CN1195859C

CN1195859C - 修饰化人源粒细胞－集落刺激因子及其制备方法

Info

Publication number: CN1195859C
Application number: CNB008100942A
Authority: CN
Inventors: 权世昌; 郑圣烨; 裴城敏; 李宽淳
Original assignee: Hanmi Pharmaceutical Industries Co Ltd
Current assignee: Hanmi Holdings Co Ltd
Priority date: 1999-07-08
Filing date: 2000-07-07
Publication date: 2005-04-06
Anticipated expiration: 2020-07-07
Also published as: EP1194575A1; RU2232772C2; EP1194575B2; EP1194575B1; DK1194575T3; KR100356140B1; US20080064066A1; US7704709B2; DK1194575T4; ES2243275T3; JP2003504069A; DE60021188T3; ATE299187T1; BRPI0012265B8; ES2243275T5; DE60021188D1; AU757147B2; AU757147C; PT1194575E; US20040224393A1

Abstract

培养用包含一个编码修饰化hG-CSF基因的表达载体转化的微生物，生产修饰化人源粒细胞一集落刺激因子(hG-CSF)，并将修饰化hG-CSF分泌到周质，上述修饰化hG-CSF是通过用其它的氨基酸代替野生型hG-CSF(SEQ ID NO：2)的第1个，第2个，第3个和第17个中至少一个氨基酸获得的。

Description

修饰化人源粒细胞—集落刺激因子及其制备方法

发明领域

本发明涉及修饰化人源粒细胞—集落刺激因子(hG-CSF)，编码上述多肽的基因，包含上述基因的载体，使用上述载体转化的微生物以及使用上述微生物生产该修饰化hG-CSF的方法。

发明背景

术语集落刺激因子(CSF)包括粒细胞/巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF)，巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，它们是由T细胞，巨噬细胞，成纤维细胞与内皮细胞产生的。GM-CSF刺激粒细胞或巨噬细胞的干细胞以诱导粒细胞或巨噬细胞克隆的分化与增殖。M-CSF和G-CSF主要是分别诱导巨噬细胞与粒细胞克隆的形成。在体内，G-CSF诱导骨髓白细胞的分化并增强成熟粒细胞的功能，因此，它在治疗白血病方面的医学重要性已经被充分证实。

人源G-CSF(hG-CSF)是一个包含174或177个氨基酸的蛋白质，其中174个氨基酸的种类具有更高的嗜中性粒细胞-增强活性(Morishita，K.et al.， J.Biol.Chem.， 262，15208-15213(1987))。包含174个氨基酸的hG-CSF的氨基酸序列如图1所示。通过对编码上述hG-CSF的基因操作，已经进行了很多研究用以大量生产hG-CSF。

例如，Chugai Pharmaceuticals有限公司(日本)已经公开了hG-CSF的氨基酸序列与编码基因(韩国专利公开号91-5624和92-2312)，并报道了通过基因重组方法制备具有hG-CSF活性蛋白的方法(韩国专利Nos.47178，53723和57582)。在该制备方法中，通过使用包含编码hG-CSF多核苷酸的基因组DNA或cDNA，在哺乳动物细胞中产生糖基化hG-CSF。糖基化的hG-CSF含有一个O-糖苷键的糖链，但是，已知上述的糖链对hG-CSF的活性并不是必需的(Lawrence，M.et al.， Science， 232，61(1986))。而且，众所周知，使用哺乳动物细胞生产糖基化的hG-CSF需要昂贵的材料和设备，因此该方法在经济上是不可行的。与此同时，有许多通过使用微生物，例如大肠杆菌来生产非糖基化hG-CSF的尝试。在这些研究中，由于微生物中所使用的ATG起始密码子，获得的是在其N端附加了一个蛋氨酸残基的具有175或178个氨基酸的hG-CSF。但是，当重组hG-CSF被用药时，这个附加的蛋氨酸残基会在人体内引起不良免疫反应(欧洲专利发表No.256,843)。此外，在大肠杆菌中产生的大部分包含蛋氨酸的hG-CSF，作为不溶的包涵体沉淀在细胞中，它们必须通过一个产量损失很大的再折叠过程转变为有活性的形式。在此方面，五个存在于野生型hG-CSF中的半胱氨酸残基，有四个参与形成二硫键，而剩余的一个在再折叠过程中参与hG-CSF产物的聚合，降低了产量。

近来，为了解决在微生物细胞中生产外源蛋白的问题，已经进行了很多努力，以得到一个基于目标蛋白跨过微生物细胞膜进入胞外区域的有效分泌的方法。

例如，在使用信号肽的方法中，目标蛋白以融合蛋白的形式表达，其中信号肽加在该蛋白的N端。当融合蛋白跨过细胞膜时，信号肽通过一个酶被除去，目标蛋白以成熟形式被分泌出来。这个分泌生产的方法是有利的，因为产生的氨基酸序列通常是与野生型一致的。然而，由于在跨膜运输和随后的纯化过程中不能令人满意的效率，使分泌生产方法的产量非常低。这与一个广为人知的事实相符：即在原核生物中以分泌形式生产哺乳动物蛋白，其产量非常低：迄今为止，在N端没有附加蛋氨酸残基的可溶性hG-CSF的有效表达和分泌的微生物方法还没有报道。

本发明人曾经报道过在hG-CSF生产方法中，通过修饰抗热大肠杆菌肠毒素II的信号肽(韩国专利公开发表No.2000-19788)所制备的新型分泌信号肽的应用。具体地，制备一个由附加在修饰的抗热大肠杆菌肠毒素II信号肽3’端的hG-CSF基因构成的表达载体，通过使用该表达载体转化大肠杆菌表达有生物活性的，成熟的hG-CSF。但是，大部分表达的hG-CSF聚集在细胞质中，而不是在周质中。

本发明人进一步努力发展了一个在微生物中生产hG-CSF的有效分泌的方法，并发现通过用其他的氨基酸替代野生型hG-CSF的至少一个氨基酸，特别是第17个的半胱氨酸残基，得到的修饰化hG-CSF保持野生型的生物活性，而且这个在N端没有蛋氨酸残基的修饰化hG-CSF，当使用合适的分泌信号肽时，能够被微生物有效的表达和分泌。

发明概述

因此，本发明的一个目的是提供可通过微生物进行有效生产的修饰化人源粒细胞—集落刺激因子(hG-CSF)..

本发明的另一个目的是提供编码上述多肽的基因和包含上述基因的载体。

本发明的再一个目的是提供用上述载体转化的微生物。

本发明还有一个目的是提供用上述微生物生产氨基端没有附加蛋氨酸残基的hG-CSF的方法。

依照本发明的一个方面，提供了一种修饰化hG-CSF，特征在于野生型hG-CSF的第1，第2，第3和第17位氨基酸中至少有一个被其它氨基酸替换。

附图简述

通过下面有关本发明的具体描述，结合下面的附图，本发明前述的以及其它目的和特征将更加明显；附图分别为：

图1：包含174个氨基酸残基的野生型人源粒细胞刺激因子的核苷酸与氨基酸序列(SEQ ID NOS：1和2)；

图2：构建载体pT-CSF的流程；

图3：构建载体pT14S1SG的流程；

图4：构建载体pT14SS1SG的流程；

图5：构建载体pT140SSG-4T22Q的流程；

图6：构建载体pT14SS1S17SEG的流程

图7：构建载体pTO1SG的流程；

图8：构建载体pBADG的流程；

图9：构建载体pBAD2M3VG的流程；

图10a和10b：west blot分析的结果，肯定hG-CSF与重组细胞系中修饰化hG-CSF的表达以及表达蛋白各自的分子量；和

图11：hG-CSF和产生于重组细胞系中的修饰化hG-CSF的细胞活性。

发明详述

本发明中的修饰化hG-CSF是通过用其它的氨基酸代替野生型hG-CSF(SEQ ID NO：2)中一个或多个氨基酸，优选替换其中第1、第2、第3和第17位氨基酸而衍生得到的。更优选的是用在中性pH值下不带电荷的氨基酸代替hG-CSF中的第17个氨基酸获得的多肽。这些优选的修饰化hG-CSF的实例都有野生型hG-CSF的氨基酸序列，除了：

