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CN118406630B - 一种生产l-苏氨酸的基因工程菌及其制备方法和发酵工艺 - Google Patents

一种生产l-苏氨酸的基因工程菌及其制备方法和发酵工艺 Download PDF

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CN118406630B CN202410833385.3A CN202410833385A CN118406630B CN 118406630 B CN118406630 B CN 118406630B CN 202410833385 A CN202410833385 A CN 202410833385A CN 118406630 B CN118406630 B CN 118406630B
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Abstract

一种生产L‑苏氨酸的基因工程菌及其制备方法和发酵工艺，属于基因工程技术领域。本发明为解决现有技术中发酵合成L‑苏氨酸的菌种对碳的消耗较大，转化率较低，副产物积累的技术问题，提供一种生产L‑苏氨酸的基因工程菌的制备方法，通过对大肠埃希氏菌ACThr1032进行ptsI、pyk、pck和ackA基因的敲除，glk、galp、 xfpk和ppc基因的引入，获得基因工程菌XY‑Ta33，并提供一种利用上述工程菌生产L‑苏氨酸的发酵工艺。本发明提供的基因工程菌XY‑Ta33及发酵工艺，在提高L‑苏氨酸产量和糖酸转化率的同时，降低了副产物乙酸的产生，提高了发酵生产的效率，适用于大规模工业化生产L‑苏氨酸。

Description

一种生产L-苏氨酸的基因工程菌及其制备方法和发酵工艺
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，涉及一种基因工程菌及其制备方法和发酵工艺。
背景技术
L-苏氨酸是人和动物生长必需的8种氨基酸之一，在人和动物的生长发育中起着重要的作用，其被广泛应用于饲料、食品添加及医药产品等方面。
L-苏氨酸的生产方法有蛋白质水解法、化学合成法、直接发酵法和酶法，其中，蛋白质水解法和化学合成法因其存在种种弊端，工业化生产中已经基本不再使用；酶法生产L-苏氨酸具有专一性高、产品单一、易于精制的特点，但所需酶难以获得，制约了酶法的应用；直接发酵法具有生产成本低、资源节约、环境污染小的优点，是目前工业化生产L-苏氨酸的主要方式。但现有技术中直接发酵法中所使用的菌种对碳的消耗较大，从而导致发酵成本的增加；传统诱变的发酵菌株生长缓慢，并且不易判断其发生突变的具体位点，在发酵过程中产生较多的副产物乙酸，存在转化率低，不能满足大规模工业化生产的需求。
综上，在本领域中，对于L-苏氨酸的生产技术，提高转化率、降低副产物乙酸积累量，一直是所有技术人员致力于解决的技术问题，针对该技术问题的核心技术就是发酵菌株。
发明内容
本发明为解决现有技术中发酵合成L-苏氨酸的菌种对碳的消耗较大，转化率较低，副产物积累的技术问题，提供一种生产L-苏氨酸的基因工程菌及其制备方法和发酵工艺。
本发明的目的之一在于提供一种生产L-缬氨酸的基因工程菌的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
S1：将载体转入出发菌株的感受态细胞中，并制成电转感受态细胞，获得待改造菌株；
S2：利用基因组编辑工具载体pGRB，对S1中获得的待改造菌株进行glk基因和galp基因的插入，同时敲除ptsI基因，获得基因工程菌XY-Ta36；
S3：利用基因组编辑工具载体pGRB，对S2中获得的基因工程菌XY-Ta36进行pykA和pykF基因的敲除，获得基因工程菌XY-Ta38；
S4：利用基因组编辑工具载体pGRB，对S3中获得的基因工程菌XY-Ta38进行xfpk基因的插入，获得基因工程菌XY-Ta40；
S5：利用基因组编辑工具载体pGRB，对S4中获得的基因工程菌XY-Ta40进行ppc基因的插入，以及Pck基因的敲除，获得基因工程菌XY-Ta57；
S6：利用基因组编辑工具载体pGRB，对S5中获得的基因工程菌XY-Ta57进行ackA基因的敲除，获得基因工程菌XY-Ta33；
S1中所述的出发菌株为大肠埃希氏菌ACThr1032，所述ACThr1032菌种的保藏号为CGMCCN0.16144，分类命名为Escherichiacoli，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2018年7月23日；
所述glk基因的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示；
所述galp基因的核苷酸序列为SEQ ID No.2所示；
所述xfpk基因的核苷酸序列为SEQ ID No.6所示；
所述ppc基因的核苷酸序列为SEQ ID No.7所示。
在本发明的一种优选实施例中，S1中所述的载体为pRed-Cas9。
在本发明的一种优选实施例中，S2中所述的ptsI基因的核苷酸序列为SEQ IDNo.3所示。
在本发明的一种优选实施例中，S3中所述的pykA基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.4所示，所述的pykF基因的核苷酸序列为SEQ ID No.5所示。
