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CN1274829C - 抗eb病毒所致肿瘤多肽及其应用与制备方法 - Google Patents

抗eb病毒所致肿瘤多肽及其应用与制备方法 Download PDF

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CN1274829C CNB2004100814468A CN200410081446A CN1274829C CN 1274829 C CN1274829 C CN 1274829C CN B2004100814468 A CNB2004100814468 A CN B2004100814468A CN 200410081446 A CN200410081446 A CN 200410081446A CN 1274829 C CN1274829 C CN 1274829C
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Abstract

本发明提供一种抗EB病毒所致肿瘤多肽的基因、重组质粒和多肽。将编码诱导多肽的基因与大肠菌素基因可操作地连接，从而获得表达重组抗肿瘤多肽的核苷酸序列。将如上所述的编码诱导多肽的核苷酸序列经双链寡聚核苷酸点突变技术插入大肠菌素基因即形成本发明的重组质粒。将获得的重组质粒转染入大肠杆菌TG1工程菌中而获得可产生重组抗肿瘤多肽的工程菌细胞；大量增菌、离心沉淀菌体、超声破碎、高速离心沉淀破碎菌体、取上清进行处理即可得到重组抗肿瘤多肽。本发明所述抗肿瘤多肽具有特异的靶向性，特异杀灭实体肿瘤的效率高于传统抗肿瘤药物，而不会攻击正常细胞，其毒性和不良反应远低于传统抗肿瘤药物。

Description

抗EB病毒所致肿瘤多肽及其应用与制备方法
                           技术领域
本发明涉及一种抗EB病毒所致肿瘤多肽的基因、重组质粒、多肽及其应用与制备方法。
                           背景技术
恶性肿瘤是对人类健康的巨大威胁。全世界每年死于恶性肿瘤的患者约有七百万人，其中中国就占了六分之一，恶性肿瘤已是我国第二位的死亡原因。由于其病因、发病机制、临床表现尚未阐明，故防治效果也不理想。现有抗肿瘤药物在肿瘤治疗中占重要地位，虽然对一些肿瘤已取得一定的疗效，但仍存在着对肿瘤细胞选择性差，免疫抑制及不良反应多而严重，产生耐药性等缺陷。
近年来肿瘤基础和临床研究取得很大的进展，其中开发新型抗肿瘤药物最重要的努力方向之一就是发展特异杀伤肿瘤细胞的药物。如果能找到一种肿瘤细胞的表面特异性标志物，也就是说这样的表面特异性标志物只有肿瘤细胞才有，而正常细胞没有，那么就可以发展出只攻击肿瘤细胞，不攻击正常细胞的安全型抗肿瘤药物。
寻找肿瘤细胞表面特异性标志物的研究已进行了数十年，然而可供使用的细胞表面特异性标志物发现得并不多，因此该难点已成为开发特异杀伤肿瘤药物的学术/技术瓶颈。
Epstein-Barr病毒(EB病毒)所致的非洲儿童恶性淋巴肉瘤、Hodgkin’s淋巴肉瘤和鼻咽癌细胞表面均带有特异的EB病毒表面抗原，因此，EB病毒表面抗原就可以认为是该类肿瘤细胞的一种特异性标志物。
                           发明内容
本发明的一个目的在于提供一种新型的抗EB病毒所致肿瘤多肽的基因、重组质粒、多肽，此种多肽能特异的杀灭实体肿瘤及转移的肿瘤细胞，且不会伤害正常的细胞。本发明的再一目的是提供上述重组抗肿瘤多肽的制备方法。
本发明的技术方案如下：
将编码诱导多肽的基因与大肠菌素基因可操作地连接，从而获得表达重组抗肿瘤多肽的核苷酸序列。编码诱导多肽的基因为序列表中SEQ ID NO.2(编码序列号-2)或SEQID NO.4(编码序列号-4)所述的核苷酸序列，上述编码诱导多肽的核苷酸序列是以ATCCHB-168杂交瘤细胞的抗EB病毒包膜糖蛋白抗体重链CDR1区，CDR3区，CDR1-CDR2连接段和轻链CDR3区的基因为蓝本构建而成。大肠菌素可选自能形成离子通道的大肠菌素E1，Ia，Ib，A，B和N，在本发明的一个优选实施例中，将上述诱导多肽的基因与大肠菌素Ia(SEQ ID NO.1)的羧基端基因连接而形成如序列表中SEQ ID NO.6(编码序列号-6)和SEQ ID NO.8(编码序列号-8)所述的核苷酸序列。
本发明所述重组质粒，是将如上所述的编码诱导多肽的核苷酸序列经双链寡聚核苷酸点突变技术插入大肠菌素的羧基端形成本发明的重组质粒。若选用大肠菌素Ia，则将编码诱导多肽的核苷酸序列插入Ia基因的第626位氨基酸后而形成本发明的重组质粒。构建重组质粒的原始质粒pSELECTTM-1来自于Promega公司，其中装载了大肠菌素Ia和Immunity蛋白基因，针对诱导多肽设计了6对引物，其序列见实施例1。利用双链寡聚核苷酸点突变技术，按照Strategene公司药箱操作获得重组质粒。
本发明的又一方面，提供本发明所述抗肿瘤多肽的制备方法，将编码诱导多肽的基因可操作地与大肠菌素基因连接获得编码重组抗肿瘤多肽的基因的重组质粒，将获得的重组质粒转染入大肠杆菌TG1工程菌中而获得可产生重组抗肿瘤多肽的工程菌细胞。分离纯化表达的多肽即获得本发明所述的抗肿瘤多肽，其氨基酸序列如序列表中SEQ IDNO.7(编码序列号-7)和SEQ ID NO.9(编码序列号-9)所述。
本发明所述多肽可在制备治疗或预防EB病毒所致肿瘤的药中应用。可以通过将本发明中的多肽添加药学上可接受的载体或赋形剂或可选的其它成分而制成适于临床使用的药物组合物。其机理是：多肽中可与靶肿瘤细胞表面特异性标志物(EB病毒表达在靶肿瘤细胞膜上的EB病毒表面抗原)结合的诱导多肽诱导大肠菌素通道结构域到达靶肿瘤细胞膜附近，然后大肠菌素通道结构域的疏水区段插入靶肿瘤细胞膜中，进而大肠菌素通道结构域在靶肿瘤细胞膜上形成离子通道，使靶肿瘤细胞内容物泄漏而致肿瘤细胞死亡，从而达到杀死肿瘤细胞的目的。
本发明所述的抗肿瘤多肽相较于传统抗肿瘤药物的优点在于，其具有特异的靶向性，因而在治疗过程中不会攻击正常细胞，所以其毒性和不良反应远低于传统抗肿瘤药物。再由于它是在肿瘤细胞膜上直接形成离子通道来杀伤肿瘤细胞，因此与传统抗肿瘤药物相较，肿瘤细胞对其产生耐药性的概率要低得多：1.在抗肿瘤多肽-离子通道造成泄漏而致肿瘤细胞死亡的这一较短时限内，肿瘤细胞较难以利用突变基因-蛋白表达方式来修复抗肿瘤多肽-离子通道在肿瘤细胞膜上造成的几何缺损；2.嵌合在肿瘤细胞基因中的病毒基因是寄生的基因，因而肿瘤细胞内可能缺乏有效的寄生病毒基因反馈机制来及时有效的调整表达在肿瘤细胞膜表面病毒抗原的变异性，这样在一个相对长的时限内，构建的引导多肽总是对该抗原保持着有效的结合效率，所以肿瘤细胞对本发明的抗肿瘤多肽产生耐药性的概率较低。再由于它可在体液和血液中游动，因此它将是对抗转移过程中肿瘤细胞的利器。需要特别说明的是，本发明实施例试验显示，它的杀肿瘤细胞效率比受试传统抗肿瘤药物高出数倍之多。
                           附图说明
图1是含有引导多肽基因和大肠菌素Ia基因的重组质粒pCHCEB1的结构示意图。
图2是含有引导多肽基因和大肠菌素Ia基因的重组质粒pCHCEB2的结构示意图。
图3为本发明所述抗肿瘤多肽对体外培养EB病毒所致恶性肿瘤细胞的杀伤效应图，表明本发明所述多肽对EB病毒所致恶性肿瘤细胞表现出了最好的杀伤效应，图中各组结果分别为对照组、抗肿瘤多肽1组(pCHCEB1质粒)、抗肿瘤多肽2组(pCHCEB2质粒)和抗金葡菌多肽组，各实验组的药物用量均为200μg/ml培养液；其中，a对照组，b抗肿瘤多肽1处理组，c抗肿瘤多肽2处理组，d抗金葡菌多肽处理组，e相差图像fPI荧光染色图像。
图4为使用多重荧光染料观察本发明所述抗肿瘤多肽对体外培养恶性肿瘤细胞(EB病毒阳性)、恶性肿瘤细胞(EB病毒阴性)和正常人体细胞的杀伤效应图，图中各组结果分别为对照组，抗肿瘤多肽1组(pCHCEB1质粒)和抗肿瘤多肽2组(pCHCEB2质粒)，各实验组的药物用量均为200μg/ml培养液；a Raji细胞(ATCC CCL-86)，EB病毒阳性的Burkitt’s淋巴肉瘤细胞，b ATCC CR1-2230，46岁男性爱滋病人(AIDS)恶性淋巴肉瘤细胞，EB病毒和Kaposi肉瘤病毒(HHV8)均阳性，c ATCC CRL-1648，EB病毒阴性的Burkitt’s淋巴肉瘤细胞，d ATCC HepG 2，EB病毒阴性的人肝胚瘤细胞，e SMMC-7721，EB病毒阴性的人肝癌细胞，f3T3，EB病毒阴性的小鼠胚胎成纤维细胞，g ECV-304，EB病毒阴性的人静脉内皮细胞，h对照组，i抗肿瘤多肽1处理组，j抗肿瘤多肽2处理组。
