CN1768147A

CN1768147A - 利用肠杆菌科的菌株生产L－氨基酸的方法,该菌株过表达编码半乳糖质子同向转运蛋白的galP基因

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Publication number: CN1768147A
Application number: CNA2004800084355A
Authority: CN
Inventors: M·里平戈
Original assignee: Degussa GmbH
Current assignee: Evonik Operations GmbH
Priority date: 2003-04-01
Filing date: 2004-03-18
Publication date: 2006-05-03
Anticipated expiration: 2024-03-18
Also published as: WO2004087937A1; CN100359002C; DK1608764T3; DE10314618A1; ATE382091T1; DE602004010896T2; EP1608764A1; PL1608764T3; DE602004010896D1; EP1608764B1; ES2298732T3; US20040214294A1

Abstract

本发明提供生产L－氨基酸尤其是L－苏氨酸的方法，它通过以下步骤完成：a)发酵肠杆菌科的微生物，该微生物中的galP基因或编码其的核苷酸序列是过表达的，且该微生物生产所希望的L－氨基酸，b)在培养基或细菌细胞中富集所希望的L－氨基酸，和c)分离所希望的L－氨基酸。

Description

利用肠杆菌科的菌株生产L-氨基酸的方法，该菌株过表达编码半乳糖质子同向转运蛋白的galP基因

发明领域

本发明提供一种利用过表达galP基因的肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的菌株生产L-氨基酸，尤其是L-苏氨酸，的方法。

发明背景

L-氨基酸，尤其是L-苏氨酸，用于人类医学，和用于制药工业、食品工业和特别是动物营养。

已知可以通过发酵肠杆菌科的菌株，尤其是大肠杆菌(E.coli)和粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)，来制备L-氨基酸。由于其极为重要，因此不断地努力改进生产方法。方法的改进可能涉及比如搅拌和供氧这样的发酵工程措施，或涉及比如发酵过程中的糖浓度这样的营养培养基组成，或涉及通过例如离子交换层析来逐步形成产物形式，或涉及微生物自身的内在生产性能。

利用诱变、选择和突变体选择的方法来改进这些微生物的生产性能。用这种方法，获得了对于比如苏氨酸类似物α-氨基-β-羟基戊酸(AHV)这样的抗代谢物有抗性，或者是对重要的调控代谢物为营养缺陷型，且能生产比如L-苏氨酸这样的L-氨基酸的菌株。

一段时间以来，通过扩增单个氨基酸生物合成基因并测试其对生产的效应，已经将重组DNA遗传工程方法用于对生产L-氨基酸的肠杆菌科的菌株进行菌株改良。可以在Neidhardt(编者)：Escherichiacoli and Salmonella，Cellular and Molecular Biology，第二版，ASM Press，Washington，D.C.，USA，(1996)中找到涉及大肠杆菌和沙门氏菌属(Salmonella)细胞生物学和分子生物学的信息的概述。

发明目的

本发明人设立的目的是提供用于改进的L-氨基酸，尤其是L-苏氨酸的发酵生产的新措施。

发明概述

本发明提供，利用来自肠杆菌科的微生物，尤其是那些已能生产L-氨基酸且其中编码galP基因的核苷酸序列过表达的微生物，来发酵生产L-氨基酸尤其是L-苏氨酸的方法。

发明详述

galP基因编码的基因产物在现有技术中已知为，尤其是“半乳糖质子同向转运蛋白”或“半乳糖通透酶”。

通常，将由核苷酸序列，即基因或等位基因所编码的蛋白质，或所编码的核糖核酸称作基因产物。

等位基因通常理解为给定的基因的替代形式。这些形式的特征在于核苷酸序列中的差异。

以下提到L-氨基酸或氨基酸的任何地方，都意指选自如下的一或多种氨基酸，包括它们的盐：L-天冬酰胺、L-苏氨酸、L-丝氨酸、L-谷氨酸、L-甘氨酸、L-丙氨酸、L-半胱氨酸、L-缬氨酸、L-甲硫氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸、L-组氨酸、L-赖氨酸、L-色氨酸和L-精氨酸。特别优选L-苏氨酸。

本文中，用语“过表达”描述，通过例如将基因的拷贝数提高至少一个(1)拷贝或使用强启动子以及可选地将这些方法相结合，导致微生物中由相应DNA编码的一或多种酶或蛋白质的细胞内活性或浓度的提高。

调节过表达这一方法通常使相应蛋白质的活性或浓度相对于野生型蛋白质或起始微生物中的蛋白质活性或浓度提高至少10％、25％、50％、75％、100％、150％、200％、300％、400％或500％，最多提高至1000％或2000％。起始微生物或亲本菌株理解为将对其实施本发明方法的微生物。

本发明提供通过发酵来自肠杆菌科的重组微生物来生产L-氨基酸的方法，其特征在于

a)在使培养基或细胞中富集所希望的L-氨基酸的条件下，于培养基中培养产生所希望的L-氨基酸的微生物，该微生物中galP基因或编码其的核苷酸序列是过表达的，和

b)分离所希望的L-氨基酸，其中所有或部分(≥0至100％)发酵液体培养基组分和/或生物质可选地保留在所分离的产物中或者被完全除去。

这些同样由本发明提供的(尤其是重组的)微生物，能够从葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜，可选地从淀粉，可选地从纤维素或从甘油和乙醇生产L-氨基酸。它们是选自埃希氏菌属(Escherichia)、欧文氏菌属(Erwinia)、普罗威登斯菌属(Providencia)和沙雷氏菌属(Serratia)的肠杆菌科的代表。埃希氏菌属和沙雷氏菌属是优选的。对于埃希氏菌属，特别提到大肠杆菌，对于沙雷氏菌属，特别提到粘质沙雷氏菌。

通常通过利用含有所希望的基因的载体进行转化、转导或结合来制备重组微生物。

埃希氏菌属中的适宜菌株，尤其是那些生产L-苏氨酸的菌株，特别是大肠杆菌的菌株，例如是

-大肠杆菌H4581 (EP-A 0 301 572)

-大肠杆菌KY10935 (Bioscience Biotechnology

and Biochemistry 61(11)：

1877-1882(1997)

-大肠杆菌VNIIgenetika MG442 (US-A-4278,765)

-大肠杆菌VNIIgenetika M1 (US-A-4,321,325)

-大肠杆菌VNIIgenetika 472T23 (US-A-5,631,157)