在本发明的一种优选实施例中，S5中所述的Pck基因的核苷酸序列为SEQ ID No.8所示；S6中所述的ackA基因的核苷酸序列为SEQ ID No.9所示。
本发明的目的之二在于提供一种基因工程菌XY-Ta33，所述基因工程菌XY-Ta33是采用上述制备方法获得的。
本发明的目的之三在于提供一种生产L-苏氨酸的发酵工艺，所述的发酵工艺是将上述基因工程菌XY-Ta33接种至发酵培养基中，然后在37℃条件下，利用25％氨水自动控制维持pH在7.0-7.2范围内，通过调整压力、转速、风量以维持溶解氧，将溶氧控制在≥30％；发酵开始5 h后开始补加液体葡萄糖，维持发酵罐内残糖浓度≤1.0 g/L，发酵完成后获得含有L-苏氨酸的发酵液。
在本发明的一种优选实施例中，所述发酵工艺中基因工程菌XY-Ta33的接种量为20-30％。
在本发明的一种优选实施例中，所述发酵工艺的发酵时间为29 h，所述发酵工艺中的压力为0.05 MPa，转速调整范围为200-600 rpm，风量调整范围为0.2-1 m3/h。
本发明的有益效果：本发明提供了一种生产L-苏氨酸的基因工程菌及其制备方法，通过对大肠埃希氏菌ACThr1032进行ptsI、pyk、pck和ackA基因的敲除，glk、galp、xfpk和ppc基因的引入，获得基因工程菌XY-Ta33。本发明提供的基因工程菌XY-Ta33在生产L-苏氨酸的过程中提高了磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）的积累量，减少了碳的损耗，促进了果糖-6-磷酸生成乙酰磷酸（AcP），以及最大程度转化为L-苏氨酸前体草酰乙酸（OAA），同时降低了副产物乙酸的合成，进一步提高了L-苏氨酸的产量和转化率，并且所述基因工程菌XY-Ta33相较于出发菌株具有良好的生长能力。
本发明还提供了利用基因工程菌XY-Ta33生产L-苏氨酸的发酵工艺，所述发酵工艺生产L-苏氨酸的产量为133.88 g/L，相比于出发菌株大肠埃希氏菌ACThr1032提高了18.6%，同时转化率相比于出发菌株提高了22.6%。可见，本发明提供的基因工程菌XY-Ta33与发酵工艺相结合，在提高L-苏氨酸产量和转化率的同时，降低了副产物乙酸的产生，使得菌株能够高效地生产和积累L-苏氨酸，提高了发酵生产的效率，可以满足大规模工业化生产的需求。
具体实施方式
本发明所用的试剂、仪器或设备等如无特殊说明书均可通过商业化途径购买获得，涉及的实验方法利用试剂盒进行的均按照试剂盒操作实施，其他方法如无特殊说明，均为常规分子生物学实验操作。
本发明实施例中所涉及的基因缩写：
glk：葡萄糖激酶编码基因；
galp：半乳糖/氢离子协同转运蛋白编码基因；
ptsI：磷酸转移酶I编码基因；
pyk：丙酮酸激酶I编码基因；
xfpk：磷酸转酮酶编码基因；
ppc：磷酸烯醇丙酮酸羧化酶编码基因；
Pck：磷酸烯醇丙酮酸羧激酶编码基因；
ackA：乙酸激酶编码基因。
本发明中24深孔板罐发酵所述的培养基：
斜面培养基（g/L）：蔗糖2.0 g，氯化铵1.0 g，KH2PO41.5 g，NaHPO43.5 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，琼脂20 g，pH=7.0-7.2；
种子培养基（g/L）：蔗糖40.0 g，（NH4）2SO410.0 g，KH2PO41.0 g，MgSO4·7H2O 0.5g，酵母浸出物2.0 g，MOPS 15.0 g；
发酵培养基（g/L）：蔗糖80.0 g，（NH4）2SO425.0 g，KH2PO42.0 g，MgSO4·7H2O 1.0g，酵母浸出物4.0 g，FeSO4·5H2O 0.5 g，MnSO4·5H2O 0.5 g，MOPS 30.0 g。
本发明中所述24深孔板罐发酵步骤为：
（1）菌种活化：将甘油管菌种从-80℃冰箱取出后自然融化，在无菌环境下使用接种环蘸取3环上述融化后的菌种到固体斜面培养基上划线，在36.5℃条件下倒置培养19 h；
（2）稀释涂布：将（1）培养好的斜面菌种接入装有玻璃珠的50 ml灭菌生理盐水中，利用玻璃珠打散菌体，菌悬液OD约0.3-0.4，梯度稀释至10-5和10-6，分别吸取0.3 ml上述稀释后的菌液涂至平板中，将平板在36.5℃条件下正置培养3 h，再倒置继续培养至24 h后取出；
（3）接种：接种前在深孔板内添加800 µL发酵培养基，使用10 ul枪头将（2）中培养完成的单菌落接入深孔板中，用封板膜封好，在36.5℃，800 rpm条件下摇床培养18 h；
（4）pH、OD、产酸、残糖和挥发量的检测：
pH：使用pH试纸检测；
OD：取0.2 ml发酵液，加1.8 ml水，稀释20倍至检测板，使用酶标仪在562 nm波长条件下测定吸光度；
残糖：将深孔板进行离心，取上清液稀释100倍，使用生物传感分析仪进行检测；
产酸：通过层析目视法和液相法进行检测；
挥发量：发酵结束后测量发酵液体积，计算其挥发量。
本发明所使用的出发菌株为大肠埃希氏菌ACThr1032，所述ACThr1032菌种的保藏号为CGMCCN0.16144，分类命名为Escherichia coli，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2018年7月23日。
实施例 1：基因工程菌XY-Ta36的制备