图5为本发明抗肿瘤多肽对裸鼠体内由EB病毒所致人恶性淋巴瘤细胞长出的实体肿瘤的杀伤效应图，图中各组结果分别为对照组，抗肿瘤多肽1组(pCHCEB1质粒)和环磷酰胺组，给药途径为每日瘤旁注射，各实验组的药物用量：抗肿瘤多肽1组为300μg/鼠/日，环磷酰胺组为100μg/鼠/日(按全国高等医药院校教材“药理学”(第5版，金有豫主编，人民卫生出版社，2002年)“抗恶性肿瘤药”章401页，人体治疗4mg/kg/日标准剂量换算；a对照组，给药后第1日，此时肿瘤已长到2×2mm大小，b对照组，给药后第10日，肿瘤持续长大，c对照组，给药后第20日，肿瘤持续长大，d抗肿瘤多肽1组，给药后第1日，此时肿瘤已长到2×2mm大小，e抗肿瘤多肽1组，给药后第10日，肿瘤尺寸未见增大，f抗肿瘤多肽1组，给药后第20日，肉眼观察已无实体肿瘤，g环磷酰胺组，给药后第1日，此时肿瘤已长到2×2mm大小，h环磷酰胺组，给药后第10日，肿瘤持续长大，i环磷酰胺组，给药后第20日，肿瘤持续长大，且顶端可见红肿，坏死。
图6为图5各组长肿瘤鼠药物处理20日后取肿瘤标本的光镜观察图，图中各组结果分别为对照组，抗肿瘤多肽1组(pCHCEB1质粒)和环磷酰胺组；a对照组肿瘤标本HE染色，100x，b环磷酰胺组肿瘤标本HE染色，100x，c抗肿瘤多肽1组肿瘤标本1，HE染色，100x，d抗肿瘤多肽1组肿瘤标本2，HE染色，100x。
                          具体实施方式
实施例1  表达抗肿瘤多肽的质粒的构建和重组抗肿瘤多肽的制备
原始质粒为装载了大肠菌素Ia和Immunity蛋白基因的pSELECTTM-1商用质粒(质粒大小8.3kb，UCSF Dr.P.Gosh赠予)，经双链寡聚核苷酸点突变技术(QuickChangeTM Kit，Strategene公司)将编码诱导多肽的基因(序列表中SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4所述核苷酸序列)插入到大肠菌素Ia基因的I626位点后，制备出了抗肿瘤多肽的两种重组质粒pCHCEB1(如图1所示)、pCHCEB2(如图2所示)。重组质粒转染入E.coli TG1工程菌(AECOM，Dr.K.Jakes赠予)里制备多肽，获得序列表中SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.9所述的抗肿瘤多肽。其中，SEQ ID NO.7所述的抗肿瘤多肽由重组质粒pCHCEB1表达(在继后的实施例中称为“重组抗肿瘤多肽1”)，SEQ ID NO.9所述的抗肿瘤多肽由重组质粒pCHCEB2表达(在继后的实施例中称为“重组抗肿瘤多肽2”)。
突变程序按Strategene QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit(catalog#200518)药箱手册进行：
1、准备点突变反应物
5ul 10x buffer
2ul(10ng)野生型大肠菌素Ia质粒
1.25ul(125ng)设计的5’-3’寡聚核苷酸引物
1.25ul(125ng)设计的3’-5’寡聚核苷酸引物
1ul dNTP
双蒸水50ul
1ul pfu
(除质粒，引物和双蒸水外，均为药箱所备试剂)
2、进行PCR扩增，扩增条件：变性95℃，35秒，退火53℃，70秒，延伸68℃，17分共20个循环；
3、加入Dpn1内切酶1ul消化母体DNA链后(37℃，1小时)，取1ul反应物与XL1-Blue感受态细胞50ul冰孵30分钟，行热冲击42℃，45秒，再置入冰中2分钟；
4、加入NZY培基0.5ml后220rpm，37℃摇菌1小时后，取50-100ul反应物铺板(LB培基加1％琼脂加50ug/ml氨苄青霉素，37℃过夜)；
5、18小时后挑菌，循Qiagene，Gibco等公司的各种商用提取质粒药箱提取质粒均可，测序确定突变成功；
6、将质粒50ng与制备的TG1工程菌感受态细胞50ul冰孵30分，42℃，90秒热冲击，取50-100ul反应物加入LB培基0.5ml，220rpm，37℃摇菌1小时后铺板(LB培基加1％琼脂加50ug/ml氨苄青霉素)37℃孵育，18小时后挑取菌落；
7、大量增菌，8-16升FB培基，250rpm，37℃，6-8小时；离心沉淀菌体，4℃，6000g，20分钟，取4℃，50mM硼酸缓冲液(2mM EDTA+2mM DTT)50-80ml悬浮菌体，加入0.2MPMSF 250微升后行超声破碎(4℃，400W，2分钟)，高速离心沉淀破碎菌体(4℃，75000g，1.5小时)，取上清加入硫酸链霉素500万单位沉淀DNA，高速离心后(4℃，30000g，10分钟)取上清装入分子量15,000的透析袋于4℃，50mM硼酸缓冲液4升透析过夜后，高速离心后(4℃，30000g，10分钟)将上清上样于CM离子交换柱(4℃)，经0.1-0.3M NaCl+50mM硼酸缓冲液(4℃)梯度洗脱后即可得到重组抗肿瘤多肽。
制备上述质粒中诱导多肽基因所设计的寡聚核苷酸序列：
pCHCEB1
1、5’-3’
gcg aat aag ttc tgg ggt att TCC TTC GGTATG CAT TGG GTG CGT CAG taa ata aaa
tat aag aca ggc
   3’-5’
gcc tgtctt ata ttt tat tta CTG ACG CAC CCA ATG CAT ACC GAA GGA aat acc cca gaa ctt att
cgc
2、5’-3’
ggt atg cat tgg gtg cgt cag GCC CCC GAG AAA GGT CTG GAG TGG GTG GCC taa ata aaa
tat aag aca ggc
   3’-5’
gcc tgt ctt ata ttt tat tta GGC CAC CCA CTC CAG ACC TTT CTC GGG GGC ctg acg cac cca
atg cat acc
3、5’-3’
aaa ggt ctg gag tgg gtg gcc GGT CAG GGT TAC TCC TAC CCC TAC ACC taa ata aaa tat aag
aca ggc
   3’-5’
gcc tgt ctt ata ttt tat tta GGT GTA GGG GTA GGA GTA ACC CTG ACC ggc cac cca ctc cag
acc ttt
pCHCEB2
1、5’-3’
gcg aat aag ttc tgg ggt att TCC TTC GGTATG CAT TGG GTG CGT CAG taa ata aaa
tat aag aca ggc
   3’-5’
gcc tgt ctt ata ttt tat tta CTG ACG CAC CCA ATG CAT ACC GAA GGA aat acc cca gaa ctt att
cgc
2、5’-3’
ggt atg cat tgg gtg cgt cag GCC CCC GAG AAA GGT CTG GAG TGG GTG GCC taa ata aaa
tat aag aca ggc
   3’-5’
gcc tgt ctt ata ttt tat tta GGC CAC CCA CTC CAG ACC TTT CTC GGG GGC ctg acg cac cca
atg cat acc
3、5’-3’
aaa ggt ctg gag tgg gtg gcc TGG GGT AAT TAC CCC CAT TAC GCC ATG GAT taa ata aaa
tat aag aca ggc
   3’-5’
gcc tgt ctt ata ttt tat tta ATC CAT GGC GTA ATG GGG GTA ATT ACC CCA ggc cac cca ctc
cag acc ttt
实施例2：重组抗肿瘤多肽对EB病毒所致人恶性淋巴肉瘤(Burkitt’s lymphoma)外杀伤用
EB病毒阳性及阴性细胞株：为美国ATCC标准细胞株。