(a)第1个氨基酸为Ser(丝氨酸)；

(b)第1个氨基酸为Ser(丝氨酸)以及第17个氨基酸为X；

(c)第2个氨基酸为Met(蛋氨酸)以及第3个氨基酸为Val(缬氨酸)；

(d)第2个氨基酸为Met(蛋氨酸)，第3个氨基酸为Val(缬氨酸)以及第17个氨基酸为X；或者

(f)第17个氨基酸为X，

其中X为中性pH值时不带电荷的氨基酸，优选Ser(丝氨酸)，Thr(苏氨酸)，Ala(丙氨酸)或Gly(甘氨酸)，更优选Ser(丝氨酸)。

hG-CSF中的五个半胱氨酸残基中有四个参与形成二硫键，而第17位半胱氨酸残基在自然状态下保持非成键(状态)。但是当大量的hG-CSF在重组细胞中表达时，第17位半胱氨酸残基参与分子内二硫键的形成，导致在细胞质中积累凝聚化的hG-CSF。而本发明中修饰化hG-CSF在第17位的氨基酸不是半胱氨酸，因此没有这种问题，而且能用适当转化的微生物通过分泌方法进行有效生产。

本发明中修饰化hG-CSF可以被一个基因编码，该基因包含根据遗传密码从修饰化hG-CSF的氨基酸序列推断得到的核苷酸序列。众所周知，由于密码子的简并性，几个不同的密码子可以编码一个特定的氨基酸，因此本发明包括此范围中从修饰化hG-CSF氨基酸序列推断得到的所有的核苷酸序列。优选的是，修饰化hG-CSF基因序列包括一个或多个大肠杆菌偏爱的密码子。

这样，制备的基因可以插入到传统的载体中获得一个表达载体，随后该载体可被转入到合适的宿主中，例如大肠杆菌。表达载体可以进一步包含一个信号肽。典型的信号肽包括抗热大肠杆菌肠毒素II信号肽(SEQID NO：53)，修饰化抗热大肠杆菌肠毒素II信号肽(SEQ ID NO：54)，β-内酰胺酶信号肽(SEQ ID NO：24)，基因III信号肽(SEQ ID NO：42)或其修饰化信号肽，但在本发明中使用的信号肽没有限制。本发明中制备表达载体所用的启动子可以是任何能在微生物宿主中表达外源蛋白的启动子。特别是当异源蛋白在大肠杆菌中表达时，lac，Tac和阿拉伯糖启动子为优选。

本发明中示范的表达载体包括pT14SS1SG，pT14SS1S17SEG，pTO1SG，pTO1S17SG，pTO17SG，pTO17TG，pTO17AG，pTO17GG，pBAD2M3VG，pBAD17SG和pBAD2M3V17SG。

本发明中的表达载体可以根据传统的转化方法(Sambrook et al.，同上)转入微生物，例如大肠杆菌BL21(DE3)(Novagen)，大肠杆菌XL-1blue(Novagen)，获得转化子大肠杆菌BL21(DE3)/pT14SS1SG(HM10310)，大肠杆菌BL21(DE3)/pT14SS1S17SEG(HM 10311)，大肠杆菌BL21(DE3)/pTO1SG(HM 10409)，大肠杆菌BL21(DE3)/pTO1S17SG(HM 10410)，大肠杆菌BL21(DE3)/pTO17SG(HM 10411)，大肠杆菌BL21(DE3)/pTO17TG(HM 10413)，大肠杆菌BL21(DE3)/pTO17AG(HM 10414)，大肠杆菌BL21(DE3)/pTO17GG(HM 10415)，大肠杆菌BL21(DE3)/pBAD2M3VG(HM 10510)，大肠杆菌BL21(DE3)/pBAD17SG(HM 10511)和大肠杆菌BL21(DE3)/pBAD2M3V17SG(HM 10512)。在这些转化微生物中，优选转化子大肠杆菌BL21(DE3)/pT14SS1S17SEG(HM 10311)，大肠杆菌BL21(DE3)/pTO1S17SG(HM10410)，大肠杆菌BL21(DE3)/pTO17SG(HM 10411)和大肠杆菌BL21(DE3)/pBAD2M3VG(HM 10510)，依据国际承认的用于专利程序的微生物保藏的布达佩斯条约中的条款，这些转化子于1999年3月24日保藏在韩国微生物保藏中心(KCCM)(地址；食品工业系，工程学院，Yonsei University，Sodaemun-gu，汉城120-749，大韩民国)，保藏号分别为KCCM-10154，KCCM-10151，KCCM-10152和KCCM-10153。

本发明中的修饰化hG-CSF蛋白可以通过培养转化子微生物，表达编码修饰化hG-CSF蛋白的基因，分泌修饰化hG-CSF到周质并且从周质中回收修饰化hG-CSF蛋白来生产。转化子微生物可根据传统方法进行培养(Sambrook et al.，同上)。对微生物培养物可通过离心或过滤来收集那些分泌修饰化hG-CSF蛋白的微生物。转化微生物可根据传统的方法(Ausubel，F.M.et al.， Current Protocols in Molecμlar Biology，(1989))进行破碎以获得周质溶液。例如，微生物可在低渗溶液，比如蒸馏水中，通过渗透压进行破碎。在周质溶液中回收修饰化hG-CSF可通过传统方法进行操作(Sambrook et al.，同上)，如离子交换层析，凝胶过滤柱层析或免疫柱层析。例如，hG-CSF可通过羧甲基-琼脂糖凝胶(CM-Sepharose)柱层析与苯基-琼脂糖凝胶(Phenyl Sepharose)柱层析的连续操作进行纯化。

根据本发明所生产的修饰化hG-CSF蛋白在N端没有蛋氨酸化，并具有等于或高于野生型hG-CSF的生物活性。因此它可以有很多用途。

以下的实施例将在不限定范围的情况下进一步阐明本发明。

实施例1：制备编码hG-CSF的基因

使用hG-CSF的模板(R&D系统，美国)，通过PCR制备编码hG-CSF的cDNA基因。所用的引物是由美国专利No.4,810,643所描述的。

为了制备编码成熟hG-CSF的cDNA基因，载体pUC19-G-CSF(Biolabs，美国)用引物SEQ ID NOS：3和4进行PCR反应。设计的引物SEQ ID NO：3在成熟hG-CSF第1位氨基酸(苏氨酸)密码子的上游提供一个NdeI限制性内切酶位点(5’-CATATG-3’)，引物SEQ IDNO：4在其终止密码子的下游提供一个BamHI限制性内切酶位点(5’-GGATCC-3’)。

扩增的hG-CSF基因用NdeI和BamHI酶切，以得到编码成熟hG-CSF的基因。该hG-CSF基因插入到载体pET14b(Novagen，美国)的NdeI/BamHI部位，获得载体pT-CSF。

图2所示的是以上构建载体pT-CSF的流程。

实施例2：构建包含编码大肠杆菌肠毒素II信号肽与修饰化hG-CSF基因的载体

(步骤1)构建大肠杆菌肠毒素II信号肽基因

为了制备大肠杆菌肠毒素II信号肽基因，根据大肠杆菌肠毒素II信号肽的核酸序列设计一对互补的寡核苷酸SEQ ID NOS：5和6，用DNA合成仪(Model 380B，应用生物系统公司，美国)进行合成。

上述设计的寡核苷酸在大肠杆菌肠毒素II起始密码子上游提供一个BspHI限制性内切酶位点(与NcoI限制性内切酶位点互补)，并在另一端通过无意改变引入一个MluI限制性内切酶位点。

