CN111990259A - 香石竹高保真种苗繁育方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种植物快速繁育技术领域，具体公开一种香石竹高保真种苗繁育方法，其以香石竹枝条作为起始外植体，接种于定芽诱导培养基上，再经不定芽诱导预培养和不定芽诱导培养步骤获得丛芽。本发明通过试验结果表明，直接诱导不定芽只需2周左右即可成芽，生长速度显著快于愈伤诱导成芽，且直接诱导成芽具有良好的遗传稳定性，具有较好应用推广前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种植物快速繁育技术领域，具体香石竹高保真种苗繁育方法。
背景技术
香石竹(Dianthus caryophyllus L.)又名康乃馨，观赏价值极高，为世界四大鲜切花之一，中国、日本、美国等100多个国家母亲节主打花卉，西班牙、土耳其等6个国家的国花，深受世界人民喜爱。近年来，我国香石竹种植面积不断扩大，国内销售量与国外出口量持续上升，但国内优质新品种不多。香石竹主要采用扦插和分株方法繁殖，但繁殖系数低下，且因易受病毒侵染而导致种质资源退化。植物离体快繁技术，能在一定程度上克服上述缺点。目前，香石竹的离体再生研究主要集中在组培快繁、脱毒及检测、基因工程、保鲜技术等方面，尤其组织培养成为香石竹优质种苗生产的重要技术手段(王文成,郝明会.香石竹组培脱毒与快繁技术[J].吉林蔬菜,2011(01):66；许杰.麝香石竹的组培脱毒技术研究[J].安徽农业科学,2008(12):4864,4866.)。
本发明人采用体细胞不对称杂交技术，培育出了香石竹新品种“元红”，其颜色与世博会中国馆红色一致，曾在2010年世博会中国馆使用。该品种红色纯正，花量大，株高适中，深受消费者青睐，市场需求日益扩大。通常情况下，国内外香石竹优质种苗的规模化繁育主要依靠离体快繁技术进行(钱丽娟,张闪闪,贾爱平等.不同激素配比对香石竹茎尖组织培养的影响[J].农业科学研究,2013(3):35-37；周瑞金,杨静,孔晓萍.植物生长调节剂对香石竹离体培养的影响[J].现代园艺,2013(24):5-6)，但大多经由愈伤组织诱导而产生不定芽，往往会造成一定量的变异株，影响种苗整齐度(张玉园,杜清叶.不同培养条件对香石竹组培苗玻璃化现象的影响[J].农民致富之友,2015(22):90-91+169.)。
因此，需要研究保护遗传稳定性和高繁殖系数双重目标的香石竹高保真种苗繁育方法。
发明内容
为克服现有技术的缺陷，本发明人就遗传稳定性和高繁殖系数双重目标开展了香石竹的直接不定芽发生研究，通过研究探索最终获得了香石竹高保真种苗繁育方法。
因此，本发明提供香石竹高保真种苗繁育方法，其包括如下步骤：
(1)外植体材料的制备：以香石竹枝条作为起始外植体，消毒接种添加抗菌保护剂的MS基本培养基中；优选地，所述抗菌保护剂是植物组织培养抗菌保护剂(PlantPreservative Mixture，PPM)，添加量为0.03-0.08％(W)，优选为0.05％(W)。其中消毒是先使用5‰高锰酸钾溶液处理2min，再使用75％乙醇溶液处理30s。
(2)定芽诱导：将第(1)步培养后的外植体，接种于定芽诱导培养基上，所述定芽诱导培养基为MS作为基本培养基，添加细胞分裂素0.1-0.6mg/L。优选地，CTK添加量为0.3mg/L与0.5mg/L，更优选为0.4mg/L。培养时间为20-35天，优选为28天。