-大肠杆菌BKIIM B-3996 (US-A-5,175,107)

-大肠杆菌kat 13 (WO98/04715)

-大肠杆菌KCCM-10132 (WO00/09660)

沙雷氏菌属中的适宜菌株，尤其是那些生产L-苏氨酸的菌株，特别是粘质沙雷氏菌的菌株，例如是

-粘质沙雷氏菌HNr21 (Applied and Environmental

Microbiology38(6)：1045-1051

(1979))

-粘质沙雷氏菌TLr156 (Gene57(2-3)：151-158(1987))

-粘质沙雷氏菌T-2000 (Applied Biochemistry and

Biotechnology 37(3)：255-265(1992))

来自肠杆菌科的生产L-苏氨酸的菌株优选具有，尤其是一种或多种选自以下的遗传或表型特征：α-氨基-β-羟基戊酸抗性，硫代赖氨酸抗性，乙硫氨酸抗性，α-甲基丝氨酸抗性，二氨基琥珀酸抗性，α-氨基丁酸抗性，疏螺旋体素抗性，环戊烷甲酸抗性，利福平抗性，对于例如缬氨酸异羟肟酸盐(Valinehydroxamate)这样的缬氨酸类似物的抗性，对于例如6-二甲基-氨基嘌呤这样的嘌呤类似物的抗性，需要L-甲硫氨酸，可选地部分且可补偿地需要L-异亮氨酸，需要中二氨基庚二酸，对含有苏氨酸的二肽为营养缺陷，L-苏氨酸抗性，苏氨酸精炼物抗性，L-高丝氨酸抗性，L-赖氨酸抗性，L-甲硫氨酸抗性，L-谷氨酸抗性，L-天冬氨酸抗性，L-亮氨酸抗性，L-苯丙氨酸抗性，L-丝氨酸抗性，L-半胱氨酸抗性，L-缬氨酸抗性，对氟代丙酮酸的敏感性，缺陷的苏氨酸脱氢酶，可选地能够利用蔗糖，苏氨酸操纵子过表达，高丝氨酸脱氢酶I-天冬氨酸激酶I过表达(优选为反馈抗性形式)，高丝氨酸激酶过表达，苏氨酸合酶过表达，天冬氨酸激酶过表达(可选地为反馈抗性形式)，天冬氨酸半醛脱氢酶过表达，磷酸烯醇丙酮酸羧化酶过表达(可选地为反馈抗性形式)，磷酸烯醇丙酮酸合酶过表达，转氢酶过表达，RhtB基因产物过表达，RhtC基因产物过表达，YfiK基因产物过表达，丙酮酸羧化酶过表达，乙酸形成减少。

人们发现，过表达galP基因后，肠杆菌科的微生物以改良的方式生产L-氨基酸，尤其是L-苏氨酸。

来自大肠杆菌的该基因的核苷酸序列是现有技术的部分，且可以从由Blattner等人公开的大肠杆菌基因组序列获得(Science 277：1453-1462(1997))。

尤其是利用以下信息来描述galP基因：

名称：糖类转运蛋白，半乳糖质子同向转运蛋白

功能：作为膜整合蛋白，将2-脱氧-D-半乳糖和质子和一

个质子同向转运进细胞

参考文献：Macpherson等人；The Journal of Biological

Chemistry258(7)：4390-4396(1983)，

Venter等人；The Biochemical Journal 363(Pt

2)：

243-252(2002)

登录号： AE000377

鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)中的半乳糖通透酶尤其描述于以下参考文献中：

Postma PW；Journal of Bacteriology 129(2)：630-639(1977)；

Nagelkerke和Postma；Journal of Bacteriology 133(2)：607-613(1978)。

核酸序列可以从国家医学图书馆(Bethesda，MD，USA)的国家生物技术信息中心(NCBI)的数据库、欧洲分子生物学实验室(EMBL，Heidelberg，Germany和Cambridge，UK)的核苷酸序列数据库或日本的DNA数据库(DDBJ，Mishima，Japan)获得。

为更加清楚的描述，大肠杆菌galP基因的核苷酸序列示为SEQ IDNO：3，由该基因编码的半乳糖质子同向转运蛋白的氨基酸序列示为SEQ ID NO：4。

根据本发明可以使用在所引用的参考文献中描述的基因。此外，可以使用通过遗传密码简并或功能中性有义突变制得的这些基因的等位基因。优选使用内源基因。

“内源基因”或“内源核苷酸序列”理解为存在于某一物种群体中的基因或等位基因或核苷酸序列。

含有功能中性有义突变的等位基因包括那些在由其编码的蛋白质中导致至少一个保守氨基酸交换的等位基因。

对于芳香族氨基酸，保守交换是指苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸相互取代。对于疏水氨基酸，保守交换是指亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸相互取代。对于极性氨基酸，保守交换是指谷氨酰胺和天冬酰胺相互取代。对于碱性氨基酸，保守交换是指精氨酸、赖氨酸和组氨酸相互取代。对于酸性氨基酸，保守交换是指天冬氨酸和谷氨酸相互取代。对于含羟基的氨基酸，保守交换是指丝氨酸和苏氨酸相互取代。

同样，可以使用那些编码所提及的蛋白质的变体的核苷酸序列，这些蛋白质变体在N-或C-末端另外加长或缩短了至少一个(1)氨基酸。这一延长或缩短不超过50、40、30、20、10、5、3或2个氨基酸或氨基酸基团。

为了产生过表达，例如可以提高相应基因的拷贝数，或者可以使位于结构基因上游的启动子和调控区域或核糖体结合位点发生突变。整合在结构基因上游的表达盒以同样的方式起作用。可以使用的启动子尤其包括已知名为lac和trp启动子的大肠杆菌乳糖和色氨酸操纵子的启动子。包含在lac启动子的-10区域和trp启动子的-35区域内的杂合启动子是tac启动子(DeBoer等人；Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America80：21-25(1983))。其它可以使用的启动子是λ噬菌体的左向PL启动子和T7噬菌体启动子，它们与已经提到的lac、trp和tac启动子起作用的方式一样与阻遏蛋白相互作用，其中转录克隆的基因可以被特异性地开启或关闭。通过利用可诱导启动子，还有可能提高L-苏氨酸发酵生产过程中的表达。还可以通过采用延长m-RNA寿命的措施来提高表达。此外，还通过防止酶蛋白质的降解来提高酶活性。基因或基因构建体可以以不同拷贝数存在于质粒中，或在染色体中整合并扩增。此外，作为选择，可以通过改变培养基组成和培养管理来实现相关基因的过表达。

