CN1778950A - 5'－核苷酸酶活性测定方法及5'－核苷酸酶诊断试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种测定5′－核苷酸酶活性的方法，同时本发明还涉及5′－核苷酸酶诊断试剂盒，属于医学检验测定技术领域。该试剂盒包括缓冲液、尿苷单磷酸、还原型辅酶、尿苷核苷酶、二氢胸腺嘧啶脱氢酶、稳定剂，通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生酶偶联反应，再将最终反应物置于生化分析仪下，检测主波长吸光度变化的情况(速度)，从而测算出5′－核苷酸酶的活性大小。采用本发明完全可以通过生化分析仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好，不受内外源物质的污染，便于推广应用。

Description

5′-核苷酸酶活性测定方法及5′-核苷酸酶诊断试剂盒

技术领域

本发明涉及一种测定5′-核苷酸酶活性的方法，同时本发明还涉及用于实现该方法的5′-核苷酸酶诊断试剂盒，属于医学检验测定技术领域。

背景技术

医学研究表明，5′-核苷酸酶(5NT)增高主要见于阻塞性黄胆，也可见于肝癌和肝炎。在胆汁淤积并发胆管炎、原发性和继发性胆汁性肝硬化和慢性肝炎时，5NT升高率高于碱性磷酸酶；肝肿瘤和肝肉芽肿时5NT升高的敏感性高于碱性磷酸酶。因为5′-核苷酸酶活性无生理性升高，对于诊断婴幼儿肝病和妊娠性肝功胆汁淤积较碱性磷酸酶不但敏感，而且有特异性。因此测定5′-核苷酸酶的活性对于疾病的诊断具有重要意义。

5′-核苷酸酶的活性测定方法很多，主要有同位素底物法、化学强酸测磷法(1925年)。据申请人了解，目前国际上普遍采用同位素底物测试法，方法为：5′-核苷酸酶作用于H³-dUMP，终止反应后，通过离子交换层析柱分析结果，求得5′-核苷酸酶活性。或者利用5′-核苷酸酶作用于单磷酸腺苷后产生无机磷，再用化学强酸法分析无机磷含量得以计算出5′-核苷酸酶的活性。

同位素底物法方法复杂还有同位素污染，而且需要同位素测定仪，因此难以切实推广应用。无机磷测定法是1925年发明的方法，准确度不好，强酸污染环境等等，也不适合推广应用。

发明内容

提出一种可以克服以上现有技术缺点的5′-核苷酸酶活性的测定方法，同时给出用以实现该方法的5′-核苷酸酶诊断试剂盒。采用该试剂盒中的试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或者半、全自动生化分析仪上进行5′-核苷酸酶活性测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。

本发明测定5′-核苷酸酶活性的步骤如下：

1)、将样品与主要由尿苷单磷酸、还原型辅酶、尿苷核苷酶、二氢胸腺嘧啶脱氢酶组成的试剂混合，使之发生如下原理的反应：

尿苷单磷酸+水   5核苷酸酶  尿苷+磷酸根

尿苷+水   尿苷核苷酶  核糖+尿嘧啶

尿嘧啶+还原型辅酶   二氢胸腺嘧啶脱氢酶  二氢尿嘧啶+

                                       氧化型辅酶

2)、检测最终反应物在主波长340nm吸光度下降的速度，测算出5′-核苷酸酶的活性大小。

通常步骤2)将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或者半、全自动生化分析仪器下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，测算出5′-核苷酸酶的活性大小。

以上样品与试剂的混合比例按体积为1/10到1/250，以上过程的测定温度控制在常规的20℃到50℃范围，反应时间控制在常规的2-30分钟。

本发明应用5′-核苷酸酶偶联尿苷核苷酶(EC 3.2.2.3)、二氢胸腺嘧啶脱氢酶(EC 1.3.1.2)反应连续监测法。5′-核苷酸酶水解尿苷单磷酸产生尿苷，然后尿苷核苷酶催化尿苷产生尿嘧啶，尿嘧啶再通过偶联二氢胸腺嘧啶脱氢酶的作用，将还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)氧化成为氧化型辅酶(在340nm处没有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的速度，通过测量340nm处吸光度下降的速度，可以测算5′-核苷酸酶的活性大小。

