CN1951174A - 一种适宜香石竹茎段诱导芽的培养基组合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种适宜香石竹茎段诱导芽的培养基组合物，特别地指MS培养基加6－BA0.05～1.2mg/L，对茎段诱导芽有效，其中MS+6－BA1mg/L效果最好。指明了植物生长调节剂6－BA对香石竹茎段诱导芽有促进的作用。本发明还提供了这种培养基组合物在香石竹组织培养快速繁殖中的应用，为今后香石竹的工厂化生产提供了可行的方案。

Description

一种适宜香石竹茎段诱导芽的培养基组合物及其应用

技术领域

本发明属于植物组织培养领域。

背景技术

香石竹(Dianthus Caryophyllus)别名麝香石竹、康乃馨。为石竹科石竹属多年生宿根草本植物，原产欧洲南部。它茎叶清秀，花朵富丽高雅，色彩绚丽娇艳，观赏价值极高，而且单朵花期长，宜制作花束、花篮，是世界著名的四大切花之一。

香石竹不易用种子繁殖，有性生殖又易产生品种间杂交，不能保持亲本的优良品质，生产中往往采用扦插进行繁殖。然而，由于扦插繁殖系数低、速度慢，难以满足市场需要，尤其是对于一些新培育出和新引进的品种，由于数量少，传统的繁殖方法更不能满足规模化生产的需要。同时，由于长期的田间无性繁殖，病毒侵染严重，直接影响切花的商品价值。采用组织培养方法繁殖香石竹，可有效地提高其品性，增加繁殖系数。

植物组织培养技术是当今国内外农业领域的一项高新技术，利用组织培养技术繁殖，繁殖速度非常快，而且可以周年生产，不受季节限制，操作简单，成本低廉。此技术应用到花卉领域，也为花卉的快速繁殖提供了便利。

目前，有关香石竹组培快繁的报道多是诱导不定芽(马均等，2003年，林业科技，28(4)：27-27；唐蓉等，2000年，试验研究，4：1-3；周菊花等，1992年，上海农业学报，8(3)：79-83；Fisher，M.等，1993年，Scientia Horticulture，53：231-237；Van Altvorst，A.C.等，1992年，Scientia Horticulture，51：223-235)或不定根(殷丽青等，1995年，上海农学院学报，13(3)：222-226)等某一个阶段的研究，而对于一个品种完整而系统地研究报道较少。

植物生长调节剂是培养基中的关键物质，虽然量极少，但在植物组织培养中起着十分重要和明显的调控作用。植物生长调节剂包括细胞分裂素、生长素及赤霉素等多种，它们在植物组织培养中具有不同的作用，其中以细胞分裂素类和生长素类最为常用。细胞分裂素有促进细胞分裂与分化，延迟组织衰老，增强蛋白质合成，促进侧芽生长及显著改变其他激素作用的特点，常用的有激动素(KT)和6-苄基腺嘌呤(6-BA)。生长素的主要作用在于诱导愈伤组织的形成，体细胞胚的产生以及试管苗的生根。常用的有2，4-二氯苯基乙酸(2，4-D)、萘乙酸(NAA)、吲哚乙酸(IAA)和吲哚丁酸(IBA)。在植物组织培养中，植物细胞分裂素和植物生长素的适当配比决定着试管苗的生长和分化。提高细胞分裂素浓度有利于芽的产生，增加生长素浓度有利于组织和器官的生长。为了使试管苗既有较高的增殖速度又能保持较好的长势，需要探索细胞分裂素和生长素的优选组合。

有关香石竹组培的试验中，周菊花等的报道中指出茎段诱导芽的最适6-BA浓度为3mg/L(周菊花等，上海农业学报，1992，8(3)：79-83)，但高浓度的6-BA培养较易出现玻璃化现象。添加其它成分比如青霉素等(胡继金，园艺学报，1991，18(1)：87-90)则可以降低香石竹组培过程中的玻璃化现象的发生。

目前未见以低浓度6-BA的培养基组合物来促进香石竹茎段诱导芽方面的应用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种适宜香石竹茎段诱导芽的培养基组合物及其应用，以克服现有的香石竹茎段诱导芽需要高浓度激素、易出现玻璃化现象、需添加青霉素使培养成本昂贵、易造成污染、不利于大规模工业化生产的缺陷。