两条寡核苷酸在95℃退火，获得含有编码大肠杆菌肠毒素II信号肽(STII基因)的核酸序列的平端DNA片段。

STII基因插入到载体pUC19(Biolabs，美国)的Smal位点，得到载体pUC19ST。

(步骤2)制备编码STII/hG-CSF的基因

为了制备编码STII/hG-CSF的基因，在制备实施例1中获得的载体pT-CSF用引物SEQ ID NOS：7和8进行PCR反应。引物SEQ ID NO：7设计为用丝氨酸密码子替代hG-CSF的第1个密码子，而引物SEQ IDNO：8在其终止密码子的下游提供一个BamHI限制性内切酶位点(5’-GGATCC-3’)。

扩增的DNA片段用MluI和BamHI酶切，然后插入到步骤1中所获得的pUCl9ST的MluI/BamHI部位，获得载体pUC19S1SG。这样获得的载体pUC19S1SG包含一个编码STII/hG-CSF的基因(被命名为STII-hG-CSF基因)。

载体pUC19S1SG用BspHI和BamHI酶切，获得一个DNA片段(522bp)。该DNA片段插入到载体pET14b(Novagen，美国)的NcoI/BamHI部位，得到载体pT14S1SG。

图3描述上述构建载体pT14S1SG的流程。

(步骤3)将大肠杆菌肠毒素II Shine-Dalgarno序列加入到STII-hG-CSF基因中

步骤2中获得的载体pT14S1SG用引物SEQ ID NOS：9和10进行PCR反应。引物SEQ ID NO：9设计为提供一个大肠杆菌肠毒素II Shine-Dalgarno序列(命名为STII SD序列)和XbaI限制性内切酶位点，而引物SEQ ID NO：10在成熟hG-CSF的终止密码子的下游提供一个BamHI限制性内切酶位点，以获得一个包含STII SD和STII-hG-CSF基因的DNA片段(STII SD-STII-hCSF)。

STII SD-STII-hCSF片段用XbaI和BamHI酶切，然后插入到载体pET14b(Novagen，美国)的XbaI/BamHI部位，得到载体pT14SS1SG。

图4描述上述构建载体pT14SS1SG的流程。

用载体pT14SS1SG转化大肠杆菌BL21(DE3)(Stratagene，美国)，获得转化子，命名为大肠杆菌HM 10310。

(步骤4)构建包含编码STII/hG-CSF融合蛋白基因的载体

依照定点突变，步骤3中所获得的质粒pT14SS1SG中的修饰化hG-CSF的第1个密码子被苏氨酸替代(Papworth，C.et al.， Strategies，9，3(1996))，这是用含有修饰化核苷酸序列的正向引物(SEQ ID NO：12)，互补的反向引物(SEQ ID NO：13)和pfu(Stragene，美国)通过质粒的PCR反应得到的。

回收扩增的DNA片段，并加入限制性内切酶DpnI以除去未转变的质粒。

大肠杆菌XL-1 blue(Novagen，美国)用修饰化的质粒进行转化。从转化的克隆中回收DNA，测定其碱基序列，这样得到的质粒pT14SSG含有hG-CSF的第1个氨基酸被苏氨酸替代的基因(SEQ ID NO：11)。

-5 -4 -3 -2 -1 +1 +2 +3 +4 +5

Thr Asn Ala Tyr Ala Thr Pro Leu Gly Pro (SEQ ID NO：11)

-ACA-AAT-GCC-TAC-GCG-ACA-CCC-CTG-GGC-CCT (SEQ ID NO：12)

-TGT-TIA-CGG-ATG-CGC-TGT-GGG-GAC-CCG-GGA (SEQ ID NO：13)

大肠杆菌BL21(DE3)(Stratagene，美国)用载体pT14SSG进行转化，得到的转化子命名为大肠杆菌HM 10301。

(步骤5)构建包含编码修饰化STII/hG-CSF基因的载体

步骤4中获得的载体pT14SSG用互补引物SEQ ID NOS：15和16进行PCR反应，这两个引物根据步骤4中的流程，设计为用苏氨酸密码子替代STII的第四个密码子以获得修饰化的质粒。

大肠杆菌XL-1 blue(Novagen，美国)用修饰化的质粒进行转化。从转化的克隆中回收DNA，测定其碱基序列，这样得到的质粒含有STII的第四个氨基酸被苏氨酸替代的基因(SEQ ID NO：14)。

Met Lys Lys Thr Ile Ala Phe Leu (SEQ ID NO：14)

5′-GG-TGT-TTT-ATG-AAA-AAG-ACA-ATC-GCA-TTT-CTT-C-3′(SEQ ID NO：15)

3′-CC-ACA-AAA-TAC-TTT-TTC-TGT-TAG-CGT-AAA-GAA-G-5′(SEQ ID NO：16)

这样获得的质粒用XbaI和MluI酶切，然后插入到步骤4中获得的载体pT14SSG的XbaI/MluI部位，得到载体pT14SSG-4T。

(步骤6)构建包含编码修饰化STII/hG-CSF基因的载体

步骤5中获得的载体pT14SSG-4T用互补引物SEQ ID NOS：18和19进行PCR反应，这两个引物根据步骤4中的流程，设计为用谷氨酰胺密码子替代STII的第22个密码子以获得修饰化的质粒。

大肠杆菌XL-1 blue(Novagen，美国)用修饰化的质粒进行转化。从转化的克隆中回收DNA，测定其碱基序列，这样得到的质粒pT14SSG-4T22Q含有STII的第22个氨基酸被谷氨酰胺替代的基因(SEQ ID NO：17)。

ASN Ala Gln Ala Thr Pro Leu Gly (SEQ ID NO：17)

5′-CA-AAT-GCC-CAA-GCG-ACA-CCC-CTG-GGC-3′(SEQ ID NO：18)

3′-GT-TTA-CGG-GTT-CGC-TGT-GGG-GAC-CCG-5′(SEQ ID NO：19)

(步骤7)构建包含编码修饰化STII SD和编码修饰化STII/hG-CSF基因的载体

步骤6中获得的载体pT14SSG-4T22Q，用根据步骤4的流程得到的互补引物SEQ ID NOS：20和21进行PCR反应，得到载体pT140SSG-4T22Q，该载体在STII SD序列(GAGG)和STII起始密码子之间含有6个核苷酸序列(修饰化的STII SD，SEQ ID NO：71)。

图5描述上述构建载体pT140SSG-4T22Q的流程。

用载体pT140SSG-4T22Q转化大肠杆菌BL21(DE3)，得到的转化子命名为大肠杆菌HM 10302。

实施例3：构建含有编码修饰化hG-CSF基因的载体

为了制备修饰化hG-CSF基因，用DNA合成仪(Model380B，应用生物系统公司，美国)合成具有大肠杆菌偏爱密码子和用丝氨酸代替hG-CSF的第17个氨基酸的S1寡核苷酸(SEQ ID NO：22)和AS1寡核苷酸(SEQ ID NO：23)。

0.5μl(50pmole)寡核苷酸在95℃反应15分钟，然后在35℃温育3小时。混合物用乙醇沉淀，并进行凝胶电泳(SDS-PAGE)以获得一个粘端的双链(ds)寡核苷酸。

在例2的步骤3中获得的质粒pT14SS1SG用ApaI和BstXI酶切，然后与粘端的双链寡核苷酸连接，获得载体pT14SS1S17SEG。载体pT14SS1S17SEG含有一个在氨端有大肠杆菌偏爱密码子和用丝氨酸分别代替hG-CSF第1个和第17个氨基酸的编码hG-CSF的基因。

图6所示的是上述构建载体pT14SS1S17SEG的流程。

用载体pT14SS1S17SEG转化大肠杆菌BL21(DE3)，得到的转化子命名为大肠杆菌HM 10311，它于1999年3月24日保藏在韩国微生物菌保中心(KCCM)，保藏号为KCCM-10154。

实施例4：构建包含编码大肠杆菌OmpA信号肽和修饰化hG-CSF基因的载体

按照以下步骤制备包含编码Tac启动子和OmpA信号肽(SEQ ID NO：24)以及编码修饰化hG-CSF基因的载体：

Met-Lys-Lys-Thr-Ala-Ile-Ala-Ile-Ala-Val-Ala-Leu-Ala-Gly-Phe-Ala-

Thr-Val-Ala-Gln-Ala- (SEQ ID NO：24)

