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CN1918292A - 用于调节bcl－2的寡聚化合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供改进的寡聚化合物，特别是寡核苷酸化合物，以及在人中调节BCL－2基因表达的方法。具体而言，本发明涉及10－30个核苷碱基长度的寡聚化合物，其包含与人Bcl－2mRNA上第1459(5’)位至第1476(3’)位碱基之间的区域可特异性杂交的靶结合区，所述靶结合区具有式5’－[(DNA/RNA) 0－1－(LNA/LNA*)2－7－(DNA/RNA/LNA*)4－14－(LNA/LNA*)2－7－(DNA/RNA) 0－1]－3’，并且所述靶结合区包含至少两个通过硫代磷酸酯基团(－O－P(O，S)－O－)连接的LNA核苷酸或LNA类似物核苷酸。更具体而言，该寡聚物是显著或完全硫醇化的。本发明也涉及这类寡聚物或缀合物或嵌合体在治疗与Bcl－2基因表达有关的各种疾病、例如癌症中的用途。

Description

用于调节BCL-2的寡聚化合物
发明领域
本发明提供改进的寡聚化合物及在人中调节BCL-2基因表达的方法。具体而言，本发明涉及10-30个核苷碱基(nucleobase)长度的寡聚化合物，其包含与人Bcl-2mRNA上第1459(5’)位至第1476(3’)位碱基之间的区域可特异性杂交的靶结合区，所述靶结合区包含至少两个通过硫代磷酸酯基团(-O-P(O，S)-O-)连接的LNA核苷酸或LNA类似物核苷酸。
因此，本发明涉及针对人Bcl-2mRNA并能够调节人Bcl-2蛋白生物合成的反义寡聚化合物。本发明进一步涉及包含这种寡聚化合物的药物组合物、其用途及使用这种寡聚化合物的治疗和诊断方法。
背景技术
人Bcl-2蛋白是与程序性细胞死亡(凋亡)密切相关的蛋白质。凋亡是参与发育、正常细胞转化及激素诱导的组织萎缩的活跃的、高度受调节的生理过程。程序性细胞死亡在癌症和其他增生性疾病，例如再狭窄、纤维化、银屑病或其他类型的变应性疾病中起重要作用，特别是在肿瘤进展中，并且重要的是它可能会促进对抗肿瘤方案、特别是对标准化疗化合物的抗性这一临床问题。和大多数正常的组织相反，在恶性肿瘤，例如小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)中，Bcl-2常常共表达。
WO95/08350公开了反密码子寡聚物(anticode oligomer)及使用它们来控制表达Bc1-2基因之癌细胞的生长的方法。
Klasa等人，Antisense & Nucleic Acid Drug Development02：1993-213(2002)(综述)讨论了化合物奥利默森钠(oblimersensodium)(G3139)的生物学作用及其作为反义药物的可能性。该化合物具有5’-d(P-硫代)-TCT-CCC-AGC-GTG-CGC-CAT-3’的结构。Genta有限公司以奥利默森钠(G3139)加达卡巴嗪(dacarbazine)(DTIC)的方式向FDA递交了一个NDA(新药申请)。它基于的是奥利默森钠(G3139)加达卡巴嗪(DTIC)相对于单独DTIC作为对转移性黑素瘤的一线化疗法(每三周)的国际性多中心随机化3期研究。在2004年5月有报道说该研究未显示G3139和DTIC的联合具有生存益处。该联合组与增加的毒性及由于不良事件(AE)的终止相关，所述终止包括G3139组由于不良事件而终止治疗的69位(18.6％)患者，与此相对的是单独DTIC组的39位(10.8％)患者终止。严重不良事件(SAE)率在G3139组中是40％，与此相对的是单独DTIC组是27％。因为在两组中DTIC的施用是相同的，毒性的增加可能是由于G3139的加入。存活率没有提高而毒性增加。随后该NDA被撤销了。然而，该申办者的二级终点分析的确显示了DTIC的无进展存活中值为49天，而联合用药时为74天有统计上显著的益处，差别为25天(p＝0.0003，HR＝0.73)。该申办者还报道了单独DTIC的响应率为6.8％，而联合用药为11.7％，有显著差异(p＝0.019)。奥利默森钠达到二级终点的事实表明它可以作为治疗转移性黑素瘤的有效化合物。增加的毒性、一级终点的选择及总体临床试验设计是导致失败的所有因素。
Jan Stenvang Jepsen(2003年5月，Copenhagen大学)答辩的博士论文中研究了针对人Bcl-2mRNA中前6个密码子的含LNA的寡聚脱氧核苷酸的LNA。分析了完全修饰的LNA磷酸二酯(PO)序列、磷酸二酯(phosporodiester)头聚物(headmer)(LNA/PO在5’末端且DNA/PS硫代磷酸酯在3’末端)、完全磷酸二酯gapmer(缺口大小为8、10、12、14)和缺口中完全硫醇化(缺口大小为8、10、12、14)的gapmer连同不同转染剂的体外摄取及其对Bcl-2蛋白的下调。该摄取研究在MCF-7细胞中进行，结果通过显微术和流式细胞术分析。针对含有不同PO和PO/PS的所有构建物得到同样有效的投递。可能因为已知硫代磷酸酯化将导致亲和力下降并且因为没有稳定性问题，Stenvang Jepsen虽然研究了多种含有LNA的寡核苷酸和构建物，但是他并没有公开或预见含有LNA的寡核苷酸gapmer，其中靶结合域内大量的核苷酸连键(包括LNA侧翼)是硫代磷酸酯基团(-O-P(O，S)-O-)。
基于体外试验，Frieden等人，Nucleic Acid Research，2003，第31卷，No.21，6365-6373和WO2004/046160 A2公开了有关反义寡核苷酸的设计的多种意见。
Fluiter等人，Nucleic Acid Research，2003，第3卷，953-962公开了LNA反义寡核苷酸的肿瘤生长抑制及其生物分布研究。
发明内容
基于上面的描述，具体地是奥利默森钠化合物相关的潜在性问题，仍然需要下调Bcl-2的改进型寡聚化合物。这种化合物优选应当在分布和下调Bcl-2方面具有合适的体内模式，从而对各种Bcl-2相关疾病、特别是癌症具有治疗相关性。
这就是说，本发明人现已发现了某种新的gapmer型LNA寡聚化合物，相对奥利默森钠而言，其表现相当的或提高的生物学作用，而在药理相关剂量下没有监测到不利后果。
更具体地，本发明人已发现10-30个核苷碱基长度的如下寡聚化合物具有有趣的生物学性质：该化合物包含与人Bcl-2mRNA上第1459(5’)位至第1476(3’)位碱基位置之间的区域可特异性杂交的靶结合区，其中所述靶结合区具有下式：
5′-[(DNA/RNA)0-1-(LNA/LNA*)2-7-(DNA/RNA/LNA*)4-14-(LNA/LNA*)2-7-(DNA/RNA)0-1]-3′
其中，“LNA”表示LNA核苷酸，“LNA*”表示LNA类似物核苷酸；且在靶结合区包含至少两个通过硫代磷酸酯基团连接的LNA核苷酸或LNA类似物核苷酸。
附图简述
图1显示通过western印迹分析LNA寡聚化合物转染的15PC3细胞中Bcl-2的下调。相对于奥利默森钠即SEQ ID NO：56(参比)而言，SEQ ID NO：2、4、15、21和24(见表1)是在蛋白质水平上测定的更有效的Bcl-2抑制剂。survivin蛋白作为对照。
图2A显示通过western印迹及使用化学发光检测系统显色分析的LNA寡聚化合物转染的15PC3细胞中Bcl-2的下调。相对于SEQ ID NO：56(参比)而言，SEQ ID NO：2明显更加有效。survivin蛋白作为对照。
图2B显示了western印迹。518A2细胞分别用5nM SEQ ID NO：56(参比)、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：15进行脂质转染。48小时后测定蛋白质。在时间段内SEQ ID NO：15仍具有活性。该图显示以微管蛋白归一化的数据。
图2C显示western印迹。518A2细胞分别用5nM SEQ ID NO：56(参比)、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：35进行脂质转染，其中SEQ ID NO：35是SEQ ID NO：15的n-1个15-mer形式。在48小时时分析蛋白质。SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：15一样有效。数据以微管蛋白归一化。
图3A显示通过胱冬酶3/7的活性测定的含有LNA之化合物在518A2细胞中24、48和72小时后的凋亡诱导。LNA寡聚SEQ ID NO：2、4、12、15、21、24和27诱导凋亡比SEQ ID NO：56(参比)及其对应的胞嘧啶甲基化化合物(称为SEQ ID NO：59)更有效。在稍晚的时间点(例如在72小时)胱冬酶3/7的较低值是由于通过在胱冬酶3/7的早期活化时经凋亡引起的细胞死亡所致。因此，在监视的时间前已达到最大活化。
图3B显示通过胱冬酶3/7活性测定的含有LNA之化合物在518A2细胞中13、24、48和72小时后的凋亡诱导。相对于SEQ ID NO：58(即也含有LNA的相反极性对照寡核苷酸)而言，LNA寡聚化合物SEQID NO：8、9、15和16更有效地诱导凋亡。
图3C显示通过Annexin V-FITC流式细胞仪分析法测定的后凋亡性细胞阶段的诱导。相对于模拟物(mock)和SEQ ID NO：56(参比)处理的细胞而言，以LNA寡聚化合物SEQ ID NO：15处理的Hela细胞归类为更加“晚凋亡”或“损伤(damaged)的”。
图3D显示相对于模拟物(mock)处理的细胞，通过Annexin V-FITC流式细胞术分析法测定的用5nM和12.5nM SEQ ID NO：8和SEQ IDNO：15处理细胞导致的早期凋亡和晚凋亡的诱导。
图4显示用Bcl-2LNA寡聚化合物处理后48小时测量的增殖癌细胞(MTS测定法)、518A2细胞中Bcl-2的抑制。相对于SEQ ID NO：56(参比)及其对应的胞嘧啶甲基化化合物SEQ ID NO：59(参比)，SEQ ID NO：2、4、12、15、21、24和57的是更有效的增殖抑制剂。针对经模拟物处理的对照调整数据。实验1和实验2代表了两个单独的实验。
图5显示用Bcl-2LNA寡聚化合物处理后0-48小时时程内测量的增殖癌细胞518A2细胞中的Bcl-2抑制。相对于SEQ ID NO：56(参比)及其对应的胞嘧啶甲基化化合物SEQ ID NO：59(参比)而言，SEQ ID NO：2、4、12、15、21、24和57均是更有效的增殖抑制剂。针对经模拟物处理的对照调整(校正)数据。
图6显示了western印迹。518A2细胞分别用10nM SEQ ID NO：56(参比)和SEQ ID NO：15进行脂质转染。在24小时、48小时和72小时时分析蛋白质。在整个时间段内SEQ ID NO：15均具有活性。在24小时时(已和蛋白质的半寿期一样长)Bcl-2蛋白仍然可见。
图7显示相对于SEQ ID NO：56(参比)而言，在前列腺PC3无胸腺(atymic)裸鼠异种移植物模型中使用SEQ ID NO：15的体内肿瘤体积的有效减小。该化合物以10mg/kg腹膜内注射14天。丝裂霉素C以2mg/kg腹膜内注射14天作为阳性对照。处理后观察肿瘤生长8天。
图7B显示在前列腺PC3无胸腺裸鼠异种移植物模型中施用SEQ IDNO：15时体重没有明显的下降。10mg/kg的SEQ ID NO：56(参比)和2mg/kg的丝裂霉素C阳性对照显示类似的模式。
图7C显示相对于盐水对照而言，在前列腺PC3无胸腺裸鼠异种移植物模型中使用SEQ ID NO：8时体内肿瘤体积的有效减小。该化合物以10mg/kg腹膜内注射14天(第5-19天)。
图7D显示相对于盐水对照而言，在前列腺PC3无胸腺裸鼠异种移植物模型中第7-15天中的每天或第8、11、13、15、18、20天施用SEQ ID NO：15时体内肿瘤体积的有效减小。该化合物以10mg/kg腹膜内施用14天。处理后再观察肿瘤生长8天。
图8A显示在黑素瘤518A2 scid小鼠异种移植物模型中腹膜内施用1.75mg/kg的SEQ ID NO：15计14天后体内肿瘤重量(克数)相比于施用4倍高剂量的SEQ ID NO：56(参比)而言有相当的减小。
图8B显示来自和图8A中相同试验的结果，但是该结果是以肿瘤减小％表示，而不是以克数表示。
图9显示在黑素瘤518A2 scid小鼠异种移植物模型中腹膜内施用1.75mg/kg的SEQ ID NO：15计14天后体内肿瘤体积相比于施用4倍高剂量的SEQ ID NO：56(参比)而言有相当的减小。
图10A显示相对于盐水对照，在黑素瘤518A2 scid小鼠异种移植物模型中腹膜内施用1.75mg/kg的SEQ ID NO：15计14天时，肝脏的大小没有增加。以7mg/kg施用SEQ ID NO：56(参比)引起肝脏大小增加。
图10B显示，相对于盐水对照，在黑素瘤518A2 scid小鼠异种移植物模型中腹膜内施用1.75mg/kg的SEQ ID NO：15计14天时，脾脏的大小没有增加。以7mg/kg施用SEQ ID NO：56(参比)显示脾脏大小有增加。这表明相对于SEQ ID NO：56(参比)而言，在活性剂量下SEQ ID NO：15具有更低的毒性水平。
图10C显示相对于盐水对照和7mg/kg的SEQ ID NO：56(参比)而言，在黑素瘤518A2 scid小鼠异种移植物模型中腹膜内施用1.75mg/kg的SEQ ID NO：15计14天时，该处理没有导致小鼠体重的减少。这表明相比于SEQ ID NO：56(参比)，活性剂量下SEQ ID NO：15具有更低的毒性水平。
图11显示相比于同样剂量的SEQ ID NO：56(参比)，当腹膜内施用7mg/kg的SEQ ID NO：8计14天时，在黑素瘤518A2 scid小鼠异种移植物模型中体内肿瘤重量的进一步减少。当SEQ ID NO：8以比SEQ ID NO：56(参比)低7倍的剂量施用时，其显示相同的抗肿瘤活性。
图12A显示相对于SEQ ID NO：56(参比)而言，在大鼠血浆(NtacSD雄性，Li-肝素化(Taconic，M&B))中SEQ ID NO：15、16和20有增加的稳定性。将该寡核苷酸在37℃下以20μM的浓度分别孵育0、4、24和48小时。样品中存在的唯一降解片段是n-1个对应的寡核苷酸(15mer)，其缺乏3’末端的DNA残基。甚至在48小时的消化后仍然没有观察到其他的降解片段。
图12B显示相对于SEQ ID NO：56(参比)而言，在大鼠血浆中SEQ ID NO：8和9显示高稳定性。将该寡核苷酸在37℃下以20μM的浓度分别孵育0、4、24和48小时。样品中存在的唯一的降解片段是n-1个对应的寡核苷酸(15mer)，其缺乏3’末端的DNA残基。甚至在48小时的消化后仍然没有观察到其他的降解片段。
图13显示在单剂量静脉内施用SEQ ID NO：15(25mg/kg)后，其在来自NMRI小鼠的肝脏和肾脏中的水平。发现活性化合物SEQ IDNO：15在肝脏和肾脏中的半寿期(T1/2)均是大约3天。这表明，SEQ IDNO：15的最佳生物剂量的剂量方案可以比连续输注和每日给药(dailydosing)的频率少。
发明详述
如上所述，本发明人已发现10-30个核苷酸碱基长度的如下寡聚化合物具有有趣的生物学特性：该化合物包含可与人Bcl-2mRNA上第1459(5’)位至第1476(3’)位碱基位置之间的区域特异性杂交的靶结合区，其中所述靶结合区具有下式：
5′-[(DNA/RNA)0-1-(LNA/LNA*)2-7-(DNA/RNA/LNA*)4-14-(LNA/LNA*)2-7-(DNA/RNA)0-1]-3′
其中，“LNA”表示LNA核苷酸，“LNA*”表示LNA类似物核苷酸；其在靶结合区包含至少两个通过硫代磷酸酯基团连接的LNA核苷酸或LNA类似物核苷酸。
一般而言，相信相对于已知的寡聚化合物，本文定义的寡聚化合物具有改进的性质。“改进的性质”应理解为寡聚化合物相比于它们的硫代磷酸酯对应物表现出更好或相当的全面性质的一或多个参数。
这类改进的参数的实例是更长的药物保存期、与靶(寡聚化合物或mRNA靶中的interim互补物)更高的结合常数、对细胞外和细胞内核酸酶的优异抗性、作用模式中的更大潜能、更好的表型反应性、更持久的作用、更好的化学敏感性(chemosensitization)及改进的患者便利性。相当参数的实例是生产方便、制药上配制方便、组织分布、良好的安全特性。
总的来说，在下调Bcl-2mRNA方面、在蛋白质的下调(Bcl2/Bax的比率从1nM开始改变)和细胞增殖的抑制方面本文定义的寡聚化合物表现出IC50值在极低的纳摩尔浓度范围(5nM)内。比奥利默森和Jepsen化合物观察到的水平(在400nM处可见显著下调水平)高很多的水平。此外，细胞死亡和凋亡诱导强烈相关，并且凋亡诱导的水平远比奥利默森更强。进一步，与奥利默森相比，本文定义的寡聚化合物在大鼠血浆中表现出显著增强的稳定性及组织中更长的半寿期。在前列腺和黑素瘤模型中观察到多次抗肿瘤反应，甚至在1mg/Kg/天下观察到反应。另外，与文献中记载的奥利默森的常规剂量相比，观察到该化合物以更低频率使用时的抗肿瘤反应。没有监测到药理学相关剂量下的不良反应，例如ASAT、ALAT的升高。我们的发明超越了Jepsen的构建物，针对后者没有检测功能性反应、稳定性、组织中的半寿期、体内反应、临床化学或生物分布。
本文引用的人Bcl-2mRNA序列可在GenBank数据库中以HUMBcl-2，登录号M13994得到。在本申请的上下文中，核酸的编号，特别是mRNA或对应的cDNA序列的编号，与以该登录号在该数据库中存在的人Bcl-2 mRNA的相应编号相关。对应的cDNA序列可以从mRNA序列推导出，具体是用mRNA序列中的碱基U替换cDNA序列中的任何碱基T，反之亦然。
寡聚化合物
寡聚化合物的特征在于它在靶结合区包含至少两个通过硫代磷酸酯基团连接的LNA核苷酸或LNA类似物核苷酸。
本文中使用的表述“靶结合区”指结合特定靶序列、本文中是指人Bcl-2 mRNA上第1459(5’)位至第1476(3’)位碱基位置之间的区域的寡聚化合物区域(或甚至是这类寡聚化合物本身)。
在一个实施方案中，该靶结合区包含至少两个通过硫代磷酸酯基团(-O-P(O，S)-O-)连接的LNA核苷酸。
在另一个实施方案中，该靶结合区包含至少两个通过硫代磷酸酯基团(-O-P(O，S)-O-)连接的LNA类似物核苷酸。
本文中使用的术语“寡聚化合物”指LNA寡核苷酸，即通过用LNA核苷酸或LNA核苷酸、特别是至少两个LNA核苷酸取代其中的一个或多个(或全部)核苷酸修饰的核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)，并且可能有用LNA类似物核苷酸及核苷酸衍生物/类似物对核苷酸进一步取代。
术语“寡核苷酸”包括含有天然产生的核苷碱基、糖和核苷间(主链)键的寡核苷酸及具有相似功能或具有特别改进的功能的非天然产生部分的寡核苷酸。
本发明上下文中使用的寡聚化合物为10-30个核苷酸碱基长度，即10-25个核苷酸碱基长度，例如10-20个核苷酸碱基长度，如10-18个或10-16个或15-17个核苷酸碱基长度。
术语“核苷酸碱基长度”指以与直链互补核酸分子杂交的核苷酸碱基数目计的长度，即寡聚化合物与之杂交的互补核酸区域的核苷酸碱基总数。因此，寡聚化合物的长度包括缺少核苷酸碱基的任何中间核苷酸。
在一个主要实施方案中，本发明的寡聚化合物(LNA寡核苷酸)包含至少两个LNA核苷酸。
在另一个实施方案中，本发明的寡聚化合物(LNA寡核苷酸)包含至少两个LNA类似物核苷酸和可能的一个或多个LNA核苷酸。
术语“至少两个”包含大于或等于2的整数，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17等。
