CN1867319A - 包含生理活性物质的乳化溶液及其制备方法和给药方法 - Google Patents
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Abstract
本发明是关于一种利用脂肪球吸收作用给予动物口服药品的技术，所述脂肪球吸收作用通过本发明的发明人发表的报道而新近知名。本发明提供了一种制备包含生理活性物质的乳剂的方法，以有效利用特定动物消化道内的脂肪球吸收作用，还提供了使用该方法制备的包含生理活性物质的乳剂，因而提供了一种口服药物输送方法，由此包括免疫激活剂和药理活性物质在内的所述生理活性物质能通过简单的方法非常高效地被动物吸收。
Description
技术领域
本发明是关于一种利用脂肪球吸收作用(oil globule absorption action)给予动物口服药品的技术，所述脂肪球吸收作用通过本发明的发明人发表的报道而新近知名。更具体地，本发明是关于一种包含生理活性物质(physiologically active material)的新型乳剂及其制备方法和给药方法，开发该乳剂以适合特定动物消化道中脂肪球吸收作用的有效利用。
背景技术
从古至今，为了预防哺乳动物如人、兔、鼠及家畜的特定疾病，有时建议给予对抗有关疾病的疫苗或免疫激活剂(immune activator)的方法。近来，除给予水产养殖动物疫苗和具有药理作用的物质外，越来越多预防/治疗所述疾病的试验还通过给予多种生理活性物质进行。
传统上对除人以外的哺乳动物进行的血管注射(静脉内注射)为一种给药方法，使用该给药方法在理论上能预期到极好的效果，但是存在使有机体遭受一定程度外科入侵应激反应(surgical invasion stress)的缺点；此外上述的方法不容易对鱼类、甲壳类和贝类动物应用。
结果口服给药方法成为给予鱼类、甲壳类和贝类动物生理活性物质的主要方法。由于上述原因，设计口服制剂时，考虑到要给予的一种或多种生理活性物质及结合使用的各助剂具有不同的亲和性(亲水的或疏水的)的事实，并且同时考虑口服制剂的稳定性，目前已研究多种乳剂制剂形式。
例如日本特开平11-255664公开了一项技术，其中分子量低于10000的肽聚糖(peptidoglycan)作为口服给药免疫增强剂的有效成分，以肽聚糖本身或添加了肽聚糖的饲料的形式，给予哺乳动物、鱼类和甲壳类动物(特别是黑虎虾(Black Tiger shrimp))。
此外，日本特开平8-504811公开了一种生理可接受的药物输送乳剂，该乳剂包括含氟化合物(特别是全氟化碳(perfluorocarbon)如全氟萘烷(perfluorodecalin))和水包油(oil in water)的乳化粒子、表面活性剂和溶解在该乳剂中的药物。
更确切地说，从上述两种专利文献中可得出一种乳剂系统，其中至多30重量％的液态脂肪油如甘油三酯作为基质，至多75重量％的氟代化合物和至多20重量％的药物溶液通过表面活性剂的作用进行分散。
同时，日本特开平7-53404公开了一种亲脂-亲水混合物，其中抗原物质和一种佐剂呈亲脂性，并且另外一种佐剂侧(side)呈亲水性。特别地，在油包水乳剂中，分散体(水滴，30重量％)通过含有在分散介质中的乳化剂(油的70重量％)作为基质，包含所述抗原物质和佐剂。
然而，口服给予生理活性物质时，以前已经认识到的常规问题为所述生理活性物质的给药功效不能得到充分表现。例如，从上述日本特开平11-255664可以看出，该专利指出生理活性物质的口服给药不能在鱼类中发挥充分功效。这是因为，虽然所述原因没有得到充分阐明，但是当用与血管注射不同的口服给药时，可能由于所述材料通过消化道吸收，因此认为与生理活性材料在吸收前被消化，或者不能在消化道里得到充分吸收有关。也就是说，一般意义上讲，油(脂肪)被降解成脂肪酸和甘油，并在动物消化道内以分子水平被吸收。