本领域技术人员，尤其可以在Chang和Cohen(Journal ofBacteriology 134：1141-1156(1978))、Hartley和Gregori(Gene13：347-353(1981))、Amann和Brosius(Gene40：183-190(1985))、de Broer等人(Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America 80：21-25(1983))、LaVallie等人(BIO/TECHNOLOGY 11：187-193(1993))、WO98/04715、Llosa等人(Plasmid26：222-224(1991))、Quandt和Klipp(Gene 80：161-169(1989))、Hamilton等人(Journal of Bacteriology 171：4617-4622(1989))、Jensen和Hammer(Biotechnology andBioengineering 58：191-195(1998))以及熟知的有关遗传学和分子生物学的教科书中找到与此有关的指导。

可以使用可在肠杆菌科细菌中复制的质粒载体，比如源自pACYC184的克隆载体(Bartolomé等人；Gene102：75-78(1991))、pTrc99A(Amann等人；Gene69：301-315(1988))或pSC101-衍生物(Vocke和Bastia；Proceedings of the National Academy ofSciences USA 80(21)：6557-6561(1983))。在本发明的方法中，可以使用用质粒载体转化了的菌株，其中质粒载体包含至少一个编码galP基因的核苷酸序列。

表达转化理解为宿主(微生物)接受一种分离的核酸。

还有可能通过序列交换(Hamilton等人；Journal ofBacteriology 171：4617-4622(1989))、结合或转导来转换不同菌株中影响特定基因表达的突变。

对遗传学和分子生物学中所使用的这些概念的更详细的说明可以在熟知的遗传性和分子生物学教科书中获得，比如Birge的教科书(Bacterial and Bacteriophage Genetics，第4版，Springer Verlag，New York(USA)，2000)，或Berg、Tymoczko和Stryer的教科书(Biochemistry，第五版，Freeman and Company，New York(USA)，2002)，或Sambrook等人的手册(Molecular Cloning，ALaboratoryManual，(3卷套)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor(USA)，2001)。

此外，利用这样的肠杆菌科的菌株，即该菌株除了过表达galP基因之外还过表达一种或多种在熟知的苏氨酸生物合成途径中的酶或anoplerotic代谢中的酶，或产生还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的酶，或糖酵解中的酶，或PTS酶，或硫代谢中的酶，对于生产L-氨基酸，尤其是L-苏氨酸，可能是有利的。通常优选利用内源基因。

因此，可以同时过表达，例如一或多种选自以下的基因

·编码天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶和苏氨酸合酶(US-A-4,278,765)的thrABC操纵子，

·来自谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)的、编码丙酮酸羧化酶的pyc基因(WO99/18228)，

·编码磷酸烯醇丙酮酸合酶的pps基因(Molecular andGeneral Genetics 231(2)：332-336(1992))，

·编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的ppc基因(Gene31：279-283(1984))，

·编码转氢酶的pntA和pntB基因(European Journal ofBiochemistry 158：647-653(1986))，

·赋予高丝氨酸抗性的rhtB基因(EP-A-0 994 190)，

·编码苹果酸：醌氧化还原酶的mqo基因(WO02/06459)，

·赋予苏氨酸抗性的rhtC基因(EP-A-1 013 765)，

·来自谷氨酸棒杆菌的、编码苏氨酸输出蛋白的thrE基因(WO01/92545)，

·编码谷氨酸脱氢酶的gdhA基因(Nucleic Acids Research11：5257-5266(1983)；Gene 23：199-209(1983))，

