CN1981029B

CN1981029B - 生产胆固醇的酵母菌株及其用途

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Publication number: CN1981029B
Application number: CN2005800227391A
Authority: CN
Inventors: D·庞旁; B·杜马斯; R·斯帕格诺利
Original assignee: Aventis Pharma SA
Current assignee: Aventis Pharmaceuticals Co ltd; Sanofi Metso Intellectual Property
Priority date: 2004-05-06
Filing date: 2005-05-02
Publication date: 2010-06-16
Anticipated expiration: 2025-05-02
Also published as: BRPI0509598B8; EP1745123B1; IL238365B; JP2007535960A; EP1745123A1; DK1745123T3; US8211676B2; NZ551057A; RS52444B; BRPI0509598A; JP5670310B2; KR101252304B1; LT2354218T; AU2005252401B2; IL178741A0; RU2006143060A; MXPA06012840A; SG10201501156WA; PT2354218T; SG185179A1

Abstract

本发明涉及真菌界生物体中的胆固醇生产。更特别地，本发明涉及从单一碳源独立生产胆固醇的被遗传改变的真菌。本发明还涉及本发明的真菌用于生产未标记和标记的胆固醇的用途。

Description

生产胆固醇的酵母菌株及其用途

本发明涉及在真菌(Fungi)界的生物体中生产胆固醇。

胆固醇(参照图1)是最重要的动物固醇。它是细胞膜的基本成分，在其中控制流动性，并且存在于所有的动物组织，特别是神经组织中。

胆固醇是具有重要工业利益的产品。因而，它普遍用于化妆品工业。它也用于制药工业，例如用于药物递送，以及用于细胞培养。

胆固醇也用于维生素D₃的工业合成。这个维生素随后被用于补充人类食品(例如，用于乳制品)和动物食料。胆固醇也可有利地用作动物食料的添加剂，特别是用于饲养虾的饲料。

目前，大多数市场化的胆固醇是从动物组织提取的(很少量是通过化学合成生产的)。2个主要的起始来源被用于提取胆固醇：牛脊髓和为羊毛天然脂肪的羊毛脂。

动物组织作为起始来源的用途产生了问题。因为，最近与对羊瘙痒病负责的朊病毒传递至牛(被称为在牛中BSE(牛海绵状脑炎)的疾病)相关的问题已经使得当使用动物组织作为起始材料时需要格外小心。然而尽管采取了措施，传递病原体的风险仍然不能被完全排除。因此极为有利的是拥有不是来自动物组织的胆固醇来源。

本发明的目的是提供就健康观点来说是安全的胆固醇的丰富来源。本发明人已经令人惊讶地表明，转换真菌中天然生产的麦角固醇以生产胆固醇是有可能的。

发明概述

本发明的第一个方面涉及自主生产胆固醇的真菌界的生物体。

本发明的第二个方面涉及如上定义的真菌界的生物体，其中后者是被遗传改变的。

本发明的第三个方面涉及如上定义的真菌界的生物体，其中后者从单一碳源生产胆固醇。

本发明也涉及如上定义的真菌界的生物体，其表达7-脱氢胆固醇还原酶和3β-羟基固醇Δ24-还原酶。更特别地，本发明涉及如上定义的生物体，其中固醇24-C-甲基转移酶已经失活和/或C-22固醇去饱和酶已经失活。

本发明的另一个方面涉及如上定义的真菌界的生物体，其中7-脱氢胆固醇还原酶和3β-羟基固醇Δ24-还原酶的表达是通过该生物体的转化获得的。

本发明也涉及如上定义的真菌界的生物体，其中固醇24-C-甲基转移酶的失活是通过基因失活进行的和/或C-22固醇去饱和酶的失活是通过基因失活进行的。

本发明的另一个方面涉及如上定义的真菌界的生物体，其选自子囊菌门，更特别地选自酵母(Saccharomycotina)亚门，更特别地选自酵母纲或裂殖酵母(Schizosaccharomycetes)纲，更特别地选自酵母目或裂殖酵母目，更特别地选自酵母科或裂殖酵母科，更特别地选自酵母属或裂殖酵母属。

本发明的另一个方面涉及如上定义的真菌界的生物体，其是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)种的酵母。

本发明也涉及用于生产非动物起源的胆固醇的方法，包括培养如上定义的生物体。更特别地，在这个方法中，由培养生物体组成的步骤之后是包括提取胆固醇的步骤。优选，胆固醇的提取是用非水溶性溶剂进行的。

更特别地，在如上定义的方法中，皂化步骤是在胆固醇提取之前进行的。更特别地，在如上定义的方法中，由机械研磨细胞组成的步骤是在皂化或胆固醇的提取之前进行的。

本发明的另一个方面涉及如上定义的真菌界的生物体用于生产以¹³C或¹⁴C标记的胆固醇、或其代谢中间物中的一种、或固醇混合物的用途。

本发明也涉及用于生产以¹³C或¹⁴C标记的胆固醇、或其代谢中间物中的一种、或固醇混合物的方法，包括下列步骤：

在¹³C-标记或¹⁴C-标记的底物上培养如上定义的真菌界的生物体，以及

提取所述的胆固醇、或其代谢中间物中的一种、或固醇混合物。

本发明也涉及用于生产利用同位素标记在不同位置进行标记的胆固醇、胆固醇中间物或胆固醇代谢物的同位素混合物的方法，包括在标记的底物，以及然后是未标记的底物上培养如上定义的真菌界的生物体，选择这些底物每一个上的培养时间以获得明确的同位素分布图谱。本发明也涉及利用同位素标记在不同位置进行标记并且具有明确同位素分布图谱的胆固醇、胆固醇中间物或胆固醇代谢物的、可通过这个生产方法获得的分子样品。

本发明还涉及包含利用同位素标记在不同位置进行标记并且具有明确同位素分布图谱的胆固醇、胆固醇中间物或胆固醇代谢物的同位素混合物作为可追踪标记的组合物。更特别地，这个组合物旨在用于人或动物的食品或治疗领域。

发明详述

本发明涉及在真菌界的生物体中生产胆固醇。在真菌中，没有发现自然状态的胆固醇，因后者是动物固醇。这些生物体细胞膜中的主要固醇是麦角固醇。

本发明使得在存在单一碳源时通过真菌增殖进行胆固醇合成成为可能。因此本发明建议的方法使得以低成本获得大量胆固醇成为可能，因为该方法利用真菌界生物体的培养并且添加可容易地商业获得的单一碳源。

根据本发明，术语“单一碳源”是指可被本领域技术人员用于真菌，特别是酵母正常生长的碳源。特别指明的是多种可同化的糖，例如葡萄糖、半乳糖或蔗糖、或糖蜜，或这些糖的副产品。最特别优选的单一碳源是乙醇和甘油。

生产是自主进行的事实是指不需要为了获得胆固醇而加入底物，但该生物体能够只从起始的单一碳源进行生产。也很清楚该菌株能够利用位于代谢途径上游的底物生产胆固醇，就此而言，本发明所述生物体的菌株包含为完成胆固醇生产的代谢途径所需要的全部基因。

本发明特别涉及能够从单一碳源自主生产胆固醇的遗传改变的真菌界(真菌类)生物体。

为了使麦角固醇生产的天然代谢途径向胆固醇生产转化，真菌的某些遗传改变可能是有效的。本发明因此涉及表达7-脱氢胆固醇还原酶和3β-羟基固醇Δ24-还原酶的遗传改变的真菌界生物体。如此改变的真菌界生物体的菌株生产胆固醇。本申请人实际上已经能够借助获得的结果(参考本申请的实施例部分)模仿导致产生麦角固醇及其一些衍生物的代谢途径(参考图2)。7-脱氢胆固醇还原酶和3β-羟基固醇Δ24-还原酶在真菌酿酒酵母中的表达可容许通过转换部分的麦角固醇生物合成途径来生产胆固醇。

7-脱氢胆固醇还原酶在国际酶分类中担负EC号：1.3.1.21。在这个文件的其余部分，它也称为Δ-5，7-固醇-Δ-7-还原酶、7-DHC还原酶或固醇Δ-7-还原酶，并且也称为Δ-7固醇还原酶、Δ-7Red、Δ7还原酶或Δ7-还原酶。植物中天然状态的这个酶催化，例如Δ-5，7-胆甾二烯醇依赖NADPH还原为Δ-5-胆甾烯醇，或催化在7-8位具有双键的固醇中间物的还原(Taton和Rahier，1991)。编码7-脱氢胆固醇还原酶的基因最初是在植物拟南芥中分离出来的；该相应基因的分离和这个酶在酿酒酵母中的表达在专利EP 727 489中有描述。这个基因和蛋白质的序列可以下列GenBank登录号：U49398获得(Lecain等，1996)。

这个基因的某些同源物已经在其他的物种中有描述。这些是例如，人类中的同源基因(核苷酸序列可以GenBank登录号AF034544获得，蛋白质序列可以GenBank登录号：AAC05086获得)(Moebius等人，1998)；褐家鼠中的同源基因(核苷酸序列可以GenBank登录号：AB016800获得，蛋白质序列可以GenBank登录号：BAA34306获得)。同源基因也已经在鸡Gallus gallus，Genbank参考号BM490402；爪蟾，Genbank参考号BI315007；斑马鱼Danio rerio，Genbank参考号BQ132664中鉴定出来。编码Δ7固醇还原酶活性的基因也在植物中被发现，例如水稻，Oryza sativa，Genbank参考号CA753545；或番茄，Solanum tuberosum，Genbank参考号BF342071。编码Δ7固醇还原酶活性的这个基因也能够在原生生物Mastigamoeba balamuthi中被发现，Genbank参考号BE636562。

本领域的技术人员将能够容易地分离在其他生物体中编码7-脱氢胆固醇还原酶的其他同源基因。他们可特别地参考在EP 727 489的实施例1中描述的克隆方法，该专利公开了用于分离编码具有Δ-5，7-固醇-Δ-7-还原酶活性的蛋白质的cDNA的克隆方法。本领域的技术人员也可特别利用也在专利EP 727 489的实施例1中描述的活性分析来容易地测定相应蛋白质的7-脱氢胆固醇还原酶活性。

