CN102827256A - 人参糖蛋白的制备及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医药和保健食品开发技术领域，提供了一种经大孔吸附树脂、中空纤维柱超滤分离等技术，从传统中药人参中提取分离得到人参糖蛋白的方法，该糖蛋白中总糖含量为30%左右，酸性糖含量在10%左右，蛋白质含量在30%以上，人参糖蛋白重均分子量(Mw)分布在1.7×104左右，糖部分的糖苷键连接方式为以1→4连接葡萄糖为主链，蛋白质部分由16种氨基酸组成，通过药效学试验也证明了人参糖蛋白具有抗炎、镇痛和镇静的作用。
Description
技术领域
本发明涉及一种由人参中提取分离得到的人参糖蛋白，其中总糖含量为30%左右，酸性糖含量在10%左右，蛋白质含量在30%以上，人参糖蛋白重均分子量(Mw)分布在1.7×104左右，糖部分的糖苷键连接方式为以1→4连接葡萄糖为主链，蛋白质部分由16种氨基酸组成。此人参糖蛋白具有抗炎、镇痛、镇静的作用。本发明属于医药和保健食品开发领域。
背景技术
人参为五加科植物人参（Panax ginseng C.A.Meyer）的干燥根及根茎。为名贵药材，具有独特的药用价值和医疗保健作用，一直深受人们的重视。多年的研究结果表明，人参在调节中枢神经系统、提高学习记忆能力、改善心脏功能、 降血糖作用、增强机体的免疫功能、抗肿瘤作用、抗氧化作用等方面都显示出很强的药用活性。迄今为止，已从人参中分离出的化学成分有皂苷类化合物、多糖（寡糖）类成分、多肽、脂肪酸类化合物、氨基酸等，其中研究最多的是人参皂苷类和多糖类成分为人参生物活性的主要成分。目前，对人参糖蛋白的研究报道甚少。经文献检索，仅查到张彬等报道的人参糖蛋白的分离纯化及其性质研究（药物分析杂志 2006（26）2 272-276页），该文献报道的人参糖蛋白的制备是将人参粗多糖提取物先经Hiprep2660Sephacryl S200柱层析分离纯化得到第一个组分峰1，再经 过HitrapQTM 26/60柱层析梯度洗脱纯化得到组分P1，经HPGPC检测，该组分P1为一峰形对称的蛋白质-糖组分，重均分子量(Mw)分布在24000左右，该组分对水透析，冷冻干燥，即为人参糖蛋白。张彬报道的人参糖蛋白仅是人参糖蛋白其中的一个片段(分子量在24000左右)，并对该片段的理化性质进行了研究。而本权利要求书1所制得的人参糖蛋白重均分子量(Mw)分布在1.7×104左右，所以，本权利要求书1与张彬报道的人参糖蛋白有其本质差异。
本发明所得到的人参糖蛋白其重均分子量(Mw)分布在1.7×104左右，其中人参糖蛋白中的总糖含量为30%左右，酸性糖含量为10%左右，蛋白质含量在30%以上。本发明所得到的人参糖蛋白，为今后以人参为原料开发新药、保健食品或食品拓宽了开发空间。
经文献检索，有关糖蛋白生物活性报道很多，主要集中在抗氧化、抗肿瘤、增强免疫方面的活性研究，关于糖蛋白的其他方面的用途非常少见。到目前为止，尚未检索到有关人参糖蛋白生物活性的报道。在本发明中，通过药效学实验数据证明了人参糖蛋白在抗炎、镇痛、镇静方面的活性，其中抗炎作用通过对小鼠二甲苯耳水肿的影响和对小鼠角叉菜胶足肿胀的影响来证实；镇痛作用通过对醋酸所致小鼠扭体反应的影响和对福尔马林所致小鼠疼痛的影响来证实；镇静作用通过对小鼠自主活动的影响和对小鼠戊四氮致惊厥的影响来证实。在本发明之前，尚未见有关人参糖蛋白抗炎、镇痛、镇静方面的研究报道。因此，本发明权利要求所保护的内容具有创新性和新颖性。
发明内容
