L- nebo Daminokyselinu, přičemž m má výše uvedený význam.
17. Sloučenina podle nároku 1 až 16, vyznačuj ící se t i m, že alespoň jedna aminokyselina (X)m může být nezávisle na dalších vyměněna za jinou nepřírodní aminokyselinu nebo aminokyselinový derivát.
18. Sloučenina podlá nároku 17, vyznačující se tím, že jako nepřírodní aminokyselina nebo aminokyselinový derivát je vybrána jedna z následujících sloučenin:
naftalanin, cyklohexylalanin, norleucin, norvalin, aaminoadipová kyselina, α-aminomáselná kyselina, β-alanin, βcyklohexylalanin, ornithin, sarkosin nebo δ-hydroxylysin
19. Sloučenina podle nároku 1 až 18, vyznačuj ící se t i m, že jako analog VIP může být vybrána sloučenina následující struktury:
X1SDAVX2TDNX3 TRLRKQMAVK KX4LNSILN, kde X1, X2, X3 a X4 jsou nepřírodní aminokyseliny nebo aminokyselinové deriváty.
20. Sloučenina podle nároku 19, vyznačující se t i m, že nepřírodní aminokyseliny nebo aminokyselinové deriváty «* ··♦ · jsou vybrány z následující skupiny:
naftalanin, cyklohexylalanin, norleucin, norvalin, oc-aminoadipová kyselina, a-aminomáselná kyselina, β-alanin, β-cyklohexylalanin, ornithin, sarkosin nebo δ-hydroxylysin.
21. Sloučenina podle nároků 1 až 20, v y z n a č u j i c i s e tím, že všechny aminokyseliny (X) m jsou vyměněny za odpovídající D- aminokyseliny. 22. Sloučenina podle nároků 1 až 21, v y z n a č u j i c i
se t i m, že jako fragmenty, části sekvence, deriváty nebo analoga vasoaktivního intestinálního peptidu jsou vybrány retrosyntetické aminokyselinové sekvence
23. Sloučenina podle nároků 1 až 22, vyznačuj ící se t i m, že jako fragmenty, části sekvence, deriváty nebo analoga vasoaktivního intestinálního peptidu jsou vybrány retrosyntetické aminokyselinové sekvence, u nichž je 2 až m aminokyselin zaměněno za odpovídající D-aminokyseliny, kde m má výše uvedený význam.
24. Sloučenina podle nároku 10, vyznačující se tím, že jako fragmenty, částečné sekvence, deriváty nebo analoga vasoaktivního intestinálního peptidu jsou vybrány následující aminokyselinové sekvence:
rlrkqmavkkylnsiln lrkqmavkkylnsiln rkqmavkkylnsiln kqmavkkylnsiln qmavkkylnsiln mavkkylnsiln rlrkqmavkkylnsil lrkqmavkkylnsil rkqmavkkylnsil kqmavkkylnsil qmavkkylnsil mavkkylnsil rlrkqmavkkylnsi Irkqmavkkylnsi rkqmavkkylnsi kqmavkkylnsi qmavkkylnsi mavkkylnsi •0 ···· avkkylnsiln avkkylnsil avkkylnsi
RLRKQMAvKKyLNSILN RL RKQMAvKKyLN SIL RLRKQMAvKKyLNSI LRKQMAvKKyLNSILN LRKQMAvKKyLNSIL LRKQMAvKKyLNSI RKQMAvKKyLNSILN RKQMAvKKyLNSIL RKQMAvKKyLNSI KQMAvKKyLNSILN KQMAvKKyLNSIL KQMAvKKyLNSI QMAvKKyLNSILN QMAvKKyLNSIL QMAvKKyLNSI MAvKKyLNSILN MAvKKyLNSIL MAvKKyLNSI AvKKyLNSILN AvKKyLNSIL AvKKyLNSI 25. Sloučeniny podle nároku 11, v y z načující se tím, že jako fragmenty, částečné sekvence, deriváty nebo