7-脱氢胆固醇还原酶在本发明所述的真菌界生物体中的表达可通过本领域技术人员已知的任何方式来获得。这可特别涉及用包括由转录启动子，优选同源的转录启动子，编码7-脱氢胆固醇还原酶的开放阅读框和适合的转录终止子组成的表达盒的构建体，根据本领域技术人员已知的常规法则转化生物体。作为同源启动子，一般使用容许异源蛋白足够且功能性的表达的启动子。该启动子可以例如是，PGK启动子、ADH启动子、CYC1启动子、GAL10/CYC1启动子、TDH3启动子或TPI启动子。终止子可以例如是，磷酸甘油酸激酶(PGK)基因的终止子。所述表达盒可以一个或多个拷贝的形式被整合进入宿主的核或线粒体基因组，或可被酵母人工染色体(YAC)类型的人工结构携带，或可被游离基因元件，例如质粒携带。为了影响这种类型的表达，可使用例如Yarrowia lipolitica、乳酸克鲁维氏酵母、或巴斯德毕赤酵母类型的酵母。

优选，表达的7-脱氢胆固醇还原酶是植物拟南芥的酶(在酿酒酵母中表达这个酶的方法的实例在专利EP 727 489中有描述)。然而，它可以是显示相同酶活性的任何同源或非同源、天然或人工的酶。

3β-羟基固醇Δ24-还原酶，也称为DHCR24或24-脱氢胆固醇还原酶，天然催化24-去氢胆甾醇(胆-5，24-二烯醇)或者在侧链上24-25位具有双键的羊毛脂醇衍生物(例如14-去甲-羊毛脂醇，酵母甾醇，或胆-7，24-二烯醇)的还原，该还原对于尤其人类中胆固醇的生物合成而言是必需的(HR.Waterham等人，2001)。在这一文件中的其余部分，该酶也称为Δ24-(25)固醇还原酶，Δ24-固醇还原酶。

编码3β-羟基固醇Δ24-还原酶的基因最初是从人类分离的；相应基因的分离和这个酶在酿酒酵母中的表达在出版物HR.Waterham等人，2001中有描述。这个基因和蛋白质的序列可以下列GenBank登录号：NM_014762和NP_055577获得。

这个基因的某些同源物已经在其他物种中有描述。它们是例如，小鼠(小家鼠)中的同源基因(其核苷酸序列可以GenBank号：NM_053272获得，其蛋白质序列可以GenBank号：NP_444502获得)。同源物已经在蠕虫秀丽线虫中有描述，特别的，互补DNA Genbank参考号AF026214。同源序列也已经在植物中有描述，例如棉花，Gossypium hirsutum，Genbank参考号AAM 47602.1；水稻，Orysasativa，Genbank参考号AAP53615；或豌豆，Pisum sativum，Genbank参考号AAK15493。

本领域的技术人员将能够容易地分离其他生物体中编码3β-羟基固醇Δ24-还原酶的其他同源基因。他们可特别地参考出版物HR.Waterham等人，2001中描述的克隆方法。本领域的技术人员也能够特别利用也在出版物(Waterham等人，2001)中描述的活性分析来容易地测定相应蛋白质的3β-羟基固醇Δ24-还原酶活性。

3β-羟基固醇Δ24-还原酶在本发明所述真菌界生物体中的表达可通过本领域技术人员已知的任何方式来获得。这可能特别涉及上文关于7-脱氢胆固醇还原酶表达所描述的方法。

优选，表达的3β-羟基固醇Δ24-还原酶是人类的酶。相应基因的分离和这个酶在酿酒酵母中的表达的实施例在出版物HR.Waterham等人，2001中有描述。然而它可以是显示相同酶活性的任何同源或非同源、天然或人工的酶。

有利地，本发明所述的真菌界生物体表达7-脱氢胆固醇还原酶和3β-羟基固醇Δ24-还原酶，并且也显示固醇24-C-甲基转移酶的失活。

固醇24-C-甲基转移酶在国际酶分类中担负号码EC-2.1.1.41。它也被称为ERG6p、Δ(24)-甲基转移酶、Δ(24)-固醇甲基转移酶、酵母甾醇-24-甲基转移酶、S-腺苷-4-甲硫氨酸：固醇Δ(24)-甲基转移酶、SMT1、24-固醇C-甲基转移酶、S-腺苷-L-甲硫氨酸：Δ(24(23))-固醇甲基转移酶或植物甾醇甲基转移酶。这个酶天然催化酵母甾醇的C-24甲基化，导致形成粪甾醇(fecosterol)。

编码固醇24-C-甲基转移酶的基因在酿酒酵母中被命名为Erg6。这个基因的序列可以下列GenBank登录号：NC_001145获得。相应蛋白质的序列可以下列GenBank登录号：NP_013706获得(Bowman等人，1997)，(Goffeau等人，1996)。

这个基因的某些同源物已经在其他真菌中有描述。它们是例如，粟酒裂殖酵母中的同源基因(其核苷酸序列可以GenBank号Z99759获得，其蛋白质序列可以GenBank号：CAB16897获得)(Wood等人，2002)；粗糙镰孢酶中的同源基因(其核苷酸序列可以GenBank号：NCB24P7获得，其蛋白质序列可以GenBank号：CAB97289获得)；白色假丝酵母中的同源基因(其核苷酸序列可以GenBank号AF031941获得，其蛋白质序列可以GenBank号：AAC26626获得)(Jensen-Pergakes等人，1998)。编码与ERG6同源的酶的基因已经在葡萄牙假丝酵母，Genbank参考号AA021936.1，和卡氏肺囊虫(Kaneshiro等人，2002)或乳酸克鲁维氏酵母(Ozier-Kalogeropoulos等人，1998)中有描述。

本领域的技术人员能够容易地分离在真菌界生物体中与Erg6同源的其他基因。本领域的技术人员也能够特别利用这些基因破裂的酵母菌株的功能互补作为活性分析来容易地测定相应蛋白质的固醇24-C-甲基转移酶活性。然后通过形成在24-位分支的固醇，特别是在24-28位携带甲叉基团的麦角类型固醇来证明互补。ERG6-型固醇24-C-甲基转移酶生物活性的存在也可通过由(MyCammon等人，1984)或由Taylor和Parks(Taylor和Parks，1978)开发的技术方式来体外测定。此外，生产的固醇和用于ERG6酶的底物可通过由Nes开发的技术所述的气相色谱法来分离(Methods in Enzymology Steroids andIsoprenoids Volume 111part B，1985，“A comparison of Methods for theIdentification of Sterols”，pp.3-37)。

表达7-脱氢胆固醇还原酶和3β-羟基固醇Δ24-还原酶并且也显示固醇24-C-甲基转移酶失活的本发明所述的真菌界生物体菌株生产胆固醇。本申请人实际上已经能够令人惊讶地确定固醇24-C-甲基转移酶的失活阻断了麦角固醇上游的生物合成途径，并且容许通过该真菌菌株增加胆固醇的生产(参考本申请的实施例部分)。

7-脱氢胆固醇还原酶和3β-羟基固醇Δ24-还原酶如下表达。

固醇24-C-甲基转移酶的失活可通过本领域技术人员已知的任何方式进行。它可特别地涉及通过诱变，导入无义突变，导入导致编码所述蛋白质的基因中阅读框变化的插入或缺失。它也可涉及表达与编码所述蛋白的信使RNA互补的反义RNA，或者如果这些系统不是天然存在于宿主中，则表达本领域技术人员已知的基因沉默系统，如RNAi(小的干扰RNA)，和相关酶系统。诱变可以是在编码序列或非编码序列中进行，以使得编码的蛋白质失活或阻止其表达或其翻译。诱变可以通过在所考虑的基因中抑制、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基，或通过基因失活而在体外或原位进行。

这可能特别涉及将外源DNA导入编码序列或启动子序列(例如具有同源启动子和/或终止子及异源编码部分的表达盒)。该表达盒有利地容许选择标记的表达。也可能改变基因的启动子以减少表达水平。对于真菌，失活也通过用异源或同源标记基因的编码序列打断编码序列来进行。用于打断真菌基因的主要技术在Johnston等人，(2002)的论文(Methods in Enzymology Volume 350Edited by ChristineGuthrie and Gerry Fink；“Gene Disruption”；M.Johnston，Riles，J.Hegemann，pp.290-315)中有描述。

有利的是，本发明所述的真菌界生物体表达7-脱氢胆固醇还原酶和3β-羟基固醇Δ24-还原酶并且也显示C-22固醇去饱和酶的失活。

C-22固醇去饱和酶也称为ERG5p、Cyp61、细胞色素p-45061或固醇Δ22-去饱和酶。这个酶天然催化通过在C22位加入双键而转化麦角甾-5，7，24(28)-三烯醇为麦角甾-5，7，22，24(28)-四烯醇(参考图2)。

编码C-22固醇去饱和酶的基因在酿酒酵母中被命名为Erg5。这个基因的序列可以下列GenBank登录号：U34636获得。相应蛋白质的序列可以下列GenBank登录号：AAB06271(Skaggs等人，1996)或p54781(Bowman等人，1997)获得。

这个基因的某些同源物已经在其他真菌中有描述。它们是例如，粟酒裂殖酵母中的同源基因(其核苷酸序列可以GenBank号Z98974获得，其蛋白质序列可以GenBank号：CAB11640获得)(Wood等人，2002)，Symbiotaphrina buchneri中的同源基因(其核苷酸序列可以GenBank号AB086896获得，其蛋白质序列可以GenBank号：BAC01142获得)(Noda和Koizumi，2003)；Symbiotaphrina kochii中的同源基因(其核苷酸序列可以GenBank号AB086890获得，其蛋白质序列可以GenBank号：BAC01139获得)(Noda和Koizumi，2003)；白色假丝酵母中的同源基因(其核苷酸序列可以GenBank号AL033396获得，其蛋白质序列可以GenBank号：CAA21953获得)(Tait等人，1997)。ERG5基因也已经在葡萄牙假丝酵母中有描述，Genbank参考号AAO48601。