·编码葡糖激酶的glk基因(Journal of Bacteriology 179：1298-1306(1997)，

·编码DNA结合蛋白HLP-II的hns基因(WO03/004671)，

·编码葡糖磷酸变位酶的pgm基因(WO03/004598)，

·编码果糖二磷酸醛缩酶的fba基因(WO03/004664)，

·来自ptsHIcrr操纵子的、编码磷酸转移酶系统PTS中的磷酸组氨酸蛋白己醣磷酸转移酶的ptsH基因(WO03/004674)，

·来自ptsHIcrr操纵子的、编码磷酸转移酶系统PTS中的酶I的ptsI基因(WO03/004674)，

·来自ptsHIcrr操纵子的、编码磷酸转移酶系统PTS中的葡萄糖-特异性IIA组分的crr基因(WO03/004674)，

·编码葡萄糖-特异性IIBC组分的ptsG基因(WO03/004670)，

·编码亮氨酸调节子中的调控蛋白的lrp基因(WO03/004665)，

·编码全局调控蛋白Csr的csrA基因(Journal ofBacteriology 175：4744-4755(1993)，

·编码fad调节子中的调控蛋白的fadR基因(Nucleic AcidsResearch 16：7995-8009(1988))，

·编码中央中间代谢中的调控蛋白的iclR基因(Journal ofBacteriology 172：2642-2649(1990))，

·编码10KDa陪伴蛋白的mopB基因(WO03/004669)，已知其名称还为groES，

·来自ahpCF操纵子的、编码烷基氢过氧化物还原酶的小亚基的ahpC基因(WO03/004663)，

·来自ahpCF操纵子的、编码烷基氢过氧化物还原酶的大亚基的ahpF基因(WO03/004663)，

·编码半胱氨酸合酶A的cysK基因(WO03/006666)，

·编码cys调节子中的调控蛋白的cysB基因(WO03/006666)，

·来自cysJIH操纵子的、编码NADPH亚硫酸盐还原酶中的黄素蛋白的cysJ基因(WO03/006666)，

·来自cysJIH操纵子的、编码NADPH亚硫酸盐还原酶中的血蛋白的cysI基因(WO03/006666)，

·来自cysJIH操纵子的、编码腺苷酰硫酸还原酶的cysH基因(WO03/006666)，

·来自phoBR操纵子的、编码pho调节子中的正调控蛋白PhoB的phoB基因(WO03/008606)，

·来自phoBR操纵子的、编码pho调节子中的传感蛋白的phoR基因(WO03/008606)，

·编码细胞外膜中的E蛋白的phoE基因(WO03/008608)，

·编码受果糖刺激的丙酮酸激酶I的pykF基因(WO03/008609)，

·编码6-磷酸果糖激酶II的pfkB基因(WO03/008610)，

·编码麦芽糖转运中的周质结合蛋白的malE基因(WO03/008605)，

·编码超氧化物歧化酶的sodA基因(WO03/008613)，

·来自rseABC操纵子的、编码具有抗-σE活性的膜蛋白的rseA基因(WO03/008612)，

·来自rseABC操纵子的、编码σE因子中的全局调控蛋白的rseC基因(WO03/008612)，

·来自sucABCD操纵子的、编码2-酮戊二酸脱氢酶的脱羧酶亚基的sucA基因(WO03/008614)，

·来自sucABCD操纵子的、编码2-酮戊二酸脱氢酶的二氢硫辛酸转琥珀酸酶E2亚基的sucB基因(WO03/008614)，

·来自sucABCD操纵子的、编码琥珀酰-CoA合成酶的β-亚基的sucC基因(WO03/008615)，

·来自sucABCD操纵子的、编码琥珀酰-CoA合成酶的α-亚基的sucD基因(WO03/008615)，

·编码腺苷酸激酶的adk基因(Nucleic Acids Research13(19)：7139-7151(1985))，

·编码具有类似陪伴蛋白功能的周质蛋白的hdeA基因(Journal of Bacteriology175(23)：7747-7748(1993))，

·编码具有类似陪伴蛋白功能的周质蛋白的hdeB基因(Journal of Bacteriology 175(23)：7747-7748(1993))，

·编码异柠檬酸脱氢酶的icd基因(Journal of BiologicalChemistry 262(22)：10422-10425(1987))，

·编码周质、结合半乳糖的转运蛋白的mglB基因(Molecularand General Genetics 229(3)：453-459(1991))，

·编码二氢硫辛酰胺脱氢酶的lpd基因(European Journal ofBiochemistry 135(3)：519-527(1983))，

·编码丙酮酸脱氢酶复合物的E1组分的aceE基因(EuropeanJournal of Biochemistry133(1)：155-162(1983))，

·编码丙酮酸脱氢酶复合物的E2组分的aceF基因(EuropeanJournal of Biochemistry133(3)：481-489(1983))，

·编码氨肽酶B的pepB基因(Journal of Fermentation andBioengineering 82：392-397(1996))，

·编码醛脱氢酶(E.C.1.2.1.3)的aldH基因(Gene99(1)：15-23(1991))，

·编码铁贮藏同型蛋白(细菌铁蛋白)的bfr基因(Journal ofBacteriology 171(7)：3940-3947(1989))，

·编码尿苷磷酸化酶的udp基因(Nucleic Acids Research 17(16)：6741(1989))，和

·编码具有σE因子活性的调控蛋白的rseB基因(MolecularMicrobiology 24(2)：355-371(1997))。

此外，除过表达galP基因外，衰减尤其是关闭或减少一个或多个选自下列的基因的表达，对于生产L-氨基酸，尤其是L-苏氨酸，可能是有利的

·编码苏氨酸脱氢酶的tdh基因(Journal of Bacteriology169：4716-4721(1987))，

·编码苹果酸脱氢酶(E.C.1.1.1.37)的mdh基因(Archivesin Microbiology 149：36-42(1987))，

·开放阅读框(ORF)yjfA的基因产物(国家生物技术信息中心(NCBI，Bethesda，MD，USA)的登录号AAC77180，WO02/29080)，

·开放阅读框(ORF)ytfP的基因产物(国家生物技术信息中心(NCBI，Bethesda，MD，USA)的登录号AAC77179，WO02/29080)，

·编码磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的pckA基因(WO02/29080)，

·编码丙酮酸氧化酶的poxB基因(WO02/36797)，

·编码异柠檬酸裂合酶的aceA基因(WO02/081722)，

·编码磷酸转移酶系统中的DgsA调控蛋白的dgsA基因(WO02/081721)，已知其名称也为mlc基因，

·编码果糖阻遏蛋白的fruR基因(WO02/081698)，已知其名称也为cra基因，

·编码38-因子的rpoS基因(WO01/05939)，已知其名称也为katF基因，

·编码天冬氨酸铵裂合酶的aspA基因(WO03/008603)，和

·编码苹果酸合酶A的aceB基因(WO03/008603)。

本文中的表达“衰减”描述了，通过例如利用弱启动子或编码具有较低活性的相应酶或蛋白质的基因或等位基因，或者使相应酶或蛋白质或基因失活，以及可选地结合这些方法，微生物中一或多种由相应DNA编码的酶或蛋白质的细胞内活性或浓度的减少或关闭。

由于衰减措施，使相应蛋白质的活性或浓度通常降低至起始微生物中的野生型蛋白质活性或浓度的0至75％、0至50％、0至25％、0至10％或0至5％。

此外，除了过表达galP基因之外，还关闭不希望的副反应对于生产L-氨基酸，尤其是L-苏氨酸，可能是有利的。(Nakayama：“Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms”，in：Overproduction of Microbial Products，Krumphanzl，Sikyta，Vanek(编者)，Academic Press，London，UK，1982)

根据本发明生产的微生物可以用分批法、补料分批法或重复补料分批法培养。Chmiel的教科书(Bioprozesstechnik1.Einführung indie Bioverfahrenstechnik(Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1991))或Storhas的教科书(Bioreaktoren und periphereEinrichtungen(Vieweg Verlag，Braunschweig/Wiesbaden，1994))中给出了已知培养方法的概述。

所欲使用的培养基必须以适宜方式满足特定菌株的需要。美国细菌学协会的手册“Manual of Methods for General Bacteriology”(Washington D.C.，USA，1981)中给出了有关不同微生物培养基的说明。

可以使用的适宜碳源有糖类和碳水化合物例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉以及任选的纤维素，油和脂肪例如大豆油、葵花油、花生油和椰子脂，脂肪酸例如棕榈酸、硬脂酸、亚油酸，醇类例如甘油和乙醇这样的，和有机酸例如乙酸这样的。这些物质可以分别或作为混合物使用。

可以使用的氮源有，有机含氮化合物例如蛋白胨、酵母提取物、肉提取物、麦芽提取物、玉米浆、大豆粉和尿素，无机化合物例如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵。氮源可以分别或作为混合物使用。

可以使用的磷源有，磷酸、磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或相应的含钠盐。培养基还可以包含比如硫酸镁或硫酸铁这样的生长所需的金属盐。最后，除上述提到的物质外，还可以使用比如氨基酸和维生素这样的基本生长物质。培养基中还可以添加适宜的前体。上述提到的原料可以以单个混合物的形式添加到培养物中或者可以在培养过程中以适宜的方式给料。