细胞培养：取出0.1ml复苏培养的Raji细胞悬浮液，缓缓加入含3ml 1640液体培养基(加10％血清)的培养皿中(稀释比例为1∶30)，混合均匀，放入37℃ CO2培养箱中培养。实验使用一株EB病毒阳性细胞株：ATCC CCL-86(即全世界细胞培养室使用的标准人Burkitt’s恶性淋巴肉瘤细胞，Raji细胞，1963年分离自12岁非洲男性患儿)。受试细胞共分4组，第一组为空白组，即加入重组抗肿瘤多肽空白保存液(10mMPB+0.2M NaCI磷酸盐缓冲液(pH7.4))。第二组为加入200μg/ml的重组抗肿瘤多肽1(质粒为pCHCEB1，保存液为10mMPB+0.2M NaCI磷酸缓冲液pH7.4)。第三组为加入200μg/ml的重组抗肿瘤多肽2(质粒为pCHCEB2，保存液为10mMPB+0.2M NaCI磷酸缓冲液pH7.4)。第四组为加入200μg/ml的抗金葡菌多肽(保存液为10mM PB+0.2M NaCI磷酸盐缓冲液pH7.4)。
细胞在培养24小时后，分别加入上述各组处理物于培养皿中，在加入处理物后的第72小时加入100uMol碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)20ul，10分钟后在荧光显微镜下观察。受试细胞株的空白组和抗金葡菌多肽组的细胞均生长良好。惟重组抗肿瘤多肽组中绝大部分细胞被PI染成了红色。提示这些细胞膜已被抗肿瘤多肽破坏，造成肿瘤细胞死亡。从细胞死亡数量来比较，重组抗肿瘤多肽1显然比重组抗肿瘤多肽2更为有效，见附图3。
实施例3：重组抗肿瘤多肽对EB病毒所致Burkitt’s人恶性淋巴肉瘤细胞和其它肿瘤细胞及正常细胞的体外杀伤作用的多重荧光染色观察
细胞培养条件同实施例2。实验共使用七株细胞，EB病毒阳性细胞株：ATCC CCL-86(Raji细胞，Burkitt’s恶性淋巴肉瘤细胞)；ATCC CRL-2230，46岁男性爱滋病人(AIDS)恶性淋巴肉瘤细胞株，EB病毒和Kaposi肉瘤病毒(HHV8)均阳性；EB病毒阴性细胞株：ATCC CRL-1648(CA-46，细胞分离自美国型Burkitt’s恶性淋巴肉瘤病人的腹水)；ATCCHepG2人肝胚瘤细胞；SMMC-7721人肝癌细胞，3T3小鼠胚胎成纤维细胞；ECV-304人脐静脉内皮细胞(后三株细胞均源自中国协和医科大学细胞中心)。每株细胞分为三个实验组，第一组为加入重组抗肿瘤多肽空白保存液(10mMPB+0.2M NaCI磷酸盐缓冲液(pH7.4))。第二组为加入200μg/ml的重组抗肿瘤多肽1(质粒为pCHCEB1)，保存液为10mMPB+0.2M NaCI磷酸缓冲液pH7.4。第三组为加入200μg/ml的重组抗肿瘤多肽2(质粒为pCHCEB2)，保存液为10mM PB+0.2M NaCI磷酸盐缓冲pH7.4。
细胞在培养24小时后，分别加入上述各组处理物于培养皿中，在加入处理物后的第72小时分别加入50uMol FITC 20ul及50uMol Rodamin-123 20ul两种荧光染料。10分钟后在Olympus IX-71荧光显微镜下观察。EB病毒阴性的各肿瘤细胞株和人，鼠正常细胞株被重组抗肿瘤多肽处理后均生长良好，胞体(染为绿色)，胞核(染为淡绿色)及线粒体(染为红色)结构清晰，无细胞肿胀。而EB病毒阳性的各肿瘤细胞株被重组抗肿瘤多肽处理后，绝大多数细胞出现线粒体及胞核结构消失，明显肿胀和坏死，其中以重组抗肿瘤多肽1杀伤效果最为显著，细胞几乎全部死亡。显然多重荧光染色的结果比实施例2碘化丙啶染色的结果更为精确的展示了重组抗肿瘤多肽对EB病毒阳性肿瘤细胞的强大杀伤作用，见附图4。
EB病毒阴性的肿瘤细胞和正常细胞株生长良好表明重组抗肿瘤多肽并不攻击细胞膜上不带有EB病毒表面抗原的细胞。这提示本发明重组抗肿瘤多肽具有理想的靶向性和安全性。
实施例4：重组抗肿瘤多肽对EB病毒所致人Burkitt’s恶性淋巴肉瘤细胞种植到裸鼠体内生长出的实体肿瘤的杀伤作用
BALB/C裸体小鼠由四川大学华西动物中心提供，裸鼠喂养按裸鼠饲养要求，水、垫草和饲料均经高温或紫外线灭菌。在相对无菌条件下饲养一周，无异常后进行接种实验。
收集指数生长期的Raji细胞悬液于50毫升离心管中，4℃离心，弃上清后，用1640液体培养基(加小牛血清)重悬细胞，使之达到1.0×107/ml个细胞。在裸鼠右腋处皮下注射Raji细胞悬液0.1ml。
注射细胞后3-4日肿瘤即长到约2×2mm，将荷瘤裸鼠随机分为(A组)重组抗肿瘤多肽空白保存液(10mM PBS+0.2MNaCI磷酸盐缓冲液(pH7.4))为对照组，(B组)重组抗肿瘤多肽1(质粒为pCHCEB1)治疗组，300μg/鼠(以25克重计算)/日，(C组)环磷酰胺组，按标准教科书(Cancer，Principles & Practice of Oncology，Editor，V.T.De Vita，Jr.，S.Hellman and S.A.Rosenberg，Lippincott Williams & Wilkins Publisher，2001，6th Edition，p2247-2249，Burkitt’s Lymphoma Treatment)选用环磷酰胺为现用抗肿瘤药物对照组，环磷酰胺100μg/鼠/日(按全国高等医药院校教材“药理学”(第5版，金有豫主编，人民卫生出版社，2002年)“抗恶性肿瘤药”章401页，人体治疗4mg/kg/日标准剂量换算)，间日给药，连续20日；每组10只荷瘤裸鼠。每天观察裸鼠活动情况，并作记录，隔天精确测量肿瘤大小并照相。
给药方式为瘤旁局部注射，每天注射1次，每次0.1ml，连续给药20天。
结果显示：重组抗肿瘤多肽组鼠肿瘤生长明显受到抑制，其中6只裸鼠的瘤块消失，其余4只的瘤块明显小于对照组和环磷酰胺组。6只环磷酰胺组鼠在20日实验期中死亡，所有环磷酰胺组鼠的瘤块大于重组抗肿瘤多肽组，小于对照组；详情请见附图5；重组抗肿瘤多肽在裸鼠体内可以远比环磷酰胺有效地抑制Raji细胞所致的实体瘤块生长。而并未表现出如环磷酰胺一样的致死性细胞毒性。
实施例5：体内实体肿瘤消除试验的病理观察
瘤体病理组织学观察：实施例4实验到期后处死动物，取出瘤体于10％福尔马林中固定，石蜡切片，HE染色常规光镜观察。
镜下观对照组鼠的实体肿瘤增殖旺盛；环磷酰胺组鼠的实体肿瘤中心部分出现坏死，提示经环磷酰胺20日处理后，虽然肉眼观实体肿瘤尺寸未见减小，但中心部分肿瘤细胞已被杀伤；抗肿瘤多肽组鼠的实体肿瘤显著减小，标本1中缩小的肿瘤细胞团中几乎均为坏死的肿瘤细胞，周边可见大量淋巴细胞浸润；标本2中仅见大量淋巴细胞浸润。病理组织学结果提示抗肿瘤多肽几乎杀灭了实体肿瘤中的所有肿瘤细胞，而环磷酰胺对实体肿瘤中的肿瘤细胞表现出的是部分杀灭效应；在20日处理期限中，抗肿瘤多肽的杀灭效果比环磷酰胺的杀灭效果出现得早而且彻底，见附图6。
                    SEQUENCE LISTING
<110>四川大学华西医院
<120>抗EB病毒所致肿瘤多肽及其应用与制备方法
<160>9
<170>PatentIn Version 2.1
<210>1
<211>1878
<212>DNA
<213>Escherichia coli
<220>
<221>misc_feature
<222>(1).....(1878)
<223>大肠菌素Ia基因
<400>1
atgtctgacc ctgtacgtat  tacaaatccc ggtgcagaat cgctggggta tgattcagat    60
ggccatgaaa ttatggccgt  tgatatttat gtaaaccctc cacgtgtcga tgtctttcat    120
ggtaccccgc ctgcatggagg ttccttcggg aacaaaacca tctggggcgg aaacgagtgg    180
gttgatgatt ccccaacccg  aagtgatatc gaaaaaaggg acaaggaaat cacagcgtac    240
aaaaacacgc tcagcgcgca  gcagaaagag aatgagaata agcgtactga agccggaaaa    300
cgcctctctg cggcgattge  tgcaagggaa aaagatgaaa acacactgaa aacactccgt    360
gccggaaacg cagatgccgc  tgatattaca cgacaggagt tcagactcct gcaggcagag    420
ctgagagaat acggattccg  tactgaaatc gccggatatg acgccctccg gctgcataca    480
gagagccgga tgctgtttgc  tgatgctgat tctcttcgta tatctccccg ggaggccagg    540
tcgttaatcg aacaggctga  aaaacggcag aaggatgcgc agaacgcaga caagaaggcc    600