本领域的技术人员将能够容易地分离真菌界生物体中与Erg5同源的其他基因。本领域的技术人员也能够特别利用由B.A.Skaggs等人，1996描述的活性分析来容易地测定相应蛋白质的C-22固醇去饱和酶活性。这个活性也可通过预先破裂efg5基因的酿酒酵母的功能互补来证实。这个互补将通过在互补菌株中存在麦角甾-5，7，22-三烯醇来证实。C22固醇去饱和酶活性可通过利用由Kelly和Baldwin等人，JBC(1997)描述的方法，在裂解酵母后来体外测量(Kelly等人，1997)。

表达7-脱氢胆固醇还原酶和3β-羟基固醇Δ24-还原酶并且也显示C-22固醇去饱和酶失活的本发明所述的真菌界生物体菌株生产胆固醇。本申请人实际上已经能够确定C-22固醇去饱和酶的失活有利地阻断胆固醇转化为胆甾-5，22-二烯醇并且容许稳定胆固醇的生产(参考本申请的实施例部分)。这个阻断也发生在胆甾-5，7-二烯醇，胆固醇的前体转化为胆甾-5，7，22-三烯醇，胆甾-5，22-二烯醇的前体的水平。令人惊讶地，C-22固醇去饱和酶实际上接受胆固醇作为底物，并且将其转化为胆甾-5，22-二烯醇。这个副反应可通过如本申请人已经能够确定的，使C-22固醇去饱和酶失活而消除。

7-脱氢胆固醇还原酶和3β-羟基固醇Δ24-还原酶的表达如上述进行。C-22固醇去饱和酶的失活可通过本领域技术人员已知的任何方法来进行。它们可能特别地是上文描述的关于使固醇24-C-甲基转移酶失活的方法。

有利的是，本发明所述的真菌界生物体表达7-脱氢胆固醇还原酶和3β-羟基固醇Δ24-还原酶并且也显示C-22固醇去饱和酶的失活和固醇24-C-甲基转移酶的失活。这些菌株实际上显示两种失活的累加优势并且是生产胆固醇的菌株。

7-脱氢胆固醇还原酶和3β-羟基固醇Δ24-还原酶的表达及C-22固醇去饱和酶和固醇24-C-甲基转移酶的失活如上述进行。

在一个实施方案中，本发明所述的生物体菌株中胆固醇以由本发明所述的该菌株生产的总固醇的大于20％，优选35％，最优选50％以上的比例存在(特别是合成的中间物)。

优选，本发明所述的真菌界生物体选自子囊菌门，更优选其选自酵母亚门，更优选其选自酵母纲或裂殖酵母纲，更优选其选自酵母目或裂殖酵母目，更优选其选自酵母科或裂殖酵母科，更优选其选自酵母属或裂殖酵母属，完全优选本发明所述的真菌界生物体属于酿酒酵母种或粟酒裂殖酵母种。

本发明也涉及用于生产非动物起源的胆固醇的方法，包括下列步骤：

培养如上限定的真菌界生物体，

提取由这个生物体所生产的胆固醇。

提取是基于用胆固醇的溶剂，优选非水溶性的溶剂处理真菌。这个处理可优选与机械研磨细胞的任何方法相结合。更优选，该真菌可在用溶剂提取前，用旨在释放可能结合其他细胞成分，例如特别是结合脂肪酸的胆固醇的皂化混合物处理。这个皂化组合物可能由碱，例如溶于水或，更优选溶于例如甲醇或乙醇的水溶性有机溶剂的氨水、氢氧化钠或氢氧化钾，或溶剂-水混合物组成。皂化可没有加热或优选在大气压或在低压下加热至60-120℃的温度进行。用非水溶性溶剂提取可被疏水性树脂上的固相提取替换。固醇提取方法由L.Parks等人，(1985)(Methods in Enzymology 111Edited by L.Rilling，L.Parks，C.Bottema，R.Rodriquez和Thomas Lewis，pp.333-339)描述。

如此获得的粗胆固醇可通过本领域技术人员已知的任何方法，特别是由Boselli E，Velazco V，Caboni Mf和Lercker G J，ChromatogrA.2001May 11；917(1-2)：239-44描述的方法来纯化。

也可使用其他方法，例如，描述用于从羊毛提取胆固醇的方法。本领域的技术人员可特别地参考美国专利US2 688 623或US 2 650929，或英国专利GB690879、GB646227或GB613778中描述的方法。

本发明的另一个方面涉及本发明所述菌株的用途，以获得胆固醇或其代谢中间物中的一种，或标记的固醇混合物。术语“胆固醇的代谢中间物”特别是指图2中指定的固醇。其特别可能是胆甾-8，24(25)-二烯醇、胆甾-7，24(25)-二烯醇、胆甾-5，7，24(25)-三烯醇、胆甾-5，24(25)-二烯醇或胆甾-5，22-二烯醇。

获得标记胆固醇的原理在图10中有描述。这个操作包括首先使真菌菌株在完全标记的底物上生长。然后该细胞在未标记的底物上培养。因此存在碳源同位素标记的变化；继之以代谢中间物和随后包括胆固醇的固醇的重新合成，并且包括标记的逐步变化。这因此涉及复杂但可被完全地试验确定的分布图谱，并且其表示独特的同位素标记同时依赖于：

1)标记方案，特别是使用标记和非标记底物的培养时间和条件

2)所使用菌株的准确遗传结构

3)终止培养的准确时间。

一旦培养已经(例如通过细胞裂解或通过在存在亚致死浓度的细胞毒素或细胞抑制的抗真菌产品来终止培养)被终止，标记的胆固醇或其代谢产物中间物之一，或标记的固醇混合物如上述被提取和纯化出来。

标记的胆固醇或其代谢产物之一，或标记的固醇混合物的同位素分布图谱，具有几个独特的性质：

1)它可通过调节培养条件、使用的菌株和选择的固醇来按需要加以调节。因此可产生独特的标记指示；

2)它是“可结合的”，即相应于具有其本身可被调节的同位素分布图谱标记的几个独特固醇的几个同位素标签可被结合起来以形成“分子字母表”。

3)它是可重复的并且可容易地进行实验确定；

4)它相应于易于分离、稳定、无色且无嗅、不挥发且无毒的分子示踪混合物，并且其可被掺入食品、医药制品、添加剂或可被人类吸收的其他产品；

5)在没有特定的重组菌株和非常准确的标记、培养和提取条件的情况下，它是不能被伪造的。此外，对同位素标签的了解并不能使追踪使其可能被生产出来的参数成为可能。

因此，不能被伪造并且可被掺入任何类型产品，包括消费品的广泛使用的“同位素字母表”，可借助本发明而容易地获得。实际上存在可从使用标记分布图谱和各种类型固醇的这种字母表组成的无数“同位素单词”。因此这种标签进入大多数不同产品的掺入构成了不能被伪造的独特标记方法，其不同于例如一旦已知则能被再现的DNA标签。此外该标签能够通过例如，激光电离和随后的质谱分析(MALDI-TOF等)被非破坏性地读取。

使用¹³C-标记的底物替代未标记的碳源用于培养本发明所述的真菌菌株使合成极高标记的固醇，特别是胆固醇(包括至少95％的¹³C碳)成为可能。通过相同的方法，¹⁴C放射性固醇和胆固醇的制备也是可行的。该方法也可掺入生产固醇，特别是皮质甾醇的酵母菌株(参照专利申请WO 02/061109)以生产¹³C-标记或¹⁴C-标记的类固醇，来例如用于RIA测定。

附图简述

图1：胆固醇的化学式，和一般用于编号不同碳原子的命名法以及不同环的名称。胆固醇分子的4个环分别被命名为A、B、C和D，而碳被编号为1至27。

图2：天然或改变的酵母中麦角甾-和胆甾-类型固醇生物合成途径后期部分的简化图解。该图解不是详尽的，但使明确涉及本文件中提及的酶的步骤成为可能。ERG2p、ERG3p、ERG5p和ERG6p蛋白是真菌或酵母蛋白，而Δ-7Red(Δ-7固醇还原酶)和Δ24-(25)Red(Δ24-(25)固醇还原酶)蛋白是哺乳动物起源或植物起源的异源蛋白质。

图3：来自BMA64菌株的菌株游离固醇在206nm处UV检测的比较性HPLC分布图谱和这些固醇的鉴定。研究的菌株如下：WGIF01(打断erg6基因(参照实施例1)的BMA64菌株)、WGIF02(打断erg6基因并且表达Δ24-还原酶的BMA64菌株，实施例12)、WGIF03(打断erg6基因并且表达Δ7-还原酶的BMA64菌株，实施例13)、WGIF04(打断erg6基因并且表达Δ7-还原酶和Δ24-还原酶的BMA64菌株，实施例14)。C5：胆甾-5-烯醇(胆固醇)；C5，22：胆甾-5，22-二烯醇；C5，24：胆甾-5，24-二烯醇(链甾醇)；C8，24：胆甾-8，24-二烯醇(酵母甾醇)；C5，7，22：胆甾-5，7，22-三烯醇；C5，7，24：胆甾-5，7，24-三烯醇；C5，22，24：胆甾-5，22，24-三烯醇；C5，7，22，24：胆甾-5，7，22，24-四烯醇；lan：羊毛甾醇。

图4：用半乳糖诱导0、2、4、8和24小时后，来自WGIF04菌株(打断erg6基因并且表达Δ7-还原酶和Δ24-还原酶的BMA64菌株，实施例14)的游离固醇在206nm处UV检测的比较性HPLC分布图谱。Δ：WGIF01菌株(实施例1)。对于WGIF04菌株，样品取自转换碳源为半乳糖后的第0、2、4、8和24h。拥有erg6打断(WGIF01)存在的BMA64菌株的分布图谱是在转换为半乳糖后立即获得的。这个图谱实际上在诱导期间(0-24h)保持无变化。在206nm处的吸收信号相应于固醇相互之间可变的吸收系数。C5：胆甾-5-烯醇(胆固醇)；C5，22：胆甾-5，22-二烯醇；C5，24：胆甾-5，24-二烯醇(链甾醇)；C8，24：胆甾-8，24-二烯醇(酵母甾醇)；C5，7，22：胆甾-5，7，22-三烯醇；C5，7，24：胆甾-5，7，24-三烯醇；C5，22，24：胆甾-5，22，24-三烯醇；C5，7，22，24：胆甾-5，7，22，24-四烯醇；lan：羊毛甾醇。

