CN1865275A - 对人b细胞肿瘤有治疗作用的人工合成的单链脱氧核苷酸 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一批人工合成的单链脱氧核苷酸，该脱氧核苷酸能够诱导人B细胞肿瘤细胞发生凋亡，增强人B细胞肿瘤细胞表达CD40，因而对人B细胞肿瘤有治疗作用。本发明也提供了用人工合成的单链脱氧核苷酸治疗人B细胞肿瘤的技术和方法。
Description
技术领域
本发明提供一种治疗人B淋巴细胞肿瘤的制剂，特别地涉及人工合成的单链脱氧核苷酸，该核苷酸能够诱导人B淋巴细胞肿瘤发生凋亡，增强人B细胞肿瘤细胞表达CD40，对人B淋巴细胞肿瘤有治疗作用。
技术背景：
根据世界卫生组织的分类系统(WHO classification system)，人类的淋巴样恶性疾病(lymphoid malignancies)分为三种主要的类型：B淋巴细胞肿瘤(B-cell neoplasms)，T淋巴细胞/天然杀伤细胞肿瘤(T-cell/natural killer(NK)-cell neoplasms)和何杰金淋巴瘤(Hodgkin’s lymphoma)。人B淋巴细胞肿瘤(B-cell neoplasms)又被分为两类：前B细胞肿瘤(Precursor B-cell neoplasm)和外周B细胞肿瘤(Peripheral B-cellneoplasms)。前B细胞肿瘤包括：前B细胞急性淋巴母细胞白血病/淋巴母细胞淋巴瘤(precursor B-acute lymphoblastic leukemia/lymphoblastic lymphoma(B-ALL，LBL)。外周B细胞肿瘤包括：B细胞慢性淋巴细胞白血病(B-cell chronic lymphocytic leukemia)，小淋巴细胞淋巴瘤(small lymphocytic lymphoma)，B细胞多型细胞白血病(B-cellprolymphocytic leukemia)，淋巴浆细胞淋巴榴(Lympho plasmacyticlymphoma/immunocytoma)，蓬状细胞淋巴瘤(Mantle cell lymphoma)，滤泡状淋巴瘤(Follicular lymphoma)，淋巴结外边缘区B细胞淋巴瘤(Extranodal marginal zone B-celllymphoma of MALT type)，淋巴结边缘区B细胞淋巴瘤(Nodal marginal zone B-cell lymphoma(+/-monocytoid B-cells)，脾边缘区B淋巴瘤(Splenic marginal zone lymphoma(+/-villous lymphocytes)，毛细胞白血病(Hairy cell leukemia)，浆细胞瘤/浆细胞骨髓瘤(Plasmacytoma/plasma cell myeloma)，弥散性大B细胞淋巴瘤(Diffuse large B-celllymphoma)，Mediastinal(thymic)large B cell lymphoma，血管内大B细胞淋巴瘤(intravascular large B-cell lymphoma)，原发性渗出性淋巴瘤(primary effusionlymphoma)和伯基特淋巴瘤(Burkitt’s lymphoma)。
B细胞慢性淋巴细胞白血病是B淋巴细胞肿瘤的一种，以血液等体液内恶性B淋巴细胞进行性增多为主要特点，单克隆的B-CLL患者的白血病细胞具有CD19+CD5+CD23+的表型(Nicholas Chiorazzi，M.D.，Kanti R.Rai，M.B.，B.S.，and Manlio Ferrarini，M.D.NEngl J Med 2005；352：804-15)。B淋巴细胞白血病包括前B细胞急性淋巴母细胞白血病和B细胞慢性淋巴细胞白血病。
小淋巴细胞淋巴瘤(small lymphocytic lymphoma)是人B淋巴细胞肿瘤的一种，以淋巴结中聚集大量恶性的B淋巴细胞为特征，单克隆的小淋巴细胞淋巴瘤细胞具有CD20+CD5+CD23+的表型(Catherine Thieblemont，Vale′ry Nasser，Pascale Felman，Karen Leroy，Sophie Gazzo，Evelyne Callet-Bauchu，Be′atrice Loriod，SamuelGranjeaud，Philippe Gaulard，Corinne Haioun，Alexandra，Traverse-Glehen，LucileBaseggio，Franc，ois Bertucci，Daniel Birnbaum，Florence Magrangeas，Ste′phaneMinvielle，Herve′Avet-Loiseau，Gilles Salles，Bertrand Coiffier，Franc，oise Berger，and Re′mi Houlgatte.Blood.2004；103：2727-2737)。
B淋巴细胞肿瘤的治疗方法主要是化疗，如采用苯丁酸氮芥(chlorambucil)、环磷酰胺(cyclophosphamide)或fludarabine治疗B细胞慢性淋巴细胞白血病。近年来，CD20特异性嵌合单克隆抗体在B淋巴细胞肿瘤治疗的临床实验中也表现出了疗效(John C.Byrd，Kanti Rai，Bercedis L.Peterson，Frederick R.Appelbaum，Vicki A.Morrison，JonathanE.Kolitz，Lois Shepherd，John D.Hines，Charles A.Schiffer，and Richard A.Blood.2005，105：49-53；O’Brien SM，Kantarjian H，Thomas DA et al.J Clin Oncol 2001；19：2165-2170；Huhn D，von Schilling C，Wilhelm M et al.Blood 2001，98：1326-1331)。
CD40是表达在B淋巴细胞、树突状细胞表面的蛋白，为肿瘤坏死因子受体家族(TNFR)的成员。CD40L(CD154)是CD40的配体，表达在T淋巴细胞表面的蛋白，为肿瘤坏死因子家族的成员(Castle BE，Kishimoto K，Stearns C et al.J Immunol 1993；151：1777-1788)。CD40L和CD40相互作用可促进B淋巴细胞，树突状细胞和单核细胞增生、分化、提呈抗原(Ranheim EA，Kipps TJ.J Exp Med 1993；177：925-935；Yellin MJ，Sinning J，CoveyLR et al.J Immunol 1994；153：666-674；Banchereau J，Bazan F，Blanchard D et al.Annu Rev Immunol 1994；12：881-922；von Bergwelt-Baildon MS，Vonderheide RH，MaeckerB et al.Blood 2002；99：3319-3325；M.von Bergwelt-Baildonl，B.Maeckerl，J.Schultze2 & J.G.Gribbenl.Annals of Oncology 15：853-857，2004)。
CD40也表达在多种在B淋巴细胞肿瘤细胞的表面。研究表明，增强B淋巴细胞肿瘤细胞CD40的表达可促进B淋巴细胞肿瘤细胞的凋亡(Peter Chu，Dieter Deforce，IreneM.Pedersen，Youngsoo Kim，Shinichi Kitada，John C.Reed，and Thomas J.Kipps.PNAS，March 19，2002，vol.99，no：63854-3859；Frank Dicker，Arnon P.Kater，TetsuyaFukuda，and Thomas.J.Kipps.BLOOD，15 APRIL 2005 VOLUME 105，NUMBER 8：3193-3198)。
体内和体外实验证明，增强CD40的表达可使B淋巴细胞肿瘤细胞的生长受到抑制(Funakoshi，S.，D.L.Longo，M.Beckwith，D.K.Conley，G.Tsarfaty，T.Tsarfaty，R.J.Armitage，W.C.Fanslow，M.K.Spriggs，and W.J.Murphy.1994.Blood 83：2787；Eliopoulos，A.G.，C.W.Dawson，G.Mosialos，J.E.Floettmann，M.Rowe，R.J.Armitage，J.Dawson，J.M.Zapata，D.J.Kerr，M.J.O.Wakelam，et al.1996.Oncogene13：2243；Hirano，A.，D.L.Longo，D.D.Taub，D.K.Ferris，L.S.Young，A.G.Eliopoulos，A.Agathanggelou，N.Cullen，J.Macartney，W.C.Fanslow，and W.J.Murphy.1999.Blood 93：2999；Tong，A.W.，M.H.Papayoti，G.Netto，D.T.Armstrong，G.Ordonez，J.M.Lawson，and M.J.Stone.2001.Clin.Cancer Res.7：691)。
增强B淋巴细胞肿瘤细胞CD40的表达，可增强B淋巴细胞肿瘤细胞的免疫原性，促进诱生B淋巴细胞肿瘤细胞特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。在免疫系统中，CTL是最高效的肿瘤杀伤细胞。B淋巴细胞肿瘤细胞特异性的细胞毒性T淋巴细胞可有效杀伤B淋巴细胞肿瘤细胞(Dilloo D，Brown M，Roskrow M，et al.Blood.1997；90：1927-1933；Kato K，CantwellMJ，Sharma S，Kipps TJ.J Clin Invest.1998；101：1133-1141；Wierda WG，Cantwell MJ，Woods SJ，Rassenti LZ，Prussak CE，Kipps TJ.Blood.2000；96：2917-2924；Takahashi S，Rousseau R，Yotnda P，et al.Hum Gene Ther.2001；12：659-670；Takahashi S，RousseauR，Yotnda P，et al.Cancer Gene Ther.2001；8：378-387)。在CD40L存在的条件下，表达CD40的B细胞慢性淋巴细胞白血病细胞可被CD4细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)杀伤(FrankDicker，Arnon P.Kater，Tetsuya Fukuda，and Thomas J.BLOOD，15 APRIL 2005 VOLUME105，NUMBER 8：3193-3198)。用CD40L刺激表达在伯基特淋巴瘤细胞的CD40可促进伯基特淋巴瘤细胞向特异性的CTL提呈伯基特淋巴瘤细胞的肿瘤抗原(Khanna，R.，L.Cooper，N.Kienzle，D.J.Moss，S.R.Burrows，and K.K.Khanna.1997.J.Immunol.159：5782)。体内实验和临床实验表明，CD40激活可增强B细胞慢性淋巴细胞白血病细胞的免疫原性，诱导针对B细胞慢性淋巴细胞白血病细胞的T细胞免疫(Kato，K.，M.J.Cantwell，S.Sharma，and T.J.Kipps.1998.J.Clin.Invest.101：1133；Wierda，W.G.，M.J.Cantwell，S.J.Woods，L.Z.Rassenti，C.E.Prussak，and T.J.Kipps.2000.Blood 96：2917)。给病人静脉输入转染携带CD40L基因的腺病毒载体的自体白血病细胞可使病人的白血病细胞数急剧下降，淋巴结迅速缩小(Wierda WG，Cantwell MJ，Woods SJ，Rassenti LZ，PrussakCE，Kipps TJ.Blood.2000；96：2917-2924)。
上述结果表明，增强B淋巴细胞肿瘤细胞CD40的表达可产生抗B细胞肿瘤的作用，这些作用表现在但不限于下述的方面：
1)促进B淋巴细胞肿瘤细胞的凋亡；
2)B淋巴细胞肿瘤细胞的生长受到抑制；
3)增强B淋巴细胞肿瘤细胞的免疫原性，促进诱生B淋巴细胞肿瘤细胞特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。
