CN1842341B

CN1842341B - 从人参叶和茎分离的抗癌以及抗转移活性级分

Info

Publication number: CN1842341B
Application number: CN03812081XA
Authority: CN
Inventors: 郭大焕; 申明锡; 金知燕; 朴正国
Original assignee: Mazence Inc
Current assignee: Mazence Inc
Priority date: 2002-05-28
Filing date: 2003-05-28
Publication date: 2010-09-08
Anticipated expiration: 2023-05-28
Also published as: CA2486915C; AU2003231394A1; JP4861619B2; KR100594353B1; US20060034951A1; KR20030091760A; KR100605292B1; WO2003099309A1; JP2011093928A; KR20030091665A; JP2005531576A; CA2486915A1; US7901716B2; KR20050112071A; KR20050105435A; EP1507544B1; EP1507544A1; AU2003231392A1; WO2003099308A1; CN1842341A

Abstract

本发明提供了含有作为活性成分的从人参属植物的叶和/或茎分离的提取物或多糖的组合物，所述组合物具有增强造血功能、抑制癌症转移、骨髓防御等的效果，本发明还涉及从人参属植物的叶和/或茎制备提取物的方法。

Description

从人参叶和茎分离的抗癌以及抗转移活性级分

技术领域

本发明涉及含有从人参属植物的叶和/或茎提取的作为有效成份的组合物以及制备多糖，尤其是含有从人参属植物的叶和/或茎分离的多糖的组合物的方法，所述多糖尤其是含多糖组合物可通过活化免疫细胞，诸如自然杀伤(NK)T细胞，NK细胞等用作抗癌药物和/或癌症转移抑制剂，并且也可通过增强造血功能，骨髓防御效果，放射灵敏度防御效果等用作抗癌药物的佐剂，本发明还涉及通过在50-180℃加热水中的人参叶和/或茎0.5-20小时从其中提取多糖从而用于制备多糖的方法。

发明背景

据报道每年20％的美国人死亡是由癌症相关疾病引起的。为了治疗这些癌症，通常使用化疗，已知仅有少数抗癌药是有效的。

大多数由癌症引起的死亡源于癌转移而非首次发生的癌症本身(Fifler，1991 cancer metastasis.Br.Med.Bull.47，157-177)。许多实验以及临床试验证实自然免疫在抑制癌症转移以及破坏癌症本身中起重要作用(Schantz等人，cancer immunol.Immunother.25.，141--148，1987)。

NKT(自然杀伤T)细胞是一类特异性α/βT细胞群，其共表达NK细胞系的受体并且具有非常迅速地分泌大量细胞因子的独特潜能，所述细胞因子提供效应细胞的早期辅助并且调节一些免疫应答的Th1或Th2分化(Annu.Rev.Immunol.1997.15；Albert Bendelae等人p535)。而且，它们也清除诸如癌细胞，寄生虫，李斯特菌，结核杆菌等传染性微生物或细菌(Seki等人，Clin.Immunol.28，p1069，1996)。

除了NKT细胞，NK细胞、LAK细胞以及巨噬细胞已知是可以有效抑制癌细胞，病毒以及细菌感染的细胞。尤其是，NK细胞，LAK细胞以及巨噬细胞的有效激活已知可以阻断癌细胞生长及其转移。并且，据报道通过免疫刺激物激活NK细胞可以抑制由癌症转移引起的癌细胞增殖(Herberman，1984 J.Invest.Dermatol.83，137--140)。

免疫系统的这些抗癌、抗转移以及抗病毒功能通过分泌各种活化免疫系统的细胞因子介导。尤其是，γ干扰素，肿瘤坏死因子-α等等是与抗癌、抗转移以及抗病毒功能相关的细胞因子的代表。

主要由T细胞产生的γ干扰素用来控制免疫反应以及活化T和B细胞、嗜中性粒细胞、NK细胞以及巨噬细胞以使它们攻击癌细胞。因此，γ干扰素被用于治疗慢性骨髓白血病以及肾癌。而且，γ干扰素对DNA复制和细胞增殖具有强烈的抑制效果，因此临床上它不仅被用于治疗癌症而且通过抑制微生物的增殖治疗病毒感染，多抗性细菌以及真菌传染。

肿瘤坏死因子-α主要由巨噬细胞产生并且参与诸如炎症反应的各种免疫反应，尤其是显示出对癌细胞的强毒性。目前，在日本TNF-α行将被批准作为皮肤癌治疗剂，取决于临床试验的结果。

然而，细胞因子直接应用于抗癌治疗引起诸如炎症反应、呕吐等的出乎意外的副作用。因此，目前正在尝试寻找可以完全激活免疫系统，而且不仅仅使用特定细胞因子的物质。

然而令人遗憾的是，几乎没有天然产物可以激活包括NK细胞的免疫细胞：例如来自槲寄生(Viscum coloratum)提取物的凝集素，所述提取物部分用于癌症治疗的替代性治疗，以及从蘑菇获得的属于β-葡聚糖类的多糖。

同时，属于人参属(所谓的高丽参)的植物作为代表性的补药，通常以收获后室温下干燥的白参形式或以收获后热处理的红参形式应用。目前已经进行了许多表征人参的成分以及药效的研究，并且已报道的药效包括延缓老化，抗关节硬化，高脂血恢复，增强肝功能，消除放射副作用，免疫系统增强，抗血栓，增强大脑功能，抗应力，血糖降低，血压降低以及抗癌效果。已经发现诱导这些效果的主要成分属于皂苷。最近的研究集中在从人参根提取/分离酸性多糖以便鉴定它们的效果。已知这些酸性多糖可以激活巨噬细胞，借此使巨噬细胞迅速产生干扰素-γ，并由此抑制癌细胞的增殖(韩国专利号144130)。