图5：用半乳糖诱导0、2、4、8和24小时后，来自WGIF04菌株(实施例14)的游离固醇的阳离子化电喷射检测(质谱)的比较性HPLC分布图谱。Δ：WGIF01菌株。C5：胆甾-5-烯醇(胆固醇)；C5，22：胆甾-5，22-二烯醇；C5，24：胆甾-5，24-二烯醇(链甾醇)；C8，24：胆甾-8，24-二烯醇(酵母甾醇)。该HPLC图谱来自与图4相同的测定。

图5A(左侧)：在m/z＝367的检测，图5B(右侧)：m/z＝369。

y-轴：计数离子的数目/秒。x-轴：洗提时间，分钟。

图6：3个菌株在m/z＝369的HPLC图谱细节：WGIF01，拥有Δ24固醇还原酶表达质粒的CA10，并且对于WGIF04，注入胆固醇作为内标准。注入3个菌株的总胆固醇量相应于以通过600nm处的吸收率测量的相同量培养物进行的提取。

图7：WGIF(缺失erg6)、WGIF02(缺失erg6，表达Δ24-还原酶)、WGIF03(缺失erg6，表达Δ7-还原酶)、WGIF04(缺失erg6，表达Δ24-还原酶和Δ7-还原酶)和CA10pYES_Δ24(FY1679遗传背景，缺失erg5，表达Δ24-还原酶、Δ7-还原酶、erg5)菌株的总固醇(游离的和酯的)通过气相色谱的比较性图谱。反应比例(火焰电离电流)是任意的。图谱只在菌株相互之间进行定性比较。然而，滞留时间的比例对于全部菌株都是相同的(滞留时间表示为分钟)。固醇根据本申请描述的标准被鉴定出来。

图8：基于UV光谱评估的酵母菌株(BMA64(图8A)、WGIF01(图8B)、WGIF02(图8C)和WGIF03(图8D))中主要游离固醇的定量分布。给出的分布是附图中提供的总种类的％并且它是能够以可测量的数量被检测到的唯一种类。当对于几个中间物固醇缺乏标准物时，根据与利用下列给出的评估吸光系数(参照表1，吸光系数表示为每升和每cm的mM)的HPLC色谱的每个峰相关的UV光谱来进行定量。为此，相应于给定固醇结构中存在的不饱和结构单元的吸光系数可在表1中找到，被任选地加入(如果几个单元存在于相同的分子中)以提供对每一类型固醇消光系数的评估。如果存在在280nm波长被吸收的至少一个单元，则利用280nm处的值进行评估，如果没有，则使用波长235nm，并且如果在后者的波长没有吸收，使用波长206nm来评估来自各个HPLC吸收信号的每种固醇的浓度。

图9：基于UV光谱评估的WGIF4酵母菌株中主要游离固醇的定量分布。定量以与图8描述相同的方式来进行。

图10：通过碳源取代来同位素标记固醇的原理。

图11：诱导4、8和24小时后，WGIF04菌株中所生产胆固醇的同位素标记图谱的评估。游离固醇如上述通过HPLC提取和分离。在洗提期间每0.2秒获得m/z＝300和m/z＝450值之间的质谱。这些质谱随后以1.8秒的窗口被平均，再使用作为回归基础的一组代表标记胆固醇随机掺入的理论质量分布的24个矢量，其中根据所考虑的矢量，标记每个碳原子的概率在0和1之间变化，通过独立选择在该分子的27个位置中每一个的碳13来进行多线性回归。选择用作基础的不同矢量的标记概率，以使得该基础的2个连续矢量分布的交互相关系数是0.92，该基础以相应于在全部位置的碳12上100％存在的概率的矢量开始。多线性调节是基于使Gauss法(最大数值滤波)偏导数结果的矩阵非对角项为零的最小平方统计准则作出的。分析后，质谱随后在优化的基础上重建。因此附图中表示的曲线代表了在值100的最大振幅标准化后优化过滤重建的结果。

对于每个诱导时间，两个曲线代表相应于相差1.8秒洗提时间并且相应于位于胆固醇洗提峰中心区的光谱的两个独立图谱。该附图证明了该分析是可高度重复再现的。

图12：不同固醇或不同诱导时间的各种同位素标签的实例。计算和表示法与图11相同，但针对不同的固醇和不同的诱导时间。

RT值指示了用于计算的滞留时间的范围(分钟)。这个范围的值如下：

图12A：RT＝12.25-12.42，

图12B：RT＝12.2-12.7，

图12C：RT＝12.25-12.35，

图12D：RT＝13.3-13.6.

诱导时间是8或24小时。

m/z的值指示了m/z值的左右限制。每个框m/z的最低值相应于完全由碳12组成的固醇的m/z。

图13：YIM59/pIM303菌株(附图的A部分)和YIM59/pIM331菌株(附图的B部分)总固醇(游离的和酯的)的气相色谱比较性图谱(参照实施例18)。反应比例是任意的。滞留时间比例对于两个菌株是相同的(滞留时间表示为分钟)。固醇根据本申请描述的标准来鉴定。

本发明利用下列应被认为非限制性例证的实施例来举例说明。

所使用的分子生物学技术由Ausubel等人描述，一些酵母操作由Adams等人(Adams and Holm，1996)描述。

实施例1：打断erg6基因的酿酒酵母菌株的构建(WGIF01菌株)：

其中ERG6基因被TRP1基因打断的酿酒酵母菌株WGIF01通过用携带以与ERG6基因同源的极点为边界的功能性TRP1基因的PCR产物转化BM64菌株来获得。

BM64菌株(基因型MATa；ura3-52；trp1Δ2；leu2-3112；his3-11；ade2-1；can1-100的)是完全缺失TRP1基因的酿酒酵母菌株W303MATα的衍生物。BMA64菌株和W303MATα在Baudin-Baillieu等的出版物中有描述(Baudin-Baillieu等人，1997)。

为了分离TRP1基因，利用由公司Takara(PanVera LLC 501Charmany Drive，Madison，WI 53719USA)提供的Z-TaqI(依赖DNA的DNA聚合酶)来扩增质粒pFL44的TRP1基因(Bonneaud等人，1991)。使用的引物对使通过DNA聚合酶扩增以相应于ERG6基因的序列为边界的TRP1基因成为可能。

这些引物的序列如下：

OERG6trp1：

5′

(CCTAGCGACGAAAAGCATCATTGGAGTGAATAACTTGGACTTACCAttcttagcattttgacg)3′(SEQ ID No.1).

OERG6trp2： 5′ 5′

(GCATAAGAGTGAAACAGAATTGAGAAAAAGACAGGCCCAATTCAaattcgggtcgaaaaaagaaaagg)3′(SEQ ID No.2).

如此获得的PCR(聚合酶链式反应)产物通过电洗脱相应于预期大小的片段来纯化，并用于通过如(Gietz等人，1995)描述的氯化锂技术转化BM64菌株。

转化后，处理的酵母菌株被接种在不含有色氨酸的基本培养基上(Gietz等人，1995)。如此获得41个转化的色氨酸原养型的BM64克隆。然后测试这41个克隆的3种特性：对制霉菌素的敏感性、TRP1基因插入的基因组结构、和由其生产的总固醇的气相色谱的分布图谱。

为此，41个克隆被转移到分别含有10、20、或50μg/ml制霉菌素的基本培养基上；大约10个克隆能够在含有50μg/ml制霉菌素剂量培养基上生长。选择这些抗性克隆以验证其基因结构及其固醇组成。

TRP1基因进入ERG6基因的插入通过PCR利用覆盖功能性TRP1基因和打断的ERG6之间连接的寡核苷酸对来验证。这个寡核苷酸对如下：

OERG6trp3：AGGGCCGAACAAAGCCCCGATCTTC(SEQ ID No.3)和OERG6trp4：GGCAAACCGAGGAACTCTTGG(SEQ ID No.4).

一些菌株显示预期的PCR图谱，即相应于预期TRP1插入ERG6大小的800个碱基对的片段。

为了验证ERG6基因在这些菌株中实际上是失活的，这些菌株的固醇组成的分析通过气相色谱和高压液相色谱来进行(Duport等人，2003；Szczebara等人，2003)。

这些分析证实了打断的菌株中与生物合成途径的预期打断相容的麦角固醇合成的缺乏和异常固醇的累积。

一个菌株被更特别地选择出来，并被称为WGIF01。

实施例2：CA10、CA14和CA23菌株的构建

CA10菌株(基因型：MATα，rho⁺，GAL2，ura3-52，trp1-Δ63，his3-Δ200，erg5::HYGRO^R，ade2::GAL10/CYC1::Δ7还原酶::PGK1，LEU2::GAL10/CYC1::matADR::PGK1的)、CA14菌株(基因型：MATα，rho⁺，GAL2，ura3-52，trp1-Δ63，his3-Δ200，erg5::HYGRO^Ratf2::G418^R，ade2::GAL10/CYC1::Δ7还原酶::PGK1，LEU2::GAL10/CYC1::matADR::PGK1的)、和_CA23菌株(基因型：MATα，rho⁺，GAL2，ura3-52，trp1-Δ63，his3-Δ200，erg5::HYGRO^Rare1::G418^R，are2::HIS3，ade2::GAL10/CYC1::Δ7还原酶::PGK1，LEU2::GAL10/CYC1::matADR::PGK1的)、及其构建体，在参考文献Duport等中有描述，其关于构建这些菌株的技术内容被引入本申请作为参考。

这些菌株生产且在其膜中含有非天然的固醇(如在欧洲专利申请EP 0727 489中所描述的)，特别是麦角甾-5-烯醇(油菜甾醇)。

这3个菌株不表达ERG5基因的产物，其由于在其编码序列中插入潮霉素抗性基因而是非功能性的。此外，这些菌株表达编码植物Δ7还原酶的cDNA(欧洲专利申请EP 0727 489特别描述了植物拟南芥Δ7还原酶的克隆，其被引入本申请作为参考，这个序列的GenBank登录号是ATU49398)。

