CN1625549A

CN1625549A - (3－{[4－叔丁基－苄基)－(吡啶－3－磺酰基)－氨基]－甲基}－苯氧基)－乙酸的代谢物

Info

Publication number: CN1625549A
Application number: CNA038029952A
Authority: CN
Inventors: 金伯利·奥基夫·卡梅伦; 金·A·约翰森; 布鲁斯·A·莱夫克; 钱德拉·A·普拉卡什
Original assignee: Pfizer Products Inc
Current assignee: Pfizer Products Inc
Priority date: 2002-01-31
Filing date: 2003-01-20
Publication date: 2005-06-08
Also published as: IL162167A0; BR0307339A; KR20040077884A; WO2003064391A1; IS7281A; NO20043569D0; OA12760A; PL371982A1; US20030216445A1; EA200400724A1; MA27169A1; PA8564601A1; HRP20040683A2; NO20043569L; ZA200404067B; GB2400100A; CA2473984A1; JP2005521668A; ECSP045215A; US6852863B2

Abstract

本发明涉及(3－{[4－叔丁基－苄基)－(吡啶－3－磺酰基)－氨基]－甲基}－苯氧基)－乙酸的代谢物。

Description

(3-{[4-叔丁基-苄基)-(吡啶-3-磺酰基)-氨基]- 甲基}-苯氧基)-乙酸的代谢物

发明领域

本发明涉及(3-{[4-叔丁基-苄基)-(吡啶-3-磺酰基)-氨基]-甲基}-苯氧基)-乙酸的代谢物。本发明还涉及使用(3-{[4-叔丁基-苄基)-(吡啶-3-磺酰基)-氨基]-甲基}-苯氧基)-乙酸的代谢物治疗骨质疏松症并辅助骨折愈合的方法。此外，本发明涉及患者是否已经被给药了(3-{[4-叔丁基-苄基)-(吡啶-3-磺酰基)-氨基]-甲基}-苯氧基]-乙酸的测定方法。

发明背景

化合物(3-{[4-叔丁基-苄基)-(吡啶-3-磺酰基)-氨基]-甲基}-苯氧基)-乙酸是可以用于治疗骨质疏松症、辅助骨折愈合并治疗其它与骨丢失相关的疾病的选择性EP₂激动剂。化合物(3-{[4-叔丁基-苄基)-(吡啶-3-磺酰基)-氨基]-甲基}-苯氧基)-乙酸公开在WO 99/19300(PCT/IB98/01540)中。该化合物还可以用于开放式楔形截骨术、治疗儿童原发性骨丢失、与牙周炎相关的骨丢失、糖皮质激素诱发的骨质疏松症、甲状腺功能亢进诱发的骨质疏松症、固定术诱发的骨质疏松症、肝素诱发的骨质疏松症、免疫抑制剂诱发的骨质疏松症并用于增加和维持骨质量、整容后骨的愈合、上颌骨再造后骨的愈合、下颌骨再造后骨的愈合、椎骨骨性联结的诱发、长骨伸长增加、骨移植物愈合比例的增加和假体向内生长增加。

本发明提供了(3-{[4-叔丁基-苄基)-(吡啶-3-磺酰基)-氨基]-甲基}-苯氧基)-乙酸的代谢物或所述代谢物的药物上可接受的盐或前体药物或该前体药物的盐。这些代谢物可以用于治疗与(3-{[4-叔丁基-苄基)-(吡啶-3-磺酰基)-氨基]-甲基}-苯氧基)-乙酸所治疗相同的疾病或可以用于测定患者是否被给药了化合物(3-{[4-叔丁基-苄基)-(吡啶-3-磺酰基)-氨基]-甲基}-苯氧基)-乙酸。