S1：利用网站（http://www.rgenome.net/cas-designer/）设计sgRNA，通过上游引物001-ptsI-sg-F（如SEQ ID No.10所示）和下游引物002-ptsI-sg-R（如SEQ ID No.11所示）二聚化合成sgRNA，引物二聚化反应体系为：上游引物10 µL、下游引物10 µL；反应程序为：95℃ 5 min、55℃ 1 min、30℃ 1 min、22℃ ∞；二聚化后将获得的sgRNA稀释至20 ng/µL，获得稀释后的sgRNA；
S2：利用上游引物pGRB-F（如SEQ ID No.12所示）和下游引物pGRB-R（如SEQ IDNo.13所示）PCR扩增pGRB载体质粒DNA，获得PCR扩增产物；
所述PCR扩增的反应体系为：上游引物 2.5 µL、下游引物 2.5 µL、pGRB载体质粒DNA 2.5 µL、PFU酶 25 µL和ddH2O 18 µL；
所述PCR扩增的反应程序为：95℃预变性3 min、95℃变性15 s-58℃退火15 s-72℃延伸1 min循环35次、72℃彻底延伸5 min，4℃保存；
S3：通过DpnI对S2中获得的PCR扩增产物进行消化，去除环状pGRB质粒DNA，在37℃条件下反应1 h，通过琼脂糖凝胶电泳进行检测，将电泳检测片段大小为2000 bp的正确条带进行切胶回收备用，获得线性化pGRB载体质粒DNA，并将其稀释至浓度为50 ng/µL；
S4：使用连接酶c112（购买自vazemy），将S1中获得的sgRNA与S3中获得的线性化pGRB载体质粒DNA进行连接，连接方法参见说明书，在37℃条件下反应30 min后转化大肠杆菌感受态细胞，冰浴30 min，在42℃条件下热击45 s，并迅速冰浴2 min，37℃复苏1 h后涂布Amp抗性平板，37℃条件下过夜培养，挑选单克隆菌株直接进行测序，选取测序结果正确的菌落提取质粒DNA备用，获得ptsI-sgRNA-pGRB；
S5：利用primer5软件设计修复模板融合PCR引物，以156-ptsI-up-F（如SEQ IDNo.14所示）和157-ptsI-up-R（如SEQ ID No.15所示）为引物扩增ptsI基因上游同源臂，以158-ptsI-down-F（如SEQ ID No.16所示）和159-ptsI-down-R（如SEQ ID No.17所示）为引物扩增ptsI基因下游同源臂，获得ptsI基因上下游同源臂片段；
以154-galp+glk-pGRB-F2（如SEQ ID No.18所示）、001-glk-R（如SEQ ID No.19所示）为引物扩增glk基因片段；
以001-galP-F（如SEQ ID No.20所示）和155-galp+glk-pGRB-R（如SEQ ID No.21所示）为引物扩增galp基因片段；
利用上游引物156-ptsI-up-F（如SEQ ID No.14所示）和下游引物159-ptsI-down-R（如SEQ ID No.17所示），通过融合PCR将上述获得的galp基因片段与glk基因片段连接入ptsI基因上下游同源臂之间，通过琼脂糖凝胶电泳进行检测，将电泳检测片段大小为3500bp的扩增产物进行切胶回收备用，获得galp基因和glk基因修复模板；
S6：将工具载体pRed-Cas9质粒转入出发菌株ACThr1032的化学转化感受态细胞，再通过以下步骤获得ACThr1032-pRed-Cas9菌株的电转化感受态细胞；
（S6-1）细胞培养：
S6-1-1：从冻存管中取出ACThr1032-pRed-Cas9菌液划线LB固体平板，37℃静置培养过夜（12 h-16 h）；
S6-1-2：从S6-1-1中的LB固体平板上挑取单菌落，接种到5 mL LB液体培养基中，在30℃、220 rpm条件下震荡培养过夜（12 h-16 h）；
S6-1-3：取S6-1-2中500 µL过夜培养的ACThr1032-pRed-Cas9菌液接种到500 mLLB液体培养基中，在30℃、220 rpm条件下震荡培养至OD660=0.7-0.9（约4-6 h），获得ACThr1032-pRed-Cas9菌液；
（S6-2）电转感受态细胞的制备：
S6-2-1：将（S6-1）中OD660检测合格的ACThr1032-pRed-Cas9菌液置于冰上20-30min预冷，转移至预冷的50 mL离心管中，在4℃、4500 rpm条件下离心10 min，弃上清，获得ACThr1032-pRed-Cas9菌体；向上述菌体中先加入5 mL预冷的无菌10%甘油，轻柔吹打均匀后，再使用10%甘油补齐至30 mL，在4℃、4500 rpm条件下离心10 min，弃上清，重复2次，获得ACThr1032-pRed-Cas9菌体沉淀；
S6-2-2：向S6-2-1中获得的ACThr1032-pRed-Cas9菌体沉淀中加入500 µL预冷的10%甘油重悬浮，以每管90 µL的体积分装至预冷的1.5 mL EP管中，获得ACThr1032-pRed-Cas9菌株的电转化感受态细胞，立即使用或-80℃保存；