人工合成的单链脱氧核苷酸是含胞嘧啶和鸟嘌呤通过磷酸连接而成的二核苷酸基序的DNA分子。在一个人工合成的单链脱氧核苷酸中，可包括一个以上的这样的基序(含胞嘧啶和鸟嘌呤通过磷酸连接而成的二核苷酸)。由于序列尤其是此基序两侧的序列的不同，人工合成的单链脱氧核苷酸可有多种多样的形式，表现出不同的免疫调节活性。人工合成的单链脱氧核苷酸的长度范围为14-50个碱基。
天然免疫系统细胞，如树突状细胞、巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞可通过模式识别受体(pattern-recognition receptor，PRR)识别保守的微生物特异性分子(conservedmicrobial-specific molecules)后被激活。Toll样受体(Toll-like receptor，TLR)是PRR家族的成员。Toll样受体是介导天然免疫反应的重要受体(Aderem，A.& Ulevitch，R.J.Nature 406，782-7，2000)。迄今为止，在人类，已发现了十种Toll样受体，这些受体组成了机体天然防御机制的微生物识别系统(Akira，S.，Takeda，K.& Kaisho，T.Nat Immunol2，675-80(2001)。不同的TLR可识别不同的配体，如TLR2可识别细菌的脂蛋白、肽聚糖和脂壁酸等；TLR3识别病毒的双链RNA；TLR4识别脂多糖；TLR5识别细菌的鞭毛；TLR9能够识别人工合成的单链脱氧核苷酸分子(Takeshita F，Leifer CA，Gursel I，Ishii KJ，Takeshita S，Gursel M，Klinman DM.J Immunol.2001 Oct 1；167(7)：3555-8)。研究表明，人工合成的单链脱氧核苷酸可通过刺激人浆细胞样树突状细胞和B淋巴细胞的Toll样受体9(TLR9)发挥生物学作用(Veit Hornung，et al.J Immunol，2002，168：4531-4537)。表达TLR9的细胞是人工合成的单链脱氧核苷酸作用的靶细胞。人工合成的单链脱氧核苷酸可通过作用TLR9增强刺激天然免疫和获得性免疫反应(Krieg AM.Annu Rev Immunol.2002；20：709-760)。Oligo 2006是一种典型的能刺激人B细胞的人工合成的单链脱氧核苷酸(Hartmann G，Krieg AM.J Immunol.2000；164：944-953)。
本研究证明：人工合成的单链脱氧核苷酸可以诱导人B细胞肿瘤细胞发生凋亡，增强人B细胞肿瘤细胞表达CD40，对人B细胞肿瘤有治疗作用。
发明内容
本发明的目的之一是提供对可诱导人B淋巴细胞肿瘤细胞发生凋亡的人工合成的单链脱氧核苷酸，这些人工合成的单链脱氧核苷酸可治疗人B淋巴细胞肿瘤，这些肿瘤包括但不限于下述人B细胞肿瘤：前B细胞急性淋巴母细胞白血病/淋巴母细胞淋巴瘤(precursorB-acute lymphoblastic leukemia/lymphoblastic lymphoma(B-ALL，LBL)，B细胞慢性淋巴细胞白血病(B-cell chronic lymphocytic leukemia)，小淋巴细胞瘤(small lymphocyticlymphoma)，B细胞多型细胞白血病(B-cell prolymphocytic leukemia)，淋巴浆细胞淋巴榴(Lympho plasmacytic lymphoma/immunocytoma)，蓬状细胞淋巴瘤(Mantle celllymphoma)，滤泡状淋巴瘤(Follicular lymphoma)，淋巴结外边缘区B淋巴瘤(Extranodalmarginal zone B-cell lymphoma of MALT type)，淋巴结边缘区B淋巴瘤(Nodal marginalzone B-cell lymphoma(+/-monocytoid B-cells)，脾边缘区B淋巴瘤(Splenic marginalzone lymphoma(+/-villous lymphocytes)，毛细胞白血病(Hairy cell leukemia)，浆细胞瘤/浆细胞骨髓瘤(Plasmacytoma/plasma cell myeloma)，弥散性大B细胞淋巴瘤(Diffuse large B-cell lymphoma)，Mediastinal(thymic)large B cell lymphoma，血管内大B细胞淋巴瘤(intravascular large B-cell lymphoma)，原发性渗出性淋巴瘤(primary effusion lymphoma)和伯基特淋巴瘤(Burkitt’s lymphoma)。
本发明的目的之二是提供用任何人工合成的单链脱氧核苷酸治疗人B细胞肿瘤的技术和方法。
本发明的目的之三是提供用对人B细胞肿瘤有治疗作用的人工合成的单链脱氧核苷酸的序列，这些人工合成的单链脱氧核苷酸的磷酸二酯键可以被部分硫化或全部硫化，这些人工合成的单链脱氧核苷酸可以经化学修饰。这些人工合成的单链脱氧核苷酸是两端和中间可加上/入或改动碱基所产生的结构的核心结构。
本发明的目的之四是提供用人工合成的单链脱氧核苷酸通过诱导人B细胞肿瘤细胞发生凋亡而治疗人B细胞肿瘤的技术和方法。
本发明的目的之五是提供用人工合成的单链脱氧核苷酸增强人B细胞肿瘤细胞表达CD40而治疗人B细胞肿瘤的技术和方法。
图表说明
图1.人慢性B淋巴细胞白血病细胞表达TLR9受体的Western Blot鉴定。
Lane A：人慢性B淋巴细胞白血病细胞
Lane B：正常人B淋巴细胞
Lane C：正常人T淋巴细胞
1，2，3分别代表三位慢性淋巴细胞白血病病人或正常人
结果表明，人慢性B淋巴细胞白血病细胞表达TLR9，是人工合成的单链脱氧核苷酸的靶细胞。
表1、人工合成的单链脱氧核苷酸对人慢性B淋巴细胞白血病细胞的诱导凋亡作用。
结果表明，人工合成的单链脱氧核苷酸诱导人B细胞肿瘤细胞发生凋亡，因而也证明，人工合成的单链脱氧核苷酸对人B细胞肿瘤有治疗作用。
图2.人工合成的单链脱氧核苷酸对人慢性B淋巴细胞白血病细胞表达CD40的影响。
结果表明，人工合成的单链脱氧核苷酸显著刺激人B细胞肿瘤细胞表达CD40，因而可产生抗B细胞肿瘤的作用，这些作用包括但不限于：促进B淋巴细胞肿瘤细胞的凋亡；使B淋巴细胞肿瘤细胞的生长受到抑制；增强B淋巴细胞肿瘤细胞的免疫原性，促进诱生B淋巴细胞肿瘤细胞特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。
图3.小淋巴细胞淋巴瘤细胞表达TLR9受体的Western Blot鉴定。
Lane A：小淋巴细胞淋巴瘤细胞
Lane B：正常人的B淋巴细胞
Lane C：正常人的T淋巴细胞
1，2分别代表两位小淋巴细胞淋巴瘤病人或正常人
结果表明，人小淋巴细胞淋巴瘤细胞表达TLR9，是人工合成的单链脱氧核苷酸的靶细胞。
表2、人工合成的单链脱氧核苷酸对小淋巴细胞淋巴瘤细胞的诱导凋亡作用。
结果表明，人工合成的单链脱氧核苷酸诱导人B细胞肿瘤细胞发生凋亡，因而也证明，人工合成的单链脱氧核苷酸对人B细胞肿瘤有治疗作用。
图4.人工合成的单链脱氧核苷酸对小淋巴细胞淋巴瘤细胞表达CD40的影响。
结果表明，人工合成的单链脱氧核苷酸显著刺激人B细胞肿瘤细胞表达CD40，因而可产生抗人B细胞肿瘤的作用，这些作用包括但不限于：促进B淋巴细胞肿瘤细胞的凋亡；使B淋巴细胞肿瘤细胞的生长受到抑制；增强B淋巴细胞肿瘤细胞的免疫原性，促进诱生B淋巴细胞肿瘤细胞特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。
实施例1、人工合成的单链脱氧核苷酸的设计
设计序列如下：
1、符合(G)n(L)n X1X2CGY1Y2(M)n(G)N公式的人工合成的单链脱氧核苷酸(X1＝A，T，G；X2＝A，T；Y1＝A，T；Y2＝A，T，C；L，M＝A，T，C，G；n为0-6)
5’-ggggTCgTTCgTCgTTgggggg-3’(SEQ ID NO：1)[121]
5’-ggggATAACgTTgCgggggg-3’(SEQ ID NO：2)[143]
5’-ggggTgCAACgTTCAgggggg-3’(SEQ ID NO：3)[402]
5’-ggggTCCTACgTAggAgggggg-3’(SEQ ID NO：4)[123]
5’-ggggTCCATgACgTTCCTgAAgggggg-3’(SEQ ID NO：5)[603]
5’-gggggACgTCgCCggggggg-3’(SEQ ID NO：6)[118]
5’-ggATCCgTACgCATgggggg-3’(SEQ ID NO：7)[320]
5′-gggggAATCgATTCgggggg-3′(SEQ ID NO：8)[154]
5′-gggATgCATCgATgCATCgggggg-3′(SEQ ID NO：9)[464]
5′-ggTgCgACgTCgCAgggggg-3′(SEQ ID NO：10)[471]
5′-gggACgTACgTCgggggg-3′(SEQ ID NO：11)[390]
5′-gggggATCgACgTCgATCgggggg-3’(SEQ ID NO：12)[322]
5′-ggCgATCgATCgATCggggggg-3′(SEQ ID NO：13)[333]
5’-ggggTCgATCgATCgAgggggg-3′(SEQ ID NO：14)[113]
5’-ggTCgCgATCgCgAgggggg-3’(SEQ ID NO：15)[307]
5’-ggGGTCAACGTTGAgggggG-3’(SEQ ID NO：16)[156]
5’-gTCgTTTTCgTCgACgAATTgggggggg-3’(SEQ ID NO：17)[222]
5’-gTCgTTATCgTTTTTTCgTAgggggg-3’(SEQ ID NO：18)[151]
5’-ggCgTTAACgACgggggg-3’(SEQ ID NO：19)[288]
5’-gTCggCACgCgACgggggg-3’(SEQ ID NO：20)[157]
5’-ggTgCgACgTCgCAgggggg-3’(SEQ ID NO：21)[312]
5’-gTCTATTTTgTACgTACgTgggg-3’(SEQ ID NO：22)[360]
5’-gACgTCgACgTCgACgTCAggggg-3’(SEQ ID NO：23)[209]
5’-ggggTCgATCgTTgCTAgCgggggg-3’(SEQ ID NO：24)[399]
5’-gggggACgTTATCgTATTggggggg-3’(SEQ ID NO：25)[600]
5’-ggggTCgTCgTTTgTCgTgTgTCgTTgggggg-3’(SEQ ID NO：26)[408]
5’-ACgATCgATCgATCgggggg-3’(SEQ ID NO：27)[304]
5’-AgACgTCTAACgTCggggg-3’(SEQ ID NO：28)[301]
5’-ggggTgCTggCCgTCgTTgggggg-3’(SEQ ID NO：29)[266]
5’-ggggTCgTTgCCgTCgggggg-3’(SEQ ID NO：30)[248]
5’-ACCggTATCgATgCCggTgggggg-3’(SEQ ID NO：31)[389]
5’-TTCgTTgCATCgATgCATCgTTgggggg-3’(SEQ ID NO：32)[287]
2、符合(G)n(L)nCG(XY)nCG(M)n(G)n公式的人工合成的单链脱氧核苷酸(X＝A，T；Y＝A，T；L，M＝A，T，C，G；n为0-6)
5’-ggggACgATACgTCggggggg-3’(SEQ ID NO：33)[546]
5’-ggggACgATATCgATgggggg-3’(SEQ ID NO：34)[1007]
5′-ggACgATCgATCgTgggggg-3′(SEQ ID NO：35)[521]
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5′-ggTgCATCgTACgATgCAgggggg-3′(SEQ ID NO：40)[100]
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5’-gTACAACggCgAggAATACCT-3’(SEQ ID NO：48)[523]
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5’-gggggCgTCgTTTTCgTCgACgAATT-3’(SEQ ID NO：66)[278]