(3)不定芽诱导预培养：将第(2)步获得的定芽诱导的外植体接种至不定芽诱导预培养基上获得芽苗，所述不定芽诱导预培养基使用MS作为基本培养基，添加6-苄氨基嘌呤0.1-0.5mg/L与萘乙酸0.01-0.05mg/L。优选地，最佳激素组合为6-BA 0.2mg/L+NAA0.03mg/L。培养时间为7-20天，优选为14天。
(4)不定芽诱导培养：将预培养后获得的带侧芽的芽苗切除顶端部分，保留老桩及侧芽转接至不定芽诱导培养基上以获得丛芽，所述不定芽诱导培养基使用MS作为基本培养基，优选地，添加6-苄氨基嘌呤2-3mg/L+萘乙酸0.1-0.4mg/L，更优选，添加6-苄氨基嘌呤2-3mg/L+萘乙酸0.2-0.3mg/L，最优选，添加6-苄氨基嘌呤2mg/L+萘乙酸0.3mg/L；培养时间为30-45天，优选为35天。
进一步地，所述方法还包括下述步骤：(5)生根培养：将第(4)步中不定芽诱导出的丛芽分成单株，接种至生根培养基中，进行生根诱导。优选地，所述生根培养基使用MS作为基本培养基，添加0.1-1mg/L吲哚丁酸，优选添加量为0.3-0.5g/L吲哚丁酸，更优选为0.4g/L吲哚丁酸。培养时间为15-25天，优选为20天。
更进一步地，还包括：(6)炼苗：将第(5)步获得的已生根再生苗进行炼苗。所述炼苗方法为：将培养瓶盖打开，注入0.5-1cm清水，置于室温、自然光照下，静置2-3天，将瓶苗掏出，将基部附着的培养基洗净，准备移栽。
更进一步地，还包括：(7)移栽：将炼苗后的再生苗移栽至基质为泥炭土：珍珠岩：蛭石的培养质上，优选地所述基因为泥炭土：珍珠岩：蛭石＝3：1：1。具体操作时，在移栽前将基质连盆浸入水中使其完全润湿，移栽后套袋保湿，湿度不够时使用喷壶喷洒植株表面，待苗生长强健后除去套袋，正常养护。
优选地，第(1)至(5)中采用的培养基中添加蔗糖30g/L，肌醇0.1g/L，琼脂粉5.5g/L，调节培养基pH值为5.8。各步骤的培养条件为25±2℃，光照强度2000-3000lx，光照14h/d。
在一个优选实施方式中，作为起始外植体的香石竹枝条是带节茎段，优选长1cm。
在一个较具体的实施方式中，本发明的香石竹高保真种苗繁育方法，包括如下步骤：
(1)外植体材料的制备：取3-5cm长香石竹枝条作为起始外植体，先使用5‰高锰酸钾溶液处理2min，再使用75％乙醇溶液处理30s，接种至添加有0.05％植物组织培养抗菌保护剂的MS基本培养基中，培养1周后基部切口划平板，确定外植体维管束无菌后转至定芽诱导与伸长培养基中培养。其中更优选地，培养基中添加蔗糖30g/L，肌醇0.1g/L，琼脂粉5.5g/L，调节培养基pH值为5.8；培养条件为25±2℃，光照强度2000-3000lx，光照14h/d。
(2)定芽诱导与伸长：将(1)获得的无菌外植体，用解剖刀切1cm左右长度，接种于定芽(外植体芽点处诱导出的芽，一级侧芽)诱导培养基上。定芽诱导培养基使用MS作为基本培养基，添加细胞分裂素CTK 0.4mg/L。接种5d左右腋芽即开始出现萌动，2周左右开始萌发新芽，培养4周左右，诱导率达到98.6％。其中更优选地，培养基中添加蔗糖30g/L，肌醇0.1g/L，琼脂粉5.5g/L，调节培养基pH值为5.8。