发明概述

本发明提供了下列化合物或其药物上可接受的盐：

2-(4-{[(3-羧基甲氧基-苄基)-(吡啶-3-磺酰基)-氨基]-甲基}-苯基)-2-甲基-丙酸；

(3-{[[4-(2-羟基-1，1-二甲基-乙基)-苄基]-(吡啶-3-磺酰基)-氨基]-甲基}-苯氧基)-乙酸；

(3-{[(4-叔丁基-苄基)-(吡啶-N-氧化物-3-磺酰基)-氨基]-甲基}-苯氧基)-乙酸；

(5-{[(4-叔丁基-苄基)-(吡啶-3-磺酰基)-氨基]-甲基}-羟基-苯氧基)-乙酸；

2-{4-[吡啶-N-氧化物-3-磺酰氨基)-甲基}-苯基}-2-甲基-丙酸；

(3-{[[4-(2-羟基-1，2-二甲基-乙基)-苄基]-(吡啶-3-磺酰基)-氨基]-甲基}-苯氧基)-乙酸葡糖苷酸；

吡啶-N-氧化物-3-磺酸4-(2-羟基-1，1-二甲基-乙基)-苄酰胺的硫酸酯共轭物；

(3-{[[4-(2-羟基-1，1-二甲基-乙基)-苄基]-(吡啶-3-磺酰基)-氨基]-甲基}-苯氧基)-乙酸的硫酸酯共轭物；

吡啶-3-磺酸4-(2-羟基-1，1-二甲基-乙基)-苄酰胺的硫酸酯共轭物；

2-甲基-2-{4-[(吡啶-3-磺酰氨基)-甲基]-苯基}-丙酸；

(3-{[[4-(1，2-二羟基-1-甲基-乙基)-苄基]-(吡啶-3-磺酰基)-氨基]-甲基}-苯氧基)-乙酸；

(3-{[[4-(1-羟基-1-甲基-乙基)-苄基]-(吡啶-3-磺酰基)-氨基]-甲基}-苯氧基)-乙酸；

(3-{[(4-(1，1-二甲基-2-氧代-乙基)-苄基]-(吡啶-3-磺酰基)-氨基]-甲基}-苯氧基)-乙酸；和

(3-{[(4-异丙烯基-苄基)-(吡啶-3-磺酰基)-氨基]-甲基}-苯氧基)-乙酸。

本发明还提供了患者是否已经被给药了(3-{[4-叔丁基-苄基)-(吡啶-3-磺酰基)-氨基]-甲基}-苯氧基)-乙酸的测定方法，该方法包括测定获自所述患者的血浆、尿、胆汁或粪便样品是否显示存在一种或多种选自下列化合物组成的组的化合物：