实现本发明方法的5′-核苷酸酶诊断试剂盒可以是单剂，包括：

缓冲液                  40——200mmol/l

尿苷单磷酸              0.5——50mmol/l

还原型辅酶              0.15——0.3mmo/l

尿苷核苷酶              500——50000U/l

二氢胸腺嘧啶脱氢酶      500——50000U/l

稳定剂                  10——80％(总体积)

也可以将以上单剂配成如下双剂，更有利于消除内、外源尿苷、尿嘧啶污染：

试剂I

缓冲液                  40——200mmol/l

还原型辅酶              0.15——0.3mmo/l

尿苷核苷酶              500——50000U/l

二氢胸腺嘧啶脱氢酶      500——50000U/l

稳定剂                  10——80％(总体积)

试剂II

缓冲液                  40——200mmol/l

尿苷单磷酸              0.5——50mmol/l

稳定剂                  10——50mmol/l

双剂的配方不仅限于上述配方，其中的试剂I的成分，还原型辅酶、尿苷核苷酶、二氢胸腺嘧啶脱氢酶等可以放在试剂II，试剂II其中的成分，尿苷单磷酸也可以放在试剂I，如此可以形成多种配方，不在此一一详述。

还可以将试剂配成如下三试剂，不但更有利于消除内、外源尿苷、尿嘧啶污染，还更有利于试剂的稳定：

试剂I

缓冲液                    40——200mmol/l

还原型辅酶                0.15——0.3mmo/l

稳定剂                    10——50mmol/l

试剂II

缓冲液                    40——200mmol/l

尿苷核苷酶                500——50000U/l

二氢胸腺嘧啶脱氢酶        500——50000U/l

稳定剂                    10——80％(总体积)

试剂III

缓冲液                    40——200mmol/l

尿苷单磷酸                0.5——50mmol/l

稳定剂                    10——50mmol/l

三剂的配方不仅限于上述配方，其中的试剂I的成分，还原型辅酶可以放在试剂II或试剂III中。试剂II其中的成分，尿苷核苷酶、二氢胸腺嘧啶脱氢酶等也可以放在试剂I或试剂III中。试剂III其中的成分，尿苷单磷酸也可以放在试剂I或试剂II中，如此可以形成多种配方，不一一详述。

缓冲剂的pH范围可以是6.0～11.0。缓冲剂可以是三(羧甲基)氨基甲烷—盐酸(Tris-HCl)缓冲液、磷酸盐(Phosphate)缓冲液、三乙醇胺(Triethanolamine)缓冲液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇(2-Amino-2-methyl-l-propanol)缓冲液、咪唑(Imidazole)缓冲液或双甘氨肽(Glycylglycine)缓冲液等，但不仅限于这些缓冲液(例如还可以是咪唑/盐酸缓冲液6.2-7.8；磷酸氢二钠柠檬酸缓冲液5.0-8.0；柠檬酸柠檬酸钠缓冲液5.0-6.6；磷酸盐缓冲液6.0-8.0；磷酸氢二钠—磷酸二氢钾缓冲液6.0-8.0；磷酸二氢钾氢氧化钠缓冲液6.0-8.0；巴比妥钠-盐酸缓冲液6.8-9.6；Tris盐酸缓冲液7.0-9.0；硼酸硼砂缓冲液7.4-9.0；甘氨酸-氢氧化钠缓冲液8.6-10.6；砂-氢氧化钠缓冲液9.2-10.0；碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液8.8-10.6(Ca²⁺、Mg²⁺存在时不得使用)；PBS缓冲液7.0-7.6等)。

以上还原型辅酶可以是NADPH、NADH或thio-NADH等还原型烟酰胺辅酶或其衍生物。

此外，为了减少各试剂成分之间的交叉影响、保持试剂的稳定性，以便长期储存，以上单剂、双剂的试剂I、试剂II或三剂的试剂I、试剂II、试剂III中通常加入稳定剂10～80％或者10～50mmol/l，稳定剂可以是乙二醇、丙二醇、甘油、聚糖、聚醇、硫酸胺或盐等中的一种或一种以上，还可以在硫基乙醇、腺苷二磷酸、牛血清白蛋白、碳酸盐、胆酸盐、葡聚糖、乙二胺四乙酸、黄素腺嘌呤二核苷酸、黄素单核苷酸、葡萄糖、谷氨酸盐、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化钠、丁二酸盐等中选择。

实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下配方成分关系的本发明5′-核苷酸酶诊断试剂盒较为理想：