gctgatatgc ttgctgaata  cgagcgcaga aaaggtattc tggacacccg gttgtcagag    660
ctggaaaaaa atggcggggc  agcccttgcc gttcttgatg cacaacaggc ccgtctgctc    720
gggcagcaga cacggaatga  cagggccatt tcagaggccc ggaataaact cagttcagtg    780
acggaatcgc ttaacacggc  ccgtaatgca ttaaccagag ctgaacaaca gctgacgcaa    840
cagaaaaaca cgcctgacgg  caaaacgata gtttcccctg aaaaattccc ggggcgttca    900
tcaacaaatc attctattgt  tgtgagcggt gatccgagat ttgccggtac gataaaaatc    960
acaaccagcg cagtcatcga  taaccgtgca aacctgaatt atcttctgag ccattccggt    1020
ctggactata aacgcaatat  tctgaatgac cggaatccgg tggtgacaga ggatgtggaa    1080
ggtgacaaga aaatttataa tgctgaagtt gctgaatggg ataagttacg gcaaagattg    1140
cttgatgcca gaaataaaat cacctctgct gaatctgcgg taaattcggc gagaaataac    1200
ctcagtgcca gaacaaatga gcaaaagcat gcaaatgacg ctcttaatgc cctgttgaag    1260
gaaaaagaga atatacgtaa ccagctttcc ggcatcaatc agaagatagc ggaagagaaa    1320
agaaaacagg atgaactgaa ggcaacgaaa gacgcaatta atttcacaac agagttcctg    1380
aaatcagttt cagaaaaata tggtgcaaaa gctgagcagt tagccagaga gatggccggg    1440
caggctaaag ggaagaaaat acgtaatgtt gaagaggcat taaaaacgta tgaaaagtac    1500
cgggctgaca ttaacaaaaa aattaatgca aaagatcgtg cagcgattgc cgcagccctt    1560
gagtctgtga agctgtctga tatatcgtct aatctgaaca gattcagtcg gggactggga    1620
tatgcaggaa aatttacaag tcttgctgac tggatcactg agtttggtaa ggctgtccgg    1680
acagagaact ggcgtcctct ttttgttaaa acagaaacca tcatagcagg caatgccgca    1740
acggctcttg tggcactggt cttcagtatt cttaccggaa gcgctttagg cattatcggg    1800
tatggtttac tgatggctgt caccggtgcg ctgattgatg aatcgcttgt ggaaaaagcg    1860
aataagttct ggggtatt                                                  1878
<210>2
<211>84
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>CDS
<222>(1).....(84)
<223>编码引导多肽序列1
<400>2
tccttcggta tgcattgggt gcgtcaggcc cccgagaaag gtctggagtg ggtggccggt    60
cagggttact cctaccccta cacc                                           84
<210>3
<211>28
<212>PRT
<213>人工序列
<223>编码引导多肽氨基酸序列1
<400>3
Ser Phe Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val
 1               5                  10                  15
Ala Gly Gln Gly Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr
    20                  25
<210>4
<211>87
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>CDS
<222>(1).....(87)
<223>编码引导多肽序列2
<400>4
tccttcggta tgcattgggt gcgtcaggcc cccgagaaag gtctggagtg ggtggcctgg    60
ggtaattacc cccattacgc catggat                                        87
<210>5
<211>29
<212>PRT
<213>人工序列
<223>编码引导多肽氨基酸序列2
<400>5
Ser Phe Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu
 1               5                   10                 15
Glu Trp Val Ala Trp Gly Asn Tyr Pro His Tyr Ala  Met Asp
                 20                  25
<210>6
<211>1962
<212>DNA
<222>(1).....(1962)
<213>人工序列
<223>编码抗EB病毒所致肿瘤多肽1基因
<400>6
atgtctgacc ctgtacgtat tacaaatccc ggtgcagaat cgctggggta tgattcagat    60
ggccatgaaa ttatggccgt tgatatttat gtaaaccctc cacgtgtcga tgtctttcat    120
ggtaccccgc ctgcatggag ttccttcggg aacaaaacca tctggggcgg aaacgagtgg    180
gttgatgatt ccccaacccg aagtgatatc gaaaaaaggg acaaggaaat cacagcgtac    240
aaaaacacgc tcagcgcgca gcagaaagag aatgagaata agcgtactga agccggaaaa    300
cgcctctctg cggcgattgc tgcaagggaa aaagatgaaa acacactgaa aacactccgt    360
gccggaaacg cagatgccgc tgatattaca cgacaggagt tcagactcct gcaggcagag    420
ctgagagaat acggattccg tactgaaatc gccggatatg acgccctccg gctgcataca    480
gagagccgga tgctgtttgc tgatgctgat tctcttcgta tatctccccg ggaggccagg    540
tcgttaatcg aacaggctga aaaacggcag aaggatgcgc agaacgcaga caagaaggcc    600
gctgatatgc ttgctgaata cgagcgcaga aaaggtattc tggacacccg gttgtcagag    660
ctggaaaaaa atggcggggc agcccttgcc gttcttgatg cacaacaggc ccgtctgctc    720
gggcagcaga cacggaatga cagggccatt tcagaggccc ggaataaact cagttcagtg    780