5’-actcgagacgcccgttgatagctt-3’(SEQ ID NO：67)355[244]
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5’-TgCgACgTCgCACAgCgT-3’(SEQ ID NO：77)[492]
3、符合(TCG)n(L)nCG(M)n(G)n公式的人工合成的单链脱氧核苷酸(L，M＝A，T，C，G；n为0-6)
5’-TCgTTgCCgTCgg-3’(SEQ ID NO：78)[619]
5’-TCgTTgCCgTCggg-3’(SEQ ID NO：79)[577]
5’-TCgTTgCCgTCgggg-3’(SEQ ID NO：80)[533]
5’-TCgTTgCCgTCggggg-3’(SEQ ID NO：81)[537]
5’-TCgTTgCCgTCgggggg-3’(SEQ ID NO：82)[481]
5’-TCgTTgCCgTCggggggg-3’(SEQ ID NO：83)[177]
5’-TCgTTgCCgTCgggggggg-3’(SEQ ID NO：84)[111]
5’-TCgTTgCCgTCggggggggg-3’(SEQ ID NO：85)[105]
5′-TCgTCgggTgCATCgATgCAgggggg-3′(SEQ ID NO：86)[664]
5’-TCgTCgggTgCAACgTTgCAgggggg-3’(SEQ ID NO：87)[564]
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5’-TCgTCgggTgCgACgATCgTCgCAgggggg-3’(SEQ ID NO：90)[465]
5’-TCgTCgTgCgACgTCgCAgggggg-3’(SEQ ID NO：91)[498]
5’-TCgTCgCAgAACgTTCTgggggg-3’(SEQ ID NO：92)[527]
5’-TCgTgCgACgTCgCAgggggg-3’(SEQ ID NO：93)[112]
5’-TCgTgCgACgATCgTCgCAgggggg-3’(SEQ ID NO：94)[178]
5’-TCgTATgCATCgATgCATAgggAgg-3’(SEQ ID NO：95)[410]
5’-TCgTgCATCgATgCAgggggg-3’(SEQ ID NO：96)[444]
5’-TCgAAACgTTTCgggggg-3’(SEQ ID NO：97)[532]
5’-TCggACgATCgTCgggggg-3’(SEQ ID NO：98)[598]
5’-TCgAgCgATCgCTCgAgggggg-3’(SEQ ID NO：99)[555]
5’-TCgTCgCTTTgTCgTTgggg-3’(SEQ ID NO：100)[418]
5’-TCgTCgTTTTgTCgTTgggg-3’(SEQ ID NO：101)[208]
5’-TCgTCgggTgCgACgTCgCAgggggg-3’(SEQ ID NO：102)[302]
5’-TCgTCgggTgCgACgATCgTCgggggg-3’(SEQ ID NO：103)[290]
5’-TCgTCgTTTgCATCgATgCAggggggg-3’(SEQ ID NO：104)[627]
5’-TCgTCgTTTTgACgATCgTCgggggg-3’(SEQ ID NO：105)[500]
5’-TCgTTCggggTgCCg-3’(SEQ ID NO：106)[103]
5’-TCgTTCggggTACCgATgggg-3’(SEQ ID NO：107)[578]
5’-TCgTTgCgCTCCCATgCCgggggg-3’(SEQ ID NO：108)[319]
5’-TCgTCgTTTCgTCgTTgggg-3’(SEQ ID NO：109)[205]
5’-TCgTTgTCgTTTCgCTgCCggCggggg-3’(SEQ ID NO：110)[417]
5’-TgCTTgggTggCAgCTgCCAgggggg-3’(SEQ ID NO：111)[427]
5’-TgCTgCTTTgCTgCTTgggg-3’(SEQ ID NO：112)[421]
5’-AACgTTCgACgTCgAACggggggg-3’(SEQ ID NO：113)[453]
5’-AACgACgACgTTggggg-3’(SEQ ID NO：114)[580]
5’-tcgtcgggtgcgacgtcgca-3’(SEQ ID NO：165)[612]
4、符合(TCG)n(L)nX1X2CG(M)n公式的人工合成的单链脱氧核苷酸(X1＝A，T，G；X2＝A，T；L，M＝A，T，C，G；n为0-6)
5’-TCgTAACgTTgTTTTTAACgTT-3’(SEQ ID NO：115)[470]
5’-TCgTCgTATACgACgATCgTT-3’(SEQ ID NO：116)[502]
5’-TCgTCgTTTgCgTTgTCgTT-3’(SEQ ID NO：117)[601]
5’-TCCTgTCgTTTTgTCgTT-3’(SEQ ID NO：118)[625]
5’-TCgTCgTTgTCgTTCgCT-3’(SEQ ID NO：119)[430]
5’-TCgTCgTTACCgATgACgTCgCCgT-3’(SEQ ID NO：120)[480]
5’-TCgTCgTTTgCATCgATgCAgTCgTCgTT-3’(SEQ ID NO：121)[108]
5’-TCgCCTCgTCgCCTTCgAgC-3’g-3’(SEQ ID NO：122)[102]
5’-TCgTgTgCgTgCCgTTggg-3’T-3’(SEQ ID NO：123)[406]
5’-TCgTCgAgggCgCCggTgAC-3’-3’(SEQ ID NO：124)[560]
5’-TCgTCgCCggTgggggTgTg-3’3’(SEQ ID NO：125)[629]
5’-TCgTCgTACgCAATTgTCTT-3’3’(SEQ ID NO：126)[440]
5’-TCgCCCACCggTgggggggg-3’3’(SEQ ID NO：127)[207]
5’-TCgTCgCAgACCggTCTgggg-3’(SEQ ID NO：128)[615]
5’-TCgTCgCggCCggCgCCCCC-3’(SEQ ID NO：129)[610]
5’-TCgTCgCggCCgCgAggggg-3’(SEQ ID NO：130)[206]
5’-TCgAggACAAgATTCTCgTgC-3’(SEQ ID NO：131)[119]
5’-TCgAggACAAgATTCTCgTgCAggCC-3’(SEQ ID NO：132)[570]
5’-TCgTgCAggCCAACgAggCCg-3’(SEQ ID NO：133)[631]
5’-TCgTTgCCgTCggCCC-3’(SEQ ID NO：134)[115]
5’-TCggCACgCgACgTgCTggCCgTCgTTTCC-3’(SEQ ID NO：135)[370]
5’-TCgTTgCCgTCggCCCCCCCCC-3’(SEQ ID NO：136)[309]
5’-TCgTTgCCgTCggCCCCCC-3’(SEQ ID NO：137)[506]
5’-TCgTTgCCgTCggCCCCC-3’(SEQ ID NO：138)[404]
5’-TCgTTgCCgTCggCCCC-3’(SEQ ID NO：139)[203]
5’-TCgTTgCCgTCggCCCCCCC-3’(SEQ ID NO：140)[501]
5’-TCgAggACAAgATTCTCgT-3’(SEQ ID NO：141)[305]
5’-TCggCACgCgACgTgCTggCCgTCgTT-3’(SEQ ID NO：142)[509]
5’-TCgTCgCgCCgTCACgggggg-3’(SEQ ID NO：143)[630]
5’-TCgTgTgCgTgCCgTTggg-3’(SEQ ID NO：144)[106]
5’-TCgTCgCCgTTgggCggg-3’(SEQ ID NO：145)[117]
5’-TCgTCgACgTCgTTgggCggg-3’(SEQ ID NO：146)[280]
5’-TCgCAgTTgTCgTAACgTTgggCggg-3’(SEQ ID NO：147)[299]
5’-TCgTCgTTggTATgTT-3’(SEQ ID NO：148)[613]
5’-TCgTCgTCgTCgTTgTCgTT-3’(SEQ ID NO：149)[306]
5’-TCgTCgTCgTCgTTgTCgTTgggg-3’(SEQ ID NO：150)[309]
5’-TCgTTCggggTgCCg-3’(SEQ ID NO：151)[409]
5’-TCgTTCggggTAACgATT-3’(SEQ ID NO：152)[508]
5’-TCgTTCggggTAACgTT-3’(SEQ ID NO：153)[540]
5’-TCgTTCggggTACCgAT-3’(SEQ ID NO：154)[401]
5’-TCgTACggCCgCCgTACggCggg-3’(SEQ ID NO：155)[607]
5’-TCgCgTCgACTCCCCTCgAgggg-3’(SEQ ID NO：156)[380]
5’-TCgTCgTCgACTCgTggTCggggg-3’(SEQ ID NO：157)[656]
5’-TCgggCgCCCgATCgggggg-3’(SEQ ID NO：158)[310]
5’-TCgTCggTCTTTCgAAATT-3’(SEQ ID NO：159)[109]
5’-TCgTgACgTCCTCgAgTT-3’(SEQ ID NO：160)[330]
5’-TCgTCTTTCgACTCgTTCTC-3’(SEQ ID NO：161)[605]
5’-TCgTCgTTTTgCgTTCTC-3’(SEQ ID NO：162)[504]
5’-TCgACTTTCgTCgTTCTgTT-3’(SEQ ID NO：163)[407]
5’-TCgTCgTTTCgTCgTTCTC-3’(SEQ ID NO：164)[550]
5’-TCgTTCTCgACTCgTTCTC-3’(SEQ ID NO：166)[277]
5’-TCgACgTTCgTCgTTCgTCgTTC-3’(SEQ ID NO：167)[667]
5’-TCgTCgACgTCgTTCgTTCTC-3’(SEQ ID NO：168)[705]
5’-TCgTgCgACgTCgCAgATgAT-3’(SEQ ID NO：169)[114]
5’-TCgTCgAgCgCTCgATCggAT-3’(SEQ ID NO：170)[211]
5’-TCgTCgTTTCgTAgTCgTTgACgTCggg-3’(SEQ ID NO：171)[204]
5’-TCgTCggACgTTTTCCgACgTTCT-3’(SEQ ID NO：172)[308]
5’-TCgTCgTTTTCgTCgTTTTCgTCgTT-3’(SEQ ID NO：173)[340]
5’-TCgTCgTTTgTCgTgTgTCgTT-3；(SEQ ID NO：174)[503]
5’-TCgTCgTTggTCggggTCgTTggggTCgTT-3’(SEQ ID NO：175)[405]
5’-TCgTCgTTTCgTCTCTCgTT-3’(SEQ ID NO：176)[614]
5’-TCgTCgTTTTgCTgCgTCgTT-3’(SEQ ID NO：177)[505]
5’-TCgAgCgTTTTCgCTCgAATT-3’(SEQ ID NO：178)[530]
4、包含TTCGTCG的序列公式的人工合成的单链脱氧核苷酸
5’-TTCgTCgTTTgATCgATgTTCgTTgggggg-3’(SEQ ID NO：179)[507]
5’-TTCgTCgTTgTgATCgATgggggg-3’-3’(SEQ ID NO：180)[210]
5’-TATCgATgTTTTCgTCgTCgTTgggggg-3’(SEQ ID NO：181)[202]
5’-TCgACTTTCgTCgTTCTgTT-3’(SEQ ID NO：182)[303]
5’-TCgTCgTTTCgTCgTTCTC-3’(SEQ ID NO：183)[491]
5’-TCgACgTTCgTCgTTCgTCgTTC-3’(SEQ ID NO：184)[590]