CA14菌株通过打断ATF2基因来源于CA10菌株。这个基因的产物导致的第3位上孕烯醇酮(pregnenolone)的乙酰化(如在专利申请WO99/40203中所描述的)。

CA23菌株是通过缺失ARE1和ARE2基因来源于CA10菌株的菌株；两个蛋白质Are1p和Are2p负责麦角固醇的酯化(Sturley，2000)和胆固醇的可能酯化，因为它们与负责哺乳动物中胆固醇酯化的酶(ACAT)同源。

实施例3：用于表达人类起源的Δ24-25还原酶的质粒的构建(质粒pYES_Δ24)

这个质粒的构建由Waterham，2001等描述。该构建体包括将编码Δ24固醇还原酶的cDNA置于载体pYES2(Invitrogen SARL，CergyPontoise，France)中的pGAL1启动子和tCYC1终止子的控制之下。这个质粒是大肠杆菌/酿酒酵母穿梭质粒，且含有2微复制原点和URA3基因，这容许其在酵母中复制并且容易地选择用这个质粒转化的酵母。

此外，GAL1启动子是半乳糖诱导的。

实施例4：表达拟南芥表达的Δ7-还原酶的质粒pAG1的构建

特异地构建质粒用于在单拷贝载体上表达拟南芥Δ7-还原酶。质粒pAM1被用于这个构建。其构建在PCT申请WO 02/061109(参照所述申请的实施例9.b，其被引入本申请作为参考)中有描述的这个质粒是基于自主复制序列和着丝粒(ARS CEN)的大肠杆菌/酿酒酵母穿梭质粒。选择标记是ADE2基因。这个质粒是相容的，因此作为基于2微复制原点的质粒可同时复制。这个质粒特别具有独特的NotI位点来用于如上述PCT申请中所描述的克隆表达盒。

这个位点被用于克隆起源自CA10菌株的拟南芥Δ7-还原酶表达盒。实际上，这个表达盒是非常有效的，且能使也被打断ERG5的CA10菌株生产油菜甾醇(麦角甾-5-烯醇)作为主要固醇(Duport等人，1998)。含有Δ7-还原酶基因的CA10菌株的基因组DNA片段利用下列引物来扩增：

OSA72 5′(TATATAGCGGCCGCTTTCGCTGATTAATTACCCCAG)3′

(SEQ ID No.5)

OSA 77 5′(TATATAGCGGCCGCGAGAAGTGACGCAAGCATCA)3′

(SEQ ID No.6).

扩增针对通过由Adams等描述的快速酚/氯仿提取技术制备的CA10菌株的基因组DNA来进行(Adams和Holm，1996)。

50纳克的CA10基因组DNA被用作利用引物OSA72和OSA77的扩增的基底。Tag DNA聚合酶和酶促条件来自于公司Stratagene。扩增条件如下：95℃，5min的起始变性；随后进行30个循环，其由95℃，30s的变性，50℃，30s的杂交，和随后72℃，1min的延长组成。该反应通过72℃，10min的最终延伸来终止。

然后PCR片段用NotI酶消化并在琼脂糖凝胶上纯化，随后被常规地克隆到质粒pAM1唯一的NotI位点中。如此获得的质粒被命名为pAG1。

它是在酵母中表达拟南芥Δ7-还原酶的单拷贝载体，其中该Δ7-还原酶基因被置于GAL10/CYC1启动子的控制之下(Lecain等人，1996)。

实施例5：提取酵母中游离和酯化的固醇，用于分析：

1)提取酵母中游离和酯化的固醇的条件(方法1)

a)提取游离固醇的条件：

细胞颗粒在玻璃试管中用500μl去离子和过滤的水洗涤两次。

然后细胞重悬在含有0.5mm玻璃珠的500μl水中，相应于试管中的150μl液体。

用2ml1，2-二氯乙烷，伴随在涡旋器上剧烈搅拌10分钟来提取两次。第一次提取后，细胞、玻璃珠和溶剂的混合物在1500g离心5分钟以分离两相。

来自两次连续提取的两个有机馏分被组合在一起并在氮气流下干燥若干小时。

固醇提取物悬浮在100μl乙腈中以使其通过高效液相色谱(HPLC)来加以分析(Szczebara等人，2003)，或悬浮在100μl己烷中用于气相色谱(GC)分析(Duport等人，2003)。

b)提取总固醇的条件：皂化和提取酯化的固醇，定性分析方法1：

细胞颗粒重悬在500μl纯化的水中。向这个悬浮液加入2ml在甲醇中的10％氢氧化钾KOH。在封闭的试管中于60℃加热该混合物1小时。孵育后，且一旦该试管已经恢复到环境温度，用2ml己烷提取该混合物3次。每次提取之间，通过在1500g离心5min分离两相。每次提取后，有机相被转移到新试管中，然后3个有机相被组合在一起，再在氮气流下干燥。

固醇残余物重悬在100μl 100％的乙腈中以使其通过高效液相色谱(HPLC)来加以分析(Szczebara等人，2003)，或重悬在100μl己烷中用于气相色谱(GC)分析(Duport等人，2003)。

2)提取酵母中游离和酯化的固醇的条件，用于定性分析(方法2)

菌株培养在丰富培养基(每升10g细菌蛋白胨和每升10g酵母提取物)中，其中含2％的葡萄糖作为碳源以获得500mg冻干的细胞。这些干燥的细胞被吸收在含有1g KOH和微量焦酚的3ml甲醇(100％)，然后该混合物在90℃孵育45分钟。恢复至环境温度后，固醇用5ml己烷提取。有机相被分为相同体积的3份样品，并在空气流下干燥。所提取固醇的2个样品被吸收在100μl己烷来通过气相色谱(GC)和气相色谱/质谱GC/MS加以分析，而第三个样品被吸收在150μl甲醇用于高效液相色谱(HPLC)研究。

实施例6：通过气相色谱法(GC)分析酵母中游离和酯化的固醇

1)FID(火焰电离检测)气相色谱法(GC)

悬浮在己烷中的(游离或总)固醇提取物根据方法1(参照实施例51)a)和b))来制备。注射对照被加入固醇混合物，一般胆固醇浓度为10至50ng/μl。

然后1至3μl的样品在下列条件下被注射到气相色谱装置上。1至3μl被注射到Alltech SE30-型柱上(柱参照：30m×0.32mm IDX 0.25μm)。气相载体是氦。分流比是在50和80之间。柱头压是30psi。注射器设置在280℃。柱的起始温度是130℃，0.5分钟。它以40℃/min的速率升高至230℃，然后以3℃/min的速率从230℃升高至280℃。然后柱维持在290℃。检测器的温度是310℃。

2)与质谱偶联的FID(火焰电离检测)气相色谱法(GC)(GC/MS)

悬浮在己烷中的总固醇提取物根据方法2来制备。使用的GC装备有传统的“分流/非分流(split/splitless)”注射器，其具有长度为30米，直径为0.25mm的传统DB5柱。

注射在230℃，以氦作为气相载体，于2ml/min的流速来进行。柱子以4个阶段从130达到290℃。注射前，柱子维持在130℃，然后以40℃/min的线性变化增加至230℃，再以3℃/min的线性变化从230℃增加至280℃，以及再以30℃/min的线性变化从280℃增加至290℃。柱子在290℃保持5分钟。

在气相色谱柱出口，随后通过在例如来自Perkin Elmer的TurboMass型装置的离子化腔室中的喷射质谱法来分析分子。该分子用高能量的电子流片段化。然后不同的片段在四极过滤器上分离，并在离子检测器上检测。包括M+离子片段化全部产物质量的质谱相应于位于离子流图表上的每个质量。将在柱子上给定的滞留时间获得的这个质谱与片段化产物的文库以及由Quail和Kelly描述的固醇质谱(Methods inMolecular Biology Vol.53Yeast Protocols Edited by Evans；M.Quail和S，Kelly″The Extraction and Analysis of Sterols from Yeast″pp.123-131(1996))进行比较。

由此可见，可能证实WGIF01菌株中缺失ERG6基因，特别是缺乏麦角甾-8，24(28)-二烯醇和存在具有24(25)-位双键的胆甾型固醇的效果。

实施侧7：通过UV检测或质谱检测的高效液相色谱(HPLC)分析酵母中游离和酯化的固醇

1)通过UV检测HPLC的分析：

10个30μl的固醇提取物(悬浮在乙腈或甲醇中并根据方法1或2)来制备(参照实施例5)被注射到X terra RP8型4.6×100mm柱上(Waters，Milford，MA01757USA)。

分离在由含有0.02％TFA(三氟乙酸)的水(缓冲液A)和纯的乙腈(缓冲液B)组成的梯度上进行。该柱子在分析期间维持在60℃。

使用的HPLC装置是“Waters 600E System Controller”型(Waters，Milford，MA01757USA)。UV检测在覆盖206至350nm波长的二极管-阵列检测器上进行。该柱子用含有20％(v/v)缓冲液A(乙腈)和80％缓冲液B(含有0.02％TFA(三氟乙酸)的水)的缓冲液平衡。线性梯度从含有50％缓冲液A和50％缓冲液B的溶液形成。10min后，洗提缓冲液的组成是25％缓冲液A对75％缓冲液B。然后施加新的线性梯度，以使得在30min，该梯度达到100％缓冲液B的值。这个值保持5分钟以清洁该柱子。

2)通过HPLC分析，通过质谱检测(HPLC/MS)：

在通过质谱法分析的情况下，样品维持在30℃并且在分析期间柱子维持在60℃。使用的HPLC装置是“Alliance HT Waters 2790”型，其偶连有“Waters MicroMass ZQ”质量检测器。不同于前述的检测方法，洗提缓冲液A不含有任何TFA，但两种缓冲液A和B含有0.01％(v/v)甲酸。