迄今为止大多数研究只集中在人参根部，除非有时集中在人参的叶和茎部。虽然人参的根部必须培养至少6年以便显示出药效，但是人参的叶和茎部每年生然后就废弃。因此，如果发现人参的叶和茎含有如同人参根部所含的特异性生理活性成分，在副产品利用以及环境保护方面将具有很大益处。

如上所述，人参的叶和茎的应用已经限于下列情况：使用人参叶的皂苷生产化妆品(韩国公开专利，81--3736)，在碱性条件下从人参叶获得苷元皂苷的方法(Korean Pharmaceutical Bulletin，38(4)，1994，8)，使用包括人参叶的药草提取物的洗发香波和洗涤剂(韩国专利，23641)，以及妇女用含人参叶的组织清洁制剂(韩国专利214223)。

一些研究已经显示从人参叶获得的多糖可有效治疗胃溃疡(PlantaMed.58，1992，445--448)；然而，没有研究显示人参叶或茎提取物具有抗癌效果，抑制癌症转移的效果等。

发明概述

本发明的发明者最先发现人参叶和/或茎的提取物激活诸如NKT细胞，NK细胞，巨噬细胞等的免疫细胞，并且促进诸如干扰素-α，肿瘤坏死因子-α等细胞因子的分泌，从而抑制癌症细胞的生长和癌细胞扩散并且支持造血加速效应以及减少现存抗癌药和放射治疗的副作用。本发明是基于这些发现得以完成的。

因此，本发明的目的是提供从人参叶和/或茎获得的提取物，其具有癌症抑制作用，造血功能增强效应，骨髓防御效果，放射敏感性防御效果等等。

本发明的另一目的是提供包含上述作为活性成分的提取物的组合物。

本发明更进一步的目的是提供上述组合物，诸如抗癌药物，癌症转移抑制剂，造血功能增强剂，放射副作用抑制剂，抗癌药物副作用抑制剂，自身免疫性疾病制剂的新用途。

本发明的另一目的是提供从人参叶和/或茎获得上述提取物的方法。

本发明的组合物包含作为活性成分的提取物，所述提取物可通过在特殊条件下处理属于人参属(以下称为“Panax genus植物”或者有时称作“高丽参”)植物的时和/或茎获得。本发明使用的这些人参属包括例如，Panax ginseng C.A.Mayer，Panax quinquefolum，Panaxnotoginseng，Panax pseudoginseng，Panax japonicum，Panax vietnamensisHa et Grushv等，其中的一种或者多种可被用于本发明。

本发明的组合物的形式没有特别的限制只要可以显示出上述提取物的效果，并且包括例如固相，悬浮液相，乳化相，液相等。并且，上述提取物在组合物中的含量没有特别的限制，只要它起到用于特定目的活性成分的作用。

下面将详细描述本发明。

根据本发明，为了从人参属植物的叶和/或茎获得提取物，首先将这些叶和/或茎在10-20当量的水中，在pH 4-10，50-180℃条件下加热0.5-20小时。如上所述，使用的人参属植物可以是Panax ginsengC.A.Mayer，Panax quinquefolum，Panax notoginseng，Panaxpseudoginseng，Panax japonicum，以及Panax vietnamensis Ha et Grushv等中的一种或者多种。热水处理后，通过过滤除去人参的叶和/或茎以及残留物。通过细滤过程和离心除去小的漂浮颗粒。用0.45μm孔径的过滤器或超滤器进行最终过滤，并且在7000离心30分钟。例如通过蒸发促进多糖的分离而浓缩由此获得的溶液。可以在70℃，760mmHg的条件下进行浓缩过程，直到糖度折光仪测定溶液的浓度达到20白利。为了从浓缩液有效收集多糖，将0.1-1M NaCl，优选0.5-1M的NaCl加入到浓缩液中。然后利用1-4体积，优选2-4体积的诸如甲醇和乙醇，丙醇的醇或丙酮沉淀多糖。用95％或更高浓度的醇或丙酮漂洗沉淀的多糖若干次以除去水和杂质，然后通过进行透析或超滤作用除去盐和醇。经过热风干燥、真空干燥、冷冻干燥、喷雾干燥等中的一种干燥由此获得的多糖。

依赖于靶药物及其应用可以更有效地选择精炼过程。示范性的过程描述如下。完成分离以及过滤后，将溶液调整到约pH 8.0以及0.4MNaCl/10mM Tris--HCl，然后以30ml/min的速度加样到阴离子交换树脂柱中。必须首先用0.4M NaCl/10mMTris--HCl平衡阴离子交换树脂以便只吸附有色物质和杂质而非多糖。用缓冲溶液充分洗涤阴离子交换树脂柱。将已经通过柱子的溶液调解到pH6-7，然后以30-50ml/min的速度上样到吸附剂树脂柱中。用蒸馏水(DW)充分洗涤柱体。进行3-次乙醇沉淀法以检测是否所有多糖都流出了柱体。3体积的95％乙醇被添加到流动溶液中以有效地沉淀多糖，由此浓缩多糖。为了收集多糖，进行离心(5000rpm，15分钟)并透析。将由此获得的溶液调节到pH 8。将10mM Tris--HCl(pH 8)缓冲液加入到溶液后，以15-20ml/分钟的速度将溶液上样到阴离子交换树脂柱体上。用缓冲液充分洗涤柱体后，用0.5M NaCl进行洗脱。将3体积的乙醇添加到洗脱物中沉淀多糖，然后进行离心收集。用95％乙醇洗涤收集的小球两次然后透析截流6000MW的分子以除去剩余的乙醇和低分子量杂质，然后进行冷冻干燥。