技术方案

本发明的目的之一是提供一种适宜香石竹茎段诱导芽的培养基组合物，其组成包括：

(1)基础培养基

(2)6-苄基腺嘌呤0.05～1.2mg/L。

上述的香石竹茎段诱导芽的培养基组合物的一种优选方案是，所说的6-苄基腺嘌呤浓度为0.8～1.2mg/L。

上述的香石竹茎段诱导芽的培养基组合物的另一种优选方案是，所说的6-苄基腺嘌呤浓度为1mg/L。

上述的香石竹茎段诱导芽的培养基组合物中，所说的基础培养基为MS培养基或者LS培养基。

本发明的另一目的是提供香石竹茎段诱导芽的培养基组合物的应用，包括将所说的培养基组合物用于石竹科石竹属植物试管苗的增殖培养。所说的石竹科石竹属植物可为香石竹；特别是香石竹品种0409樱花、0413白玉兰、0418虞美人或者0420玛丽。

有益效果

香石竹茎段诱导芽的现有技术中多是采用基础培养基加高浓度激素如3mg/L 6-BA作为最适的培养基且多与NAA联用，本发明的适宜香石竹茎段诱导芽的培养基为：基础培养基加6-苄基腺嘌呤0.05～1.2mg/L，优选的6-苄基腺嘌呤浓度为0.8～1.2mg/L。基础培养基可使用MS或者LS。

(1)与现有技术相比，以本发明的培养基加单一的低浓度的激素6-BA对茎段外植体进行培养，芽的诱导效果显著：诱导率高，可达82.5％。

(2)芽体粗壮，增殖出的苗生长旺盛，30天后平均芽体长度可达2.09cm，茎叶生长都比较整齐健壮。

(3)增殖后的试管苗经生根、移栽到珍珠岩和蛭石配成的基质中，成活率达90％以上。

(4)单一低浓度的6-BA降低了香石竹组培过程中的玻璃化现象的发生，玻璃化苗的比例低于5％。

(5)单一低浓度的激素有利于降低培养原料成本、减少废水废物的处理成本。

(6)单一低浓度的激素可以减少大规模生产造成的环境激素污染，有利于废水废物处理过程的简化。

(7)本发明的培养基及其应用，为探索植物生长调节剂6-BA对香石竹茎段诱导芽的影响，以及增殖和移栽等全过程提供了合适的组培快繁条件，为今后香石竹的工厂化生产提供一套可行的措施。

本文所用的术语“植物组织培养技术”是指将植物的离体器官(如根、茎、叶、花、果实、种子等)、组织(如花药、胚珠、胚乳等)、细胞(如体细胞、生殖细胞花粉等)以及去除细胞壁的原生质体，放在离体无菌条件下，在人工控制的环境下，培养在人工配制的培养基上(含有营养物质和植物生长调节物质等)对其进行克隆，使其生长、分化并成长为完整植株的过程。由于培养物是在离体条件下的试管内进行，亦可称为离体培养或试管培养。

本文所用的术语“MS培养基”是指Murashige和Skoog研制的培养基，成分如表1所示。

                        表1 MS培养基成分

	成分	分子量	MS浓度(mg/L)
				大量元素	硝酸钾KNO3	101.11	1900
硝酸铵NH4NO3	80.04	1650
			磷酸二氢钾KH2PO4		136.09	170
硫酸镁MgSO4.7H2O	246.47	370
			氯化钙CaCl2.2H2O		147.02	440

微量元素	碘化钾KI	166.01	0.83
				硼酸H3BO3	61.83	6.2
	硫酸锰MnSO4.4H2O	223.01	22.3
				硫酸锌ZnSO4.7H2O	287.54	8.6
	钼酸钠Na2MoO4.2H2O	241.95	0.25
				硫酸铜CuSO4.5H2O	249.68	0.025
	氯化钴CoCl2.62	237.93	0.025
				铁盐	乙二胺四乙酸二钠Na2.EDTA	372.25	37.3
硫酸亚铁FeSO24.7H2O	278.03	27.8
			有机成分		肌醇		100
甘氨酸		2
				盐酸硫胺素VB1		0.1
盐酸吡哆醇VB6		0.5
				烟酸VB5或VPP		0.5
	蔗糖sucrose	342.31					30g/L
				琼脂agar		7g/L