analoga somatostatinu jsou vybrány následující aminokyselinové sekvence:
AG^KNFFwKTFTS^
AGyKNFFwKTFTSy yKNFFwKTFTSy fFYwKVFT
AG^KNFFwKTFTStp
AGcpKNFFwKTFTSy <pKNFFwKTFTS(p f^FwKV^T fCYwKVCT Il fCFwKTCT II fCYwKTCT II
D-Nal
-yYwKVC f CywK-Abu-C-Nal fcFwKVCT
II fcYwKVCT
II fcFwKTCT
II fcYwKTCT
II
D-Nal-cYwKVC f cywK-Abu-C -Nal
26. Sloučenina podle nároku 12, vyznačující se tím, že jako fragmenty, částečné sekvence, deriváty nebo analoga neurotensinu jsou vybrány následující aminokyselinové sekvence:
pGlu-LYQNKPRRPFIL pGlu-LYENKPRRPYI ·* »··· pGlu-LYENKPRRPylL pGlu-LYQNKPRRPYIL pGlu-LYQNKPRRPylL pGlu-LYENKPRRPFIL pGlu-LYENKPRRPfIL pGlu-LYQNKPRRPfIL pGlu-LYENKPRRPWIL pGlu-LYENKPRRPwIL pGlu-LYQNKPRRPWIL pGlu-LYQNKPRRPwIL pGlu-LYENKPRRPY pGlu-LYENKPRRP pGlu-LYENKPRR pGlu-LYENKPR pGlu-LYENKP
NKPRRPYIL NKPRRPylL NKPRRPfIL NKPRRPwIL KPRRPYIL KPRRPylL KPRRPfIL KPRRPwIL PRRPYIL PRRPylL PRRPfIL PRRPwIL RRPYIL RRPylL RRPfIL RRPwIL
27.
Použiti sloučenin podle nároků až 26 pro in vivo diagnostikování nádorů, dalších nemocných tkání nebo adenomů pomocí optických směrových metod, ( nebo pro in vivo a fluorescenční diagnostiku nádorů, nádorových buněk a/nebo zánětlivých tkání pomocí endoskopických metod v gastrointestinálním traktu, jícnu, bronchiálním traktu, měchýři nebo krčku nebo pro in vivo fluorescenční diagnostiku a/nebo absorpční diagnostiku nádoru prsů pomocí optické mamografie (transiluminace nebo optická tomografie prsu).
28. Použití sloučenin pro in vivo fluorescenční diagnostiku, vyznačující se tím, že se pacientům zavede sloučenina podle nároku 1 intravenozní aplikací nebo místně zavedením do gastrointestinálního traktu, jícnu, měchýře nebo pomocí inhalace bronchy, přičemž v případě zavedení je nevázaná, přebývající část sloučeniny vyloučena vymytím, a že se provede endoskopické vyšetření lokálním ozářením vlnovou délkou vybranou z vlnového rozsahu 380 až 1200 nm a pomocí místně závislé detekce specifického, barvivém emitovaného fluorescenčního záření.
ď
29. Optické diagnostikům pro in vivo diagnostiku nemocných tkání, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jednu sloučeninu podle nároku 1 společně s obvyklými pomocnými látkami a/nebo nosiči popř. ředidly.
30. Kyaninové barvivo obecného vzorce XVIII kde p je 1, 2 nebo 3, n je číslo 1, 2, 3, 4 nebo 10,
R1 a R2 jsou nezávisle na sobě 4-sulfobutyl-, 3-sulfopropyl-, 2-sulfoethyl-, 3-methyl-3-sulfopropyl-, methylový, ethylový nebo propylový zbytek a
R3 je vodík nebo zbytek -COOE1, -CONE^2, -NHCOE1, -NHCONHE1, -NE1E2, -OE1, -OSO3E1, -SO3Ex, -SO2NHE1, kde E1 a E2 jsou nezávisle na sobě vodíkový atom nebo methyl, ethyl nebo C3 až C6 alkylový zbytek, který může být přerušen s 0 až 2 kyslíkovými atomy a/nebo 0 až 1 karbonylovou skupinou a/nebo může být substituován s 0 až 5 hydroxylovými skupinami.