用三次蒸馏水稀释由溶剂提取获得的提取物从而到达1mg/ml的浓度然后进行分析。结果表明Panax ginseng C.A.Mayer的中性糖含量为68.9％，糖醛酸含量为15.9％，蛋白质含量为8.7％；Panax quinquefolum的中性糖含量为57.8％，糖醛酸含量为35％，并且蛋白质含量为5.4％。

通过利用离子交换树脂，吸附剂树脂等精制分离/精炼过程获得的提取物用三次蒸馏水稀释到1mg/ml的浓度然后进行分析。结果表明Panax ginseng C.A.Mayer的中性糖含量为51.3％，糖醛酸含量为46.8％，并且蛋白质含量为0.1％，其中糖的分配是鼠李糖5.97％，岩藻糖1.22％，阿拉伯糖14.86％，木糖0.44％，甘露糖1.93％，葡萄糖3％，半乳糖22.7％，半乳糖醛酸31.4％，葡糖醛酸14.4％，KDO(2-酮-3-脱氧辛糖醛酸)1.38％，以及DHA(3--脱氧---D-来苏糖-2--heptulosaric acid)1.02％；Panax quinquefolum具有的中性糖含量为49％，糖醛酸含量为50.8％，以及蛋白质含量为0.2％，其中糖的分配是鼠李糖9.7％，岩藻糖4.1％，阿拉伯糖8.7％，木糖0.7％，甘露糖1.5％，葡萄糖1.2％，半乳糖12％，半乳糖醛酸44％，葡糖醛酸5％，KDO 6％以及DHA 1.2％。

本发明的发明者发现人参叶和/或茎的提取物具有大约6,000-340,000Da，以及平均分子量大约120,000Da的分子量。

同样，糖的组成根据人参种类的不同而不同，例如中性糖为30-80％，酸性糖为10-60％，以及蛋白为0.01-10％；然而，通常糖包含鼠李糖，岩藻糖，阿拉伯糖，木糖，甘露糖，葡萄糖，半乳糖，半乳糖醛酸，葡糖醛酸，KDO以及DHA，并且所有的提取物显示出抗癌、抗转移和/或抗癌药物佐剂的效果。

包含从上述人参叶和/或茎获得的提取物或多糖的组合物激活诸如NKT细胞，NK细胞、巨噬细胞、T细胞、B细胞等的免疫细胞，并且促进与抗癌功能相关的细胞因子的分泌，由此显著降低癌细胞的增殖和转移。因此，所述组合物可用作抗癌药物和抗癌转移抑制药物。同样，组合物通过降低抗癌药或放射治疗的副作用可被用作抗癌药或放射治疗的佐剂。

本发明的组合物可以独自配制或与药用常规载体一起配制成传统的剂型，诸如口服药物，例如药丸，胶囊，液态，悬浮液形成等，以及注射用药物。为了防止药物口服过程中被胃酸降解，可以与抗酸剂一起共给药或与肠溶衣一起配制。

必须通过考虑活性成分的吸收速率，灭活率，排泄率，患者的年龄，性别以及目前的健康状况适当地确定人体内多糖的剂量，并且通常为成年人每天100μg-6000mg，优选地为20-5000mg。

本发明的组合物可以更进一步包含抗癌药物和/或其佐剂或将它们一起共给药。抗癌药物的种类没有特别的限制，并且其实例包括

和

附图说明

图1是显示根据本发明的实施例1和比较实施例1从Panax ginsengC.A.以及Panax quinquefolium的叶和茎获得的多糖对肺癌转移的抑制效果的图；