2-{4-[吡啶-N-氧化物-3-磺酰氨基)-甲基}-苯基}-2-甲基-丙酸；

(3-{[(4-(2-羟基-1，1-二甲基-乙基)-苄基)-(吡啶-3-磺酰基)-氨基]-甲基}-苯氧基)-乙酸葡糖苷酸；

(3-{[[4-(2-羟基-1，1-二甲基-乙基)-苄基]-(吡啶-3-磺酰基)-氨基)-甲基}-苯氧基)-乙酸的硫酸酯共轭物；

2-甲基-2-{4-[(吡啶-3-磺酰氨基)-甲基]-苯基}-丙酸；

(3-{[[4-(1，1-二甲基-2-氧代-乙基)-苄基]-(吡啶-3-磺酰基)-氨基]-甲基}-苯氧基)-乙酸；和

本发明还提供了治疗骨质疏松症或辅助骨折愈合的方法，该方法包括根据患者需要对其给药治疗有效量的化合物或其药物上可接受的盐，所述的化合物选自：

(3-{[[4-(1，1-二甲基-2-氧代-乙基)-苄基]-(吡啶-3-磺酰基)-氨基]-甲基}-苯氧基)-乙酸；或

本发明还提供了包括一种或多种化合物或其药物上可接受的盐的药物组合物，所述的化合物选自：

2-{4-[吡啶-N-氧化物-3-磺酰氨基)-甲基}-苯基}-2-甲基-丙酸；

(3-{[[4-(2-羟基-1，1-二甲基-乙基)-苄基]-(吡啶-3-磺酰基)-氨基]-甲基}-苯氧基)-乙酸葡糖苷酸；

2-甲基-2-{4-[(吡啶-3-磺酰氨基)-甲基]-苯基}-丙酸；

附图简述

图1.(3-{[4-叔丁基-苄基)-(吡啶-3-磺酰基)-氨基]-甲基}-苯氧基)-乙酸的代谢物在大鼠、狗、猴和人肝脏微粒体中有代表性的HPLC放射色谱图。

图2.(3-{[4-叔丁基-苄基)-(吡啶-3-磺酰基)-氨基]-甲基}-苯氧基)-乙酸的代谢物在大鼠、狗、猴和人肝细胞中有代表性的HPLC放射色谱图。

图3.(3-{[4-叔丁基-苄基)-(吡啶-3-磺酰基)-氨基]-甲基}-苯氧基)-乙酸的CID产物的离子光谱(m/z 469)。

图4.代谢物M21的CID产物的离子光谱(m/z 321)。

图5.代谢物M11的CID产物的离子光谱(m/z 335)。

图6.代谢物M2的CID产物的离子光谱(m/z 501)。

图7.代谢物M3的CID产物的离子光谱(m/z 499)。

图8.代谢物M4的CID产物的离子光谱(m/z 485)。

图9.代谢物M19的CID产物的离子光谱(m/z 321)。

图10.代谢物M6的CID产物的离子光谱(m/z 565)。

图11.代谢物M5的CID产物的离子光谱(m/z 485)。

图12.代谢物M12的CID产物的离子光谱(m/z 485)。

图13.代谢物M20的CID产物的离子光谱(m/z 305)。

图14.代谢物M22的CID产物的离子光谱和1H NMR(m/z 487)。

图15.代谢物M23的CID产物的离子光谱和1H NMR(m/z 471)。

图16.代谢物M24的CID产物的离子光谱和1H NMR(m/z 483)。

图17.代谢物M26的CID产物的离子光谱和1H NMR(m/z 453)。

发明详述

下列化合物是(3-{[4-叔丁基-苄基)-(吡啶-3-磺酰基)-氨基]-甲基}-苯氧基)-乙酸的代谢物：2-(4-{[(3-羧基甲氧基-苄基)-(吡啶-3-磺酰基)-氨基]-甲基}-苯基)-2-甲基-丙酸；(3-{[[4-(2-羟基-1，1-二甲基-乙基)-苄基]-(吡啶-3-磺酰基)-氨基]-甲基}-苯氧基)-乙酸；2-{4-[吡啶-N-氧化物-3-磺酰氨基)-甲基]-苯基}-2-甲基-丙酸；(3-{[[4-(2-羟基-1，1-二甲基-乙基)-苄基]-(吡啶-3-磺酰基)-氨基]-甲基}-苯氧基)-乙酸葡糖苷酸；吡啶-N-氧化物-3-磺酸4-(2-羟基-1，1-二甲基-乙基)-苄酰胺的硫酸酯共轭物；(3-{[[4-(2-羟基-1，1-二甲基-乙基)-苄基]--(吡啶-3-磺酰基)-氨基]-甲基}-苯氧基)-乙酸的硫酸酯共轭物；吡啶-3-磺酸4-(2-羟基-1，1-二甲基-乙基)-苄酰胺的硫酸酯共轭物；2-甲基-2-{4-[(吡啶-3-磺酰氨基)-甲基]-苯基}-丙酸；(3-{[(4-叔丁基-苄基)-(吡啶-N-氧化物-3-磺酰基)-氨基]-甲基}-苯氧基)-乙酸；(5-{[(4-叔丁基-苄基)-(吡啶-3-磺酰基)-氨基]-甲基}-羟基-苯氧基)-乙酸；(3-{[[4-(1，2-二羟基-1-甲基-乙基)-苄基]-(吡啶-3-磺酰基)-氨基]-甲基}-苯氧基)-乙酸；(3-{[[4-(1-羟基-1-甲基-乙基)-苄基]-(吡啶-3-磺酰基)-氨基)-甲基}-苯氧基)-乙酸；(3-{[[4-(1，1-二甲基-2-氧代-乙基)-苄基]-(吡啶-3-磺酰基)-氨基]-甲基}-苯氧基)-乙酸；和(3-{[(4-异丙烯基-苄基)-(吡啶-3-磺酰基)-氨基]-甲基}-苯氧基)-乙酸。