然而，本发明的发明人在鱼类等的消化道中发现了一种令人惊奇的脂肪球吸收作用，即非常细小的脂肪球被体内肠道上皮细胞以其本身形式被吸收，并且公开于Miyazaki等人题为《Histological study on egg yolk absorptionand nutrient intake in a digestive tract of Fry and Juvenile Pagrus major or Girellapunctata》的论文中，the First Report I，15-27页(1998)，Faculty ofBioresources，Mie University，Japan。此外还发现新的事实：同样类型的脂肪球吸收作用也出现在某些哺乳动物中。
发明内容
因此本发明的发明人基于如下想法做出了本发明：利用所述脂肪球吸收作用可能使构建口服药物输送方式成为可能，由此疫苗、免疫激活剂和药理活性物质可以被动物以一种简单化的方式非常高效地吸收。
其中，所述想法具有两个基本必要条件：其一，应用的对象应当限于在其消化道中证实有脂肪球吸收作用的动物；其二，口服给予相关动物的细小脂肪球应当具有预先确定的粒子直径，以使脂肪球吸收作用能够发生。包括上述日本专利公开的现有技术都没有公开和考虑所述必要条件。
此外，即使本发明发明人的上述日本文献报道了脂肪球吸收作用，也没有提及脂肪球吸收作用可用于口服药物输送方式，并且没有明确的实现方法。
根据本发明的第一个方面，提供了一种包含生理活性物质的水包油乳剂，其中，
细脂肪球作为动物消化道中脂肪球吸收作用靶标分散在所述乳剂中；
所述生理活性物质包含在其中分散有细脂肪球的乳剂的油滴中；并且
所述生理活性物质通过细脂肪球中存在的油溶性乳化剂的作用，以其本身或与少量水一起的非常细的分散相形式包埋于油相中。
根据本发明的第二个方面，提供了一种包含生理活性物质的水包油乳剂，其中，
细脂肪球作为动物消化道中脂肪球吸收作用靶标分散在乳剂中；
所述生理活性物质包含在其中分散有细脂肪球的乳剂的油滴中；并且
所述生理活性物质亲脂性地溶解或悬浮于细脂肪球中。
根据本发明的第三个方面，提供了一种包含生理活性物质的水包油乳剂，其中，
细脂肪球作为动物消化道内脂肪球吸收作用靶标分散在所述乳剂中；
所述生理活性物质包含在其中分散有细脂肪球的乳剂的油滴中；并且
所述生理活性物质以封入细脂肪球内的形式存在，所述细脂肪球具有由脂质双分子层形成的胶团结构。
根据本发明的第四个方面，提供了一种包含生理活性物质的乳剂的制备方法，该方法包括：
将生理活性物质、生理活性物质的水溶液或生理活性物质的水悬浮液与添加有油溶性乳化剂的乳剂混合并乳化，以制备油性乳化相；并且
将所述油性乳化相与加入到其中的含有水溶性乳化剂的水混合并乳化，以制备水包油乳剂，在该乳剂中油性乳化相在水中分散成作为动物消化道中脂肪球吸收作用靶标的细脂肪球。
根据本发明的第五个方面，提供了一种给予包含生理活性物质的乳剂的方法，该方法包括：
给动物口服包含生理活性物质并且其中分散有细脂肪球的乳剂，
其中制备所述细脂肪球，以便乳剂的油滴中包含生理活性物质，并且与此同时，所述细脂肪球成为动物消化道中脂肪球吸收作用的靶标。
根据本发明的第六个方面，提供了一种给予包含生理活性物质的乳剂的方法，该方法包括：
将包含生理活性物质并且其中分散有细脂肪球的乳剂含浸到饲料或饲料颗粒中；并且
使动物摄取所述含浸的物质，
其中，制备所述细脂肪球，以便乳剂的油滴中包含生理活性物质，并且与此同时，所述细脂肪球成为动物消化道中脂肪球吸收作用的靶标。
具体实施方式
现在描述完成本发明第一至第六方面的具体实施方式，包括最佳方式。
包含生理活性物质的乳剂
根据本发明第一至第三个方面，与所述包含生理活性物质的乳剂有关，在水包油乳剂中分散有平均直径适合于动物消化道内脂肪球吸收作用的细脂肪球，所述生理活性物质通过油溶性乳化剂作用，以其本身或与少量水一起的非常细的分散相形式在各细脂肪球中包埋于油相中。