图2是显示根据本发明的实验实施例2，人参叶或茎的提取物MB40100对实体癌的抗癌效果；

图3是显示根据本发明的实验实施例3，MB40100对肺癌转移的预防效果的图；

图4是显示根据本发明的实验实施例4，MB40100减少肺癌转移的效果图；

图5是显示根据本发明的实验实施例5，MB40100增强对NK细胞介导的对癌细胞的细胞毒性的效果图；

图6是显示根据实验实施例6，由人参的叶或茎的提取物诱导的粒细胞巨噬细胞-集落形成单位(GM--CFU)的增加图；

图7是显示根据实验实施例7由MB40100降低抗癌药物诱导的抑制造血功能的效果图，其由血液中白血球数目的改变表示；

图8是显示根据实验实施例7，MB40100降低抗癌药物诱导的抑制造血功能的效果图，其由血液中血小板数目的改变表示；

图9是显示根据实验实施例7，由MB40100降低抗癌药物诱导的抑制造血功能的效果图，其由脾细胞数目的改变表示；

图10是显示根据实验实施例7，由MB40100降低抗癌药物诱导的抑制造血功能的效果图，其由骨髓细胞数目的改变表示；

图11是显示根据实验实施例8，MB40100抗放射的防御效果图，其由脾细胞数目的改变表示；

图12是显示根据实验实施例8，由MB4013A0抗放射的防御效果图，其由骨髓细胞数目的改变表示；

图13A到13D是显示根据实验实施例9，由MB4013A0激活免疫细胞的程度图；

图14A和14B是显示根据实验实施例9，MB40100诱导的抗癌细胞因子的水平图；

图15是显示根据实验实施例10，由MB40100对抗癌药物和MB40100共给药中抗癌药物的副作用的抑制作用的图；

图16是显示根据实验实施例10，抗癌药物和MB40100共给药增强抗癌效果的图；以及

图17是显示根据实验实施例11，由抗癌药物和MB40100共给药增强抗癌效果的图。

优选实施方案的详细描述

本发明参考下列实施例进行更详细的描述。然而本发明的范围并不限于这些。

制备实施例1：从人参叶和/或茎制备粗多糖提取物

将100g的Panax ginseng C.A.Mayer叶和/或茎添加到1L水中，然后在100℃加热5小时以从其中提取活性成分。由过滤以及7,000rpm离心30分钟从叶和/或茎分离液相以从其中除去不溶性杂质。在70℃760mmHg压力下将含有多糖的上清液浓缩到20白利以获得100ml的浓缩液。添加氯化钠到终浓度1M，并添加300ml的乙醇。将合成混合物放置1小时进行沉淀。用100ml的95％乙醇洗涤沉淀两次以除去杂质然后透析，继之以冷冻干燥获得粗多糖提取物。

同样重复Panax quinquefolium叶和/或茎的上述过程获得粗多糖提取物。

制备实施例2：从人参叶和/或茎制备多糖

将500g的Panax ginseng C.A.Mayer添加到5L蒸馏水中并加热3小时制备提取物溶液。从提取物溶液由纱布分离淤浆。在7,000rpm离心提取物溶液20分钟以分离上清液。将上清液调整到约pH 8.0以及0.4M NaCl/10mM Tris--HCl，然后以30ml/min的速度上样到阴离子交换树脂(基于PA312的强碱性阴离子交换树脂，samyang公司)中。阴离子交换树脂先前已经用0.4M NaCl/10mM Tris--HCl平衡以便只吸附杂质并防止多糖的吸附。用缓冲液充分清洗阴离子交换树脂，并且将已经通过树脂的溶液调解到pH 6-7。将合成溶液以30-50ml/min的速度上样到吸附剂树脂(HP 20，Mitsubishi Corporation)中。用蒸馏水充分洗涤柱体然后利用三重乙醇沉淀法证实是否所有的溶液都已经流过柱体。3体积的95％乙醇被添加到流动溶液中以有效地只沉淀多糖，由此浓缩多糖。为了收集多糖，在5,000rpm离心溶液15分钟然后透析。被调解到pH 8、10mM Tris--HCl的合成溶液以15-20ml/min的速度上样到阴离子交换树脂柱体上(Q琼脂糖凝胶，Phamaciabiotech.公司)进行吸附。用10mM Tris--HCl缓冲液洗涤并且用0.5MNaCl进行洗脱。将3体积的乙醇添加到溶液中沉淀多糖。在5,000rpm离心溶液15分钟获得沉淀物。用95％乙醇洗涤沉淀物两次除去杂质，并透析截流小于6000分子量的分析以除去剩余的乙醇，继之以冷冻干燥，获得多糖。

对Panax quinquefolium的叶和/或茎重复上述过程以获得多糖。制备实施例3：制备来自人参叶和/或茎的提取物，MB40100，并制备用于注射的液体溶液

制备实施例2中已经上样到阴离子交换树脂柱体(Q-琼脂糖凝胶)中来源于Panax ginseng C.A.Mayer的溶液上样到填充了二氧化硅凝胶的柱体中以从其中除去致热原物质。加入3体积的乙醇沉淀多糖，并通过离心收集多糖然后用95％乙醇洗涤两次以除去杂质。产生的部分溶于三次蒸馏水然后透析截留小于6,000分子量的分子以除去剩余的乙醇。为了无菌，将获得的级分上样到0.2μm的过滤系统中制备无致热原物质的溶液。无菌溶液在3ml小瓶中冷冻干燥制备多糖级分。将干燥的多糖级分溶于盐溶液中制备用于注射的液体溶液，其用于下述实施例。从Panax ginseng C.A.Mayer叶或茎提取的多糖被命名为“MB40100”。

实验实施例1：分析从人参叶和/或茎获得的提取物

对上述制备实施例制备的提取物进行组分分析。

通过石炭酸-硫酸法(Dubois等，Anal.Chem.，28，350，1956)利用半乳糖作为标准物质测量糖的总含量。通过间羟基联苯基法(Blumenkrantz等，Anal.biochem.，54，484，1973)利用β-D-半乳糖醛酸作为标准物质测定糖醛酸的含量。通过Lowry法(Lowry等，J.Biol.，Chem.，193，265，1951)利用牛白蛋白作为标准物质测定蛋白含量。通过硫代巴比妥酸法测定KDO(3-脱氧-D-甘露糖-2-octubsonic酸)。

通过气液色谱法(GLC)，利用Jones法(plant physiol.，49，926，1972)用醛醇乙酸酯作为衍生物进行多糖分析。

在制备实施例1中获得的粗提物溶于三次蒸馏水到1mg/ml的浓度然后根据上述方法进行分析。结果表明Panax ginseng C.A.Mayer的中性糖含量为68.9％，糖醛酸含量为15.9％，以及蛋白质含量为8.7％；Panax quinquefolium的中性糖含量为57.8％，糖醛酸含量为35％，并且蛋白质含量为5.4％。