acggaatcgc ttaacacggc ccgtaatgca ttaaccagag ctgaacaaca gctgacgcaa    840
cagaaaaaca cgcctgacgg caaaacgata gtttcccctg aaaaattccc ggggcgttca    900
tcaacaaatc attctattgt tgtgagcggt gatccgagat ttgccggtac gataaaaatc    960
acaaccagcg cagtcatcga taaccgtgca aacctgaatt atcttctgag ccattccggt    1020
ctggactata aacgcaatat tctgaatgac cggaatccgg tggtgacaga ggatgtggaa    1080
ggtgacaaga aaatttataa tgctgaagtt gctgaatggg ataagttacg gcaaagattg    1140
cttgatgcca gaaataaaat cacctctgct gaatctgcgg taaattcggc gagaaataac    1200
ctcagtgcca gaacaaatga gcaaaagcat gcaaatgacg ctcttaatgc cctgttgaag    1260
gaaaaagaga atatacgtaa ccagctttcc ggcatcaatc agaagatagc ggaagagaaa    1320
agaaaacagg atgaactgaa ggcaacgaaa gacgcaatta atttcacaac agagttcctg    1380
aaatcagttt cagaaaaata tggtgcaaaa gctgagcagt tagccagaga gatggccggg    1440
caggctaaag ggaagaaaat acgtaatgtt gaagaggcat taaaaacgta tgaaaagtac    1500
cgggctgaca ttaacaaaaa aattaatgca aaagatcgtg cagcgattgc cgcagccctt    1560
gagtctgtga agctgtctga tatatcgtct aatctgaaca gattcagtcg gggactggga    1620
tatgcaggaa aatttacaag tcttgctgac tggatcactg agtttggtaa ggctgtccgg    1680
acagagaact ggcgtcctct ttttgttaaa acagaaacca tcatagcagg caatgccgca    1740
acggctcttg tggcactggt cttcagtatt cttaccggaa gcgctttagg cattatcggg    1800
tatggtttac tgatggctgt caccggtgcg ctgattgatg aatcgcttgt ggaaaaagcg    1860
aataagttct ggggtatttc cttcggtatg cattgggtgc gtcaggcccc cgagaaaggt    1920
ctggagtggg tggccggtca gggttactcc tacccctaca cc                       1962
<210>7
<211>653
<212>PRT
<213>人工序列
<223>抗EB病毒所致肿瘤多肽1氨基酸序列
<400>7
Ser Asp Pro Val Arg Ile Thr Asn Pro Gly Ala Glu Ser Leu Gly Tyr
                5                   10                  15
Asp Ser Asp Gly His Glu Ile Met Ala Val Asp Ile Tyr Val Asn Pro
            20                  25                  30
Pro Arg Val Asp Val Phe His Gly Thr Pro Pro Ala Trp Ser Ser Phe
        35                  40                  45
Gly Asn Lys Thr Ile Trp Gly Gly Asn Glu Trp Val Asp Asp Ser Pro
    50                  55                  60
Thr Arg Ser Asp Ile Glu Lys Arg Asp Lys Glu Ile Thr Ala Tyr Lys
65                  70                  75                  80
Asn Thr Leu Ser Ala Gln Gln Lys Glu Asn Glu Asn Lys Arg Thr Glu
                85                  90                  95
Ala Gly Lys Arg Leu Ser Ala Ala Ile Ala Ala Arg Glu Lys Asp Glu
            100                 105                 110
Asn Thr Leu Lys Thr Leu Arg Ala Gly Asn Ala Asp Ala Ala Asp Ile
        115                 120                 125
Thr Arg Gln Glu Phe Arg Leu Leu Gln Ala Glu Leu Arg Glu Tyr Gly
     130                 135                 140
Phe Arg Thr Glu Ile Ala Gly Tyr Asp Ala Leu Arg Leu His Thr Glu
145                 150                 155                 160
Ser Arg Met Leu Phe Ala Asp Ala Asp Ser Leu Arg Ile Ser Pro Arg
                165                 170                 175
Glu Ala Arg Ser Leu Ile Glu Gln Ala Glu Lys Arg Gln Lys Asp Ala
            180                 185                 190
Gln Asn Ala Asp Lys Lys Ala Ala Asp Met Leu Ala Glu Tyr Glu Arg
        195                 200                 205
Arg Lys Gly Ile Leu Asp Thr Arg Leu Ser Glu Leu Glu Lys Asn Gly
    210                 215                 220
Gly Ala Ala Leu Ala Val Leu Asp Ala Gln Gln Ala Arg Leu Leu Gly
225                 230                 235                 240
Gln Gln Thr Arg Asn Asp Arg Ala Ile Ser Glu Ala Arg Asn Lys Leu
                245                 250                 255
Ser Ser Val Thr Glu Ser Leu Asn Thr Ala Arg Asn Ala Leu Thr Arg
            260                 265                 270
Ala Glu Gln Gln Leu Thr Gln Gln Lys Asn Thr Pro Asp Gly Lys Thr
        275                 280                 285