(3)不定芽诱导预培养：将(2)获得的定芽诱导伸长的外植体接种至不定芽诱导预培养基上。不定芽诱导预培养基使用MS作为基本培养基，添加6-苄氨基嘌呤0.2mg/L与萘乙酸0.03mg/L，2-3周植株不定芽发生。其中更优选地，培养基中添加蔗糖30g/L，肌醇0.1g/L，琼脂粉5.5g/L，调节培养基pH值为5.8；培养条件为25±2℃，光照强度2000-3000lx，光照14h/d。
(4)不定芽诱导培养：将预培养2周的芽苗(带部分侧芽)切除顶端部分，保留1cm左右老桩及侧芽转接至不定芽诱导培养基上。不定芽诱导培养基使用MS作为基本培养基，添加6-BA 2mg/L+NAA 0.3mg/L，培养5-6周，增殖系数(增殖系数＝增殖出的不定芽总个数/发生增殖的外植体总数)可达24.3个，平均同质芽率(产生不定芽质量一致(高度相差不超过平均高度的10％)的外植体数/发生增殖的外植体总数×100％)达57.5％以上。其中更优选地，培养基中添加蔗糖30g/L，肌醇0.1g/L，琼脂粉5.5g/L，调节培养基pH值为5.8；培养条件为25±2℃，光照强度2000-3000lx，光照14h/d。
(5)生根培养：将(4)中不定芽诱导出的丛芽分成单株，接种至生根培养基中，进行生根诱导，生根培养基使用MS作为基本培养基，添加0.4mg/L添吲哚丁酸。7-14d可生根，生根诱导率达98.6％，平均生根条数3-5条。其中更优选地，培养基中添加蔗糖30g/L，肌醇0.1g/L，琼脂粉5.5g/L，调节培养基pH值为5.8；培养条件为25±2℃，光照强度2000-3000lx，光照14h/d。
(6)炼苗：挑选(5)中已生根且长势健壮的瓶苗进行炼苗，炼苗方法为：将培养瓶盖打开，注入0.5-1cm清水，置于室温、自然光照下，静置2-3天，将瓶苗掏出，将基部附着的培养基洗净，准备移栽。
(7)移栽：移栽基质为泥炭土：珍珠岩：蛭石＝3：1：1，移栽前将基质连盆浸入水中使其完全润湿，移栽后套袋保湿，湿度不够时使用喷壶喷洒植株表面，待苗生长强健后除去套袋，正常养护。1个月后统计成活率，成活率在95％以上。
与现有技术的效果相比，本发明在通过几个环节能够有效避免变异株的产生，包括通过带节茎段直接诱导定芽，及不定芽的诱导预培养及增殖，而不是通过愈伤诱导来产生不定芽；而且和常规的组培相比，本发明添加了不定芽诱导预培养，有利于高效稳定芽簇的产生。本发明通过试验结果表明，直接诱导不定芽只需2周左右即可成芽，生长速度显著快于愈伤诱导成芽，且直接诱导成芽具有良好的遗传稳定性。同时，在过程采取切除上部芽，而只保留老桩，并放大激素进行培养，有利于提高不定芽繁殖的整齐度，也可减少因植株不均匀导致的不定芽畸形、变异。
附图说明
图1元红新品种顶芽。
图2整理后的起始外植体。
图3消毒后的起始外植体。
图4诱导的定芽(A：0.01mg/L CTK处理；B：0.03mg/L CTK处理；C：0.05mg/L CTK处理)。
图5预培养的芽丛。
图6稳定再生不定芽簇(A：0.5mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA处理；B：1mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA处理；C：3mg/L 6-BA+0.3mg/L NAA处理)。
图7生根的试管苗。
图8移栽成活苗(40d)。
具体实施方式
下面通过具体实施方式的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限制，仅仅作示例说明。
(1)外植体材料的制备