在制备实施例2中获得的提取物溶于三次蒸馏水到1mg/ml的浓度然后根据上述方法进行分析。结果表明Panax ginseng C.A.Mayer的中性糖含量为51.3％，糖醛酸含量为46.8％，蛋白质含量为0.1％，其中糖组合物包括鼠李糖5.97％，岩藻糖1.22％，阿拉伯糖14.86％，木糖0.44％，甘露糖1.93％，葡萄糖3％，半乳糖22.7％，半乳糖醛酸31.4％，葡糖醛酸14.4％，KDO1.38％，以及DHA(d-脱氧-D-来苏糖-2-heptulosaric acid)1.02％；Panax quinquefolium具有的中性糖含量为49％，糖醛酸含量为50.8％，蛋白质含量为0.2％，其中糖组合物包括鼠李糖9.7％，岩藻糖4.1％，阿拉伯糖8.7％，木糖0.7％，甘露糖1.5％，葡萄糖1.2％，半乳糖12％，半乳糖醛酸44％，葡糖醛酸5％，KDO 6％以及DHA 1.2％。

通过HPLC串联连接GS--520HQ，GS--320HQ和GS--220HQ(Shodex Asaipack GS系列，Showa Denko Corporation)测定分子量。根据测量，人参的叶和/或茎的提取物具有约6,000-340,000Da，以及平均分子量大约120,000Da的分子量。

虽然糖的组成根据人参叶和茎种类的不同而不同，诸如中性糖为30-80％，uronic糖为10-60％，以及蛋白为0.01-10％；然而糖组合物通常包含鼠李糖、岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、半乳糖醛酸、葡糖醛酸、KDO以及DHA，并且所有的提取物显示出抗癌、抗转移的效果并发现具有抗癌药物佐剂的功能。

比较实施例1：比较从PANAX GINSENG C.A.MAYER和Panaxquinquefolium提取的多糖的活性

测量从每一制备实施例获得的每一提取物抑制肺癌转移的能力，并且人们发现Panax ginseng C.A.Mayer具有88.3％的抑制率，而Panaxquinquefolium具有83.1％的抑制率(参考图1)。在下面的实施例中，使用从Panax ginseng C.A.Mayer提取的多糖MB40100，因为它显示出更高的抗癌转移抑制率。

实验实施例2：MB40100抗实体癌的抗癌效果

将非上皮癌细胞系1×10⁶肉瘤180细胞注射在BALB/c小鼠(20只/组)的鼠蹊部。注射3天后，在10天期间每天口服10和20mg/kg浓度的MB40100一次，口服后，与对照组比较肿瘤的大小。对作为上皮癌细胞系的UV2237P细胞重复上述过程。如图2所示，在非上皮癌的情况下，以10mg/kg的剂量MB40100治疗肿瘤大小降低60％，20mg/kg的剂量肿瘤大小降低70％。。对比上皮癌，在相应的剂量，MB40100治疗肿瘤大小分别降低65％和78％。

实验实施例3：MB40100对肺癌转移的预防效果

作为强转移性结肠癌细胞的结肠26-M3.1细胞培养在含有7.5％FBS，维生素溶液，丙酮酸钠，非必要氨基酸和L-谷氨酰胺的EaglesMEM配养基中。通过将癌细胞注射到Balb/c小鼠然后测量癌症转移的程度(YOO等，1994 VACCINE 12，175--180)进行结肠26-M3.1细胞的肺癌转移实验。将溶于PBS并经0.2μl无菌过滤纸过滤的MB40100以不同剂量，即分别为500μg，100μg，20μg，以及4μg注射到每一小鼠的静脉中。注射后2天，注射结肠26-M3.1细胞(2.5×10⁴细胞/小鼠)评价抗癌转移的预防有效果。注射后14天，处死小鼠并将它们的肺保存在Bouin’s溶液中。记录转移到肺的癌细胞的数目。如图3所示，血管中注射的MB40100显著抑制的结肠26-M3.1细胞的肺转移。

实验实施例4：MB40100对肺癌转移的治疗学效果

将作为转移性非常强的结肠癌细胞，结肠26--M3.1细胞培养在含有7.5％FBS，维生素溶液，丙酮酸钠，非必要氨基酸以及L-谷氨酰胺的Eagles MEM中。通过将癌细胞注射到C57BL/6小鼠以及Balb/c小鼠进行结肠26--M3.1细胞的肺癌转移实验以测定癌症转移的程度(Yoo等，1994 Vaccine 12，175--180)。将溶于PBS并通过0.2μl无菌过滤纸过滤的MB40100以不同剂量注入每一小鼠体内。将结肠26--M3.1细胞(2.5×10⁴细胞/小鼠)注入小鼠体内诱导转移癌症的生长。在注射后1天和4天，将500μg，100μg以及20μg的MB40100分别注入小鼠的血管内以测定对癌症转移的治疗学效果。注射癌细胞后14天，处死小鼠病分离它们的肺病保存在Bouin’s溶液中。通过显微镜检查记录转移到肺的癌细胞数目。如图4所示，注射到血管中的MB40100依赖于给药剂量显著抑制了转移在肺细胞中的结肠26--M3.1细胞的生长。

实验实施例5：测量由MB40100激活的NK-介导的对癌细胞的细胞毒性

通过测定⁵¹Cr，放射性同位素的活性评价由MB40100激活的NK-介导的对癌细胞的细胞毒性(Yoo等，1997，Jpn.J.Cancer Res.88，184--190)。分别将500μg、100μg，20μg以及4μg的MB40100注入每组两只的Balb/c小鼠的静脉中。注入后2天，收集小鼠的脾细胞。将⁵¹Cr-标记的Yac-1细胞(1×10⁴/100μl/微孔)以一定比例(E/T比例)放入圆底96-微孔板中的每一脾细胞溶液中，所述效应物(脾细胞)∶靶(Yac--1)细胞的比例分别为100∶1，50∶1，25∶1以及12.5∶1。将它们在5％CO₂和37℃条件下培养6小时。培养后，将微孔板离心10分钟，然后用棉拭吸收每一微孔中的上清液。利用γ粒子计数管测量放射性同位素的量。根据下列公式将由NK细胞产生的细胞毒性计算为放射性(计数/分钟)：