5’-TCgTCgTTTTCgTCgTTTTCgTCgTT-3’(SEQ ID NO：185)[633]
实施例2、单链脱氧核苷酸的合成
采用固相亚磷酰胺三酯法合成DNA片段，此方法具有高效、快速等优点，已在DNA化学合成中广泛使用。
DNA化学合成不同于酶促的DNA合成，酶促的DNA合成过程是从5’→3’方向延伸，而DNA化学合成是由3’端开始。具体的反应步骤如下：
一、脱保护基
用三氯乙酸脱去连结在CPG(Controlled Pore Glass)上的核苷酸的保护基团DMT(二甲氧基三苯甲基)，获得游离的5’-羟基端，以供下一步缩合反应使用。
二、活化
将亚磷酰胺保护的核苷酸单体与四氮唑活化剂混合并进入合成柱，形成亚磷酰胺四唑活性中间体(其3′-端已被活化，但5′-端仍受DMT保护)，此中间体将与GPG上的已脱保护基的核苷酸发生缩合反应。
三、连接
亚磷酰胺四唑活性中间体遇到人工合成的单链脱氧核苷酸上已脱保护基的核苷酸时，将与其5′-羟基发生亲合反应，缩合并脱去四唑，此时合成的寡核苷酸链向前延长一个碱基。
四、封闭
缩合反应后为了防止连在人工合成的单链脱氧核苷酸上的未参与反应的5′-羟基在随后的循环反应中被延伸，常通过乙酰化来封闭此端羟基，一般乙酰化试剂是用乙酸酐和N-甲基咪唑等混合形成的。
五、氧化
缩合反应时核苷酸单体是通过亚磷酯键与连在人工合成的单链脱氧核苷酸上的寡核苷酸连接，而亚磷酯键不稳定，易被酸、碱水解，此时常用碘的四氢呋喃溶液将亚磷酰转化为磷酸三酯，从而得到稳定的寡核苷酸。
经过以上五个步骤后，一个脱氧核苷酸就被连到人工合成的单链脱氧核苷酸的核苷酸上，同样再用三氯乙酸脱去新连上的脱氧核苷酸5′-羟基上的保护基团DMT后，重复以上的活化、连接、封闭、氧化过程即可得到一个DNA片段粗品。最后对其进行切割、脱保护基(一般对A、C碱基采用苯甲酰基保护；G碱基用异丁酰基保护；T碱基不必保护；亚磷酸用腈乙基保护)、纯化(常用的有HAP，PAGE，HPLC，C18，OPC等方法)、定量等合成后处理即可得到符合实验要求的寡核苷酸片段。
实施例3、Toll样受体9在人B淋巴细胞白血病细胞的表达
1、制备人慢性B淋巴细胞白血病细胞
从人慢性B淋巴细胞白血病患者的血液，采用Ficoll-hypaque梯度离心的方法获得外周血单个核细胞(PBMC)。利用B淋巴细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，Germany)分离出CD5+CD19+CD23+的人慢性B淋巴细胞白血病细胞，纯度达95％。具体操作按照Miltenyi Biotec公司提供的方法进行。利用B或T淋巴细胞分离试剂盒(MiltenyiBiotec，Bergisch Gladbach，Germany)，从正常人PBMC中分离出的B或T淋巴细胞，所获得的B淋巴细胞(CD19+)和所获得的T淋巴细胞(CD3+)的纯度均在95％以上。具体操作按照Miltenyi Biotec(Bergisch Gladbach，Germany)公司提供的方法进行。
2人慢性B淋巴细胞白血病细胞表达TLR9的Western blots鉴定
将5×106个人慢性B淋巴细胞白血病细胞、正常人的B淋巴细胞和T淋巴细胞分别裂解后，按常规方法进行Western blot操作。采用的抗TLR 9抗体购自Active MotiF，(Carlsbad，California)。Western blot的结果表明，慢性B淋巴细胞白血病细胞表达较高水平的TLR9(图1)。在实验中，采用了3位慢性淋巴细胞性白血病患者和3位正常人的外周血。
实施例3提供的结果表明，人B淋巴细胞白血病细胞表达TLR9，是人工合成的单链脱氧核苷酸作用的靶细胞。
实施例4、人工合成的单链脱氧核苷酸诱导B淋巴细胞白血病患者B淋巴细胞凋亡
1细胞培养：从未经治疗的人慢性B淋巴细胞白血病患者外周血经Ficoll-hypaque梯度离心分离出PBMC，再利用B细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，Germany)从此PBMC中分离出CD5+CD19+CD23+的人慢性B淋巴细胞白血病细胞，纯度在95％以上。具体操作按照Miltenyi Biotec(Bergisch Gladbach，Germany)公司提供的方法进行。
2.人工合成的单链脱氧核苷酸诱导凋亡试验：采用48孔板，用含10％人的AB型血清的RPMI1640培养基培养人慢性B淋巴细胞白血病细胞，1×106个细胞/孔。设立实验组和对照组，实验组的培养板的孔中加入人工合成的单链脱氧核苷酸至终浓度3μg/ml。
3.人工合成的单链脱氧核苷酸配制：用50μl PBS溶解100μg人工合成的单链脱氧核苷酸制备成应用液。
所采用的人工合成的单链脱氧核苷酸序列以Oligo 1-10和Oligo 2006，Oligo 2116代表，其相应序列如序列表中所示。
Oligo 1：SEQ ID NO167
Oligo 2：SEQ ID NO168
Oligo 3：SEQ ID NO135
Oligo 4：SEQ ID NO150
Oligo 5：SEQ ID NO78
Oligo 6：SEQ ID NO102
Oligo 7：SEQ ID NO89
Oligo 8：SEQ ID NO86
Oligo 9：SEQ ID NO165
Oligo 10：SEQ ID NO36
对照序列：
Oligo 2006：5’-tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt-3’
Oligo 2216：5’-gggggacgatcgtcgggggg-3’
在对照组培养板孔中加入不含人工合成的单链脱氧核苷酸的培养基。在加入上述人工合成的单链脱氧核苷酸的第3，5，7后，用TMRE(Molecular Probes Inc)(Lena Thyrell，Linn Hjortsberg，Velmurugesan Arulampalam，Theocharis Panaretakis，Sabine Uhles，MarkusDagnell，Boris Zhivotovsky，Ingo Leibiger，Dan Grande′r，and Katja Pokrovskaja.THEJOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY Vol.279，No.23，Issue of June 4，pp.24152-24162，2004)分别对细胞进行染色。具体方法是：将细胞和TMRE共同于37℃孵育10分钟。在TMRE染色过程中，只有活的慢性B淋巴细胞白血病细胞能够着色(TMRE+)；发生凋亡的慢性B淋巴细胞白血病B淋巴细胞不着色(TMRE-)。然后，收集细胞，利用流式细胞仪(BD USA)计数着色细胞(未凋亡细胞)和未着色细胞(凋亡细胞)。利用下述公式计算未凋亡细胞百分率：
3结果：人工合成的单链脱氧核苷酸可使人慢性B淋巴细胞白血白细胞未凋亡细胞百分率明显降低(表1)。
4结论：人工合成的单链脱氧核苷酸能够显著诱导B淋巴细胞白血病细胞发生凋亡，对人淋巴细胞白血病有治疗作用。
实施例5、人工合成的单链脱氧核苷酸刺激人B淋巴细胞白血病细胞表达CD40
1、人B淋巴细胞白血病细胞的分离
从未经治疗的B-CLL病人的血液经Ficoll-hypaque梯度离心分离出PBMC，再利用B细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，Germany)从此PBMC中分离出CD5+CD19+CD23+的人慢性B淋巴细胞白血病细胞，纯度在95％以上。具体操作按照Miltenyi Biotec(BergischGladbach，Germany)公司提供的方法进行。
2、人工合成的单链脱氧核苷酸刺激人B淋巴细胞白血病细胞表达CD40
采用48孔板，用含10％人的AB型血清的RPMI1640培养基培养人慢性B淋巴细胞白血病细胞，1×106个细胞/孔。设立培养基对照组和人工合成的单链脱氧核苷酸组。在人工合成的单链脱氧核苷酸组，每孔加入人工合成的单链脱氧核苷酸至终浓度3μg/ml，所采用的人工合成的单链脱氧核苷酸序列以Oligo 1-1O和Oligo 2006，Oligo 2116代表，其相应序列如序列表中所示。
Oligo 1：SEQ ID NO167
Oligo 2：SEQ ID NO168
Oligo 3：SEQ ID NO135
Oligo 4：SEQ ID NO150
Oligo 5：SEQ ID NO78
Oligo 6：SEQ ID NO102
Oligo 7：SEQ ID NO89
Oligo 8：SEQ ID NO86
Oligo 9：SEQ ID NO165
Oligo 10：SEQ ID NO36
对照序列：
Oligo 2006：5’-tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt-3’
Oligo 2216：5’-gggggacgatcgtcgggggg-3’
在加入人工合成的单链脱氧核苷酸72小时后，用FITC-CD40抗体(Becton Dickinson)对细胞进行染色。然后用利用流式细胞仪(BD USA)测定结果。
结果(图-2)表明，人工合成的单链脱氧核苷酸显著刺激人B淋巴细胞白血病细胞表达CD40，因而可产生抗B细胞肿瘤的作用，这些作用表现在但不限于下述的方面：
1)促进B淋巴细胞肿瘤细胞的凋亡；
2)使B淋巴细胞肿瘤细胞的生长受到抑制；
3)增强B淋巴细胞肿瘤细胞的免疫原性，促进诱生B淋巴细胞肿瘤细胞特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。
实施例6、Toll样受体9在人淋巴瘤细胞的表达
1、制备人小淋巴细胞淋巴瘤
从新鲜的人小淋巴细胞淋巴瘤患者的淋巴结活检组织(经病理学鉴定)分离人小淋巴细胞淋巴瘤细胞。取活检组织，在直径为6cm的培养皿中，加5ml用含10％人的AB型血清的RPMI 1640培养基，用两片粗糙面玻璃片研磨组织，释放细胞。用不绣钢网滤过细胞。将细胞收集在50ml试管(conical tube)中，加15ml无血清RPMI 1640培养基，300×g离心10分钟。弃上清。重悬细胞，利用B淋巴细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，Germany)分离出CD5+CD20+CD23+的人小淋巴细胞淋巴瘤细胞，所得细胞的纯度在95％以上。具体操作按照Miltenyi Biotec(Bergisch Gladbach，Germany)公司提供的方法进行。利用B或T淋巴细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec)，从正常人PBMC中分离出的B或T淋巴细胞，所获得的B淋巴细胞(CD19+)和所获得的T淋巴细胞(CD3+)的纯度均在95％以上。具体操作按照Miltenyi Biotec(Bergisch Gladbach，Germany)公司提供的方法进行。
2、人小淋巴细胞淋巴瘤细胞表达TLR9的Western blots鉴定
将5×106个人小淋巴细胞淋巴瘤细胞、正常人的B淋巴细胞和T淋巴细胞分别裂解后，按常规方法进行Western blot操作。抗TLR 9抗体购自Active Motif(Carlsbad，California)。在实验中，采用了2位小淋巴细胞淋巴瘤细胞患者的小淋巴细胞淋巴瘤细胞和2位正常人外周血的B淋巴细胞和T淋巴细胞。
实施例6提供的结果表明，人小淋巴细胞淋巴瘤细胞表达TLR9，是人工合成的单链脱氧核苷酸用的靶细胞(图3)。
实施例7、人工合成的单链脱氧核苷酸诱导人小淋巴细胞淋巴瘤细胞凋亡
1制备人小淋巴细胞淋巴瘤细胞
从新鲜的人小淋巴细胞淋巴瘤患者的淋巴结活检组织(经病理学鉴定)分离人小淋巴细胞淋巴瘤细胞。取活检组织，在直径为6cm的培养皿中，加5ml用含10％人的AB型血清的RPMI1640培养基，用两片粗糙面玻璃片研磨组织，释放细胞。用不绣钢网滤过细胞。将细胞收集在50ml试管(conical tube)中，加15ml无血清RPMI1640培养基，300×g离心10分钟。弃上清。重悬细胞，利用B淋巴细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，Germany)分离出CD5+CD20+CD23+的人小淋巴细胞淋巴瘤细胞，所得细胞的纯度在95％以上。具体操作按照Miltenyi Biotec(Bergisch Gladbach，Germany)公司提供的方法进行。
2.人工合成的单链脱氧核苷酸诱导凋亡试验