选取健壮枝条(图1)作为消毒材料；切去叶片，保留从下往上数第2茎节的茎段和叶柄(图2)；先使用5‰高锰酸钾溶液处理2min，再使用75％乙醇溶液处理30s，接种至添加有0.05％植物组织培养抗菌保护剂(Plant Preservative Mixture，PPM)的MS基本培养基中，培养1周后基部切口划平板，确定外植体维管束无菌后转至定芽诱导与伸长培养基中培养。得到起始外植体(图3)。其中，MS培养基中添加蔗糖30g/L，肌醇0.1g/L，琼脂粉5.5g/L，调节培养基pH值为5.8；培养条件为25±2℃，光照强度2000-3000lx，光照14h/d。
(2)定芽诱导与伸长
选取植株带节茎段作为起始外植体，用解剖刀切1cm左右长度，接种于定芽(外植体芽点处诱导出的芽，一级侧芽)诱导培养基上。定芽诱导培养基使用MS作为基本培养基，分别添加CTK 0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6，单位mg/L。14d后统计：诱导率、平均伸长量。其中，MS培养基中添加蔗糖30g/L，肌醇0.1g/L，琼脂粉5.5g/L，调节培养基pH值为5.8；培养条件为25±2℃，光照强度2000-3000lx，光照14h/d。
结果表明，不同浓度的CTK均能诱导“元红”产生定芽并使芽苗伸长(表1)。其中CTK0.4mg/L诱导效果最好(图4)，诱导率达到98.64％，平均长度3.6cm，且所需启动时间最短，接种5d左右腋芽即开始出现萌动，2周左右开始萌发新芽。当CTK浓度达到0.5mg/L时，除芽点诱导出的定芽外，部分诱导出了不定芽，芽平均长度降低，主茎较细弱，并伴随有玻璃化的现象产生，生长势下降，继续增大浓度则玻璃化现象更加显著，部分植株边缘逐渐发红，失去活力。综上，CTK 0.4mg/L为定芽诱导培养基最佳激素浓度。
表1不同CTK浓度对“元红”定芽诱导的影响
(3)不定芽诱导预培养
将已进行定芽诱导伸长的外植体接种至不定芽诱导预培养(诱导一级侧芽再生，即二级侧芽诱导)配方上。不定芽诱导预培养基使用MS作为基本培养基，选取了不同浓度的6-BA(0.1、0.2、0.3、0.4mg/L)与NAA(0.01、0.02、0.03、0.04mg/L)两种常见植物激素进行不同浓度的组合，以0mg/L 6-BA+0mg/L NAA为对照，进行不定芽诱导预培养的研究。其中，MS培养基中添加蔗糖30g/L，肌醇0.1g/L，琼脂粉5.5g/L，调节培养基pH值为5.8；培养条件为25±2℃，光照强度2000-3000lx，光照14h/d。14d后统计：愈伤率、二级侧芽发生率、多芽发生率。
结果表明(表2)，16种6-BA与NAA的激素组合均能使“元红”外植体产生愈伤组织及侧芽，随着激素浓度的增加，愈伤率、二级侧芽发生率及多芽发生率均逐步上升，在一定范围内提高NAA的浓度能在一定程度上控制愈伤率的上升，提高二级侧芽发生率，缩短成芽时间；过高浓度的6-BA会使多芽发生率显著上升，导致植株突变增多，大大降低了植株的整齐度及生长势；当6-BA浓度为0.2mg/L时外植体形成愈伤率低于15％，二级侧芽发生率平均接近60％，且多芽发生率低于20％，植株保持有较好的整齐性和稳定性(图5)；当6-BA浓度达到0.3mg/L时，多芽发生率超过40％，继续增大浓度则芽苗逐渐失去活力。综上，0.2mg/L 6-BA+0.03mg/L NAA既能有效的控制多芽发生，又有较低的愈伤率及较高的二级侧芽发生率，为不定芽预培养的最佳激素组合配方。