本发明的目的之一是提供了一种植物资源丰富、可产业化生产的人参糖蛋白，可以更好地开发和利用著称为“百草之王”的传统中药—人参。该人参糖蛋白的特征在于：（a）人参糖蛋白中的总糖含量为30%左右，酸性糖含量为10%左右，蛋白质含量在30%以上；(b) 人参糖蛋白重均分子量(Mw)分布在1.7×104左右；（c）人参糖蛋白中的糖部分主要为葡萄糖，此外，还含有少量的甘露糖、半乳糖、岩藻糖、半乳糖醛酸；(d) 糖部分的糖苷键连接方式为以1→4连接葡萄糖为主链，（e）蛋白质部分由天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、组氨酸、甘氨酸、精氨酸、苏氨酸、脯氨酸、丙氨酸、缬氨酸、半胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、络氨酸等16种氨基酸组成。
本发明的目的之二是通过药效学试验筛选出人参糖蛋白的活性，通过试验结果表明人参糖蛋白在抗炎、镇痛、镇静方面具有良好的生物活性，为将人参糖蛋白开发成新药、保健食品或食品用于疾病的预防治疗及保健奠定了基础。
为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
1、人参糖蛋白的制备
将人参Panax ginseng C.A.Meyer粉碎，加10-15倍量的水煎煮2次，每次3小时，滤过，合并滤液，浓缩至每1ml含1g药材，通过已处理好的D101大孔吸附树脂，用水洗脱2倍量柱体积，水洗脱液通过截留分子量为20000的中空纤维柱进行超滤，超滤液继续通过截留分子量为1000的中空纤维柱进行超滤，浓备液浓缩，真空干燥， 得人参糖蛋白。
2、人参糖蛋白结构表征
为了确定人参糖蛋白中糖与蛋白部分的基本构成，我们利用化学方法和光谱数据验证上述工艺生产的产品为人参糖蛋白，分析结果如下：
（1）理化性质结果
总糖含量的测定 采用苯酚-硫酸法，葡萄糖作为对照品，制作标准曲线，结果表明，人参糖蛋白中的总糖含量在34%。
酸性糖含量的测定 采用间-羟基联苯法，半乳糖醛酸作为对照品，制作标准曲线，结果表明，人参糖蛋白中的酸性糖含量为12%，
蛋白质含量的测定 采用Lowry法，牛血清蛋白作为对照品，制作标准曲线，结果表明，人参糖蛋白中的蛋白含量在45%。
（2）分子量分布 采用HPLC，示差检测器，美国赛芬柱SRT SEC-100（截留分子量100-100000），以色氨酸（分子量为204.23）、蛋白酶抑制剂（分子量为6512）、VB12(分子量 为1355)、细胞色素C(分子量为12327)、牛血清白蛋白（分子量为66200）作为对照品，制作标准曲线， GPC软件计算结果表明，人参糖蛋白重均分子量(Mw)分布在1.74×104左右。
Ln(Mn)=Bo+B1×T+B2×T2+B3×T3
Bo=6.421077, B1=-0.1460711, B2=0, B3=0
R2=0.996563
（3）组成糖分析 采用PMP-柱前衍生化法，将人参糖蛋白中糖 部分制备成衍生物，以各单糖的衍生物作为对照品，HPLC结果表明，人参糖蛋白中糖部分主要为葡萄糖，还含有及少量的甘露糖、半乳糖、岩藻糖及半乳糖醛酸组成。
（4）甲基化分析 采用Hakomori法，将人参糖蛋白中糖部分制备成衍生物，GC-MS结果表明，人参糖蛋白中糖苷键连接方式为以1→4连接葡萄糖为主链。