术语“至少一个”包含大于或等于1的整数，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17等。
针对核苷、核苷类似物、SEQ ID NO等使用的术语“一个(一种)”意指一个(种)或多个(种)。具体而言，表述“一种(个)组分(例如核苷、核苷类似物、SEQ ID NO等)选自…”意指可选择一个或多个所引用的组分。因此，像“一种组分，选自A、B和C”这样的表述意指包括A、B和C的所有组合，即A、B、C；A+B；A+C；B+C和A+B+C。
术语“LNA”(被锁核酸(Locked Nucleic Acid))(或“LNA寡核苷酸”)指含有一个或多个二环核苷类似物的寡核苷酸，也指LNA核苷酸和LNA核苷酸类似物。
LNA寡核苷酸、LNA核苷酸和LNA类似物核苷酸概述于WO 99/14226以及后续申请WO 00/56746、WO00/56748、WO 00/66604、WO 00/125248、WO02/28875、WO2002/094250和PCT/DK02/00488之中，在此将它们全部引入作为参考。
在本申请的上下文和权利要求中，发明人区分了“LNA核苷酸”和“LNA类似物核苷酸”。“LNA核苷酸”是式1的核苷酸：
Figure A20048004181900141
式1(LNA核苷酸)
这类LNA核苷酸通常是指“β-D-氧基-LNA”。
式1中的B构成核苷碱基。核苷碱基包括天然产生的核苷碱基和非天然产生的核苷碱基。这类核苷碱基的示例性实例选自腺嘌呤、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、异胞嘧啶、假异胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、5-丙炔-6-氟尿嘧啶、5-甲基噻唑基尿嘧啶(5-methylthiazoleuracil)、6-氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、肌苷、二氨基嘌呤、7-丙炔-7-脱氮腺嘌呤(deazaadenine)、7-丙炔-7-脱氮鸟嘌呤(deazaguanine)和2-氯-6-氨基嘌呤。B的优选实例是自腺嘌呤、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、异胞嘧啶、假异胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、6-氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、肌苷、二氨基嘌呤和2-氯-6-氨基嘌呤。
式1中的Z*选自核苷间连键合和端基，式1中的Z选自与前一核苷酸/核苷的核苷间连键的键和端基，当然前提条件是Z和Z*中只有一个可以是端基。
作为Z*的可能含义的核苷间连键是指与随后的核酸/核苷的核苷间连键。核苷间连键的实例是-O-P(O)2-O-、-O-P(O，S)-O-、-O-P(S)2-O-、-S-P(O)2-O-、-S-P(O，S)-O-、-S-P(S)2-O-、-O-P(O)2-S-、-O-P(O，S)-S-、-S-P(O)2-S-、-O-PO(RH)-O-、O-PO(OCH3)-O-、-O-PO(NRH)-O-、-O-PO(OCH2CH2S-R)-O-、-O-PO(BH3)-O-、-O-PO(NHRH)-O-、-O-P(O)2-NRH-、-NRH-P(O)2-O-、-NRH-CO-O-、-NRH-CO-NRH-、-O-CO-O-、-O-CO-NRH-、-NRH-CO-CH2-、-O-CH2-CO-NRH-、-O-CH2-CH2-NRH-、-CO-NRH-CH2-、-CH2-NRH-CO-、-O-CH2-CH2-S-、-S-CH2-CH2-O-、-S-CH2-CH2-S-、-CH2-SO2-CH2-、-CH2-CO-NRH-、-O-CH2-CH2-NRH-CO-、-CH2-NCH3-O-CH2-，其中RH选自氢和C1-4-烷基。优选的核苷间连键是-O-P(O)2-O-、-O-P(O，S)-O-、-O-P(S)2-O-、-S-P(O)2-O-、-S-P(O，S)-O-、-S-P(S)2-O-、-O-P(O)2-S-、-O-P(O，S)-S-、-S-P(O)2-S-。本发明的特别特征是两个LNA核苷酸通过-O-P(O，S)-O-(硫代磷酸酯)基团连接，即该核苷间连键优选是硫代磷酸酯基团。
在本发明的上下文中，术语“C1-4-烷基”意指直链或支链饱和烃链，其中该链具有一至四个碳原子，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基。
当LNA核苷酸是寡聚化合物的5’-末端核苷酸时，Z*是端基；如果LNA核苷酸是寡聚化合物的3’-末端核苷酸时，Z是端基。这类端基一般选自氢、叠氮基、卤素、氰基、硝基、羟基、Prot-O-、Act-O-、巯基、Prot-S-、Act-S-、C1-6-烷基硫代、氨基、Prot-N(RH)-、Act-N(RH)-、单-或二(C1-6-烷基)氨基、任选取代的C1-6-烷氧基、任选取代的C1-6-烷基、任选取代的C2-6链烯基、任选取代的C2-6-链烯氧基、任选取代的C2-6炔基、任选取代的C2-6-炔氧基、一磷酸酯、一硫代磷酸酯、二磷酸酯、二硫代磷酸酯、三磷酸酯、三硫代磷酸酯、DNA嵌入剂、光化学活性基团、热化学活性基团、螯合基团、报道基团、配体、羟基、砜、羟甲基、Prot-O-CH2-、Act-O-CH2-、氨基甲基、Prot-N(RH)-CH2-、Act-N(RH)-CH2-、羧甲基和砜甲基，其中Prot是-OH、-SH和-NH(RH)各自的保护基团，Act是-OH、-SH和-NH(RH)各自的活化基团，且RH选自氢和C1-6烷基。端基的优选实例是氢、叠氮基、卤素、氰基、硝基、羟基、Prot-O-、Act-O-、巯基、Prot-S-、Act-S-、C1-6-烷基硫代、氨基、Prot-N(RH)-、Act-N(RH)-、单-或二(C1-6-烷基)氨基、任选取代的C1-6-烷氧基、任选取代的C1-6-烷基、任选取代的一磷酸酯、一硫代磷酸酯、二磷酸酯、二硫代磷酸酯、三磷酸酯、三硫代磷酸酯，其中Prot是-OH、-SH和-NH(RH)各自的保护基团，Act是-OH、-SH和-NH(RH)各自的活化基团，且RH选自氢和C1-6-烷基。
羟基(和硫)取代基的保护基团(Prot)包括取代的三苯甲基，例如4，4’-二甲氧基三苯甲氧基(4，4’-dimethoxytrityloxy，DMT)、4-一甲氧基三苯甲氧基(4-monomethoxytrityloxy，MMT)和三苯甲氧基(trityloxy)、任选取代的9-(9-苯基)呫吨氧基(xanthenyloxy)(pixyl)、任选取代的甲氧基四氢吡喃氧基(methoxytetrahydropyranyloxy，mthp)、甲硅烷氧基例如三甲基甲硅烷氧基(TMS)、三异丙基甲硅烷氧基(TIPS)、叔丁基二甲基甲硅烷氧基(TBDMS)、三乙基甲硅烷氧基和苯基二甲基甲硅烷氧基、叔丁基醚、缩醛(包括两个羟基基团)、酰氧基例如乙酰基或卤素取代的乙酰基，即氯乙酰氧基或氟乙酰氧基、异丁酰氧基、新戊酰氧基(pivaloyloxy)、苯甲酰氧基和取代的苯甲酰基、甲氧基甲基氧基(methoxymethyloxy，MOM)和二苄醚或取代的二苄醚例如2，6-二氯苄氧基(2，6-Cl2Bzl)。羟基(和硫)取代基的优选保护基团包括取代的三苯甲基例如4，4’-二甲氧基三苯甲氧基(DMT)、4-一甲氧基三苯甲氧基(MMT)、任选取代的9-(9-苯基)呫吨氧基(pixyl)、任选取代的甲氧基四氢吡喃氧基(mthp)、甲硅烷氧基例如三甲基甲硅烷氧基(TMS)、三异丙基甲硅烷氧基(TIPS)、叔丁基二甲基甲硅烷氧基(TBDMS)、三乙基甲硅烷氧基和苯基二甲基甲硅烷氧基、叔丁基醚、缩醛(包括两个羟基基团)和酰氧基例如乙酰基。
氨基或酰胺基的保护基团的示例性实例是芴基甲氧基-羰基氨基(Fmoc)、叔丁氧基羰基氨基(BOC)、三氟乙酰氨基、烯丙氧基羰基氨基(alloc，AOC)、Z苄氧基羰基氨基(Cbz)、取代的苄氧基羰基氨基例如2-氯苄氧基羰基氨基(2-Cbz)、一甲氧基三苯甲基氨基(MMT)、二甲氧基三苯甲基氨基(DMT)、邻苯二甲酰氨基和9-(9-苯基)呫吨基氨基(pixyl)。优选的实例是芴基甲氧基-羰基氨基(Fmoc)、叔丁氧基羰基氨基(BOC)、三氟乙酰氨基、烯丙氧基羰基氨基(alloc，AOC)、一甲氧基三苯甲基氨基(MMT)、二甲氧基三苯甲基氨基(DMT)、邻苯二甲酰氨基。
基团“Act”是指-OH、-SH和-NH(RH)各自的活化基团，以便偶联其他的核苷酸、固相、蛋白质等。在上述实施方案中“Act”是指活化基团。这类活化基团例如选自任选取代的O-亚磷酰胺、任选取代的O-磷酸三酯、任选取代的O-磷酸二酯、任选取代的H-膦酸酯和任选取代的O-膦酸酯。在本发明的上下文中，术语“亚磷酰胺”指式-P(ORx)-N(Ry)2的基团，其中Rx是指任选取代的烷基，例如甲基、2-氰基乙基或苄基，且每个Ry指任选取代的烷基，例如乙基或异丙基，或-N(Ry)2基团形成吗啉代基团(-N(CH2CH2)O)。Rx优选是指2-氰基乙基，两个Ry优选相同并且指异丙基。因此，特别相关的亚磷酰胺是N，N-二异丙基-O-(2-氰基乙基)亚磷酰胺。
如上所述，该寡聚化合物包含LNA核苷酸，可能与非LNA核苷酸的核苷酸相组合。这类核苷酸包括脱氧核糖核苷酸(DNA核苷酸)、核糖核苷酸(RNA核苷酸)、核苷酸衍生物、LNA类似物核苷酸、核苷酸类似物(不同于LNA)和PNA单元等。
核苷酸类似物和核苷酸衍生物描述于例如Freier & Altmann(Nucl.Acid Res.，1997，25，4429-4443)和Uhlmann(Curr.Opinionin Drug & Development(2000，3(2)：293-213))。方案1图示就此选择的实例：
Figure A20048004181900181
硫代磷酸酯               2’-O-甲基                2’-MOE                     2’-氟代
Figure A20048004181900182
2’-AP                           HNA                      CeNA                         PNA
Figure A20048004181900183
Figure A20048004181900184
吗啉代               2’-F-ANA             2’-(3-羟甲基)丙基       3’-亚磷酰胺
硼烷磷酸酯
方案1
术语“LNA类似物核苷酸”是那些概述于WO 99/14226以及后续申请WO 00/56746、WO 00/56748、WO 00/66604、WO 00/125248、WO02/28875、WO 2002/094250和WO 2003/006475(PCT/DK02/00488)(参考上述)的二环核苷酸类似物，但是排除已描述过的“LNA核苷酸”。
优选的LNA类似物核苷酸的具体基团实例以式2为例：
式2(LNA类似物核苷酸)
在式2中，X和Y独立地选自-O-、-S-、-N(H)-、-N(R)-、-CH2-或-CH-(如果是双键部分)、-CH2-O-、-CH2-S-、-CH2-N(H)-、-CH2-N(R)-、-CH2-CH2-或-CH2-CH-(如果是双键部分)、-CH＝CH-，其中R选自氢和C1-4烷基。不对称基团可以任一方向存在。在优选的实施方案中，X是氧，Y选自-O-、-S-、-N(H)-和-N(R)-，注意不包括“LNA核苷酸”(X＝O且Y＝O)。
本发明的寡聚化合物可以进一步带有针对LNA核苷酸中定义的那些Z和Z*基团。
在式2中，四个手性中心以固定的构型显示。但是，本发明中也包括通式2中的化合物，其中这些手性中心以不同的构型存在。因此，式2中的每个手性中心可以R或S构型存在。R(rectus)和S(sinister)的定义描述于IUPAC 1974 Recommendations，E部分，FundamentalStereochemistry(基础立体化学)：规则可见于Pure Appl.Chem.45，13-30，(1976)和“Nomenclature of organic Chemistry(有机化学命名法)”Pergamon，纽约，1979中发现。
“LNA类似物核苷酸”的具体例子以式I、II、III、IV、V和VI为例图示：
一个例子是“硫代-LNA”核苷酸，即其中式I、III、IV或VI中的至少一个X选自-S-或-CH2-S-的LNA类似物核苷酸。这种硫代-LNA可分别处于β-D-构型(I和IV)和α-L-构型(III和VI)。
另一个实例是“氨基-LNA”核苷酸，即其中式I、III、IV或VI中的至少一个X选自-N(H)-、-N(R)-、-CH2-N(H)-、-CH2-N(R)-的LNA类似物核苷酸，其中R选自氢和C1-4烷基。这种氨基-LNA可分别以β-D-构型(I和IV)和α-L-构型(III和VI)存在。
另一个实例是“ena-LNA”核苷酸，其中式II或V中的至少一个X是-CH2-O-的LNA类似物核苷酸。
Figure A20048004181900211
β-D-氧基-LNA    α-L-氧基-LNA
在另一个实施方案中，该寡聚化合物包含“α-L-LNA”(即“阿尔法-L-LNA”)核苷酸，即式III和VI中所示的LNA核苷酸。
这就是说，该LNA核苷酸类似物(如果存在)优选选自β-D-氨基-LNA、β-D-硫代-LNA和α-L-氧基-LNA，更特别地，所有的LNA核苷酸类似物(如果存在)是α-L-氧代-LNA。
如上所述，本发明具体涉及10-30个核苷碱基长度的寡聚化合物，其包含与人Bcl-2mRNA上第1459(5’)位至第1476(3’)位碱基位置之间的区域特异性杂交的靶结合区，其中所述靶结合区具有下式：
5′-[(DNA/RNA)0-1-(LNA/LNA*)2-7-(DNA/RNA/LNA*)4-14-(LNA/LNA*)2-7-(DNA/RNA)0-1]-3′
其中，“LNA”表示LNA核苷酸，“LNA*”表示LNA类似物核苷酸；该靶结合区包含至少两个通过硫代磷酸酯基团(-O-P(O，S)-O-)连接的LNA核苷酸或LNA类似物核苷酸。
因此，该寡聚化合物是10-30个核苷碱基长度，例如10-25个核苷碱基长度，例如10-20个核苷酸碱基长度，例如为10-18个核苷酸碱基长度或10-16个核苷酸碱基长度。其靶结合区具有多达18个核苷酸碱基/核苷酸，因为该靶结合区不可以比其应当“可特异结合”的区域更长。然而，根据下文可以理解的是，该靶结合区不需要是18个核苷酸碱基长度，甚至当寡聚化合物是18个核苷碱基长度或更长时也不需要。例如，该寡聚化合物可以是20个核苷碱基长度，那么该靶结合区可以是18或17或16个核苷碱基长度等等。(因而，可以理解该寡聚化合物的任何不是所述靶结合区部分的核苷酸可以结合到靶mRNA指示区域附近的核苷碱基上。)然而，理想的是靶结合区代表寡聚化合物的主要部分。最优选地，靶结合区组成不超过18个核苷酸长度的寡聚化合物的90％-100％，即，如果寡聚化合物具有多达18个核苷酸的长度，那么靶结合区构成它的90％-100％，如果寡聚化合物具有19个或更多个核苷酸的长度，那么靶结合区具有16-18个核苷酸的长度(18个核苷酸的90％-100％)。更优选的，靶结合区构成整个寡聚化合物。
本文使用的“杂交”是指互补核苷或核苷酸碱基之间的氢键键合，其可以是Watson-Crick、Hoogsteen、反相Hoogsteen氢键键合等。Watson和Crick在大约五十年前揭示了脱氧核糖核酸由两条链组成，这两条链通过它们中的反向互补核苷碱基间形成的氢键以螺旋构型结合在一起。在DNA中普遍可见的四种核苷碱基是鸟嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)和胞嘧啶(C)，其中G与C核苷碱基配对，A与T核苷碱基配对。在RNA中，核苷碱基胸腺嘧啶被核苷碱基尿嘧啶(U)替代，其与T类似地和A核苷碱基配对。参与标准双链体形成的核苷碱基中的化学基团组成Watson-Crick面(Watson-Crickface)。几年后Hoogsteen揭示嘌呤核苷碱基(G和A)除了具有Watson-Crick面之外还具有可在双链体外面识别的Hoogsteen面，其通过氢键键合结合嘧啶寡核苷酸，由此形成三螺旋结构。
术语“可特异性杂交”是指所述的寡聚化合物能够与靶mRNA足够强和特异性地结合，以便提供对靶mRNA正常功能的期望干扰，同时使非靶mRNA的功能不受干扰。相关的杂交和由此的功能干扰在大约37℃的生理条件下发生。然而，这并不排除在靶结合区中可以存在一个或两个错配。靶结合区优选不包括错配或最多有一个错配(进一步参见下文)。
本文使用的术语“靶mRNA”是指编码人Bcl-2蛋白的人Bcl-2mRNA。
本文使用的术语“调节”是指通过寡聚化合物与编码人Bcl-2蛋白的人Bcl-2mRNA的结合而降低(抑制)人Bcl-2基因的表达。
通过靶结合区与靶mRNA的指定区域的结合获得“特异性杂交”。应该理解的是，靶结合区不需要结合靶mRNA的全部18个核苷酸区域，在寡聚化合物并且由此地靶结合区具有少于18个核苷酸碱基长度时尤其如此。然而，靶结合区优选结合靶mRNA的指定区域中至少10个核苷碱基的一个片段，例如10-18或10-17或10-16或10-15或10-14范围内的一个片段。
一般优选地，靶结合区中的大量核苷酸连键(更准确地，核苷间的连键，即核苷间键合)是硫代磷酸酯基团(-O-P(O，S)-O-)。更优选地，至少70％，例如至少80％或至少87％或至少93％的核苷酸连键是硫代磷酸酯基团(-O-P(O，S)-O-)。在具体的实施方案中，所有的核苷酸连键是硫代磷酸酯基团。更具体地，寡聚化合物中的所有核苷酸连键是硫代磷酸酯基团。
在许多实施方案中，靶结合区中的至少3个，例如至少4个、至少5个或甚至至少6个、至少7个或至少8个核苷碱基是LNA核苷酸的核苷碱基。
在另一个实施方案中，靶结合区中的至少3个，例如至少4个、至少5个或甚至至少6个、至少7个或至少8个核苷碱基是LNA类似物核苷酸的核苷碱基。
在关于表1中的许多具体序列的优选实施方案中，靶结合区中的10-50％核苷碱基是LNA核苷酸的核苷碱基。
在一些优选的设计中，所述靶结合区中的两个5’-末端核苷碱基是LNA核苷酸的核苷碱基。
在其他优选的设计中，所述靶结合区中的两个5’-末端核苷碱基是DNA或RNA核苷酸的核苷碱基及随后的LNA核苷酸的核苷碱基，特别是DNA或RNA核苷酸及随后的LNA核苷酸的两个核苷碱基。
在另一个优选的设计中，所述靶结合区中的3’-末端核苷碱基是DNA或RNA核苷酸的核苷碱基。
在其变通方案中，所述靶结合区中的两个3’-末端核苷碱基是DNA或RNA核苷酸的核苷碱基及随后的LNA核苷酸的核苷碱基。
在另一个优选的设计中，所述靶结合区中的两个3’-末端核苷碱基是LNA核苷酸的核苷碱基。
该寡聚化合物具有含gapmer设计的靶结合区，例如LNA/(非-LNA)/LNA gapmer设计。上面定义的gapmer构建物的具体变体是具有选自下面的通式的靶结合区：
5′-[(LNA/LNA*)2-7-(DNA/RNA/LNA*)4-14-LNA/LNA* 2-7]-3′；
5′-[(LNA/LNA*)2-7-(DNA/RNA/LNA*)4-14-LNA/LNA* 2-7-(DNA/RNA)]-3′；
5′-[(DNA/RNA)-(LNA/LNA*)2-7-(DNA/RNA/LNA*)4-14-LNA/LNA* 2-7]-3′；和
5′-[(DNA/RNA)-(LNA/LNA*)2-7-(DNA/RNA/LNA*)4-14-LNA/LNA* 2-7-(DNA/RNA)]-3′.