这些代谢物或其药物上可接受的盐或其前体药物或这些前体药物的盐可以用于治疗与其它EP₂激动剂且特别是(3-{[4-叔丁基-苄基]-(吡啶-3-磺酰基)-氨基}-甲基)-苯氧基)-乙酸所治疗相同的疾病和疾患。可以用EP₂激动剂治疗的疾病和病患的实例公开在国际专利申请公开号WO 99/19300中且包括开放式楔形截骨术、儿童原发性骨丢失、与牙周炎相关的骨丢失、糖皮质激素诱发的骨质疏松症、甲状腺功能亢进诱发的骨质疏松症、固定化诱发的骨质疏松症、肝素诱发的骨质疏松症、免疫抑制剂诱发的骨质疏松症并用于增加和维持骨质量、整容后骨的愈合、上颌骨再造后骨的愈合、下颌骨再造后骨的愈合、椎骨骨性联结的诱发、长骨伸长增加、骨移植物愈合比例的增加和假体向内生长增加。优选的治疗包括对骨质疏松症的治疗和辅助骨折愈合。

本领域技术人员认为抗骨吸收剂、例如孕酮类、多膦酸酯类、二膦酸酯(类)、雌激素激动剂/拮抗剂[也称作SERMs(选择性雌激素受体调节剂)]、雌激素、雌激素/孕酮联合用药物、普罗马林^(结合雌激素)、雌酮、雌三醇或17α-或17β-炔雌醇可以与本发明的化合物联用。

典型的孕酮类得自商业来源且包括：阿孕苯奈德、烯丙孕素、醋酸阿马地酮、醋酸阿那孕酮、醋酸氯地孕酮、烯孕醇、醋酸氯孕酮、醋酸氯美孕酮、醋酸地马孕酮、去氧孕烯、地美炔酮、地屈孕酮、氯炔诺酮、双醋炔诺酮、依托孕烯、醋酸氟孕酮、孕氯酮、孕二烯酮、己酸孕诺酮、孕三烯酮、卤孕酮、己酸羟孕酮、左炔诺孕酮、利奈孕酮、美屈孕酮、醋酸甲羟孕酮、醋酸美仑孕酮、双醋甲诺醇、炔诺酮、醋酸炔诺酮、异炔诺酮、诺孕酯、诺孕美特、炔诺孕酮、苯丙酸奥索孕酮、黄体酮、醋酸奎孕醇、奎孕酮和替孕醇。优选的孕酮类是甲羟孕酮、炔诺酮和异炔诺酮。

典型的骨吸收抑制性多膦酸类包括美国专利US3,683,080中公开类型的多膦酸类。优选多膦酸类是双膦酸类(也称作二膦酯类)。替鲁膦酸钠是特别优选的多膦酸盐。伊班膦酸是特别优选的多膦酸。阿仑膦酸盐是特别优选的多膦酸盐。唑来膦酸是特别优选的多膦酸。其它优选的多膦酸类是6-氨基-1-羟基-亚己基-二膦酸和1-羟基-3(甲基戊氨基)-亚丙基-二膦酸。可以以酸、可溶性碱金属盐或碱土金属盐的形式给药所述的多膦酸。同样包括多膦酸的可水解的酯。具体的实例包括乙烷-1-羟基1，1-二膦酸、甲烷二膦酸、戊烷-1-羟基-1，1-二膦酸、甲烷二氯二膦酸、甲烷羟基二膦酸、乙烷-1-氨基-1，1-二膦酸、乙烷-2-氨基-1，1-二膦酸、丙烷-3-氨基-1-羟基-1，1-二膦酸、丙烷-N，N-二甲基-3-氨基-1-羟基-1，1-二膦酸、丙烷-3，3-二甲基-3-氨基-1-羟基-1，1-二膦酸、苯氨基甲二膦酸、N，N-二甲氨基甲二膦酸、N(2-羟乙基)氨基甲二膦酸、丁烷-4-氨基-1-羟基-1，1-二膦酸、烷戊-5-氨基-1-羟基-1，1-二膦酸、己烷-6-氨基-1-羟基-1，1-二膦酸及其药物上可接受的酯类和盐。