在细脂肪球中，非常细的生理活性物质(或生理活性物质和少量水之间)分散相以将油溶性乳化剂保持与分散体的界面上的状态稳定地分散在作为分散体的脂肪球油相中。并且，各细脂肪球稳定分散于作为分散体的水中，同时将水溶性乳化剂保持在与分散体(水)的界面上。
由于所述包含生理活性物质的乳剂为水包油型，细脂肪球作为油滴的分散状态稳定，并且由于细脂肪球的平均粒子直径适合作为动物消化道内脂肪球吸收作用的靶标，因而可以利用感兴趣动物消化道内的脂肪球吸收作用，并且可以在动物体内高效摄入。此外，通过油溶性乳化剂在细脂肪球中的作用，生理活性物质本身或者与少量水一起形成非常细的分散相，这样被包埋到油相中。因此对于动物肠道内的脂肪酶接受作用(receiving action)，虽然部分细脂肪球表面被消化，但是与胶团结构不同，细脂肪球的粒子结构仍然维持没有瓦解，因此有利于通过肠上皮细胞吸收。另外，由于生理活性物质通过油溶性乳化剂的作用分散于油中，因此不管它们的亲和性(亲水性或亲脂性)如何，它们能以非常细微的分散状态包埋在脂肪球中，此外很容易制备具有预先确定的细平均粒子直径的脂肪球。
更具体地，可以使用任何生理活性物质，只要它们的亲和性为水溶性、亲水性、油溶性和亲脂性。优选作为上位概念分类，生理活性物质可以是选自疫苗、免疫激活剂、营养物质、药理活性物质、天然色素和矿物所组成的组中的至少一种。例如，所述物质可以得自疫苗例如病原病毒、或者细菌或寄生虫的粉碎物质，以及免疫激活剂如葡聚糖、岩藻依聚糖(fucoidan)和脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)。此外还可能应用生理活性多肽例如抗体，营养物质如维生素，或药理活性物质如抗生素、激素和干扰素。为了赋予感兴趣的动物所需的颜色，还可能利用天然色素或矿物如有机或无机的钙、铁和镁。
同时，在包含生理活性物质的乳剂中所含的细脂肪球的特征在于，所述生理活性物质通过油溶性乳化剂的作用，在细脂肪球中形成非常细的分散相(即被包埋在油相中)。同样，由于生理活性物质本身或与少量水一起分散得非常精细，生理活性物质在细分散相中的浓度即使不是100％，也非常高，并且因此药物的崩解效果也显著增强。
基于上述特征的比较，(1)的结构为本发明的发明人创造的粒子结构，用于有效实现第一发明，并且其详细的描述在第七发明中讨论，但是甚至动物肠脂肪酶不能瓦解细脂肪球的粒子结构，并且，进一步地，不管它们的亲和性如何，生理活性物质可能非常细地分散在脂肪球中。
同时，虽然适合于脂肪球吸收作用的细脂肪球的平均粒子直径不能相对于感兴趣动物的种类而统一确定，但是优选在1-60微米范围内，更优选1-20微米。也不可能明确限定脂肪球的粒度分布(各种细脂肪球的粒子直径等级)，但是在上述平均粒子直径范围内，粒度分布越窄越理想。
此外，如果细脂肪球在适合脂肪球吸收作用范围内，无需限定具体的粒子结构，但是下列三种粒子结构可以更理想地举例说明：
(1)生理活性物质本身或与少量水一起通过油溶性乳化剂，在细脂肪球中形成非常细的分散相；
(2)亲脂性生理活性物质溶解或悬浮于细脂肪球中；
(3)细脂肪球具有由脂质双分子层形成的胶团结构，并且将生理活性物质置于其内部。
三者之中，第二种结构通过在乳剂中溶解或精细悬浮生理活性物质并通过使用所得的乳剂和水(优选再使用乳化剂)制得，组成水包油乳剂。
第三种结构是由脂质双分子层在水中形成的胶团结构构造(生理活性物质的水溶液置于胶团结构内)。制备第二种和第三种粒子结构，或制备具有所述粒子结构分散其中的包含细脂肪球的乳剂可以用选自己知或公知的适合方法很容易地完成。