相信上述四种gapmer类型将产生相同类型的活性种类，即通过外切核酸酶裂解5’-或3’-DNA部分后的5’-[(LNA/LNA*)2-7-(DNA/RNA/LNA*)4-14-LNA/LNA*2-7]-3’型gapmer，参见实施例15。因此，因为SEQID NO：15是特别优选的gapmer(和具体化合物)，因而相信SEQ IDNO：29是同等令人感兴趣的。同样，因为SEQ ID NO：8是特别优选的gapmer(和具体化合物)，因而相信SEQ ID NO：35是同等令人感兴趣的。
具体的设计是靶结合区具有式5’-[(LNA/LNA*)2-7-(DNA/RNA/LNA*)4-14-LNA/LNA*2-7-(DNA/RNA)]-3’，例如5’-[(LNA/LNA*)2-5-(DNA/RNA/LNA*)7-12-LNA/LNA*2-5-(DNA/RNA)]-3’，特别是5’-[(LNA/LNA*)2-4-(DNA/RNA/LNA*)10-12-LNA/LNA*2-4-(DNA/RNA)]-3’。
表述“(LNA/LNA*)”是指所述区段(即含有2-7个核苷酸的区段)可包括LNA核苷酸、LNA类似物核苷酸或此两者。同理，区段“(DNA/RNA/LNA*)”可包括脱氧核糖核苷酸(DNA核苷酸)、核糖核苷酸(RNA核苷酸)和LNA类似物核苷酸以及它们的组合。区段“(DNA/RNA)”可包括脱氧核糖核苷酸(DNA核苷酸)和核糖核苷酸(RNA核苷酸)或此两者。
相信-(DNA/RNA/LNA*)4-14-亚区段应该可以募集RNA酶H，理由是该亚区段优选由α-L-LNA核苷酸形式的DNA核苷酸或LNA类似物核苷酸、特别是DNA核苷酸组成。虽然亚区段定义为长度为4至14个核苷碱基，但是相信在7至12个核苷碱基范围内的长度，例如10至12个核苷碱基，特别是11个核苷碱基可产生特别有用的gapmer，参见表1。
因此，更具体的设计是其中靶结合区具有式5’-[(LNA/LNA*)2-7-(DNA/α-L-LNA)5-14-LNA/LNA*2-7-(DNA/RNA)]-3’，例如5’-[(LNA/LNA*)2-5-(DNA/α-L-LNA)7-12-LNA/LNA*2-5-(DNA/RNA)]-3’，特别是5’-[(LNA/LNA*)2-4-(DNA/α-L-LNA)10-12-LNA/LNA*2-4-(DNA/RNA)]-3’的类型。
另一个特别令人感兴趣的设计是其中靶结合区具有式5’-[LNA2-7-(DNA)4-14-LNA2-7-(DNA/RNA)]-3’，例如5’-[LNA2-5-(DNA)7-12-LNA2-5-(DNA/RNA)]-3’，特别是5’-[LNA2-4-(DNA)10-12-LNA2-4(DNA/RNA)]-3’。另一个特别令人感兴趣的设计是其中靶结合区具有式5’-[LNA2-7-(DNA)5-14-LNA2-7-(RNA)]-3’或5’-[LNA2-7-(DNA)5-14-LNA2-7-(DNA)]-3’或5’-[LNA2-7-(DNA/α-L-LNA)5-14-LNA2-7-(RNA)]-3’或5’-[LNA2-7-(DNA/α-L-LNA)5-14-LNA2-7-(DNA)]-3’，例如，5’-[LNA2-5-(DNA)7-12-LNA2-5-(RNA)]-3’或5’-[LNA2-5-(DNA)7-12-LNA2-5-(DNA)]-3’或5’-[LNA2-5-(DNA/α-L-LNA)7-12-LNA2-5-(RNA)]-3’或5’-[LNA2-5-(DNA/α-L-LNA)7-12-LNA2-5-(DNA)]-3’，特别是5’-[LNA2-4(DNA)10-12-LNA2-4-(RNA)]-3’或5’-[LNA2-4-(DNA)10-12-LNA2-4-(DNA)]-3’或5’-[LNA2-4-(DNA/α-L-LNA)10-12-LNA2-4-(RNA)]-3’或5’-[LNA2-4-(DNA/α-L-LNA)10-12-LNA2-4-(DNA)]-3’的类型。
在另一个实施方案中，靶结合区具有式5’-[(DNA/RNA)-(LNA/LNA*)2-7-(DNA/RNA/LNA*)4-14-LNA/LNA*2-7-(DNA/RNA)]-3’，特别是式5’-[(DNA/RNA)-LNA2-7-(DNA)4-14-LNA2-7-(DNA/RNA)]-3’，例如5’-[(DNA/RNA)-(LNA/LNA*)2-5-(DNA/RNA/LNA*)7-12-LNA/LNA*2-5-(DNA/RNA)]-3’，特别是式5’-[(DNA/RNA)-LNA2-5-(DNA)7-12-LNA2-5-(DNA/RNA)]-3’或5’-[(DNA/RNA)-(LNA/LNA*)2-4-(DNA/RNA/LNA*)10-12-LNA/LNA*2-4-(DNA/RNA)]-3’，特别是式5’-[(DNA/RNA)-LNA2-4-(DNA)10-12-LNA2-4-(DNA/RNA)]-3’。另一个特别令人感兴趣的设计是其中靶结合区具有式5’-[(DNA)-LNA2-7-(DNA)5-14-LNA2-7-(RNA)]-3’或5’-[(DNA)-LNA2-7-(DNA)5-14-LNA2-7-(DNA)]-3’或5’-[(DNA)-LNA2-7-(DNA/α-L-LNA)5-14-LNA2-7-(RNA)]-3’或5’-[(DNA)-LNA2-7-(DNA/α-L-LNA)5-14-LNA2-7-(DNA)]-3’或5’-[(RNA)-LNA2-7-(DNA)5-14-LNA2-7-(RNA)]-3’或5’-[(RNA)-LNA2-7-(DNA)5-14-LNA2-7-(DNA)]-3’或5’-[(RNA)-LNA2-7-(DNA/α-L-LNA)5-14-LNA2-7-(RNA)]-3’或5’-[(RNA)-LNA2-7-(DNA/α-L-LNA)5-14-LNA2-7-(DNA)]-3’，例如5’-[(DNA)-LNA2-5-(DNA)7-12-LNA2-5-(RNA)]-3’或5’-[(DNA)-LNA2-5-(DNA)7-12-LNA2-5-(DNA)]-3’或5’-[(DNA)-LNA2-5-(DNA/α-L-LNA)7-12-LNA2-5-(RNA)]-3’或5’-[(DNA)-LNA2-5-(DNA/α-L-LNA)7-12-LNA2-5-(DNA)]-3’或5’-[(RNA)-LNA2-5-(DNA)7-12-LNA2-5-(RNA)]-3’或5’-[(RNA)-LNA2-5-(DNA)7-12-LNA2-5-(DNA)]-3’或5’-[(RNA)-LNA2-5-(DNA/α-L-LNA)7-12-LNA2-5-(RNA)]-3’或5’-[(RNA)-LNA2-5-(DNA/α-L-LNA)7-12-LNA2-5-(DNA)]-3’，特别是5’-[(DNA)-LNA2-4-(DNA)10-12-LNA2-4-(RNA)]-3’或5’-[(DNA)-LNA2-4-(DNA)10-12-LNA2-4-(DNA)]-3’或5’-[(DNA)-LNA2-4-(DNA/α-L-LNA)10-12-LNA2-4-(RNA)]-3’或5’-[(DNA)-LNA2-4-(DNA/α-L-LNA)10-12-LNA2-4-(DNA)]-3’或5’-[(RNA)-LNA2-4-(DNA)10-12-LNA2-4-(RNA)]-3’或5’-[(RNA)-LNA2-4-(DNA)10-12-LNA2-4-(DNA)]-3’或5’-[(RNA)-LNA2-4-(DNA/α-L-LNA)10-12-LNA2-4-(RNA)]-3’或5’-[(RNA)-LNA2-4-(DNA/α-L-LNA)10-12-LNA2-4-(DNA)]-3’的类型。
在另一个实施方案中，靶结合区具有式5’-[(DNA/RNA)-(LNA/LNA*)2-7-(DNA/RNA/LNA*)4-14-LNA/LNA*2-7]-3’，特别是式5’-[(DNA/RNA)-LNA2-7-(DNA)4-14-LNA2-7]-3’，例如5’-[(DNA/RNA)-(LNA/LNA*)2-5-(DNA/RNA/LNA*)7-12-LNA/LNA*2-5]-3’，特别是式5’-[(DNA/RNA)-LNA2-5-(DNA)7-12-LNA2-5]-3’或5’-[(DNA/RNA)-(LNA/LNA*)2-4-(DNA/RNA/LNA*)10-12-LNA/LNA*2-4]-3’，特别是式5’-[(DNA/RNA)-LNA2-4-(DNA)10-12-LNA2-4]-3’。另一个特别令人感兴趣的设计是其中靶结合区具有式5’-[(DNA)-LNA2-7-(DNA)5-14-LNA2-7]-3’或5’-[(DNA)-LNA2-7-(DNA/α-L-LNA)5-14-LNA2-7]-3’或5’-[(RNA)-LNA2-7-(DNA)5-14-LNA2-7]-3’或5’-[(RNA)-LNA2-7-(DNA/α-L-LNA)5-14-LNA2-7]-3’，例如5’-[(DNA)-LNA2-5-(DNA)7-12-LNA2-5]-3’或5’-[(DNA)-LNA2-5-(DNA/α-L-LNA)7-12-LNA2-5]-3或5’-[(RNA)-LNA2-5-(DNA)7-12-LNA2-5]-3’或5’-[(RNA)-LNA2-5-(DNA/α-L-LNA)7-12-LNA2-5]-3’，特别是5’-[(DNA)-LNA2-4-(DNA)10-12-LNA2-4]-3’或5’-[(DNA)-LNA2-4-(DNA/α-L-LNA)10-12-LNA2-4]-3’或5’-[(RNA)-LNA2-4-(DNA)10-12-LNA2-4]-3’或5’-[(RNA)-LNA2-4-(DNA/α-L-LNA)10-12-LNA2-4]-3’。
在另一个实施方案中，靶结合区具有式5’-[(LNA/LNA*)2-7-(DNA/RNA/LNA*)4-14-LNA/LNA*2-7]-3’，特别是式5’-[LNA2-7-(DNA)4-14-LNA2-7]-3’，例如5’-[(LNA/LNA*)2-5-(DNA/RNA/LNA*)7-12-LNA/LNA*2-5]-3’，特别是式5’-[(LNA2-5-(DNA)7-12-LNA2-5]-3’或5’-[(LNA/LNA*)2-4-(DNA/RNA/LNA*)10-12-LNA/LNA*2-4]-3’，特别是式5’-[LNA2-4-(DNA)10-12-LNA2-4]-3’。另一个特别令人感兴趣的设计是其中靶结合区具有式5’-[LNA2-7-(DNA)5-14-LNA2-7]-3’或5’-[LNA2-7-(DNA/α-L-LNA)5-14-LNA2-7]-3’，例如5’-[LNA2-5-(DNA)7-12-LNA2-5]-3’或5’-[LNA2-5-(DNA/α-L-LNA)7-12-LNA2-5]-3’，特别是5’-[LNA2-4-(DNA)10-12-LNA2-4]-3’或5’-[LNA2-4-(DNA/α-L-LNA)10-12-LNA2-4]-3的类型。
在一些实施方案中，寡聚化合物还包含LNA类似物核苷酸(本文中命名为“LNA*”)。特别地，靶结合区中核苷碱基的10-100％或0-90％，例如10-50％是LNA类似物核苷酸(“LNA*”)的核苷碱基。
在其变通方案中，靶结合区具有式5’-[(LNA*)2-7-(DNA/RNA/LNA*)4-14-LNA*2-7-(DNA/RNA)]-3’，特别是式5’-[LNA*2-7-(DNA)4-14-LNA*2-7-(DNA/RNA)]-3’，例如5’-[(LNA*)2-5-(DNA/RNA/LNA*)7-12-LNA*2-5-(DNA/RNA)]-3’，特别是5’-[(LNA*)2-5-(DNA)7-12-LNA*2-5-(DNA/RNA)]-3’，或5’-[(LNA*)2-4-(DNA/RNA/LNA*)10-12-LNA*2-4-(DNA/RNA)]-3’，特别是5’-[LNA*2-4-(DNA)10-12-LNA*2-4-(DNA/RNA)]-3’。
如上所述，寡聚化合物应当与靶mRNA的指定区域特异性杂交。更具体地，该靶结合区与和其特异性杂交的人Bcl-2mRNA上第1459(5’)位至第1476(3’)位碱基位置之间的区域部分互补，其中可能有至多2个非互补核苷碱基。
本发明的上下文中的术语“互补”指靶mRNA相关区域的核苷酸和靶结合区的核苷酸之间准确配对的能力。例如，如果靶mRNA的某个位点的核苷酸能够与靶结合区的核苷酸氢键键合，那么，认为该靶mRNA和该靶结合区在这个位点彼此互补。(从上面又可以理解，该靶结合区是对应于人Bcl-2mRNA的指定区域或其短片段)。术语“非互补核苷碱基”自然指具体核苷酸的核苷碱基不互补的情形。
在一个实施方案中，该靶结合区与和其特异性杂交的人Bcl-2mRNA上第1459(5’)位至第1476(3’)位碱基位置之间的区域部分互补。
该实施方案中优选化合物的例子是包含选自SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8(和35)、12、13、14、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51和52、特别是SEQ ID NO：8(和35)的靶结合区的那些化合物。在一个变通方案中，该靶结合区是SEQ ID NO：8。在另一个变通方案中，该靶结合区是SEQ ID NO：35。
更优选的化合物是选自SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8(和35)、12、13、14、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51和52的那些化合物，特别是SEQ ID NO：8(和35)。在一个变通方案中，该化合物是SEQ ID NO：8。在另一个变通方案中，该化合物是SEQ ID NO：35。
在另一个实施方案中，该靶结合区除了l-2个非互补核苷碱基外，尤其是除了1个非互补核苷碱基外，与和其特异性杂交的人Bcl-2mRNA上第1459(5’)位至第1476(3’)位碱基位置之间的区域部分互补。因此，允许有至多两个错配(非互补核苷碱基)，但是通常仅引入一个错配。这种错配最常存在于寡聚化合物的DNA/RNA/LNA*区段内，例如存在于具有包含式5’-[(LNA/LNA*)2-7- (DNA/RNA/ LNA*) 4-14-LNA/LNA*2-7-(DNA/RNA)]-3’区段的靶结合区之化合物的DNA/RNA/LNA*区段中。
在其一个变通方案中，该靶结合区包含GCGXGCGC亚序列，其中X不是T(胸腺嘧啶)。具体地，X是C(胞嘧啶)或X是A(腺嘌呤)或X是G(鸟嘌呤)。
在其另一个变通方案中，该靶结合区包含CCCAXCGT亚序列，其中X不是G(鸟嘌呤)。具体地，X是A(腺嘌呤)或X是T(胸腺嘧啶)或X是C(胞嘧啶)。
在其另一个变通方案中，该靶结合区包含CAGXGTG亚序列，其中X不是C(胞嘧啶)。具体地，X是A(腺嘌呤)或X是T(胸腺嘧啶)或X是G(鸟嘌呤)。
在其另一个变通方案中，该靶结合区包含AGCXTGC亚序列，其中X不是G(鸟嘌呤)。具体地，X是A(腺嘌呤)或X是T(胸腺嘧啶)或X是C(胞嘧啶)。
该实施方案中优选化合物的例子是包含选自SEQ ID NO：15(和29)、17、18、19、21、22、23、24、25、26、27、28、53、54和55的靶结合区、特别是SEQ ID NO：15(和29)的那些化合物。在一个变通方案中，该靶结合区是SEQ ID NO：15。在另一个变通方案中，该靶结合区是SEQ ID NO：29。
更优选的化合物是选自SEQ ID NO：15(和29)、17、18、19、21、22、23、24、25、26、27、28、53、54和55的那些化合物，特别是SEQ ID NO：15(和29)。在一个变通方案中，该化合物是SEQ IDNO：15。在另一个变通方案中，该化合物是SEQ ID NO：29。
这就是说，现在相信对于期望的生物学效果而言，寡聚化合物SEQID NO：8(以及35)和寡聚化合物SEQ ID NO：15(以及29)相比于奥利默森钠(SEQ ID NO：56，参比)有显著的优势，参见实施例。
本发明人已揭示相比于同样剂量的SEQ ID NO：56(参比)，当腹膜内施用7mg/kg的SEQ ID NO：8计14时，在黑素瘤518A2 scid小鼠异种移植物模型中体内肿瘤重量有进一步减少，参见图11。当SEQID NO：8以比SEQ ID NO：56(参比)低7倍的剂量施用时，其显示相同的抗肿瘤活性。