表2不同组合配方对“元红”的愈伤率及侧芽发生率的影响
(4)不定芽诱导培养
将已诱导伸长的定芽切下，去除顶端部分及二级侧芽，保留1cm左右基部老桩转接至不定芽诱导培养基上。不定芽诱导培养基使用MS作为基本培养基，分别添加6-BA 1、2、3、4mg/L与NAA 0.1、0.2、0.3、0.4mg/L，共设置16组实验组与1组对照组，对照组添加0mg/L 6-BA+0mg/L NAA。其中，MS培养基中添加蔗糖30g/L，肌醇0.1g/L，琼脂粉5.5g/L，调节培养基pH值为5.8；培养条件为25±2℃，光照强度2000-3000lx，光照14h/d。35d后统计：增殖率、增殖系数和同质芽率。
结果表明(表3)，在不定芽诱导培养中，激素配比及浓度对高效稳定芽簇的产生有显著的影响。随着激素浓度的升高，增殖率和增殖系数呈现出先上升后下降的趋势，当6-BA浓度为2mg/L时，平均增殖系数超过了20，平均同质芽率高于50％，且二者都在NAA浓度为0.3mg/L时达到最大值，分别为24.26、57.52％(图6)；进一步增加两种激素浓度，虽然增殖率略有上升，增殖系数和同质芽率则逐渐下降；增殖系数越高，植株繁殖力越强，变异率越高，高变异率导致同质芽率下降，降低了植株整体稳定性及观赏性，增加生产及管理难度。综上，2mg/L 6-BA+0.3mg/L NAA为高效稳定诱导不定芽的最佳激素组合。
表3不同组合配方对“元红”高效稳定芽簇产生的影响
(5)生根培养
不定芽诱导出的丛芽分成单株，接种至生根培养基中，进行生根诱导，生根培养基使用MS作为基本培养基，分别添7种不同浓度的IBA(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mg/L)，以0mg/L IBA为对照，进行不定根诱导的研究，其中，MS培养基中添加蔗糖30g/L，肌醇0.1g/L，琼脂粉5.5g/L，调节培养基pH值为5.8；培养条件为25±2℃，光照强度2000-3000lx，光照14h/d。
结果表明(表4)，随着IBA浓度的增加，最快生根时间显著提前，继续增大浓度则略微延后；当IBA浓度为0.3mg/L时，最快生根时间均达到最小值6.7d；随着浓度的升高，生根率、平均生根条数及平均根长均呈现出先快速上升后缓慢下降的趋势，当IBA浓度为0.4mg/L时生根率达到最大值98.60％，平均生根条数及平均根长则分别为3.58条、2.51cm(图7)；IBA 0.3mg/L与0.4mg/L时生根率与平均生根条数都较高，且相较于0.5mg/L时根系更为粗壮，活力更好；当激素浓度大于0.4mg/L时则生根率及根系活力都逐渐下降。综上，0.4mg/LIBA为不定芽生根的最佳激素浓度。
表4不同IBA浓度对“元红”的生根情况的影响
(5)炼苗与移栽
将已生根且长势健壮的瓶苗进行炼苗，炼苗方法为：将培养瓶盖打开，注入0.5-1cm清水，置于室温、自然光照下，静置2-3天，将瓶苗掏出，将基部附着的培养基洗净，准备移栽。移栽基质为泥炭土：珍珠岩：蛭石＝3：1：1，移栽前将基质连盆浸入水中使其完全润湿，移栽后套袋保湿，湿度不够时使用喷壶喷洒植株表面，待苗生长强健后除去套袋，正常养护(图8)。1个月后统计成活率，成活率在95％以上。
Claims (10)
1.一种香石竹高保真种苗繁育方法，其包括如下步骤：