虽然没有限制作为脂肪球吸收作用靶标的脂肪球的种类或粒子结构，但是例如结构(1)至(3)有代表性的举例说明了能够预期的脂肪球分散稳定性。根据粒子结构(1)至(3)的相对评价，第三种结构具有一般称为核糖体的囊泡粒子结构，但是当限定的膜(脂质双分子层)通过动物消化道的脂肪酶的作用瓦解时，存在所述结构不能维持脂肪球结构和脂肪球吸收作用不能被应用的缺点。在第二种结构的情况下，由于它是脂肪球(油球)，所述脂肪球结构不容易被脂肪酶作用瓦解，但是缺点在于除了油溶性生理活性物质溶解在脂肪球中的情况，该结构通常很难精细地将生理活性物质分散在脂肪球中，此外很难构建具有预先确定的平均粒子直径的细脂肪球。
现在，在能够提供所述生理活性物质的高浓度或精细分散状态的包含生理活性物质的乳剂之中，制备第一种粒子结构的方法将得到详细描述。
制备包含生理活性物质的乳剂的方法主要包括第一乳化步骤和第二乳化步骤，假设除第一和第二步骤外可以加入任何可选择的预处理步骤、中间步骤或后处理(post-treatment)步骤。
在第一乳化步骤中，将生理活性物质、生理活性物质的水溶液或生理活性物质的水性悬浮液与添加有油溶性乳化剂的乳剂混合并乳化，以制备包埋到油相中的油性乳化相。即根据第一乳化步骤，制备所述油性乳化相，其中生理活性物质以其本身或与少量水一起的非常细的分散相形式包埋于油相。
同时，当所述生理活性物质用作其水溶液或水性悬浮液时，在第一乳化步骤中，优选使水含量最小化(即生理活性物质的高浓度水溶液或高密度水性悬浮液)。
此外，第一乳化步骤的重要技术点在于生理活性物质及其水溶液(相a)通过与添加有油溶性乳化剂的乳剂(相b)混合而乳化。这里，相a和相b的混合比例无需统一限定，但是该比例可以在相a与相b的重量比为1∶99至99∶1的范围内任选。如果相a与相b的重量比超出上述范围或相b中不加入油溶性乳化剂，可能制备不出如上所述包埋生理活性物质的细脂肪球。这里，加入相b的油溶性乳化剂的量优选在1-5重量％范围内。
虽然对油溶性乳化剂的种类没有特别的限制，只要它们不造成与毒性和生理安全有关的问题即可，但是优选亲水亲油平衡(Hydrophilic LipophilicBalance，HLB)值小于6的油溶性乳化剂，更优选小于2的油溶性乳化剂。另外，所述乳化剂优选为非离子表面活性剂。
作为满足所述条件的优选油溶性乳化剂，可以由六甘油基亚油酸酯(hexaglyceryllinoleate)、聚氧乙烯月桂醚(polyoxyethylenelaurylether)、卵磷脂和聚氧乙烯油醚(polyoxyethyleneoleylether)制得。
在第二乳化步骤中，将在第一乳化步骤所得的油性乳化相与添加有水溶性乳化剂的水混合并乳化，以制备水包油乳剂，由此所述油性乳化相具有适合动物消化道脂肪球吸收作用靶标的平均粒子直径，并且作为细脂肪球分散在水中。
第二乳化步骤中的技术点在于添加有水溶性乳化剂的水(相d)与第一乳化步骤制备的油性乳化相(相c)混合并乳化。这里，相c和相d的混合比例无需指定，但是该比例可以在相c与相d的重量比为3∶1至1∶3的范围内任选。
如果相c与相d的重量比超出上述范围或相d中不加入水溶性乳化剂，可能制备不出涉及本发明的含有生理活性物质的乳剂。这里，加入相d的水溶性乳化剂的量优选在0.5-1.3重量％范围内。
虽然对水溶性乳化剂的种类没有特别的限制，只要它们不造成与毒性和生理安全有关的问题即可，优选亲水亲油平衡(Hydrophilic LipophilicBalance，HLB)值大于10的水溶性乳化剂，更优选大于12的水溶性乳化剂。另外，关于乳化剂类型，如上所述，优选非离子表面活性剂。作为满足所述条件的理想的水溶性乳化剂，可以由十甘油二硬脂酸酯(decaglyceryldi-stearate)、甘油异硬脂酸酯(glyceryl isostearate)、十甘油单异硬脂酸酯(decaglyceryl monoisostearate)和乙二醇单油酸酯(ethyleneglycolmonooleate)制得。
在第一和第二乳化步骤中，乳化操作可以通过使用公知的超声波处理、均质器或搅拌器完成。在乳化操作中，包含生理活性物质的乳剂中的细脂肪球粒子直径和所述生理活性物质在细脂肪球中的精细分散程度可以通过适当选择乳化方法的操作条件进行调整。