Ile Val Ser Pro Glu Lys Phe Pro Gly Arg Ser Ser Thr Asn His Ser
    290                 295                 300
Ile Val Val Ser Gly Asp Pro Arg Phe Ala Gly Thr Ile Lys Ile Thr
305                 310                 315                 320
Thr Ser Ala Val Ile Asp Asn Arg Ala Asn Leu Asn Tyr Leu Leu Ser
                325                 330                 335
His Ser Gly Leu Asp Tyr Lys Arg Asn Ile Leu Asn Asp Arg Asn Pro
            340                 345                 350
Val Val Thr Glu Asp Val Glu Gly Asp Lys Lys Ile Tyr Asn Ala Glu
        355                 360                 365
Val Ala Glu Trp Asp Lys Leu Arg Gln Arg Leu Leu Asp Ala Arg Asn
    370                 375                 380
Lys Ile Thr Ser Ala Glu Ser Ala Val Asn Ser Ala Arg Asn Asn Leu
385                 390                 395                 400
Ser Ala Arg Thr Asn Glu Gln Lys His Ala Asn Asp Ala Leu Asn Ala
                405                 410                 415
Leu Leu Lys Glu Lys Glu Asn Ile Arg Asn Gln Leu Ser Gly Ile Asn
            420                 425                 430
Gln Lys Ile Ala Glu Glu Lys Arg Lys Gln Asp Glu Leu Lys Ala Thr
        435                 440                 445
Lys Asp Ala Ile Asn Phe Thr Thr Glu Phe Leu Lys Ser Val Ser Glu
    450                 455                 460
Lys Tyr Gly Ala Lys Ala Glu Gln Leu Ala Arg Glu Met Ala Gly Gln
465                 470                 475                 480
Ala Lys Gly Lys Lys Ile Arg Asn Val Glu Glu Ala Leu Lys Thr Tyr
                485                 490                 495
Glu Lys Tyr Arg Ala Asp Ile Asn Lys Lys Ile Asn Ala Lys Asp Arg
            500                 505                 510
Ala Ala Ile Ala Ala Ala Leu Glu Ser Val Lys Leu Ser Asp Ile Ser
        515                 520                 525
Ser Asn Leu Asn Arg Phe Ser Arg Gly Leu Gly Tyr Ala Gly Lys Phe
    530                 535                 540
Thr Ser Leu Ala Asp Trp Ile Thr Glu Phe Gly Lys Ala Val Arg Thr
545                 550                 555                 560
Glu Asn Trp Arg Pro Leu Phe Val Lys Thr Glu Thr Ile Ile Ala Gly
                565                 570                 575
Asn Ala Ala Thr Ala Lue Val Ala Leu Val Phe Ser Ile Leu Thr Gly
            580                 585                 590
Ser Ala Leu Gly Ile Ile Gly Tyr Gly Leu Leu Met Ala Val Thr Gly
        595                 600                 605
Ala Leu Ilu Asp Glu Ser Leu Val Glu Lys Ala Asn Lys Phe Trp Gly
    610                 615                 620
Ile Ser Phe Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu
625                 630                 635                 640
Glu Trp Val Ala Gly Gln Gly Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr
                645                 650
<210>8
<211>1965
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<222>(1).....(1965)
<223>编码抗EB病毒所致肿瘤多肽2基因
<400>8
<400>1
atgtctgacc ctgtacgtat tacaaatccc ggtgcagaat cgctggggta tgattcagat    60
ggccatgaaa ttatggccgt tgatatttat gtaaaccctc cacgtgtcga tgtctttcat    120
ggtaccccgc ctgcatggag ttccttcggg aacaaaacca tctggggcgg aaacgagtgg    180
gttgatgatt ccccaacccg aagtgatatc gaaaaaaggg acaaggaaat cacagcgtac    240
aaaaacacgc tcagcgcgca gcagaaagag aatgagaata agcgtactga agccggaaaa    300
cgcctctctg cggcgattgc tgcaagggaa aaagatgaaa acacactgaa aacactccgt    360
gccggaaacg cagatgccgc tgatattaca cgacaggagt tcagactcct gcaggcagag    420
ctgagagaat acggattccg tactgaaatc gccggatatg acgccctccg gctgcataca    480
gagagccgga tgctgtttgc tgatgctgat tctcttcgta tatctccccg ggaggccagg    540
tcgttaatcg aacaggctga aaaacggcag aaggatgcgc agaacgcaga caagaaggcc    600
gctgatatgc ttgctgaata cgagcgcaga aaaggtattc tggacacccg gttgtcagag    660