S7：利用S4中获得的ptsI-sgRNA-pGRB和S5中获得的修复模板，对S6中获得的ACThr1032-pRed-Cas9菌株的电转化感受态细胞进行编辑，加样浓度为ptsI-sgRNA-pGRB：修复模板=1：2，使用0.1 cm电击杯1.8 KV电击转化，转化后加入含有IPTG（100 mM）的LB液体培养基，在30℃条件下诱导4 h后涂布Spe、Amp抗性平板，30℃条件下培养30 h后平板上存在单菌落，将其对点于新培养基上，挑取划线菌落；利用引物ptsI-基因组鉴定-F（如SEQID No.22所示）和下游引物ptsI-基因组鉴定-R（如SEQ ID No.23所示）进行PCR验证，通过琼脂糖凝胶电泳进行检测，电泳检测正确的条带大小为3700 bp；利用阿拉伯糖诱导上述通过PCR验证的菌落进行pGRB质粒丢失，在37℃条件下再摇菌诱导pRed-Cas9质粒丢失，获得ACThr1032ΔptsI::glk::galp菌株，简称为基因工程菌XY-Ta36。
本实施例通过敲除ptsI基因，以此削弱消耗磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）的糖转运系统；并通过表达galp和glk基因，以此增强由葡萄糖激酶介导的糖转运系统以此加强PEP的积累，增加L-苏氨酸前体草酰乙酸（OAA）的积累。
本实施例对获得的基因工程菌XY-Ta36进行24深孔板罐发酵验证，结果如表1所示，出发菌株与基因工程菌XY-Ta36合成L-苏氨酸的产量相近，基因工程菌XY-Ta36的转化率为39.01%，低于出发菌株的转化率，其原因可能在于糖转运系统的改变降低了PEP的消耗，但未将其完全转化为L-苏氨酸。
表1
实施例 2：基因工程菌XY-Ta38的制备
S1：利用网站（http://www.rgenome.net/cas-designer/）设计sgRNA，通过上游引物161-pykAsg1-F（如SEQ ID No.24所示）和下游引物162-pykAsg1-R（如SEQ ID No.25所示）二聚化合成pykA-sgRNA；
通过上游引物203-pykFsg4-F（如SEQ ID No.26所示）和下游引物204-pykFsg4-R（如SEQ ID No.27所示）二聚化合成pykF-sgRNA；
引物二聚化反应体系为：上游引物 10 µL、下游引物 10 µL；反应程序为：95℃ 5min、55℃ 1 min、30℃ 1 min、22℃ ∞；二聚化后将获得的sgRNA稀释至20 ng/µL，获得稀释后的pykA-sgRNA和pykF-sgRNA；
S2：使用连接酶c112（购买自vazemy）对S1中获得的pykA-sgRNA和pykF-sgRNA与实施例1的S3中获得的线性化pGRB载体质粒DNA分别进行连接，连接方法参见说明书；在37℃条件下反应30 min后转化大肠杆菌感受态细胞，冰浴30 min，在42℃条件下热击45 s，并迅速冰浴2 min，37℃复苏1 h后涂布Amp抗性平板，37℃条件下过夜培养，挑选单克隆菌株直接进行测序，选取测序结果正确的菌落提取质粒DNA备用，获得pykA-sgRNA-pGRB和pykF-sgRNA-pGRB；
S3：利用primer5软件设计PCR引物，以165-pykAup-F（如SEQ ID No.28所示）和166-pykAup-R（如SEQ ID No.29所示）为引物扩增pykA基因上游同源臂；以167-pykAdown-F（如SEQ ID No.30所示）和168-pykAdown-R（如SEQ ID No.31所示）为引物扩增pykA基因下游同源臂，获得pykA基因上下游同源臂片段；
以175-pykFup-F（如SEQ ID No.32所示）和176-pykFup-R（如SEQ ID No.33所示）为引物扩增pykF基因上游同源臂；以177-pykFdown-F（如SEQ ID No.34所示）和178-pykFdown-R（如SEQ ID No.35所示）为引物扩增pykF基因下游同源臂，获得pykF基因上下游同源臂片段；
以pykA上下游同源臂片段为模板，以165-pykAup-F（如SEQ ID No.28所示）和168-pykAdown-R（如SEQ ID No.31所示）为引物，通过融合PCR扩增pykA基因，获得pykA基因修复模板；
以pykF上下游同源臂片段为模板，以175-pykFup-F（如SEQ ID No.32所示）和178-pykFdown-R（如SEQ ID No.35所示）为引物，通过融合PCR扩增pykF基因，获得pykF基因修复模板；
S4：将工具载体pRed-Cas9质粒转入实施例1的S6中获得的XY-Ta36菌株的化学转化感受态细胞，再通过电转化获得XY-Ta36-pRed-Cas9菌株的电转化感受态细胞；
S5：利用S2中获得的pykA-sgRNA-pGRB与S3中获得的pykA基因修复模板，对S4中获得的XY-Ta36-pRed-Cas9菌株进行编辑，加样浓度为pykA-sgRNA-pGRB：修复模板=1：2，使用0.1 cm电击杯1.8 KV电击转化，转化后加入含有IPTG（100 mM）的LB液体培养基，在30℃条件下诱导4 h后涂布Spe、Amp抗性平板，30℃条件下培养30 h后平板上存在单菌落，将其对点于新培养基上，挑取划线菌落；利用上游引物169-pykA基因组-F（如SEQ ID No.36所示）和下游引物170-pykA基因组-R（如SEQ ID No.37所示）对pykA基因进行鉴定，通过琼脂糖凝胶电泳进行检测，电泳检测的正确条带大小为1384 bp；