在图13中显示了在单剂量静脉内施用SEQ ID NO：15(25mg/kg)后，其在来自NMRI小鼠的肝脏和肾脏中的水平。发现活性化合物SEQID NO：15在肝脏和肾脏中的半寿期(T1/2)均是大约3天。这表明SEQID NO：15的最佳生物剂量的给药方案可以比连续输注和每天给药的频率低。
本发明人已证明，相比于盐水对照，在前列腺PC3无胸腺裸鼠异种移植物模型中第7-15天中的每天或第8、11、13、15、18、20天使用SEQ ID NO：15的体内肿瘤体积的有效减小。该化合物以10mg/kg腹膜内施用14天。处理后观察肿瘤生长8天。
这就是说，本发明的寡聚化合物在分布的合适体内谱图及下调Bcl-2方面具有合适的体内模式，从而具有与各种Bcl-2相关疾病、特别是癌症的治疗相关性。
寡聚化合物的制备
本发明的寡聚化合物可以按照实施例1和2及WO 99/14226、WO00/56746、WO00/56748、WO 00/66604、WO 00/125248、WO02/28875、WO2002/094250、PCT/DK02/00488和Herdewijin，P.，Oligonucleotide Synthesis，Methods and Applications，第127-145页，Humana Press，Totowa，New Jersey，2005的描述制备。因此，本发明的寡聚化合物可以使用有机化学领域内的普通技术人员众所周知的核酸化学聚合技术来制备。一般而言，使用亚磷酸胺方法(S.L.Beaucage和R.P.Iyer，Tetrahedron，1993，49，6123；S.L.Beaucage和R.P.Iyer，Tetrahedron，1992，48，2223)的标准寡聚反应循环，但是也可以使用例如H-膦酸酯化学、磷酸三酯化学法。
对于本发明的一些单体，使用了较长的偶联时间，和/或与新试剂的反复偶联，和/或更浓缩的偶联试剂。
所使用的亚磷酸胺以＞95％的令人满意的分步偶联产率进行偶联。通过例如将用于合成磷酸二酯寡聚物的常规碘/吡啶/H2O氧化换成使用ADTT试剂(苍耳烷氢化物(在体积比为9∶1的乙腈∶吡啶中0.01M))的氧化，进行磷酸盐的硫醇化。也包括其他硫醇化试剂，例如Beaucage。有效地合成了该硫代磷酸酯LNA寡聚物，分步偶联产率＞＝98％。
使用亚磷酸胺步骤也有效地合成了β-D-氨基-LNA、β-D-硫代-LNA寡核苷酸、α-L-LNA和β-D-甲基氨基-LNA寡核苷酸，分步偶联产率≥98％。
使用一次性反相纯化柱和/或反相HPLC和/或通过乙醇或丁醇的沉淀进行LNA寡聚化合物的纯化。毛细管凝胶电泳、反相HPLC、MALDI-MS和ESI-MS用于证实合成的寡核苷酸的纯度。此外，特别令人感兴趣的是具有固定于其上的任选核苷碱基保护的LNA和任选5’-OH保护的LNA的固体支持物作为用于合成含有LNA的寡聚化合物的物质，其中LNA核苷酸包括在3’末端。在这种情况下，该固体支持物优选是CPG，例如可获得(市售)的CPG物质或聚苯乙烯，其上通过供应商针对该具体物质规定的条件，连接上3’-官能化的、任选核苷碱基保护的LNA或3’-官能化的、任选5’-OH保护的LNA。盐
本发明的寡聚化合物可以多种药学上可接受的盐使用。本文使用的该术语是指保持此处鉴别的化合物的期望生物活性并显示最小的不期望的毒理作用的盐。这类盐的非限定性实例可由有机氨基酸和碱加成盐形成，所述碱加成盐与金属阳离子例如锌、钙、铋、钡、镁、铝、铜、钴、镍、镉、钠、钾等，或由氨、N，N-二苄基亚乙二胺、D-葡糖胺、四乙铵或乙二胺形成；或(c)(a)和(b)的组合，例如单宁酸锌盐等。
这类盐例如是由具有酸性基团、例如羧基基团、磷酸二酯基团或硫代磷酸酯基团的本发明化合物形成的，例如与合适碱形成的盐。这些盐包括，例如源自元素周期表第Ia、Ib、IIa和IIB族金属的无毒金属盐，特别是合适的碱金属盐，例如锂盐、钠盐或钾盐，或碱土金属盐，例如镁盐或钙盐。它们进一步包括锌盐和铵盐，还包括和适合的有机胺形成的盐，例如未取代的或羟基取代的一、二或三烷基胺，特别是一、二或三烷基胺，或和季铵化合物，例如和N-甲基-N-乙基胺、二乙胺、三乙胺、单、双或三-(2-羟基-低级烷基)胺，例如单、双或三-(2-羟乙基)胺、2-羟基-叔丁基胺或三(羟甲基)甲胺、N，N-二低级烷基-N-(羟基-低级烷基)胺，例如N，N-二甲基-N-(2-羟乙基)胺或三-(2-羟乙基)胺或N-甲基-D-葡糖胺，或例如四丁基铵盐的季铵化合物形成的盐。优选锂盐、钠盐、镁盐、锌盐或钾盐，特别优选钠盐。
具有碱性基团例如氨基或亚氨基的本发明化合物可以形成酸加成盐，例如和无机酸、例如和诸如盐酸的氢卤酸、硫酸或磷酸形成盐，或和有机羧酸、磺酸(sulfonic acid)、硫代酸(sulfo acid)或膦酸或N-取代的氨基磺酸，例如乙酸、丙酸、乙醇酸、琥珀酸、马来酸、羟基马来酸、甲基马来酸、富马酸、苹果酸、酒石酸、葡糖酸、葡糖二酸、葡糖醛酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、水杨酸、4-氨基水杨酸、2-苯氧基苯甲酸、2-乙氧基苯甲酸、embonic酸、烟酸或异烟酸形成盐，以及和氨基酸形成盐，例如和氨基酸形成盐，且还可和甲磺酸、乙磺酸、2-羟基甲磺酸、乙烷-1，2-二磺酸、苯二磺酸、4-甲基苯二磺酸、萘磺酸、2-或3-磷酸甘油酸、葡糖磷酸或N-环己氨基磺酸(和形成甜蜜素(cyclamate))形成盐，或和其他酸性有机化合物例如抗坏血酸形成盐。
具有酸性和碱性基团二者的本发明化合物也可以形成内盐。例如苦味酸盐或高氯酸盐的药学不合适盐可用于分离和纯化。
只有在正确使用时无毒的药学上允许的盐才被用于治疗目的，因此是优选的盐。
缀合物
本发明另一方面涉及包含本文定义的化合物的缀合物，所述化合物上共价连接了至少一个非核苷酸或非多核苷酸部分。
在本发明的上下文中，术语“缀合物”旨在表示异质分子(heterogenous molecule)，其通过本文描述的寡聚化合物(即，包含核苷或核苷类似物序列的化合物)和一个或多个非核苷酸或非多核苷酸部分的共价连接而形成。
因此，该寡聚化合物可以例如是缀合的，或与非核苷酸或非多核苷酸部分形成嵌合体，所述非核苷酸或非多核苷酸部分包括肽核酸(PNA)、蛋白质(例如靶蛋白质的抗体)、大分子、低分子量药物、脂肪酸链、糖残基、糖蛋白、聚合物(例如聚乙二醇)、胶束形成基团、抗体、糖类、受体结合基团、甾族化合物例如胆固醇、多肽、插入剂例如吖啶衍生物、长链醇、树枝状聚合物(dendrimer)、磷脂和其他亲油基或它们的组合等，该寡聚化合物可以以二聚化或树枝状结构排列。本发明的化合物或缀合物也可与活性药物缀合或进一步缀合，所述活性药物例如阿司匹林、ibuprofen、磺胺药、抗糖尿病的制剂、抗菌剂、化疗化合物或抗生素。
这种方式的缀合为本发明的寡聚化合物带来了药物动力学特征方面的有益性质。特别地，这种方式的缀合实现了增加的细胞摄入。
在一个实施方案中，本发明的寡聚化合物连接到配体上形成缀合物，所述配体是为了增加缀合物相对于反义寡核苷酸的细胞摄入。该缀合可出现在末端位置5’/3’-OH，但是该配体也可以出现在糖和/或碱基上。缀合物/配体的实例是胆固醇部分，Soutschek等人，Nature，432，173-178(2004)，双链体插入剂例如吖啶、聚-L-赖氨酸、以一个或多个核酸酶-抗性连接基团例如一硫代磷酸、运铁蛋白复合体(Wagner等人，Pro.Natl.美国87，3410-3414(1990))、叶酸衍生物(Low等人，美国专利5,108,921号，也参见Leamon等人，Pro.Natl Acad.Sci.88，5572(1991))等的“封端”。
前药
在本发明的一些实施方案中，寡聚化合物可以是前药的形式。实际上，寡核苷酸是带负电荷的离子。由于细胞膜的亲脂性，相比于中性或亲脂性对应物，寡核苷酸的细胞摄入有所减少。该极性“障碍”通过使用前药方法可以避免(见，例如Crook，R.M.(1998)在Crook，S.T.，Antisense Research and Application.Springer-Verlag，Berlin，德国，第131卷，第103-140页)。在该方法中，寡聚化合物以被保护的方式制备，使得该寡聚化合物在施用时是中性的。这些保护基团被设计成当寡聚化合物被细胞摄入时，它们可以被除去。这类保护基团的实例是S-乙酰硫乙基(SATE)或S-新戊酰基硫乙基(叔丁基-SATE)。这些保护基团是核酸酶抗性，可以在细胞内选择性除去。
治疗原理
本领域的技术人员可以理解的是，本发明的LNA寡聚化合物基于多种不同的机理可用于抗击Bcl-2相关的疾病，这属于本发明的精神。
例如，LNA寡聚化合物可设计成反义抑制剂，其是单链核酸，通过在mRNA水平上进行干预而防止生成致病蛋白质。同时，它们可设计成免疫调节剂寡核苷酸(IMO)、核酶或是反义寡核苷酸的oligozyme，它们除了含有一个或多个靶结合区之外还含有降解靶mRNA(oligozyme)的催化活性，或含有募集降解靶mRNA(oligozyme)的内源酶(RNA酶P)的外部引导序列(EGS)。
同样，LNA寡聚化合物可被设计成siRNA，其是小的双链RNA分子，可被细胞利用，通过至今仍了解甚少的“反义样”机制沉默特定内源或外源基因。
寡聚化合物也可被设计成Aptamer(及其变异体，称为spiegelmer)，其是通过分子内氢键结合而形成三维结构，使得它们能够以高亲和性和特异性结合并阻断它们的生物靶的核酸。同样，LNA寡聚化合物可被设计成小的双链核酸形式的Decoy，其通过选择性封闭它们的DNA结合位点而防止细胞转录因子反式激活它们的靶基因。
另外，LNA寡聚化合物可被设计成Chimeraplast，其是能够和靶基因序列特异性配对并将其改变的小的单链核酸。因此，含有利用该机理的寡聚化合物的LNA特别可用于治疗由于Bcl-2基因中的突变导致的Bcl-2相关疾病。
最后，LNA寡聚化合物可被设计成TFO(形成三链体的寡核苷酸)，其是与双链DNA结合并通过RNA转录水平上的干预而防止生成致病蛋白质的核酸。就LNA寡聚化合物可以发挥其治疗作用的上述原理而言，本发明的靶是Bcl-2mRNA。
该LNA寡聚化合物与包含翻译起始位点的人Bcl-2mRNA的部分，即编码人Bcl-2蛋白的人Bcl-2mRNA上第1459(5’)位至第1476(3’)位碱基之间的区域相杂交。
本领域的技术人员可以理解，优选的LNA寡聚化合物是与人Bcl-2mRNA的部分杂交的那些，所述人Bcl-2mRNA的序列在不相关基因的转录物中不常出现，从而可以维持治疗的特异性。
本发明的寡聚化合物被设计成与靶充分互补，以便提供期望的临床反应，例如该寡聚化合物必须与它的靶以足够的强度和特异性相结合，以获得希望的效果。在一个实施方案中，所述LNA寡聚化合物被设计成也可调节不编码人Bcl-2蛋白的其他特异核酸。
优选本发明的寡聚化合物被设计成可避免分子内和分子间寡核苷酸杂交的形式。
反义药物
在本发明的一个实施方案中，LNA寡聚化合物以合适的反义药物形式呈递。有效和安全的反义药物的设计需要微调各种参数，例如效力/效能、亲和性/特异性、生物流体中的稳定性、细胞摄入、作用方式、药物动力学性质和毒性。
亲和性和特异性：具有氧亚甲基2’-O，4’-C键的LNA(β-D-氧基-LNA)显示出对DNA和RNA靶序列的空前结合特性、同样，LNA的衍生物，例如氨基-、硫代-和α-L-氧基-LNA表现出对互补RNA和DNA的空前亲和性，而在硫代-LNA的情况下，其对RNA的亲和性甚至大于β-D-氧基-LNA。
除了这些显著的杂交特性外，LNA核苷酸还可以和DNA及RNA核苷酸以及其他核酸类似物例如2’-O-烷基改性的RNA单体混合并协同作用。同样的，本发明的寡核苷酸可完全由β-D-氧基-LNA核苷酸组成，或者它可以由β-D-氧基-LNA与DNA、RNA核苷酸或同代核酸类似物的任意组合组成，所述同代核酸类似物包括LNA衍生物，例如氨基-LNA、硫代-LNA和α-L-氧基-LNA。根据本发明，LNA对DNA和RNA靶序列的空前结合亲和性及其与DNA、RNA和一系列同代核酸类似物自由混合的能力对于研发有效和安全的反义药物有一系列重要影响。此外，含有LNA的寡核苷酸表现出优异的水溶性。
首先，在本发明的一个实施方案中，它能够将反义核苷酸的通常长度缩短相当多(例如从20-25mer缩短至12-16mer)而不损害药理学活性所需要的亲和性。由于寡核苷酸本身的特异性和其长度反相关，这种缩短将显著地增加反义化合物对其RNA靶的特异性。由于可得到人类基因组序列，并且对其基因的阐明快速进展，本发明的一个实施方案是在靶mRNA中鉴别尽可能短的特有序列。
在另一个实施方案中，使用LNA减小反义寡核苷酸的大小显著缩短了工艺过程并降低了费用，因此为反义治疗提供了基础，可以作为多种疾病的商业上有竞争力的治疗选择方案。
在另一个实施方案中，LNA的空前亲和性可用于充分提高寡聚化合物与其靶mRNA体内杂交的能力，因此，相对于其他化学物的情况而言，可显著降低鉴定活性化合物所需的时间和努力(工作)。
在另一个实施方案中，LNA的空前亲和性可用于提高反义寡核苷酸的效力，因此，能够研发相对于那些目前临床治疗中应用的化合物而言具有更加有益的治疗性质的化合物。
当设计为反义抑制剂时，本发明的寡核苷酸与靶核酸特异性及选择性结合，并调节其相关蛋白质的表达。优选地，相对于正常表达水平而言，这类调节引起至少10％至20％的表达抑制，更优选地，相对于正常表达水平而言，引起至少30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的抑制。
生物流体中的稳定性：本发明的一个实施方案包括将LNA核苷酸掺入标准的DNA或RNA寡核苷酸中来提高所得寡聚化合物在生物流体中的稳定性，例如通过增加对核酸酶(内切核酸酶和外切核酸酶)的抗性。稳定性的程度将依赖于所使用的LNA核苷酸的数目、它们在寡核苷酸中的位置和所使用的LNA核苷酸的类型。相比于DNA和硫代磷酸酯，稳定寡核苷酸抗核酸水解降解的能力的顺序如下：DNA＜＜硫代磷酸酯～氧基-LNA＜α-L-LNA＜氨基-LNA＜硫代-LNA。
既然LNA与标准DNA合成兼容并可与许多同代核酸类似物自由混合，那么可通过掺入表现增加的核酸酶稳定性的其他类似物或通过使用核酸酶抗性核苷间键，例如一硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯和膦酸甲酯键等，可以按照本发明进一步增强LNA-寡聚化合物的核酸酶抗性。
作用方式：本发明的反义化合物可通过多种机理发挥他们的治疗作用，并能够与多个相同的化合物组合。在一个方案中，寡核苷酸与其靶(前mRNA或mRNA)的结合可防止靶发挥正确功能所需要的其他因子(蛋白质、其他核酸等)的结合，即通过位阻实现。例如，反义寡核苷酸可与对于识别和结合剪接、多聚腺苷酸化、细胞转运、RNA中的核苷转录后的修饰、5’-末端加帽、翻译等重要的前mRNA或mRNA中的序列基序结合。在前mRNA剪接的情况下，寡核苷酸及其靶间的相互作用结果可以是抑制不期望的蛋白质的表达、编码希望的蛋白质的可变剪接mRNA的产生，或两者。
在另一个实施方案中，寡核苷酸与其靶的结合通过对核糖体的机制产生物理阻碍而使翻译过程不能进行，即翻译终止。
在另一个实施方案中，寡核苷酸与其靶的结合干扰了RNA产生对于其正确功能很重要的二级和更高级结构的能力即结构干扰。例如，寡核苷酸可干扰在多种功能中具有重要作用的茎-环结构形成，这种重要作用例如为RNA提供额外的稳定性或对不同的蛋白质使用基本的识别基序。
在另一个实施方案中，寡核苷酸与其靶的结合通过募集降解mRNA的细胞酶而使靶对于其他的细胞代谢过程失活。例如，寡核苷酸可包含能够募集降解DNA/RNA双链体中的RNA部分的核糖核酸酶H(RNA酶H)的核苷区段。同样，寡核苷酸可包含募集双链RNA酶(例如RNA酶III)的区段，或包含募集降解靶mRNA的内源酶(RNA酶P)的外部指导序列(EGS)。同样，寡核苷酸可包含显示RNA酶催化活性的序列基序，或者可在寡核苷酸上连接一些部分，当通过杂交事件使其与靶接近时，它能够使该靶不具有代谢活性。
这就是说，gapmer的缺口大小，即该亚片段被定义为具有4至14个核苷碱基的长度，但相信在8至13个核苷酸碱基范围内的长度，例如10至12个核苷酸碱基，特别是11个核苷酸碱基可产生特别有用的gapmer，参见表1。
药物动力学性质：反义寡核苷酸的临床效力取决于它们的药物动力学，例如吸收、分布、细胞摄入、代谢和排泄。反之，这些参数由寡核苷酸的基本化学性质及其大小和三维结构所充分控制。