--GTT-GCG-CAA-GCT-TCT-CGA-- (SEQ ID NO：25)

--CAA-CGC-GTT-CGA-AGA-GCT-- (SEQ ID NO：26)

HindIII限制性位点

在实施例1中获得的载体pT-CSF用以丝氨酸密码子代替hG-CSF第1个密码子的引物(SEQ ID NO：27)和另一个在其终止密码子下游提供EcoRI限制性内切酶位点(5’-GAATTC-3’)的引物(SEQ ID NO：28)进行PCR反应，得到包含编码修饰化hG-CSF基因的DNA片段。

该DNA片段用HindIII和EcoRI酶切，然后插入到载体pFlag.CTS(Eastman，美国)的HindIII/EcoRI部位，得到的载体pTO1SG包含编码大肠杆菌OmpA信号肽和修饰化hG-CSF(SEQ ID NO：29)的基因。

图7所示的是上述构建载体pTO1SG的流程。

用载体pTO1SG转化大肠杆菌BL21(DE3)(Stratagene，美国)，得到的转化子命名为大肠杆菌HM 10409。

实施例5：构建包含编码大肠杆菌OmpA信号肽和修饰化hG-CSF基因的载体

通过用设计为用苏氨酸密码子代替hG-CSF的第1个密码子的正向引物(SEQ ID NO：30)和一个互补反向引物(SEQ ID NO：31)对实施例4中获得的质粒pTO1SG进行PCR反应，这样在实施例4获得的质粒pTO1SG中，修饰化hG-CSF基因的第1个密码子根据定点突变被苏氨酸密码子替代(Papworth，C.et al.， Strategies，9，3(1996))。

用修饰化的质粒转化大肠杆菌XL-1 blue(Novagen，美国)。从转化的克隆中回收DNA，测定其碱基序列，这样得到的质粒pTOG含有hG-CSF的第1个氨基酸被苏氨酸替代的基因。

用载体pT14SSG转化大肠杆菌BL21(DE3)(Stratagene，美国)，得到的转化子命名为大肠杆菌HM 10401。

实施例6：生产修饰化hG-CSF

(a)生产[丝氨酸1，丝氨酸17] hG-CSF

实施例4中获得的载体pTO1SG用设计为以丝氨酸密码子代替hG-CSF的第17个密码子的正向引物(SEQ ID NO：32)和一个根据实施例2中的步骤4所得到的互补反向引物(SEQ ID NO：33)进行PCR反应，获得一个修饰化质粒。

用修饰化质粒转化大肠杆菌XL-1 blue(Novagen，美国)。从转化的克隆中回收DNA，测定其碱基序列，这样得到的质粒pTO1S17SG含有hG-CSF的第1个和第17个氨基酸被丝氨酸替代的基因。

用载体pTO1S17SG转化大肠杆菌BL21(DE3)(Stratagene，美国)，得到的转化子命名为大肠杆菌HM 10410，它于1999年3月24日保藏在韩国微生物菌保中心(KCCM)，保藏号为KCCM-10151。

(b)生产[丝氨酸17]hG-CSF

实施例5中获得的载体pTOG用设计为以丝氨酸密码子代替hG-CSF的第17个密码子的正向引物(SEQ ID NO：32)和一个根据实施例2中的步骤4所得到的互补反向引物(SEQ ID NO：33)进行PCR反应，获得一个修饰化质粒。

用修饰化质粒转化大肠杆菌XL-1 blue(Novagen，美国)。从转化的克隆中回收DNA，测定其碱基序列，这样得到的质粒pTO17SG含有hG-CSF的第17个氨基酸被丝氨酸替代的基因。

用载体pTO17SG转化大肠杆菌BL21(DE3)(Stratagene，美国)，得到的转化子命名为大肠杆菌HM 10411，它于1999年3月24日保藏在韩国微生物菌保中心(KCCM)，保藏号为KCCM-10152。

(c)生产[苏氨酸17]hG-CSF

实施例5中获得的载体pTOG用设计为以苏氨酸密码子代替hG-CSF的第17个密码子的正向引物(SEQ ID NO：34)和一个根据实施例2中的步骤4所得到的互补反向引物(SEQ ID NO：35)进行PCR反应，获得一个修饰化质粒。

用修饰化质粒转化大肠杆菌XL-1 blue(Novagen，美国)。从转化的克隆中回收DNA，测定其碱基序列，这样得到的质粒pTO17TG含有hG-CSF的第17个氨基酸被苏氨酸替代的基因。

用载体pTO17TG转化大肠杆菌BL21(DE3)(Stratagene，美国)，得到的转化子命名为大肠杆菌HM 10413。

(d)生产[丙氨酸17]hG-CSF

实施例5中获得的载体pTOG用设计为以丙氨酸密码子代替hG-CSF的第17个密码子的正向引物(SEQ ID NO：36)和一个根据实施例2中的步骤4所得到的互补反向引物(SEQ ID NO：37)进行PCR反应，获得一个修饰化质粒。

用修饰化质粒转化大肠杆菌XL-1 blue(Novagen，美国)。从转化的克隆中回收DNA，测定其碱基序列，这样得到的质粒pTO17AG含有hG-CSF的第17个氨基酸被丙氨酸替代的基因。

用载体pTO17AG转化大肠杆菌BL21(DE3)(Stratagene，美国)，得到的转化子命名为大肠杆菌HM 10414。

(e)生产[甘氨酸17]hG-CSF

实施例5中获得的载体pTOG用设计为以甘氨酸密码子代替hG-CSF的第17个密码子的正向引物(SEQ ID NO：38)和一个根据实施例2中的步骤4所得到的互补反向引物(SEQ ID NO：39)进行PCR反应，获得一个修饰化质粒。

用修饰化质粒转化大肠杆菌XL-1 blue(Novagen，美国)。从转化的克隆中回收DNA，测定其碱基序列，这样得到的质粒pTO17GG含有hG-CSF的第17个氨基酸被甘氨酸替代的基因。

用载体pTO17GG转化大肠杆菌BL21(DE3)(Stratagene，美国)，得到的转化子命名为大肠杆菌HM 10415。

(f)生产[天冬氨酸17]hG-CSF

实施例5中获得的载体pTOG用设计为以天冬氨酸密码子代替hG-CSF的第17个密码子的正向引物(SEQ ID NO：40)和一个根据实施例2中的步骤4所得到的互补反向引物(SEQ ID NO：41)进行PCR反应，获得一个修饰化质粒。

用修饰化质粒转化大肠杆菌XL-1 blue(Novagen，美国)。从转化的克隆中回收DNA，测定其碱基序列，这样得到的质粒pTO17APG含有hG-CSF的第17个氨基酸被天冬氨酸替代的基因。

用载体pTO17APG转化大肠杆菌BL21(DE3)(Stratagene，美国)，得到的转化子命名为大肠杆菌HM 10416。

实施例7：构建包含编码大肠杆菌基因III信号肽和修饰化hG-CSF的载体

(a)构建编码阿拉伯糖启动子和大肠杆菌基因III信号肽基因的载体

按照以下步骤制备包含编码阿拉伯糖启动子和大肠杆菌基因III信号肽(SEQ ID NO：42)以及修饰化hG-CSF基因的载体：

Met-Lys-Lys-Leu-Leu-Phe-Ala-Ile-Pro-Leu-Val-Val-Pro-

Phe-Tyr-Ser-His-Ser- (SEQ ID NO：42)

-TAT-AGC-CAT-AGC-ACC-ATG-GAG- (SEQ ID NO：43)

-ATA-TCG-GTA-TCG-TGG-TAC-CTC- (SEQ ID NO：44)