采用48孔板，用含10％人的AB型血清的RPMI1640培养基培养人小淋巴细胞淋巴瘤细胞，1×106个细胞/孔。设立实验组和对照组，实验组的培养板孔中加入人工合成的单链脱氧核苷酸至终浓度3μg/ml，所采用的人工合成的单链脱氧核苷酸序列以Oligo 1-10和Oligo 2006，Oligo 2116代表，其相应序列如序列表中所示。
Oligo 1：SEQ ID NO167
Oligo 2：SEQ ID NO168
Oligo 3：SEQ ID NO135
Oligo 4：SEQ ID NO150
Oligo 5：SEQ ID NO78
Oligo 6：SEQ ID NO102
Oligo 7：SEQ ID NO89
Oligo 8：SEQ ID NO86
Oligo 9：SEQ ID NO165
Oligo 10：SEQ ID NO36
对照序列：
Oligo 2006：5’-tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt-3’
Oligo 2216：5’-gggggacgatcgtcgggggg-3’
在对照组培养板孔中加入不含人工合成的单链脱氧核苷酸的培养基。在加入上述人工合成的单链脱氧核苷酸的第3，5，7后，用TMRE(Molecular Probes Inc)(Lena Thyrell，Linn Hjortsberg，Velmurugesan Arulampalam，Theocharis Panaretakis，Sabine Uhles，MarkusDagnell，Boris Zhivotovsky，Ingo Leibiger，Dan Grande′r，and Katja Pokrovskaja.THEJOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY Vol.279，No.23，Issue of June 4，pp.24152-24162，2004)对细胞进行染色。具体方法是：将细胞和TMRE共同于37℃孵育10分钟。在TMRE染色过程中，只有存活的人小淋巴细胞淋巴瘤细胞能够着色(TMRE+)；发生凋亡的人小淋巴细胞淋巴瘤细胞不着色(TMRE-)。然后，收集细胞，利用流式细胞仪(BD USA)计数着色细胞(未凋亡细胞)和未着色细胞(凋亡细胞)。利用下述公式计算未凋亡细胞百分率：
3结果：人工合成的单链脱氧核苷酸可使人小细胞淋巴瘤细胞未凋亡细胞百分率明显降低(表1)。
4结论：人工合成的单链脱氧核苷酸能够显著诱导人淋巴瘤细胞发生凋亡，对人淋巴瘤有治疗作用。
实施例8、人工合成的单链脱氧核苷酸诱导小淋巴细胞淋巴瘤细胞表达CD40
1、制备人小淋巴细胞淋巴瘤细胞
从新鲜的人小淋巴细胞淋巴瘤患者的淋巴结活检组织(经病理学鉴定)分离人小淋巴细胞淋巴瘤细胞。取活检组织，在直径为6cm的培养皿中，加5ml用含10％人的AB型血清的RPMI 1640培养基，用两片粗糙面玻璃片研磨组织，释放细胞。用不绣钢网滤过细胞。将细胞收集在50ml试管(conical tube)中，加15ml无血清RPMI 1640培养基，300×g离心10分钟。弃上清。重悬细胞，利用B淋巴细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，Germany)分离出CD5+CD20+CD23+的人小淋巴细胞淋巴瘤细胞，所得细胞的纯度在95％以上。具体操作按照Miltenyi Biotec(Bergisch Gladbach，Germany)公司提供的方法进行。
2、人工合成的单链脱氧核苷酸刺激人B淋巴细胞白血病细胞表达CD40
采用48孔板，用含10％人的AB型血清的RPMI1640培养基培养人慢性B淋巴细胞白血病细胞，1×106个细胞/孔。设立培养基对照组和人工合成的单链脱氧核苷酸组。在人工合成的单链脱氧核苷酸组，每孔加入人工合成的单链脱氧核苷酸至终浓度3μg/ml，所采用的人工合成的单链脱氧核苷酸序列以Oligo 1-10和Oligo 2006，Oligo 2116代表，其相应序列如序列表中所示。
Oligo 1：SEQ ID NO167
Oligo 2：SEQ ID NO168
Oligo 3：SEQ ID NO135
Oligo 4：SEQ ID NO150
Oligo 5：SEQ ID NO78
Oligo 6：SEQ ID NO102
Oligo 7：SEQ ID NO89
Oligo 8：SEQ ID NO86
Oligo 9：SEQ ID NO165
Oligo 10：SEQ ID NO36
对照序列：
Oligo 2006：5’-tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt-3’
Oligo 2216：5’-gggggacgatcgtcgggggg-3’
在加入人工合成的单链脱氧核苷酸72小时后，用FITC-CD40抗体(Becton Dickinson)对细胞进行染色。然后用利用流式细胞仪(BD USA)测定结果。
结果(图-4)表明，人工合成的单链脱氧核苷酸显著刺激人小淋巴细胞淋巴瘤细胞表达CD40，因而可产生抗B细胞肿瘤的作用，这些作用表现在但不限于下述的方面：
1)淋巴细胞肿瘤细胞的凋亡；
2)使B淋巴细胞肿瘤细胞的生长受到抑制；
3)增强B淋巴细胞肿瘤细胞的免疫原性，促进诱生B淋巴细胞肿瘤细胞特异性的胞毒性T淋巴细胞(CTL)。
序列表
<110>北京迪威华宇生物技术有限公司
<120>对人B细胞肿瘤有治疗作用的人工合成的单链脱氧核苷酸
<210>1
<211>22
<212>DNA
<213>Artificial
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<212>DNA
<213>Artificial
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<212>DNA
<213>Artificial
<400>3
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<210>4
<211>22
<212>DNA
<213>Artificial
<400>4
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<212>DNA
<213>Artificial
<400>5
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<211>20
<212>DNA
<213>Artificial
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<211>20
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<213>Artificial
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<211>20
<212>DNA
<213>Artificial
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<211>24
<212>DNA
<213>Artificial
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<211>20
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<213>Artificial
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<212>DNA
<213>Artificial
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<211>24
<212>DNA
<213>Artificial
<400>12
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<211>22
<212>DNA
<213>Artificial
<400>13
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<211>22
<212>DNA
<213>Artificial
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<212>DNA
<213>Artificial
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<212>DNA
<213>Artificial
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<212>DNA
<213>Artificial
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<212>DNA
<213>Artificial
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gtcgttatcg ttttttcgta gggggg 26
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<212>DNA
<213>Artificial
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<213>Artificial
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<212>DNA
<213>Artificial
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<212>DNA
<213>Artificial
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<211>24
<212>DNA
<213>Artificial
<400>23
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<210>24
<211>25
<212>DNA
<213>Artificial
<400>24
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<210>25
<211>25
<212>DNA
<213>Artificial
<400>25
gggggacgtt atcgtattgg ggggg 25
<210>26
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<212>DNA
<213>Artificial
<400>26
ggggtcgtcg tttgtcgtgt gtcgttgggg gg 32
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<211>20
<212>DNA
<213>Artificial
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acgatcgatc gatcgggggg 20
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<212>DNA
<213>Artificial
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<211>24
<212>DNA
<213>Artificial
<400>29
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<211>21
<212>DNA
<213>Artificial
<400>30
ggggtcgttg ccgtcggggg g 21
<210>31
<211>24
<212>DNA
<213>Artificial
<400>31
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<210>32
<211>28
<212>DNA
<213>Artificial
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ttcgttgcat cgatgcatcg ttgggggg 28
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<211>21