如前所述，本发明的LNA不是具有单一的，而是多个相关的化学性质，其虽然在分子上不同，但对互补DNA和RNA均显示极好的亲和性。因此，LNA家族的化学性质特别适合研发具有定制的药物动力学性质的本发明寡聚物，其可利用LNA的高亲和性来调节活性化合物的大小，或利用不同的LNA化学性质来调节活性化合物的精确分子组成。在后一种情况下，例如，相比于氧基-LNA，氨基-LNA的使用将改变寡聚化合物的整体电荷并影响摄入和分布行为。同样，使用硫代-LNA代替氧基-LNA将增加寡核苷酸的亲脂性，并因此影响其通过亲脂性屏障(例如细胞膜)的能力。
另外，调节本发明LNA寡核苷酸的药物动力学性质可通过与多种不同部分的连接来达到。例如，可以通过将诸如脂类部分连接到寡核苷酸上来增强寡核苷酸通过细胞膜的能力，所述脂类部分是例如胆固醇部分、硫醚、脂族链、磷脂或多胺。同样，可通过将与膜内的分子相互作用、介导向细胞质内的转运的部分和寡核苷酸缀合来增加LNA寡核苷酸在细胞内的摄入。
药物动力学性质
根据本发明，药物动力学性质可用增加寡聚物摄入、提高生物稳定性，例如提高寡聚物对降解的抗性，和/或增加寡核苷酸与靶序列例如mRNA序列的杂交性质中的特异性和亲和性的基团进行改善。
毒性
与反义寡聚物相关的毒性主要有两类：序列依赖性毒性，包括靶结合区，以及非序列依赖性、种类相关性(class-related)毒性。除了与通过天然CpG序列基序的免疫刺激相关的情况外，在反义寡核苷酸的研发中最为突出的毒性与序列无关，例如和寡核苷酸的化学性质和剂量、施用方式、频率和持续时间相关。特别是，硫代磷酸酯类的寡核苷酸已充分表征，并发现可引起许多副作用，例如补体激活、延长PTT(部分凝血激酶时间(partial thromboplastin time))、血小板减少、肝毒性(肝酶的增加)、脾肿大和网状内皮细胞增生。
如前所述，LNA家族的化学性质提供了空前的亲和性、极高的生物稳定性和调节寡核苷酸的精确分子组成的能力。在本发明的一个实施方案中，含有LNA的化合物使得能够开发出结合了高效力与少量(如果有的话)硫代磷酸酯键、并因此很可能相比于同代的反义化合物而言表现出更好的功效和安全性的寡核苷酸。
药物组合物
根据上文，应该理解的是本发明也涉及包含寡聚化合物或本文定义的缀合物及药物可接受载体的药物组合物。
药物组合物制备的指导可见于Alfonso R.Gennaro的“Remington：The Science and Practice of Pharmacy”和下文中。
药物可接受载体，例如粘合剂和佐剂，是药物组合物的一部分。胶囊剂、片剂和丸剂等可例如含有下列化合物：微晶纤维素、作为粘合剂的树胶或明胶、作为赋形剂的淀粉或乳糖、作为润滑剂的硬脂酸盐(酯)、各种甜味剂或增香剂。对于胶囊剂，单位剂型可含有液体载体，例如脂肪油。同样，糖包衣或肠剂(enteric agent)可以是该单位剂型的一部分。该药物组合物也可以是活性药物成分(包括寡聚化合物)的乳剂和形成微胶粒乳剂的脂类。
本发明的寡聚化合物可以和不损害期望活性的任何物质混合，或和补充期望活性的物质混合。这些物质可包含其他药物，包括其他核苷化合物。
对于静脉内、皮下或局部施用，该制剂可包括无菌稀释剂、缓冲剂、张力调节剂和抗菌剂。活性化合物可以和载体一起制备，该载体可以起到保护作用，防止降解或从机体直接排出，所述载体包括具有受控释放性质的植入物或微胶囊。对于静脉内施用，优选的载体是生理盐水或磷酸盐缓冲盐水。
优选地，寡聚化合物以足以向患者投递治疗有效量而在该被治疗患者中不产生严重副作用的量包括在单位制剂中，例如在药物可接受载体或稀释剂中。
该药物组合物的优选实施方案中，寡聚化合物被配制在水性载体中，特别是在含有保持pH在4.0-8.5的范围内，并具有20-2000mM离子强度的缓冲液的水性载体中。
术语“水性载体”是指所讨论的药物组合物是液体形式，并且该液体载体主要由水组成，即至少80％(w/w)、或至少90％(w/w)、或甚至至少95％(w/w)的载体由水组成。也可以使用其他液体成分，例如乙醇、DMSO、乙二醇等。
该水性载体优选包含保持pH在4.0-8.5范围内的缓冲液。优选地，该缓冲液将保持pH在5.0-8.0的范围内，例如在6.0-7.5的范围内。
药物组合物的离子强度/张力也是重要的。因此，液体药物组合物一般具有20-2000mM范围内的离子强度，例如在50-1500mM的范围内，或者在100-1000mM的范围内。
在一个实施方案中，该液体药物组合物包含本文定义的在水性载体中的寡聚化合物；并且所述水性载体包含保持pH在4.0-8.5的范围内，并具有20-2000mM离子强度的缓冲液。
在另一个实施方案中，该液体药物组合物包含在水性载体中的缀合物；所述缀合物由本文定义的寡聚化合物和至少一种共价连接到所述寡聚化合物上的非核苷酸/非多核苷酸部分组成，并且所述水性载体包含保持pH在4.0-8.5范围内、并具有20-2000mM离子强度的缓冲液。
在这两个实施方案中，寡聚化合物的靶结合区优选选自SEQ IDNO：1、2、3、4、5、6、7、8(和35)、12、13、14、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51和52，更具体地，该靶结合区是SEQ ID NO：8(和35)，或者该寡聚化合物的靶结合区优选选自SEQ IDNO：15(和29)、17、18、19、21、22、23、24、25、26、27、28、53、54和55，更具体地，该靶结合区是SEQ ID NO：15(和29)。
如上所述，如果该化合物选自SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8(和35)、12、13、14、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51和52，特别是SEQ ID NO：8(和35)，或者如果该化合物选自SEQ ID NO：15(和29)、17、18、19、21、22、23、24、25、26、27、28、53、54和55，特别是SEQ ID NO：15(和29)是特别优选的。
在另一个实施方案中，该药物组合物也包含其他药剂，其选自化疗化合物、抗炎化合物、抗病毒化合物、细胞生长抑制化合物、抗血管生成化合物、抗增殖化合物、促凋亡(pro-apoptotic)化合物、信号转导调节剂和激酶抑制剂。
在特别令人感兴趣的变通方案中，该其他药剂是至少一种化疗化合物。这类化疗化合物的合适实例是选自下列的化合物：肾上腺皮质激素类药物，例如强的松、地塞米松(dexamethasone)或地塞米松(decadron)、六甲蜜胺(克瘤灵、hexamethylmelamine(HMM))、氨磷汀(氨磷汀针粉剂)、氨鲁米特(氨鲁米特片剂)、安吖啶(M-AMSA)、阿那曲唑(瑞宁得)、雄激素，例如睾酮、天冬酰胺酶(爱施巴)、卡介苗、比卡鲁氨(康士德)、博来霉素(硫酸博来霉素)、白消安(马利兰)、碳铂(伯尔定)、卡莫斯汀(BCNU、BiCNU)、苯丁酸氮芥(留可然)、氯脱氧腺嘌呤(2-CDA、克拉屈滨、leustatin)、顺铂(platinol)、阿糖胞苷(cytarabine)、达卡包嗪(DTIC)、放线霉素D(actinomycin-D、cosmegen)、柔红霉素(盐酸柔红霉素)、多西他赛(泰索帝)、阿霉素(adriomycin)、表柔比星、雌莫司汀(emcyt)、雌激素，例如己烯雌酸(DES)、etopside(VP-16、依托泊甙、凡毕复)、氟达拉滨(fludara)、氟他胺(eulexin)；5-FUDR(氟尿苷)、5-氟尿嘧啶(5-FU)、吉西他滨(健择)、戈舍瑞林(zodalex)、曲妥单抗(司徒曼布)、羟基脲(hydrea)、依达比星(盐酸依达比星)、异环磷酰胺、IL-2(重组白细胞介素-2、阿地白介素)、干扰素α(intron A、roferon A)、依立替康(camptosar)、醋酸亮丙瑞林(亮丙瑞林)、左旋咪唑(ergamisole)、洛莫司汀(CCNU)、盐酸氮芥(mustargen、氮芥)、美法仑(爱克兰)、巯嘌呤(purinethol、6-MP)、氨甲蝶呤(mexate)、丝裂霉素-C(mutamucin)、米托蒽醌(novantrone)、奥曲肽(善宁)、脱氧助间型霉素(2-喷斯他丁、nipent)、普卡霉素(光辉霉素、mithracin)、prorocarbazine(盐酸甲基苄肼)、链脲霉素、他莫昔芬(诺瓦得士)、泰素(紫杉醇)、替尼泊苷(卫萌、VM-26)、噻替哌、托泊替康(盐酸拓扑替康)、维A酸(vesanoid、全反式维A酸)、长春碱(valban)、长春新碱(硫酸长春新碱)和长春瑞滨(诺维本)。在一个实施方案中，该化疗化合物选自氟达拉滨和例如泰素(taxol)、紫杉醇(paclitaxel)和多西他赛的紫杉烷类，特别是氟达拉滨。
在一个变通方案中，本发明提供药物组合物，其包含(a)一种或多种寡聚化合物及(b)一种或多种通过非反义机理起作用的其他化疗化合物。当与本发明的这些化合物一起使用时，这类化疗化合物可以单独使用(例如光辉霉素和寡核苷酸)、连续使用(例如，使用光辉霉素和寡核苷酸一段时间再使用另一种药剂和寡核苷酸)，或和一种或多种其他这类化疗化合物组合，或和放疗组合。本领域技术人员已知的所有化疗化合物包括那些上面清楚描述的那些化合物，都被引入本文，和本发明的化合物一起作为联合治疗。
在一个变通方案中，本发明提供药物组合物，其包含(a)一种或多种寡聚化合物及(b)一种或多种抗体化合物。也可在该组合中加入一种和多种化疗化合物。
在一个优选的实施方案中，该药物组合物和选自氟达拉滨和紫杉烷的化合物组合施用。
术语“紫杉烷化合物”是指包括紫杉醇(Taxol)、紫杉醇衍生物、多西他赛、泰索帝、改性的紫杉烷和紫杉烷类似物。紫杉醇(Taxol)是分离自西方(pacific)紫杉即短叶红豆杉(Taxus brevifolia)的树皮的二萜，并代表b具有紫杉烷环系的一类治疗剂。紫杉烷及其类似物已通过从10-去乙酰基浆果赤霉素III(获自红豆杉针叶和小枝的前体)通过部分合成及全合成得到制备。见Holton.，等人，J.Am.Chem.Soc.116：1597-1601(1994)和Nicolaou等人，Nature 367：630(1994)。已显示紫杉醇在几种人类肿瘤的临床治疗中具有疗效。见McGuire等人，Ann.Int.Med.11：237-279(1989)；Holmes等人，J.Natl.Cancer Inst.83：1797-1805(1991)；Kohn等人J.Natl.Cancer Inst.86：18-24(1994)；和Kohn等人，American Societyfor Clinical Oncology 12(1993)。改性的紫杉烷和紫杉烷类似物是那些具有带改性侧链的紫杉烷环的化合物。许多这些类似物具有改进的性质，例如比天然产生的紫杉醇更高的水溶性和稳定性。这些类似物是本领域技术人员已知的，并公开于例如美国专利第5,278,324号、5,272,171号、5,254,580、5,250,683号、5,248,796号和5,227,400号中，它们的公开内容在此全部引用作为参考。紫杉醇和taxotene可以通过WO93/18210、EP0 253 739、EP 0 253 739和WO92/09589中的方法制备，它们的公开内容在此全部引用作为参考。在具体的实施方案中，紫杉烷化合物是紫杉醇或多西紫杉醇。
一般而言，该组合物中化疗化合物(例如，氟达拉滨和/或紫杉烷化合物)和寡聚化合物的重量比在50∶1至1∶25的范围内，例如在25∶1至1∶25的范围内，或在10∶1至1∶25的范围内，或在1∶1至1∶25的范围内，或在50∶1至1∶10的范围内，或在1∶1到1∶50的范围内，或在25∶1至1∶10的范围内。
在一个实施方案中，药物组合物在药学可接受的载体中包含至少一种化疗化合物(例如，氟达拉滨和/或紫杉烷化合物)和本文定义的寡聚化合物，其中在所述组合物中该化疗化合物和该寡聚化合物的重量比在50∶1至1∶25的范围内。
在另一个实施方案中，药物组合物在药学可接受的载体中包含至少一种化疗化合物(例如，氟达拉滨和/或紫杉烷化合物)和缀合物，所述缀合物由本文定义的寡聚化合物和至少一种共价连接到所述寡聚化合物上的非核苷酸/非多核苷酸部分组成；并且其中在所述组合物中所述化疗化合物和该缀合物的寡聚化合物部分的重量比在50∶1至1∶25的范围内。在该实施方案的变通方案中，所述至少一种非核苷酸/非多核苷酸部分包含化疗化合物(例如，氟达拉滨或紫杉烷化合物)。
在这两个实施方案中，该寡聚化合物的靶结合区优选是选自SEQID NO：1、2、3、4、5、6、7、8(和35)、12、13、14、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51和52中的一种，特别地，该靶结合区是SEQ ID NO：8(和35)。或者该寡聚化合物的靶结合区优选是选自SEQ ID NO：15(和29)、17、18、19、21、22、23、24、25、26、27、28、53、54和55中的一种，特别地，该靶结合区是SEQID NO：15(和29)。
如上所述，如果该化合物选自SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8(和35)、12、13、14、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51和52，特别是SEQ ID NO：8(和35)，或者如果该化合物选自SEQ ID NO：15(和29)、17、18、19、21、22、23、24、25、26、27、28、53、54和55，特别是SEQ ID NO：15(和29)是特别优选的。
本发明的寡聚化合物也可与活性药物物质缀合，例如阿司匹林、布洛芬、磺胺药、抗糖尿病药物、抗菌药物或抗生素。
抗炎药物，包括、但不限于非甾族抗炎药物和皮质类固醇、抗病毒化合物及免疫调节药物，也包括在本发明的组合物中。两种或多种组合的化合物可以一起使用或依次使用。
在另一个实施方案中，本发明的药物组合物可以包含一种或多种靶向Bcl-2的寡聚化合物和一种或多种靶向第二核酸靶的其他反义化合物。两种或多种组合的化合物可以一起使用或依次使用。
另外，包含寡聚化合物的药物可以和放疗等组合使用。
优选的药物组合物
在一个实施方案中，本发明的药物组合物是在水性载体中包含10-30个核苷碱基长度的寡聚化合物的液体药物组合物，所述寡聚化合物包含与人Bcl-2mRNA上第1459(5’)位至第1476(3’)位碱基之间的区域可特异性杂交的靶结合区，所述靶结合区具有下式：
5′-[(DNA/RNA)0-1-(LNA/LNA*)2-7-(DNA/RNA/LNA*)4-14-(LNA/LNA*)2-7-(DNA/RNA)0-1]-3′
其中，“LNA”表示LNA核苷酸，“LNA*”表示LNA类似物核苷酸；并且所述靶结合区包含至少两个通过硫代磷酸酯基团(-O-P(O，S)-O-)连接的LNA核苷酸或LNA类似物核苷酸；并且所述水性载体包含保持pH在4.0-8.5的范围内，并具有20-2000mM离子强度的缓冲液。
在另一个实施方案中，本发明的药物组合物是在水性载体中包含缀合物的液体药物组合物，所述缀合物由10-30个核苷碱基长度的寡聚化合物和至少一种共价连接到所述化合物上的非核苷酸/非多核苷酸部分组成，所述寡聚化合物包含与人Bcl-2mRNA上第1459(5’)位至第1476(3’)位碱基之间的区域可特异性杂交的靶结合区，所述靶结合区具有下式：
5′-[(DNA/RNA)0-1-(LNA/LNA*)2-7-(DNA/RNA/LNA*)4-14-(LNA/LNA*)2-7-(DNA/RNA)0-1]-3′
其中，“LNA”表示LNA核苷酸，“LNA*”表示LNA类似物核苷酸；并且所述靶结合区包含至少两个通过硫代磷酸酯基团(-O-P(O，S)-O-)连接的LNA核苷酸或LNA类似物核苷酸；并且所述水性载体包含保持pH在4.0-8.5的范围内，并具有20-2000mM离子强度的缓冲液。
这种组合物优选进一步包含至少一种化疗化合物(例如，氟达拉滨和/或紫杉烷化合物)。如上所述，在所述组合物中该化疗化合物和该缀合物的LNA寡核苷酸部分的重量比在50∶1至1∶25的范围内。
在另一个实施方案中，本发明的药物组合物是在水性载体中包含至少一种化疗化合物(例如，氟达拉滨和/或紫杉烷化合物)和10-30个核苷碱基长度的寡聚化合物的药物组合物，所述寡聚化合物包含与人Bcl-2 mRNA上第1459(5’)位至第1476(3’)位碱基之间的区域可特异性杂交的靶结合区，所述靶结合区具有下式：
5′-[(DNA/RNA)0-1-(LNA/LNA*)2-7-(DNA/RNA/LNA*)4-14-(LNA/LNA*)2-7-(DNA/RNA)0-1]-3′