细胞毒性(％)＝[(实验释放-自发释放)/(最大释放-自发释放)]×100

如图5所示，已经注射了MB40100的小鼠脾细胞中NK细胞的活性根据MB40100浓度的增加而增强，并且与对照组相比施用了500μg、100μg以及20μg的组显示出的活性增加了3-10倍。虽然NK细胞的活性通常随着E/T比例的改变而改变，但是本实验实施例中NK细胞的活性无论E/T比例是否增加都显著增强。

实验实施例6：通过产生粒细胞巨噬细胞-集落形成单位(GM-CFU)增强造血功能

1×10⁵细胞/ml的骨髓细胞放入35mm平皿(2mm网格，NalgenNunc)中，利用1ml的MethoCult(Stem Cell，Canada)琼脂，用不同浓度的MB40100进行处理，然后在37℃以及5％CO₂的条件下在恒温箱中培养7天。无MB40100的琼脂用作对照组。培养7天后，培养的35mm平皿放在具有2mm网格的60mm平皿上并通过显微镜检查记录集落的数目。虽然10μg-处理组中的集落数目为168，不同于非处理的对照组，但是与对照组相比50μg和100μg-处理组中的集落数分别增加36.6％和32.5％。

实验实施例7：MB40100降低由抗癌药引起的抑制造血水平的效果

通常，抗癌药(例如环磷酰胺)体内起免疫抑制剂的作用，由此减少免疫系统中细胞的数目，这是抗癌药的典型副作用。在本实验中，在MB40100共给药的过程中测定免疫细胞的数目，所述共给药被期望降低用环磷酰胺给药中发生的免疫抑制。

环磷酰胺(250mg/kg)给药后24小时和48小时，分别以不同的剂量(10mg/kg，20mg/kg)对小鼠腹部施用MB40100。7天后，处死小鼠病分离骨髓细胞和脾细胞，然后根据台盼蓝拒染法(Trypanblue exclusion)对这些细胞进行计数。

利用肝素处理的玻璃毛细管从眼球末梢的静脉快速取周围血液并收集在K3-EDTA-处理的血液采集管中，然后用自动血球分析器检验。

A.施用环磷酰胺后白血球(白细胞：WBC)数目的改变

当利用自动血球分析器测定时，从正常小鼠眼球末梢静脉收集的血液中WBC的数目平均为7800；然而施用环磷酰胺的小鼠组WBC的数目为5300，与正常小鼠相比减少了约30％。同时，在施用环磷酰胺前2天施用10mg/kg和20mg/kg MB40100的小鼠组，WBC的数目分别为6600和6400，与只施用环磷酰胺的小鼠相比约提高了15％。

此外，在施用环磷酰胺后1天施用MB40100的小鼠组，WBC的数目比对照组约高12.1％；然而随着MB40100浓度的不同并无差异。并且，施用环磷酰胺前后两次施用MB40100的小鼠组，WBC的数目比对照组高约15％(参考图7)。

B.周围血液中血小板数目的改变

只施用环磷酰胺小鼠的血小板数目比正常小鼠约少56％。当施用MB40100时，血小板的数目比只施用环磷酰胺的情况高约6.6％，显示了复原效果。而且，无论是在施用前还是后施用MB40100增加约6-7％(参考图8)。

C.脾细胞数目的改变

只施用了环磷酰胺的小鼠脾细胞的数目比正常小鼠少约72.8％。同时，当施用环磷酰胺前施用20mg/kg的MB40100时，脾细胞的数目比只施用环磷酰胺的小鼠高26.8％。并且施用环磷酰胺后分别施用了10mg/kg和20mg/kg MB40100的小鼠组，脾细胞的数目高了33％和43％。上述结果表明MB40100可以降低由抗癌药引起的免疫细胞抑制(参考图9)。

D.骨髓细胞数目的改变

施用环磷酰胺后7天，记录处死的小鼠骨髓细胞的数目。正常小鼠的骨髓细胞密度为41.1×10⁶细胞/ml，但是施用环磷酰胺的小鼠的骨髓细胞密度为29.6×10⁶细胞/ml，其通过抗癌药物降低了29.2％。然而施用环磷酰胺前2天施用10mg/kg和20mg/kg MB40100的小鼠组的细胞数目分别比施用环磷酰胺小鼠组高17.1％和18.1％。同样，在施用环磷酰胺后施用20mg/kg MB40100的小鼠组的细胞数目增加10.78％(参考图10)。

实验实施例8：MB40100抗放射的抗癌效果

癌症治疗过程中常常伴随抗癌药给药的放射治疗破坏骨髓细胞并且对正常免疫细胞的产生和复制具有副作用，由此损坏造血和免疫功能。在本试验中，检验了MB40100的共给药是否能够降低放射治疗伴随的造血和免疫功能的恶化。

将MB40100腹部注射于重18-22g的雄性Balb/c小鼠，48小时后，将小鼠暴露于半致死的量4.5Gy的钴(60Co)γ射线。放射后5和9天，处死小鼠收集骨髓细胞和脾细胞，然后根据台盼蓝拒染法(Tryphan blue exclusion)记录每一细胞的数目。对对照组，施用PBS代替MB40100。

