MX2008003198A - Compuestos antagonistas de acido ribonucleico (arn) para la inhibicion de expresion apo-b1oo - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a oligonucleótidos dirigidos contra el gen Apo-B100, para modular la expresión de Apo-B100. Las composiciones comprenden oligonucleótidos, particularmente oligonucleótidos antisentido, dirigidos aácidos nucleicos que codifican la Apo-B100. Se proporcionan métodos para usar estos compuestos para modulación de la expresión Apo-B100 y para el tratamiento de enfermedades asociadas con ya sea la sobre expresión de Apo-B100, expresión de Apo-B100 mutada o ambas. Ejemplos de enfermedades son cáncer tal como cáncer de pulmón, mama, colon, próstata, páncreas, pulmón, hígado, tiroides, riñón, cerebro, testículos, estómago, intestino, estómago, médula espinal, senos, vejiga, tracto urinario u ovario. Los oligonucleótidos pueden estar compuestos de desoxirribonucleósidos o un análogo deácido nucleico tal como por ejemplo,ácido nucleico bloqueado o una combinación de los mismos.

Description

COMPUESTOS ANTAGONISTAS DE ACIDO RIBONUCLEICO (ARN) PARA LA INHIBICIÓN DE EXPRESIÓN APO-B100 CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona composiciones y métodos para modular la expresión de Apo-BlOO. En particular, esta invención se refiere a compuestos de oligonucleótido los cuales hibridizan específicamente con ácidos nucleicos que codifican Apo-BlOO . Los compuestos de oligonucleótidos han sido mostrados por modular la expresión de Apo-BlOO y preparaciones farmacéuticas de los mismos y se describe su uso como tratamiento de enfermedades cancerígenas .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La apolipoproteína B (también conocida como ApoB, apolipoproteína B-100; ApoB-100, apolipoproteína B-48; ApoB-48 y antígeno Ag(x)), es una glicoproteína grande que desempeña un papel indispensable en el montaje y secreción de lípidos y en transporte y absorción mediada por el receptor y suministro de distintas clases de lipoproteínas. La ApoB juega un papel importante en la regulación de niveles de lipoproteína de circulación, y es por lo tanto, relevante en términos de susceptibilidad de aterosclerosis la cual está altamente correlacionada con la concentración ambiente de lipoproteínas que contienen apolipoproteína B. Véase, Ref .: 190320 Davidson and Shelness (Annul Rev. Nutr., 2000, 20, 169-193), para detalles adicionales de las dos formas de ApoB presentes en mamíferos, su estructura e importancia médica de ApoB. Los niveles elevados de plasma de lipoproteína Lp(a) que contiene ApoB-100, están asociados con el riesgo aumentado por aterosclerosis y sus manifestaciones, los cuales pueden incluir hipercolesterolemia (Seed et al., N. Engl. J. Med., 1990, 322, 1494-1499), infarto al miocardio (Sandkamp et al., Clin. Chew., 1990, 36, 20-23), y trombosis (Nowak-Gottl et al., Pediatrics, 1997, 99, Eli). La concentración de plasma de Lp(a) está fuertemente influenciada por factores hereditarios y es refractaria a la mayoría de fármacos y manipulación de dieta (Katan and Beynen, Am. J. Epidemiol., 1987, 125, 387-399; Vessby et al., Atherosclerosis, 1982, 44, 61-71). La terapia farmacológica de niveles elevados de Lp(a), ha sido solamente modestamente exitosa y permanece la aférisis a la mayor modalidad terapéutica efectiva (Hajjar and Nachman, Annul Rev. Med., 1996, 47, 423-442). Las dos formas de apolipoproteína B existen en mamíferos. La ApoB-100 representa la proteína de longitud completa que contiene 4536 residuos de aminoácidos sintetizados exclusivamente en el hígado humano (Davidson and Shelness, Annul Rev. Nutr., 2000, 20, 169-193). Una forma truncada conocida como ApoB-48 es colineal con los 2152 residuos amino terminales y es sintetizada en el intestino delgado de todos los mamíferos (Davidson and Shelness, Annul Rev. Nutr., 2000, 20, 169-193). Las bases por la cual el gen estructural común para la apolipoproteína B produce dos isoformas de proteínas distintas, es un proceso conocido como edición de ARN. Un sitio específico de reacción de edición citosina a uracilo produce un codón de detención UAA y terminación traduccional de apolipoproteína B para producir ApoB-48 (Davidson and Shelness, Annul Rev. Nutr., 2000, 20, 169-193) La significancia medicinal de ApoB de mamífero ha sido verificada usando estudios de ratón transgénico ya sea que sobre expresan ApoB humano (Kim and Young, J. Lipid Res., 1998, 39, 703- 723; Nishina et al., J. Lipid Res., 1990, 31, 859-869) o ratones agénicos ApoB (Farese et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U. S. A., 1995, 92, 1774-1778; Kim and Young, J. Lipid Res., 1998, 39, 703-723). A la fecha, estrategias dirigidas a la inhibición de la función de apolipoproteína B han sido limitadas a aféresis de Lp(a), anticuerpos, fragmentos de anticuerpo y ribozimas. Sin embargo, la baja bioestabilidad y/o baja afinidad de enlace de oligonucleótidos antisentido, ha sido descrita y reivindicada en la publicación de PCT WO 00/97662, WO 03/11887 y WO 2004/44181. Consecuentemente, permanece una necesidad de agentes adicionales capaces de antagonizar efectivamente la función de la apolipoproteína B y consecuentemente, disminuir el nivel de Lp(a) en el plasma. La presente invención proporciona compuestos oligoméricos de Ácido Nucleico Bloqueado (LNA) y su uso en métodos para modular la expresión de apolipoproteína B, que incluye inhibición de la isoforma alternativa de apolipoproteína B ApoB-48.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona composiciones y métodos para modular la expresión de apolipoproteína B (Apo-B100/Apo-B48) . En particular, esta invención se refiere a compuestos de oligonucleótidos sobre porciones específicas dirigidas a la apolipoproteína B. Estas porciones son las SEC ID NOS: 2-26, en particular, SEC ID NOS: 2, 3, 10, 11 y 21. Los diseños específicos de compuestos de oligonucleótido que contienen LNA también se describen. Los compuestos específicamente preferidos son SEC ID NOS: 29-47, en particular, las SEC ID NOS: 29, 30, 31, 36, 37, 38, 40 y 42. Los compuestos de la invención son inhibidores potentes de ARNm de apolipoproteína y expresión de la proteína. La expresión de ApoB regulada descendentemente de las SEC ID NOS: 29 y 30 in vitro, con IC50 alrededor de 1-5 nM, y la SEC ID NO:27, mostró un IC50 de aproximadamente 0.5 nM. La expresión de ARNm de ApoB-100 in vivo, fue suprimida en el hígado y en el yeyuno después del tratamiento con la SEC ID NO: 29 en una manera dependiente de la dosis. Concomitante con los niveles reducidos de ApoB-100, el colesterol total en el plasma se redujo por 70%. Las composiciones farmacéuticas y otras que comprenden los compuestos de oligonucleótidos de la invención, también se proporcionan. Además se proporcionan métodos para modular la expresión de apolipoproteína B en células o tejidos que comprenden contactar dichas células o tejidos con uno o más de los compuestos o composiciones de oligonucleótidos de la invención. También se describen métodos para tratar un animal o un humano, que se sospecha de tener o estar propenso a una enfermedad o afección, asociada con la expresión de apolipoproteína B, administrando una cantidad terapéuticamente o profilácticamente efectiva de uno o más de los compuestos o composiciones de oligonucleótidos de la invención. Además, se proporcionan métodos para usar compuestos de oligonucleótidos para la inhibición de la expresión de apolipoproteína B y para el tratamiento de enfermedades asociadas con la actividad de apolipoproteína B. Ejemplos de tales enfermedades son tipos diferentes de desequilibrio de colesterol HDL/LDL; dislipidemias, por ejemplo, hiperlipidemia combinada familiar (FCHL), hiperlipidemia adquirida, hipercolesterolemia; hipercolesterolemia resistente a estatina; enfermedad de la arteria coronaria (CAD) , enfermedad cardiaca coronaria (CHD) , aterosclerosis .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1A: Expresión relativa de ARNm de ApoB en hepatocitos de ratón (células Hepal-6) después de la absorción asistida por lípido de la SEC ID NO:29, siARN (no modificada) o siARN modificada por colesterilo. Figura IB: Expresión relativa de ApoB en células BNLCL2 después del tratamiento con las SEC ID NOS: 29 y 30. Ambos compuestos son inhibidores potentes del ARNm de ApoB-100 ya a concentración de 1 nM o 5 nM. Figura 2A: Expresión relativa de ARNm de ApoB-100 después del tratamiento (dosificación diaria i.v. por tres días) con la SEC ID NO: 29, siARN (no modificado) (SEC ID NOS: 48/49) o siARN modificado por colesterilo (SEC ID NOS: 50/49) en hígados. Figura 2B: Expresión relativa de ARNm de ApoB-100 después del tratamiento (dosificación diaria i.v por tres días) con la SEC ID NO:29, siARN (no modificado) (SEC ID NOS: 48/49) o siARN modificado por colesterilo (SEC ID NOS: 50/49) en yeyuno. Figura 3: Niveles relativos de colesterol en plasma de ratones tratados con SEC ID NO:29, siARN (no modificado) (SEC ID NOS: 48/49) o siARN modificado por colesterilo (SEC ID NOS: 50/49). Figura 4: Regulación descendente objetivo de ApoB-100 in vi tro en BNCL o células Hepa 1-6. Efecto de respuesta de dosis de la SEC ID NO: 29 y 37 en el nivel de ARNm de ApoB (normalizado a GapDH) a partir de líneas de células de ratón. Figura 5A: Silenciamiento de ApoB-100 in vivo en hígado después del tratamiento antisentido de LNA de ratones C57BL/6. Las moléculas antisentido de LNA fueron dosificadas una dosis (6.25, 12.5 o 25 mg/kg) y el siARN (50 mg/kg) 3 días consecutivos en ratones C57BL/6. Se midió la expresión de ApoB-100 por qPCR y se normalizó a Gapdh. Los datos representan la media + SD (n=7). Figura 5B: Silenciamiento de ApoB-100 in vivo en yeyuno después del tratamiento antisentido de LNA de ratones C57BL/6. Las moléculas antisentido de LNA fueron dosificadas una dosis (6.25, 12.5 o 25 mg/kg) y el siARN (50 mg/kg) 3 días consecutivos en ratones C57BL/6. Se midió la expresión de ApoB-100 por qPCR y se normalizó a Gapdh. Los datos representan la media + SD (n=7). Figura 6A: Niveles de colesterol de plasma después del tratamiento antisentido de LNA. Las moléculas antisentido de LNA fueron dosificadas una dosis (6.25, 12.5 o 25 mg/kg) y el siARN (50 mg/kg) 3 días consecutivos en ratones C57BL/6. Se determinaron los niveles de colesterol de LDL, usando un kit colorimétrico. Los datos representan la media + SD (n=7).

Figura 6B: Niveles de colesterol de plasma después del tratamiento antisentido de LNA. Las moléculas antisentido de LNA fueron dosificadas una dosis (6.25, 12.5 o 25 mg/kg) y el siARN (50 mg/kg) 3 días consecutivos en ratones C57BL/6. Se determinaron los niveles de colesterol total del plasma, usando un kit colorimétrico. Los datos representan la media + SD (n=7). Figura 7 : Muestra la comparación de secuencia del complimiento inverso de las secuencias preferidas del ácido nucleico dirigido a ApoB, las cuales han sido usadas para diseñar compuestos oligoméricos de conformidad con la invención. Figura 8: Selección in vitro y respuesta de dosis (1, 5 o 25 nM) en células Huh-77 (Hepatocitos) tratados con diferentes oligonucleótidos antisentido de LNA y el efecto de oligonucleótidos se midió como regulación descendente de ARNm (ApoB-100) objetivo (QPCR) . Figura 9: IC50 (concentración de oligonucleótido antisentido para dar 50% de inhibición de expresión objetivo (ApoB-100) para 7 oligonucleótidos antisentido de LNA seleccionados, medidos en células Huh-7 analizados por QPCR. Figura 10A: Niveles de ARNm de ApoB-100 medidos en hígado al día de sacrificio 28. Los ratones C57BL/6 fueron dosificados ya sea dos veces semanalmente con 2.5 mg/kg/dosis (total de 8 dosis) o una vez semanalmente 5 mg/kg (total de 4 dosis) por 4 semanas.

Figura 10B: Niveles de LDL de plasma medido una vez semanalmente por 4 semanas en sangre retro orbital. Los ratones C57BL/6 fueron dosificados ya sea dos veces semanalmente con 2.5 mg/kg/dosis (total de 8 dosis) o una vez semanalmente 5 mg/kg (total de 4 dosis) por 4 semanas. Figura HA: Duración de acción medida como niveles de ARNm de ApoB-100 en hígado al día de sacrificio 3, 5, 8, 13 o 21. Los ratones C57BL/6 fueron dosificados una, dos o tres dosis de 25 mg/kg/dosis de SEC ID NO:27 una dosis en cada uno de 1, 2 o 3 días consecutivos, respectivamente. Figura 11B: Colesterol de plasma total medido al día del sacrificio 3, 5, 8, 13 o 21. Ratones hembra C57BL/6 fueron dosificados una, dos o 3 dosis de 25 mg/kg/dosis de SEC ID NO: 37, una dosis cada uno en uno, dos o tres días consecutivos, respectivamente.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención emplea compuestos oligoméricos, particularmente oligonucleótidos antisentido, para uso en la modulación de la función de moléculas de ácido nucleico que codifican la apolipoproteína B (tal como ApoB-100 y/o ApoB-48) . La modulación es finalmente un cambio en la cantidad de apolipoproteína B producida. En una modalidad, esto se realiza proporcionando compuestos oligoméricos, los cuales específicamente hibridizan con ácidos nucleicos, tales como ARN mensajeros, los cuales codifican la apolipoproteína B. La modulación preferiblemente resulta en la inhibición de la expresión de la apolipoproteína B, es decir, conduce a una reducción en el número de proteínas funcionales producidas. Las Figuras 1A y IB demuestran que el siARN y oligonucleótidos antisentido de hebra única que comprenden análogos de nucleótidos de LNA, son potentes en el mismo intervalo nanomolar in vi tro . Sin embargo, in vivo, los oligonucleótidos antisentido de LNA de 16-mer de la invención, son superiores a tanto siARN conjugado de colesterol y no modificado. Las Figuras 2A y 2B muestran oligonucleótidos de LNA de la invención los cuales son hasta 8 veces más potentes que el siARN conjugado con colesterilo in vivo (cotéjese). Los oligonucleótidos de LNA reducen el colesterol total en plasma de ratón, mientras el tratamiento de siRNA no lo es (Figura 3) . Además, oligonucleótidos de LNA son más bioestables que el siARN. Los compuestos oligoméricos, los cuales modulan la expresión del objetivo, son identificados a través de la experimentación o a través del diseño racional basado en la información de secuencia en el objetivo y conocida o mejor conocida por diseñar un compuesto oligonucleótido contra un objetivo deseado. Las secuencias de estos compuestos son modalidades preferidas de la invención. Del mismo modo, las porciones de secuencia en el objetivo al cual estos compuestos oligoméricos preferidos son complementarios (referidos como "manchas calientes") , son sitios preferidos para objetivo.