本文所用的术语“LS培养基”是指Linsmaier和Skoog研制的，大量元素除CaCl₂.2H₂O用400ml/L外和MS培养基相同，微量元素、铁盐和MS培养基一样，有机物成分改为肌醇100mg/L、盐酸硫胺素VB10.4mg/L、水解酪蛋白1000-3000mg/L、蔗糖3％，琼脂1％的培养基。

本文所用的术语“芽诱导率”是指植物组织培养中外植体诱导出芽的比率，等于出芽的外植体个数与接种的外植体总数的比值。

本文所用的术语“玻璃化”是指植物组织培养中特有的一种生理性病变，是培养环境中的一些物理、化学和生化因子共同作用使植物组织新陈代谢紊乱所致。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

培养基及其配制、香石竹茎段外植体的选择、灭菌、接种和培养等方法主要参照杨永花的方法(杨永花等，甘肃农业科技，2000，5：45-46)进行。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

本实施例是香石竹茎段外植体诱导芽的过程，比较诱导芽的诱导率和茎段诱导芽的质量，筛选出最佳的培养基配方。

1)无菌材料的获得

试验材料：供试的香石竹品种为：“0420”玛丽，由上海花卉良种场提供。

选择供试品种生长健壮的植株，切取3cm左右的茎段，用肥皂水浸泡7-8min，流水冲洗过夜。将洗干净的外植体材料在超净台上用75％的酒精浸泡30s，无菌水冲洗2-3次，再用2％的NaClO并加1-2滴吐温-20消毒15-20min，无菌水冲洗6-7次。再切取1cm左右的茎段做最终接种外植体。

2)茎段外植体诱导芽

先用无菌滤纸轻轻吸去切取好的茎段表面的水分，然后接种于MS培养基加不同浓度细胞分裂素的培养基上诱导芽的产生。每一处理三瓶，每瓶接种10个茎段，30d后统计茎段诱导率，期间观察诱导出的芽的生长状况。

3)培养基配方及培养条件：

如表2所示，以MS为基础培养基，加不同浓度6-BA或者KT激素的培养基，蔗糖浓度为3.0％，琼脂浓度为0.7％，pH值为5.8。

培养条件：培养温度为25±2℃，光照强度1500-2000lx，光照时间16h/d。

                     表2MS培养基加6-BA/KT对茎段培养诱导形成芽

激素浓度(mg/L		接种数	芽数/外植体	芽诱导率(％)	芽生长状况
						6-BAKT6-BAKT6-BAKT6-BAKT	0.050.10.51	3030303030303030	2.51.22.71.63.53.15.23.3	49.839.454.652.875.272.482.540.7	芽长势较弱 出芽慢 芽体长约0.1cm芽长势较弱 出芽慢 芽体长度＜0.1cm芽长势较弱 出芽慢 芽体长约0.5～0.8cm芽长势较弱 出芽慢 芽体长约0.6cm芽体较粗壮 长约1.0～1.4cm芽体较粗壮 长约1.5cm芽体粗壮 芽体长约2～3cm叶色深绿芽长势稍差 芽体长约1cm叶水浸状

6-BAKT6-BAKT

1.52

30303030

3.61.81.90.6

38.929.326.218.6

芽长势稍差 芽体长约1.5cm芽长势差 部分玻璃化芽长势差 芽体长约0.6cm芽长势差 几乎全部玻璃化

注：芽诱导率＝诱导出的芽数/出芽的外植体个数

试验结果：

表2结果表明，把香石竹茎段外植体接种在含有细胞分裂素6-BA或KT的培养基中，均可形成芽。6-BA在0.05～1.0mg/L，KT在0.05～0.5mg/L范围内随浓度的升高，对芽的诱导形成的促进作用越明显，浓度超过1.0mg/L和0.5mg/L时则表现出抑制作用。同时还可看出，使用的细胞分裂素KT≥1.0mg/L时诱导产生的芽开始出现玻璃化，并且随着KT浓度的升高，玻璃化现象越严重。