S6：利用S2中获得的pykF-sgRNA-pGRB与S3中获得的pykF基因修复模板，对S4中获得的XY-Ta36-pRed-Cas9菌株进行编辑，加样浓度为pykF-sgRNA-pGRB：修复模板=1：2，使用0.1 cm电击杯1.8 KV电击转化，转化后加入含有IPTG（100 mM）的LB液体培养基，在30℃条件下诱导4 h后涂布Spe、Amp抗性平板，30℃条件下培养30 h后平板上存在单菌落，将其对点于新培养基上，挑取划线菌落；利用上游引物179-pykF基因组-F（如SEQ ID No.38所示）和下游引物180-pykF基因组-R（如SEQ ID No.39所示）对pykF基因进行鉴定，通过琼脂糖凝胶电泳进行检测，电泳检测的正确条带大小为1180 bp；
S7：利用阿拉伯糖诱导上述S5和S6中通过PCR验证的菌落进行pGRB质粒丢失，在37℃条件下再摇菌诱导pRed-Cas9质粒丢失，获得XY-Ta36ΔpykAΔpykF菌株，简称为基因工程菌XY-Ta38。
本实施例对获得的基因工程菌XY-Ta38进行24深孔板罐发酵验证，结果如表2所示，基因工程菌XY-Ta38在发酵培养基中生长受到影响，所以未合成L-苏氨酸；本实施例对pyk基因进行敲除，导致丙酮酸的合成被完全阻断，不能产生三羧酸循环的前体乙酰辅酶A，从而使基因工程菌XY-Ta38在发酵培养基中不能正常生长。
表2
实施例 3：基因工程菌XY-Ta40的制备
S1：利用网站（http://www.rgenome.net/cas-designer/）设计sgRNA，通过上游引物110-yfaS-sg1-F（如SEQ ID No.40所示）和下游引物111-yfaS-sg1-R（如SEQ ID No.41所示）二聚化合成sgRNA；
引物二聚化反应体系为：上游引物 10 µL、下游引物 10 µL；反应程序为：95℃ 5min、55℃ 1 min、30℃ 1 min、22℃ ∞；二聚化后将获得的sgRNA稀释至20 ng/µL，获得稀释后的sgRNA；
S2：使用连接酶c112（购买自vazemy），将S1中获得的sgRNA与实施例1的S3中获得的线性化pGRB载体质粒DNA进行连接，连接方法参见说明书，在37℃条件下反应30 min后转化大肠杆菌感受态细胞，冰浴30 min，在42℃条件下热击45 s，并迅速冰浴2 min，37℃复苏1 h后涂布Amp抗性平板，37℃条件下过夜培养，挑选单克隆菌株直接进行测序，选取测序结果正确的菌落提取质粒DNA备用，获得yfaS-sgRNA-pGRB；
S3：利用primer5软件设计PCR引物，以102-yfaS-up-F（如SEQ ID No.42所示）和205-yfas-xfpk-up-R（如SEQ ID No.43所示）为引物，通过PCR扩增xfpk基因上游同源臂；以208-yfas-xfpk-down-F（如SEQ ID No.44所示）和105-yfaS-down-R（如SEQ ID No.45所示）为引物，通过PCR扩增yfaS基因下游同源臂，获得xfpk基因和yfaS基因上下游同源臂片段；
以206-xfpk-yfaS-F（如SEQ ID No.46所示）和207-xfpk-yfaS-R（如SEQ ID No.47所示）为引物，通过PCR扩增xfpk基因，获得xfpk基因片段；
以yfaS基因上下游同源臂片段为模板，利用上游引物102-yfaS-up-F（如SEQ IDNo.42所示）和下游引物105-yfaS-down-R（如SEQ ID No.45所示），通过融合PCR将上述获得的xfpk基因片段与yfaS基因上下游同源臂片段进行融合，获得xfpk和yfaS基因的修复模板；
S4：将工具载体pRed-Cas9质粒转入实施例2的S7中获得的XY-Ta38菌株的化学转化感受态细胞，再通过电转化获得XY-Ta38-pRed-Cas9菌株的电转化感受态细胞；
S5：将S2中获得的yfaS-sgRNA-pGRB和S3中获得的修复模板，对S4中获得的XY-Ta38-pRed-Cas9菌株进行编辑，加样浓度为yfaS-sgRNA-pGRB：修复模板=1：2，使用0.1 cm电击杯1.8 KV电击转化，转化后加入含有IPTG（100 mM）的LB液体培养基，在30℃条件下诱导4 h后涂布Spe、Amp抗性平板，30℃条件下培养30 h后平板上存在单菌落，将其对点于新培养基上，挑取划线菌落；利用上游引物130-yfaS基因组-F（如SEQ ID No.48所示）和下游引物131-yfaS基因组-R（如SEQ ID No.49所示）对xfpk基因进行鉴定，通过琼脂糖凝胶电泳进行检测，电泳检测的正确条带大小为1390 bp；利用阿拉伯糖诱导上述通过PCR验证的菌落进行pGRB质粒丢失，在37℃条件下再摇菌诱导pRed-Cas9质粒丢失，获得XY-Ta38ΔyfaS::xfpk菌株，简称为基因工程菌XY-Ta40。
本实施例通过引入外源xfpk基因催化果糖-6-磷酸生成乙酰磷酸（AcP），并进一步产生三羧酸循环所需前体乙酰辅酶A，用以回补缺失丙酮酸导致的菌株生长异常的现象从而使得基因工程菌XY-Ta40在发酵培养基中恢复正常生长。
本实施例对获得的基因工程菌XY-Ta40进行24深孔板罐发酵验证，结果如表3所示，基因工程菌XY-Ta40在发酵培养基中正常生长，合成L-苏氨酸的产量略低于出发菌株，但基因工程菌XY-Ta40产酸及糖酸转化率均低于出发菌株，其原因在于前期积累的PEP没有完全转化为L-苏氨酸前体OAA。
表3
实施例 4：基因工程菌XY-Ta57的制备
S1：利用网站（http://www.rgenome.net/cas-designer/）设计sgRNA，通过上游引物124-敲pck-sg2-F（如SEQ ID No.50所示）和下游引物125-敲pck-sg2-R（如SEQ ID No.51所示）二聚化合成pck-sgRNA；