该柱子用含有80％缓冲液A’(含有0.01％(v/v)甲酸的水)和20％缓冲液B’(含有0.01％(v/v)甲酸的乙腈)的缓冲液平衡。

注射以含有50％的这两种缓冲液的缓冲液开始。具有两个线性变化的线性梯度从含有50％缓冲液A’和50％缓冲液B’的溶液形成。

10min后，洗提缓冲液的组成是25％缓冲液A’对75％缓冲液B’。然后该梯度的线性变化被改变以在分析25分钟后达到12.5％缓冲液A’和87.5％缓冲液B’，以及在30分钟达到100％的缓冲液B。这个值维持5分钟以使该柱子再生。

“Waters MicroMass ZQ”质量检测器设置为阳性电喷射离子化扫描。m/z的值在295和450之间。选择“连续”采集模式用于扫描。此外，“SIR”模式的信号提取在全部的预期质量通过待分析固醇的天然同位素丰度平行进行。检测器被设置为使得其能够完全分辨而没有来自有1个单位m/z差异的分子的干扰。所有的采集设置参数为使得相应于扫描和采集所有SIRs的总时间的总采集时间保持小于2秒。

实施例8：培养酵母菌株用于分析有或没有¹³C标记的其固醇含量：

待分析的菌株培养在含有2％常规D-葡萄糖或D-葡萄糖-U-¹³C₆(关于标记实验，参照图10)的50ml体积Kappeli培养基中(Kappeli等人，1985)。

起始培养物的光密度在600nm是0.1。这个培养物在30℃的温度，以200rpm摇动培养72小时。

然后细胞通过在600g离心培养基10分钟来回收。细胞颗粒再通过实施例5中提供的分析技术来直接分析(对于该研究不需要用半乳糖诱导)。

然而，对于Δ7-还原酶和Δ24-还原酶表达诱导的动力学研究(用质粒pYES_Δ24和/或pAG1转化的菌株)，沉淀颗粒重悬在含有2％半乳糖的50ml新鲜Kappeli培养基中(未用¹³C碳标记)。

这个培养物在30℃的温度，以200rpm摇动培养。

培养0小时、2小时、4小时、8小时和24小时后回收10ml培养物。

这些培养物样品在800g离心10分钟，在通过实施例5中描述的方法提取固醇前，细胞沉淀颗粒被冷冻并储存在-20℃。

实施例9：鉴定被分析菌株中存在的固醇：

固醇的鉴定是基于下列原则的组合：

-在油菜甾醇(麦角甾-5-烯醇)、麦角固醇(麦角甾-5，7，22-三烯醇)、胆固醇(胆甾-5-烯醇)、链甾醇(胆甾-5，24-二烯醇)、胆甾-5，22-二烯醇和酵母甾醇(胆甾-8，24-二烯醇)的情况中，以可靠的标准通过GC、HPLC、GC/MS和HPLC/MS比较性能。

-通过HPLC和二极管-阵列UV检测分析吸收光谱(参照实施例7-1)：

这个方法使得在光谱基础上清楚地鉴定5类固醇成为可能：1)SA1类：没有共轭二烯系统；2)SA2类：存在5，7-二烯系统；3)SA3类：存在22，24(25)-二烯系统；4)SA4类：存在8，14-二烯系统；5)SA5类：存在22，24(28)-二烯系统。类别SA3和SA5由于结构原因不能共存。类别SA2和SA4由于生物合成原因不能共存，SA2类可能与SA1、SA3、SA5的结构单位化合而形成附加的复合光谱。

-根据与各种类型的不饱和及麦角甾或胆甾型骨架的存在相关的滞留时间迁移的近似叠加性来分析GC和HPLC中的滞留时间。由于这个标准不是绝对的，其使用是为了帮助鉴定和除去不明确性，但其如果单独使用，存在出错的风险。因此它只与其他标准组合使用。

-GC/MS分析(参照实施例6-2)，其提供可与光谱文库进行比较的分子质量和片段化分布图谱。

-HPLC/电喷射-MS分析(参照实施例7-2)，就3-羟基固醇而言，其提供在分子质量-17(质子化(+1)和水分子丢失(-18))的主要信号。

-分析在生物合成的各个点被打断的不同参照酵母菌株固醇组成的上述全部系统。

-分析补充各种生物合成酶期间固醇组成的变化和导入这种补充期间这种补充的动力学。

-分析用碳-13同位素标记各种固醇的图谱。

-分析通过HPLC在给定的滞留时间分离的固醇的UV光谱。2个5，7-共轭双键显示在265和280nm之间具有2个吸收峰的典型光谱，同时2个22，24-共轭双键显示在235nm之间有吸收峰。最后，8，14-共轭双键可通过在245nm的吸收峰被鉴定出来。

实施例10：鉴定BMA64菌株中存在的固醇：

BMA64菌株培养在含有2％D-葡萄糖的50ml体积的Kappeli培养基中用于固醇的定量和比较分析。

然后细胞通过在600g离心培养基10分钟来回收，细胞颗粒沉淀通过实施例5中提供的技术加以分析。所描述的各种分析使得鉴定由这个菌株生产的固醇成为可能。

因此确定这个菌株累积其80％以上的游离固醇为麦角固醇(麦角甾-5，7，22-三烯醇)的形式(参照图8)。两个其他次要的可检测固醇是由这个菌株生产的；它们是麦角甾-5，7-二烯醇(ERG5基因产物的底物)(12％)和酵母甾醇(麦角甾-8，24-二烯醇)(5％)。没有检测到微量的胆固醇(该方法的检测极限是可观测到的固醇的大约0.5％)。也可检测到少量的羊毛甾醇(只是在总固醇的分析中)。

实施例11：鉴定WGIF01菌株中存在的固醇：

WGIF01菌株(参照实施例1)培养在含有2％D-葡萄糖的50ml体积的Kappeli培养基中(Kappeli等人，1985)用于固醇的定量和比较分析。

色谱中对于麦角甾-5，7，22-三烯醇(麦角固醇)或麦角甾-5，7-二烯醇在偶连质谱法的HPLC中的搜索是阴性的(小于在BMA64中获得的值的0.5％)。就游离的固醇而言，该菌株累积50％的总酵母固醇(胆甾-8，24-二烯醇)，ERG6基因产物的底物，和分别为30和20％的胆甾-5，7，24-三烯醇和胆甾-5，7，22，24-四烯醇可能由与在亲本菌株中导致产生麦角甾-5，7-二烯醇和麦角甾-5，7，22-三烯醇的机制相同的合成机制产生(参照图3和8)。这清楚地显示生物合成途径在erg6的水平被阻断，因为ERG6p酶(S-腺苷甲硫氨酸Δ24固醇C-甲基-转移酶)转化胆甾-8，24(25)-二烯醇为麦角甾-8，24(28)-二烯醇(参照图2)。这个累积清楚地表明WGIF01菌株不具有erg6基因的功能拷贝。该结果也表明酵母中麦角甾醇的正常生物合成途径，特别是固醇8，7-异构酶、固醇5-去饱和酶和固醇Δ22-去饱和酶，能够以保持相当大的活性转化胆甾-型底物。

实施例12：构建WGIF02菌株并且鉴定这个菌株中存在的固醇：

WGIF02菌株是通过用携带Δ24-还原酶表达盒的质粒pYES2(pYES_Δ24，参照实施例3)转化WGIF01菌株获得的。克隆在缺少尿嘧啶的培养基上被选择出来，Δ24-还原酶cDNA的存在和表达通过利用方法1分析这些转化子的固醇来验证(参照实施例5-1))。

选择称为WGIF02的克隆，因为它具有不同于WGIF01菌株的固醇图谱；而且，附加的固醇具有与胆固醇相似的滞留时间(参照图7)。WGIF02菌株培养在含有2％D-葡萄糖的50ml体积的Kappeli培养基中(Kappeli等人，1985)，用于固醇的定量和比较分析。

WGIF01菌株和WGIF02菌株的两个固醇提取图谱是相似的，除了出现借助其质量、其滞留时间及其共轭双键被鉴定为胆甾-5，7，22-三烯醇的新的峰(图2，3和7)。这个化合物的存在表明胆甾-5，7，22，24(25)-四烯醇的24(25)位中双键上24，25-固醇还原酶活性的预期存在。此外，胆甾-5，7，24-三烯醇的数量随着WGIF02菌株中胆甾-5，7，22-三烯醇的出现而降低(图7和8)。酶的活性通过胆甾-5，7，24-三烯醇在WGIF01菌株中表现为30％而在WGIF02中只表现为12％，其差异，即WGIF02菌株中18％完全转化为胆甾-5，7，22-三烯醇的形式来被证实。就由Δ24-还原酶转化胆甾-5，7，24的产物是在WGIF02中缺乏的胆甾-5，7，并且因此定量地被转化为胆甾-5，7，22而言，这是出乎意料的结果。这证明了另一个出乎意料的结果，即胆甾-5，7是固醇22-去饱和酶的底物，而胆甾-5，7，24，根据WGIF01菌株的固醇图谱，是较差的底物。

实施例13：构建WGIF03菌株并且鉴定这个菌株中存在的固醇：

WGIF03菌株是通过用质粒pAG1转化WGIF01菌株获得的。这个在大肠杆菌和酿酒酵母之间的穿梭质粒携带其相应的cDNA在GAL10/CYC1启动子控制之下的Δ7-还原酶的表达盒。WGIF01菌株通过氯化锂技术转化，并且转化子在不含有腺嘌呤的培养基上被选择出来。Δ7-还原酶的表达通过在正确克隆的固醇图谱中出现胆甾-5，24(25)-二烯醇来验证。更特定地选择满足这些标准的克隆并称为WGIF03。

WGIF03菌株培养在含有2％D-葡萄糖的50ml体积的Kappeli培养基中(Kappeli等人，1985)，用于固醇的定量和比较分析。

WGIF01菌株中Δ7-固醇还原酶的表达(产生WGIF03菌株)，不同于Δ24-固醇还原酶的表达，导致该菌株固醇图谱的深刻变化，其中几乎完全消失胆甾-5，7，22，24-四烯醇、胆甾-7，24-二烯醇和胆甾-8，24-二烯醇。