NcoI限制性位点

包含编码阿拉伯糖启动子和大肠杆菌基因III信号肽基因的质粒pBAD·gIIIA(Invitrogen，美国)用NcoI酶切，然后用Klenow DNA聚合酶除去单链DNA，得到平端双链DNA，然后它用BgIII酶切，得到含有一个平端和一个粘端的载体片段。

实施例1中得到的载体pT-CSF用设计为核苷酸序列编码hG-CSF的第2到第九个氨基酸的正向引物(SEQ ID NO：46)和根据实施例2中的步骤4所得到的互补反向引物(SEQ ID NO：47)进行PCR反应，得到一个平端DNA片段，该片段包含hG-CSF基因，其羧端包含一个BamHI内切酶位点。然后该片段用BamHI酶切，获得含有一个平端和一个粘端的hG-CSF基因片段。

Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu (SEQ ID NO 45)

5′-C-CCC-CTG-GGC-CCT-GCC-AGC-TCC-CTG-3’(SEQ ID NO 46)

3′-G-GGG-GAC-CCG-GGA-CGG-TCG-AGG-GAC-5′(SEQ ID NO 47)

该hG-CSF基因片段插入到上述获得的载体中，得到载体pBADG，该载体包含编码大肠杆菌基因III信号肽和hG-CSF的基因(SEQ ID NO：48)。

图8描述上述构建载体pBADG的流程。

用载体pBADG转化大肠杆菌BL21(DE3)(Stratagene，美国)，得到的转化子命名为大肠杆菌HM 10501。

(b)生产[蛋氨酸2，缬氨酸3]hG-CSF

用NcoI和BgIII酶切质粒pBAD·gIIIA(Invitrogen，美国)，得到含有两个粘端的片段。

实施例1中获得的载体pT-CSF用设计为含有编码[蛋氨酸2，缬氨酸3]hG-CSF的第1个到第9个氨基酸的核苷酸序列的正向引物(SEQ IDNO：49)与根据实施例2中的步骤4所得到的互补反向引物(SEQ ID NO：51)进行PCR反应，获得一个包含hG-CSF基因和羧端有一个BamHI位点的平端DNA片段，然后它用NcoI和BgIII酶切，得到含有两个粘端的hG-CSF基因片段。

Thr Met Val Gly Pro Ala Ser Ser Leu (SEQ ID NO：49)

5′-TAC-GCG-TCC-ATG-GTG-GGC-CCT-GCC-AGC-TCC-CTG-3′(SEQ ID NO：50)

3′-ATG-CGC-AGG-TAC-CAC-CCG-GGA-CGG-TCG-AGG-GAC-5′(SEQ ID NO：51)

NcoI限制性位点

该hG-CSF基因片段插入到上述获得的载体中，得到载体pBAD2M3VG，该载体包含一个编码大肠杆菌基因III信号肽与分别用蛋氨酸和缬氨酸代替hG-CSF的第2及第3个氨基酸的基因(SEQ ID NO：52)。

图9所示的是上述构建载体pBAD2M3VG的流程。

用载体pBAD2M3VG转化大肠杆菌BL21(DE3)(Stratagene，美国)，得到的转化子命名为大肠杆菌HM10510，它于1999年3月24日保藏在韩国微生物菌保中心(KCCM)，保藏号为KCCM-10153。

(c)生产[丝氨酸17]hG-CSF

在(a)中获得的载体pBADG用设计为以丝氨酸密码子代替hG-CSF的第17个密码子的正向引物(SEQ ID NO：32)和一个根据实施例2中的步骤4所得到的互补反向引物(SEQ ID NO：33)进行PCR反应，获得一个修饰化质粒。

用修饰化质粒转化大肠杆菌XL-1 blue(Novagen，美国)。从转化的克隆中回收DNA，测定其碱基序列，这样得到的质粒pBAD17SG含有hG-CSF的第17个氨基酸被丝氨酸替代的基因。

用载体pBAD17SG转化大肠杆菌BL21(DE3)(Stratagene，美国)，得到的转化子命名为大肠杆菌HM 10511。

(d)生产[蛋氨酸2，缬氨酸3，丝氨酸17]hG-CSF

在(b)中获得的载体pBAD2M3VG用设计为以丝氨酸密码子代替hG-CSF的第17个密码子的正向引物(SEQ ID NO：32)和一个根据实施例2中的步骤4所得到的互补反向引物(SEQ ID NO：33)进行PCR反应，获得一个修饰化质粒。

用修饰化质粒转化大肠杆菌XL-1 blue(Novagen，美国)。从转化的克隆中回收DNA，测定其碱基序列，这样得到的质粒pBAD2M3V17SG含有hG-CSF的第2个，第3个和第17个氨基酸分别被蛋氨酸，缬氨酸和丝氨酸替代的基因。

用载体pBAD2M3V17SG转化大肠杆菌BL21(DE3)(Stratagene，美国)，得到的转化子命名为大肠杆菌HM10512。

实施例8：生产hG-CSF

在实施例2到实施例7中制备的转化子，使用LB培养基(1％细菌用-胰蛋白胨，0.5％细菌用-酵母提取物和1％氯化钠)进行培养，然后在表达诱导物(IPTG)存在下温育三个小时，或在没有IPTG存在时培养15个小时以上。培养物在6000rpm离心20分钟，沉淀菌体细胞，将沉淀悬浮在1/10体积的等渗溶液(20％蔗糖，含1mM EDTA的10mM Tris-Cl缓冲液，pH7.0)中。悬浮液在室温静止30分钟，然后7000rpm离心10分钟，收集菌体细胞。细胞在4℃重新悬浮在蒸馏水中，7000rpm离心10分钟，得到的上清为周质溶液。周质溶液中的hG-CSF水平用hG-CSF的抗体(Aland，美国)根据ELISA方法(Kato，K.et al.， J.Immunol.，116，1554(1976))进行测定，计算每升培养物所产生的hG-CSF数量，结果如表1所示。

表1

转化子	实施例	表达载体	周质hG-CSF水平(mg/l)
转化子	实施例	表达载体	周质hG-CSF水平(mg/l)	HM 10301	2(Step 4)	pT14SSG	65
HM 10302	2(Step 7)	pT140SSG-4T22Q	277	HM 10301	2(Step 4)	pT14SSG	65
HM 10302	2(Step 7)	pT140SSG-4T22Q	277	HM 10310	2(Step 3)	pT14SS1SG	92
HM 10311	3	pT14SS1S17SEG	1,512	HM 10310	2(Step 3)	pT14SS1SG	92
HM 10311	3	pT14SS1S17SEG	1,512	HM 10401	5	pTOG	85
HM 10409	4	pTO1SG	105	HM 10401	5	pTOG	85
HM 10409	4	pTO1SG	105	HM 10410	6(a)	pTO1S17SG	1,477
HM 10411	6(b)	pTO17SG	1,550	HM 10410	6(a)	pTO1S17SG	1,477
HM 10411	6(b)	pTO17SG	1,550	HM 10413	6(c)	pTO17TG	1,373
HM 10414	6(d)	pTO17AG	1,486	HM 10413	6(c)	pTO17TG	1,373
HM 10414	6(d)	pTO17AG	1,486	HM 10415	6(e)	pTO17GG	1,480
HM 10416	6(f)	pTO17APG	67	HM 10415	6(e)	pTO17GG	1,480
HM 10416	6(f)	pTO17APG	67	HM 10501	7(a)	pBADG	54
HM 10510	7(b)	pBAD2M3VG	69	HM 10501	7(a)	pBADG	54
HM 10510	7(b)	pBAD2M3VG	69	HM 10511	7(c)	pBAD17SG	937
HM 10512	7(d)	pBAD2M3V17SG	983	HM 10511	7(c)	pBAD17SG	937

实施例9：纯化hG-CSF

在实施例6(b)中制备的转化子大肠杆菌HM 10411在LB培养基中培养，培养物6000rpm离心20分钟收获细胞。重复实施例8中的流程，从细胞中制备周质溶液。

周质溶液调节pH到5.0～5.5，用预平衡到pH为5.3的CM-Sepharose(羧甲基-琼脂糖凝胶)柱(Pharmacia公司，瑞典)吸收，然后用25mM的氯化钠洗柱。顺序加入包含50mM，100mM和200mM的氯化钠柱缓冲液对hG-CSF进行洗脱，收集并合并包含hG-CSF的部分。