通过上游引物135-yjivsg2-F（如SEQ ID No.52所示）和下游引物136-yjivsg2-R（如SEQ ID No.53所示）二聚化合成yjiv-sgRNA；
引物二聚化反应体系为：上游引物 10 µL、下游引物 10 µL；反应程序为：95℃ 5min、55℃ 1 min、30℃ 1 min、22℃ ∞；二聚化后将获得的sgRNA稀释至20 ng/µL，获得稀释后获得的pck-sgRNA和yjiv-sgRNA；
S2：使用连接酶c112（购买自vazemy），将S1中获得的pck-sgRNA和yjiv-sgRNA与实施例1的S3中获得的线性化pGRB载体质粒DNA分别进行连接，连接方法参见说明书，在37℃条件下反应30 min后转化大肠杆菌感受态细胞，冰浴30 min，在42℃条件下热击45 s，并迅速冰浴2 min，37℃复苏1 h后涂布Amp抗性平板，37℃条件下过夜培养，挑选单克隆菌株直接进行测序，选取测序结果正确的菌落提取质粒DNA备用，获得pck-sgRNA-pGRB和yjiv-sgRNA-pGRB；
S3：利用primer5软件设计PCR引物，以126-pckup-F（如SEQ ID No.54所示）和127-pckup-R（如SEQ ID No.55所示）为引物，通过PCR扩增pck基因上游同源臂；以128-pckdown-F（如SEQ ID No.56所示）和129-pckdown-R（如SEQ ID No.57所示）为引物，通过PCR扩增pck基因下游同源臂，获得pck基因上下游同源臂片段；
以137-yjivup-F（如SEQ ID No.58所示）和138-yjivup-R（如SEQ ID No.59所示）为引物，通过PCR扩增yjiv基因上游同源臂；以141-yjivdown-F（如SEQ ID No.60所示）和142-yjivdown-R（如SEQ ID No.61所示）为引物，通过PCR扩增yjiv基因下游同源臂，获得yjiv基因上下游同源臂片段；
以139-ppc-F（如SEQ ID No.62所示）和140-ppc-R（如SEQ ID No.63所示）为引物，通过PCR扩增ppc基因，获得ppc基因片段；
以pck基因上下游同源臂片段为模板，利用上游引物126-pckup-F（如SEQ IDNo.54所示）和下游引物129-pckdown-R（如SEQ ID No.57所示），通过融合PCR扩增pck基因上下游同源臂，获得pck基因上下游同源臂修复模板；
利用上游引物137-yjivup-F（如SEQ ID No.58所示）和下游引物142-yjivdown-R（如SEQ ID No.61所示），通过融合PCR将上述获得的ppc基因片段连接入yjiv基因上下游同源臂之间，获得ppc基因修复模板；
S4：将工具载体pRed-Cas9质粒转入实施例3的S5中获得的XY-Ta40菌株的化学转化感受态细胞，再通过电转化获得XY-Ta40-pRed-Cas9菌株的电转化感受态细胞；
S5：利用S2中获得的pck-sgRNA-pGRB和S3中获得的pck基因上下游同源臂修复模板，对S4中获得的XY-Ta40-pRed-Cas9菌株进行编辑，加样浓度为pck-sgRNA-pGRB：修复模板=1：2，使用0.1 cm电击杯1.8 KV电击转化，转化后加入含有IPTG（100 mM）的LB液体培养基，在30℃条件下诱导4 h后涂布Spe、Amp抗性平板，30℃条件下培养30 h后平板上存在单菌落，将其对点于新培养基上，挑取划线菌落；利用上游引物150-pck基因组-F（如SEQ IDNo.64所示）和下游引物151-pck基因组-R（如SEQ ID No.65所示）对pck基因进行鉴定，通过琼脂糖凝胶电泳进行检测，电泳检测的正确条带大小为1372 bp；
S6：利用S2中获得的yjiv-sgRNA-pGRB和S3中获得的ppc基因修复模板，对S4中获得的XY-Ta40-pRed-Cas9菌株进行编辑，加样浓度为yjiv-sgRNA-pGRB：修复模板=1：2，使用0.1 cm电击杯1.8 KV电击转化，转化后加入含有IPTG（100 mM）的LB液体培养基，在30℃条件下诱导4 h后涂布Spe、Amp抗性平板，30℃条件下培养30 h后平板上存在单菌落，将其对点于新培养基上，挑取划线菌落；利用上游引物yjiv基因组-F（如SEQ ID No.66所示）和下游引物yjiv基因组-R（如SEQ ID No.67所示）对yjiv基因进行鉴定，通过琼脂糖凝胶电泳进行检测，电泳检测的正确条带大小为1139 bp，并制成电转感受态细胞；
S7：利用阿拉伯糖诱导上述S5和S6通过PCR验证的菌落进行pGRB质粒丢失，在37℃条件下再摇菌诱导pRed-Cas9质粒丢失，获得XY-Ta40Δpck::ppc菌株，简称为基因工程菌XY-Ta57。
本实施例通过敲除pck基因和插入ppc基因，强化了改造菌株XY-Ta57 PEP转化为L-苏氨酸前体OAA的能力，使前期改造积累的大量PEP转化为L-苏氨酸前体OAA，从而提升了L-苏氨酸的产量和转化率。
本实施例对获得的基因工程菌XY-Ta57进行24深孔板罐发酵验证，结果如表4所示，基因工程菌XY-Ta57合成L-苏氨酸的产量为10.67 g/L高于出发菌株的9.66 g/L，并且基因工程菌XY-Ta57的糖酸转化率49.02%远高于出发菌株的39.01%。
表4
实施例 5：基因工程菌XY-Ta33的制备