同时，如上所述，首先将所述生理活性物质或其水溶液与乳剂混合，然后向所得的乳剂中加入所述油溶性乳化剂，以形成油性乳化相，其中，通过利用公知的乳剂形成方法如超声波处理和应用均质器，生理活性物质以其本身或与少量水一起的非常精细分散相的形式包埋于油相中。
生理活性物质的给药方法
在与本发明有关的生理活性物质的给药方法中，制备细脂肪球，其中水包油乳剂中的油滴包含生理活性物质，同时细脂肪球具有适合动物消化道内脂肪球吸收作用靶标的平均粒子直径，并且将所得乳剂口服给予除人以外消化道表现脂肪球吸收作用的动物。
就此而论，假设这里用到的各种物质应当都是对实验动物无毒的或生理安全的。所述物质例如构建油滴的乳剂、用于形成乳剂的表面活性剂(用于制备上述包含生理活性物质的乳剂的油溶性乳化剂和水溶性乳化剂)或饲料小球。此外，优选使用在营养上对实验动物有益的物质。
在与本发明有关的生理活性物质的给药方法中，无需具体限定水包油乳剂的口服给药方法。例如，可以使用注射器将所述生理活性物质注射到口腔中，并且在哺乳动物情况下，溶液自身就可以被吸收。此外生理活性物质可以混入并且吸进动物饲料中。在这些方法中，更优选将生理活性物质含浸到动物饲料小球(多孔饲料小球更加理想)中并直接摄取或干燥后摄取。作为饲料小球，各种商业可供产品均可随意应用。
关于所述口服给药方法，没有由于血管注射除人以外的动物作为给药对象引起的外科入侵应激反应(surgical invasion stress)，并且因而很容易对鱼类、甲壳类和贝类动物应用。
同时，如上所述，通过满足两个必要条件，即其一，应用的对象限于在其消化道中证实有脂肪球吸收作用的动物；其二，口服给予实验动物的细脂肪球应当具有适于脂肪球吸收作用的预先确定的粒子直径，同时通过将生理活性物质即所需的药物输送材料包含在作为为水包油乳剂的油滴的细脂肪球中，包含生理活性物质的细脂肪球在口服给药的实验动物的消化道内被机体在肠上皮以其自身原有形式吸收，因此能够避免常规口服方法表现的弊端：所述生理活性物质在吸收前被消化，或者在消化道内不能充分吸收。因此，生理活性物质能以简单化的方式相当高效地被吸收到动物体内。
同时，作为用于与本发明有关的生理活性物质的给药方法的实验动物，优选在其消化道中证实有脂肪球吸收作用的动物，即水生动物或除人以外的陆生哺乳动物。
更具体地，在其消化道中证实有脂肪球吸收作用的动物例如：可能选自哺乳动物如兔、鼠、狗、猫、牛和猪，不包括人；还可以是鸟类、两栖类、爬行类、各种鱼类包括水产养殖鱼类或观赏性鱼类、贝类和水生甲壳类动物(虾、蟹)。
现在将参考下列实施例，更加详细地解释本发明。这些实施例只用于解释本发明，不应当被解释为是对本发明范围和实质的限定。
实施例1
福尔马林灭活的细菌大肠杆菌(E.coli)作为生理活性物质，处理成包含高密度死菌的水性悬浮液(一液)。同时，在乌贼(cuttlefish)肝油的情况下，加入5重量％作为油溶性乳化剂的六甘油基亚油酸酯(Oxygen Food#818R，Taiyou Chemical Industry Co.，Ltd，Japan)以制备乳液(二液)。
然后，作为第一乳化处理，将一液和二液以重量比90∶10混合，使用超声波仪进行充分的乳化处理，以形成包埋于油相的油性乳化相(三液)，其中福尔马林灭活的细菌大肠杆菌高密度悬浮液形成非常精细的分散相。
接着，向水中加入1重量％作为水溶性乳化剂的十甘油二硬脂酸酯(Oxygen Food Q-182S，Taiyou Chemical Industry Co.，Ltd，Japan)(四液)。作为第二乳化处理，将三液和四液以重量比2∶1混合，使用搅拌器充分搅拌，以制备包含生理活性物质的乳剂，其中所述油性乳化相作为细脂肪球分散于水中。
据观测，制得的包含生理活性物质的乳剂中所包括的细脂肪球的粒子直径大约为5-10微米。制得的包含生理活性物质的乳剂在冰箱里保存一周，再次观测所述细脂肪球的粒子直径时，其粒子直径大约为5-10微米。此结果可以证明细脂肪球的分散状态稳定。