(1)外植体材料的制备：以香石竹枝条作为起始外植体于种添加抗菌保护剂的MS基本培养基中；优选地，所述抗菌保护剂是植物组织培养抗菌保护剂，添加量为0.03-0.08％(W)，优选为0.05％(W)；其中消毒是先使用5‰高锰酸钾溶液处理2min，再使用75％乙醇溶液处理30s；
(2)定芽诱导：将第(1)步培养后的外植体，接种于定芽诱导培养基上，所述定芽诱导培养基为MS作为基本培养基，添加细胞分裂素0.1-0.6mg/L；
(3)不定芽诱导预培养：将第(2)步获得的定芽诱导的外植体接种至不定芽诱导预培养基上以获得芽苗，所述不定芽诱导预培养基使用MS作为基本培养基，添加6-苄氨基嘌呤0.1-0.5mg/L与萘乙酸0.01-0.05mg/L；
(4)不定芽诱导培养：将预培养后获得的带侧芽的芽苗切除顶端部分，保留老桩及侧芽转接至不定芽诱导培养基上以获得丛芽，所述不定芽诱导培养基使用MS作为基本培养基，添加6-苄氨基嘌呤1-3mg/L 6-BA与萘乙酸0.1-0.4mg/L。
2.如权利要求1所述的香石竹高保真种苗繁育方法，其特征在于，
所述第(2)步中，细胞分裂素CTK添加量为0.3mg/L至0.5mg/L，更优选为0.4mg/L；培养时间为20-35天。
3.如权利要求1所述的香石竹高保真种苗繁育方法，其特征在于，
所述第(3)步中，优选地，添加6-苄氨基嘌呤0.2-0.4mg/L+萘乙酸0.02-0.04mg/L；更优选地，添加6-苄氨基嘌呤0.2mg/L+萘乙酸0.03mg/L；培养时间为7-20天。
4.如权利要求1所述的香石竹高保真种苗繁育方法，其特征在于，
所述第(4)步中，添加6-苄氨基嘌呤2-3mg/L+萘乙酸0.1-0.4mg/L，更优选，添加6-苄氨基嘌呤2-3mg/L+萘乙酸0.2-0.3mg/L，最优选，添加6-苄氨基嘌呤2mg/L+萘乙酸0.3mg/L；培养时间为30-45天。
5.如权利要求1所述的香石竹高保真种苗繁育方法，其特征在于，
还包括下述步骤；
(5)生根培养：将第(4)步中不定芽诱导出的丛芽分成单株，接种至生根培养基中，进行生根诱导；优选地，所述生根培养基使用MS作为基本培养基，添加0.1-1mg/L吲哚丁酸，优选添加量为0.3-0.5g/L吲哚丁酸，更优选为0.4g/L吲哚丁酸；培养时间为15-25天。
6.如权利要求5所述的香石竹高保真种苗繁育方法，其特征在于，进一步地，还包括下述步骤：
(6)炼苗：将第(5)步获得的已生根再生苗进行炼苗；优选地，所述炼苗方法为：将培养瓶盖打开，注入0.5-1cm清水，置于室温、自然光照下，静置2-3天，将瓶苗掏出，将基部附着的培养基洗净，准备移栽。
7.如权利要求6所述的香石竹高保真种苗繁育方法，其特征在于，进一步地，还包括下述步骤：
(7)移栽：将炼苗后的再生苗移栽至基质为泥炭土：珍珠岩：蛭石的培养质上；优选地所述基因为泥炭土：珍珠岩：蛭石＝3：1：1。
8.如权利要求1至7任一项所述的香石竹高保真种苗繁育方法，其特征在于，所述MS基本培养中添加蔗糖30g/L，肌醇0.1g/L，琼脂粉5.5g/L，调节培养基pH值为5.8。
9.如权利要求1至7任一项所述的香石竹高保真种苗繁育方法，其特征在于，各步骤的培养条件为25±2℃，光照强度2000-3000lx，光照14h/d。
10.如权利要求1至7任一项所述的香石竹高保真种苗繁育方法，其特征在于，作为起始外植体的香石竹枝条是带节茎段，优选长度为1cm。
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