合并的部分进行Phenyl Sepharose(苯基-琼脂糖凝胶)(Pharmacia公司，瑞典)柱层析，获得纯度为99％的[丝氨酸17]hG-CSF。

进一步，用实施例3，4，6(b)，6(c)，6(d)，6(e)，7(b)和7(d)中制备的转化子大肠杆菌HM10311，HM10409，HM10411，HM10413，HM10414，HM10415，HM10510和HM10512分别重复进行上述流程。

每个纯化的hG-CSF部分都进行十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，测定hG-CSF的纯度和大约浓度，然后进行ELISA，测定周质溶液中hG-CSF的确切浓度。Met-hG-CSF(Kirin amgen)作为对照。

图10a所示的是SDS-PAGE结果，其中泳道1为Met-G-CSF，泳道2为转化子大肠杆菌HM 10411的周质溶液，泳道3为纯化的[丝氨酸17]hG-CSF。而从图10b中可看到，[丝氨酸17]hG-CSF的分子量与野生型hG-CSF相同，而且转化子大肠杆菌HM10411的周质溶液中包含高水平的[丝氨酸17]hG-CSF。

进一步对hG-CSF的N端氨基酸序列进行测定，转化子HM10311，HM10409，HM10411，HM10413，HM10414，HM10415，HM10510和HM10512所产生的编码第1个到第32个氨基酸的核酸序列，分别以SEQID NOS：56，58，60，62，64，66，68和70表示。结果表明，根据本发明所生产的修饰化hG-CSF在N末端是非蛋氨酸化的。

用blotting缓冲液(170mM甘氨酸，25mM Tris·HCl(pH8)，20％甲醇)浸泡硝酸纤维素滤膜(Bio-Rad实验室，美国)，在胶中分离的蛋白在硝酸纤维素滤膜(Bio-Rad实验室，美国)上进行三个小时的western-blot。滤膜在1％的酪蛋白中放置1小时，然后用含0.05％吐温20的PBS洗三次。滤膜放在以PBS稀释的羊抗-G-CSF抗体(R&D系统，AB-214-NA，美国)溶液中，室温反应2小时。反应后滤膜用PBST溶液洗三次，以除去未反应的抗体。向其中加入以PBS稀释的辣根过氧化物酶-连接的兔抗羊IgG(Bio-Rad实验室，美国)，室温反应2小时。滤膜用PBST冲洗，然后加入过氧化物酶底物试剂盒(Bio-Rad实验室，美国)中的溶液进行颜色反应。上述western-blotting的结果如图10b所示，其中泳道1代表阳性对照Met-hG-CSF，泳道2为纯化的[丝氨酸17]hG-CSF。从图10b可看出[丝氨酸17]hG-CSF的分子量等于野生型hG-CSF的分子量。

实施例10：hG-CSF和修饰化hG-CSF的细胞活性

细胞系HL-60(ATCC CCL-240，来源于1个患有骨髓性白血病的36岁白种妇女患者的骨髓)在含有10％胎儿牛血清蛋白的RPMI 1640培养基中培养到2.2×10⁵细胞/毫升，随后加入DMSO(二甲亚砜，培养级/SIGMA)至浓度为1.25％(v/v)。将90μl的上述溶液加入到96孔板中(Coring/低蒸发96孔板)至2×10⁴细胞/孔，37℃在5％的CO₂中温育48小时。

每个修饰化的[丙氨酸17]hG-CSF，[甘氨酸17]hG-CSF，[丝氨酸17]hG-CSF和[苏氨酸17]hG-CSF用RPMI 1640培养基稀释到浓度为500ng/ml，然后用二倍体积的RPMI 1640培养基连续稀释10次。

上述溶液以10μl/孔加到各孔中，37℃温育48小时。以商品化hG-CSF作为阳性对照(Jeil Phamaceutical.)。

根据在670nm测得的光密度值，用商品化的CellTiter96^TM(Cat #G4100，Promega)检测增加的细胞系水平。

从图11可以看出，修饰化hG-CSF的细胞活性等于或高于作为阳性对照的野生型hG-CSF的活性。

虽然已经描述和图示说明了本发明的实施例，但很显然：在不偏离所附权利要求范围所限定的本发明主旨的情况下，可以进行多种改变和修饰。

序列表

<110>Pharm.Co.，Ltd.

<120>修饰化人源粒细胞——集落刺激因子及其制备方法

<130>PCA00729/HMY

<160>71

<170>KOPATIN 1.0

<210>1

<211>522

<212>DNA

<213>人

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(522)

<400>1

aca ccc ctg ggc cct gcc agc tcc ctg ccc cag agc ttc ctg ctc aag 48

Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys

1 5 10 15

tgc tta gag caa gtg agg aag atc cag ggc gat ggc gca gcg ctc cag 96

Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln

20 25 30

gag aag ctg tgt gcc acc tac aag ctg tgc cac ccc gag gag ctg gtg 144

Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val

35 40 45

ctg ctc gga cac tct ctg ggc atc ccc tgg gct ccc ctg agc tcc tgc 192

Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys

50 55 60

ccc agc cag gcc ctg cag ctg gca ggc tgc ttg agc caa ctc cat agc 240

Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser

65 70 75 80

ggc ctt ttc ctc tac cag ggg ctc ctg cag gcc ctg gaa ggg ata tcc 288

Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser

85 90 95

ccc gag ttg ggt ccc acc ttg gac aca ctg cag ctg gac gtc gcc gac 336

Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp

100 105 110

ttt gcc acc acc atc tgg cag cag atg gaa gaa ctg gga atg gcc cct 384

Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro

115 120 125

gcc ctg cag ccc acc cag ggt gcc atg ccg gcc ttc gcc tct gct ttc 432

Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe

130 135 140

cag cgc cgg gca gga ggg gtc ctg gtt gct agc cat ctg cag agc ttc 480

Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe

145 150 155 160

ctg gag gtg tcg tac cgc gtt cta cgc cac ctt gcg cag ccc 522

Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro

165 170

<210>2

<211>174

<212>PRT

<213>人

<400>2

Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys

1 5 10 15

Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln

20 25 30

Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val

35 40 45

Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys

50 55 60

Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser

65 70 75 80

Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser

85 90 95

Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp

100 105 110

Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro

115 120 125

Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe

130 135 140

Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe

145 150 155 160

Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro

165 170

<210>3

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hG-CSF N末端的寡核苷酸引物

<400>3

cgccgccata tgacacccct gggccctgcc ag 32

<210>4

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hG-CSF C末端的寡核苷酸引物

<400>4

accgaattcg gatcctcagg gctgcgcaag gtggcg 36

<210>5

<211>72

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>制备大肠杆菌肠毒素II信号肽的寡核苷酸

<400>5

tcatgaaaaa gaatatcgca tttcttcttg catctatgtt cgttttttct attgctacaa 60

atgcctacgc gt 72

<210>6

<211>72

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>制备大肠杆菌肠毒素II信号肽的寡核苷酸

<400>6

acgcgtaggc atttgtagca atagaaaaaa cgaacataga tgcaagaaga aatgcgatat 60

tctttttcat ga 72

<210>7

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>编码[Ser1]hG-CSF N端的寡核苷酸引物

<400>7

acaaatgcct acgcgtctcc cctgggccct gccagctcc 39

<210>8

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>编码[Ser1]hG-CSF C端的寡核苷酸引物

<400>8

accgaattcg gatcctcagg gctgcgcaag gtggcgtaga ac 42

<210>9

<211>65

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>编码大肠杆菌肠毒素II Shine-Dalgarno序列的寡核苷酸引物