31. Kyaninové barvivo obecného vzorce XIX nebo XX (XIX) ·· ··<· • · kde n je 2 nebo 3,
R1 a R2 jsou nezávisle na sobě 4-sulfobutyl-, 3-sulfopropylnebo 2-sulfoethylový zbytek,
R3 označuje skupinu -COOH nebo jednu z následujících skupin:
-CONH-(CH2)n-COOH kde n = 2 nebo 3,
-CONH- (CH2) n-NCS kde n = 2 nebo 3,
-CONH- (CH2) n-NHCO-CH2-X1 kde n = 2 nebo 3 a X1 = Cl, Br, I
R4 a R5 jsou nezávisle na sobě vodíkový atom, methylový zbytek nebo hydroxylovaný alkylový zbytek jako třeba 2-hydroxyethyl, 3-hydroxypropyl, 2,3-dihydroxypropyl, 1,3-dihydroxy-2-propyl, 2,3,4-trihydroxybutyl, 1,3,4-trihydroxy-2-butyl, 2,3,4,5,6pentahydroxyhexyl,
R6 je jedna z následujících skupin:
-(CH2)m-COOH kde m = 0 až 2,
-(CH2)m-NCS kde m = 0 až 2, a X je kyslíkový atom nebo atom síry.
·· ··· ·
32. Kyaninové barvivo obecného vzorce XXI kde
R2 jsou nezávisle na sobě 4-sulfobutyl-,
3. Sloučenina podle nároků 1 nebo 2, vyznačuj ící se t í m, že molekula barviva A1 a/nebo A2 je kyaninové popř. squariliové barvivo obecného vzorce II (Π) kde
D označuje fragment odpovídající obecnému vzorci III až VI, kde je spojení s B provedeno v pozici označené hvězdičkou, ·· φ··· • · · • · · • · · · • 0 0 0
4/7
Z7/ J5O
Obrázek 4
Foto fyzikální vlastnosti konjugátů barviva s peptidy 14-38
Rozpouštědlo: PBS (fosfátem pufrovaná solanka, pH 7,4)
Sloučenina # Absorpční max. ^abs, max O“11) Fluorescenční max. ^em, max í™1) Extinkční koef. E(čmol1 cm’1) 14 556 582 98 000 15 649 675 105 000 16 746 781 125 000 17 749 783 115 000 18 556 580 108 000 19 649 677 110 000 20 746 781 135 000 21 552 580 n. b. 22 648 676 111 000 23 746 781 n. b. 24 746 783 n. b. 25 747 784 121 000 26 748 784 156 000 27 748 784 159 000 28 552 579 102 000 29 648 676 111 000 30 746 781 128 000 31 746 781 n. b. 32 748 782 169 000 33 552 579 101 000 34 648 677 121 000 35 746 780 130 000 36 747 781 109 000 37 554 578 99 000 38 648 676 121 000
·· ···· · ·* ·»
9 9 · ·*··»·· • · ♦ ·····
4-sulfobutylovy nezávisle zbytek,
J sou sulfopropylový R3 je zbytek -CONH-peptid,
-CONH-(CH2) m-CONH-peptid,
-CONH-(CH2) n-NH-CS-NH-peptid nebo -CONH-(CH2) n-NHCO-CH2-peptid kde m=lažl0an=2 nebo
4. Sloučenina podle nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že molekula barviva Al a/nebo A2 je indokarbokyaninové, indodikarbokyaninové nebo indotrikarbokyaninové barvivo.