通常在pH5.5至9.0，尤其是6.0至8.0下完成发酵。以适宜的方式使用比如氢氧化钠、氢氧化钾、氨或氨水这样的碱性化合物或比如磷酸或硫酸这样的酸性化合物来控制pH。可以使用比如脂肪酸聚乙二醇酯这样的抗泡沫剂来控制泡沫形成。可以向培养基中添加以选择性方式起作用的物质例如抗生素，以保持质粒的稳定性。为保持通气条件，向培养基中导入氧气或含氧气体例如空气。培养温度通常为25℃至45℃，优选为30℃至40℃。连续培养至已经产生了最大量的L-氨基酸或L-苏氨酸。这一目标通常在10小时至160小时内实现。

可以按照Spackman等人(Analytical Chemistry30：1190-1206(1958))所述通过在阴离子交换层析后进行茚三酮衍生来完成L-氨基酸的分析，或者可以按照Lindroth等人(Analytical Chemistry 51：1167-1174(1979))所述通过反相HPLC来完成。

根据本发明的方法用于发酵生产L-氨基酸，例如L-苏氨酸、L-异亮氨酸、L-缬氨酸、L-甲硫氨酸、L-高丝氨酸和L-赖氨酸，尤其是L-苏氨酸。

利用工作实施例，本发明在下文中得到了更为详细的说明。

J.H.Miller(A short course in bacterial genetics(1992)，Cold Spring Harbor Laboratory Press)描述了大肠杆菌的基本培养基(M9)和完全培养基(LB)。根据Sambrook等人(Molecular Cloning-A Laboratory Manual(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press)所描述的完成从大肠杆菌中分离质粒DNA以及所有涉及限制性、连接、Klenow和碱性磷酸酶处理的技术。除非另外描述，根据Chung等人所述(Proceedings of the National Academy of Sciences of the UnitedStates of America 86：2172-2175(1989))完成大肠杆菌的转化。

制备菌株和转化体期间的培养温度是37℃。

实施例1

构建表达质粒pTrc99AgalP

利用聚合酶链式反应(PCR)和合成的寡核苷酸来扩增来自大肠杆菌K12的galP基因。从大肠杆菌K12 MG1655中的galP基因核苷酸序列开始(登录号AE000377，Blattner等人(Science 277：1453-1474(1997))，合成PCR引物。(MWG Biotech，Ebersberg，Germany)。引物序列经过修饰从而产生限制酶的识别位点。选择XbaI的识别序列用于galP1引物，选择HindIII的识别位点用于galP2引物，它们在以下所示核苷酸序列中用下划线表示：

galP1：

5′-CACAA TCTAGATAAACCATATTGGAGGGCATC-3′(SEQ ID No.1)

galP2：

5′-GGGAGG AAGCTTGGGGAGATTAATC-3′(SEQ ID No.2)

根据生产商的说明，利用“Qiagen Genomic-tips100/G”(QIAGEN，Hilden，Germany)分离用于PCR的染色体大肠杆菌K12MG1655 DNA。用Vent DNA聚合酶(New England Biolabs GmbH，Frankfurt，Germany)，在标准PCR条件(Innis等人(1990)PCR Protocols.A Guide toMethods and Applications，Academic Press)下利用特异引物可以扩增出大约1450bp大小的DNA片段(SEQ ID No.3)。

用酶XbaI和HindIII切割所扩增的galP片段，并与已经用酶XbaI和HindIII消化过的载体pTrc99A(Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)连接。用连接混合物转化大肠杆菌菌株TOP 10 One Shot^(TOPOTA Cloning Kit，Invitrogen，Groningen，荷兰)，在已经用50μg/ml氨苄青霉素处理过的LB琼脂上选择含有质粒的细胞。在质粒DNA分离后，经酶XbaI、HindIII和EcoRV的测试切割可以检测到成功的克隆。该质粒称作pTrc99AgalP(附图1)。

实施例2

用菌株MG442/pTrc99AgalP生产L-苏氨酸

生产L-苏氨酸的大肠杆菌菌株MG442描述于专利说明书US-A-4,278,765中，并保藏在俄罗斯国家工业微生物保藏所(VKPM，Moscow，Russia)，保藏号为CMIMB-1628。

用实施例1中描述的质粒pTrc99AgalP和用载体pTrc99A转化菌株MG442，在含有50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂上选择含有质粒的细胞。在质粒DNA分离后，经酶HincII、BamHI和KpnI的测试切割可以检测到成功的转化。用这种方式制备菌株MG442/pTrc99AgalP和MG442/pTrc99A。然后，在具有以下组成的基本培养基上再次扩增所选择出的单个克隆：3.5g/l Na₂HPO₄*2H₂O、1.5g/l KH₂PO₄、1g/l NH₄Cl、0.1g/l MgSO₄*7H₂O、2g/l葡萄糖、20g/l琼脂、50mg/l氨苄青霉素。在置于100ml锥形瓶中的10ml分批培养物中检查L-苏氨酸的生产。向其中添加具有以下组成的10ml预培养培养基：2g/l酵母提取物、10g/l(NH₄)₂SO₄、1g/l KH₂PO₄、0.5g/l MgSO₄*7H₂O、15g/lCaCO₃、20g/l葡萄糖、50mg/l氨苄青霉素，接种，并于37℃在KühnerAG(Birsfelden，瑞士)的ESR培养器上以180rpm培养16小时。然后将这些预培养物各250μl接种到10ml生产培养基(25g/l(NH₄)₂SO₄、2g/l KH₂PO₄、1g/l MgSO₄*7H₂O、0.03g/l FeSO₄*7H₂O、0.018g/l MnSO₄*1H₂O、30g/l CaCO₃、20g/l葡萄糖、50mg/l氨苄青霉素)中，于37℃培养48小时。以同样的方式检查起始菌株MG442的L-苏氨酸生产，然而其中在培养基内不添加氨苄青霉素。培养后，用Dr.Lange Co.(Düsseldorf，德国)的LP2W光度计在660nm的测量波长下测定培养物悬浮液的光密度(OD)。

最后，用Eppendorf-BioTronik(Hamburg，Germany)的氨基酸分析仪，通过离子交换层析和采用茚三酮检测的柱后反应来测定在无菌过滤的培养物上清液中产生的L-苏氨酸浓度。