（5）氨基酸分析，采用HPLC，将人参糖蛋白用6mol/L盐酸水解20小时，以20种氨基酸作为对照品，分别制作标准曲线,结果表明，人参糖蛋白由天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、组氨酸、甘氨酸、精氨酸、苏氨酸、脯氨酸、丙氨酸、缬氨酸、半胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、络氨酸16种氨基酸组成。
人参糖蛋白具有抗炎、镇痛、镇静的作用，这些药理作用，通过以下药效学试验例得到证实。
口服及腹腔给予小鼠人参糖蛋白，观察其对炎症、疼痛及中枢神经系统的影响。方法：采用小鼠二甲苯耳水肿及角叉菜胶足肿胀作为炎症模型、小鼠醋酸扭体、甲醛舔后足为疼痛模型，小鼠自主活动、戊四氮引起惊厥作镇静模型。
动物：昆明种小鼠，体重18-22g, 雄性，购自长春生物制品研究所，许可证号：SCXK（吉）-2006-0001。自由摄食饮水。
药物：人参糖蛋白由吉林省中医药科学院植化室提供，为浅黄色粉末。阿司匹林为沈阳奥吉娜药业有限公司产品，批号：20120107。安痛定为河南润弘制药股份有限公司产品，批号：1206091。300、200、 100mg/kg为人参糖蛋白口服给药剂量，实验前一天口服给药2次，每次间隔8h，实验当天再给药一次，共3次；60、30、15mg/kg为人参糖蛋白腹腔给药剂量，只在实验当天给药一次。
数据统计结果用t检验处理。
实验方法及结果
（1）.抗炎作用
a. 对小鼠二甲苯耳水肿的影响
取雄性小鼠80只，随机分为对照组、50mg/kg阿司匹林口服组、300、200、100mg/kg为人参糖蛋白口服组、60、30、15mg/kg为人参糖蛋白腹腔组，每组10只，共8组，于口服给药45min及腹腔给药30min后与小鼠左耳涂二甲苯20μl，20min后处死小鼠，利用9mm铁冲下动物左右耳，以动物左右耳差作为肿胀度，进行“t”检验。结果见表1。
b. 对小鼠角叉菜胶足肿胀的影响
分组及给药同前，实验当天于每只小鼠右后足注射0.1%角叉菜胶0.03ml,注射角叉菜胶后4h处死小鼠，在处死小鼠前45、30min分别口服及腹腔给药，于脚掌于脚踝绒毛分界处剪下左右脚掌，以左右足重量之差作为肿胀度，进行“t”检验。结果见表1、2。
表1.口服给予人参糖蛋白对小鼠炎症模型的影响
注：与对照组比较：* P<0.05，** P<0.01，*** P<0.001。
表2.腹腔给予人参糖蛋白对小鼠炎症模型的影响
注：与对照组比较：* P<0.05，** P<0.01，*** P<0.001。
从表1、2可见，人参糖蛋白对二甲苯及角叉菜胶所致的小鼠耳水肿及足肿胀均有一定的抑制作用，说明人参糖蛋白具有抗炎作用。
（2）镇静作用
a.对小鼠自主活动的影响
取小鼠80只按表2将小鼠随机分为8组，每组10只，阳性药肌注0.15ml/kg安痛定，给药同前，于口服给药45min、腹腔及肌注给药30min后置于自主活动记录仪中，使其适应 5 min 后开始记录随后 1min内的活动次数。见表2
自主活动抑制率（%）=（空白组活动次数-药物组活动次数）/
空白组活动次数×100%。
b.对小鼠戊四氮致惊厥的影响
分组给药同前，于口服给药40min、肌注及腹腔给药30min后，各组 ip 戊四氮 75 mg kg( 75% 惊厥发生剂量)，以小鼠跌倒并呈现阵挛性惊厥为指标，观察各组惊厥发作次数和潜伏时间, 见表3。
表3.口服给予人参糖蛋白对小鼠的镇静作用
注：与对照组比较：* P<0.05，** P<0.01，*** P<0.001。
表4.腹腔给予人参糖蛋白对小鼠的镇静作用
注：与对照组比较：* P<0.05，** P<0.01，*** P<0.001。