5/7
9 9 9 9 9 99 9 99
99 99 999 99 99999
Obrázek 5 (’Ή ’M) aauaasajonn/asdjosq® oo
700 • * ·· ♦ · · · · ·· • · « ···<«·· ··· ····· • · · · · · « «·· ·· ·· ··· ·· ·· ···
5. Sloučenina podle nároku 4, vyznačující se tím, že molekula barviva A1 a/nebo A2 je indokarbokyaninové, indodikarbokyaninové nebo indotrikarbokyaninové barvivo obecného vzorce XIII nebo XIV kde
XIII • · · · • · · · · ch=ch)-c
Ρ
XIV p je 1, 2 nebo 3, n je číslo 1, 2, 3, 4 nebo 10,
R1 a R2 jsou nezávisle na sobě 4-sulfobutyl-, 3-sulfopropyl-, 2-sulfoethyl-, 3-methyl-3-sulfopropyl-, methyl- nebo propylový zbytek a
R3 je vodík, chlor, brom, jod nebo nitroskupina nebo zbytek -COOE1, -ΟΟΝΕΧΕ2, -NHCOE1, -NHCONHE1, -NE^2, -OE1, -OSO3E1, SO3E1, -SO2NHE1, kde E1 a E2 jsou nezávisle na sobě vodíkový atom nebo methyl, ethyl nebo C3 až C6 alkylový zbytek, který může být přerušen s 0 až 2 kyslíkovými atomy a/nebo 0 až 1 karbonylovou skupinou á/nebo může být substituován s 0 až 5 hydroxylovými skupinami nebo může být póly (oxyethylen) glykolový zbytek se 2 až 30 jednotkami -CH2CH2O-.
6. Sloučenina podle nároku 4, vyznačující se tím, že molekula barviva A1 a/nebo A2 je indokarbokyaninové, indodikarbokyaninové nebo indotrikarbokyaninové barvivo obecného vzorce XIII nebo XIV
R*
XIII • · • · · ·
kde p je 1, 2 nebo 3, n je 1, 2 nebo 4, R1 a R2 jsou nezávisle na sobě 4-sulfobutylový nebo 3
sulfopropylový zbytek,
R3 je vodík nebo zbytek -COOE1 nebo -CONHE1, kde E1 je vodíkový atom nebo methyl, ethyl nebo C3 až C6 alkylový zbytek, který může být přerušen s 0 až 2 kyslíkovými atomy a/nebo 0 až 1 karbonylovou skupinou a/nebo může být substituován s 0 až 5 hydroxylovými skupinami.
7. Sloučenina podle nároku 4, vyznačující se tím, že molekula barviva A1 a/nebo A2 je indotrikarbokyaninové barvivo obecného vzorce XV nebo XVI
XV
XVI kde n je 2 nebo 3,
R1 a R2 jsou nezávisle na sobě 4-sulfobutyl-, 3-sulfopropylnebo 2-sulfoethylový zbytek,
R3 je zbytek -CONH-peptid, -CONH-(CH2)m-CONH-peptid,
-CONH-(CH2) n-NH-CS-NH-peptid nebo -CONH- (CH2) n-NHCO-CH2-peptid
s m = ; 1 až 10 a n = 2 nebo 3,
nebo představuje následující skupinu
H .^N—Peptid
Y
S
R4 a R5 jsou nezávisle na sobě vodíkový atom, methylový zbytek nebo hydroxylovaný alkylový zbytek,
R6 je jedna z následujících skupin:
- (CH2) m-CONH-peptid kde m = 0 až 2,
- (CH2) m-NH-CS-NH-peptid kde m = 0 až 2, a X je kyslíkový atom nebo atom síry;
• · · · · ·
8. Sloučenina podle nároku 4, vyznačující se tím, že molekula barviva A1 a/nebo A2 je indotrikarbokyaninové barvivo obecného vzorce XVII:
6/7
Obrázek 6
Stabilita konjugátů barviva s peptidem vázajícím VIP receptor v hovězí plasmě
Obsah pomocí HPLC (%)