<212>DNA
<213>Artificial
<400>33
ggggacgata cgtcgggggg g 21
<210>34
<211>21
<212>DNA
<213>Artificial
<400>34
ggggacgata tcgatggggg g 21
<210>35
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial
<400>35
ggacgatcga tcgtgggggg 20
<210>36
<211>21
<212>DNA
<213>Artificial
<400>36
tcggggacga tcgtcggggg g 21
<210>37
<211>24
<212>DNA
<213>Artificial
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gggggatcga tatcgatcgg gggg 24
<210>38
<211>22
<212>DNA
<213>Artificial
<400>38
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<211>24
<212>DNA
<213>Artificial
<400>39
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<210>40
<211>24
<212>DNA
<213>Artificial
<400>40
ggtgcatcgt acgatgcagg gggg 24
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<211>22
<212>DNA
<213>Artificial
<400>41
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<211>22
<212>DNA
<213>Artificial
<400>42
gggggggtcg atcgatgggg gg 22
<210>43
<211>22
<212>DNA
<213>Artificial
<400>43
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<210>44
<211>17
<212>DNA
<213>Artificial
<400>44
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<210>45
<211>24
<212>DNA
<213>Artificial
<400>45
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<211>26
<212>DNA
<213>Artificial
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<212>DNA
<213>Artificial
<400>47
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<212>DNA
<213>Artificial
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<210>49
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial
<400>49
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<212>DNA
<213>Artificial
<400>50
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<211>14
<212>DNA
<213>Artificial
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<212>DNA
<213>Artificial
<400>52
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<211>14
<212>DNA
<213>Artificial
<400>53
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<210>54
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<212>DNA
<213>Artificial
<400>54
ttaccggtta acgttggccg gcc 23
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<211>23
<212>DNA
<213>Artificial
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accggttaac gttgtccccg ggg 23
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<211>24
<212>DNA
<213>Artificial
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<212>DNA
<213>Artificial
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<212>DNA
<213>Artificial
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<212>DNA
<213>Artificial
<400>59
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<211>21
<212>DNA
<213>Artificial
<400>60
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<211>20
<212>DNA
<213>Artificial
<400>61
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<210>62
<211>21
<212>DNA
<213>Artificial
<400>62
atcgtcgact ctcgtgttct c 21
<210>63
<211>23
<212>DNA
<213>Artificial
<400>63
tgcagcttgc tgcttgctgc ttc 23
<210>64
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial
<400>64
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<210>65
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial
<400>65
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<210>66
<211>26
<212>DNA
<213>Artificial
<400>66
gggggcgtcg ttttcgtcga cgaatt 26
<210>67
<211>24
<212>DNA
<213>Artificial
<400>67
actcgagacg cccgttgata gctt 24
<210>68
<211>24
<212>DNA
<213>Artificial
<400>68
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<212>DNA
<213>Artificial
<400>69
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<211>18
<212>DNA
<213>Artificial
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<211>18
<212>DNA
<213>Artificial
<400>71
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<212>DNA
<213>Artificial
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<212>DNA
<213>Artificial
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<212>DNA
<213>Artificial
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<212>DNA
<213>Artificial
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<210>76
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<212>DNA
<213>Artificial
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<212>DNA
<213>Artificial
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<212>DNA
<213>Artificial
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<212>DNA
<213>Artificial
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<212>DNA
<213>Artificial
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<211>16
<212>DNA
<213>Artificial
<400>81
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<211>17
<212>DNA
<213>Artificial
<400>82
tcgttgccgt cgggggg 17
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<211>18
<212>DNA
<213>Artificial
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tcgttgccgt cggggggg 18
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<211>19
<212>DNA
<213>Artificial
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<211>20
<212>DNA
<213>Artificial
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<211>26
<212>DNA
<213>Artificial
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<211>26
<212>DNA
<213>Artificial
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<210>88
<211>26
<212>DNA
<213>Artificial
<400>88
tcgtcgggtg cgtcgacgca gggggg 26
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<211>24
<212>DNA
<213>Artificial
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tcgtcgggtg cgatcgcagg gggg 24