缓冲液                    80——120mmol/l

尿苷单磷酸                2——10mmol/l

还原型辅酶                0.2——0.3mmo/l

尿苷核苷酶                5000——10000U/l

二氢胸腺嘧啶脱氢酶            5000——10000U/l

稳定剂                        20——50％(总体积)

由于本发明是完全利用酶学方法，酶解反应具有特异性高的特点，不易受到内、外源其他物质的干扰。酶法方法简便、易于操作。酶解反应的特异性促使测试结果精确。酶解反应都是在缓冲液条件下进行，没有污染环境问题。酶法方法不需要特殊、额外的仪器，测试成本低廉。因此可以保证具有较高的测试准确性，更便于推广应用。

此外，本发明的显著特色之一是可以消除内、外源尿苷、尿嘧啶的污染，消除内、外源尿苷、尿嘧啶的作用发生在整个反应时间段的前半部分，在后半段时间受污染的内、外源尿苷、尿嘧啶已经被消耗殆尽，而在后半段时间测试5′-核苷酸酶活性所需要的尿苷、尿嘧啶都是产生于5′-核苷酸酶的活性。

具体实施方式

下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。

实施例一(单剂)

本实施例的5′-核苷酸酶诊断试剂盒包括：

缓冲液                      80mmol/l

尿苷单磷酸                  2mmol/l

还原型辅酶                  0.2mmo/l

尿苷核苷酶                  5000U/l

二氢胸腺嘧啶脱氢酶          5000U/l

稳定剂                      50％(总体积)

在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，测试主波长340nm，测试副波长405nm以上，被测5′-核苷酸酶样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为负反应，延迟时间1分钟，检测时间2分钟，理论K值-4180。

加入样品和试剂后，使之混合，发生以下反应：

尿苷单磷酸+水   5核苷酸酶  尿苷+磷酸根

尿苷+水   尿苷核苷酶  核糖+尿嘧啶

尿嘧啶+还原型辅酶   二氢胸腺嘧啶脱氢酶  二氢尿嘧啶+

                                       氧化型辅酶

将最终反应物置于生化分析仪器下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出5′-核苷酸酶的活性大小。

本实施例应用5′-核苷酸酶偶联尿苷核苷酶(EC 3.2.2.3)、二氢胸腺嘧啶脱氢酶(EC 1.3.1.2)反应连续监测法。5′-核苷酸酶水解尿苷单磷酸产生尿苷，然后尿苷核苷酶催化尿苷产生尿嘧啶，尿嘧啶再通过偶联二氢胸腺嘧啶脱氢酶的作用，将还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)氧化成为氧化型辅酶(在340nm处没有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的速度，通过测量340nm处吸光度下降的速度，可以测算5′-核苷酸酶的活性大小。

实施例二(双剂)

本实施例的5′-核苷酸酶诊断试剂有：

试剂I

缓冲液                100mmol/l

还原型辅酶            0.25mmo/l

尿苷核苷酶            8000U/l

二氢胸腺嘧啶脱氢酶    8000U/l

稳定剂                50％(总体积)

试剂II

缓冲液                100mmol/l

尿苷单磷酸            6mmol/l

稳定剂                20mmol/l

测定5′-核苷酸酶活性时，温度控制在30℃，反应时间15分钟，测试主波长340nm，测试副波长405nm以上，被测5′-核苷酸酶样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为负反应，延迟时间1分钟，检测时间2分钟，理论K值-4180。

具体测定步骤为：

尿苷单磷酸+水   5核苷酸酶  尿苷+磷酸根

尿苷+水   尿苷核苷酶  核糖+尿嘧啶

尿嘧啶+还原型辅酶   二氢胸腺嘧啶脱氢酶  二氢尿嘧啶+

                                       氧化型辅酶

将最终反应物置于生化分析仪器下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出5′-核苷酸酶的活性大小。

各反应步骤的反应时间控制在15分钟。

实施例三(三剂)

本实施例的5′-核苷酸酶诊断试剂为三剂，有：

试剂I

缓冲液                    120mmol/l

还原型辅酶                0.3mmo/l

稳定剂                    20mmol/l

试剂II

缓冲液                    120mmol/l

尿苷核苷酶                10000U/l

二氢胸腺嘧啶脱氢酶        10000U/l

稳定剂                    50％(总体积)