<400>9

cggtttccct ctagaggttg aggtgtttta tgaaaaagaa tatcgcattt cttcttgcat 60

ctatg 65

<210>10

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>包含BamHI限制性内切酶位点的寡核苷酸

<400>10

accgaattcg gatcctcagg gctgcgcaag gtggcgtaga acgcg 45

<210>11

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>大肠杆菌肠毒素II信号肽的最后5个氨基酸加hG-CSF的第1到第5个氨基酸

<400>11

Thr Asn Ala Tyr Ala Thr Pro Leu Gly Pro

1 5 10

<210>12

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>制备[Thr1]hG-CSF的寡核苷酸

<400>12

acaaatgcct acgcgacacc cctgggccct 30

<210>13

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>SEQ ID NO：12的反意链

<400>13

agggcccagg ggtgtcgcgt aggcatttgt 30

<210>14

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>以苏氨酸作为第4个氨基酸的大肠杆菌肠毒素II信号肽的N末端序列

<400>14

Met Lys Lys Thr Ile Ala Phe Leu

1 5

<210>15

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<22 >用苏氨酸替换大肠杆菌肠毒素II信号肽的第4个氨基酸的寡核苷酸

<400>15

ggtgttttat gaaaaagaca atcgcatttc ttc 33

<210>16

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>SEQ ID No：15的反意链

<400>16

gaagaaatgc gattgtcttt ttcataaaac acc 33

<210>17

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>以谷氨酸作为第22个氨基酸的大肠杆菌肠毒素II信号肽的C末端序列

<400>17

Asn Ala G ln Ala Thr Pro Leu Gly

1 5

<210>18

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用谷氨酸替换大肠杆菌肠毒素II信号肽的第22个氨基酸的寡核苷酸

<400>18

caaatgccca agcgacaccc ctgggc 26

<210>19

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>SEQ ID NO：18的反意链

<400>19

gcccaggggt gtcgcttggg catttg 26

<210>20

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>修饰化大肠杆菌肠毒素II Shine-Dalgarno序列的寡核苷酸

<400>20

tctagaggtt gaggtgtttt atga 24

<210>21

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>SEQ ID NO：20的反意链

<400>21

tcataaaaca cctcaacctc taga 24

<210>22

<211>66

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>含有大肠杆菌偏爱的编码[Ser17]hG-CSF第6到第26个氨基酸的S1寡核苷酸序列

<400>22

cagcctcttc tcttccacaa tctttccttc ttaagtctct tgaacaagtt agaaagatcc 60

aaggcg 66

<210>23

<211>66

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>SEQ ID NO：22的反意链(AS1寡核苷酸)

<400>23

ccgggtcgga gaagagaagg tgttagaaag gaagaattca gagaacttgt tcaatctttc 60

taggtt 66

<210>24

<211>21

<212>PRT

<213>大肠杆菌

<220>

<221>信号

<222>(1)..(21)

<223>大肠杆菌OmpA信号肽

<400>24

Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala

1 5 10 15

Thr Val Ala Gln Ala

20

<210>25

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>含有Hind III识别位点的寡核苷酸

<400>25

gttgcgcaag cttctcga 18

<210>26

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>SEQ ID NO：25的反意链

<400>26

tcgagaagct tgcgcaac 18

<210>27

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>[Ser1]hG-CSF N末端的寡核苷酸

<400>27

gttgcgcaag cttctcccct gggccctgcc agctccctg 39

<210>28

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>含有EcoRI限制性酶切位点的寡核苷酸

<400>28

accgaattct cagggctgcg caaggtggcg tagaacgcg 39

<210>29

<211>13

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>大肠杆菌OmpA信号肽加[Ser1]hG-CSF的第1到第5个氨基酸

<400>29

Gly Phe Ala Thr Val Ala Gln Ala Ser Pro Leu Gly Pro

1 5 10

<210>30

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>制备[Thr1]hG-CSF的寡核苷酸

<400>30

accgttgcgc aagctacacc cctgggccct 30

<210>31

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>SEQ ID NO：30的反意链

<400>31

agggcccagg ggtgtagctt gcgcaacggt 30

<210>32

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>制备[Ser17]hG-CSF的寡核苷酸

<400>32

agcttcctgc tcaagtcttt agagcaagtg agg 33

<210>33

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>SEQ ID NO：32的反意链

<400>33

cctcacttgc tctaaagact tgagcaggaa gct 33

<210>34

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>制备[Thr17]hG-CSF的寡核苷酸

<400>34

agcttcctgc tcaagacctt agagcaagtg agg 33

<210>35

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>SEQ ID NO：34的反意链

<400>35

cctcacttgc tctaaggtct tgagcaggaa gct 33

<210>36

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>制备[Ala17]hG-CSF的寡核苷酸

<400>36

agcttcctgc tcaaggcctt agagcaagtg agg 33

<210>37

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<223>SEQ ID NO：36的反意链

<400>37

cctcacttgc tctaaggcct tgagcaggaa gct 33

<210>38

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>制备[Gly17]hG-CSF的寡核苷酸

<400>38

agcttcctgc tcaagggctt agagcaagtg agg 33

<210>39

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>SEQ ID NO：38的反意链

<400>39

cctcacttgc tctaagccct tgagcaggaa gct 33

<210>40

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>制备[Asp17]hG-CSF的寡核苷酸

<400>40

agcttcctgc tcaaggactt agagcaagtg agg 33

<210>41

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>SEQ ID NO：40的反意链

<400>41

cctcacttgc tctaagtcct tgagcaggaa gct 33

<210>42

<211>18

<212>PRT

<213>大肠杆菌

<220>

<221>信号

<222>(1)..(18)

<223>大肠杆菌基因III信号肽

<400>42

Met Lys Lys Leu Leu Phe Ala Ile Pro Leu Val Val Pro Phe Tyr Ser

1 5 10 15

His Ser

<210>43

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>含有NcoI限制性酶切位点的寡核苷酸

<400>43

tatagccata gcaccatgga g 21

<210>44

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>SEQ ID NO：43的反意链

<400>44

ctccatggtg ctatggctat a 21

<210>45

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>hG-CSF的第2到第10个氨基酸

<400>45

Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu

1 5

<210>46

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223编码hG-CSF的第2到第10个氨基酸加其5′端附加胞嘧啶的寡核苷酸引物

<400>46

ccccctgggc cctgccagct ccctg 25

<210>47

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>SEQ ID NO：46的反意链

<400>47

cagggagctg gcagggccca ggggg 25

<210>48

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>大肠杆菌基因III信号肽加hG-CSF的第1到第5个氨基酸

<400>48

Phe Tyr Ser His Ser Thr Pro Leu Gly Pro

1 5 10

<210>49

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>[Met2，Val3]hG-CSF的第1到第9个氨基酸

<400>49

Thr Met Val Gly Pro Ala Ser Ser Leu

1 5

<210>50

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>制备[Met2，Val3]hG-CSF的寡核苷酸

<400> 50

tacgcgtcca tggtgggccc tgccagctcc ctg 33

<210>51

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>SEQ ID NO：50的反意链

<400>51

cagggagctg gcagggccca ccatggacgc gta 33

<210>52

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>大肠杆菌基因III信号肽加[Met2，Val3]hG-CSF的第1到第5个氨基酸

<400>52

Phe Tyr Ser His Ser Thr Met Val Gly Pro

1 5 10

<210>53

<211>23

<212>PRT

<213>大肠杆菌

<220>

<221>信号

<222>(1)..(23)

<223>抗热大肠杆菌肠毒素II信号肽

<400>53

Met Lys Lys Asn Ile Ala Phe Leu Leu Ala Ser Met Phe Val Phe Ser

1 5 10 15

Ile Ala Thr Asn Ala Tyr Ala

20

<210>54

<211>23

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>修饰化抗热大肠杆菌肠毒素II信号肽

<400>54

Met Lys Lys Thr Ile Ala Phe Leu Leu Ala Ser Met Phe Val Phe Ser

1 5 10 15

Ile Ala Thr Asn Ala Gln Ala

20

<210>55

<211>96

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>编码[Ser1，Ser17]hG-CSF第1到第32个氨基酸的核苷酸序列