其中，“LNA”表示LNA核苷酸，“LNA*”表示LNA类似物核苷酸；并且所述靶结合区包含至少两个通过硫代磷酸酯基团(-O-P(O，S)-O-)连接的LNA核苷酸或LNA类似物核苷酸；并且在所述组合物中该化疗化合物和该LNA寡核苷酸部分的重量比在50∶1至1∶25的范围内。
在另一个实施方案中，本发明的药物组合物是在药物可接受载体中包含至少一种化疗化合物(例如，氟达拉滨和/或紫杉烷化合物)和缀合物的药物组合物，所述缀合物由10-30个核苷碱基长度的寡聚化合物和至少一种共价连接到所述化合物上的非核苷酸/非多核苷酸部分组成，所述寡聚化合物包含与人Bcl-2mRNA上第1459(5’)位至第1476(3’)位碱基之间的区域可特异性杂交的靶结合区，所述靶结合区具有下式：
5′-[(DNA/RNA)0-1-(LNA/LNA*)2-7-(DNA/RNA/LNA*)4-14-(LNA/LNA*)2-7-(DNA/RNA)0-1]-3′
其中，“LNA”表示LNA核苷酸，“LNA*”表示LNA类似物核苷酸；并且所述靶结合区包含至少两个通过硫代磷酸酯基团(-O-P(O，S)-O-)连接的LNA核苷酸或LNA类似物核苷酸；并且在所述组合物中该化疗化合物和该缀合物中的LNA寡核苷酸部分的重量比在50∶1至1∶25的范围内。
指征
Bcl-2参与许多基础生物机制，包括红细胞增殖、细胞增殖、离子代谢、葡萄糖和能量代谢、pH调节和基质代谢。本发明的方法优选用于癌症导致的疾病的治疗、维持治疗或预防，特别是用于治疗和Bcl-2的表达相关的癌症，例如乳癌、结肠癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、肝癌、甲状腺癌、肾癌、脑癌、睾丸癌、胃癌、小肠癌、肠癌、脊髓癌、窦癌(sinuses cancer)、膀胱癌、尿道癌、卵巢癌、头颈癌、血癌、皮肤癌、胃癌或骨癌。
本发明包括预防、维持治疗或治疗癌症的方法，其包括对人给予治疗有效量的Bcl-2调节寡聚化合物。本发明进一步包括短期施用Bcl-2调节寡聚化合物的用途。通常，非癌性细胞以该具体细胞类型特征性的频率分裂。当细胞已转化进入癌性阶段，将产生不受控制的细胞增殖和降低的细胞死亡。因此，杂乱的细胞分裂或细胞生长是癌性细胞类型的特点。这些癌症类型的实例包括、但不限于淋巴瘤和白血病(例如，非何杰金淋巴瘤(non-Hodgkin′s lymphoma)、何杰金淋巴瘤(Hodgkin′s lymphoma)、急性白血病，例如急性淋巴细胞性白血病、急性粒细胞性白血病、慢性粒细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤)、结肠癌、直肠癌、胰腺癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒膜癌、子宫颈癌、睾丸癌、肺癌、膀胱癌、黑素瘤、头颈癌、脑癌、未知源发位置癌(cancersof unknown primary site)、瘤、外周神经系统癌、中枢神经系统癌、不同类型的肿瘤(例如，纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肉瘤、软骨肉瘤、骨原性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮瘤(lymphangioendotheliosarcoma)、滑膜瘤、间皮瘤、尤因瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌(papillary denocarcinomas)、囊腺癌、髓样癌、支气管肺癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、维尔姆斯瘤(Wilms′tumour)、小细胞肺癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经鞘瘤、少突神经胶质细胞瘤、脑膜瘤、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤)、重链病、转移或以不受控制的或异常细胞生长为特征的任何疾病或病症。
本发明的非何杰金淋巴瘤包括，但不限于前体细胞淋巴瘤，例如原始淋巴细胞性淋巴瘤(T细胞和B细胞)；外周B细胞瘤(Peripheral B-cell neoplasma)，例如B-慢性淋巴细胞性白血病和小淋巴细胞性淋巴瘤、B-幼淋巴细胞性淋巴瘤(prolymphocyticleukaemia)、淋巴浆细胞样淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(Mantel Celllymphoma)、滤泡型淋巴瘤、MALT型淋巴结外边缘带B细胞淋巴瘤、淋巴结边缘带B细胞淋巴瘤、脾边缘区B细胞淋巴瘤、多毛细胞白血病、弥漫型大B细胞淋巴瘤、包括Burkitt样淋巴瘤的Burkitt淋巴瘤、浆细胞瘤和浆细胞骨髓瘤；外周T细胞和NK细胞肿瘤，例如T-幼淋巴细胞性白血病、T细胞颗粒淋巴细胞白血病、侵袭性NK细胞白血病、蕈样肉芽肿病和塞泽里综合征、外周T细胞淋巴瘤、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤、NK/T细胞淋巴结外淋巴瘤(鼻和鼻型)、肠病型T细胞淋巴瘤、肝脾γδT细胞淋巴瘤、皮下脂膜炎样T细胞淋巴瘤、退行性大细胞淋巴瘤(T细胞/裸细胞和原发性系统性类型)、退行性大细胞淋巴瘤(T细胞/裸细胞、原发性皮肤性类型)和成人T细胞淋巴瘤和白血病(HTLV1+)。
目前已相信可以得到特别好的临床结果的癌症类型是急性粒细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病和非何杰金淋巴瘤，尤其是滤泡型淋巴瘤和弥散型大B细胞淋巴瘤。
术语“癌(carcinoma)”是指上皮来源的恶性肿瘤。上皮组织覆盖或沿着机体内外的机体表面。上皮组织的实例是皮肤及沿着体腔和内部器官，例如肠、膀胱、子宫等的粘膜和浆膜。上皮组织也可以延伸入更深的组织层以形成腺体，例如粘液分泌腺。
术语“肉瘤(sarcoma)”是指由结缔组织，例如软骨、脂肪、肌肉、腱和骨，发展成的恶性肿瘤。
本文使用的术语“神经胶质瘤(glioma)”是指涵盖起源于神经胶质细胞的恶性肿瘤。
用途
本发明的寡聚化合物可用于治疗、维持治疗和预防之中。在研究中，该反义寡聚化合物可用于特异性抑制细胞和试验动物中Bcl-2蛋白的合成，由此方便靶的功能性分析或评价其作为治疗干预目标的有效性。对于治疗，疑似患有可通过调节Bcl-2表达进行治疗的疾病或病症的动物或人(特别是人)可通过给予本发明的反义化合物来治疗。进一步提供了治疗动物，特别是小鼠和大鼠，和治疗人的方法，所述动物和人疑似患有与Bcl-2表达相关的疾病或病症或者对其易感，所述方法包括施用治疗或预防有效量的一种或多种本发明的反义化合物或组合物。
本发明进一步提供在细胞或组织内调节Bcl-2表达的方法，该方法包括用本文定义的寡聚化合物或缀合物，特别是本文定义的药物组合物接触该细胞或组织，以便调节Bcl-2表达。
更进一步，本发明提供了调节癌症疾病中涉及的基因的表达的方法，其包括将本文定义的寡聚化合物或缀合物，特别是本文定义的药物组合物与该基因或来自该基因的RNA相接触，以便调节基因表达。该基因优选是人Bcl-2基因。
本发明的另一方面涉及诱导细胞凋亡的方法，其包括将本文定义的寡聚化合物或缀合物、特别是本文定义的药物组合物与该细胞或来自该细胞的RNA相接触，以便诱导细胞凋亡。该凋亡的诱导可以在体外或体内。该诱导可以在细胞测定中或组织样品内或活的哺乳动物内引发。
本发明的另一方面涉及防止或减少细胞增殖的方法，其包括将本文定义的寡聚化合物或缀合物、特别是本文定义的药物组合物与该细胞或来自该细胞的RNA相接触，以便防止或减少细胞增殖。该细胞增殖的防止或减少可以是体外或体内的。该防止可以在细胞测定中或组织样品内或活的哺乳动物内进行。
另一方面，本发明提供了治疗患有或易患癌症疾病的哺乳动物的方法，该方法包括对该哺乳动物施用治疗有效量的本文定义的寡聚化合物或缀合物，特别是本文定义的药物组合物。
在一个实施方案中，该治疗与其他制剂的给药联合应用，所述制剂选自化疗化合物、抗炎化合物、抗病毒化合物、细胞生长抑制剂、抗血管生成化合物、抗增殖化合物、促凋亡化合物、信号转导调节剂、抗体和激酶抑制剂。在一个特别的变通方案中，所述其他制剂是至少一种化疗制剂，尤其是一种或多种上述的特定化疗剂。
本发明也提供治疗患有或易患血管发生导致的疾病的哺乳动物的方法，该方法包括对该哺乳动物给予治疗有效量的本文定义的寡聚化合物或缀合物，特别是本文定义的药物组合物。
更进一步，本发明提供本文定义的寡聚化合物用作药物。更特别的，本发明提供本文定义的寡聚化合物在制备用于治疗癌症疾病的药物上的用途。该药物优选处于上述定义的药物组合物的形式。
因此，本发明的一个进一步的方面涉及本文定义的寡聚化合物在制备用于治疗患有或易患癌症疾病的哺乳动物、特别是人的药物组合物上的用途。
本发明的另一个方面涉及治疗患有或易患癌症疾病的哺乳动物、特别是人的方法，该方法包括对该哺乳动物给予一种或多种治疗有效剂量的含本文定义的寡聚化合物的第一药物组合物。
本发明的另一个方面涉及治疗患有或易患癌症疾病的哺乳动物、特别是人的方法，该方法包括对该哺乳动物给予一种或多种治疗有效剂量的含缀合物的第一药物组合物，所述缀合物由本文定义的寡聚化合物和至少一种共价连接到该寡聚化合物上的非核苷酸/非多核苷酸部分组成。
上面后两个方面的变通方案是其中一种或多种化疗化合物(例如，氟达拉滨和/或紫杉烷化合物)和LNA寡核苷酸联合施用，特别是其中化疗化合物存在于含LNA寡核苷酸的第一药物组合物中的情形。
上面后两个方面的另一个变通方案是其中一种或多种化疗化合物(例如氟达拉滨和/或紫杉烷化合物)存在于不含LNA寡核苷酸的第二药物组合物中。在这种情况下，第一药物组合物和第二药物组合物可以同时施用或依次施用。
更普遍的，该药物可以进一步包含其他药剂，所述其它药剂选自化疗化合物、抗炎化合物、抗病毒化合物、细胞生长抑制剂、抗血管生成化合物、抗增殖化合物、促凋亡化合物、信号转导调节剂和激酶抑制剂。在一个特别的变通方案中，该其他制剂是至少一种化疗化合物，尤其是一种或多种上述的特定化疗化合物。
上面所指的癌症疾病特别是上面详细描述的肺癌、乳癌、结肠癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、肝癌、甲状腺癌、肾癌、脑癌、睾丸癌、胃癌、小肠癌、肠癌、脊髓癌、窦癌、膀胱癌、尿道癌、卵巢癌、头颈癌、血癌或皮肤癌。
另外。本发明提供包含与编码人Bcl-2蛋白的核糖核酸杂交的化合物的复合物，所述化合物是本文定义的寡聚化合物或缀合物。这类复合物可以是用本文定义的寡聚化合物或缀合物。对靶即编码人Bcl-2蛋白的核糖核酸进行治疗的结果。
施用
本发明的药物组合物可用多种方式施用，这取决于期望的是局部还是系统性治疗及待治疗的面积。施用可以是(a)口服(b)经肺，例如通过吹入或吸入粉末或气溶胶，包括通过喷雾器；气管内、鼻内；(c)局部，包括经表皮、透皮、眼和包括阴道和直肠的粘膜递送；或(d)肠胃外的，包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或肌肉内注射或输注；或颅内，例如鞘内或心室内施用。在一个实施方案中，寡聚化合物通过静脉内注射、腹膜内、经口、局部地或以大药丸式注射或施用直接到达靶器官。
局部施用的药物组合物和制剂可包括透皮贴剂、软膏、洗剂、乳剂、凝胶、滴剂、喷雾剂、栓剂、液体剂和粉末剂。常规药物载体、水性、粉末或油基、增稠剂等是必需的或期望的。包被的避孕套、手套等也是有用的。优选的局部制剂包括其中本发明的寡核苷酸和局部递送剂相混合的那些，所述局部递送剂例如为脂类、脂质体、脂肪酸、脂肪酸酯、类固醇、螯合剂和表面活性剂。口服的组合物和制剂包括、但不限于粉末或颗粒、微颗粒、纳米粒、在水或非水介质中的悬浮液或溶液、胶囊、凝胶胶囊(gel capsules)、小袋(sachets)、片剂或小片剂。肠胃外、鞘内或心室内施用的组合物和制剂可包括无菌水溶液，其也可以包含缓冲剂、稀释剂和其他合适的添加剂，例如但不限于渗透增强剂、载体化合物和其他药学可接受的载体或赋形剂。
递送
本发明的药物组合物包括但不限于溶液、乳剂和含脂质体的制剂。这些组合物可由许多组分形成，这些组分包括但不限于预制液(preformed liquid)、自乳化固体和自乳化半固体。药物向肿瘤组织的递送可以通过载体介导的递送增强，其包括但不限于阳离子脂质体、环糊精、卟啉衍生物、支链树形分子(dendrimer)、聚乙烯亚胺聚合体、纳米颗粒和微球体(Dass CR.J Pharm Pharmacol 2002；54(1)：3-27)。
可方便地以单位剂型形式存在的本发明药物制剂可根据制药业中众所周知的常规技术制备。这类技术包括使活性组分与一种或多种药物载体或赋形剂相混合的步骤。一般而言，该制剂通过均匀和紧密地将把活性组分与液体载体或分得很小的固相载体或二者相结合，然后，如果需要的话将产品成形来制备。
本发明的组合物可配制成多种可能的剂型形式中的任一种，例如但不限于片剂、胶囊剂、凝胶胶囊剂、液体糖浆剂、软凝胶剂和栓剂。本发明的组合物也可配制成水性、非水性或混合介质中的悬浮液。水性悬浮液可进一步包含增加悬浮剂粘性的物质，包括例如羟甲基纤维素钠、山梨糖醇和/或葡聚糖。该悬浮液也可以含有稳定剂。
剂量
给药量取决于待治疗的疾病状态的严重性和反应性以及治疗过程，可持续几天至几个月，或直至达到治疗的效果或达到疾病状态的减轻。最佳剂型方案将取决于例如组合治疗的选择、疾病和疾病状态及起始临床治疗的结果。
最佳剂量可根据各个寡聚化合物的相关对效力而不同。一般而言，它可根据在体外和体内动物模型上发现有效的EC50来估计。一般地，剂量在每公斤体重0.01μg至1g的范围内，并且可以每天、每周、每月或每年给予一次或多次，或甚至每2至10年给予一次，或连续输注几小时长达几个月。给药的重复频率可根据所测定的药物在体液或组织中的停留时间和浓度估计。成功治疗后，可能希望患者接受维持治疗以预防疾病状态的复发。
并不局限于任何具体的理论，预计化疗化合物和本发明的寡聚化合物的联合效果(及潜在的协同效果)将使得有可能降低化疗化合物或寡聚化合物或此两者的剂量。
试剂盒
本发明的另一方面涉及试剂盒，其包含：
(a)含有一种或多种本文定义的寡聚化合物的可注射溶液剂的第一组分，和
(b)含有一种或多种化疗化合物(例如，氟达拉滨和/或紫杉烷化合物)的一种或多种可注射溶液的第二组分，和
其中在所述组合物中所述至少一种紫杉烷化合物和至少一种LNA寡核苷酸的重量比在50∶1至1∶25的范围内。
优选的，寡聚化合物的可注射溶液剂是上述定义的药物组合物。
实施例
实施例1单体合成
LNA单体构建模块及其衍生物按照以下公开的步骤和其中引用的文献制备，参见：
WO 03/095467A1
D.S.Pedersen，C.Rosenbohm，T.Koch(2002)Preparation of LNA Phosphoramidites，Synthesis 6，802-808.
M.D.Srensen，L.Kvaern，T.Bryld，A.E.Hkansson，B.Verbeure，G.Gaubert，P.Herdewijn，J.Wengel(2002)α-L-ribo-configured Locked Nucleic Acid(α-l-LNA)：Synthesisand Properties，J.Am.Chem.Soc.，124，2164-2176.
S.K.Slngh，R.Kumar，J.Wengel(1998)Synthesis of Novel Blcyclo[2.2.1]Ribonucleosides：2′-Amino-and 2′-Thio-LNA Monomeric Nucleosides，J.Org.Chem.1998，63，6078-6079.
C.Rosenbohm，S.M.Christensen，M.D.Srensen，D.S.Pedersen，L.E.Larsen，J.Wengel，T.Koch(2003)Synthesis of 2′-amino-LNA：a new strategy，Org.Biomol.Chem.1，655-663.
D.S.Pedersen，T.Koch(2003)Analogues of LNA(Locked Nucleic Acid).Synthesis of the 2′-Thio-LNA Thymine and 5-Methyl Cytosine Phosphoramidites，Synthesis，accepted.