表1给出了实验结果。

表1

菌株	OD(660nm)	L-苏氨酸g/l
菌株	OD(660nm)	L-苏氨酸g/l	MG442	5.6	1.4
MG442/pTrc99A	3	1.3	MG442	5.6	1.4
MG442/pTrc99A	3	1.3	MG442/pTrc99AgalP	4.1	1.9

附图简述：

附图1：含有galP基因的质粒pTrc99AgalP图谱涉及长度的数据视为近似数据。所使用的缩写和名称定义如下：

·Amp：氨苄青霉素抗性基因

·lacI：trc启动子中阻遏蛋白的基因

·Ptrc：trc启动子区域，IPTG可诱导

·galP：galP基因的编码区域

·5S：5SrRNA区域

·rrnBT：rRNA终止子区域

限制酶缩写定义如下：

·BamHI：来自解淀粉芽孢杆菌H(Bacillusamyloliquefaciens H)的限制性内切酶

·EcoRV：来自大肠杆菌B946的限制性内切酶

·HincII：来自流感嗜血杆菌(Haemophilus influence)RC的限制性内切酶

·HindIII：来自流感嗜血杆菌的限制性内切酶

·KpnI：来自肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)的限制性内切酶

·XbaI：来自巴氏黄单胞菌(Xanthomonas badrii)(ATTC11672)的限制性内切酶

序列表

<110>Degussa AG

<120>利用肠杆菌科的菌株生产L-氨基酸的方法

<130>020481 BT

<160>4

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>32

<212>DNA

<213>合成序列

<220>

<221>引物

<222>(1)..(32)

<223>galP1

<400>1

cacaatctag ataaaccata ttggagggca tc 32

<210>2

<211>25

<212>DNA

<213>合成序列

<220>

<221>引物

<222>(1)..(25)

<223>galP2

<400>2

gggaggaagc ttggggagat taatc 25

<210>3

<211>1446

<212>DNA

<213>大肠杆菌

<220>

<221>DNA片断

<222>(1)..(1446)

<223>PCR产物

<220>

<221>CDS

<222>(33)..(1427)