A Indotrikarbokyanin-D-VIP(14-24) konjugát (příklad 25) <1 Indotrikarbokyanin-VIP(14-28) konjugát (příklad 20) Indotrikarbokyanin-VIP(l-28) konjugát (příklad 16) *při 750 nm, vztaženo na kontrolní vzorek (1 min 0 °C)
CZ20013562A 1999-04-09 2000-03-28 Konjugáty barviv s peptidy s krátkým řetězcem a jejich pouľití jako optických diagnostik CZ20013562A3 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19917713A DE19917713A1 (de) 1999-04-09 1999-04-09 Kurzkettige Peptid-Farbstoffkonjugate als Konstrastmittel für die optische Diagnostik

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ20013562A3 true CZ20013562A3 (cs) 2002-05-15

Family

ID=7905136

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20013562A CZ20013562A3 (cs) 1999-04-09 2000-03-28 Konjugáty barviv s peptidy s krátkým řetězcem a jejich pouľití jako optických diagnostik

Country Status (28)

Country Link
EP (2) EP1176987B1 (cs)
JP (1) JP2002541219A (cs)
KR (1) KR20020000555A (cs)
CN (1) CN1351505A (cs)
AT (2) ATE421341T1 (cs)
AU (1) AU769392B2 (cs)
BG (1) BG105988A (cs)
BR (1) BR0009658A (cs)
CA (1) CA2368490A1 (cs)
CZ (1) CZ20013562A3 (cs)
DE (3) DE19917713A1 (cs)
DK (1) DK1176987T3 (cs)
EE (1) EE200100521A (cs)
ES (2) ES2321586T3 (cs)
HK (1) HK1046867A1 (cs)
HR (1) HRP20010833A2 (cs)
HU (1) HUP0202990A3 (cs)
IL (1) IL145596A0 (cs)
MX (1) MXPA01010174A (cs)
NO (1) NO20014911L (cs)
NZ (2) NZ514533A (cs)
PL (1) PL351766A1 (cs)
PT (1) PT1176987E (cs)
RU (1) RU2001129707A (cs)
SK (1) SK14152001A3 (cs)
WO (1) WO2000061194A2 (cs)
YU (1) YU70501A (cs)
ZA (1) ZA200109238B (cs)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CZ304948B6 (cs) * 2013-01-02 2015-02-04 Vysoká škola chemicko-technologická v Praze Využití polymethiniových solí jako senzorů pro nádorové markery

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2002220720B2 (en) 2000-11-28 2006-09-14 Mondobiotech Ag Compounds with the biological activity of vasoactive intestinal peptide for the treatment of pulmonary and arteriolar hypertension
KR100406460B1 (ko) * 2001-09-29 2003-11-19 한국과학기술연구원 커플링된 스티릴시아닌 색소 및 그의 제조 방법
IL148921A0 (en) 2002-03-26 2002-09-12 Peptor Ltd Photo active backbone cyclized somatostatin analogs for optical imaging and photodynamic therapy
JP4599948B2 (ja) * 2003-09-18 2010-12-15 チッソ株式会社 α−フルオロアクリレート化合物、組成物およびその重合体
GB0328060D0 (en) * 2003-12-04 2004-01-07 Sod Conseils Rech Applic Botulinum toxin treatment
NO20035683D0 (no) * 2003-12-18 2003-12-18 Amersham Health As Optisk avbildning av prostatakreft
NO20035681D0 (no) * 2003-12-18 2003-12-18 Amersham Health As Optisk avbildning av lungekreft
NO20035682D0 (no) * 2003-12-18 2003-12-18 Amersham Health As Optisk avbildning av ösofagkreft og Barretts ösofag
ATE538135T1 (de) * 2004-06-16 2012-01-15 Ge Healthcare As Verbindungen auf peptidbasis