实施例2
在该实施例中，使用福尔马林灭活的细菌迟钝爱德华氏菌(Edwardsiellatarada)，该菌是褐牙鲆(英文名Olive flounder，拉丁名Paralichthys olivaceus)的致病菌。制备浓度为107个细胞/毫升的含有死菌的水性悬浮液(一液)，然后用实施例1中所述同样的方法制备包含生理活性物质的乳剂。
然后，将适量制得的包含生理活性物质的乳剂含浸到商购的多孔鱼饲料小球中。用所述多孔鱼饲料小球连续饲喂15尾褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)13天，保持乳剂吸收量为10微升/天/100克鱼体重。
在吸收期完成后第23天，从5尾褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)的动脉采集血液，然后通过凝集值(agglutination value)测定如此获得的血清的迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarada)抗体的抗体滴度。
测量结果见下表1。这里“给药组”指关于本实施例的5尾褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)，而“对照组”指关于对比例的5尾褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)。此外，“鱼”栏的数字指给药组和对照组每组5尾褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)分别的样品编号。
表1
| 角 | 给药组的凝集值 | 对照组的凝集值 |
| 1 | 1024 | 2 |
| 2 | 1024 | 4 |
| 3 | 256 | 2 |
| 4 | 32 | 16 |
| 5 | 64 | 16 |
除了测量上述凝集值外，关于本实例在吸收期完成后第23天，15尾褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)中剩余的10尾肌肉注射活迟钝爱德华氏菌(注射0.3毫升含有105细胞/毫升的菌液作为激发量的细菌)，随后进行14天的培养并评价生存能力。同时，作为对比例，按照与上述相同的方法，10尾没有喂饲包含生理活性物质的乳剂的褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)肌肉注射活迟钝爱德华氏菌，随后进行14天的培养并评价生存能力。
评价结果见下表2。这里“逝去天数”栏中的数字代表活菌注射后的天数，“给药组”指关于本实施例的褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)，而“对照组”指关于对比例的褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)，各个所示的数字指相应天数死鱼的数量。
表2
| 逝去天数 | 给药组 | 对照组 |
| 7 | 0 | 0 |
| 8 | 0 | 0 |
| 9 | 0 | 1 |
| 10 | 0 | 4 |
| 11 | 1 | 1 |
| 12 | 1 | 0 |
| 13 | 3 | 1 |
| 14 | 0 | 3 |
从表2可以证实，从注射活菌经过的6天中给药组和对照组都没有死鱼，但是在第14天时间点，相对于对照组中鱼全部死亡，给药组中的死鱼总数为5尾(生存能力50％)。
从上述结果可以看出与对照组相比，所述给药组在检测的抗体滴度和注射活菌后的生存能力方面，都显示出了极好的结果。
实施例3