这个活性由于出现如先前描述的被鉴定为胆甾-5，24-二烯醇或链甾醇的主峰故而也是明显的。胆甾-8，24-二烯醇的数量从12变化至48％。对于WGIF01和WGIF03菌株分别是，检测到的胆甾-5，7，24-三烯醇从30变化至3％，而检测到的胆甾-5，7，22，24-四烯醇从23变化至4％。这些观察结果出乎意料地表明，固醇Δ7-还原酶以几乎不依赖于由固醇侧链携带的不饱和状态的方式还原胆甾-5，7-二烯醇。这个结果与用固醇Δ24-还原酶观察到的结果相反。出乎意料地，固醇Δ7-还原酶的表达也导致与胆甾-5，7-二烯醇协同的分子的累积(12％)。然而，似乎是相对不可能的，尽管不是不可能的，这个分子是胆甾-5，7-二烯醇，其理论水平在这些条件下应该降低而不是增加。出现少量的胆甾-5，22，24-三烯醇(8％)也是令人感兴趣的。后者的固醇是固醇22-去饱和酶对胆甾-5，24-二烯醇，WGIF03菌株中的主要固醇(60％)(由固醇Δ7-还原酶还原胆甾-5，7，24-三烯醇产生)起作用的预期产物。胆甾-5，22，24-三烯醇的少量积累出乎意料地表明，胆甾-5，24-二烯醇不是固醇22-去饱和酶的优良底物。借助在WGIF02菌株中获得的结果(参照实施例12)，可推测在24-位存在不饱和(胆甾-5，24-二烯醇或胆甾-5，7，24-三烯醇)使固醇22-去饱和酶难以代谢该固醇。ERG6p酶转化在24-位不饱和的胆甾为麦角甾的作用因而导致ERG5基因(22-去饱和酶)的较差底物转化为优良底物。

实施例14：构建WGIF04菌株并且鉴定这个菌株中存在的固醇：

WGIF04菌株是通过氯化锂技术，用质粒pAG1转化WGIF02菌株获得的，转化子在既不含有腺嘌呤也不含有尿嘧啶的培养基上被选择出来。然后正确的转化子根据胆固醇累积的检测来证实。满足这些标准的克隆被更特定地加以选择并称为WGIF04。WGIF04菌株的样品于2004年4月22日被保藏在国家微生物保藏中心(CNCM)，InstitutPasteur，25rue du Docteur Roux，75724Paris Cedex 15，法国，保藏号为I-3203。

不能与WGIF04区分的菌株也可通过用pYES_Δ24转化WGIF03菌株并应用相同的选择来获得。

WGIF04菌株培养在含有2％D-葡萄糖的50ml体积的Kappeli培养基中，用于固醇的定量和比较分析。

胆固醇表现为WGIF04菌株游离固醇的25％(参照图9)。这个菌株中胆固醇的形成是通过协同可靠的标准和通过GC/MA和HPLC/MS的验证在GC和HPLC中独立证实的。胆固醇在不同时表达Δ7-还原酶和Δ24-还原酶的所有菌株中是未检测到的(＜0.5％的总固醇)。

不具有erg6基因打断的菌株能够生产胆固醇；然而这表现为小于总游离固醇的5％。因此，可能构建从用pYES_Δ24和pAG1共转化的BMA64获得的BMA64-pYES_Δ24-pAG1菌株。这个菌株生产胆固醇，后者表现为总固醇的一些％。

CA10菌株用质粒pYES_Δ24转化。这个菌株也生产胆固醇，后者表现为总固醇的一些％。

此外，可能证明胆固醇的形成明显需要Δ7-还原酶和Δ24-还原酶启动子的诱导(参照图4和5)。含有这些基因的菌株在缺乏诱导时不生产胆固醇；图5表明诱导大约24h后，达到胆固醇的最大水平。与胆固醇(胆甾-5-烯醇)的形成相平行，也观察到胆甾-5，22-二烯醇的形成。图4和图5的分析表明诱导后，后者化合物的形成比胆固醇的形成更快，甚至在诱导前就开始形成(参照图5A：m/z＝367)。然而，如果菌株没有携带两个质粒pAG1和pYES_Δ24，这个化合物是完全缺乏的。因此22-脱氢胆固醇的形成比胆固醇的形成是更快的过程，但这个过程涉及在诱导后快速消失，为胆固醇的形成留下空间的前体。胆固醇可借助Δ24-还原酶从胆甾-5，24或借助Δ7-还原酶从胆甾-5，7形成。现在已经显示胆甾-5，7-二烯醇由于其立即被转化为胆甾-5，7，22-三烯醇的事实而不累积。因此胆固醇的来源是胆甾-5，24-二烯醇，其在诱导的时候是缺乏的，而在诱导大约4至8小时的时候累积，然后在大约24h减少(图5)。这解释了胆固醇的晚期出现，因为需要胆甾-5，24-二烯醇的在先合成。反之，胆甾-5，22-二烯醇的2个可能前体是胆甾-5，7，22-三烯醇和胆甾-5，22，24-三烯醇。后者在开始诱导时是缺乏的(图4)，而前者是存在的，然后平行于胆甾-5，22-二烯醇形成的稳定而快速减少。由此得出结论，胆固醇的来源是经Δ24-还原酶的5，24-二烯醇的还原，而胆甾-5，22-二烯醇的形成由经Δ7-还原酶的5，7，22-三烯醇的还原产生。通过Δ22-去饱和酶对胆固醇的作用形成胆甾-5，22-二烯醇不完全在讨论范围之外，但基于在动力学的长期时点(24h)与胆甾-5，22-二烯醇相比较的胆固醇的优先累积，胆甾-5，22-二烯醇的形成似乎是次要的过程(图4和5)。

实施例15：Δ22-去饱和酶的作用，优化胆固醇的生物合成途径：

对于WGIF04菌株约为24h的诱导时间，就游离固醇而言，胆甾-5，22-二烯醇的累积表现为胆固醇累积的大约50％(图4)。Δ22-去饱和酶基因的打断是用于优化胆固醇生产的一个选择。构建双重打断Δ22-去饱和酶(erg5基因)和erg6基因，并且表达Δ7-还原酶和Δ24-还原酶的菌株是完全可以想象到的。携带子集：打断Δ22-去饱和酶、表达Δ7-还原酶和表达Δ24-还原酶的菌株被生产出来。

这个菌株是通过氯化锂技术，用质粒pYES_Δ24转化CA10菌株并通过关于尿嘧啶的原养型来获得的。所得到的菌株称为CA10/Δ24。

表达Δ24固醇还原酶的CA10菌株生产相对少量的胆固醇(参照图6和7)并且主要累积麦角甾-5-烯醇和中间量的麦角甾-5，7-二烯醇。在这个菌株中麦角甾-5，7-二烯醇的积累是极低的，表明erg6基因的打断对于胆甾系列衍生物的大量累积是很必要的。因此Δ24还原酶的活性令人惊讶地相对很少与erg6基因产物竞争。由这些结果可得出结论，erg5和erg6基因的同时打断对于优化胆固醇生产的目的是很重要的。

WGIF04菌株中erg5基因的打断使得本领域的技术人员可能相当大地增加胆固醇的生产。这个菌株的可适用性是通过WGIF04和CA10/Δ24菌株的构建和这个菌株只是从前述两个菌株产生的明显遗传组合的事实确立的。源自WGIF04的数据表明当Δ24-还原酶表达时，胆甾-5，24快速消失(将用WGIF03获得的结果与用WGIF04获得的进行比较)。这使得预测胆固醇将在同时打断erg5和erg6基因并且共表达Δ7-还原酶和Δ24-还原酶，然后该胆固醇是唯一终末固醇的菌株中非常有效地被合成成为可能。

总而言之，对在阈值以上或等于总固醇20％的胆固醇生产的最小要求是打断erg6基因，表达Δ7-还原酶和Δ24-还原酶。Δ22-去饱和酶的补充打断使得提高胆固醇的产率和消除胆甾-5，22-二烯醇作为终末固醇的附加形成成为可能。

实施例16：胆固醇的同位素标记和同位素标签的限定：

生产标记胆固醇的原理在图10中有描述。这个操作首先包括使酵母生长在用¹³C完全标记的葡萄糖上，在30℃培养72小时。

然后细胞通过在600g离心培养基10分钟来回收。细胞沉淀颗粒再悬浮在含有未用¹³C碳标记的2％半乳糖的50ml新鲜的Kappeli培养基中。转换为半乳糖后2小时、4小时、8小时或24小时终止培养，提取固醇并进行分析(参照实施例7)。从葡萄糖转换为半乳糖导致诱导GAL10/CYC1启动子控制Δ7-还原酶基因和Δ24-还原酶基因。同时存在碳源同位素标记的变化。其确保代谢中间物以及随后的固醇，包括胆固醇的重新合成，其包括标记的逐步变化。标记中的这个变化以每种中间物固醇的质量分布图谱为特征。实际上，每个¹³C原子的掺入诱导一个原子量单位(AMU)质量的迁移。因此例如，胆固醇表现为摩尔质量范围根据标记的程度为386至413道尔顿。在利用正电喷射离子化的HPLC-质量分析中，这相应于范围为369至396(离子M+H⁺-H₂O，即M+1-18＝385-17＝369)的m/z(质量/电荷)值。HPLC中固醇的滞留时间不是可检测地依赖于标记的程度。相应于单个固醇“X”的HPLC峰的质谱相应于标记后在不同时间合成的固醇“X”质量分布的叠加(总和)的质量分布。因此它是复杂(图11)、但完全可被实验确定、并且表现独特同位素标签的分布图谱，其同时取决于：