试剂III

缓冲液                120mmol/l

尿苷单磷酸            10mmol/l

稳定剂                20mmol/l

在全自动生化分析仪上设定：温度25℃，反应时间20分钟，测试主波长340nm，测试副波长405nm以上，被测5′-核苷酸酶样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为负反应，延迟时间1分钟，检测时间2分钟，理论K值-4180。

具体测定步骤为：

尿苷单磷酸+水   5核苷酸酶  尿苷+磷酸根

尿苷+水   尿苷核苷酶  核糖+尿嘧啶

尿嘧啶+还原型辅酶   二氢胸腺嘧啶脱氢酶  二氢尿嘧啶+

                                       氧化型辅酶

将最终反应物置于生化分析仪器下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出5′-核苷酸酶的活性大小。

各反应步骤的反应时间控制在20分钟。

实施例四

本实施例的5′-核苷酸酶诊断试剂有：

试剂I

缓冲液                100mmol/l

还原型辅酶            0.3mmo/l

稳定剂                20mmol/l

试剂II

缓冲液                100mmol/l

尿苷单磷酸            3mmol/l

尿苷核苷酶                6000U/l

二氢胸腺嘧啶脱氢酶        6000U/l

稳定剂                    50％(总体积)

在生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，测试主波长340nm，测试副波长405nm以上，被测5′-核苷酸酶样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为负反应，延迟时间1分钟，检测时间2分钟，理论K值-4180。

加入样品和试剂后，使之混合，发生以下反应：

尿苷单磷酸+水   5核苷酸酶  尿苷+磷酸根

尿苷+水   尿苷核苷酶  核糖+尿嘧啶

尿嘧啶+还原型辅酶   二氢胸腺嘧啶脱氢酶  二氢尿嘧啶+

                                       氧化型辅酶

将最终反应物置于生化分析仪器下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出5′-核苷酸酶的活性大小。

总之，实验证明，采用本发明的测定方法完全可以通过紫外/可见光分析仪或者半、全自动生化分析仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好，不受内、外源物质的污染。

Claims (9)

1.一种5′-核苷酸酶活性测定方法，步骤如下：

1)、将样品与主要由尿苷单磷酸、还原型辅酶、尿苷核苷酶、二氢胸腺嘧啶脱氢酶组成的试剂混合，使之发生如下原理的反应：

尿苷单磷酸+水 5核苷酸酶尿苷+磷酸根

尿苷+水 尿苷核苷酶核糖+尿嘧啶

尿嘧啶+还原型辅酶 二氢胸腺嘧啶脱氢酶二氢尿嘧啶+

                                     氧化型辅酶

2)、检测最终反应物在主波长340nm吸光度下降的速度，测算出5′-核苷酸酶的活性大小。

2.根据权利要求1所述5′-核苷酸酶活性测定方法，其特征在于：所述步骤2)为，将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或者半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，测算出5′-核苷酸酶的活性大小。

3、根据权利要求1或2所述测定5′-核苷酸酶活性的方法，其特征在于：温度控制在20℃到50℃范围，反应时间控制在2-30分钟。

4、根据权利要求1或2所述测定5′-核苷酸酶活性的方法，其特征在于：被测5′-核苷酸酶样品与试剂的比例控制在1/10到1/250。

5.一种5′-核苷酸酶诊断试剂盒，由以下成分组成：

缓冲液                  40--200mmol/l

尿苷单磷酸              0.5--50mmol/l

还原型辅酶              0.15--0.3mmo/l

尿苷核苷酶              500--50000U/l

二氢胸腺嘧啶脱氢酶          500--50000U/l

稳定剂                      10--80％(总体积)

6.根据权利要求5所述5′-核苷酸酶诊断试剂盒，其特征在于：所述试剂配成单剂、双剂或三剂。

7.根据权利要求5或6所述5′-核苷酸酶诊断试剂盒，其特征在于：所述稳定剂为乙二醇、丙二醇、甘油、聚糖、聚醇、硫酸铵或盐中的至少一种。

8.根据权利要求5或6所述5′-核苷酸酶诊断试剂盒，其特征在于：所述缓冲剂的pH范围是6.0～11.0，所述缓冲剂是三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液、三乙醇胺缓冲液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇缓冲液、咪唑缓冲液或双甘氨肽缓冲液中的一种。

9、根据权利要求5或6所述5′-核苷酸酶诊断试剂盒，其特征在于：所述还原型辅酶是NADPH、NADH或thio-NADH还原型烟酰胺辅酶或其衍生物中的一种。