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(96)

<400>55

tct ccc ctg ggc cct gcc agc tcc ctg ccc cag agc ttc ctg ctc aag 48

Ser Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys

1 5 10 15

tct tta gag caa gtg agg aag atc cag ggc gat ggc gca gcg ctc cag 96

Ser Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln

20 25 30

<210>56

<211>32

<212>PRT

<213>人工序列

<400>56

Ser Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys

1 5 10 15

Ser Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln

20 25 30

<210>57

<211>96

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>编码[Ser1]hG-CSF第1到第32个氨基酸的核苷酸序列

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(96)

<400>57

tct ccc ctg ggc cct gcc agc tcc ctg ccc cag agc ttc ctg ctc aag 48

Ser Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys

1 5 10 15

tgc tta gag caa gtg agg aag atc cag ggc gat ggc gca gcg ctc cag 96

Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln

20 25 30

<210>58

<211>32

<212>PRT

<213>人工序列

<400>58

Ser Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys

1 5 10 15

Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln

20 25 30

<210>59

<211>96

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>编码[Ser17]hG-CSF第1到第32个氨基酸的核苷酸序列

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(96)

<400>59

aca ccc ctg ggc cct gcc agc tcc ctg ccc cag agc ttc ctg ctc aag 48

Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys

1 5 10 15

tct tta gag caa gtg agg aag atc cag ggc gat ggc gca gcg ctc cag 96

Ser Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln

20 25 30

<210>60

<211>32

<212>PRT

<213>人工序列

<400>60

Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys

1 5 10 15

Ser Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln

20 25 30

<210>61

<211>96

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>编码[Thr17]hG--CSF第1到第32个氨基酸的核苷酸序列

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(96)

<400>61

aca ccc ctg ggc cct gcc agc tcc ctg ccc cag agc ttc ctg ctc aag 48

Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys

1 5 10 15

acc tta gag caa gtg agg aag atc cag ggc gat ggc gca gcg ctc cag 96

Thr Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln

20 25 30

<210>62

<211>32

<212>PRT

<213>人工序列

<400>62

Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys

1 5 10 15

Thr Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln

20 25 30

<210>63

<211>96

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>编码[Ala17]hG-CSF第1到第32个氨基酸的核苷酸序列

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(96)

<400>63

aca ccc ctg ggc cct gcc agc tcc ctg ccc cag agc ttc ctg ctc aag 48

Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys

1 5 10 15

gcc tta gag caa gtg agg aag atc cag ggc gat ggc gca gcg ctc cag 96

Ala Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln

20 25 30

<210>64

<211>32

<212>PRT

<213>人工序列

<400>64

Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys

1 5 10 15

Ala Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln

20 25 30

<210>65

<211>96

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>编码[Gly17]hG-CSF第1到第32个氨基酸的核苷酸序列

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(96)

<400>65

aca ccc ctg ggc cct gcc agc tcc ctg ccc cag agc ttc ctg ctc aag 48

Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys

1 5 10 15

ggc tta gag caa gtg agg aag atc cag ggc gat ggc gca gcg ctc cag 96

Gly Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln

20 25 30

<210>66

<211>32

<212>PRT

<213>人工序列

<400>66

Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys

1 5 10 15

Gly Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln

20 25 30

<210>67

<211>96

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>编码[Met2，Val3]hG-CSF第1到第32个氨基酸的核苷酸序列

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(96)

<400>67

aca atg gtc ggc cct gcc agc tcc ctg ccc cag agc ttc ctg ctc aag 48

Thr Met Val Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys

1 5 10 15

tgc tta gag caa gtg agg aag atc cag ggc gat ggc gca gcg ctc cag 96

Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln

20 25 30

<210>68

<211>32

<212>PRT

<213>人工序列

<400>68

Thr Met Val Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys

1 5 10 15

Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln

20 25 30

<210>69

<211>96

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>编码[Met2，Val3，Ser17]hG-CSF第1到第32个氨基酸的核苷酸序列

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(96)

<400>69

aca atg gtc ggc cct gcc agc tcc ctg ccc cag agc ttc ctg ctc aag 48

Thr Met Val Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys

1 5 10 15

tct tta gag caa gtg agg aag atc cag ggc gat ggc gca gcg ctc cag 96

Ser Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln

20 25 30

<210>70

<211>32

<212>PRT

<213>人工序列

<400>70

Thr Met Val Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys

1 5 10 15

Ser Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln

20 25 30

<210>71

<211>10

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>修饰化Shine-Dalgarno序列

<400>71

gaggtgtttt 10

1

Claims

1.一种修饰化人源粒细胞-集落刺激因子hG-CSF，特征在于具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的野生型hG-CSF的第1个、第2个、第3个和第17个氨基酸中至少一个被其它氨基酸替代。

2.权利要求1的修饰化hG-CSF，其氨基酸序列与野生型hG-CSF一样，除了

所述第1个氨基酸为丝氨酸；

所述第1个氨基酸为丝氨酸以及所述第17个氨基酸为X；

所述第2个氨基酸为蛋氨酸以及所述第3个氨基酸为缬氨酸；

所述第2个氨基酸为蛋氨酸，所述第3个氨基酸为缬氨酸以及所述第17个氨基酸为X；或者

所述第17个氨基酸为X，

其中X是一个中性pH值时不带电荷的氨基酸。

3.权利要求2的修饰化hG-CSF，其中X是丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸或甘氨酸。

4.权利要求3的修饰化hG-CSF，其中X是丝氨酸。

5.一种编码权利要求1至4之一的修饰化hG-CSF的DNA。

6.权利要求5的DNA，其中所述修饰化hG-CSF DNA的第1个到第96个核苷酸的序列相应于SEQ ID NOS：55、57、59、61、63、65、67和69中的一个。

7.一种包含权利要求5的DNA的表达载体。

8.权利要求7的表达载体，进一步包含在编码所述修饰化hG-CSF的DNA的5’端附加一个编码信号肽的多核苷酸。

9.权利要求8的表达载体，其中所述信号肽为具有SEQ ID NO：53的氨基酸序列的大肠杆菌抗热肠毒素II信号肽。

10.权利要求8的表达载体，其中所述信号肽为具有SEQ ID NO：54的氨基酸序列的修饰化的大肠杆菌抗热肠毒素II信号肽。

11.权利要求9或10的表达载体，进一步包含核苷酸序列为SEQ IDNO：71的修饰化大肠杆菌肠毒素II Shine-Dalgano序列。

12.权利要求8的表达载体，其中所述信号肽为具有SEQ ID NO：24的氨基酸序列的大肠杆菌β内酰胺酶信号肽。

13.权利要求8的表达载体，其中信号肽为具有SEQ ID NO：42的氨基酸序列的大肠杆菌基因III信号肽。

14.权利要求7或8的表达载体，它是pT14SS1SG、pT14SS1S17SEG、pTO1SG、pTO1S17SG、pTO17SG或pBAD2M3V17SG。

15.一种用权利要求7或8的表达载体转化的微生物。

16.权利要求15的微生物，它是转化的大肠杆菌。

17.权利要求16的微生物，其中所述转化的大肠杆菌是大肠杆菌BL21/pT14SS1SG，大肠杆菌BL21/pT14SS1S17SEG，其保藏号为KCCM-10154，大肠杆菌BL21/pTO1SG，大肠杆菌BL21/pTO1S17SG，其保藏号为KCCM-10151，大肠杆菌BL21/pTO17SG，其保藏号为KCCM-10152，大肠杆菌BL21/pTO17TG，大肠杆菌BL21/pTO17AG，大肠杆菌BL21/pTO17GG，大肠杆菌BL21/pBAD2M3VG，其保藏号为KCCM-10153，大肠杆菌BL21/pBAD17SG或大肠杆菌BL21/pBAD2M3V17SG。

18.一种在微生物中生产修饰化hG-CSF的方法，包括培养权利要求15中的转化微生物，从而生产和向周质分泌修饰化hG-CSF。