<223>galP编码区

<400>3

cacaatctag ataaaccata ttggagggca tc atg cct gac gct aaa aaa cag 53

Met Pro Asp Ala Lys Lys Gln

1 5

ggg cgg tca aac aag gca atg acg ttt ttc gtc tgc ttc ctt gcc gct 101

Gly Arg Ser Asn Lys Ala Met Thr Phe Phe Val Cys Phe Leu Ala Ala

10 15 20

ctg gcg gga tta ctc ttt ggc ctg gat atc ggt gta att gct ggc gca 149

Leu Ala Gly Leu Leu Phe Gly Leu Asp Ile Gly Val Ile Ala Gly Ala

25 30 35

ctg ccg ttt att gca gat gaa ttc cag att act tcg cac acg caa gaa 197

Leu Pro Phe Ile Ala Asp Glu Phe Gln Ile Thr Ser His Thr Gln Glu

40 45 50 55

tgg gtc gta agc tcc atg atg ttc ggt gcg gca gtc ggt gcg gtg ggc 245

Trp Val Val Ser Ser Met Met Phe Gly Ala Ala Val Gly Ala Val Gly

60 65 70

agc ggc tgg ctc tcc ttt aaa ctc ggg cgc aaa aag agc ctg atg atc 293

Ser Gly Trp Leu Ser Phe Lys Leu Gly Arg Lys Lys Ser Leu Met Ile

75 80 85

ggc gca att ttg ttt gtt gcc ggt tcg ctg ttc tct gcg gct gcg cca 341

Gly Ala Ile Leu Phe Val Ala Gly Ser Leu Phe Ser Ala Ala Ala Pro

90 95 100

aac gtt gaa gta ctg att ctt tcc cgc gtt cta ctg ggg ctg gcg gtg 389

Asn Val Glu Val Leu Ile Leu Ser Arg Val Leu Leu Gly Leu Ala Val

105 110 115

ggt gtg gcc tct tat acc gca ccg ctg tac ctc tct gaa att gcg ccg 437

Gly Val Ala Ser Tyr Thr Ala Pro Leu Tyr Leu Ser Glu Ile Ala Pro

120 125 130 135

gaa aaa att cgt ggc agt atg atc tcg atg tat cag ttg atg atc act 485

Glu Lys Ile Arg Gly Ser Met Ile Ser Met Tyr Gln Leu Met Ile Thr

140 145 150

atc ggg atc ctc ggt gct tat ctt tct gat acc gcc ttc agc tac acc 533

Ile Gly Ile Leu Gly Ala Tyr Leu Ser Asp Thr Ala Phe Ser Tyr Thr

155 160 165

ggt gca tgg cgc tgg atg ctg ggt gtg att atc atc ccg gca att ttg 581

Gly Ala Trp Arg Trp Met Leu Gly Val Ile Ile Ile Pro Ala Ile Leu

170 175 180

ctg ctg att ggt gtc ttc ttc ctg cca gac agc cca cgt tgg ttt gcc 629

Leu Leu Ile Gly Val Phe Phe Leu Pro Asp Ser Pro Arg Trp Phe Ala

185 190 195

gcc aaa cgc cgt ttt gtt gat gcc gaa cgc gtg ctg cta cgc ctg cgt 677

Ala Lys Arg Arg Phe Val Asp Ala Glu Arg Val Leu Leu Arg Leu Arg

200 205 210 215

gac acc agc gcg gaa gcg aaa cgc gaa ctg gat gaa atc cgt gaa agt 725

Asp Thr Ser Ala Glu Ala Lys Arg Glu Leu Asp Glu Ile Arg Glu Ser

220 225 230

ttg cag gtt aaa cag agt ggc tgg gcg ctg ttt aaa gag aac agc aac 773

Leu Gln Val Lys Gln Ser Gly Trp Ala Leu Phe Lys Glu Asn Ser Asn

235 240 245

ttc cgc cgc gcg gtg ttc ctt ggc gta ctg ttg cag gta atg cag caa 821

Phe Arg Arg Ala Val Phe Leu Gly Val Leu Leu Gln Val Met Gln Gln

250 255 260

ttc acc ggg atg aac gtc atc atg tat tac gcg ccg aaa atc ttc gaa 869

Phe Thr Gly Met Asn Val Ile Met Tyr Tyr Ala Pro Lys Ile Phe Glu

265 270 275

ctg gcg ggt tat acc aac act acc gag caa atg tgg ggg acc gtg att 917

Leu Ala Gly Tyr Thr Asn Thr Thr Glu Gln Met Trp Gly Thr Val Ile

280 285 290 295

gtc ggc ctg acc aac gta ctt gcc acc ttt atc gca atc ggc ctt gtt 965

Val Gly Leu Thr Asn Val Leu Ala Thr Phe Ile Ala Ile Gly Leu Val

300 305 310

gac cgc tgg gga cgt aaa cca acg cta acg ctg ggc ttc ctg gtg atg 1013

Asp Arg Trp Gly Arg Lys Pro Thr Leu Thr Leu Gly Phe Leu Val Met

315 320 325

gct gct ggc atg ggc gta ctc ggt aca atg atg cat atc ggt att cac 1061

Ala Ala Gly Met Gly Val Leu Gly Thr Met Met His Ile Gly Ile His

330 335 340

tct ccg tcg gcg cag tat ttc gcc atc gcc atg ctg ctg atg ttt att 1109

Ser Pro Ser Ala Gln Tyr Phe Ala Ile Ala Met Leu Leu Met Phe Ile

345 350 355

gtc ggt ttt gcc atg agt gcc ggt ccg ctg att tgg gta ctg tgc tcc 1157

Val Gly Phe Ala Met Ser Ala Gly Pro Leu Ile Trp Val Leu Cys Ser

360 365 370 375

gaa att cag ccg ctg aaa ggc cgc gat ttt ggc atc acc tgc tcc act 1205

Glu Ile Gln Pro Leu Lys Gly Arg Asp Phe Gly Ile Thr Cys Ser Thr

380 385 390

gcc acc aac tgg att gcc aac atg atc gtt ggc gca acg ttc ctg acc 1253

Ala Thr Asn Trp Ile Ala Asn Met Ile Val Gly Ala Thr Phe Leu Thr

395 400 405

atg ctc aac acg ctg ggt aac gcc aac acc ttc tgg gtg tat gcg gct 1301

Met Leu Asn Thr Leu Gly Asn Ala Asn Thr Phe Trp Val Tyr Ala Ala

410 415 420

ctg aac gta ctg ttt atc ctg ctg aca ttg tgg ctg gta ccg gaa acc 1349

Leu Asn Val Leu Phe Ile Leu Leu Thr Leu Trp Leu Val Pro Glu Thr

425 430 435

aaa cac gtt tcg ctg gaa cat att gaa cgt aat ctg atg aaa ggt cgt 1397

Lys His Val Ser Leu Glu His Ile Glu Arg Asn Leu Met Lys Gly Arg

440 445 450 455

aaa ctg cgc gaa ata ggc gct cac gat taa tctccccaag cttcctccc 1446

Lys Leu Arg Glu Ile Gly Ala His Asp

460

<210>4

<211>464

<212>PRT

<213>大肠杆菌

<400>4

Met Pro Asp Ala Lys Lys Gln Gly Arg Ser Asn Lys Ala Met Thr Phe

1 5 10 15

Phe Val Cys Phe Leu Ala Ala Leu Ala Gly Leu Leu Phe Gly Leu Asp

20 25 30