实施例2：寡核苷酸的合成
寡核苷酸的小量合成
在Expedite 8900/MOSS合成仪(Multiple OligonucleotideSynthesis System)上使用亚磷酰胺(phospheramidite)方法，以1μmol或15μmol的量合成寡核苷酸。对于大量合成，使用KTA OligoPilot。在合成的最后(具有DMT)，在室温下使用氨水1-2小时从固相支持物上裂解下寡核苷酸，并进一步在65℃下脱保护4个小时。通过反相HPLC(RP-HPLC)纯化该寡核苷酸。除去DMT基团后，该寡核苷酸通过AE-HPLC、RP-HPLC和CGE表征，并且通过ESI-MS证实分子量。
更详细见下：
LNA-固相载体的制备
LNA琥珀酰半酯(succinyl hemiester)的制备
将5’-O-Dmt-3’-羟基-LNA单体(500mg)、琥珀酸酐(1.2当量)和DMAP(1.2当量)溶解在DCM(35ml)中。该反应物在室温下搅拌过夜。用0.1M的NaH2PO4，pH 5.5(2x)和盐水(1x)萃取后，用无水Na2SO4进一步干燥有机层，过滤并蒸发。以95％的收率获得该半酯衍生物，其无需进一步纯化即可使用。
LNA-支持物的制备
将以上制备的半酯衍生物(90μmol)溶解在微量DMF中，加入DIEA和pyBOP(90μmol)并混合在一起1分钟。将该预激活的混合物与LCAA-CPG(500，80-120目径，300mg)在手动合成器里混合并搅拌。室温下1.5小时后，将滤掉支持物并用DMF、DCM和MeOH洗涤。干燥后，上样被确定为57μmol/g(见Tom Brown，Dorcas J.S.Brown.Modern machine-aided methods of oligodeoxyribonucleotidesynthesis.In：F.Eckstein，编者。Oligonucleotides andAnalogues A Practical Approach.Oxford：IRL Press，1991：13-14)。
寡核苷酸的延伸
通过使用乙腈中0.1M 5’-O-DMT-保护的amidite和乙腈0.25ml中的DCI(4，5-二氰咪唑)溶液作为激活剂，进行亚磷酰胺(A(bz)，G(ibu)，5-甲基-C(bz))或T-β-氰乙基-亚磷酰胺的偶联。通过使用氢化黄原素(xanthane hydride)(在乙腈：吡啶10％中的0.01M)进行硫醇化反应。其余的试剂是一般用于寡核苷酸合成的那些。将供应商提供的方案合适地优化。
RP-HPLC纯化
柱：Xterra RP18
流速：3ml/min
缓冲液：0.1M醋酸铵，pH 8和乙腈
缩写
DMT：二甲氧三苯甲基
DCI：4，5-二氰咪唑
DMAP：4-二甲氨基吡啶
DCM：二氯甲烷
DMF：二甲基甲酰胺
THF：四氢呋喃
DIEA：N-二异丙基乙胺
PyBOP：六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基-三吡咯烷并鏻
Bz：苯甲酰基
Ibu：异丁酰基
寡核苷酸的大量合成
在KTA OligoPilot上使用亚磷酰胺方法，以200μmole到1mmole的量合成大量寡核苷酸。在寡聚化合物的DMT-OFF-合成后，进行DEA-处理，也在合成器上进行。在55℃下用氨水处理12个小时，从固相支持物上裂解下寡核苷酸并去除保护基团。然后，该寡核苷酸通过在KTA Pilot上的离子交换(IEX)纯化。在SephadexTMG-25介质上进行脱盐，然后冻干。该寡核苷酸通过IEX-HPLC、CGE和ESI-MS表征。
通过使用乙腈中的0.2M所述亚酰胺酯(amidite)和0.75MDCI(4，5-二氰基咪唑)溶液用作激活剂，进行DNA-亚磷酰胺(A(bz)、C(bz)、G(ibu)和(T))和LNA-亚磷酰胺(C(bz)和(T))的偶联。通过使用氢化黄原素(0.0175M，在乙腈：吡啶20％中)进行硫醇化反应。其余的试剂是一般用于寡核苷酸合成的那些。
实施例3：寡聚化合物的设计
表1-本发明的寡聚化合物
在本申请中，以指定的序列号、例如“SEQ ID NO：15”表示寡聚化合物。化合物“SEQ ID NO：56”也被称为奥利默森钠，在此处被用作参比化合物。
SEQ ID    序列                                        设计
NO：
          互补的18mers
1         TsCstscscscsasgscsgstsgscsgscsCsAst             gap 13
2         TsCsTscscscsasgscsgstsgscsgsCsCsAst             gap 11
3         TsCsTsCscscsasgscsgstsgscsGsCsCsAst             gap 9
4         tsCsTsCscscsasgscsgstsgscsgsCsCsAst             gap 10
5         TsCsTscscscsasgscsgstsgscsgsCsCsAsT             gap 11
6         Tα sCα sTα scscscsasgscsgstsgscsgsCα sCα sAα st gap 11
7         tsCα sTα sCα scscsasgscsgstsgscsgsCα sCα sAa st  gap 10
          互补的16mers
8         CsTscscscsasgscsgstsgscsgsCsCsa                    gap 11
9         Cα sTα scscscsasgscsgstsgscsgsCα sCα sa            gap 11，α-L-LNA
10        CsTscscscsasgscsgstsgscsgsCsCsA                    LNA 3′-end
11        CsTscscscsasgscsgstsgscsgscsCsA                    LNA 3′-end
12        CsTsCscscsasgscsgstsgscsGsCsCsa                    gap 9
13        CsTsCsCscsasgscsgstsgsCsGsCsCsa                    gap 7
14        CsTsCscscsasgscsgstsgscsGsCsCsA                    gap 9
          cstscscscsasMscsgstsgscsgscacsa，16mers
15        CsTscscscsasascsgstsgscsgsCsCsa                    gap 11
16        Cα sTα scscscsasascsgstsgscsgsCα sCα sa            gap 11，α-L-LNA
17        CsTsCscscsasascsgstsgscsGsCsCsa                    gap 9
18        CsTsCscscsastscsgstsgscsGsCsCsa                    gap 9
19        CsTsCsCscsasascsgstsgsCsGsCsCsa                    gap 7
20        CsTscscscsasascsgstsgscsGsCsCsa                    gap 10
          cstscscscsasgscsgsMsgscsgscscsa，16mers
21        CsTscscscsasgscsgscsgscsgsCsCsa                    gap 11
22        CsTsCscscsasgscsgscsgscsGsCsCsa                    gap 9
23        CsTsCsCscsasgscsgscsgsCsGsCsCsa                    gap 7
24        CsTscscscsasgscsgsasgscsgsCsCsa                    gap 11
25        CsTscscscsasgscsgsgsgscsgsCsCsa                    gap 11
          tscstscscscsasgsMsgstsgscsgscscsa，t，18mers
26        TCsTscscscsasgsasgstsgscsgsCsCsAst                gap 11
27        TCsTscscscsasgstsgstsgscsgsCsCsAst                gap 11
28        TCsTscscscsasgsgsgstsgscsgsCsCsAst                gap 11
          标准
标准的
29        CsTscscscsasascsgstsgscsgsCsC                    N-1，3′-end
30        CsTscscscsasascsgstsgscsgsC                       N-2，3′-end(ref.)
31        CsTscscscsasascsgstsgscsgs                        N-3，3′-end(ref.)
32        TscscscsasascsgstsgscsgsCsCsa                    N-1，5′-end(ref.)
33        cscscsasascsgstsgscsgsCsCsa                       N-2，5′-end(ref.)
34        cscsasascsgstsgscsgsCsCsa                          N-3，5′-end(ref.)
35        CsTscscscsasgscsgstsgscsgsCsC                    N-1，3′-end
36        CsTscscscsasgscsgstsgscsgsC                       N-2，3′-end(ref.)
37        CsTscscscsasgscsgstsgscsgs                        N-3，3′-end(ref.)
38        TscscscsasgscsgstsgscsgsCsCsa                    N-1，5′-end(ref.)
39        cscscsasgscsgstsgscsgsCsCsa                       N-2，5′-end(ref.)
40        cscsasgscsgstsgscsgsCsCsa                           N-3，5′-end(ref.)
41        CsTscscscsasgscsgstsgscsgscsCsAst             gap 12
42        CsTsCscscsasgscsgstsgscsgsCsCsAst             gap 10
43        CsTsCsCscsasgscsgstsgscsGsCsCsAst             gap 8
44        TsCstscscscsasgscsgstsgscsgsCsCsa             gap 12
45        TsCsTscscscsasgscsgstsgscsGsCsCsa             gap 10
46        TsCsTsCscscsasgscsgstsgsCsGsCsCsa             gap 8
47        TsCstscscscsasgscsgstsgscsGsCsc                 gap 11
48        TsCsTscscscsasgscsgstsgsCsGsCsc                 gap 9
49        TsCsTsCscscsasgscsgstsGsCsGsCsc                 gap 7
50        TsCscscsasgscsgstsgscsgscsCsAst                 gap 11
51        TsCsCscsasgscsgstsgscsgsCsCsAst                 gap 9
53        TCsTscscscsasgscsastsgscsgsCsCsAst             gap 11
54        TCsTscscscsasgscststsgscsgsCsCsAst             gap 11
55        TCsTscscscsasgscscstsgscsgsCsCsAst             gap 11
56        tscstscscscsasgscsgstsgscsgscscsast           Reference
57        TsCsTscscscsasgscsastsgstsgsCsCsAst           2mismatches
58        AsCscsgscsgstsgscsgsascscsCsTsc                  Reference；reversed
                                                                               pola rity
59        ts mcsts mcs mcs mcsasgs mcsgstsgs mcsgs mcs mcsast Reference
60        CsTscscscsasascm sgstsgscm sgsCsCsa                gap 11
61        CsTs mcs mcs mcsasas mcsgstsgs mcsgsCsCsa            gap 11
SEQ ID    序列                                                                  设计
          引物
62        catgtgtgtggagagcgtcaa
63        gccggttcaggtactcagtca
64        FAM-cctggtggacaacatcgccctgt-TAMRA
在表1中，大写字母表示LAN核苷酸，上标“α”表示LAN核苷酸是α-L-LNA核苷酸(例如，LNA类似物核苷酸)，下标“S”表示相邻核苷酸通过硫代磷酸酯基团连接。所有LNA-C单体是甲基-C。
实施例4：体外模型：细胞培养
反义化合物对靶核酸表达的影响可在多种细胞类型中的任何一种中检测，条件是目标核酸以可测量的水平存在。靶可内源性表达，或通过编码所述核酸的核酸的瞬时或稳定转染表达。
靶核酸的表达水平可使用例如Northern印迹分析、定量PCR、核糖核酸酶保护测试或其他定量方法按常规确定。为示例目的提供以下细胞类型，但是其他细胞类型也可按常规使用，条件是靶在所选细胞类型中表达。
细胞培养在如以下所述的合适培养基中，并保持在37℃下、95-98％湿度和5％CO2中。细胞每周按常规传代2-3次。
15PC3：人前列腺癌细胞系15PC3由F.Baas博士，NeurozintuigenLaboratory，AMC，The Netherland惠赠，并培养在DMEM(Sigma)+10％胎牛血清(FBS)+Glutamax I+庆大霉素。
PC3：人前列腺癌细胞系PC3购自ATCC，并培养在含有谷氨酰胺(Gibco)+10％(FBS)+庆大霉素的F12Coon’s中。
518A2：人黑素瘤癌细胞系518A2由B.Jansen博士，Section ofexperimental Oncology，Molecular Pharmacology，Department ofClinical Pharmacology，University of Vienna惠赠，并培养在DMEM(Sigma)+10％胎牛血清(FBS)+Glutamax I+庆大霉素中。
实施例5：体外模型：反义寡核苷酸的处理
使用阳离子脂质体制剂Lipofect AMINE 2000(Gibco)作为转染载体，用寡核苷酸处理细胞。
将细胞接种于12-孔细胞培养板(NUNC)中，在80-90％融合时处理。所用的寡聚物的浓度在0.2nM到100nM最终浓度的范围内。寡聚物-脂质复合物的配制基本按照Dean等人(Journal of BiologicalChemistry 1994，269，16416-16424)所述实施，其中在500μl总体积中使用无血清OptiMEM(Gibco)和最终脂质浓度为10μg/ml的LipofectAMINE 2000。
通过在37℃下孵育4小时转染细胞。随后，去除转染培养基，并在加入含血清的培养基之前洗涤细胞。将细胞培养0到72小时范围内的不同时间长度。
实施例6：体外模型：RNA和cDNA合成的提取
分离总RNA
使用RNeasy小试剂盒(Qiagen cat.No.74104)或Trizol试剂(Life technologies cat.No.15596)分离总RNA。RNeasy是从细胞系中分离RNA的优选方法，Trizol是从组织样品中分离RNA的优选方法。
按照制造商提供的方案，使用Qiagen RNA OPF-BIO Robot 3000从细胞系中分离总RNA。
使用制造商提供的Trizol试剂方案匀浆组织样品并分离总RNA。
第一条链的合成
按照制造商的指导，使用OmniScript逆转录试剂盒(cat#205133，Qiagen)进行第一条链的合成。
对每个样品，分别用不含RNase的水将0.5μg总RNA调整到12μl，并与2μl聚(dT)12-18(2.5μg/ml)(Life Technologies，GibcoBRL，Roskilde，DK)、2μl dNTP混合物(每种dNTP 5mM)、2μl 10X缓冲液RT、lμl RNAguardTM RNase抑制剂(33.3U/ml)、(cat#27-0816-01，Amersham Pharmacia Biotech，Hφrsholm，DK)和1μl OmniScript逆转录酶(4U/μl)混合，随后在37℃下孵育60分钟并在93℃下热灭活5分钟。
实施例7：体外模型：通过实时PCR分析Bcl-2表达的寡核苷酸抑制
可用本领域已知的多种方法测定Bcl-2表达的反义调节。例如，Bcl-2 mRNA的水平可通过如Northern印迹分析或定量PCR来定量。目前，定量实时PCR是优选的。RNA分析可在总细胞RNA或mRNA上进行。
RNA分离和分析方法，如Northern印迹分析，在本领域是常规的，并在如John Wiley和Sons所著Current Protocols in MolecularBiology中有教导。
使用可从BioRAD Laboratories商购的市售iQ多色实时PCR检测系统可方便地实现定量实时PCR。
Bcl-2mRNA水平的实时定量PCR分析
按照制造商的指导，使用iQ多色实时PCR检测系统(BioRAD)通过实时定量PCR确定mRNA水平的量。
实时定量PCR是本领域公知的技术，并在如Heid等人Real timequantitative PCR，Genome Research(1996)，6：986-994中有教导。
Platinum Quantitative PCR SuperMix UGD 2x PCR master mix获自Invitrogen cat#11730。引物和TaqMan探针获自MWG-BiotechAG，Ebersberg，德国。
使用公开的序列信息(GenBank登陆号NM 001168，以SEQ IDNO：1001形入并入本文)，设计与人Bcl-2序列杂交的人Bcl-2探针和引物。
对于人Bcl-2，PCR引物是：
正向引物：5’catgtgtgtggagagcgtcaa 3’(测试中的最终浓度；0.6μM)(SEQ ID NO：62)
反向引物：5’gccggttcaggtactcagtca 3’(测试中的最终浓度；0.6μM)(SEQ ID NO：63)，
PCR探针是：5’FAM-cctggtggacaacatcgccctgt-TAMRA 3’(测试中的最终浓度；0.1μM)(SEQ ID NO：64)
3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)mRNA的量被用作内源对照从而对样品制备中的任何变化进行标准化。
按照制造商的指导，使用人GAPDH ABI Prism Pre-DevelopedTagMan Assay试剂(Applied Biosystems cat.No.4310884E)对人GAPDH mRNA中的样品含量进行定量。
实时PCR
将来自如上述进行的第一条链合成的eDNA稀释2-20倍，并由实时定量PCR进行分析。将引物和探针与2x Platinum Quantitative PCRSuperMix UDG(cat.#11730，Invitrogen)混合，并加入到3.3μl的cDNA中达到最终体积25μl。每个样品一式三份分析。从表达目的RNA的细胞系中纯化的材料制备的cDNA的2倍稀释物进行测定，得到了该测定法标准曲线。使用无菌水代替cDNA用作无模板对照。PCR程序：50℃2分钟，95℃10分钟，随后95℃15秒、60℃1分钟循环40次。
使用iCycler iQ实时检测系统软件，从计算的阀值循环确定目标mRNA序列的相对量(见表3)。
实施例8：体外分析：Bcl-2蛋白水平的Western印迹分析
可用本领域中公知的多种方法对Bcl-2蛋白水平定量，例如免疫沉淀法、Western印迹分析(免疫印迹法)、ELISA、RIA(放射免疫测定)或荧光激活细胞分拣术(FACS)和其他。可从多种来源鉴定及获得针对Bcl-2的抗体，例如Upstate Biotechnologies(Lake Placid，美国)、Novus Biologicals(Littleton，Colorado)、Santa CruzBiotechnology(Santa Cruz，California)、DAKO(Glostrup，丹麦)或可通过常规抗体生产方法制备。Western印迹：
由Western印迹确定Bcl-2寡聚物对Bcl-2蛋白水平的体外影响。
按照实施例5所述转染细胞。转染后，在0至72小时范围内的时间点处收获细胞，在2.5％SDS、5mM DTT和6M补充有蛋白酶抑制剂混合物药片(Roche)的尿素中裂解。使用Bradford试剂测定总蛋白的浓度。按照制造商的建议(Invitrogen)，将150μg总蛋白在MOPS缓冲液中的12％Bis-Tris凝胶上电泳，并印迹到PVDF膜上。在封闭缓冲液(Introgen)中孵育过夜后，用单克隆抗Bcl-2抗体(DAKO)及抗Survivin抗体(Novus Biologicals 500-205克隆60.11)或抗微管蛋白抗体(NeoMarkers)将膜孵育2小时，随后在二抗中孵育1小时。使用生色免疫检测试剂盒(Invitrogen)显现Bcl-2、Survivin或微管蛋白。或者，用缀合了HRP的小鼠免疫球蛋白(DAKO)孵育该膜，随后用ECL+Plus试剂(Amersham)孵育，并用VersaDoc化学发光检测系统显示。见图1、2A、2B和2C。图6表示Bcl-2蛋白上SEQ ID NO：15的活性的持续时间。表2表示化合物浓度为10nM和10nM的凝胶的化学发光值(凝胶未示出)。图2A表示来自相似实验但不同剂量(1nM和5nM)的凝胶。