从表3、4可见，无论口服还是腹腔给药人参糖蛋白均可显著减少小鼠自主活动次数，对戊四氮引起的惊厥也有明显的抑制作用，证明人参糖蛋白具有明显的镇静作用。
(3)疼痛作用
a.对醋酸所致小鼠扭体反应的影响
取雄性小鼠80只，随机分为对照组，0.1ml/kg阳性药组。300、200、100mg/kg和60、30 、15mg/kg为人参糖蛋白口服和腹腔给药6个给药组，共8组。给药同前，于口服给药45min及腹腔给药30min后，腹腔注射(ip) 0.9%醋酸0.2ml/只，记录其15min内小鼠扭体次数。结果见表3。
b.对福尔马林所致小鼠疼痛的影响
取雄性小鼠80只，随机分为对照组，0.1ml/kg阳性药组，300、200、100mg/kg和60、30 、15mg/kg为人参糖蛋白口服和腹腔给药6个给药组，共8组。给药同前，于口服给药45min及腹腔给药30min后，于小鼠右后足腱膜下注入4%福尔马林10μl/只，记录其2min内及10-20min小鼠舔后右足的次数。结果见表5、6。
表5.口服给予人参糖蛋白对小鼠的镇痛作用
注：与对照组比较：* P<0.05，** P<0.01，*** P<0.001。
表6.腹腔给予人参糖蛋白对小鼠的镇痛作用
注：与对照组比较：* P<0.05，** P<0.01，*** P<0.001。
表5、6表明，人参糖蛋白即对醋酸引起的脏腑疼痛有明显的镇痛作用，还对致炎剂福尔马林导致炎症所致的疼痛也有显著的镇痛作用，其作用于安痛定相当。
从以上的药效学实验可知，人参糖蛋白在抗炎、镇痛、镇静具有显著的作用。用于开发成新药或保健食品将有很好的疗效。
本发明是通过如下的实验施例得以实现。
实施例
制备工艺 方法 取人参5kg，粉碎成粗粉，加15倍量的水，煎煮2次，每次3小时，滤过，合并滤液，滤液浓缩至5升，通过已处理好的D101（内径：10cm×高：100cm）大孔吸附树脂，水洗脱至20升，水洗脱液通过截留分子量为20000的中空纤维柱进行超滤，超滤液继续通过截留分子量为1000的中空纤维柱进行超滤，超滤液浓缩，真空干燥，得人参糖蛋白50 g。
Claims (3)
1.一种人参糖蛋白的制备方法，其特征在于：将人参Panax ginsengC.A.Meyer粉碎，加10-15倍量的水煎煮2次，每次3小时，滤过，合并滤液，浓缩至每1ml含1g药材，通过已处理好的D101大孔吸附树脂，用水洗脱2倍量柱体积，水洗脱液通过截留分子量为20000的中空纤维柱进行超滤，超滤液继续通过截留分子量为1000的中空纤维柱进行超滤，浓备液浓缩，真空干燥，得人参糖蛋白。
2.根据权利要求1所述人参糖蛋白，其特征在于：
(a)人参糖蛋白中的总糖含量为30%左右，酸性糖含量为10%左右，蛋白质含量在30%以上；
(b)人参糖蛋白重均分子量分布在1.7×104左右；
(c)人参糖蛋白中的糖部分主要为葡萄糖，此外，还含有少量的甘露糖、半乳糖、岩藻糖、半乳糖醛酸；
(d)糖部分的糖苷键连接方式为以1→4连接葡萄糖为主链；
(e)人参糖蛋白中的蛋白部分由天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、组氨酸、甘氨酸、精氨酸、苏氨酸、脯氨酸、丙氨酸、缬氨酸、半胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、络氨酸16种氨基酸组成。
3.根据权利要求2所述人参糖蛋白在制备抗炎、镇痛、镇静的药物和保健食品中的应用。
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