Ile Gly Val Ile Ala Gly Ala Leu Pro Phe Ile Ala Asp Glu Phe Gln

35 40 45

Ile Thr Ser His Thr Gln Glu Trp Val Val Ser Ser Met Met Phe Gly

50 55 60

Ala Ala Val Gly Ala Val Gly Ser Gly Trp Leu Ser Phe Lys Leu Gly

65 70 75 80

Arg Lys Lys Ser Leu Met Ile Gly Ala Ile Leu Phe Val Ala Gly Ser

85 90 95

Leu Phe Ser Ala Ala Ala Pro Asn Val Glu Val Leu Ile Leu Ser Arg

100 105 110

Val Leu Leu Gly Leu Ala Val Gly Val Ala Ser Tyr Thr Ala Pro Leu

115 120 125

Tyr Leu Ser Glu Ile Ala Pro Glu Lys Ile Arg Gly Ser Met Ile Ser

130 135 140

Met Tyr Gln Leu Met Ile Thr Ile Gly Ile Leu Gly Ala Tyr Leu Ser

145 150 155 160

Asp Thr Ala Phe Ser Tyr Thr Gly Ala Trp Arg Trp Met Leu Gly Val

165 170 175

Ile Ile Ile Pro Ala Ile Leu Leu Leu Ile Gly Val Phe Phe Leu Pro

180 185 190

Asp Ser Pro Arg Trp Phe Ala Ala Lys Arg Arg Phe Val Asp Ala Glu

195 200 205

Arg Val Leu Leu Arg Leu Arg Asp Thr Ser Ala Glu Ala Lys Arg Glu

210 215 220

Leu Asp Glu Ile Arg Glu Ser Leu Gln Val Lys Gln Ser Gly Trp Ala

225 230 235 240

Leu Phe Lys Glu Asn Ser Asn Phe Arg Arg Ala Val Phe Leu Gly Val

245 250 255

Leu Leu Gln Val Met Gln Gln Phe Thr Gly Met Asn Val Ile Met Tyr

260 265 270

Tyr Ala Pro Lys Ile Phe Glu Leu Ala Gly Tyr Thr Asn Thr Thr Glu

275 280 285

Gln Met Trp Gly Thr Val Ile Val Gly Leu Thr Asn Val Leu Ala Thr

290 295 300

Phe Ile Ala Ile Gly Leu Val Asp Arg Trp Gly Arg Lys Pro Thr Leu

305 310 315 320

Thr Leu Gly Phe Leu Val Met Ala Ala Gly Met Gly Val Leu Gly Thr

325 330 335

Met Met His Ile Gly Ile His Ser Pro Ser Ala Gln Tyr Phe Ala Ile

340 345 350

Ala Met Leu Leu Met Phe Ile Val Gly Phe Ala Met Ser Ala Gly Pro

355 360 365

Leu Ile Trp Val Leu Cys Ser Glu Ile Gln Pro Leu Lys Gly Arg Asp

370 375 380

Phe Gly Ile Thr Cys Ser Thr Ala Thr Asn Trp Ile Ala Asn Met Ile

385 390 395 400

Val Gly Ala Thr Phe Leu Thr Met Leu Asn Thr Leu Gly Asn Ala Asn

405 410 415

Thr Phe Trp Val Tyr Ala Ala Leu Asn Val Leu Phe Ile Leu Leu Thr

420 425 430

Leu Trp Leu Val Pro Glu Thr Lys His Val Ser Leu Glu His Ile Glu

435 440 445

Arg Asn Leu Met Lys Gly Arg Lys Leu Arg Glu Ile Gly Ala His Asp

450 455 460

Claims

1.生产L-氨基酸尤其是L-苏氨酸的方法，它通过以下步骤完成：

a)发酵肠杆菌科的微生物，该微生物中的galP基因或编码其的核苷酸序列是过表达的，且该微生物生产所希望的L-氨基酸，

b)在培养基或微生物细胞中富集所希望的L-氨基酸，和

c)分离所希望的L-氨基酸，其中一些或全部(≥0至100％)发酵液体培养基组分和/或生物质可选地保留在产物中。

2.根据权利要求1的方法，其中另外还使用过表达在所希望的L-氨基酸合成途径中的其它基因的微生物。

3.根据权利要求1的方法，其中使用至少一些代谢途径被关闭的微生物，所述代谢途径减少所希望的L-氨基酸的生产。

4.根据权利要求1的方法，其中通过提高拷贝数来提高编码galP基因的多核苷酸的过表达。

5.根据权利要求1的方法，其中通过改变启动子来提高编码galP基因的多核苷酸的过表达。

6.根据权利要求1的方法，其中发酵另外还同时过表达选自下列的一或多种基因的肠杆菌科微生物来生产L-氨基酸：

6.1编码天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶和苏氨酸合酶的thrABC操纵子，

6.2编码丙酮酸羧化酶的pyc基因，

6.3编码磷酸烯醇丙酮酸合酶的pps基因，

6.4编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的ppc基因，

6.5编码转氢酶的pntA和pntB基因，

6.6赋予高丝氨酸抗性的rhtB基因，

6.7编码苹果酸：醌氧化还原酶的mqo基因，

6.8赋予苏氨酸抗性的rhtC基因，

6.9编码苏氨酸输出蛋白的thrE基因，

6.10编码谷氨酸脱氢酶的gdhA基因，

6.11编码葡糖激酶的glk基因，

6.12编码DNA结合蛋白HLP-II的hns基因，

6.13编码葡糖磷酸变位酶的pgm基因，

6.14编码果糖二磷酸醛缩酶的fba基因，

6.15编码磷酸组氨酸蛋白己醣磷酸转移酶的ptsH基因，

6.16编码磷酸转移酶系统中的酶I的ptsI基因，

6.17编码葡萄糖-特异性IIA组分的crr基因，

6.18编码葡萄糖-特异性IIBC组分的ptsG基因，

6.19编码亮氨酸调节子中的调控蛋白的lrp基因，

6.20编码全局调控蛋白Csr的csrA基因，

6.21编码fad调节子中的调控蛋白的fadR基因，

6.22编码中央中间代谢中的调控蛋白的iclR基因，

6.23编码10KDa陪伴蛋白的mopB基因，

6.24编码烷基氢过氧化物还原酶的小亚基的ahpC基因，

6.25编码烷基氢过氧化物还原酶的大亚基的ahpF基因，

6.26编码半胱氨酸合酶A的cysK基因，

6.27编码cys调节子中的调控蛋白的cysB基因，

6.28编码NADPH亚硫酸盐还原酶中的黄素蛋白的cysJ基因，

6.29编码NADPH亚硫酸盐还原酶中的血蛋白的cysI基因，

6.30编码腺苷酰硫酸还原酶的cysH基因，

6.31编码pho调节子中的正调控蛋白PhoB的phoB基因，

6.32编码pho调节子中的传感蛋白的phoR基因，

6.33编码细胞外膜中的E蛋白的phoE基因，

6.34编码受果糖刺激的丙酮酸激酶I的pykF基因，

6.35编码6-磷酸果糖激酶II的pfkB基因，

6.36编码麦芽糖转运中的周质结合蛋白的malE基因，

6.37编码超氧化物歧化酶的sodA基因，

6.38编码具有抗-σE活性的膜蛋白的rseA基因，

6.39编码σE因子中的全局调控蛋白的rseC基因，

6.40编码2-酮戊二酸脱氢酶的脱羧酶亚基的sucA基因，

6.41编码2-酮戊二酸脱氢酶的二氢硫辛酸转琥珀酸酶E2亚单位的sucB基因，

6.42编码琥珀酰-CoA合成酶的β-亚基的sucC基因，

6.43编码琥珀酰-CoA合成酶的α-亚基的sucD基因，

6.44编码腺苷酸激酶的adk基因，

6.45编码具有类似陪伴蛋白功能的周质蛋白的hdeA基因，

6.46编码具有类似陪伴蛋白功能的周质蛋白的hdeB基因，

6.47编码异柠檬酸脱氢酶的icd基因，

6.48编码周质、结合半乳糖的转运蛋白的mglB基因，

6.49编码二氢硫辛酰胺脱氢酶的lpd基因，

6.50编码丙酮酸脱氢酶复合物的E1组分的aceE基因，

6.51编码丙酮酸脱氢酶复合物的E2组分的aceF基因，

6.52编码氨肽酶B的pepB基因

6.53编码醛脱氢酶的aldH基因，

6.54编码铁贮藏同型蛋白的bfr基因，

6.55编码尿苷磷酸化酶的udp基因，和

6.56编码具有σE因子活性的调控蛋白的rseB基因。

7.根据权利要求1的方法，其中为生产L-氨基酸发酵肠杆菌科的微生物，这些微生物中另外还衰减尤其是关闭了一个或多个选自下列的基因，或降低了它们的表达：

7.1编码苏氨酸脱氢酶的tdh基因，

7.2编码苹果酸脱氢酶的mdh基因，

7.3开放阅读框(ORF)yjfA的基因产物，

7.4开放阅读框(ORF)ytfP的基因产物，

7.5编码磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的pckA基因，

7.6编码丙酮酸氧化酶的poxB基因，

7.7编码异柠檬酸裂合酶的aceA基因，

7.8编码磷酸转移酶系统中的DgsA调控蛋白的dgsA基因，

7.9编码果糖阻遏蛋白的fruR基因，

7.10编码σ³⁸-因子的rpoS基因，

7.11编码天冬氨酸铵裂合酶的aspA基因，和

7.12编码苹果酸合酶A的aceB基因。

8.来自肠杆菌科，尤其是来自埃希氏属的微生物，其galP基因或编码该基因的核苷酸序列过表达。

9.根据权利要求8的微生物，其中这些微生物产生L-苏氨酸。