ctggaaaaaa atggcggggc agcccttgcc gttcttgatg cacaacaggc ccgtctgctc    720
gggcagcaga cacggaatga cagggccatt tcagaggccc ggaataaact cagttcagtg    780
acggaatcgc ttaacacggc ccgtaatgca ttaaccagag ctgaacaaca gctgacgcaa    840
cagaaaaaca cgcctgacgg caaaacgata gtttcccctg aaaaattccc ggggcgttca    900
tcaacaaatc attctattgt tgtgagcggt gatccgagat ttgccggtac gataaaaatc    960
acaaccagcg cagtcatcga taaccgtgca aacctgaatt atcttctgag ccattccggt    1020
ctggactata aacgcaatat tctgaatgac cggaatccgg tggtgacaga ggatgtggaa    1080
ggtgacaaga aaatttataa tgctgaagtt gctgaatggg ataagttacg gcaaagattg    1140
cttgatgcca gaaataaaat cacctctgct gaatctgcgg taaattcggc gagaaataac    1200
ctcagtgcca gaacaaatga gcaaaagcat gcaaatgacg ctcttaatgc cctgttgaag    1260
gaaaaagaga atatacgtaa ccagctttcc ggcatcaatc agaagatagc ggaagagaaa    1320
agaaaacagg atgaactgaa ggcaacgaaa gacgcaatta atttcacaac agagttcctg    1380
aaatcagttt cagaaaaata tggtgcaaaa gctgagcagt tagccagaga gatggccggg    1440
caggctaaag ggaagaaaat acgtaatgtt gaagaggcat taaaaacgta tgaaaagtac    1500
cgggctgaca ttaacaaaaa aattaatgca aaagatcgtg cagcgattgc cgcagccctt    1560
gagtctgtga agctgtctga tatatcgtct aatctgaaca gattcagtcg gggactggga    1620
tatgcaggaa aatttacaag tcttgctgac tggatcactg agtttggtaa ggctgtccgg    1680
acagagaact ggcgtcctct ttttgttaaa acagaaacca tcatagcagg caatgccgca    1740
acggctcttg tggcactggt cttcagtatt cttaccggaa gcgctttagg cattatcggg    1800
tatggtttac tgatggctgt caccggtgcg ctgattgatg aatcgcttgt ggaaaaagcg    1860
aataagttct ggggtatttc cttcggtatg cattgggtgc gtcaggcccc cgagaaaggt    1920
ctggagtggg tggcctgggg taattacccc cattacgcca tggat                    1965
<210>9
<211>654
<212>PRT
<213>人工序列
<223>抗EB病毒所致肿瘤多肽2氨基酸序列
<400>9
Ser Asp Pro Val Arg Ile Thr Asn Pro Gly Ala Glu Ser Leu Gly Tyr
                  5                  10                  15
Asp Ser Asp Gly His Glu Ile Met Ala Val Asp Ile Tyr Val Asn Pro
             20                  25                  30
Pro Arg Val Asp Val Phe His Gly Thr Pro Pro Ala Trp Ser Ser Phe
         35                  40                  45
Gly Asn Lys Thr Ile Trp Gly Gly Asn Glu Trp Val Asp Asp Ser Pro
     50                  55                  60
Thr Arg Ser Asp Ile Glu Lys Arg Asp Lys Glu Ile Thr Ala Tyr Lys
 65                  70                  75                  80
Asn Thr Leu Ser Ala Gln Gln Lys Glu Asn Glu Asn Lys Arg Thr Glu
                 85                  90                  95
Ala Gly Lys Arg Leu Ser Ala Ala Ile Ala Ala Arg Glu Lys Asp Glu
            100                 105                 110
Asn Thr Leu Lys Thr Leu Arg Ala Gly Asn Ala Asp Ala Ala Asp Ile
        115                 120                 125
Thr Arg Gln Glu Phe Arg Leu Leu Gln Ala Glu Leu Arg Glu Tyr Gly
    130                 135                 140
Phe Arg Thr Glu Ile Ala Gly Tyr Asp Ala Leu Arg Leu His Thr Glu
145                 150                 155                 160
Ser Arg Met Leu Phe Ala Asp Ala Asp Ser Leu Arg Ile Ser Pro Arg
                165                 170                 175
Glu Ala Arg Ser Leu Ile Glu Gln Ala Glu Lys Arg Gln Lys Asp Ala
            180                 185                 190
Gln Asn Ala Asp Lys Lys Ala Ala Asp Met Leu Ala Glu Tyr Glu Arg
        195                 200                 205
Arg Lys Gly Ile Leu Asp Thr Arg Leu Ser Glu Leu Glu Lys Asn Gly
    210                 215                 220
Gly Ala Ala Leu Ala Val Leu Asp Ala Gln Gln Ala Arg Leu Leu Gly
225                 230                 235                 240
Gln Gln Thr Arg Asn Asp Arg Ala Ile Ser Glu Ala Arg Asn Lys Leu
                245                 250                 255
Ser Ser Val Thr Glu Ser Leu Asn Thr Ala Arg Asn Ala Leu Thr Arg