S1：利用网站（http://www.rgenome.net/cas-designer/）设计sgRNA，通过上游引物191-ackAsg2-F（如SEQ ID No.68所示）和下游引物192-ackAsg2-R（如SEQ ID No.69所示）二聚化合成sgRNA；
引物二聚化反应体系为：上游引物 10 µL、下游引物 10 µL；反应程序为：95℃ 5min、55℃ 1 min、30℃ 1 min、22℃ ∞；二聚化后将获得的sgRNA稀释至20 ng/µL，获得稀释后的sgRNA；
S2：将S1中获得的sgRNA及实施例1的S3中获得的线性化pGRB载体质粒DNA使用连接酶c112（购买自vazemy）进行连接，连接方法参见说明书，在37℃条件下反应30 min后转化大肠杆菌感受态细胞，冰浴30 min，在42℃条件下热击45 s，并迅速冰浴2 min，37℃复苏1 h后涂布Amp抗性平板，37℃条件下过夜培养，挑选单克隆菌株直接进行测序，选取测序结果正确的菌落提取质粒DNA备用，获得ackA-sgRNA-pGRB；
S3：利用primer5软件设计PCR引物，以193-ackAup-F（如SEQ ID No.70所示）和194-ackAup-R（如SEQ ID No.71所示）为引物，通过PCR扩增ackA基因上游同源臂；以195-ackAdown-F（如SEQ ID No.72所示）和196-ackAdown-R（如SEQ ID No.73所示）为引物，通过PCR扩增ackA基因下游同源臂，获得ackA基因上下游同源臂片段；
以ackA基因上下游同源臂片段为模板，利用上游引物193-ackAup-F（如SEQ IDNo.70所示）和下游引物196-ackAdown-R（如SEQ ID No.73所示），通过融合PCR扩增ackA基因上下游同源臂片段，获得ackA基因上下游同源臂修复模板；
S4：将工具载体pRed-Cas9质粒转入实施例4的S7中获得的XY-Ta57菌株的化学转化感受态细胞，再通过电转化获得XY-Ta57-pRed-Cas9菌株的电转化感受态细胞；
S5：将S2中获得的ackA-sgRNA-pGRB和S3中获得的修复模板，对S4中获得的XY-Ta57-pRed-Cas9菌株进行编辑，加样浓度为ackA-sgRNA-pGRB：修复模板=1：2，使用0.1 cm电击杯1.8 KV电击转化，转化后加入含有IPTG（100 mM）的LB液体培养基，在30℃条件下诱导4 h后涂布Spe、Amp抗性平板，30℃条件下培养30 h后平板上存在单菌落，将其对点于新培养基上，挑取划线菌落；利用上游引物ackA基因组-F（如SEQ ID No.74所示）和下游引物ackA基因组-R（如SEQ ID No.75所示）对ackA基因进行鉴定，通过琼脂糖凝胶电泳进行检测，电泳检测的正确条带大小为1269 bp；利用阿拉伯糖诱导上述通过PCR验证的菌落进行pGRB质粒丢失，在37℃条件下再摇菌诱导pRed-Cas9质粒丢失，获得XY-Ta57ΔackA菌株，简称为基因工程菌XY-Ta33。
本实施例在保持较高L-苏氨酸产量以及较高转化率的前提下，通过敲除ackA基因，削弱了Acp合成乙酸的反应过程，减少副产物乙酸的积累，同时确保引入外源xfpk基因产生的Acp全部用于合成乙酰辅酶A，从而使基因工程菌XY-Ta33的转化率进一步提升，且OD值接近于出发菌株，获得了生长状态良好的基因工程菌XY-Ta33。
本实施例对获得的基因工程菌XY-Ta33进行24深孔板罐发酵验证，结果如表5所示，基因工程菌XY-Ta53合成L-苏氨酸的产量为10.64 g/L高于出发菌株的9.06 g/L，并且基因工程菌XY-Ta33的糖酸转化率48.29%远高于出发菌株的34.08%。
表5
实施例 6：生产L-苏氨酸的发酵工艺
S1：从-80℃冰箱中取出装有实施例5中获得的基因工程菌XY-Ta33的甘油管，自然融化，在无菌环境下使用接种环蘸取3环到固体斜面培养基（斜面培养基（g/L）：葡萄糖 2.0g、氯化铵 1.0 g、KH2PO41.5 g、NaHPO43.5 g、MgSO4·7H2O 0.1 g和琼脂 20 g，pH值=7.0-7.2）上划线，在36.5℃条件下倒置培养19 h，获得XY-Ta33斜面菌种；
S2：将S1中培养好的XY-Ta33斜面菌种接入装有玻璃珠的50 ml灭菌生理盐水中，利用玻璃珠打散菌体，XY-Ta33基因工程菌悬液OD660为0.3-0.4，浓度梯度稀释至10-5和10-6，分别吸取0.3 ml上述不同浓度的XY-Ta33基因工程菌悬液涂平板，然后将平板置于36.5℃条件下正置培养3 h，倒置继续培养至24 h，获得活化后的基因工程菌XY-Ta33；
S3：取S2中获得活化后的基因工程菌XY-Ta33菌落转接至装有种子培养基的种子罐中（种子培养基（g/L）：葡萄糖 40.0 g、（NH4）2SO410.0 g、KH2PO41.0 g、MgSO4·7H2O 0.5g、酵母浸出物 2.0 g和MOPS 15.0 g），培养7-8 h，当基因工程菌XY-Ta33 OD660达到0.7时获得培养后的基因工程菌XY-Ta33；