EP1679082A1 (en) * 2005-01-07 2006-07-12 Schering AG Use of cyanine dyes for the diagnosis of proliferative diseases
DE602005010747D1 (de) 2005-01-13 2008-12-11 Cinv Ag Kohlenstoffnanopartikel enthaltende verbundwerkstoffe
KR100716840B1 (ko) * 2005-08-29 2007-05-09 삼성전기주식회사 노트북 컴퓨터 자동개폐장치
GB0615211D0 (en) * 2006-07-31 2006-09-06 Ge Healthcare Uk Ltd Asymmetric flouro-substituted polymethine dyes
GB0718957D0 (en) * 2007-09-28 2007-11-07 Ge Healthcare Ltd Optical imaging agents
CA3162577C (en) 2008-05-20 2023-09-26 University Health Network Device and method for fluorescence-based imaging and monitoring
CN115919256A (zh) 2014-07-24 2023-04-07 大学健康网络 用于诊断目的的数据的收集和分析
JP2020066637A (ja) * 2017-02-27 2020-04-30 富士フイルム株式会社 病理診断用染色剤、細胞核染色方法、病理標本の製造方法、及び色素
WO2021259899A1 (en) * 2020-06-23 2021-12-30 Bracco Imaging Spa Near-infrared cyanine dyes and conjugates thereof
CN118048050B (zh) * 2024-04-16 2024-06-25 南京诺源医疗器械有限公司 一种七甲川菁近红外荧光染料及其制备方法和应用

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5627027A (en) * 1986-04-18 1997-05-06 Carnegie Mellon University Cyanine dyes as labeling reagents for detection of biological and other materials by luminescence methods
JPS6488537A (en) * 1987-09-30 1989-04-03 Fuji Photo Film Co Ltd Silver halide photographic sensitive material
JPS6491134A (en) * 1987-10-02 1989-04-10 Fuji Photo Film Co Ltd Silver halide photographic sensitive material
MY106120A (en) * 1988-12-05 1995-03-31 Novartis Ag Peptide derivatives.
US5382654A (en) * 1992-02-05 1995-01-17 Mallinckrodt Medical, Inc. Radiolabelled peptide compounds
US5849261A (en) * 1991-02-08 1998-12-15 Diatide, Inc. Radiolabeled vasoactive intestinal peptides for diagnosis and therapy
JP3137349B2 (ja) * 1991-03-27 2001-02-19 生化学工業株式会社 ペプチド誘導体
EP0591820A1 (en) * 1992-10-05 1994-04-13 E.I. Du Pont De Nemours And Company Near-infrared absorbing dyes prepared from Stenhouse salts
JPH06172212A (ja) * 1992-12-10 1994-06-21 Tsumura & Co 医薬組成物
JPH06202260A (ja) * 1993-01-07 1994-07-22 Konica Corp ハロゲン化銀写真感光材料及びその処理方法
DE4445065A1 (de) * 1994-12-07 1996-06-13 Diagnostikforschung Inst Verfahren zur In-vivo-Diagnostik mittels NIR-Strahlung
US5824772A (en) * 1995-04-04 1998-10-20 Advanced Bioconcept, Inc. Fluorescent somatostatin
EP0898596B1 (en) * 1996-04-19 2001-08-29 Amersham Pharmacia Biotech UK Limited Squarate dyes and their use in fluorescent sequencing method
DE19649971A1 (de) * 1996-11-19 1998-05-28 Diagnostikforschung Inst Optische Diagnostika zur Diagnostik neurodegenerativer Krankheiten mittels Nahinfrarot-Strahlung (NIR-Strahlung)
DE19717904A1 (de) * 1997-04-23 1998-10-29 Diagnostikforschung Inst Säurelabile und enzymatisch spaltbare Farbstoffkonstrukte zur Diagnostik mit Nahinfrarotlicht und zur Therapie