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<211>30
<212>DNA
<213>Artificial
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<211>24
<212>DNA
<213>Artificial
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tcgtcgtgcg acgtcgcagg gggg 24
<210>92
<211>23
<212>DNA
<213>Artificial
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tcgtcgcaga acgttctggg ggg 23
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<211>21
<212>DNA
<213>Artificial
<400>93
tcgtgcgacg tcgcaggggg g 21
<210>94
<211>25
<212>DNA
<213>Artificial
<400>94
tcgtgcgacg atcgtcgcag ggggg 25
<210>95
<211>25
<212>DNA
<213>Artificial
<400>95
tcgtatgcat cgatgcatag ggagg 25
<210>96
<211>21
<212>DNA
<213>Artificial
<400>96
tcgtgcatcg atgcaggggg g 21
<210>97
<211>18
<212>DNA
<213>Artificial
<400>97
tcgaaacgtt tcgggggg 18
<210>98
<211>19
<212>DNA
<213>Artificial
<400>98
tcggacgatc gtcgggggg 19
<210>99
<211>22
<212>DNA
<213>Artificial
<400>99
tcgagcgatc gctcgagggg gg 22
<210>100
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial
<400>100
tcgtcgcttt gtcgttgggg 20
<210>101
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial
<400>101
tcgtcgtttt gtcgttgggg 20
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<211>26
<212>DNA
<213>Artificial
<400>102
tcgtcgggtg cgacgtcgca gggggg 26
<210>103
<211>27
<212>DNA
<213>Artificial
<400>103
tcgtcgggtg cgacgatcgt cgggggg 27
<210>104
<211>27
<212>DNA
<213>Artificial
<400>104
tcgtcgtttg catcgatgca ggggggg 27
<210>105
<211>26
<212>DNA
<213>Artificial
<400>105
tcgtcgtttt gacgatcgtc gggggg 26
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<211>15
<212>DNA
<213>Artificial
<400>106
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<211>21
<212>DNA
<213>Artificial
<400>107
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<210>108
<211>24
<212>DNA
<213>Artificial
<400>108
tcgttgcgct cccatgccgg gggg 24
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<211>20
<212>DNA
<213>Artificial
<400>109
tcgtcgtttc gtcgttgggg 20
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<211>27
<212>DNA
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<400>110
tcgttgtcgt ttcgctgccg gcggggg 27
<210>111
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<212>DNA
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<400>111
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<210>112
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial
<400>112
tgctgctttg ctgcttgggg 20
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<211>24
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<213>Artificial
<400>113
aacgttcgac gtcgaacggg gggg 24
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<213>Artificial
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aacgacgacg ttggggg 17
<210>115
<211>22
<212>DNA
<213>Artificial
<400>115
tcgtaacgtt gtttttaacg tt 22
<210>116
<211>21
<212>DNA
<213>Artificial
<400>116
tcgtcgtata cgacgatcgt t 21
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<211>20
<212>DNA
<213>Artificial
<400>117
tcgtcgtttg cgttgtcgtt 20
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<211>18
<212>DNA
<213>Artificial
<400>118
tcctgtcgtt ttgtcgtt 18
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<212>DNA
<213>Artificial
<400>119
tcgtcgttgt cgttcgct 18
<210>120
<211>25
<212>DNA
<213>Artificial
<400>120
tcgtcgttac cgatgacgtc gccgt 25
<210>121
<211>29
<212>DNA
<213>Artificial
<400>121
tcgtcgtttg catcgatgca gtcgtcgtt 29
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<211>21
<212>DNA
<213>Artificial
<400>122
tcgcctcgtc gccttcgagc g 21
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<212>DNA
<213>Artificial
<400>123
tcgtgtgcgt gccgttgggt 20
<210>124
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial
<400>124
tcgtcgaggg cgccggtgac 20
<210>125
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<212>DNA
<213>Artificial
<400>125
tcgtcgccgg tgggggtgtg 20
<210>126
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial
<400>126
tcgtcgtacg caattgtctt 20
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<211>20
<212>DNA
<213>Artificial
<400>127
tcgcccaccg gtgggggggg 20
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<212>DNA
<213>Artificial
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<213>Artificial
<400>129
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<213>Artificial
<400>131
tcgaggacaa gattctcgtg c 21
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<213>Artificial
<400>132
tcgaggacaa gattctcgtg caggcc 26
<210>133
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<212>DNA
<213>Artificial
<400>133
tcgtgcaggc caacgaggcc g 21
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<212>DNA
<213>Artificial
<400>134
tcgttgccgt cggccc 16
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<213>Artificial
<400>135
tcggcacgcg acgtgctggc cgtcgtttcc 30
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<212>DNA
<213>Artificial
<400>136
tcgttgccgt cggccccccc cc 22
<210>137
<211>19
<212>DNA
<213>Artificial
<400>137
tcgttgccgt cggcccccc 19
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<213>Artificial
<400>138
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<213>Artificial
<400>139
tcgttgccgt cggcccc 17
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<213>Artificial
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tcgttgccgt cggccccccc 20
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<213>Artificial
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<213>Artificial