S4：将S3中培养后的基因工程菌XY-Ta33接种至发酵培养基（发酵培养基（g/L）：葡萄糖 80.0 g、（NH4）2SO425.0 g、KH2PO42.0 g、MgSO4·7H2O 1.0 g、酵母浸出物 4.0 g、FeSO4·5H2O 0.5 g、MnSO4·5H2O 0.5 g和MOPS 30.0 g）中，基因工程菌XY-Ta33的接种量为30%；在37℃条件下，利用25％氨水自动控制维持pH=7.2，调整压力为0.05 MPa，调整转速为400 rpm，调整风量为0.2-1 m3/h，将溶氧控制在≥30％；发酵开始5 h后开始补加液体葡萄糖，维持发酵罐内残糖浓度≤1.0 g/L，发酵时间29 h，获得含有L-苏氨酸的发酵液，不同菌株各重复3次。
本实施例对基因工程菌XY-Ta33进行10 L罐发酵验证，结果如表6所示，出发菌株大肠埃希氏菌ACThr1032在本实施例提供的发酵工艺下L-苏氨酸的产量为108.99 g/L，转化率为55.31%；通过本实施例提供的发酵工艺将基因工程菌XY-Ta33合成L-苏氨酸的产量提高到133.88 g/L，转化率为67.79%；相比于出发菌株，本发明提供的基因工程菌XY-Ta33将L-苏氨酸产量提高了18.6%，转化率提高了22.6%。
由此可见，本发明提供的基因工程菌XY-Ta33和发酵工艺在提高L-苏氨酸产量和转化率的同时，降低了副产物乙酸的产生，使得菌株能够高效地生产和积累L-苏氨酸，提高了发酵生产的效率，可以满足大规模工业化生产的需求。
表6.10 L罐发酵验证结果
综上所述，本发明定向改造提供了基因工程菌XY-Ta33，通过对L-苏氨酸合成所需物质进行积累，同时降低碳的损耗，以及减低副产物乙酸的积累，使得基因工程菌XY-Ta33在发酵培养基中具有良好的生长状态，从而获得较高的L-苏氨酸产量和较高的转化率。
本发明说明书中未详细描述内容为本领域技术人员公知技术。虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (9)

1.一种生产L-苏氨酸的基因工程菌的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
S1：将载体转入出发菌株的感受态细胞中，并制成电转感受态细胞，获得待改造菌株；
S2：利用基因组编辑工具载体pGRB，对S1中获得的待改造菌株进行glk基因和galp基因的插入，同时敲除ptsI基因，获得基因工程菌XY-Ta36；
S3：利用基因组编辑工具载体pGRB，对S2中获得的基因工程菌XY-Ta36进行pykA和pykF基因的敲除，获得基因工程菌XY-Ta38；
S4：利用基因组编辑工具载体pGRB，对S3中获得的基因工程菌XY-Ta38进行xfpk基因的插入，获得基因工程菌XY-Ta40；
S5：利用基因组编辑工具载体pGRB，对S4中获得的基因工程菌XY-Ta40进行ppc基因的插入，以及Pck基因的敲除，获得基因工程菌XY-Ta57；
S6：利用基因组编辑工具载体pGRB，对S5中获得的基因工程菌XY-Ta57进行ackA基因的敲除，获得基因工程菌XY-Ta33；
S1中所述的出发菌株为大肠埃希氏菌ACThr1032，所述ACThr1032菌种的保藏号为CGMCC NO.16144，分类命名为Escherichia coli，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2018年7月23日；
所述glk基因的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示；
所述galp基因的核苷酸序列为SEQ ID No.2所示；
所述xfpk基因的核苷酸序列为SEQ ID No.6所示；
所述ppc基因的核苷酸序列为SEQ ID No.7所示。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，S1中所述的载体为pRed-Cas9。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，S2中所述ptsI基因的核苷酸序列为SEQ ID No.3所示。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，S3中所述pykA基因的核苷酸序列为SEQ ID No.4所示，所述pykF基因的核苷酸序列为SEQ ID No.5所示。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，S5中所述Pck基因的核苷酸序列为SEQID No.8所示；S6中所述ackA基因的核苷酸序列为SEQ ID No.9所示。
6.一种基因工程菌XY-Ta33，其特征在于，所述基因工程菌XY-Ta33是采用权利要求1至5任意一项所述制备方法获得的。
7.一种生产L-苏氨酸的发酵工艺，其特征在于，所述发酵工艺是将权利要求6所述的基因工程菌XY-Ta33接种至发酵培养基中，然后在37℃条件下，利用25％氨水自动控制维持pH在7.0-7.2范围内，通过调整压力、转速、风量以维持溶解氧，将溶氧控制在≥30％；发酵开始5 h后开始补加液体葡萄糖，维持发酵罐内残糖浓度≤1.0 g/L，发酵完成后获得含有L-苏氨酸的发酵液。
8.根据权利要求7所述的发酵工艺，其特征在于，所述发酵工艺中基因工程菌XY-Ta33的接种量为20-30％。
9.根据权利要求7所述的发酵工艺，其特征在于，所述发酵工艺的发酵时间为29 h，所述发酵工艺中的压力为0.05 MPa，转速调整范围为200-600 rpm，风量调整范围为0.2-1m3/h。
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