Compuestos oligoméricos y compuestos oligonucleótidos Los términos "compuestos oligoméricos", los cuales son intercambiables con el término "oligonucleótido", "oligo" y "compuesto oligonucleótido", se refieren, en el contexto de la presente invención, a un oligómero, es decir, un polímero de ácido nucleico (por ejemplo, ácido ribonucleico (ARN) o ácido desoxirribonucleico (ADN) ) , o análogo de ácido nucleico de aquellos conocidos en la técnica, preferiblemente Ácido Nucleico Bloqueado (LNA)), o una mezcla de los mismos). Este término incluye oligonucleótidos compuestos de nucleobases que se originan naturalmente, azúcares y enlaces de internucleósidos (estructura) , así como también oligonucleótidos que tienen porciones que no se originan naturalmente los cuales funcionan similarmente o con funciones mejoradas específicas. Los oligonucleótidos parcialmente modificados o sustituidos, son a menudos preferidos sobre formas nativas, debido a varias propiedades deseables de tales oligonucleótidos, tales como por ejemplo, la capacidad para penetrar una membrana celular, buena resistencia a nucleasas extra e intracelulares, alta afinidad y especificidad para el ácido nucleico objetivo. El análogo de LNA es particularmente preferido, por ejemplo, con respecto a las propiedades mencionadas anteriormente. Por lo tanto, en una modalidad altamente preferida, los términos "compuesto oligomérico", "oligonucleótido", "oligo" y "compuesto oligonucleótido", de conformidad con la invención, son compuestos los cuales son construidos de ambas unidades de nucleótido y análogas de nucleótidos, tales como unidades de LNA para formar un compuesto polimérico de entre 12-50 nucleótidos/análogos de nucleótidos (oligómero) . Por el término "unidad" se entiende un monómero. Los compuestos oligoméricos de la invención son capaces de hibridizar a ya sea el ARN(s) mensajero de apolipoproteína B y/o las hebras de ADN de apolipoproteína B (Apo-B) de mamífero complementarias o sentido. El acceso NCBI No. NM_000384 proporciona una secuencia de ARNm para apolipoproteína B humana. Es altamente preferible que el compuesto oligomérico de la invención sea capaz de hibridizar a la apolipoproteína humana codificada por el ácido nucleico descrito en el Acceso NCBI No. NM_000384, o complemento inverso del mismo, que incluye, en una modalidad preferida, objetivos de ácido nucleico de ARNm derivados de dicha apolipoproteína humana. En una modalidad preferida, los oligonucleótidos son capaces de hibridizar contra el ácido nucleico objetivo, tal como un ARNm de ApoB, para formar un duplo con una Tm de al menos 37°C, tal como al menos 40°C, al menos 50°C, al menos 55°C, o al menos 60°C. En un aspecto, la Tm es entre 37°C y 80°C, tal como entre 50 y 70°C.

Medición de Tm Una solución de 3 µM del compuesto en 10 mM de fosfato de sodio/100 mM de NaCl/0.1 nM de EDTA, a pH 7.0, se mezcla con su oligonucleótido de ADN o ARN de complemento a una concentración de 3 µM en 10 mM de fosfato de sodio/100 mM de NaCl/0.1 nM de EDTA, a pH 7.0 a 90°C por un minuto y se dejó enfriar descendente a temperatura ambiente. La curva de fusión del duplo es entonces determinada midiendo la absorbancia a 260 nm con una velocidad de calentamiento de 1 °C/min, en el intervalo de 25 a 95°C. La Tm es medida como la máxima de la primera derivativa de la curva de fusión. Los compuestos oligoméricos son preferiblemente compuestos oligoméricos antisentido, también referidos como "oligonucleótidos antisentido" e "inhibidores antisentido". Tales inhibidores antisentido, son compuestos los cuales comprenden secuencias análogas de nucleótido/nucleótido complementario al ácido nucleico objetivo, y pueden tomar la forma de "siARN", "miARN", "ribozimas", "oligozimas" . Sin embargo, preferiblemente, los inhibidores antisentido son oligonucleótidos de hebra única.

Los oligonucleótidos de hebra única son preferiblemente complementarios a la región correspondiente del ácido nucleico objetivo. Típicamente, los oligonucleótidos "antisentido" de hebra única, específicamente interactúan con el ARNm del gen objetivo, causando ya sea degradación dirigida del ARNm, por ejemplo, vía el mecanismo RNaseH, o de otro modo, previniendo la traducción. En una modalidad, el compuesto oligomérico de conformidad con la invención, puede dirigir el ADN que codifica el ApoB de mamífero, tal como la hebra de ADN sentido o antisentido. Los siARN son conocidos por ser capaces de interactuar con el ADN objetivo. El compuesto oligomérico de conformidad con la invención, preferiblemente comprende al menos, tres análogos de nucleótidos. Al menos tres análogos de nucleótidos son preferiblemente análogos de nucleótido de ácido nucleico bloqueado, y compuestos oligoméricos los cuales comprenden tales análogos de nucleótidos son referidos aquí como "compuesto oligomérico de LNA", "compuesto oligonucleótido de NLA" y "oligonucleótido de LNA". Adecuadamente, los términos "compuesto oligonucleótido", "compuesto oligomérico", "compuesto oligomérico de LNA", de conformidad con la invención, son oligonucleótidos como se define en este documento, los cuales pueden inducir un efecto terapéutico deseado en humanos a través de por ejemplo, enlace por unión de hidrógeno a un ácido nucleico objetivo. La invención se dirige a un compuesto oligomérico, tal como un oligonucleótido que consiste de 8-50, tal como 10-50, en particular 12-50 ó 12-25 nucleótidos y/o análogos de nucleótido, en donde dicho compuesto comprende una subsecuencia de al menos 8, por ejemplo, al menos 10, tal como al menos 12, tal como al menos 14, tal como al menos 15, tal como 14, 15, 16 ó 17 nucleótidos o análogos de nucleótidos, dicha subsecuencia es localizada dentro (es decir, que corresponde a) una secuencia de la secuencia objetivo de ácido nucleico Apo-BlOO y/o Apo-B48. Los análogos de nucleótido son análogos de sus nucleótidos respectivos de las secuencias SEC ID NOS: 2-26, en particular SEC ID NOS: 2, 3, 10, 11 y 21. De este modo, la subsecuencia del compuesto de la invención, está localizada dentro (es decir, que corresponde a) una secuencia seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NOS: 2-26, en particular, SEC ID NOS: 2, 3, 10, 11 y 21, o comprende análogos de los nucleótidos dentro de la secuencia de las SEC ID NOS: 2-26, en particular, las SEC ID NOS: 2, 3, 10, 11 y 21. Los grupos preferidos de secuencias en las cuales la subsecuencia del compuesto está localizada dentro (o la subsecuencia comprende análogos de los nucleótidos dentro) , incluyen la SEC ID NO: 2 y 3; SEC ID NO: 2 y 3 y 11; SEC ID NO: 10 y 11; SEC ID NO. 21. En una modalidad, el grupo de secuencias en las cuales la subsecuencia del compuesto está localizada dentro (o la subsecuencia comprende análogos de los nucleótidos dentro de) la SEC ID NO: 3. En una modalidad, el grupo de secuencias en las cuales la subsecuencia del compuesto está localizada dentro (o la subsecuencia comprende análogos de los nucleótidos dentro de) una secuencia seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID No 2, SEC ID No 3, SEC ID No 6, SEC ID No 7, SEC ID No 8, SEC ID No 9, SEC ID No 10, SEC ID No 11, SEC ID No 12, SEC ID No 13, SEC ID No 14, SEC ID No 15, SEC ID No 16, SEC ID No 17, SEC ID No 27, SEC ID No 28, SEC ID No 48 y SEC ID No 50. En una modalidad interesante, el compuesto de la invención comprende desde 8-50 nucleótidos, en donde dicho compuesto comprende una subsecuencia de al menos, 8 nucleótidos, dicha subsecuencia está localizada dentro de una secuencia seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NOS: 2 y 3, en donde al menos, un nucleótido es reemplazado por un análogo de nucleótido correspondiente y en donde el extremo 3' comprende nucleótido, preferentemente un análogo de nucleótido. En modalidades del compuesto de la invención que comprende de 8-50 nucleótidos, en donde dicho compuesto comprende una subsecuencia de al menos, 8 nucleótidos, dicha subsecuencia está localizada dentro de una secuencia seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NOS: 2 y 3 y dichos nucleótidos que comprenden análogos de nucleótidos de LNA, la subsecuencia típicamente puede comprender un estiramiento de 2-6 LNA, como se define en este documento, seguido por un estiramiento de 4-12 nucleótidos, el cual es seguido por un estiramiento de 2-6 LNAs, como se define en este documento. Los términos "localizado dentro de"/"que corresponde a", se refieren a la comparación entre la secuencia combinada de nucleótidos y análogos de nucleótidos del compuesto oligomérico de la invención, o subsecuencia del mismo, y la secuencia de nucleótido equivalente de i) el complemento inverso de una secuencia de ácido nucleico de Apolipoproteína B (es decir, el ácido nucleico objetivo) , y/o ii) la secuencia de nucleótidos proporcionada en el grupo que consiste de las SEC ID NOS: 2-26, y 59-67, respectivamente (es decir, una porción de secuencia) , o en una modalidad, los cumplimientos inversos del mismo. Los análogos de nucleótidos son comparados directamente a sus nucleótidos equivalentes. La • subsecuencia puede comprender al menos 8, tal como al menos 9, tal como al menos 10, tal como al menos 11, tal como al menos 12, tal como al menos 13, tal como al menos , tal como al menos 15, tal como al menos 16, tal como al menos 17, tal como al menos 18, tal como al menos 19, o al menos, 20 nucleótidos o análogos de nucleótidos los cuales corresponden a un número equivalente de nucleótidos consecutivos presentes en un ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste de: SEC ID No 63, SEC ID No 64, SEC ID No 65, SEC ID No 66, SEC ID No 67 y SEC ID No 68 (véase Figura 7) . Preferiblemente, al menos 3 análogos de nucleótido están localizados dentro de dicha subsecuencia, opcionalmente como una secuencia consecutiva de al menos, 3 análogos de nucleótido, tal como una secuencia consecutiva de 3, 4, 5 o 6 análogos de nucleótidos. En una modalidad preferida, el compuesto oligomérico consiste solamente de una subsecuencia, es decir, la secuencia completa del compuesto oligomérico se encuentra en la secuencia correspondiente, tal como una secuencia seleccionada del grupo que consiste de la SEC ID No.2-26 y SEC ID NO 59-62. Preferiblemente, no existen nucleótidos o análogos de nucleótidos los cuales formen un desapareamiento cuando se correlaciona con la región correspondiente de la secuencia objetivo de ApoB, es decir, todos los nucleótidos y análogos de nucleótidos presentes en el oligómero de la invención, son capaces de formar apareamiento de bases consecutivas con la secuencia objetivo de ácido nucleico de ApoB. Sin embargo, en una modalidad, puede existir un desapareamiento o dos desapareamientos dentro de una subsecuencia y la secuencia objetivo de ácido nucleico. Cuando ocurre el desapareamiento, puede ser preferido que no estén entre un análogo de nucleótido y la secuencia objetivo. Sin embargo, en una "apertura" de un gamero, el cual es capaz de reclutar RNaseH, el desapareamiento puede conducir a pérdida de la capacidad para reclutar RNaseH. Típicamente, 5 o 6 nucleótidos complementarios consecutivos son requeridos para asegurar suficiente actividad de RNaseH. En una modalidad preferible, el compuesto oligonucleótido de conformidad con la invención, comprende una secuencia la cual corresponde a una SEC ID NO. 59 y/o SEC ID NO.60, en donde dicha subsecuencia puede opcionalmente, comprender uno o dos desapareamientos. En una modalidad, el compuesto oligonucleótido de conformidad con la invención, comprende una secuencia la cual corresponde a una SEC ID NO 61 y/o SEC ID NO 62, en donde dicha subsecuencia puede, opcionalmente, comprender uno o dos desapareamientos . En una modalidad preferible de la invención, la subsecuencia comprende al menos 8, tal como al menos 10 o al menos 12, tal como al menos 14, tal como 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 nucleótidos o análogos de nucleótidos, los cuales están localizados dentro (es decir, que corresponde a) el número equivalente de nucleótidos consecutivos en la SEC ID NO 63, en donde dicha subsecuencia puede, opcionalmente, comprender uno o dos desapareamientos. En modalidades adicionales de la invención, la subsecuencia comprende al menos 8, tal como al menos 10, o al menos 12, tal como al menos 14, tal como entre 14 y 20, tal como 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 nucleótidos o análogos de nucleótidos, los cuales están localizados dentro (es decir, que corresponden a) , el número equivalente de nucleótidos consecutivos en una secuencia de nucleótido seleccionada del grupo que consiste de la SEC ID No 64, SEC ID No 65, SEC ID No 66, SEC ID No 67 y SEC ID No 68, en donde dicha subsecuencia puede opcionalmente, comprender uno o dos desapareamientos. En una modalidad, el compuesto oligomérico de la invención es un oligonucleótido de doble hebra, en donde cada hebra comprende (o consiste de) , un total de 16-30 nucleótidos y/o análogos de nucleótidos. Se debe entender que una hebra del complejo de doble hebra (oligonucleótido), corresponde al compuesto oligonucleótido definido en este documento, y que la otra hebra es un oligonucleótido que tiene una secuencia complementaria. El total de por ejemplo, 8-50 nucleótidos y/o análogos de nucleótidos, está propuesto por significar 8-50 nucleótidos u 8-50 análogos de nucleótidos o una combinación de los mismos que no excede un total combinado de 50 unidades de nucleótidos. Los compuestos consisten preferiblemente desde 12-25 nucleótidos o análogos de nucleótidos, tales como 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 o 24 nucleótidos o análogos de nucleótidos, tal como entre 15 y 22 nucleótidos o análogos de nucleótidos, tal como entre 14 y 18 nucleótidos o análogos de nucleótidos, más preferidos 15 o 16 nucleótidos o análogos de nucleótidos. En el presente contexto, los términos "nucleósido" y "nucleótido", son usados en su significado normal. Por ejemplo, contiene una unidad de 2-desoxirribosa la cual está unida a través de su número de un átomo de carbono a una de las bases nitrogenosas de adenina (A) , citosina (C) , timina (T) o guanina (G) . En una forma similar, el término "nucleótido" significa, por ejemplo, en una modalidad preferida cuando se refiere al compuesto de la invención, el término "nucleótido" se refiere a una unidad 2-desoxirribosa la cual está unida a través de su número de un átomo de carbono a una de las bases nitrogenosas adenina (A) , citosina (C) , timina (T) o guanina (G) , y la cual está unida a través de su número de cinco átomos de carbono a un fosfato internucleósido (o en una modalidad, un equivalente, tal como un grupo fosforotioato) o a un grupo terminal. Un nucleótido puede también por ejemplo en una modalidad, comprender una unidad de ribosa, tal como un nucleótido de ARN. Cuando se usa aquí, el término "análogo de nucleótido", se refiere a un nucleótido que no se origina naturalmente en donde, por ejemplo en una modalidad preferida, ya sea la unidad de ribosa es diferente de 2-desoxirribosa y/o la base nitrogenosa es diferente de A, C, T y G y/o el grupo de enlace de fosfato internucleósido es diferente. Ejemplos específicos de análogos de nucleósidos son descritos por ejemplo, por Freier & Altmann; Nucí. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443 y Uhlmann; Curr. Opinión in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213, y en los Esquemas de Reacción 1. Los términos "análogo de nucleótido/nucleósido correspondiente" y "nucleósido/nucleótido correspondiente", están propuestos para indicar que la base nitrogenosa en el análogo de nucleósido/nucleótido y el nucleósido/nucleótido, son idénticas. Por ejemplo, cuando la unidad de 2-desoxiribosa del nucleótido está ligada a una adenina, el "análogo nucleósido correspondiente", contiene una unidad pentosa (diferente de 2-desoxirribosa) unida a una adenina. El término "ácido nucleico", es definido como una molécula formada por enlace covalente de dos o más nucleótidos. Los términos "ácido nucleico" y "polinucleótido", son usados intercambiablemente aquí. Por ejemplo, ADN y ARN son ácidos nucleicos. El término "análogo de ácido nucleico" se refiere a un compuesto de enlace al ácido nucleico que no se origina naturalmente, es decir, en una modalidad preferida, un compuesto tal como una secuencia de al menos un nucleótido y al menos un análogo de nucleótido, tal como una unidad LNA. Tales compuestos no son encontrados naturalmente dentro del organismo de mamífero (o, en una modalidad, no son públicamente conocidos por encontrarse dentro del organismo del mamífero al tiempo de la invención) . Un análogo de nucleótido preferido es LNA, tal como beta-D-oxi-LNA, alfa-L-oxi-LNA, beta-D-amino-LNA y beta-D-tio-LNA, más preferido, beta-D-oxi-LNA. Los compuestos de la invención son típicamente aquellos en donde dichos nucleótidos comprenden un grupo de enlace seleccionado del grupo que consiste de un grupo fosfato, un grupo fosforotioato y un grupo boranofosfato, el enlace internucleósido puede ser -0-P(0)2-0-, -0-P(0,S)-0, en particular, un grupo fosfato y/o un grupo fosforotioato. En una modalidad particular, todos los nucleótidos comprenden un grupo fosforotioato. En una modalidad, algunos o todos los nucleótidos están ligados entre sí por medio de un grupo fosforotioato. Adecuadamente, todos los nucleótidos están ligados entre sí por medio de un grupo fosforotioato. Los nucleótidos son típicamente ligados entre sí por medio de un grupo enlazante. Análogos de nucleótido y análogos de ácido nucleico se describen en, por ejemplo, Freier & Altmann (Nucí. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443) y Uhlmann (Curr. Opinión in Drug & Development (2000, 3(2): 293-213). Los Esquemas de Reacción 1 y 2 ilustran ejemplos seleccionados de análogos de nucleótido adecuados para elaborar ácidos nucleicos: Fosforo tionto 2'-0-Mctilo 2'-MOE 2'-Fluoro 2--AP HNA CeNA PNA 2'-F-ANA 2'-(3-hidroxi)propiIo Boranofosfatos Esquema de Reacción 1 En una modalidad interesante, los compuestos comprenden desde 3-12 análogos de nucleótido, por ejemplo, 6 o 7 análogos de nucleótido. En las modalidades más lejanas preferidas, al menos uno de dichos análogos de nucleótidos es un ácido nucleico bloqueado (LNA) , tal como al menos dos, o al menos 3 o' al menos 4, o al menos 5, o al menos 6, o al menos 7, o al menos 8, o al menos 9, o al menos 10, o al menos 11, de los análogos de nucleótido puede ser LNA, en una modalidad, todos los análogos de nucleótidos pueden ser LNA. El término "LNA" se refiere a un análogo de nucleótido que contiene un análogo de nucleótido bicíclico, también referido como un monómero LNA. El término "LNA" cuando se usa en el contexto de "oligonucleótidos LNA", se refiere a un oligonucleótido que contiene uno o más análogos de nucleósido bicíclico. El Ácido Nucleico Bloqueado (LNA) usado en los compuestos oligonucleótidos de la invención, tiene la estructura de la fórmula general X y Y son seleccionados independientemente entre los grupos -O-, -S-, -N(H)-, N(R)-, -CH2- o -CH- (si es parte de un doble enlace), -CH2-0-, -CH2-S-, -CH2-N(H)-, -CH2-N(R)-, -CH2-CH2 o -CH2-CH- (si es parte de un doble enlace), -CH=CH-, en donde R se selecciona de hidrógeno y alquilo C?_ ; Z y Z* se seleccionan independientemente entre un enlace internucleósido, un grupo terminal o un grupo protector; B constituye una nucleobase natural o no natural; y los grupos asimétricos se pueden encontrar en cualquier orientación. Preferiblemente, el Ácido Nucleico Bloqueado (LNA) usado en el compuesto oligonucleótido de la invención, comprende al menos una unidad de Ácido Nucleico Bloqueado (LNA) de conformidad con cualquiera de las fórmulas en donde Y es -O-, -S-, -NH-, o N(RH); Z y Z* son seleccionados independientemente entre un enlace internucleósido, un grupo terminal o un grupo protector; B constituye una nucleobase natural o no natural, y RH se selecciona de hidrógeno y alquilo C?~ . Preferiblemente, el Ácido Nucleico Bloqueado (LNA) usado en el compuesto oligonucleótido de la invención comprende enlaces internucleósido seleccionados del grupo que consiste de -O-, P(0)2-0-, -O-P (O, S) -0-, -0-P(S)2-0-, S-P(0)2-0, -S-P(0,S)-0, -S-0(S)2-0-, -0-P(0)2-S-, -0-P(0,S) -S-, -S-P(0)2-S, -0-P0(RH)-0-, 0-P0(0CH3)-0-, -0-P0 (NRH) -0-, -0- PO(OCH2CH2S-R) -0-, -0-P0(BH3) -0-, -0-P0 (NHRH) -0-, -0-P (0) 2-NR- , -NRH-P(0) 2-0-, -NRH-CO-0, en donde RH se selecciona de hidrógeno y alquilo C?- . Como se declara, en una modalidad interesante de la invención, los compuestos oligonucleótidos contienen al menos, una unidad de la química llamada LNA (Ácido Nucleico Bloqueado) . Unidades LNA específicamente preferidas se muestran en el Esquema de Reacción 2. ß-D-amino-LNA Esquema de Reacción 2 El término "tio-LNA", comprende un nucleótido bloqueado en el cual, al menos uno de X y Y en la fórmula general anterior se selecciona de S o -CH2-S. Tio-LNA puede estar en configuración tanto beta-D como alfa-L. El término "amino-LNA", comprende un nucleótido bloqueado en el cual, al menos uno de X o Y en la fórmula general anterior -N(H)-, N(R)-, CH2-N(H)-, -CH2-N(R), en donde R se selecciona de hidrógeno y alquilo C?- . Amino-LNA puede estar en configuración tanto beta-D como alfa-L. El término "oxi-LNA" comprende un nucleótido bloqueado en el cual al menos, uno de X o Y en la fórmula generar anterior representa -O- o -CH2-0. Oxi-LNA puede estar en la configuración tanto beta-D como alfa-L. El término "ena-LNA" comprende un nucleótido bloqueado en el cual, Y en la fórmula general anterior es -CH2-0- (en donde el átomo de oxígeno de -CH2-0- está unido a la posición 2' con relación a la nucleobase B) . En una modalidad preferida, LNA se selecciona de beta-D-oxi-LNA, alfa-L-oxi-LNA, beta-D-amino-LNA y beta-D-tio-LNA, en particular beta-D-oxi-LNA. Los nucleósidos y/o LNAs son típicamente ligados en conjunto por medio de grupos fosfato y/o por medio de grupos fosforotioato. El término "al menos uno", comprende los números entero más grandes que o iguales a 1, tal como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 y así sucesivamente. Como se usa en este documento, el término "ácido nucleico objetivo", abarca ADN que codifican el Apo-BlOO, ARN (que incluye pre-mARN y ARN, y edición de ARNm) transcritos de tal ADN, y también ADNc derivado de tal ARN. La "proteína objetivo" es una apolipoproteína de mamífero B, preferiblemente apolipoproteína humana B. Se reconocerá que como la ApoB-100 y ApoB-48 ambas se originan de la misma secuencia genética, tales compuestos oligoméricos de conformidad con la invención, pueden ser usados para regulación descendente de ya sea, ambas formas de apolipoproteína B, y tanto ARNm que codifica ApoB-100, como la forma editada de ARN la cual codifica a Apo-B48. Como se usa en este documento, el término "gen" significa el gen que incluye exones, intrones, regiones no codificantes 5' y 3' y elementos regulatorios y todas las variantes actualmente conocidas de los mismos y cualquiera de las variantes adicionales las cuales pueden ser elucidadas. Como se usa en este documento, el término "ARNm" significa los transcriptos ARNm actualmente conocidos de un gen objetivo, y cualquiera de los transcriptos adicionales, los cuales pueden ser identificados. Como se usa en este documento, el término "modulación", significa ya sea un incremento (estimulación) o un decremento (inhibición) en la expresión de un gen. En la presente invención, inhibición es la forma preferida de modulación de la expresión del gen y ARNm es un objetivo preferido. Como se usa en este documento, el término "objetivo" de un compuesto antisentido a un ácido nucleico objetivo particular, significa proporcionar el oligonucleótido antisentido a la célula, animal o humana en tal forma que el compuesto antisentido es capaz de enlazarse y modular la función de su objetivo propuesto. Un análogo de nucleótido preferido es LNA. Un análogo de nucleótido preferido adicional es cuando el enlace fosfato internucleósido es un fosforotioato. Un análogo de nucleótido preferido todavía adicional es en donde el nucleótido es LNA con un enlace fosforotioato internucleósido. En una modalidad interesante, el extremo 3' del compuesto de la invención comprende un nucleótido, preferentemente un análogo de nucleótido. Preferiblemente, el compuesto oligonucleótido, tal como un oligonucleótido antisentido, de conformidad con la invención, comprende al menos una unidad de Ácido Nucleico Bloqueado (LNA), tal como 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 unidades de Ácido Nucleico Bloqueado (LNA) , preferiblemente entre 4 a 9 unidades LNA, tal como 6-9 unidades LNA, más preferiblemente 6, 7 u 8 unidades LNA. Preferiblemente, las unidades LNA comprenden al menos, una unidad beta-D-oxi-LNA tal como 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 unidades beta-D-oxi-LNA. Todas las unidades LNA pueden ser unidades beta-D-oxi-LNA, aunque se considera que los compuestos oligoméricos, tales como el oligonucleótido antisentido, pueden comprender más de un tipo de unidad de LNA. Adecuadamente, el compuesto oligomérico puede comprender tanto beta-D-oxi-LNA, y uno o más de las siguientes unidades LNA: tio-LNA, amino-LNA, oxi-LNA, ena-LNA y/o alfa-LNA, en ya sea las configuraciones D-beta o L-alfa o combinaciones de las mismas. En una modalidad del compuesto de la invención el cual comprende análogos de nucleótido, tal como análogos de nucleótido LNA, la subsecuencia típicamente puede comprender un estiramiento de 2-6 análogos de nucleótido, tal como análogos de nucleótido de LNA, como se define en este documento, seguido por un estiramiento de 4-12 nucleótidos, los cuales son seguidos por un estiramiento de 2-6 nucleótidos análogos, tales como análogos de nucleótido LNA, como se define en este documento. Subsecuencias que comprenden un estiramiento de análogos de nucleótido, tal como análogos de nucleótido LNA, seguido por un estiramiento de nucleótidos, seguido por un estiramiento de análogos de nucleótido LNA, son conocidos como gapmeros.