本实施例也使用福尔马林灭活的细菌迟钝爱德华氏菌(Edwardsiellatarada)。制备含有浓度为109个细胞/毫升的死菌的水性悬浮液(一液)，然后用实施例1中所述同样的方法制备二液。
然后，将一液和二液以重量比99∶1混合，使用超声波仪进行充分的乳化处理，以形成包埋于油相的油性乳化相(组1的三液)，其中福尔马林灭活的细菌大肠杆菌高密度悬浮液形成非常精细的分散相。此外，将一液和二液以重量比90∶10混合，所得混合物经过上述乳化处理以形成油性乳化作用相(组2的三液)。
接着，以与实施例1同样的方法制备四液。将三液和四液以重量比2∶1混合，所述三液分别为组1的三液和组2的三液，使用搅拌器充分搅拌，以制备包含生理活性物质的乳剂([组1的包含生理活性物质的乳剂]和[组2的包含生理活性物质的乳剂])，其中所述油性乳化作用相作为细脂肪球分散于水中。
之后，将适量制得的组1的包含生理活性物质的乳剂和组2的包含生理活性物质的乳剂含浸到商购的多孔鱼饲料小球中。用所述多孔鱼饲料小球连续饲喂上述的鱼13天，保持乳剂吸收量为0.05毫升/天/100克鱼体重。使每10尾褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)(平均体重：100克)自由摄食3天。下文中，饲喂组1的包含生理活性物质的乳剂的褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)命名为“组A”，饲喂组2的包含生理活性物质的乳剂的褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)命名为“组B”。
之后，关于组A和组B的褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)，在吸收期完成后第23天，通过凝集值(agglutination value)测定获得的褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)血清的迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarada)抗体的抗体滴度。所得结果示于下表3的“包埋细菌体的脂肪球给药组”栏中。“鱼”一栏中的数字指关于组A和组B的10尾褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)的样品编号。
同时，作为对照组，如上所述，使用与实施例3“组A”等量的福尔马林灭活的细菌迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarada)、乌贼肝油以及油溶性乳化剂，制备简单混合油溶液。
所述油性溶液不经过相应的第二乳化处理，因此不包括在关于本发明的包含生理活性物质的乳剂之内。
将所述油溶液含浸到上述多孔小球中并给予10尾褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)，并且测量抗体产物。饲喂所述油溶液的褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)作为“组D”。评价结果见表3中“组D”栏。此外未以任何方式给予福尔马林灭活的细菌迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarada)和乳剂的10尾正常褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)作为“组C”并且使用相同方法进行抗体产物的评价。评价结果见表3对照组的栏“组C”。
表3
| 包埋细菌体的脂肪球给药组 | 对照组 | |||
| 凝集值 | 凝集值 | |||
| 组A | 组B | 组C | 组D | |
| 1 | 256 | 32 | 16 | 4 |