A.脾细胞数目的改变

半致死放射量的4.5Gy钴γ放射正常小鼠并且，5天后，脾细胞数目为15.8×10⁴细胞/ml，其只是正常小鼠脾细胞数目的3％，9天后恢复到14.8％。然而，放射之前施用2天10mg/kg的MB40100的小鼠组，5天后的脾细胞数目为7.6％并且9天后恢复到18.2％。放射之前施用2天20mg/kg的MB40100的小鼠组，5天后脾细胞数目为4.6％，小于10mg/kg-给药组，并且9天后没有继续增长。并且放射后1天施用MB40100的小鼠组，根据MB40100的浓度脾细胞的数目增长，并且没有差异。放射前后施用MB40100的小鼠组，脾细胞的数目与未施用MB40100的小鼠组相比增长(参考图11)。

B.骨髓细胞数目的改变

放射后5天，当从小鼠左侧股骨区收集骨髓细胞时，细胞数目为正常小鼠的5.3％。放射后9天，细胞数目增加到正常小鼠的11.8％。然而放射前后施用10mg/kg和20mg/kg MB40100的小鼠组的细胞数目与未处理的小鼠相比，5天后处死的小鼠高6-7％，并且9天后处死的小鼠高约15.7％。因此，MB40100被证实是有助于保护放射小鼠骨髓细胞，由此保持造血功能(参考图12)。

实验实施例9：激活免疫细胞以及产生抗癌细胞因子

将MB40100以10mg/kg的浓度施用于C57/BL6小鼠的腹部，然后每小时收集脾细胞。利用荧光标记的受体对免疫细胞进行FACS分析。结果表明所有与免疫相关的细胞，诸如NKT细胞，NK细胞，树突状细胞，巨噬细胞，CD4，CD8细胞，B细胞等被激活并且最大激活发生在施用MB40100后16小时。

为了测量从每一免疫细胞分泌的细胞因子的量，将MB40100以10mg/kg的浓度施用于C57/BL6小鼠的腹部，然后16小时后收集脾细胞。利用荧光标记的每一免疫细胞的受体以及细胞因子抗体按照胞内染色法测量从每一免疫细胞分泌的细胞因子的量。结果表明在施用MB40100的小鼠组，从NKT细胞和T细胞分泌的TNF-a IL-3增加，从巨噬细胞和树突状细胞分泌的IL-12和TNF-a也增长(参考图14)。

实验实施例10：MB40100与抗癌药物(1)共给药的协同作用

将癌细胞系B16-BL16以每小鼠1×10⁵细胞的量腹部施用于C57BL/6小鼠。通过0.2μm过滤器过滤的MB40100从注射癌细胞后第1天起每隔3天静脉内注射，共4次，注射浓度为每小鼠1mg和200μg。分别以每小鼠100μg，50μg以及20μg的浓度静脉内注射抗癌药物顺氯氨铂。小鼠被分成只施用抗癌药物的小鼠组，与抗癌药物共施用MB40100的小鼠组，并测量肿瘤大小和重量。结果表明在共给药的小鼠组癌细胞增殖被抑制约43％。也就是，在将MB40100与顺氯氨铂共给药的小鼠组，小鼠积极运动并恢复到正常小鼠的重量。相反，只施用50μg顺氯氨铂的小鼠组，观察到严重的副作用，诸如体重损失以及活动性降低。结果，MB40100被认为是有助于造血系统的激活以及免疫应答的激活(参考图15&16)。

实验实施例11：MB40100与抗癌药物(2)其给药的协同作用

裸鼠(雄性)用作实验对象。对施用抗癌药物(紫杉醇)的小鼠组，施用MB40100的小鼠组，以及共施用紫杉醇和MB40100的小鼠组测定肿瘤大小。考虑到小鼠的健康状况和毒性，从注射肿瘤后第6天每隔3天施用紫杉醇共7次，施用浓度为12.5mg/kg。注射肿瘤之前2天以及注射肿瘤后每隔3天以10mg/kg的浓度腹部施用MB40100，不与紫杉酚给药的时间重叠。使用的癌细胞系为PC-3并以每小鼠2×10⁶细胞的量皮下注射。

从注射肿瘤后14到31天测定肿瘤大小。紫杉酚和MB40100共给药的小鼠组的肿瘤大小小于只施用紫杉酚的小鼠组的肿瘤大小。由此可见MB40100和抗癌药物的共给药对抑制实体癌具有协同作用(参考图17)。

实验实施例12：制备片剂

玉米淀粉 34g

结晶纤维素 10g

Brewer′s酵母 40g

硬脂酸镁 1g

制备实施例1的多糖级分 15g

总计 100g

上述配方的成分均匀地混合然后由造粒机压缩以便产生500mg/片剂的片剂。

实验实施例13：制备粉末药物

Brewer′s酵母 45g

硬脂酸镁 5g

制备实施例1的多糖级分 50g

总计 100g

上述配方的成分均匀地混合然后由装配机填入胶囊以便产生500mg/胶囊的胶囊。

发明效果

从人参属植物的叶和/或茎提取的本发明的提取物或多糖具有抑制癌症转移的效果，借此它可用作癌症治疗的药物，预防和治疗癌症转移的药物，以及抗癌药和放射治疗的佐剂。

因此，包含从上述提取物或多糖级分的组合物对免疫系统的全部激活有效，所述免疫系统包括NKT细胞、NK细胞、巨噬细胞、T细胞、B细胞等。以及增强与抗癌相关的细胞因子的分泌，由此显著抑制癌细胞的增殖和转移，以便通过降低它们的副作用，诸如减少白细胞数目，可用作抗癌以及抗转移药物以及一般抗癌药以及放射治疗的佐剂。