GB9712524D0 (en) * 1997-06-16 1997-08-20 Nycomed Imaging As Method
DE19817517A1 (de) * 1998-04-09 1999-10-14 Diagnostikforschung Inst Neue Benzylguanidinderivate für die Therapie, In-vivo- und In-vitro-Diagnostik
US6284223B1 (en) * 1998-10-15 2001-09-04 Fluoroprobe, Inc. Method for viewing tumor tissue located within a body cavity

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CZ304948B6 (cs) * 2013-01-02 2015-02-04 Vysoká škola chemicko-technologická v Praze Využití polymethiniových solí jako senzorů pro nádorové markery

Also Published As

Publication number Publication date
WO2000061194A3 (de) 2001-11-08
SK14152001A3 (sk) 2002-04-04
CN1351505A (zh) 2002-05-29
AU4291100A (en) 2000-11-14
PT1176987E (pt) 2004-06-30
EP1176987A2 (de) 2002-02-06
NZ522136A (en) 2004-05-28
JP2002541219A (ja) 2002-12-03
IL145596A0 (en) 2002-06-30
ATE259246T1 (de) 2004-02-15
RU2001129707A (ru) 2003-09-27
ES2321586T3 (es) 2009-06-09
EP1281405A3 (de) 2003-02-12
NO20014911D0 (no) 2001-10-09
DE19917713A1 (de) 2000-10-19
BR0009658A (pt) 2002-01-15
EE200100521A (et) 2002-12-16
CA2368490A1 (en) 2000-10-19
EP1281405A2 (de) 2003-02-05
ZA200109238B (en) 2003-02-10
HRP20010833A2 (en) 2004-08-31
HUP0202990A3 (en) 2005-09-28
KR20020000555A (ko) 2002-01-05
AU769392B2 (en) 2004-01-22
NO20014911L (no) 2001-12-06
HK1046867A1 (zh) 2003-01-30
BG105988A (en) 2002-06-28
DE50005261D1 (de) 2004-03-18
MXPA01010174A (es) 2003-08-20
WO2000061194A2 (de) 2000-10-19
EP1281405B1 (de) 2009-01-21
DE50015530D1 (de) 2009-03-12
ATE421341T1 (de) 2009-02-15
EP1176987B1 (de) 2004-02-11
PL351766A1 (en) 2003-06-16
YU70501A (sh) 2004-05-12
DK1176987T3 (da) 2004-06-14
NZ514533A (en) 2003-09-26
ES2215641T3 (es) 2004-10-16
HUP0202990A2 (hu) 2002-12-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7175953B2 (en) Short-warp peptide-dye conjugate as contrast agent for optical diagnostic
CZ20013562A3 (cs) Konjugáty barviv s peptidy s krátkým řetězcem a jejich pouľití jako optických diagnostik
US6630570B1 (en) Short-chain peptide-dye conjugates as contrast media for optical diagnosis
KR101578225B1 (ko) 영상화를 위한 표지된 ｈｇｆ 결합성 펩티드
CN113880917B (zh) 几种肿瘤高亲和肽及其应用
CN110845572B (zh) 肿瘤靶向的grp类似物及其应用
JP7623957B2 (ja) 修飾シアニン色素およびそのコンジュゲート
CN115583987B (zh) 针对癌胚抗原相关黏附分子ceacam的肿瘤靶向肽及其应用
CN114933633B (zh) 一种特异性识别fgfr4的天然肽探针及其应用
CN113817023B (zh) 一种靶向fgfr4的亲和肽及其应用
CN112480212A (zh) 靶向肝细胞生长因子的高亲和肽及其应用
WO2024017317A1 (zh) 一种her2靶向肽分子及其应用
US7897142B2 (en) Peptide based-compounds
CN116462750A (zh) 一种基于蛋白fgf19的仿生多肽及其应用
CN116410262A (zh) 一种肿瘤亲和肽及其应用
NZ522135A (en) Somatostatin dye conjugates used as contrast agents for optical diagnostics
CN119039391B (zh) 靶向滋养层细抗原2的高亲和肽及其应用
CN120173056A (zh) 一类双唾液酸神经节苷脂gd2亲和肽及其应用
CN118666950A (zh) Her2靶向肽及其应用
CN116023432A (zh) 双唾液酸神经节苷脂gd2亲和肽及其应用