| 2 | 1024 | 1024 | 16 | 2 |
| 3 | 64 | 256 | 2 | 8 |
| 4 | 64 | 128 | 64 | 16 |
| 5 | 32 | 256 | 4 | 32 |
| 6 | 256 | 128 | 2 | |
| 7 | 128 | 1024 | 2 | |
| 8 | 128 | 1024 | 16 | |
| 9 | 128 | 256 | 16 | |
| 10 | 256 | 32 | 64 | |
从表3可以看出，组A和组B中的褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)产生了高浓度的迟钝爱德华氏菌抗体。另外，组C和组D之间的评价结果几乎没有差别，但是可以看出，与组A和组B相比，所述组C和组D的评价结果显示出极大差异。
工业适用性
如上所述，免疫激活剂和药理活性物质以及各种生理活性物质可以通过简单的方法被出现脂肪球吸收作用的多种水产养殖或观赏的鱼类和水生甲壳类动物或哺乳动物非常高效地吸收。
虽然为了描述的目的已经公开本发明的优选实施方式，但是本领域技术人员应当理解到，在不脱离所附权利要求书公开的本发明范围和实质的前提下，可能进行多种改变、添加和替换。
Claims (10)
1、一种包含生理活性物质的水包油乳剂，其中，
细脂肪球作为动物消化道内脂肪球吸收作用靶标分散在所述乳剂中；
所述生理活性物质包含在其中分散有细脂肪球的乳剂的油滴中；并且
所述生理活性物质通过细脂肪球中存在的油溶性乳化剂的作用，以生理活性物质本身或与少量水一起的非常精细的分散相形式包埋在油相中。
2、一种包含生理活性物质的水包油乳剂，其中，
细脂肪球作为动物消化道内脂肪球吸收作用靶标分散在所述乳剂中；
所述生理活性物质包含在其中分散有细脂肪球的乳剂的油滴中；并且
所述生理活性物质亲脂性地溶解或悬浮在细脂肪球中。
3、一种包含生理活性物质的水包油乳剂，其中，
细脂肪球作为动物消化道内脂肪球吸收作用靶标分散在所述乳剂中；
所述生理活性物质包含在其中分散有细脂肪球的乳剂的油滴中；并且
所述生理活性物质以封入细脂肪球内的形式存在，所述细脂肪球具有由脂质双分子层形成的胶团结构。
4、权利要求1-3中任意一项所述的乳剂，其中，所述细脂肪球的平均粒子直径在1-60微米的范围内。
5、权利要求1-3中任意一项所述的乳剂，其中，所述生理活性物质为选自由疫苗、免疫激活剂、营养物质、药理活性物质、天然色素和矿物所组成的组中的至少一种。
6、一种包含生理活性物质的乳剂的制备方法，该方法包括：
将生理活性物质、生理活性物质的水溶液或生理活性物质的水性悬浮液与添加有油溶性乳化剂的乳剂混合并乳化，以制备油性乳化相；并且
将所述油性乳化相与加入到其中的包含水溶性乳化剂的水混合并乳化，以制备水包油乳剂，在该乳剂中所述油性乳化相在水中分散成作为动物消化道内脂肪球吸收作用靶标的细脂肪球。
7、一种给予包含生理活性物质的乳剂的方法，该方法包括：
给动物口服包含生理活性物质并且其中分散有细脂肪球的乳剂，
其中，制备所述细脂肪球，以便乳剂的油滴中包含生理活性物质，并且与此同时，所述细脂肪球成为动物消化道中脂肪球吸收作用的靶标。
8、一种给予包含生理活性物质的乳剂的方法，该方法包括：
将包含生理活性物质并且其中分散有细脂肪球的乳剂含浸到饲料或饲料小球中；并且
使动物摄取所述含浸的物质，
其中，制备所述细脂肪球，以便乳剂的油滴中包含生理活性物质，并且与此同时，所述细脂肪球成为动物消化道中脂肪球吸收作用的靶标。
9、如权利要求7或8所述的方法，其中，所述动物为水生动物或陆生哺乳动物。
10、如权利要求7或8所述的方法，其中，所述生理活性物质为选自由疫苗、免疫激活剂、营养物质、药理活性物质、天然色素和矿物所组成的组中的至少一种。
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