<400>142
tcggcacgcg acgtgctggc cgtcgtt 27
<210>143
<211>21
<212>DNA
<213>Artificial
<400>143
tcgtcgcgcc gtcacggggg g 21
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<212>DNA
<213>Artificial
<400>144
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<212>DNA
<213>Artificial
<400>145
tcgtcgccgt tgggcggg 18
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<211>21
<212>DNA
<213>Artificial
<400>146
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<212>DNA
<213>Artificial
<400>147
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<212>DNA
<213>Artificial
<400>148
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<213>Artificial
<400>149
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<210>150
<211>24
<212>DNA
<213>Artificial
<400>150
tcgtcgtcgt cgttgtcgtt gggg 24
<210>151
<211>15
<212>DNA
<213>Artificial
<400>151
tcgttcgggg tgccg 15
<210>152
<211>18
<212>DNA
<213>Artificial
<400>152
tcgttcgggg taacgatt 18
<210>153
<211>17
<212>DNA
<213>Artificial
<400>153
tcgttcgggg taacgtt 17
<210>154
<211>17
<212>DNA
<213>Artificial
<400>154
tcgttcgggg taccgat 17
<210>155
<211>23
<212>DNA
<213>Artificial
<400>155
tcgtacggcc gccgtacggc ggg 23
<210>156
<211>23
<212>DNA
<213>Artificial
<400>156
tcgcgtcgac tcccctcgag ggg 23
<210>157
<211>24
<212>DNA
<213>Artificial
<400>157
tcgtcgtcga ctcgtggtcg gggg 24
<210>158
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial
<400>158
tcgggcgccc gatcgggggg 20
<210>159
<211>19
<212>DNA
<213>Artificial
<400>159
tcgtcggtct ttcgaaatt 19
<210>160
<211>18
<212>DNA
<213>Artificial
<400>160
tcgtgacgtc ctcgagtt 18
<210>161
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial
<400>161
tcgtctttcg actcgttctc 20
<210>162
<211>18
<212>DNA
<213>Artificial
<400>162
tcgtcgtttt gcgttctc 18
<210>163
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial
<400>163
tcgactttcg tcgttctgtt 20
<210>164
<211>19
<212>DNA
<213>Artificial
<400>164
tcgtcgtttc gtcgttctc 19
<210>165
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial
<400>165
tcgtcgtcgt cgttgtcgtt 20
<210>166
<211>19
<212>DNA
<213>Artificial
<400>166
tcgttctcga ctcgttctc 19
<210>167
<211>23
<212>DNA
<213>Artificial
<400>167
tcgacgttcg tcgttcgtcg ttc 23
<210>168
<211>21
<212>DNA
<213>Artificial
<400>168
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<210>169
<211>21
<212>DNA
<213>Artificial
<400>169
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<210>170
<211>21
<212>DNA
<213>Artificial
<400>170
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<210>171
<211>28
<212>DNA
<213>Artificial
<400>171
tcgtcgtttc gtagtcgttg acgtcggg 28
<210>172
<211>24
<212>DNA
<213>Artificial
<400>172
tcgtcggacg ttttccgacg ttct 24
<210>173
<211>26
<212>DNA
<213>Artificial
<400>173
tcgtcgtttt cgtcgttttc gtcgtt 26
<210>174
<211>22
<212>DNA
<213>Artificial
<400>174
tcgtcgtttg tcgtgtgtcg tt 22
<210>175
<211>30
<212>DNA
<213>Artificial
<400>175
tcgtcgttgg tcggggtcgt tggggtcgtt 30
<210>176
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial
<400>176
tcgtcgtttc gtctctcgtt 20
<210>177
<211>21
<212>DNA
<213>Artificial
<400>177
tcgtcgtttt gctgcgtcgt t 21
<210>178
<211>21
<212>DNA
<213>Artificial
<400>178
tcgagcgttt tcgctcgaat t 21
<210>179
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<213>Artificial
<400>179
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<210>180
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<213>Artificial
<400>180
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<213>Artificial
<400>181
tatcgatgtt ttcgtcgtcg ttgggggg 28
<210>182
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial
<400>182
tcgactttcg tcgttctgtt 20
<210>183
<211>19
<212>DNA
<213>Artificial
<400>183
tcgtcgtttc gtcgttctc 19
<210>184
<211>23
<212>DNA
<213>Artificial
<400>184
tcgacgttcg tcgttcgtcg ttc 23
<210>185
<211>26
<212>DNA
<213>Artificial
<400>185
tcgtcgtttt cgtcgttttc gtcgtt 26
Claims (24)
1、人工合成的单链脱氧核苷酸，它们由含一个或多个由胞嘧啶和鸟嘌呤通过磷酸连接成的二核苷酸的单链DNA分子构成。
2、人工合成的单链脱氧核苷酸，它们的磷酸二酯键可以是非硫化的，也可以被部分或全部全硫化的。人工合成的单链脱氧核苷酸可以经化学修饰，其碱基可以被稀有碱基替换。
3、人工合成的单链脱氧核苷酸包括但不限于序列表SEQ ID NO：1-185所示的序列以及根据实施例1所示公式所能推出的序列。
4、人工合成的单链脱氧核苷酸包括但不限于实施例中Oligo：1-10所代表的序列和Oligo：2006所代表的序列。
5、以权利要求1-4中任一项所述的单链脱氧核苷酸为核心结构的人工合成的单链脱氧核苷酸。
6、以权利要求1-4中任一项所述的单链脱氧核苷酸为核心结构的改变或添加了一到数个碱基的单链脱氧核苷酸。
7、按照权利要求1-6中任一项所述的单链脱氧核苷酸，它们能诱导人B细胞肿瘤细胞发生凋亡。
8、按照权利要求1-6中任一项所述的单链脱氧核苷酸，它们能诱导人B细胞白血病细胞发生凋亡。
9、按照权利要求1-6中任一项所述的单链脱氧核苷酸，它们能诱导人B细胞淋巴瘤细胞发生凋亡。
10、按照权利要求1-6中任一项所述的单链脱氧核苷酸，它们能增强人B细胞肿瘤细胞表达CD40，因而使人B细胞肿瘤细胞的生长受到抑制，增强人B细胞肿瘤细胞的免疫原性，促进诱生人B细胞肿瘤细胞特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。
11、按照权利要求1-6中任一项所述的单链脱氧核苷酸，它们能增强人B细胞白血病细胞表达CD40，因而使人B细胞白血病细胞的生长受到抑制，增强人B细胞白血病细胞的免疫原性，促进诱生人B细胞白血病细胞特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。
12、按照权利要求1-6中任一项所述的单链脱氧核苷酸，它们能增强人淋巴瘤细胞表达CD40，因而使人淋巴瘤细胞的生长受到抑制，增强人B细胞淋巴瘤细胞的免疫原性，促进诱生人B细胞淋巴瘤细胞特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。
13、按照权利要求1-6中任一项所述的单链脱氧核苷酸，它们能治疗人B细胞肿瘤。
14、按照权利要求1-6中任一项所述的单链脱氧核苷酸，它们能治疗人B细胞白血病。
15、按照权利要求1-6中任一项所述的单链脱氧核苷酸，它们能治疗人B细胞淋巴瘤。
13、用任何人工合成的单链脱氧核苷酸治疗人B细胞肿瘤的技术方法和技术设想。
14、用任何人工合成的单链脱氧核苷酸治疗人B淋巴细胞性白血病的技术方法和技术设想。
15、用任何人工合成的单链脱氧核苷酸治疗人B细胞淋巴瘤的技术方法和技术设想。
16、用任何人工合成的单链脱氧核苷酸通过诱导人B细胞肿瘤细胞发生凋亡治疗人B细胞肿瘤的技术方法和技术设想。
17、用任何人工合成的单链脱氧核苷酸通过诱导人B淋巴细胞性白血病细胞发生凋亡治疗人B淋巴细胞性白血病的技术方法和技术设想。
18、用任何人工合成的单链脱氧核苷酸通过诱导人B细胞淋巴瘤细胞发生凋亡治疗人B细胞淋巴瘤的技术方法和技术设想。
19、用任何人工合成的单链脱氧核苷酸通过增强人B细胞肿瘤细胞表达CD40而对人B细胞肿瘤有治疗作用的技术方法和技术设想。
20、用任何人工合成的单链脱氧核苷酸通过增强人B淋巴细胞性白血病细胞表达CD40而对人B淋巴细胞性白血病有治疗作用的技术方法和技术设想。
21、用任何人工合成的单链脱氧核苷酸通过增强人B细胞淋巴瘤细胞表达CD40而对人B细胞淋巴瘤有治疗作用的技术方法和技术设想。
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