-1)标记方案，特别是使用¹²C葡萄糖和¹³C半乳糖的培养时间和条件，

-2)所使用菌株的精确遗传结构，

-3)培养终止的精确时间。

这个同位素图谱具有几个独特的性质：

-1)它可通过调节培养条件、使用的菌株和选择的固醇按需调节。因此独特的标记指示可被生产出来；

-2)它是“可结合的”，即相应于用其本身可被调节的同位素图谱标记的几个独特固醇的几个同位素标签可结合在一起以形成“分子字母表”；

-3)它是可重复的，且易于实验确定(参照图11和12)表明该图谱的可重复性的双重或三重曲线；

-4)它相应于易于分离、稳定、无色且无嗅、不挥发且无毒，以及可被掺入食品、医用制品、添加剂或可被人类吸收的其他产品的分子追踪混合物；

-5)没有特定的重组菌株和非常精确的标记、培养和提取条件，它就不能被伪造。此外，对同位素标签的了解并不能使追踪使其可能被生产出来的参数成为可能。

概括来说，不能被伪造并且可被掺入任何类型产品，包括消费品的广泛使用的“同位素字母表”，可借助本发明而容易地获得。实际上存在可从使用标记分布图谱和各种类型固醇的这种字母表组成的无数“同位素单词”。因此这种标签进入大多数不同产品的掺入构成了不能被伪造的独特标记方法，其不同于例如一旦已知则能被再现的DNA标签。此外该标签能够通过例如，激光电离和随后的质谱分析(MALDI-TOF等)被非破坏性地读取。

实施例17：生产用¹³C高度标记的非动物胆固醇：

使用¹³C半乳糖或¹³C乙醇和葡萄糖替代未标记的碳源用于在上述用于固醇分析的条件下培养WGIF04菌株使得合成极高度标记的固醇，特别是胆固醇(至少包括95％的¹³C碳)成为可能。通过相同的方法，制备¹⁴C-放射性的固醇和胆固醇也是可能的。该方法也可被引入生产类固醇，特别是皮质甾醇的酵母菌株(参照专利申请WO02/061109)，以生产¹³C-标记或¹⁴C-标记的类固醇，例如用于RIA测定。

实施例18：构建主要生产胆固醇的菌株：

CDR07Mata菌株在以编号WO 02/061109公布的专利申请中有描述，并且在CNCM根据布达佩斯条约的规定于2001年1月24日以保藏号I-2616被保藏在国家微生物保藏中心(CNCM)，rue du DocteurRoux，75724Paris Cedex 15，法国。

CDR07MATa菌株(相关标记：ade2::GAL10/CYC1_p::Δ⁷；erg5::PGK1_p::hygro^R；ERG6)与实施例1中描述的WGIF01菌株(相关标记：ERG5；erg6::TRP1)杂交。

二倍体的孢子形成后，如实施例6中所描述的，确定孢子的固醇组成以发现生产为胆固醇前体的链甾醇的孢子。具有功能性TRP1基因并且如通过PCR分析所表明的，携带拟南芥Δ7-还原酶cDNA的生产链甾醇的孢子由此被鉴定出来。此外，称为YIM59的这个菌株对潮霉素敏感，表明ERG5基因是功能性的。

如实施例6和9所描述的制备的固醇制品显示这个YIM59菌株生产与酵母甾醇和链甾醇具有相同滞留时间的固醇。YIM59菌株也显示腺嘌呤、亮氨酸、尿嘧啶和组氨酸的营养缺陷型。链甾醇的存在证明这个菌株表达固醇Δ7还原酶并且其携带非功能性的erg6等位基因。

为了提高人DHCR24的表达水平，改变DHCR24cDNA的核苷酸序列；为了增加在起始ATG的翻译，也改变控制DHCR24表达的启动子。选择的新启动子是细胞色素c1的CYC1启动子，作为质粒pYES_Δ24的GAL1诱导型启动子的替代(参照实施例3)。

相应于与CYC1启动子融合的DHCR24还原酶末端NH2的序列被改变如下：

tagcgtggatggccaggcaactttagtgctgacacatacaggcatatatatatgtgtgcgacgacacatgatcatatggcatgcatgtgctctgtatgtatataaaactcttgttttcttcttttctctaaatattctttccttatacattaggtcctttgtagcataaattactatacttctatagacacgcaaacacaaaggaattgacaagtttgtacaaaaaagcaggctaaaaaATGGAACCTGCCGTGTCGCTGGCCGTGTGCG(SEQID No.7).

小写字母代表CYC1启动子的部分核苷酸序列，继之以AttB1重组序列，然后是先于起始ATG的AAAA序列。最初两个密码子的序列也被改变(ATG起始密码子后的序列GAA-CCT)。

携带在CYC1启动子控制之下的DHCR24cDNA、酿酒酵母2μ复制原点和URA3-d选择标记的最终质粒被称为pIM331。其没有DHCR24cDNA的等同物被称为pIM303。

YIM59菌株用质粒pIM303和pIM331独立转化，携带质粒pIM303(YIM59/pIM303菌株)或pIM331(YIM59/pIM331菌株)的两个转化子被更特定地选择出来。

这些菌株于28℃培养在重新构成的Kappeli型丰富培养基中72小时，以获得在600nm为40的吸光率。YIM59/pIM303菌株(不携带DHCR24cDNA)和YIM59/pIM331菌株(携带DHCR24cDNA)的总固醇提取物(酯化的固醇和游离的固醇)在存在甲醇氢氧化钾时(参照实施例5和6)被生产出来。测试这两个菌株生产胆固醇的能力。一些结果(GC)在图13中给出。呈现的滞留时间在两个色谱上表示为分钟。

如此可能显示不携带表达DHCR24的载体的菌株(YIM59/pIM303菌株)不生产胆固醇(部分A)，而主要是链甾醇(部分A)。相反，携带DHCR24cDNA的菌株(YIM59/pIM331菌株)生产具有胆固醇的滞留时间的固醇(部分B)。通过偶连有电子轰击质谱术的气相色谱技术(如实施例6中所描述的)可能证明，这个固醇实际上是胆固醇。利用各个固醇峰的表面积，可能评估由YIM59/pIM331菌株生产的胆固醇的数量是固醇的57％。

生物材料的保藏

下列生物体根据布达佩斯条约的规定，于2004年4月22日保藏在国家微生物保藏中心(CNCM)，25rue du Docteur Roux，75724ParisCedex 15，法国。

-WGIF04菌株以保藏号I-3203保藏。

所有提及的出版物和专利被引入本申请作为参考。

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-Wood，V.，等人2002.Nature.415：871-80。

表1：固醇不饱和度光谱分布的评估(消光系数mM^-1cm^-1)

序列表

<110>Aventis Pharma S.A.

<120>生产胆固醇的酵母菌株及其用途

<130>PRJ02025

<160>7

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>63

<212>DNA

<213>人工

<400>1

cctagcgacg aaaagcatca ttggagtgaa taacttggac ttaccattct tagcattttg 60

acg 63

<210>2

<211>68

<212>DNA

<213>人工

<400>2

gcataagagt gaaacagaat tgagaaaaag acaggcccaa ttcaaattcg ggtcgaaaaa 60

agaaaagg 68

<210>3

<211>25

<212>DNA

<213>人工

<400>3

agggccgaac aaagccccga tcttc 25

<210>4

<211>21

<212>DNA

<213>人工

<400>4

ggcaaaccga ggaactcttg g 21

<210>5

<211>36

<212>DNA

<213>人工

<400>5

tatatagcgg ccgctttcgc tgattaatta ccccag 36

<210>6

<211>34

<212>DNA

<213>人工

<400>6

tatatagcgg ccgcgagaag tgacgcaagc atca 34

<210>7

<211>270

<212>DNA

<213>人工

<400>7

tagcgtggat ggccaggcaa ctttagtgct gacacataca ggcatatata tatgtgtgcg 60

acgacacatg atcatatggc atgcatgtgc tctgtatgta tataaaactc ttgttttctt 120

cttttctcta aatattcttt ccttatacat taggtccttt gtagcataaa ttactatact 180

tctatagaca cgcaaacaca aaggaattga caagtttgta caaaaaagca ggctaaaaaa 240

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Claims

1.一种遗传改变的酵母菌株，其从单一碳源自主生产胆固醇，其特征在于它表达7-脱氢胆固醇还原酶和3β-羟基固醇Δ24-还原酶。

2.权利要求1所述的酵母菌株，其中固醇24-C-甲基转移酶已经失活。

3.权利要求1或2所述的酵母菌株，其中C-22固醇去饱和酶已经失活。

4.权利要求1-3之一项所述的酵母菌株，其特征在于7-脱氢胆固醇还原酶和3β-羟基固醇Δ24-还原酶的表达是通过该生物体的转化获得的。

5.权利要求2-4之一项所述的酵母菌株，其特征在于固醇24-C-甲基转移酶的失活是通过基因失活进行的。

6.权利要求3-5之一项所述的酵母菌株，其特征在于C-22固醇去饱和酶的失活是通过基因失活进行的。

7.前述权利要求之一项所述的酵母菌株，其特征在于它选自酵母属(Saccharomyces)或裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)。

8.一种酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株，其特征在于它是于2004年4月22日在国家微生物保藏中心(CNCM)保藏、保藏号为I-3203的WGIF04菌株。

9.一种用于生产非动物来源的胆固醇的方法，包括培养如前述权利要求之一项所述的酵母菌株。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于该由培养生物体组成的步骤之后是包括提取胆固醇的步骤。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于胆固醇的提取是用非水溶性溶剂进行的。

12.如权利要求10或11所述的方法，其特征在于皂化步骤是在胆固醇提取之前进行的。

13.如权利要求10、11或12所述的方法，其特征在于由机械研磨细胞组成的步骤是在皂化或胆固醇的提取之前进行的。

14.如权利要求1至8之一项所述的生物体用于生产以¹³C或¹⁴C标记的胆固醇、或其代谢中间物中的一种、或固醇混合物的用途。

15.用于生产以¹³C或¹⁴C标记的胆固醇、或其代谢中间物中的一种、或固醇混合物的方法，包括下列步骤：

-在¹³C-标记或¹⁴C-标记的底物上培养权利要求1至8之一项所述的生物体，以及

-提取所述的胆固醇、或其代谢中间物中的一种、或固醇混合物。

16.用于生产利用同位素标记物在不同位置进行标记的胆固醇、胆固醇中间物或胆固醇代谢物的同位素混合物的方法，包括在标记的底物，以及然后是未标记的底物上培养权利要求1至9之一项所述的生物体，选择在这些底物每一个上的培养时间以获得明确的同位素分布图谱。