本发明可以包括在若干形成中，只要不背离其精神或本质特性，同时应该理解上述实施例不受任一上述说明细节的限制，除非另作说明，而是应该广泛理解为包含在附属权利要求定义的精神和范围内，因此符合权利要求要求和范围或与这种要求和范围等效的所有改变和修饰都包含在附属权利要求的范围内。

Claims

1.一种抗癌药物和/或其佐剂的组合物，含有从人参属植物的叶和/或茎获得的提取物作为活性成分，其中的提取物包含多糖，多糖包括2-酮-3-脱氧辛糖醛酸并具有6,000-340,000Da的分子量；以及

人参属植物是选自人参(Panax ginseng)、西洋参(Panaxquinquefolium)、三七(Panax notoginseng)、假参(Panax pseudoginseng)、日本参(Panax japonicum)和越南参(Panax vietnamensis)中的一种或者多种。

2.根据权利要求1的组合物，其中的提取物通过加热水中的叶和/或茎获得。

3.根据权利要求1的组合物，其中的多糖包括含有中性糖，糖醛酸和/或蛋白的糖蛋白。

4.根据权利要求3的组合物，其中多糖的糖组成包含鼠李糖、岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、半乳糖醛酸、葡糖醛酸、2-酮-3-脱氧辛糖醛酸和3-脱氧-D-来苏糖-2-heptulosaric acid。

5.根据权利要求1到4任一项的组合物，其中的组合物具有抑制癌细胞的增殖和转移的效果。

6.根据权利要求1到4任一项的组合物，其中的组合物具有对上皮或非上皮来源的实体癌具有治疗和/或预防的效果。

7.根据权利要求1到4任一项的组合物，其中的组合物具有治疗和/或预防癌症的效果。

8.根据权利要求1到4任一项的组合物，其中的组合物对下列至少一种功能有效：增强造血功能、骨髓防御、增强免疫以及辅助放射治疗。

9.根据权利要求8的组合物，其中的组合物具有增强造血功能的活性。

10.根据权利要求8的组合物，其中的组合物具有降低一般抗癌药副作用。

11.根据权利要求8的组合物，其中的组合物具有减少白细胞和血小板的活性。

12.根据权利要求8的组合物，其中的组合物具有保护骨髓和脾免于放射的活性。

13.根据权利要求8的组合物，其中的组合物具有增强包括NKT细胞、NK细胞、巨噬细胞、T细胞和B细胞在内的免疫系统细胞激活的活性。

14.根据权利要求8的组合物，其中的组合物激活NKT细胞、NK细胞、巨噬细胞、T细胞和B细胞分泌作为抗癌物质的肿瘤坏死因子、γ干扰素和白介素1，由此显示出抗癌。

15.根据权利要求1到4任一项的组合物，其中的组合物进一步含有抗癌药物和/或其佐剂。

16.根据权利要求15的组合物，其中的抗癌药物为紫杉醇、顺氯氨铂、环磷酰胺或其中的两种或者更多种。

17.根据权利要求1到4任一项的组合物，其中的组合物进一步包含载体或赋形剂。

18.根据权利要求17的组合物，其中的载体或赋形剂为饮料或食品形式的药用载体或赋形剂。

19.权利要求1到4任一项的组合物与抗癌药物一起在制备用于治疗癌症的药物中的应用。

20.根据权利要求19的应用，其中的抗癌药物为紫杉醇、顺氯氨铂、环磷酰胺或其中的两种或者更多种。

21.含有权利要求1到16任一项的组合物作为活性成分以及药用载体或赋形剂的药物，用于增强造血功能、骨髓防御、增强免疫、辅助抗癌、辅助放射治疗、预防癌症以及治疗癌症的目的。

22.根据权利要求21的药物，其中的药物进一步含有抗酸剂。

23.根据权利要求22的药物，其中的药物剂型为下列其中一种用于单剂量或多剂量的形式：片剂、粉末、硬或软胶囊、悬浮液、注射液以及乳剂。

24.权利要求21到23任一项的药物，基于成年人的平均体重，其中的活性成分的剂量范围为0.1-6,000mg/天。

25.从人参属植物的叶和/或茎制备提取物的方法，包括如下步骤：

a)加热水中的人参属植物的叶和/或茎获得粗提物溶液的步骤；

b)任选地浓缩粗提物溶液的步骤；

c)利用有机溶剂分离多糖，沉淀粗提物溶液中含有的多糖的步骤；以及

d)除去有机溶剂获得多糖级分的步骤，其中的步骤进一步包括在步骤c)和/或d)之前，将在前步骤中获得的产物用阴离子交换层析法以及透析法进行纯化。

26.根据权利要求25的方法，其中的加热水中的人参属植物的叶和/或茎的步骤是在50-180℃的温度范围内进行0.5-20小时。

27.根据权利要求25的方法，其中的有机溶剂为醇或丙酮。

28.根据权利要求27的方法，其中的醇为乙醇、甲醇、异丙醇或丙醇。

29.含有根据权利要求25到28任一项的方法获得的提取物的组合物，其具有30-80％的中性糖含量，10-60％的糖醛酸含量以及0.01-10％的蛋白质含量。

30.根据权利要求29的组合物，其中的提取物不包含蛋白。

31.根据权利要求29的组合物，其中的提取物包含人参属植物的叶和/或茎的多糖，其中的多糖具有6,000-340,000Da的分子量。

32.根据权利要求29到31任一项的组合物，其中多糖中的糖组成包括鼠李糖、岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、半乳糖醛酸、葡糖醛酸、2-酮-3-脱氧辛糖醛酸和3-脱氧-D-来苏糖-2-heptulosaric acid。