综上可知：细胞分裂素6-BA对香石竹芽的诱导效果显著地高于细胞分裂素KT，降低6-BA的浓度可以减轻玻璃化现象，茎段诱导不定芽的适宜培养基为：MS+6-BA0.05-1.2mg/L。其中6-BA浓度为1mg/L时茎段的诱导率最高且芽体粗壮。

实施例2

本实施例是将四个香石竹品种的茎段接种在表2所示附加0.05，0.1，0.5和1.0mg/L6-BA的诱导培养基上，测试培养基应用于不同品种的适用性。

1.试验材料：供试的四个香石竹品种分别为：“0409”樱花，“0413”白玉兰，“0418”虞美人和“0420”玛丽，由上海花卉良种场提供。

2.培养基：

如表2所示，由MS培养基附加0.05，0.1，0.5和1.0mg/L 6-BA的诱导培养基。培养条件和试验方法同实施例1。

3.观察试验现象及结果分析得出：

经统计试验结果见表3。“玛丽”的诱导率最高且没有出现玻璃化现象，“樱花”和“虞美人”的诱导率中等稍有玻璃化现象，“白玉兰”的诱导率最低并且在四个品种中玻璃化现象最严重。所以，本发明MS培养基附加1.0mg/L 6-BA的诱导培养基适宜“0409”樱花，“0418”虞美人和“0420”玛丽三个品种，而不适用于“0413”白玉兰。

         表3  不同香石竹品种对茎段诱导芽的影响

品种

接种数(个)

诱导率(％)

玻璃化程度

樱花白玉兰虞美人玛丽

30303030

66.438.850.882.5

++ ++无

注：玻璃化程度表示方法：+＜5％    ++5％～15％

实施例3

本实施例是将香石竹茎段接种在LS培养基上，附加不同种类及浓度生长素，比较增殖率和再增殖的质量，测试不同培养基的适用性。

1.试验材料：供试的香石竹品种为：“0409”樱花，“0418”虞美人和“0420”玛丽，由上海花卉良种场提供。

2.培养基：

如表2所示，以LS为基础培养基，加不同浓度6-BA或者KT激素的培养基，蔗糖浓度为3.0％，琼脂浓度为0.7％，pH值为5.8。

3.培养条件和试验方法同实施例1。

4.观察试验现象及结果分析得出：

附加6-BA 0.05～1.0mg/L的LS培养基均适合上述品种的茎段诱导芽，芽诱导率为40％-70％。

尽管本发明描述了具体的例子，但是有一点对于本领域技术人员来说是明显的，即在不脱离本发明的精神和范围的前提下可对本发明作各种变化和改动。因此，所附权利要求覆盖了所有这些在本发明范围内的变动。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。

Claims (8)

1.一种香石竹茎段诱导芽的培养基组合物，其组成包括：

(1)基础培养基

(2)6苄基腺嘌呤0.05～1.2mg/L。

2.根据权利要求1所述的香石竹茎段诱导芽的培养基组合物，其特征在于，所说的6-苄基腺嘌呤浓度为0.8～1.2mg/L。

3.根据权利要求2所述的香石竹茎段诱导芽的培养基组合物，其特征在于，所说的6-苄基腺嘌呤浓度为1mg/L。

4.根据权利要求1所述的香石竹茎段诱导芽的培养基组合物，其特征在于，基础培养基为MS培养基。

5.根据权利要求1所述的香石竹茎段诱导芽的培养基组合物，其特征在于，基础培养基为LS培养基。

6.权利要求1所述的香石竹茎段诱导芽的培养基组合物的应用，包括将所说的培养基组合物用于石竹科石竹属植物试管苗的增殖培养。

7.根据权利要求6所述香石竹茎段诱导芽的培养基组合物的应用，所说的石竹科石竹属植物为香石竹。

8.根据权利要求7所述香石竹茎段诱导芽的培养基组合物的应用，所说的石竹科石竹属植物为香石竹品种0409樱花、0413白玉兰、0418虞美人或者0420玛丽。