表2
  寡聚化合物及浓度   标准化为SEQ ID NO：56，10nM的Bcl-2(％)量
  SEQ ID NO：56(参比)，10nMSEQ ID NO：56(参比)，100nMSEQ ID NO：2，10nMSEQ ID NO：2，100nM   10072334
实施例9：体外分析：使用反义寡核苷酸对人Bcl-2表达的反义抑制
根据本发明，设计了一系列与人Bcl-2mRNA的特定区域、即翻译起始密码子周围的区域可杂交的寡核苷酸。寡核苷酸的不同设计和长度显示在表1中。通过转染到细胞系15PC3和518A2中，评价寡聚化合物在这些细胞系中破坏Bcl-2的潜力。Bcl-2转录物稳定状态由实时PCR监测，并被标准化成GAPDH转录物稳定状态水平。表3显示与SEQ ID NO：56(奥利默森钠；完全改性的硫代磷酸酯；参比)相比的一系列有效化合物。
表3.由实时PCR确定的Bcl-2 mRNA表达。15PC3或518A2细胞被指定浓度的寡聚化合物转染，24小时孵育后提取RNA。以相对于模拟处理的形式显示下调结果。
  细胞系   15PC3   518A2
  SEQ ID NO：   浓度(nM)
  1   5   25   1   5   25
  56(参比)   0％   70％   88％   42％   66％
  59(参比)   29％   70％   90％
  1   72％   87％   91％
  2   74％   92％   89％   72％   89％
  3   34％   45％   84％
  4   53％   82％   90％   78％   90％
  8   61％   80％   ND   44％   60％   82％
  12   62％   92％   91％   78％   92％
  13   36％   ND   60％
  15   24％   79％   89％   72％   84％
  18   0％   71％   88％
  19   0％   0％   37％
  21   23％   80％   89％   74％   86％
  23   45％   62％   70％
  24   39％   85％   92％   70％   82％
  57   0％   37％   91％   61％   81％
  16   18％   36％   68％
  9   26％   ND   78％
实施例10：用LNA反义寡聚化合物诱导凋亡
转染前一天，将细胞以每孔12,000个细胞的密度接种在白色96孔板(Nunc 136101)内DMEM中。第二天，在预热的OptiMEM里洗涤细胞一次，随后加入72μl含有5μg/ml Lipofectamine 2000(Invitrogen)的OptiMEM将细胞培育7分钟后，加入18μl在OptiMEM中稀释的寡核苷酸。最终寡核苷酸浓度在0.2nM到25nM的范围内。处理4小时后，将细胞在OptiMEM中洗涤，并加入50μl含血清的DMEM。用寡聚化合物处理后，使细胞恢复指定的时间，然后将细胞从CO2培养箱中取出并用15分钟平衡到室温。直接将相等体积的高度敏感性Capsase 3/7-GloTM试剂(Promega)加到96孔内的细胞中，将板孵育60分钟，然后在1分钟迟滞后在来自Thermo Labsystems的Luminoskan Ascent仪器中记录发光(萤光素酶活性)。萤光素酶活性以每秒的相对光单位(RLU/s)测量。在Ascent 2.6软件中处理数据，并在excel中做图。(见图3A和3B)。
Annexin V-FITC流式细胞术分析：转染前一天，将0.4×106个Hela细胞接种到T25烧瓶中。转染当日，将细胞在37℃的OpiMEM中洗涤一次，随后加入2.8ml含有5μg/ml Lipofectamine 2000(Invitrogen)的OptiMEM。细胞孵育7分钟后，加入700μl在OptiMEM中稀释到最终寡核苷酸浓度为5nM或25nM的寡核苷酸。没有寡核苷酸进行转染的细胞作为对照。处理4小时后，将细胞在OptiMEM中洗涤，并加入3ml培养基。寡聚物处理后，允许细胞恢复48小时，然后收集细胞(通过刮)，在PBS中洗涤两次。用5μl Annexin V-FITC和10μl碘化丙锭(PI-10mg/ml)孵育0.2×106个细胞，并在黑暗中RT下孵育15分钟。
与在加入Annexin V-FITC前与阻断Annexin V的结合的纯化重组Annexin V孵育的转染细胞被用于证实染色的特异性和选择性。此外，TRAIL(Apo2L)诱导的Hela细胞(0.5g/ml)被用做阳性对照(数据未显示)。(见图3C和3D)
实施例11：在增殖的癌细胞中Bcl-2的反义寡核苷酸抑制
转染前日，将细胞以每孔12,000个细胞的密度接种在白色96孔板(Nunc 136101)内DMEM中。第二天，在预热的OptiMEM里洗涤细胞一次，随后加入72μl含有5μg/ml Lipofectamine 2000(Invitrogen)的OptiMEM。将细胞培育7分钟后，加入18μl在OptiMEM中稀释的寡核苷酸。最终寡核苷酸浓度在5nM到100nM的范围内。处理4小时后，将细胞在OptiMEM中洗涤，并加入100μl含血清的DMEM。用寡聚化合物处理后，使细胞恢复指定的时间，通过每100μlDMEM加入20μl四唑化合物[3-(4，5-二甲基-2-基)-5-(3-羧甲氧基苯基)-2-(4-硫代苯基(sulophenyl))-2H-四唑，内盐；MTS]和电子偶联试剂(吩嗪乙基硫酸酯；phenazine ethosulfate，PES)(CellTiter 96AQueous One Solution Cell Proliferation Assay，Promega)，测量活细胞。在Powerwave(Biotek Instruments)中以490nm测定活细胞。将生长速率(ΔOD/小时)对寡聚化合物浓度作图(见图4和5)。
实施例12：体内模型：通过反义寡核苷酸的系统处理，对体内生长的人异种移植PC-3肿瘤细胞进行肿瘤生长抑制
从M&B，丹麦购买6周龄的雌性Balb/c无胸腺裸鼠，并在进入实验之前使之适应气候至少1周。将人类癌细胞，一般为悬浮在300μlmatrigel(BD Bioscience)中的3×106细胞，皮下注射到体侧。对双异种移植模型而言，植入两个肿瘤，每侧一个。当确定肿瘤生长时，一般在肿瘤细胞注射后5-12天；每天、每天两次、每两天或每三天或每周采用IP(腹膜内(intaperitoneal))给药途径以0.01到20mg/kg/天给予不同的反义寡核苷酸长达30天。对照动物以同样时间和同样的给药途径仅给予生理盐水。每个实验组至少包括5只小鼠。通过由肿瘤体积测量的肿瘤生长抑制来估测抗肿瘤活性。一般通过测量2个正交直径来有规律地跟踪肿瘤生长。根据Teicher BA，Tumour Models inCancer Research.Humana Press，NJ，美国2002，第596页：肿瘤体积(mm3)＝L×W2×0.5)中的公式计算肿瘤体积，其中L代表最大直径，W是与L垂直的肿瘤直径。在处理结束时，处死动物，测量肿瘤重量。使用Mann-Whitney检测比较各组的平均肿瘤体积和重量。所有分析都在用于Windows的11.0版SPSS中进行。见图7A、7B、7C和7D。
实施例13：体内分析：通过反义寡核苷酸的系统处理，对体内生长的人异种移植PC-3肿瘤细胞的Bcl-2进行抑制
从M&B，丹麦购买6周龄的雌性Balb/c无胸腺裸鼠，并在进入实验之前使之适应气候至少1周。将人类癌细胞，一般为悬浮在300μlmatrigel(BD Bioscience)中的3×106细胞，皮下注射到体侧。对双异种移植模型而言，植入两个肿瘤，每侧一个。当确定肿瘤生长时，一般在肿瘤细胞注射后5-12天；每天、每天两次、每两天或每三天或每周采用IV(静脉内)或IP(腹膜内)给药途径以0.01到20mg/kg/天给予不同的反义寡核苷酸长达30天。对照动物以同样时间和同样的给药途径仅给予盐水。每个实验组包括至少5只小鼠。在处理结束时，麻醉小鼠，切除肿瘤，立即将其在液氮里冷冻。
为测量反义寡核苷酸是否在蛋白质水平上有抑制作用，进行了Western印迹分析。在4℃下用电动匀浆器将肿瘤在裂解缓冲液(即，20mM Tris-Cl[pH 7.5]；2％Triton X-100；1/100体积蛋白酶抑制剂混合物套装III(Calbiochem)；1/100体积蛋白酶抑制剂混合物套装II(Calbiochem))中匀浆。每100mg肿瘤组织使用500μl裂解缓冲液。将来自每组小鼠的肿瘤裂解物集中，并在4℃下以13.000g离心5分钟，以去除组织碎片。用BCA蛋白检测试剂盒(Pierce，Rockford)确定肿瘤提取物的蛋白质浓度。
将肿瘤提取物(50-100μg)在4到20％的梯度SDS-PAGE凝胶上分级分离，并将其转到PVDF膜上，用氨基黑染色法显色。用抗人Bcl-2抗体sc-509(Santa Cruz Biotechnology，Inc.Snata Cruz，CA，美国)或抗人Bcl-2抗体(clone101，Zymed)、随后用缀合了辣根过氧化物酶抗山羊IgG(DAKO)检测Bcl-2的表达。用ECL Plus(Amershambiotech)检测免疫反应性，并用Versadoc 5000Lite系统(Bio-Rad)定量。
实施例14：体内：将LNA Bcl-2寡聚物与在518A2人黑素瘤异种移植SCID小鼠中目前临床测试的奥利默森钠(SEQ ID NO：56)进行比较
测试泄漏程度的4-6周龄无菌雌性C.B-17scid/scid(SCID)小鼠获自Harlan & Winkelmann(Borchen，德国)。将动物圈养在层架(laminar flow rack)上的微隔离盒中，随意获得高压灭菌的食物和水。对SCID小鼠皮下注射悬浮在200μl PBS中的1.5×107518A2人黑素瘤细胞至左下侧。10天后，将所有长出皮下可触及肿瘤的小鼠随机分为处理组或对照组，并开始处理。为连续皮下给药，将小鼠麻醉，并将充满生理盐水溶液中的寡核苷酸或作为载体对照的盐水的微型渗透泵皮下植入脊旁腔(paraspinal pocket)。
抗肿瘤活性按照参考时间表，以7mg/kg/天的标准剂量由微渗透泵皮下给予SEQ ID NO：56(参比)14天。以7、3.5和1.75mg/kg连续皮下输注LNA寡聚化合物SEQ ID NO：15 14天。将经盐水处理的动物作为对照。
由圆规测量的肿瘤随时间的生长和实验结束时肿瘤重量是要被确定的主要参数。
见图8A、8B、9、10A、10B和10C，其中显示了1.75mg/kg的SEQID NO：15的数据。增加浓度(7和3.5mg/kg)未导致肿瘤重量或肿瘤体积的进一步减小，这表示SEQ ID NO：15化合物在较低浓度时具有剂量反应曲线。
图11显示1和7mg/kg时SEQ ID NO：8的数据以及7mg/kg时SEQID NO：15和SEQ ID NO：56的数据。当给予SEQ ID NO：8化合物时，未观察到随处理时间的体量减小，对照表现出相似模式。
实施例15：大鼠血浆中SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：8的稳定性
大鼠血浆(NtacSD雄性，Li-Heparine(Taconic，M&B))中20μM SEQ ID NO：15在37℃下不同时间点样品内的稳定性：0、4、24和48小时。SEQ ID NO：56与SEQ ID NO：56(参比)对应。SEQ ID NO：20和16是也进行了测试的其他寡核苷酸。为了具有一个能识别SEQ IDNO：15的可能消化片段的对照，还包括了与SEQ ID NO：15(自3’-端)的n-1，n-2和n-3相应的寡核苷酸。还包括了市售ladder(10和20mer在PAGE上可见)。(见图12A)
大鼠血浆(NtacSD雄性，Li-Heparine(Taconic，M&B))中20μM SEQ ID NO：8在37℃下不同时间点样品内的稳定性：0、4、24和48小时。SEQ ID NO：56与SEQ ID NO：56(参比)对应。SEQ ID NO：9是也进行了测试的另一种寡核苷酸。为了具有一个能识别SEQ ID NO：8的可能消化片段的对照，还包括了与SEQ ID NO：8(自3’-末端)的n-1，n-2和n-3相当的寡核苷酸。也包括了市售ladder(10和20mer在PAGE上可见)。(见图12B)
寡聚化合物，例如SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：15，被合成为DNA的3’端通过硫代磷酸酯连接到相邻LNA的寡核苷酸。所述的3’DNA部分可被核酸外切酶切除。降解产物是截断1个核苷酸(N-1)的寡聚化合物(SEQ ID NO：35)，所述的截断1个核苷酸的寡聚化合物与全长母分子相比，对核酸酶降解具有充分增强的抗性。在例如SEQ IDNO：8(见图2C)情况下，N-1化合物(如SEQ ID NO：35)保持完全活性。
实施例16：肝脏和肾中SEQ ID NO：15的组织半衰期分析
将90只NMRI雌性小鼠(大约30g)被分为5组，并30秒内静脉内注射给予25mg/kg SPC 2996(10ml/kg，2.5mg/ml)。对对照组给予0.9％的盐水。注射后30分钟、6小时、24小时、48小时、72小时和96小时处死所述组。取出组织样品并在RNA-later里制备。
从组织里提取寡核苷酸
将约100mg组织在500μl提取缓冲液(0.5％Igepal CA-630，25mMTris pH 8.0，25mM EDTA，100mM NaCl，含有1mg/ml RNAse A)里机械匀浆，并在37℃下孵育过夜。用参比寡核苷酸示踪500ml，并通过加入1ml苯酚-isoamyl-choloroform(25∶1∶24(v/v/v))萃取。将水相转移到新试管里并再次萃取。如果必要，将提取物冻干。
对从组织样品里提取出的寡核苷酸进行IEX-HPLC分析
通过配有保护柱DNAPac PA-100(2×50毫米，Dioex)的DNA PacPA-100(2×250毫米，Dioex)柱分离体积为50μl的样品。该柱子加热到40℃。流速0.25ml/min，检测波长260nm。流动相A的梯度：TRIS(20mM)、EDTA(1mM)和高氯酸钠(10mM)pH：7.6，B：TRIS(20mM)、EDTA(1mM)和高氯酸钠(1M)pH：7.6，(0-13分钟，A：20％、B：20％；14-18分钟，A：40％、B：60％；22-28分钟，A：0％、B：100％；33-38分钟，A：80％、B：20％)。
图13显示单剂量静脉内注射(25mg/kg)后，SEQ ID NO：15在NMRI小鼠的肝脏和肾里的组织半寿期。
                          序列表
<110>Santaris A/S
<120>用于调节bcl-2的寡聚化合物
<130>15705PCT00
<160>64
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>n是5-甲基胞嘧啶
<220>
<221>misc_feature
<222>(16)..(16)
<223>n是5-甲基胞嘧啶
<400>1
tntcccagcg tgcgcnat                                    18
<210>2
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>n是5-甲基胞嘧啶
<220>
<221>misc_feature
<222>(15)..(16)
<223>n是5-甲基胞嘧啶
<400>2
tntcccagcgtgcgnnat                                     18
<210>3
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>n是5-甲基胞嘧啶
<220>
<221>misc_feature
<222>(4)..(4)
<223>n是5-甲基胞嘧啶
<220>
<221>misc_feature
<222>(15)..(16)
<223>n是5-甲基胞嘧啶
<400>3
tntnccagcg tgcgnnat                                    18
<210>4
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>n是5-甲基胞嘧啶
<220>
<221>misc_feature
<222>(4)..(4)
<223>n是5-甲基胞嘧啶
<220>
<221>misc_feature
<222>(15)..(16)
<223>n是5-甲基胞嘧啶
<400>4
tntnccagcg tgcgnnat                                    18
<210>5
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>n是5-甲基胞嘧啶
<220>
<221>misc_feature
<222>(15)..(16)
<223>n是5-甲基胞嘧啶
<400>5
tntcccagcg tgcgnnat                                    18
<210>6
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>n是5-甲基胞嘧啶
<220>
<221>misc_feature
<222>(15)..(16)
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<223>合成寡核苷酸序列
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<223>合成寡核苷酸序列
<400>64
cctggtggac aacatcgccc tgt                              23

Claims (25)

1.10-30个核苷碱基长度的寡聚化合物，其包含与人Bcl-2mRNA上第1459(5’)位至第1476(3’)位碱基位置之间的区域可特异性杂交的靶结合区，所述靶结合区具有下式：
5′-[(DNA/RNA)0-1-(LNA/LNA*)2-7-(DNA/RNA/LNA*)4-14-(LNA/LNA*)2-7-(DNA/RNA)0-1]-3′
其中，“LNA”表示LNA核苷酸，“LNA*”表示LNA类似物核苷酸；并且
所述靶结合区包含至少两个通过硫代磷酸酯基团(-O-P(O，S)-O-)连接的LNA核苷酸或LNA类似物核苷酸。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中所述靶结合区中的大量核苷酸连键是硫代磷酸酯基团(-O-P(O，S)-O-)。
3.根据权利要求2所述的化合物，其中寡聚化合物中的所有核苷酸连键是硫代磷酸酯基团。
4.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其中所述靶结合区中10-50％的核苷碱基是LNA核苷酸的核苷碱基。
5.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其中所述靶结合区具有式5’-[LNA2-7-(DNA)4-14-LNA2-7-(DNA/RNA)]-3’。
6.根据权利要求1-4中任一项所述的化合物，其中所述靶结合区具有式5’-[(DNA/RNA)-LNA2-7-(DNA)4-14-LNA2-7-(DNA/RNA)]-3’。
7.根据权利要求1-4中任一项所述的化合物，其中所述靶结合区具有式5’-[(DNA/RNA)-LNA2-7-(DNA)4-14-LNA2-7]-3’。
8.根据权利要求1-4中任一项所述的化合物，其中所述靶结合区具有式5’-[LNA2-7-(DNA)4-14-LNA2-7]-3’。
9.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其中所述靶结合区中10-100％的核苷碱基是LNA类似物核苷酸(LNA*)的核苷碱基。
10.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其中所述靶结合区与和其特异性杂交的人Bcl-2mRNA上第1459(5’)位至第1476(3’)位碱基位置之间的部分区域互补，其中可能有至多2个非互补核苷碱基除外。
11.根据权利要求10所述的化合物，其中所述靶结合区与和其特异性杂交的人Bcl-2mRNA上第1459(5’)位至第1476(3’)位碱基位置之间的部分区域互补。
12.根据权利要求11所述的化合物，其中所述靶结合区选自SEQID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、12、13、14、35、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51和52。
13.根据权利要求12所述的化合物，其中所述靶结合区是SEQ IDNO：8。
14.根据权利要求13所述的化合物，其中所述靶结合区是SEQ IDNO：35。
15.根据权利要求10所述的化合物，其中所述靶结合区与和其特异性杂交的人Bcl-2mRNA上第1459(5’)位至第1476(3’)位碱基位置之间的部分区域互补，其中1-2个非互补核苷碱基除外。
16.根据权利要求15所述的化合物，其中所述靶结合区包含CCCAXCGT亚序列，其中X不是G(鸟嘌呤)。
17.根据权利要求16所述的化合物，其中所述靶结合区选自SRQID NO：15、17、18、19、21、22、23、24、25、26、27、28、29、53、54和55。
18.根据权利要求17所述的化合物，其中所述靶结合区选自SEQID NO：15。
19.根据权利要求17所述的化合物，其中所述靶结合区选自SEQID NO：29。
20.包含根据权利要求1-19中任一项所述的寡聚化合物和至少一种共价连接到所述化合物上的非核苷酸/非多核苷酸部分的缀合物。
21.包含根据权利要求1-19中任一项所述的寡聚化合物或根据权利要求20所述的缀合物和药物可接受载体的药物组合物。
22.根据权利要求21所述的药物组合物，其包含选自化疗化合物、抗炎化合物、抗病毒化合物、细胞生长抑制化合物、抗血管生成化合物、抗增殖化合物、促凋亡化合物、信号转导调节剂和激酶抑制剂中的额外药剂。
23.根据权利要求1-19中任一项所述的寡聚化合物或根据权利要求20的缀合物用作药物。
24.根据权利要求1-19中任一项所述的寡聚化合物或根据权利要求20的缀合物在制备用于治疗癌症疾病的药物中的用途。
25.包含与编码人Bcl-2蛋白的核糖核酸杂交的化合物的复合物，所述化合物是权利要求1-19中任一项定义的寡聚化合物或权利要求20定义的缀合物。
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