在另一个实施方案中，本发明的化合物可以与雌激素激动剂/拮抗剂联用。优选的雌激素激动剂/拮抗剂是公开在美国专利US5,047,431中的屈洛昔芬((E)-3-(1-(4-(2-(二甲氨基)乙氧基)苯基)-2-苯基-1-丁烯基)-苯酚)和相关化合物。

另一种优选的雌激素激动剂/拮抗剂是公开在Willson等的Endocrinology，1997，138，3901-3911中的3-(4-(1，2-二苯基-丁-1-烯基)-苯基)-丙烯酸。

另一种优选的雌激素激动剂/拮抗剂是公开在美国专利US4,536,516中的他莫昔芬(2-(-4-(1，2-二苯基-1-丁烯基)苯氧基)-N，N-二甲基-乙胺、(Z)-2-羟基-1，2，3-丙三甲酸酯(1∶1))和相关化合物。

另一种相关的化合物是公开在美国专利US4,623,660中的4-羟基他莫昔芬。

优选的雌激素激动剂/拮抗剂是公开在美国专利US4,418,068中的雷洛昔芬((6-羟基-2-(4-羟基苯基)苯并[b]噻吩-3-基)(4-(2-(1-哌啶基)乙氧基)苯基)-甲酮盐酸盐)。

另一种优选的雌激素激动剂/拮抗剂是公开在美国专利US4,996,225中的托瑞米芬(2-(4-(4-氯-1，2-二苯基-1-丁烯基)苯氧基)-N，N-二甲基-乙胺、(Z)-2-羟基-1，2，3-丙三甲酸酯(1∶1))。

另一种优选的雌激素激动剂/拮抗剂是公开在美国专利US3,382,287中的苯并二氢吡喃：1-(2-((4-(-甲氧基-2，2，二甲基-3-苯基-苯并二氢吡喃-4-基)-苯氧基)-乙基)-吡咯烷。还优选左美洛昔芬。

另一种优选的雌激素激动剂/拮抗剂是公开在美国专利US3,382,287中的艾多昔芬：(E)-1-(2-(4-(1-(4-碘-苯基)-2-苯基-丁-1-烯基)-苯氧基)-乙基)-吡咯烷酮。

另一种优选的雌激素激动剂/拮抗剂是公开在美国专利US5,488,058中的2-(4-甲氧基-苯基)-3-[4-(2-哌啶-1-基-乙氧基)-苯氧基]-苯并[b]噻吩-6-醇。

另一种优选的雌激素激动剂/拮抗剂是公开在美国专利US5,484,795中的6-(4-羟基-苯基)-5-(4-(2-哌啶-1-基-乙氧基)-苄基)-萘-2-醇。

另一种优选的雌激素激动剂/拮抗剂是与制备方法一起公开在PCT公开号WO 95/10513中的(4-(2-(2-氮杂-二环[2.2.1]庚-2-基)-乙氧基)-苯基)-(6-羟基-2-(4-羟基-苯基)-苯并[b]噻吩-3-基)-甲酮。