Adecuadamente, en tal modalidad de "gapmero", dicha subsecuencia comprende un estiramiento de 4 análogos de nucleótido, tal como análogos de nucleótido LNA, como se define aquí, seguido por un estiramiento de 8 nucleótidos, el cual es seguido por un estiramiento de 4 análogos de nucleótido, tal como análogos de nucleótido de LNA como se define en este documento, opcionalmente con un nucleótido único al extremo 3' . En una modalidad de "gapmero" adicional, dicha subsecuencia comprende un estiramiento de 3 análogos de nucleótido, tal como análogos de nucleótido LNA como se define en este documento, seguido por un estiramiento de 9 nucleótidos, el cual es seguido por un estiramiento de 3 análogos de nucleótido, tal como análogos de nucleótido de LNA como se define en este documento, opcionalmente con un nucleótido único al extremo 3' . Tal diseño ha sido encontrado sorprendentemente por ser muy efectivo. En una modalidad de "gapmero" adicional, dicha subsecuencia comprende un estiramiento de 4 análogos de nucleótido, tal como análogos de nucleótido LNA como se define en este documento, seguido por un estiramiento de 8 nucleótidos, el cual es seguido por un estiramiento de 3 análogos de nucleótido, tal como análogos de nucleótido de LNA como se define en este documento, opcionalmente con un nucleótido único al extremo 3' .