            260                 265                 270
Ala Glu Gln Gln Leu Thr Gln Gln Lys Asn Thr Pro Asp Gly Lys Thr
        275                 280                 285
Ile Val Ser Pro Glu Lys Phe Pro Gly Arg Ser Ser Thr Asn His Ser
    290                 295                 300
Ile Val Val Ser Gly Asp Pro Arg Phe Ala Gly Thr Ile Lys Ile Thr
305                 310                 315                 320
Thr Ser Ala Val Ile Asp Asn Arg Ala Asn Leu Asn Tyr Leu Leu Ser
                325                 330                 335
His Ser Gly Leu Asp Tyr Lys Arg Asn Ile Leu Asn Asp Arg Asn Pro
            340                 345                 350
Val Val Thr Glu Asp Val Glu Gly Asp Lys Lys Ile Tyr Asn Ala Glu
        355                 360                 365
Val Ala Glu Trp Asp Lys Leu Arg Gln Arg Leu Leu Asp Ala Arg Asn
    370                 375                 380
Lys Ile Thr Ser Ala Glu Ser Ala Val Asn Ser Ala Arg Asn Asn Leu
385                 390                 395                 400
Ser Ala Arg Thr Asn Glu Gln Lys His Ala Asn Asp Ala Leu Asn Ala
                405                 410                 415
Leu Leu Lys Glu Lys Glu Asn Ile Arg Asn Gln Leu Ser Gly Ile Asn
            420                 425                 430
Gln Lys Ile Ala Glu Glu Lys Arg Lys Gln Asp Glu Leu Lys Ala Thr
        435                 440                 445
Lys Asp Ala Ile Asn Phe Thr Thr Glu Phe Leu Lys Ser Val Ser Glu
    450                 455                 460
Lys Tyr Gly Ala Lys Ala Glu Gln Leu Ala Arg Glu Met Ala Gly Gln
465                 470                 475                 480
Ala Lys Gly Lys Lys Ile Arg Asn Val Glu Glu Ala Leu Lys Thr Tyr
                485                 490                 495
Glu Lys Tyr Arg Ala Asp Ile Asn Lys Lys Ile Asn Ala Lys Asp Arg
            500                 505                 510
Ala Ala Ile Ala Ala Ala Leu Glu Ser Val Lys Leu Ser Asp Ile Ser
        515                 520                 525
Ser Asn Leu Asn Arg Phe Ser Arg Gly Leu Gly Tyr Ala Gly Lys Phe
    530                 535                 540
Thr Ser Leu Ala Asp Trp Ile Thr Glu Phe Gly Lys Ala Val Arg Thr
545                 550                 555                 560
Glu Asn Trp Arg Pro Leu Phe Val Lys Thr Glu Thr Ile Ile Ala Gly
                565                 570                 575
Asn Ala Ala Thr Ala Lue Val Ala Leu Val Phe Ser Ile Leu Thr Gly
            580                 585                 590
Ser Ala Leu Gly Ile Ile Gly Tyr Gly Leu Leu Met Ala Val Thr Gly
        595                 600                 605
Ala Leu Ilu Asp Glu Ser Leu Val Glu Lys Ala Asn Lys Phe Trp Gly
    610                 615                 620
Ile Ser Phe Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu
625                 630                 635                 640
Glu Trp Val Ala Trp Gly Asn Tyr Pro His Tyr Ala Met Asp
                645                 650

Claims (9)

1、一种编码抗EB病毒所致肿瘤多肽的基因，其特征在于其含有编码可形成离子通道的大肠菌素的基因，以及编码以ATCC HB-168杂交瘤细胞的抗EB病毒包膜糖蛋白抗体重链CDR1区、CDR3区，CDR1-CDR2连接段或重链CDR1区，CDR1-CDR2连接段和轻链CDR3区的基因构建的诱导多肽的基因。
2、根据权利要求1所述的抗EB病毒所致肿瘤多肽的基因，其特征在于它具有序列表中SEQ ID NO.6所述的核苷酸序列。
3、根据权利要求1所述的抗EB病毒所致肿瘤多肽的基因，其特征在于它具有序列表中SEQ ID NO.8所述的核苷酸序列。
4、一种抗EB病毒所致肿瘤多肽的重组质粒，其特征在于它含有权利要求1所述的基因。
5、一种抗EB病毒所致肿瘤多肽，其特征在于它由权利要求4所述的重组质粒表达而成。
6、根据权利要求5所述的抗EB病毒所致肿瘤多肽，其特征在于它具有序列表中SEQID NO.7所述的氨基酸序列。
7、根据权利要求5所述的抗EB病毒所致肿瘤多肽，其特征在于它具有序列表中SEQID NO.9所述的氨基酸序列。
8、权利要求5或6或7所述多肽在制备治疗或预防EB病毒所致肿瘤的药中的应用。
9、一种权利要求5或6或7所述多肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
将以ATCC HB-168杂交瘤细胞的抗EB病毒包膜糖蛋白抗体重链CDR1区、CDR3区，CDR1-CDR2连接段或重链CDR1区，CDR1-CDR2连接段和轻链CDR3区的基因构建的诱导多肽的基因与编码可形成离子通道的大肠菌素的基因可操作地连接获得编码抗EB病毒所致肿瘤多肽的基因，将获得的基因导入到表达系统中进行表达，分离表达的多肽而获得抗EB病毒所致肿瘤多肽。
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