Preferiblemente, el compuesto oligomérico, tal como un nucleótido antisentido, puede comprender unidades tanto LNA como ADN. Preferiblemente, el total combinado de unidades de LNA y ADN es entre 14-20, tal como entre 15-18, más preferiblemente 16 o 17 unidades LNA/ADN. Preferiblemente, la relación de LNA a ADN presente en el compuesto oligomérico de la invención, es entre 0.3 y 1, más preferiblemente, entre 0.4 y 0.9, tal como entre 0.6 y 0.8. Preferiblemente el compuesto oligomérico, tal como un nucleótido antisentido, de conformidad con la invención es un gapmero, que comprende una secuencia de polinucleótido de fórmula (5' a 3'), A-B-C (y opcionalmente D) , en donde; A (región 5') que consiste o comprende de al menos, una unidad LNA, tal como entre 1-6 unidades LNA, preferiblemente entre 2-5 unidades LNA, más preferiblemente 4 unidades LNA y; B (dominio central) , preferiblemente inmediatamente 3' a A, consiste o comprende al menos una unidad de azúcar de ADN, tal como 1-2 unidades de ADN, preferiblemente entre 4-12 unidades de ADN, más preferiblemente, entre 6-10 unidades de ADN, tal como entre 7-9 unidades de ADN, más preferiblemente, 8 unidades de ADN y; C (región 3') preferiblemente inmediatamente 3' a B que consiste o comprende de al menos, una unidad de LNA, tal como entre 1-6 unidades LNA, preferiblemente entre 2-5 unidades LNA, más preferiblemente 4 unidades LNA. Los diseños de gapmero preferidos se describe en el documento WO2004/046160. En un oligonucleótido gapmero, es preferible que cualquier desapareamiento no esté dentro del dominio central (C) anterior, el cual preferiblemente comprende o consiste de unidades de ADN. Para digestión RNAse H, se encuentra típicamente que al menos 5 nucleótidos consecutivos (o análogos lo cuales son capaces de reclutar RNaseH al híbrido oligo/objetivo) , son requeridos en el dominio central. Por lo tanto, para gapmeros, en donde el dominio central excede 5 nucleótidos consecutivos, se contempla que uno, o posiblemente dos desapareamientos pueden ser aceptables, aunque no preferibles. En una modalidad de oligonucleótidos gapmeros, puede ser preferido que cualquier desapareamiento se localice hacia el término 5' o 3' del gapmero. En tal modalidad, se prefiere que en un oligonucleótido gapmero el cual comprende desapareamientos con el ARNm objetivo, que tales desapareamientos estén localizados en ya sea las regiones 5' y/o 3' , y/o dichos desapareamientos sean entre la unidad de nucleótido terminal al 5' o 3' de dicho oligonucleótido de gapmero y molécula objetivo. En una modalidad, el gapmero de fórmula A-B-C, además comprende una región adiciona, D, la cual consiste o comprende, preferiblemente consiste de un residuo terminal de azúcar de ADN de la región 3' (C) del compuesto oligomérico, tal como entre uno y tres residuos de azúcar de ADN, que incluyen entre 1 y 2 residuos de azúcar de ADN, más preferiblemente, 1 residuo de azúcar de ADN. En una modalidad, dentro del compuesto oligomérico de conformidad con la invención, tal como un oligonucleótido antisentido, el cual comprende LNA, todos los residuos LNAc son 5' -metil-citosina . En una modalidad particularmente interesante, el compuesto tiene la fórmula 5'-[(LNA)3-4-(DNA/RNA)8.9-(LNA)3-(DNA/RNA)1]-3' en donde "LNA" designa un nucleótido LNA y "ADN" y "ARN" designa un desoxirribonucleótido y un ribonucleótido, respectivamente . Más particularmente, el compuesto puede ser seleccionado del grupo que consiste de las SEC ID NOS: 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46 y 47. Compuestos preferidos pueden ser seleccionados del grupo que consiste de las SEC ID No. 29, 30, 31, 32, 36, 37, 38, 40, 41 y 42, o del grupo que consiste de la SEC ID No. 30 y 31, y/o del grupo que consiste de la SEC ID NO. 36, 37 y 38, y/o del grupo que consiste de la SEC ID NO 41 y 42. Compuestos actualmente más preferidos son aquellos seleccionados del grupo que consiste de las SEC ID NO: 29, SEC ID NO:30 y SEC ID NO:37. Adecuadamente, dichos nucleótidos y/o dichos LNA pueden ser ligados en conjunto por medio de grupos fosfato y/o grupos fosforotioato o combinaciones de los mismos. En una modalidad, dichos nucleótidos y/o dichos LNA son preferiblemente ligados en conjunto por medio de grupos fosforotioato. En una modalidad, la invención proporciona un compuesto oligonucleótido que comprende o consiste de la SEC ID NO:29. En una modalidad, la invención proporciona un compuesto oligonucleótido que comprende o consiste de la SEC ID NO:30. En una modalidad, la invención proporciona un compuesto oligonucleótido que comprende o consiste de la SEC ID NO:31. En una modalidad, la invención proporciona un compuesto oligonucleótido que comprende o consiste de la SEC ID NO:32. En una modalidad, la invención proporciona un compuesto oligonucleótido que comprende o consiste de la SEC ID NO:33. En una modalidad, la invención proporciona un compuesto oligonucleótido que comprende o consiste de la SEC ID NO:34. En una modalidad, la invención proporciona un compuesto oligonucleótido que comprende o consiste de la SEC ID NO:35. En una modalidad, la invención proporciona un compuesto oligonucleótido que comprende o consiste de la SEC ID NO:36. En una modalidad, la invención proporciona un compuesto oligonucleótido que comprende o consiste de la SEC ID NO:37. En una modalidad, la invención proporciona un compuesto oligonucleótido que comprende o consiste de la SEC ID NO:38. En una modalidad, la invención proporciona un compuesto oligonucleótido que comprende o consiste de la SEC ID NO:39. En una modalidad, la invención proporciona un compuesto oligonucleótido que comprende o consiste de la SEC ID NO: 40. En una modalidad, la invención proporciona un compuesto oligonucleótido que comprende o consiste de la SEC ID NO:41. En una modalidad, la invención proporciona un compuesto oligonucleótido que comprende o consiste de la SEC ID NO:42. En una modalidad, la invención proporciona un compuesto oligonucleótido que comprende o consiste de la SEC ID NO:43.

En una modalidad, la invención proporciona un compuesto oligonucleótido que comprende o consiste de la SEC ID NO:44. En una modalidad, la invención proporciona un compuesto oligonucleótido que comprende o consiste de la SEC ID NO: 5. En una modalidad, la invención proporciona un compuesto oligonucleótido que comprende o consiste de la SEC ID NO:46. En una modalidad, la invención proporciona un compuesto oligonucleótido que comprende o consiste de la SEC ID NO: 47. En una modalidad, cuando el oligonucleótido de conformidad con la invención es un oligonucleótido de ARN, tal como las SEC ID No 48, 49, 50 o 51, el 3' terminal contiene dos unidades de ribonucleótido co-unidas de 2'-0-metil-modificada, inmediatamente adyacentes al ribonucleótido terminal .

Preparación de compuestos oligonucleótidos El análogo de nucleótido LNA construye bloques (ß-D-oxi-LNA, ß-D-tio-LNA, ß-D-amino-LNA y -L-oxi-LNA) , pueden ser preparados siguiendo procedimientos publicados y referencias citadas aquí, véase el documento WO 03/095467 Al; D. S. Pedersen, C. Rosenbohm, T. Koch (2002) Preparation of LNA Phosphoramidites, Synthesis 6, 802-808; M. D. S0rensen, L. Kvcern0, T. Bryld, A. E. Hakansson, B. Verbeure, G. Gaubert, P. Herdewijn, J. Wengel (2002) a-L-ribo- configured Locked Nucleic Acid (a-l-LNA) : Synthesis and Properties, J. Am. Chem. Soc, 124, 2164-2176; S. K. Singh, R. Kumar, J. Wengel (1998) Synthesis of Novel Bicyclo [2.2.1] Ribonucleosides : 2 ' -Amino- and 2 ' -Thio-LNA Monomeric Nucleosides, J. Org. Chem. 1998, 63, 6078-6079; C. Rosenbohm, S. M. Christensen, M. D. S0rensen, D. S. Pedersen, L. E. Larsen, J. Wengel, T. Koch (2003) Synthesis of 2 ' -amino-LNA: a new strategy, Org. Biomol . Chem. 1, 655-663; y el documento WO 2004/069991 A2. Un ejemplo particular de un monómero LNA de timidina es el (ÍS, 3R, R, 7S) -7-hidroxi-l-hidroximetil-3- (timin-lil) -2, 5-dioxa-biciclo [2:2:1] heptano. Los oligonucleótidos LNA pueden ser preparados, como se describe en los Ejemplos y en los documentos WO 99/14226, WO 00/56746, WO 00/56748, WO 00/66604, WO 00/125248, WO 02/28875, WO 2002/094250 y WO 03/006475. De este modo, los oligonucleótidos LNA pueden ser producidos usando las técnicas de oligomerización de química de ácido nucleico bien conocidas por una persona de habilidad ordinaria en la técnica de química orgánica. En general, los ciclos de oligomerización del procedimientos de fosforamidita (S. L. Beaucage and R. P. Iyer, Tetrahedron, 1993, 49, 6123; S. L.

Beaucage and R. P. Iyer, Tetrahedron, 1992, 48, 2223) son usados, pero por ejemplo, la química de H-fosfonato, química de fosfotriéster también puede ser usada. Para algunos monómeros, el tiempo de acoplamiento más largo y/o acoplamientos repetidos y/o uso de más reactivos de acoplamiento concentrados, pueden ser necesarios o benéficos. Las fosforamiditas empleadas se acoplan típicamente con rendimientos satisfactorios por etapas de >95%. La oxidación del Fósforo (III) a Fósforo (IV), normalmente se hace con por ejemplo, yodo/pirídina/H20. Este proporciona después desprotección del enlace internucleósido fosforodiéster nativo. En el caso de que un enlace internucleósido de fosforotioato sea preparado, se realiza una etapa de tiolación intercambiando la oxidación normal, por ejemplo, yodo/pirídina/H20, usada para la síntesis de enlaces internucleósidos de fosforodiéster con una oxidación usando el reactivo ADTT (hidruro de xantano (0.01M en acetonitrilo:piridina 9:1; v/v)). Otros reactivos de tiolación también son posibles de usar, tal como Beaucage y PADS. Los oligonucleótidos LNA de fosforotioato fueron eficientemente sintetizados con acoplamiento por etapas proporcionando > = 98%. Los oligonucleótidos LNA que comprenden ß-D-amino-LNA, ß-D-tio-LNA y/o a-L-LNA, también pueden ser eficientemente sintetizados con el acoplamiento por etapas proporcionando > 98% usando los procedimientos de fosforamidita. La purificación de oligonucleótidos de LNA puede ser realizada usando cartuchos de purificación de fase inversa desechables y/o CLAR de fase inversa y/o precipitación de etanol y butanol. La e.lectroforesis en gel capilar, CLAR de fase inversa, MALDI-MS y ESI-MS, fueron usados para verificar la pureza de los oligonucleótidos LNA sintetizados.

Sales Los oligonucleótidos LNA pueden ser empleados en una variedad de sales farmacéuticamente aceptables. Como se usa en este documento, el término se refiere a sales que retienen la actividad biológica del oligonucleótido LNA y exhiben efectos toxicológicos indeseados mínimos. Ejemplos no limitantes de tales sales se pueden formar con sales de adición de base y aminoácido formadas con cationes metálicos tales como zinc, calcio, bismuto, bario, magnesio, aluminio, cobre, cobalto, níquel, cadmio, sodio, potasio y similares, o con un catión formado de amoníaco, N, N-dibenciletilen-diamina, D-glucosamina, tetraetilamonio o etilendiamina; o combinaciones, por ejemplo, de una sal de tanato de zinc o similares.

Tales sales se forman a partir de oligonucleótidos de LNA, los cuales poseen un grupo fosforodiéster y/o fosforotioato y son, por ejemplo, sales con bases adecuadas. Estas sales incluyen por ejemplo, sales metálicas no tóxicas las cuales se derivan de metales de grupos la, Ib, lia y Ilb del Sistema Periódico de Elementos, en particular, sales de metales álcalis adecuados, por ejemplo, sales de litio, sodio o potasio' o sales de metales alcalinotérreos, por ejemplo, sales de magnesio o calcio. Además incluyen sales de amonio y zinc y también sales las cuales se forman con aminas orgánicas adecuadas, tales como mono, di o tri-alquilaminas insustituidas o hidroxilo-sustituidas, en particular, mono, di o tri-alquilaminas, o con compuestos de amonio cuaternarios, por ejemplo, con N-metil-N-etilamina, dietilamina, trietilamina, mono, bis o tris- (2-hidroxi-alquiloinferior) aminas, tales como mono, bis o tris- (2-hidroxietil) amina, 2-hidroxi-terc-butilamina o tris (hidroximetil) metilamina, N, N-di-alquilo inferior-N- (hidroxialquilo inferior) aminas, tales como N, N-dimetil-N- (2-hidroxietil) -amina o tri- (2-hidroxietil) amina o N-metil-D-glucamina, o compuestos de amonio cuaternarios tales como sales de tetrabutilamonio. Sales de litio, sales de sodio, sales de magnesio, sales de zinc o sales de potasio son preferidas, con sales de sodio siendo particularmente preferidas.

Profármacos En una modalidad, el oligonucleótido LNA puede estar en la forma de un profármaco. Los oligonucleótidos son en virtud, iones negativamente cargados. Debido a la naturaleza lipofílica de membranas celulares, la absorción celular de oligonucleótidos se reduce comparada con equivalentes neutrales o lipofílicos. Este "obstáculo" de polaridad puede ser evitado usando el procedimiento de profármaco (véase por ejemplo, Crooke, R. M. (1998) in Crooke, S. T. Antisense research and Application. Springer-Verlag, Berlín, Germany, vol. 131, pp. 103-140). En este procedimiento, los oligonucleótidos LNA se preparan en una manera protegida de forma que los oligonucleótidos LNA son neutrales cuando se administran. Estos grupos de protección son designados en tal forma que pueden ser removidos cuando el oligonucleótido LNA es tomado por las células. Ejemplos de tales grupos de protección son S-acetiltioetilo (SATE) o -S-pivaloiltioetilo (t-butil-SATE) . Estos grupos de protección son resistentes a nucleasa y son selectivamente removidos intracelularmente.

Conj ugados Un aspecto adicional de la invención se refiere a conjugados que comprenden el compuesto como se define en este documento al menos una porción no polinucleótido o no nucleótido covalentemente unida a dicho compuesto. En un aspecto relacionado de la invención, el compuesto de la invención está ligado a ligandos para formar un conjugado a dichos ligandos propuestos para incrementar la absorción celular del conjugado con relación a los oligonucleótidos antisentido. Los compuestos o conjugados de la invención pueden también ser conjugados o además conjugados a sustancias de fármaco activas, por ejemplo, aspirina, ibuprofeno, un fármaco sulfa, un agente que reduce el colesterol, un antidiabético, un agente antibacteriano, un agente quimioterapéutico o un antibiótico. En el presente contexto, el término "conjugado", está propuesto para indicar una molécula heterogénea formada por la unión covalente de un oligonucleótido LNA como se describe en este documento (es decir, un compuesto que comprende una secuencia de nucleósidos y análogos de nucleósido de LNA) a uno o más porciones no nucleótido o no polinucleótido. De este modo, los oligonucleótidos de LNA pueden por ejemplo, ser conjugados o formar quimeras con porciones no nucleótido o no polinucleótido que incluyen, Ácidos Nucleicos Péptidos (PNA), proteínas (por ejemplo, anticuerpos para una proteína objetivo) , macromoléculas, substancias de fármacos de bajo peso molecular, cadenas de ácidos grasos, residuos de azúcar, glicoproteínas, polímeros (por ejemplo, polietilenglicol) , grupos que forman micelo, anticuerpos, carbohidratos, grupos enlazantes al receptor, esferoides tales como colesterol, polipéptidos, agentes intercalantes tales como un derivado acridina, un alcohol de cadena larga, un dendrímero, un fosfolípido y otros grupos lipofílicos o combinaciones de los mismos, etc., solo como los oligonucleótidos LNA pueden ser arreglados en estructuras diméricas o dendríticas. Los oligonucleótidos o conjugados de LNA pueden también ser conjugados o además conjugados a sustancias de fármacos activos por ejemplo, aspirina, ibuprofeno, un fármaco sulfa, un antidiabético, un agente antibacteriano, un compuesto quimioterapéutico o un antibiótico . La conjugación en esta forma, confiere propiedades ventajosas con respecto a las características farmacocinéticas de oligonucleótidos de LNA. En particular, la conjugación en esta forma logra absorción celular incrementada . En una modalidad, un oligonucleótido LNA está ligado a ligandos para formar un conjugado, dichos ligandos están propuestos para incrementar la absorción celular del conjugado con relación a oligonucleótidos LNA antisentido. Esta conjugación puede tomar lugar en las posiciones terminales 5'/3'-OH, pero los ligandos también pueden tomar lugar en los azúcares y/o las bases. En particular, el factor de crecimiento al cual el oligonucleótido antisentido LNA puede ser conjugado puede comprender, transferrina o folato. Los complejos de transferrina-polilisina-oligonucleótido o complejos de folato-polilisina-oligonucleótido, pueden ser preparados por absorción por células que expresan niveles elevados de transferrina o receptor folato. Otros ejemplos de conjugados/ligandos son porciones de colesterol, intercaladores dúplex, tales como acridina, poli-L-lisina, "extremo tapado" con uno o más grupos de enlace resistentes a nucleasa tales como fosforomonotioato, y similares. La preparación de complejos de transferrina como portadores de absorción de oligonucleótido en células, se describe por Wagner et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87, 3410-3414 (1990) . El suministro celular de conjugados de folato-macromolécula vía endocitosis del receptor folato, que incluyen el suministro de un oligonucleótido antisentido, se describe por Low et al., U.S. Patent 5,108,921. También véase, Leamon et al., Proc. Nati. Acad. Sci. 88, 5572 (1991).

Composición farmacéutica Un aspecto particularmente interesante de la invención, se dirige a una composición farmacéutica que comprende un compuesto como se define en este documento o un conjugado como se define aquí, y un diluyente, portador o adyuvante farmacéuticamente aceptable. En una modalidad particularmente interesante, la composición farmacéutica es adaptada para administración oral. Las instrucciones para la preparación de composiciones farmacéuticas se pueden encontrar en "Remington: The Science and Practice of Pharmacy" by Alfonso R. Gennaro, y en lo siguiente. Se debe entender que la presente invención también es particularmente relevante para una composición farmacéutica, la cual comprende al menos, un constructo de oligonucleótido antisentido de la invención como un ingrediente activo. Se debe entender que la composición farmacéutica de conformidad con la invención, opcionalmente comprende un portador farmacéutico, y que la composición farmacéutica opcionalmente comprende compuestos antisentido opcionales, agentes quimioterapéuticos, agentes que reducen el colesterol, compuestos anti-inflamatorios, compuestos antivirales y/o compuestos inmuno-modulantes. Como se declara, las composiciones farmacéuticas de la invención pueden además, comprender al menos un compuesto terapéutico/profiláctico. El compuesto es típicamente seleccionado del grupo que consiste de resinas secuestrantes de sal biliar (por ejemplo, colestiramina, colestipol y clorhidrato de colesevelam) , inhibidores de la reductasa HMGCoA (por ejemplo, lovastatina, cerivastatina, prevastatina, atorvastatina, simvastatina y fluvastatina) , ácido nicotínico, derivados de ácido fíbrico (por ejemplo, clofibrato, gemfibrozil, fenofibrato, bezafibrato y ciprofibrato) , probucol, neomicina, dextrotiroxina, esteres de estanol de planta, inhibidores de absorción de colesterol (por ejemplo, ezetimibe) , implitapido, inhibidores de transportadores de ácido biliar (transportadores de ácido biliar dependientes de sodio apical), reguladores de CYP7a hepáticos, terapéuticos de reemplazo de estrógeno (por ejemplo, tamoxifeno) , y anti-inflamatorios (por ejemplo, glucocorticoides) . El conjugado o compuesto oligonucleótido comprendido en esta invención, puede ser empleado en una variedad de sales farmacéuticamente aceptables. Como se usa en este documento, el término se refiere a sales que retienen la actividad biológica de los compuestos identificados aquí, y exhiben mínimos efectos toxicológicos indeseados, cotéjese "Conjugados" . En una modalidad de la invención, el compuesto o conjugado de oligonucleótido puede estar en la forma de un profármaco, cotéjese "Profármacos". La invención también incluye la formulación de uno o más compuestos o conjugados de oligonucleótidos como se describe aquí. Agentes y adyuvantes de enlace farmacéuticamente aceptables, pueden comprender parte del fármaco formulado. Cápsulas, tabletas y pildoras, etc., pueden contener por ejemplo, los siguientes compuestos: celulosa microcristalina, goma o gelatina como aglutinantes; almidón o lactosa como excipientes; estearatos como lubricantes; varios endulzantes o agentes saborizantes. Para cápsulas, la unidad de dosificación puede contener un portador líquido como aceites grasos. Del mismo modo, revestimientos de azúcar o agentes entéricos pueden ser parte de la unidad de dosificación. Las formulaciones de oligonucleótido pueden también ser emulsiones de ingredientes farmacéuticos activos y un lípido que forma una emulsión micelar. Tales formulaciones son particularmente empleadas para administración oral. Un oligonucleótido de la invención puede ser mezclado con cualquier material que no deteriora la acción deseada, o con material que suplementa la acción deseada. Esto podría incluir otros fármacos que incluyen otros compuestos de nucleótidos. Para administración parenteral, subcutánea, intradérmica o tópica, la formulación puede incluir un diluyente estéril, amortiguadores, reguladores de la tonicidad y antibacterianos. El compuesto activo puede ser preparado con portadores que protegen contra la degradación o eliminación inmediata del cuerpo, que incluye implantes o microcápsulas con propiedades de liberación controlada. Para administración intravenosa, los portadores preferidos son salina fisiológica o salina amortiguada de fosfato. Preferiblemente, un compuesto oligonucleótido está incluid en una formulación unitaria tal como en un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable en una cantidad suficiente para suministrar a un paciente una cantidad terapéuticamente efectiva sin causar efectos colaterales serios en el paciente tratado. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención, pueden ser administradas en un número de formas dependiendo de si el tratamiento local o sistémico se desea y del área a ser tratada. La administración puede ser (a) oral o (b) pulmonar, por ejemplo, por inhalación o insuflación de polvos o aerosoles, que incluyen por nebulizador; intratecal, intranasal, (c) tópica que incluye epidérmica, transdérmica, oftálmica y a las membranas de la mucosa que incluyen, suministro rectal y vaginal; o (d) parenteral que incluye inyección o infusión intravenosa, intraarterial, subcutánea, intraperitoneal o intramuscular; o intracraneal por ejemplo, administración intratecal o intraventricular . En una modalidad, el oligonucleótido LNA activo es administrado IV, IP, oralmente, tópicamente o como una inyección de bolo o administrado directamente en el órgano objetivo. Composiciones y formulaciones farmacéuticas para administración tópica, pueden incluir parches transdérmicos, ungüentos, lociones, cremas, geles, gotas, atomizadores, supositorios, líquidos y polvos. Portadores farmacéuticos convencionales, acuosos, polvos o bases aceitosas, espesantes y similares, pueden ser necesarios o deseables. Los condones revestidos, guantes y similares, también pueden ser útiles. Las formulaciones típicas preferidas incluyen aquellas en las cuales los oligonucleótidos de la invención están en mezcla con un agente de suministro tópico tal como lípidos, liposomas, ácidos grasos, esteres de ácidos grasos, agentes quelantes y tensoactivos. Las composiciones y formulaciones para administración oral incluyen pero no se restringen a, polvos o granulos, micropartículas, nanopartículas, suspensiones o soluciones en agua o medio no acuoso, cápsulas, cápsulas de gel, saquillos, tabletas, minitabletas . Típicamente. Las composiciones y formulaciones para administración parenteral, intratecal o intraventricular, pueden incluir soluciones acuosas estériles, las cuales también contienen amortiguadores, diluyentes y otros aditivos adecuados tales como, pero no limitados a, intensificadores de la penetración, compuestos portadores y otros portadores o excipientes farmacéuticamente aceptables. Composiciones farmacéuticas de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, soluciones, emulsiones, formulaciones que contienen liposoma. Estas composiciones pueden ser generadas a partir de una variedad de compuestos que incluyen, pero no se limitan a, líquidos preformados, sólidos auto-emulsificantes y semisólidos auto-emulsificantes . El suministro del fármaco al tejido del hígado puede ser mejorado por suministro mediado por el portador que incluye pero no se limita a, liposomas catiónicas, ciclodextrinas, derivados de porfirina, dendrímeros de cadena ramificada, polímeros de polietilenimina, nanopartículas y microesferas (Dass CR. J Pharm Pharmacol 2002; 54(1): 3-27). Las formulaciones farmacéuticas de la presente invención, las cuales pueden ser convenientemente presentadas en forma de dosificación unitaria, pueden ser preparadas de conformidad con las técnicas convencionales bien conocidas en la industria farmacéutica. Tales técnicas incluyen la etapa de llevar en asociación los ingredientes activos con portadores o excipientes farmacéuticos. En general, las formulaciones son preparadas uniformemente e íntimamente llevando en asociación los ingredientes activos con los portadores líquidos o portadores sólidos finamente divididos o ambos, y después, si es necesario, formar el producto. Las composiciones de la presente invención pueden ser formulada en cualquiera de muchas formas de dosificación posibles, tales como, pero no limitadas a, tabletas, cápsulas, cápsulas de gel, atomizadores líquidos, geles suaves y supositorios. Las composiciones de la presente invención también pueden ser formuladas como suspensiones, en medio acuoso, no acuoso o mezclado. Las suspensiones acuosas pueden además, contener sustancias las cuales incrementan la viscosidad de la suspensión que incluyen, por ejemplo, carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol y/o dextrano. La suspensión puede también contener estabilizadores. Los compuestos oligonucleótidos que contienen LNA son empleados para un número de aplicaciones terapéuticas como se indica anteriormente. En general, los métodos terapéuticos de la invención incluyen, administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un oligonucleótido LNA-modificad a un mamífero, particularmente un humano. En cierta modalidad, la presente invención proporciona composiciones farmacéutipas que contienen (a) uno o más compuestos antisentido y (b) uno o más agentes que reducen el colesterol, los cuales funcionan por un mecanismo no antisentido. Cuando se usa con los compuestos de la invención, tales agentes que reducen el colesterol pueden ser usados individualmente (por ejemplo, atorvastatina y oligonucleótido) , secuencialmente (por ejemplo, atorvastatina y oligonucleótido por un periodo de tiempo seguido por otro agente y oligonucleótido) , o en combinación con uno o más de otros agentes que reducen el colesterol. Todos los agentes que reducen el colesterol conocidos para una persona experta en la técnica, están aquí incorporados como tratamientos de combinación con compuestos de conformidad con la invención. Fármacos anti-inflamatorios incluyen pero no se limitan a fármacos anti-inflamatorios no esteroidales y corticoesteroides, fármacos antivirales y fármacos inmuno-modulantes, pueden también ser combinados en composiciones de la invención. Dos o más compuestos combinados pueden ser usados en conjunto o secuencialmente. En otra modalidad, las composiciones de la invención pueden contener uno o más compuestos antisentido, particularmente oligonucleótidos, dirigidos a un primer ácido nucleico y uno o más compuestos antisentido adicionales dirigidos a un segundo objetivo de ácido nucleico. Dos o más compuestos combinados pueden ser usados ' en conjunto o secuencialmente. La dosificación es dependiente de la severidad y sensibilidad del estado de enfermedad a ser tratado, y el curso de duración del tratamiento de varios días a varios meses, o hasta que una cura se efectúa o una disminución del estado de enfermedad se logra. Los programas de dosificación óptimos pueden ser calculados a partir de mediciones de acumulación de fármaco en el cuerpo del paciente. Las dosificaciones óptimas pueden variar dependiendo de la potencia relativa de oligonucleótidos individuales. En general, se puede estimar basados en EC50 encontrados por ser activos en modelos animales in vi tro e in vivo . En general, la forma de dosificación es desde 0.01 µg hasta 1 g por kg de peso corporal y puede ser dada una ver o más veces diariamente, semanalmente, mensualmente o anualmente, o aún una vez cada 2 a 10 años o por infusión continua por horas hasta varios meses. Las proporciones de repetición para dosificación pueden ser estimadas basadas en tiempos y concentraciones de residencia medidos del fármaco en fluidos o tejidos corporales. Después del tratamiento exitoso, puede ser deseable tener que someter al paciente a terapia de mantenimiento para prevenir la incidencia del estado de enfermedad.

Método de tra tamiento Una persona experta en la técnica apreciará que los compuestos de oligonucleótidos que contienen LNA, pueden ser usados para combatir la apolipoproteína B (apo-BlOO) ligados a enfermedades por muchos principios diferentes, los cuales de este modo, caen dentro del alcance de la presente invención. Los compuestos oligonucleótidos de LNA pueden ser diseñados -como siARN, los cuales son moléculas de ARN de doble hebra pequeñas, que son usadas por células para silenciar genes exógenos o endógenos específicos, por un mecanismo "similar a anti-sentido" aún escasamente entendido.

Se ha mostrado que el ß-D-oxi-LNA no soporta la actividad RNaseH. Sin embargo, esto puede ser cambiado de conformidad con la invención, creando oligonucleótidos quiméricos compuestos de ß-D-oxi-LNA y ADN, llamados gapmeros. Un gapmero se basa en un estiramiento central de 4-12 nt de ADN o monómeros modificados reconocibles y desdoblables por RNaseH (el gap) típicamente flanqueados por 1 a 6 residuos de ß-D-oxi-LNA (los flancos). Los flancos pueden también ser construidos con derivados de LNA. Existen otros constructos quiméricos de conformidad con la invención, que son capaces de actuar vía un mecanismo mediado por RNaseH. Un mer de cabeza es definido por un estiramiento continuo de derivados ß-D-oxi-LNA o LNA al extremo 5' , seguido por un estiramiento contiguo de ADN o monómeros modificados reconocibles y desdoblables por el RNaseH hacia el extremo 3' y un mero de cola es definido por un estiramiento continuo de ADN o monómeros modificados reconocibles y desdoblables por el RNase al extremo 5' , seguido por un estiramiento contiguo de derivados ß-D-oxi-LNA o LNA hacia el extremo 3' . Otras quimeras de conformidad con la invención, llamadas mezclas de mer que consisten de una composición alterna de ADN o monómeros modificados reconocibles y desdoblables por RNaseH y derivados ß-D-oxi-LNA y/o LNA, podrían también ser capaz de mediar el enlace y desdoblamiento de RNaseH. Puesto que el -L-LNA recluta actividad RNaseH a una cierta magnitud, aperturas más pequeñas de ADN o monómeros modificados reconocibles y desdoblables por el RNaseH para el constructo gapmero, podrían ser requeridos, y se podría introducir más flexibilidad en la construcción de la mezcla de mer. La efectividad clínica de oligonucleótidos antisentido depende de una extensión significante en su farmacocinética, por ejemplo, absorción, distribución, absorción celular, metabolismo y excreción. En cambio, estos parámetros son guiados significantemente por la química fundamental y el tamaño y estructura tridimensional del oligonucleótido. Modular las propiedades farmacocinéticas de un oligonucleótido LNA de conformidad con la invención, puede además lograrse a través de la unión de una variedad de porciones diferentes. Por ejemplo, la capacidad de oligonucleótidos para pasar la membrana celular por ser mejorados por unión por ejemplo, de porciones lípidas tales como una porción de colesterol, un tioéter, una cadena alifática, un fosfolípido o una poliamina al oligonucleotido . Del mismo modo, la absorción de oligonucleótidos LNA en las células puede ser mejorada conjugando porciones al oligonucleótido que interactúa con moléculas en la membrana, las cuales median el transporte en el citoplasma. Las propiedades farmacodinámicas pueden de conformidad con la invención, ser mejoradas con grupos que intensifican la absorción de oligómero, mejoran la bioestabilidad tal como resistencia al oligómero mejorada para degradación y/o incrementan la especificidad y características de afinidad de hibridización de oligonucleótido con la secuencia objetivo, por ejemplo, una secuencia de ARNm. La composición farmacéutica de conformidad con la invención, puede ser usada para el tratamiento de afecciones asociadas con niveles anormales de ApoB-100. Ejemplos de tales afecciones son hiperlipoproteinemia, hiperlipoproteinemia familiar tipo 3 (disbetalipoproteinemia familiar) y hiperalfalipoproteinemia familiar; hiperlipidemia, hiperlipidemias mezcladas, hiperlipidemia tipo lipoproteína múltiple, y hiperlipidemia familiar combinada; hipertrigliceridemia, hipertrigliceridemia familiar, y lipasa de lipoproteína familiar; hipercolesterolemia, hipercolesterolemia familiar de hipercolesterolemia resistente a estatina, hipercolesterolemia poligénica y apolipoproteína B defectiva familiar; trastornos cardiovasculares que incluyen aterosclerosis y enfermedad de arteria coronaria; trombosis; enfermedad vascular periférica; enfermedad von Gierker (enfermedad de almacenamiento de glicógeno, tipo I) ; lipodistrofias (formas adquiridas y congénitas) ; síndrome Cushing; Dwarfismo ateloítico sexual (deficiencia aislada de la hormona del crecimiento) ; diabetes mellitus; hipertiroidismo; hipertensión; anorexia nerviosa; síndrome de Werner; profiria intermitente aguda; cirrosis biliar primaria; obstrucción biliar extrahepática; hepatitis aguda; hepatoma; lupus eritematoso sistémico; gammopatías monoclonales (que incluyen mieloma, mieloma múltiple, macroglobulinemia y linfoma) ; endocrinopatías; obesidad; síndrome nefrótico; síndrome metabólico; inflamación; hipotiroidismo; uremia (hiperurecemia) ; impotencia; enfermedad hepática obstructiva; hipercalcemia idiopática; disglobulinemia; niveles elevados de insulina; Síndrome X; contractura Dupuitren; SIDA; y enfermedad de Alzheimer y demencia. La invención también proporciona métodos para reducir el riesgo de una afección que comprende la etapa de administrar a un individuo, una cantidad de compuesto de la invención, suficiente para inhibir la expresión de apolipoproteína B, dicha afección se selecciona de embarazo; claudicación intermitente; gota; y toxicidad por mercurio y enfermedades por amalgama. La invención además proporciona métodos para inhibir el enlace de partículas de colesterol a endotelio vascular que comprende la etapa de administrar a un individuo, una cantidad de un compuesto de la invención, suficiente para inhibir la expresión de apolipoproteína B, y como un resultado, la invención también proporciona métodos para reducir el riesgo de: (1) oxidación de partículas de colesterol; (ii) enlace de monocitos a endotelio vascular; (iii) diferenciación de monocitos en macrófagos; (iv) ingestión de macrófago de 30 partículas lípidas oxidadas y liberación de citocinas (que incluyen pero no se limitan a IL-1, TNF-alfa, TGF-beta) ; (v) formación de plaquetas de lesiones fibrograsas fibrosas e inflamación; (vi) lesiones del endotelio que conducen a coágulos; y (vii) coágulos que conducen a infarto miocardial o apoplejía, también comprenden la etapa de administrar a un individuo, una cantidad de un compuesto de la invención, suficiente para inhibir la expresión de apolipoproteína B. La invención también proporciona métodos para reducir la hiperlipidemia asociada con alcoholismo, tabaquismo, uso de anticonceptivos orales, uso de glucocorticoides, uso de agentes bloqueadores beta-adrenérgicos, o uso de isotretinoina (ácido 13-cis retinoico) , que comprende la etapa de administrar a un individuo, una cantidad de un compuesto de la invención suficiente para inhibir la expresión de apolipoproteína B. La invención además proporciona el uso de un compuesto de la invención, en la manufactura de un medicamento para el tratamiento de cualquiera y todas las afecciones descritas aquí.

En general declarado, un aspecto de la invención se dirige a un método para tratar un mamífero que sufre de, o es susceptible a afecciones asociadas con niveles anormales de Apo-BlOO, que comprende administrar al mamífero, una cantidad terapéuticamente efectiva de un oligonucleótido dirigido a Apo-BlOO que comprende una o más unidades LNA. Un aspecto interesante de la invención se dirige al uso de un compuesto como se define en este documento, o como un conjugado como se define aquí, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de una afección de conformidad con lo anterior. Los métodos de la invención son preferiblemente empleados para el tratamiento o profilaxis contra enfermedades causadas por niveles anormales de ApoB-100. Además, la invención descrita aquí, abarca un método para prevenir o tratar una enfermedad que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de oligonucleótido que modula Apo-BlOO, que incluye pero no se limita a altas dosis del oligómero, a un humano en necesidad de tal terapia. La invención además abarca el uso de un periodo corto de administración de un compuesto oligonucleótido que modula Apo-BlOO. En una modalidad de la invención, el compuesto oligonucleótido está ligado a ligandos/conjugados . Es una forma de incrementar la absorción celular de oligonucleótidos antisentido. Los compuestos oligonucleótidos de la invención también pueden ser conjugados a sustancias de fármacos activos, por ejemplo, aspirina, ibuprofeno, un fármaco sulfa, un antidiabético, un antibacteriano o un antibiótico. Alternativamente declarado, la invención además se dirige a un método para tratar niveles anormales de ApoB-100, dicho método comprende administrar un compuesto como se define aquí, o un conjugado como se define aquí o una composición farmacéutica como se define aquí, aun paciente en necesidad del mismo y además, comprende la administración de un agente quimioterapéutico adicional. Dicha administración además puede ser tal que el agente quimioterapéutico es conjugado al compuesto de la invención, está presente en la composición farmacéutica, o es administrado en una formulación separada. Los compuestos oligonucleótidos que contienen LNA de la presente invención, también pueden ser utilizados como reactivos de investigación para diagnóstico, terapéutico y profilaxis. En investigación, los oligonucleótidos antisentido pueden ser usados para inhibir específicamente la síntesis de genes Apo-BlOO en células y animales experimentales, con ello, facilitando el análisis funcional del objetivo o en una evaluación de su utilidad como objetivo para intervención terapéutica. En diagnóstico, los oligonucleótidos antisentidos pueden ser usados para detectar y cuantificar la expresión Apo-BlOO en células y tejidos por manchado Northern, hibridización in situ, o técnicas similares. Para terapéuticos, un animal o humano, sospechoso de tener una enfermedad o trastorno, el cual puede ser tratado modulando la expresión de Apo-BlOO, es tratado administrando compuestos antisentido de conformidad con esta invención. Además, se proporcionan métodos para tratar un animal particular, ratón y rata y tratar un humano que se sospecha de tener o s.er propenso a una enfermedad o afección, asociada con la expresión de Apo-BlOO, administrando terapéuticamente o profilácticamente, una cantidad efectiva de uno o más compuestos o composiciones antisentido de la invención . La invención también se refiere a un compuesto o conjugado como se define aquí para uso como un medicamento. La invención además se refiere al uso de un compuesto o un conjugado como se define aquí, para la manufactura de un medicamento para el tratamiento de niveles anormales de Apo-BlOO. Típicamente, dichos niveles anormales de Apo-BlOO están en la forma de aterosclerosis, hipercolesterolemia o hiperlipidemia. Sin embargo, la invención se refiere a un método para tratar un sujeto que sufre de una enfermedad o afección seleccionada de aterosclerosis, hipercolesterolemia e hiperlipidemia, el método comprende la etapa de administrar una composición farmacéutica como se define aquí al sujeto en necesidad del mismo. Preferiblemente, la composición farmacéutica es administrada oralmente.

Algunas modalidades de la invención 1. Un compuesto que consiste de un total de 12-50 nucleótidos y/o análogos de nucleótidos, en donde dicho compuesto comprende una subsecuencia de al menos 10 nucleótidos o análogos de nucleótidos, dicha subsecuencia está localizada dentro de una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NOS: SEC ID No 2, SEC ID No 3, SEC ID No 6, SEC ID No 7, SEC ID No 8, SEC ID No 9, SEC ID No 10, SEC ID No 11, SEC ID No 12, SEC ID No 13, SEC ID No 14, SEC ID No 15, SEC ID No 16, SEC ID Amo 17, SEC ID No 27, SEC ID No 28, SEC ID No 48 y SEC ID No 50, en donde dicho compuesto comprende al menos 3 análogos de nucleótidos. 2. Un compuesto de conformidad con la reivindicación 1, que consiste de un oligonucleótido de doble hebra, en donde cada hebra comprende un total de 16-30 nucleótidos y/o análogos de nucleótidos, en donde dicho compuesto comprende una subsecuencia de al menos, 10 nucleótidos o análogos de nucleótidos, dicha subsecuencia está localizada dentro de una secuencia seleccionada de las SEC ID NOS: 27, 28 (y/o 40 o 50), y en donde dicho compuesto comprende al menos 3 análogos de nucleótido. 3. El compuesto de conformidad con la modalidad 1, que consiste de 12-25 nucleótidos o análogos de nucleótidos. 4. El compuesto de conformidad con la modalidad 3, que consiste de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 o 22 nucleótidos o análogos de nucleótidos. 5. El compuesto de conformidad con la modalidad 4, que consiste de 16 nucleótidos o análogos de nucleótidos. 6. El compuesto de conformidad con cualquiera de las modalidades 1-5, en donde dichos nucleótidos comprenden un grupo de enlace seleccionado del grupo que consiste de un grupo fosfato, un grupo fosforotioato y un grupo boranofosfato, el enlace internucleósido puede ser -0-0 (O) 2-0-, -0-P(0,S)-0. 7. El compuesto de conformidad con la modalidad 6, en donde dicho enlace es un grupo fosfato. 8. El compuesto de conformidad con la modalidad 6, en donde dicho enlace es un grupo fosforotioato. 9. El compuesto de conformidad con la modalidad 6, en donde todos los nucleótidos comprenden un grupo fosforotioato. 10. El compuesto de conformidad con la modalidad 9, que comprende desde 3-12 análogos de nucleótido. 11. El compuesto de conformidad con la modalidad 9, que comprende 6 análogos de nucleótidos. 12. El compuesto de conformidad con cualquiera de las modalidades 10-11, en donde al menos uno de dichos análogos de nucleótidos es un ácido nucleico bloqueado (LNA) . 13. El compuesto de conformidad con cualquiera de la modalidad 12, en donde LNA se selecciona de beta-D-oxi-LNA, alfa-L-oxi-LNA, beta-D-amino-LNA o beta-D-tio-LNA. 14. El compuesto de conformidad con la modalidad 13, en donde dichos nucleótidos y/o LNAs son ligados en conjunto por medio de grupos fosfato. 15. El compuesto de conformidad con la modalidad 14, en donde dichos nucleósidos y/o dichos LNAs son ligados en conjunto por medio de grupos fosforotioato. 16. El compuesto de conformidad con la modalidad 12, en donde la secuencia es SEC ID NO: 2. 17. El compuesto de conformidad con la modalidad 12, en donde la secuencia es SEC ID NO: 3. 18. El compuesto de conformidad con la reivindicación 16-17, en donde el LNA del extremo 3' se reemplaza por el nucleósido natural correspondiente. 19. Un compuesto que consiste de la SEC ID NO: 29. 20. Un compuesto que consiste de la SEC ID NO: 30. 21. Un conjugado que comprende el compuesto de conformidad con cualquiera de las modalidades 1-20 y al menos una porción no de nucleótido o no de polinucleótido covalentemente unido al compuesto. 22. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto como se define por cualquiera.de las modalidades 1-20 o un conjugado como se "define en la modalidad 21, y un diluyente portador o adyuvante farmacéuticamente aceptable. 23. La composición farmacéutica de conformidad con la modalidad 22, además comprende al menos un compuesto bajo en colesterol. 24. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 23, en donde el compuesto se selecciona del grupo que consiste de resinas secuestrantes de sal biliar (por ejemplo, colestiramina, colestipol y clorhidrato de colesevelam) , inhibidores de reductada-HMGCoA (por ejemplo, lovastatina, cerivastatina, prevastatina, atorvastatina, simvastatina y fluvastatina) , ácido nicotínico, derivados -de ácido fíbrico (por ejemplo, clofibrato, gemfibrozil, fenofibrato, bezafibrato y ciprofibrato) , probucol, neomicina, dextrotiroxina, esteres de planta estanol, inhibidores de absorción de colesterol (por ejemplo, ezetimiba) , implitapida, inhibidores de transportadores de ácido biliar (transportadores de ácido biliar dependientes de sodio apical) , reguladores de CYP7a hepático, terapéuticos de reemplazo de estrógeno (por ejemplo, tamoxifen) , y antiinflamatorios (por ejemplo, glucocorticoides) . 25. Un compuesto como se define en cualquiera de las modalidades 1-20 o un conjugado como se define en la modalidad 21 para uso como un medicamento. 26. Uso de un compuesto como se define en cualquiera de las modalidades 1-20 o como . un conjugado como se define en la modalidad 21 para la manufactura de un medicamento para el tratamiento de niveles anormales de Apo-BlOO. 27. Uso de conformidad con la modalidad 26, en donde los niveles anormales de Apo-BlOO están en la forma de ateroesclerosis, hiperesterolemia o hiperlipidemia. La invención además se ilustra en una forma no limitante por los siguientes ejemplos.

EJEMPLOS Ej emplo 1 : Sín tesis de Monómero Se preparan bloques de construcción de monómero LNA y derivados de los mismos siguiendo procedimientos publicados y referencias citadas en este documento, véase: WO 03/095467 Al D.S. Pedersen, C. Rosenbohm, T. Koch (2002) Preparation of LNA Phosphoramidites, Synthesis 6, 802-808. M.D. S0rensen, L. KvasrnT, T. Bryld, A.E. Hákansson, B. Verbeure, G. Gaubert, P. Herdewijn, J. Wengel (2002) a-L-ribo-configured Locked Nucleic Acid ( -I-LNA) : Synthesis and Properties, J. Am. Chem. Soc., 124, 2164-2176. S.K. Singh, R. Kumar, J. Wengel (1998) Synthesis of Novel Bicyclo [2.2.1] Ribonucleosides : 2 ' -Amino- and 2'-Thio-LNA Monomeric Nucleosides, J. Org. Chem. 1998, 63, 6078-6079. C. Rosenbohm, S. M. Christensen, M. D. S0rensen, D. S. Pedersen, L. E. Larsen, J. Wengel, T. Koch (2003) Synthesis of 2' -amino-LNA: a new strategy, Org. Biomol. Chem. 1, 655-663. D.S. Pedersen, T. Koch (2003) Analogues of LNA (Locked Nucleic Acid). Synthesis of the 2'-Thio-LNA Thymine and 5-Methyl Cytosine Phosphoramidites, Synthesis 4, 578-582.

Ejemplo 2: Síntesis de Oligonucleótido Los oligonucleótidos se sintetizan usando el procedimiento de fosforamiditas en un sintetizador Expedite 8900/MOSS (Sistema de Síntesis de Oligonucleótido Múltiple) a escala 1 µmol o 15 µmol. Para síntesis a gran escala se un Oligo Piloto Ákta. Al final de la síntesis (DMT-on) , los oligonucleóstidos se desdoblan a partir del soporte sólido usando amoniaco acuoso por 1-2 horas a temperatura ambiente, y desprotección adicional por 4 horas a 65°C. Los oligonucleótidos se purifican por CLAR de fase inversa (CLAR-RP) . Después de remover el grupo DMT, los oligonucleótidos se caracterizan por CLAR-AE, CLAR RP y CGE y además se confirma la masa molecular por ESI-EM. Véase abajo para más detalles.

Preparación del soporte LNA sólido: Preparación de succinil hemiéster de LNA. Se disuelven el monómero 5' -O-Dmt-3' -hidroxi-LNA (500 mg) , anhídrido succínico (1.2 eq) y DMAP (1.2 eq) en DCM (35 mi) . La reacción se agita a temperatura ambiente durante la noche. Después de las extracciones con NaH2P04 0.1 M pH 5.5 (2x) y salmuera (lx), la capa orgánica se seca adicionalmente con Na2S04 anhidro se seca y se evapora. El derivado de hemiéster se obtiene en 95% de rendimiento y se usa son cualquier purificación adicional.

Preparación del soporte LNA El derivado de hemiéster preparado anteriormente (90 µmol) se disuelve en una cantidad mínima de DMF, se agrega DIEA y pyBOP (90 µmol) y se mezclan juntos por 1 minuto. Esta mezcla pre-activada se combina con LCAA-CPG (500 Á, tamaño de malla 80-120, 300 mg) en un sintetizador manual y agitación. Después de 1.5 horas a temperatura ambiente, el soporte se filtra y se lava con DMF, DCM y MeOH. Después del secado, se determina la carga por ser 57 µmol/g (véase Tom Brown, Dorcas J.S. Brown. Los métodos de ayuda de máquina moderna de síntesis de oligodesoxiribonucleótido. En: F. Eckstein, editor, Oligonucleotides and Analogues A Practical Approach. Oxford: IRL Press, 1991: 13-14).

Alargamiento del oligonucleótido El acoplamiento de fosforamidas (A(bz), G(ibu), 5-metil-C(bz)) o T-ß-cianoetil-fosforamidita) se realiza usando una solución de 0.1 M de amidita de 5'-0-DMT desprotegido en acetonitrilo y DCI (4 , 5-diacianoimidazol) en acetonitrilo (0.25 M) como activador. La tionilación se lleva a cabo usando cloruro de xantano (0.01 M en acetonitrilo:piridina %) . El resto de los reactivos son unos típicamente usados para síntesis de oligonucleótido. El protocolo proporcionado por el proveedor es convenientemente optimizado.

Purificación por CLAR-RP: Columna: Xterra RP?8 Velocidad de flujo: 3 ml/min Amortiguadores: 0.1 M de acetato de amonio, pH 8 y acetonitrilo Abreviaturas DMT: Dimetoxitritilo DCI: 4, 5-Dicianoimidazol DMAP: 4-Dimetilaminopiridina DCM: Diclorometano DMF: Dimetilformamida THF: Tetrahidrofurano DIEA: N, N-diisopropiletilamina PyBOP: Hexafluorofosfato de Benzotriazol-1-il-oxi-tris- pirrolidino-fosfonio Bz: Benzoilo Ibu: Isobutirilo ' Ejemplo 3 : Diseño del compuesto de oligonucleótido El ARNsi es una hebra sentido nucleótido 21 (SEC ID NO: 27) y una hebra antisentido nucleótido 23 (SEC ID NO: 28), resultando en dos nucleótidos sobresalientes en el extremo 3' de la hebra antisentido. Se sintetizan la sentido ApoBARNsi 5'- GUCAUCACACUGAAUACCAA*U-3' (SEC ID NO: 48), hebra antisentido ApoB-1-ARNsi: 5' -AUUGGUAUUCAGUGUGAUGAc*a*C-3 (SE ID NO: 49) y hebra sentido ApoB-ARNsi-Chol : 5' -GUCAUCACACUGAAUACCAAU*Chol- 3' (SEC ID NO: 50) por RNATEC (Leuven) . En una modalidad de la invención, las SEC ID NOS: 2-26 contienen al menos 3 nucleótidos LNA, tal como 6 ó 7 'nucleótidos LNA similares en las SEC ID NOS: 29-47.

Tabla 1. Compuesto de Oligonucleótido de la Invención En las SEC ID NOS: 27, 28, 48, 49, 50, las letras mayúsculas indican unidades de ribonucleótido y los subíndices "s" representan enlaces de fosforotiota.

La SEC ID No: 30 es un compuesto interesante de conformidad con la invención.

Ejemplo 4 : Estabilidad de compuestos LNA en plasma de humano o ra ta Se prueba la estabilidad de oligonucleótido LNA en plasma a partir de humanos o ratas (también puede ser plasma de ratón, mono o perro) . En 45 µl de plasma se agrega 5 µl de oligonucleótido (una concentración final de 20 µM) . Los oligo se incuban en plasma por tiempos que varían de 0 h-96 h a 37°C (el plasma se prueba para actividad de nucleasa hasta 96 h y no muestra diferencia en patrón de desdoblamiento de nucleasa) . En el tiempo indicado, la muestra se congela instantáneamente en nitrógeno líquido. Se diluyen 2 µl (40 pmol iguales) de oligonucleótidos en plasma agregando 15 µl de agua y 3 µl 6x de tinte cargado (Invitrogen) . Se usan como un marcador una escalera 10 pb (Invitrogen 10821-015) . A la escalera de 1 µl, se agrega 1 µl 6x cargado y 4 µl de agua. Las muestras se mezclan, se calientan a 65°C por 10 minutos y se cargan en un gel de pre-corrida (16% de acrilamida, 7 M UREA, Ix TBE, pre-corrida a 50 Watt por 1 hora) y corrida a 50-60 Watt por 2 horas. Subsecuentemente el gel se tiñe con oro lx SyBR (Sondas moleculares) en lx TBE por 15 minutos. Los enlaces se visualizan usando una fosfoimagen a partir de Biorad.

Ejemplo 5 : Modelo in vi tro : Cul tivo Celular El efecto del compuesto antisentido en expresión de ácido nucleico objetivo se puede probar en cualquiera de una variedad de tipos celulares, siempre que el ácido nucleico objetivo esté presente en niveles medibles. El objetivo se puede expresar endógenamente o por transfección transitoria o estable de un ácido nucleico que. codifica el ácido nucleico. El nivel de expresión de ácido nucleico objetivo puede ser rutinariamente determinado usando, por ejemplo, análisis de manchado Northern, RCP Cuantitativa, ensayos de protección de Ribonucleasa. Los siguientes tipos celulares se proporcionan para propósitos ilustrativos, pero otros tipos celulares pueden ser rutinariamente usados, siempre que el objetivo se expresa en el tipo celular escogido. Las células se cultivan en el medio apropiado como se describe a bajo y se mantiene a 37°C a 95-98% de humedad y C02 al 5%. Las células rutinariamente se pasan 2-3 veces semanalmente . BNCL-2 : Se adquiere la línea celular de hígado de ratón BNCL-2 de la ATCC y se cultiva en DMEM (Sigma) con FBS al 10% + Glutamax I + aminoácidos no esenciales + gentamicina . Hepal-6 : Se adquiere la línea celular del hígado de ratón Hepal-6 de la ATCC y se cultiva en DMEM (Sigma) con FBS al 10% + Glutamax I + aminoácidos no esenciales + gentamicina . HepG2 : Se adquiere la línea celular del hígado humano HepG2 de la ATCC y se cultiva en MEM Eagle (Sigma) con FBS al 10% + Glutamax I + aminoácidos no esenciales + gentamicina .

Ejemplo 6: Modelo in vitro : Tratamiento con oligonucleótido antisentido Cultivo celular y transfecciones : Se siembran células BNCL-2 o Hepal-6 en placas de 12 cavidades a 37°C (C02 al 5%) en medio de crecimiento suplementado con FBS al 10%, Glutamax I y Gentamicina. Cuando las células son 60-70% confluentes, se transfectan en duplicado con concentraciones diferentes de oligonucleótidos (0.04-25 nM) usando Lipofectamina 2000 (5 µg/ml). Las transfecciones se llevan a cabo esencialmente como se describe por Dean et al., (1994, JBC 269:16416-16424). En corto, las células se incuban por 10 minutos, con Lipofectamina en OptiMEM seguido por adición de oligonucleótido a un volumen total de 0.5 mi de mezcla de transfección por cavidad. Después de 4 horas, la mezcla de transfección se remueve, las células se lavan y hacen crecer a 37°C por aproximadamente 20 horas (el análisis ARNm y análisis de proteína en el medio de crecimiento apropiado. Las células después se cosechan para proteína o análisis ARN.

Ej emplo 7 : Modelo in vi tro : Extracción de síntesis de ARN o ADNc Aislamiento de ARN total Se aisla ARN total usando un mini kit RNeasy (Qiagen) . Las células se lavan con PBS y Amortiguador de Lisis Celular (RTL, Qiagen) suplementado con mercaptoetanol al 1% agregado directamente a las cavidades. Después de unos pocos minutos, las muestra se procesan de conformidad con las instrucciones del fabricante.

Síntesis de Primera Hebra Se realiza la síntesis de la primera hebra usando cualquiera de kit de TRanscriptasa Inversa OmniScript o transcriptasa Inversa MLV (esencialmente como se describe por el fabricante (Ambion) de conformidad con las instrucciones del fabricante (Qiagen) . Cuando se usa Transcriptasa Inversa OmniScript 0.5 µg total de cada muestra de ARN, se ajusta a 12 µl y se mezcla con 0.2 µl poli (dT)?2-?8 (0.5 µg/µl) (Life Technologies) , 2 µl de mezcla dNTP (5 mM de cada uno) , 2 µl lOx amortiguador RT, 0.5 µl de inhibidor RNase RNAguard™ (33 unidades/ml, Amersham) y 1 µl de Transcriptasa Inversa OmniScript seguido por incubación a 37°C por 60 minutos, e inactivación por calor a 93°C por 5 minutos. Cuando la síntesis de la primera hebra se realiza usando decámeros aleatorios y Transcriptasa Inversa M-MLV (esencialmente como se describe por el fabricante (Ambion) ) 0.25 µg de ARN total de cada muestra se ajusta a 10.8 µl en H20. Se agrega 2 µl de la mezcla dTPN (2.5 mM cada uno). Las muestras se calientan a 70°C por 3 minutos, y se enfrían inmediatamente en agua helada y se agregan 3.25 µl de una mezcla que contienen (2 µl lOx de amortiguador RT; 1 µl de Transcriptasa Inversa M-MLV; 0.25 µl de inhibidor RNase). Se sintetiza ADNc a 42°C por 60 minutos seguido por etapa de inactivación por calentamiento a 95°C por 10 minutos y finalmente se enfría a 4°C.

Ej emplo 8 : Modelo in vi tro o in vivo . Análisis de Inhibición de Oligonucleótido de Expresión Apo-Bl OO por RCP en tiempo Real Se puede someter a ensayo la modulación antisentido de la expresión Apo-BlOO en una variedad de rutas conocidas en la técnica. Por ejemplo, se pueden cuantificar los niveles de ARNm Apo-BlOO por, por ejemplo análisis de manchado Northern, reacción en cadena de polimerasa competitiva (RCP) o RCP cuantitativa de tiempo Real es actualmente preferida. El análisis ARN se puede realizar en ARN celular total o ARNm. Métodos de aislamiento de ARN y análisis de ARN tal como análisis de manchado Northern es de rutina en la técnica y es mostrado en, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons. La (RCP) en tiempo Real puede ser convenientemente lograda usando el Sistema de Detección RCP en Tiempo Real de Multi color iQ disponible de BioRAD. La RCP Cuantitativa en Tiempo Real es una técnica bien conocida en la técnica y se muestra en por ejemplo, Heid et al. Real time quantitative PCR, Genoma Research (1996), 6: 986-994.

Análisis RCP Cuantitativa en tiempo Real de Niveles ARNm Apo-BlOO Para determinar la relación del nivel de ARNm ApoB en ratón en muestras tratadas y no tratadas, se usa en ADNc generado en análisis RCP cuantitativo usando un iCyder a partir de BioRad. A 8 µl de ADNc diluido 5 veces (Gapdh y beta-actina) se agrega 52 µl de una mezcla que contiene 29.5 µl de RCPq Platino. Supermezcla-UDG (In-vitrogen) , 1030 nM de cada cebador, 0.57 X SYBR Verde (Molecular probes) y 11.4 nM de Fluoresceína (Molecular probes) . Se usan duplicados de 25 µl para RCP-Q: 50°C por 120 segundos, 95°C por 120 segundos y 40 ciclos [95°C por 30 segundos y 60°C por 60 segundos] . Se cuantifica la expresión ApoB usando un ADNc diluido 50 veces y un protocolo RCP-Q estándar. Los cebadores (concentración final de cebadores delanteros e inversos 0.6 µM y 0.9 µM) y sonda (concentración final 0.1 µM) se mezclan con 2x de Supermezcla UDG de RCP Cuantitativo Platino (cat. # 11730, Invitrogen) y se agrega a 3.3 µl de ADNc a un volumen final de 25 µl. Cada muestra se analiza en duplicado. Programa RCP: 50°C por 2 minutos, 95°C por 10 minutos seguido por 40 ciclos de 95°C, 15 segundos, 60°C, 1 minuto. La expresión ARNm ApoB se normaliza para ARNm Gapdh o ß-actina de ratón el cual similarmente cuantificada usando RCP-Q.

Cebadores : mGapdh: 5' -agcctcgtcccgtagacaaaat-3'' (SEC ID NO: 51 y 5' -gttgatggcaacaatctccacttt-3' (SEC ID NO: 52). mß-actina: 5' -ccttccttcttgggtatggaa-3' (SEC ID NO: 53) Y 5'-gctcaggaggagcaatgatct-3' (SEC ID NO: 54). mApoB: 5' -gcccattgtggacaagttgatc-3' (SEC ID NO: 55) y 5' -ccaggacttggaggtcttgga-3' (SEC ID NO: 56). Sonda Taqman mAPOB: 5'-fam- aagccagggcctatctccgcatcc-3' (SEC ID NO: 57). Se sintetiza ADNc de 2 veces de diluciones a partir de línea celular Hepatocito de ratón sin tratar (células Hepal-6) (diluidas 5 veces y expresan tanto ApoB como ß-actina o Gapdh) se usa para preparar curvas estándar para los ensayos. Se determinan cantidades relativas de ARNm ApoB a partir del ciclo de Umbral calculado usando el software del Sistema de Detección de Tiempo Real iCycler iQ.

Ejemplo 9 : Análisis in vitro : Análisis de manchado Western de niveles de proteína Apo-Bl OO Se determina el efecto in vitro de oligos Apo-BlOO en niveles de proteína Apo-BlOO en células transfectadas por Manchado Western. Las células se cosechan y se someten a lisis en 50 mM de Tris-HCl, pH 6.8, glicerol al 100%, SDS al 2.5%, 5 mM de DTT y 6 M de urea suplementada con coctel inhibidor de proteasa (Roche) . Las concentraciones de proteína total se miden usando un kit de ensayo de proteína BCA (Pierce) . Se corren 50 µg de la proteína total en geles Bis-Tris al 10-12% en amortiguador MOPS o en geles de Acetato Tris al 3-8% y se bloquean en membranas PVDF de conformidad con las instrucciones del fabricante (Invitrogen) . Después de incubación durante la noche en amortiguador de bloqueo (PBS-T suplementado con polvo de leche bajo en grasa al 5%), las membranas se incuban durante la noche con anticuerpo primario que detecta ApoB-100. Como control de carga, se detectan tubulina o actina usando anticuerpos monoclonales de Neomarker. Las membranas después se incuban con anticuerpos secundarios y se visualiza ApoB-100 usando un kit de inmunodetección cromogénico (Invitrogen) o un kit de detección ECL+ quimioluminiscentes (Amersham) .

Ejemplo 10: Análisis in vi tro : Inhibición Antisentido de Expresión Apo-Bl OO Humano usando oligonucleótidos antisentido De acuerdo con la presente invención, se diseñan una serie de oligonucleótidos para regiones diferentes objetivo del ARN Apo-BlOO humano. Véase la Tabla 1, los compuestos de oligonucleótido se evalúan para su potencial a ARNm Apo-BlOO reducido en hepatocitos de ratón (células Hepal-6) seguido por recuperación asistida de lípido de la SEC ID NO: 29, ARNsi (no modificado) o ARNsi modificado por colesterilo (Figura 1A) y comparación de reducción de ApoB-100 en BNLCL2 por los dos oligonucleótidos LNA de la SEC ID NO: 29 y SEC ID NO: 30 (figura IB) y en células Hepa 1-6 por SEC ID NO: 29 y SEC ID NO: 37 (Figura 4) . Los datos se presentan como porcentajes de regulación descendente en relación a células transfectadas falsas. Se monitorea el estado estable del transcripto por RCP en tiempo Real y se normaliza al estado estable del . transcripto GAPDH. Ejemplo 11 : Desregulación descendente objetivo in vivo de LNA que contienen compuestos de oligonucleótido Los ratones C57BL/6 (20 g) reciben 6.25, 12.5, 25 o 50 mg/kg i.v., en tres días consecutivos (tamaño de grupo de 7 ratones) . Se han dosificado con menos oligonucleótidos antisentido ya que el peso molecular de un ARNsi-Chol comparado a un oligonucleótido antisentido es aproximadamente 3:1. Todo el ARNsi y los oligonucleótidos antisentido se disuelven en salina 0.9% (NaCl) y se proporciona a peso corporal de 10 ml/kg (-0.2 mi por inyección). En el sacrificio, el peso del hígado se registra. Los tejidos para medición de expresión ARNm ApoB se almacenan en ARN último a -20°C (Ambion) hasta el uso. Se realiza el análisis ARNm en Yeyuno e Hígado y colesterol total en plasma 24 horas después de la última inyección i.v. (véase figura 2A y 2B) .

Ejemplo 12 : Niveles de colesterol en plasma Se mide el nivel de colesterol total en plasma usando un ensayo colorimétrico de Colesterol CP a partir de Pentra ABX. El colesterol se mide después de la hidrólisis enzimática y oxidación. Se agrega 21.5 µl de agua a 1.5 µl de plasma. Se agrega 250 µl del reactivo y dentro de los 5 minutos, se mide el contenido de colesterol e una longitud de onda de 540 nM. Las mediciones en cada animal se hacen en duplicados. La sensibilidad y linealidad se prueban con compuesto control diluido 2 veces (control N Pentra ABX) . Se determina el nivel de colesterol relativo por sustracción de la relación antecedente y presente a los niveles de colesterol en plasma del ratón tratado con salina (véase, Figura 3) .

Ejemplo 13. Regulación descendente objetivo in vivo de compuestos de oligonucleótido LNA. Ratones C57BL/6 (20 g) reciben 6.25, 12 ó 25 mg/kg, i.v. en tres días consecutivos (tamaño de grupo de 7 ratones) . Los oligonucleótidos antisentido (SEC ID NO: 29 y SEC ID NO: 37) se disuelven en salina al 0.9% (NaCl) para ser proporcionada a peso corporal de 10 ml/kg (~0.2 mi por inyección) . Los tejidos para medición de expresión ARNm ApoB se acumulan en ARN último (Ambion) a -20°C hasta el uso. Se realiza el análisis ARNm en Yeyuno e Hígado, colesterol total y LDL en plasma 24 horas después de la inyección i.v. (véase, Figuras 5A, 5B, 6A y 6B) .

Ejemplo 14 : Administración Oral de compuestos de oligonucleótido LNA a ra tones Ratones C57BL/6 (20 g) reciben 10 mg/kg, es decir, 0.2 mi, una formulación preparada recientemente de 1.0 mi de oligonucleótido (SEC ID NO: 29 o SEC ID NO: 37) en H20 estéril (7.5 mg/ml), 0.1 mi Tween80, 1.9 mi de aceita de oliva. La concentración final del compuesto de oligonucleótido: 2.5 mg/ml. La formulación se agita por 1 minutos; se somete a sonicación ultra sonido por 5 minutos (repetido 3 veces) . No se observan efectos negativos.

Ejemplo 15: Análisis in vitro: Respuesta de dosis en cultivo celular (hepatocito humano Huh-7) /Inhibición Antisentido de Expresión Apo-BlOO humano De acuerdo con la presente invención, se diseñan una serie de oligonucleótidos a regiones diferentes objetivo del ARNm Apo-BlOO humano. Véase la tabla 1, se evalúan compuestos de oligonucleótido para su potencial a ARNm Apo-BlOO disminuido en hepatocitos Humanos (células Huh-7) seguido por recuperación asistida del lípido de la SEC ID NO: 31-32, 36-38 y 40-42 (Figura 8). El experimento se realiza como se describe en loe ejemplos 5-8. Los resultados muestran una regulación descendente muy potente (>80%) con 25 nM de todos los compuestos. Sin embargo a 1 nM únicamente 2 compuestos resultan en una regulación descendente de ARNm ApoB-100 tal alto como 70% (SEC ID NO: 37 y 40, la cual es una regulación descendente muy potente (Figura 8) .

Ejemplo 16. IC50 para 7 oligonucleótidos antisentido LNS seleccionados en cultivo celular (hepatocito humano Huh-7) . Los 7 oligonucleótidos antisentidos con la mejor regulación descendente in vitro se seleccionan por un estudio IC5o para determinar la concentración del oligonucleótido antisentido para proporcionar una inhibición del 50% de expresión ARNm ApoB-100. El experimento se realiza como se describe en los ejemplos 5-8. Únicamente la SEC ID NO: 36 y 37 tienen un IC50 de aproximadamente 1 nM, mientras la SEC ID NO: 38 tiene un IC50 tan alto como 5.7 (figura 9) . Un IC50 de 0.5 nM indica un compuesto muy potente, el cual para SEC ID NO: se ha confirmado por datos in vivo (ejemplos 17 y 18) .

Ej emplo 1 7: Dura ción de acción de dosificación de la SEC ID NO: 37, una , dos o tres veces . Ratones C57BL/6 (20 g) reciben 6.25 o 25 mg/kg/dosis, i.p. una, dos o tres días consecutivos (tamaño de grupo de 5 ratones) . Todos los oligonucleótidos antisentido se disuelven en salina al 0.9% (NaCl) y se administra a 10 mg/kg por peso corporal (~0.2 mi por inyección) . En el sacrificio (los días 3, 5, 8, 13 y 21) el peso del hígado se registra. Los tejidos para medición de expresión ARNm ApoB se almacena en ARN último (Ambion) a -20°C hasta el uso. En análisis ARNm en el hígado se realiza al sacrificio, mientras el colesterol LDL y total se realiza a 24 horas, 2 ó 3 y 6, 11 y 19 días después de la inyección i.p. (véase, Figura 11). Este estudio muestra una regulación descendente muy potente de ARNm ApoB-100 seguido por la dosificación de la SEC ID NO: 37: Una dosis resultada en expresión ARNm ApoB a 45-60% a partir del día 3 al día 8 después de la dosificación, mientras la dosis 3 resulta en 85-90% de regulación descendente en el día 13 y aproximadamente 70% en el día 21, mostrando una duración de acción más prolongada de 20 días en el hígado, cuando las dosis 2 ó 3 se administran. La expresión ARNm ApoB-100 y el colesterol total se miden como se describe en los ejemplos 8 y 12.

Ejemplo 18 : Regímenes de dosis de la SEC ID NO: 37 Ratones C57BL/6 (20 g) reciben 2 mg/kg/dosis de i.p. dos veces a la semana por 4 semanas o 5 mg/kg/dosis una vez a la semana por 4 semanas (tamaño de grupo de 5 ratones) para examinar el efecto en regulación descendente de ARNm (ApoB-100) y en nivel de colesterol de plasma (colectado una vez a la semana) . El oligonucleótido antisentido se disuelve en salina al 0.9% (NaCl) y se administra a 10 ml/kg por peso corporal (~0.2 mi por inyección). En el sacrificio (día 28) el peso del hígado se registra. Los tejidos para medición de expresión ARNm ApoB se almacenan en ARN último (Ambion) a -20°C hasta el uso. El análisis ARNm o Hígado se realiza al sacrificio, mientras el nivel de colesterol LDL en plasma se determina a los días 7, 14, 21 y 28 (véase, Figura 10). Los resultados muestran una disminución lineal en el nivel de colesterol LDL durante un tiempo, resultando en una reducción del 30% al día 28 comparado al día 7 y el grupo de salina después de la dosificación 2.5 mg/kg/dosis dos veces por semana. Resultados similares se obtienen el dosificar la misma cantidad total de oligonucleótido antisentido, pero dosif-icando 5 mg/kg/dosis únicamente una vez a la semana. Además, el nivel de ARNm ApoB-100 en hígado al sacrificio (día 28) muestra una regulación descendente de 30-40% después de la dosificación 20 mg/kg durante 28 días, independiente del régimen de dosis (una o dos dosis por semana) . Estos resultados muestran una regulación descendente de ARNm ApoB-100 aún a dosis baja de la SEC ID NO: 37, y que esta regulación descendente tiene un impacto en la lectura terapéutica medida como una reducción al 30% en colesterol LDL del plasma. La expresión ARNm ApoB-100 y niveles de colesterol se miden como se describe en los ejemplos 8 y 12. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de- la presente descripción de la invención.

Claims (33)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en ' las siguientes reivindicaciones : 1. Compuesto oligomérico que consiste de un total de 12-50 nucleótidos y/o análogos de nucleótidos, caracterizado porque comprende una subsecuencia de al menos 10 nucleótidos o análogos de nucleótidos, la subsecuencia corresponde a una subsecuencia seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NOS:69, 60, 61, 62, 63, 2, 3, 6, 77, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 y 17, en donde el compuesto comprende al menos, 3 análogos de nucleótidos.
2. 2. Compuesto de conformidad con la reivindicación 1, que consiste de un oligonucleótido de doble hebra, caracterizado porque cada hebra comprende un total de 16-30 nucleótidos y/o análogos de nucleótidos, en donde el compuesto comprende una subsecuencia de al menos, 10 nucleótidos o análogos de nucleótidos, la subsecuencia está localizada dentro de una secuencia seleccionada de las SEC ID NOS: 59, 60, 61, 62, 63, 2, 3, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 y 17, en donde el compuesto comprende al menos, 3 análogos de nucleótidos.
3. 3. Compuesto de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque la subsecuencia comprende al menos, tres análogos de nucleótido.
4. 4. Compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la subsecuencia comprende un estiramiento de 2-6 análogos de nucleótido, seguido por un estiramiento de 4-12 nucleótidos, el cual es seguido por un estiramiento de 2-6 análogos de nucleótidos .
5. 5. Compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la subsecuencia comprende 1 o 2 desapareamientos cuando se compara con la secuencia correspondiente en la secuencia seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NOS: 59, 60, 61, 62, 63, 2, 3, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 y 17.
6. 6. Compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque consiste de 12-25 nucleótidos o análogos de nucleótidos.
7. 7. Compuesto de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque consiste de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 o 22 nucleótidos o análogos de nucleótidos.
8. 8. Compuesto de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque consiste de 15 o 16 nucleótidos o análogos de nucleótidos.
9. 9. Compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque los nucleótidos comprenden un grupo de enlace seleccionado del grupo que consiste de un grupo fosfato, un grupo fosforotioato y un grupo boranofosfato, el enlace internucleósido puede ser -0-P (0)2-0, -0P(0,S)0.
10. 10. Compuesto de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el enlace es un grupo fosfato.
11. 11. Compuesto de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el enlace es un grupo fosforotioato.
12. 12. Compuesto de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque todos los nucleótidos son grupos fosforotioato.
13. 13. Compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque comprende desde 3-12 análogos de nucleótido.
14. 14. Compuesto de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque comprende 6 o 7 análogos de nucleótidos .
15. 15. Compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque al menos uno de los análogos de nucleótidos es un ácido nucleico bloqueado (LNA) , tal como al menos tres o todos los análogos nucleótidos son LNA.
16. 16. Compuesto de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el LNA se selecciona de beta-D-oxi-LNA, alfa-L-oxi-LNA, beta-D-amino-LNA y beta-D-tio-LNA.
17. 17. Compuesto de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque los nucleótidos y/o LNAs son ligados en conjunto por medio de grupos fosfato o fosforotioato.
18. 18. Compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la subsecuencia se selecciona del grupo que consiste de: SEC ID NO 63, SEC ID NO: 2, SEC ID No 3 y SEC ID No 11.
19. 19. Compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la subsecuencia se selecciona del grupo que consiste de la SEC ID No 9, SEC ID NO:10, SEC ID No 11, y SEC ID No 12.
20. 20. Compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque tiene la fórmula 5' - [ (LNA) 2-6 (ADN/ARN) 4-12- (LNA) 2-6- (ADN/ARN) 0-1] -3' o 5' - [ (LNA) 3- (ADN/ARN) 8-9- (LNA) 3- (ADN/ARN) 1] -3' en donde "LNA" designa un nucleótido LNA y "ADN" y "ARN" designan un desoxirribonucleótido y un ribonucleótido, respectivamente .
21. 21. Compuesto caracterizado porque se selecciona del grupo que consiste de las SEC ID NOS: 29, 30, 313, 34, 35, 36, 37 o 38.
22. 22. Compuesto de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque es SEC ID NO: 29.
23. 23. Compuesto de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque es SEC ID NO: 30.
24. 24. Compuesto de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque es SEC ID NO : 37.
25. 25. Compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque consiste de 13 o 14 nucleótidos o análogos de nucleótidos .
26. 26. Conjugado caracterizado porque comprende el compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-25 y al menos una porción no nucleótido o no polinucleótido covalentemente unida al compuesto.
27. 27. Composición farmacéutica, caracterizada porque comprende un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-25 o un conjugado de conformidad con la reivindicación 26 y un diluyente, portador o adyuvante farmacéuticamente aceptable .
28. 28. Composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 27, caracterizada porque se adapta para administración oral.
29. 29. Composición farmacéutica de conformidad con las reivindicaciones 27 o 28, caracterizada porque además comprende al menos, un compuesto que reduce el colesterol.
30. 30. Composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada porque el compuesto se selecciona del grupo que consiste de resinas secuestrantes de sal biliar (por ejemplo, colestiramina, colestipol y clorhidrato de colesevelam) , inhibidores de reductasa-HMGCoA (por ejemplo, lovastatina, cerivastatina, prevastatina, atorvastatina, simvastatina y f luvastatina ) , ácido nicotínico, derivados de ácido fíbrico (por ejemplo, clofibrato, gemfibrozil, fenofibrato, bezafibrato y ciprofibrato ) , probucol, neomicina, dextrotiroxina , esteres de planta estanol, inhibidores de absorción de colesterol (por ejemplo, ezetimiba), implitapida, inhibidores de transportadores de ácido biliar (transportadores de ácido biliar dependientes de sodio apical), reguladores de CYP7a hepático, terapéuticos de reemplazo de estrógeno (por ejemplo, tamoxifen) , y anti-inflamatorios (por ejemplo, glucocorticoides).
31. 31. Compuesto, caracterizado porque es de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1- 25 o un conjugado de conformidad con la reivindicación 26 para uso como un medicamento.
32. 32. Uso de un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-25 o como un conjugado de conformidad con la reivindicación 26 para la manufactura de un medicamento para el tratamiento de niveles anormales de Apo-BlOO.
33. 33. Uso de conformidad con la reivindicación 32, en donde los niveles anormales de Apo-BlOO se correlacionan con la presencia de una afección seleccionada del grupo que consiste de: ateroesclerosis, hiperesterolemia o hiperlipidemia.