其它优选的雌激素激动剂/拮抗剂包括如一般转让的美国专利US5,552,412中所述的化合物。其中描述的特别优选的化合物是：

顺式-6-(4-氟-苯基)-5-(4-(2-哌啶-1-基-乙氧基)-苯基)-5，6，7，8-四氢-萘-2-醇；

(-)-顺式-6-苯基-5-(4-(2-吡咯烷-1-基-乙氧基)-苯基)-5，6，7，8-四氢-萘-2-醇；

顺式-6-苯基-5-(4-(2-吡咯烷-1-基-乙氧基)-苯基)-5，6，7，8-四氢-萘-2-醇；

顺式-1-(6′-吡咯烷乙氧基-3′-吡啶基)-2-苯基-6-羟基-1，2，3，4-四氢化萘；

1-(4′-吡咯烷乙氧基苯基)-2-(4″-氟苯基)-6-羟基-1，2，3，4-四氢异喹啉；

顺式-6-(4-羟基苯基)-5-(4-(2-哌啶-1-基-乙氧基)-苯基)-5，6，7，8-四氢-萘-2-醇；和

1-(4′-吡咯烷乙氧基苯基)-2-苯基-6-羟基-1，2，3，4-四氢异喹啉。

特别优选的化合物是美国专利US 5,948,809中公开的(-)-顺式-6-苯基-5-(4-(2-吡咯烷-1-基-乙氧基)-苯基)-5，6，7，8-四氢-萘-2-醇D-酒石酸盐。

其它雌激素激动剂/拮抗剂描述在美国专利US 4,133,814中。美国专利US 4,133,814中公开了2-苯基-3-芳酰基-苯并噻吩和2-苯基-3-芳酰基苯并噻吩-1-氧化物的衍生物。

其它优选的雌激素激动剂/拮抗剂包括TSE-424(美国专利US5,998,402)、arozoxifene(美国专利US5,723,474)、EM-652、EM-800、GW 5638和GW 7604或其旋光异构体或几何异构体、其药物上可接受的盐、N-氧化物、酯、季铵盐或其前体药物。

其它优选的雌激素激动剂/拮抗剂包括通式V或VI的化合物或其旋光异构体或几何异构体或其药物上可接受的盐、N-氧化物、酯、季铵盐或前体药物：

其中：

R_1B选自H、OH、-O-C(O)-C₁-C₁₂烷基(直链或支链)、-O-C₁-C₁₂烷基(直链或支链或环状)或卤素或C₁-C₄卤代醚类；

R_2B、R_3B、R_4B、R_5B和R_6B独立地选自H、OH、-O-C(O)-C₁-C₁₂(直链或支链)、-O-C₁-C₁₂(直链或支链或环状)、卤素或C₁-C₄卤代醚类、氰基、C₁-C₆烷基(直链或支链)或三氟甲基；

X_A选自H、C₁-C₆烷基、氰基、硝基、三氟甲基和卤素；

S是2或3；

Y_A是如下基团：

其中：

a)R_7B和R_8B独立地选自H、C₁-C₆烷基或任选被CN、C₁-C₆烷基(直链或支链)、C₁-C₆烷氧基(直链或支链)、卤素、-OH、-CF₃或-OCF₃取代的苯基；

或

b)R_7B和R_8B连接成含有一个氮杂原子的5-元饱和杂环，该杂环任选被1-3个取代基取代，所述的取代基独立地选自氢、羟基、卤素、C₁-C₄烷基、三卤代甲基、C₁-C₄烷氧基、三卤代甲氧基、C₁-C₄酰氧基、C₁-C₄烷硫基、C₁-C₄烷基亚磺酰基、C₁-C₄烷基磺酰基、羟基(C₁-C₄)烷基、-CO₂H、-CN、-CONHR_1B、-NH₂、-NH(C₁-C₄烷基)、-N(C₁-C₄烷基)₂、-NHSO₂R_1B、NHCOR_1B、-NO₂或任选被1-3个(C₁-C₄)烷基取代的苯基组成的组；或

c)R_7B和R_8B连接成含有一个氮杂原子的6-元饱和杂环，该杂环任选被1-3个取代基取代，所述的取代基独立地选自氢、羟基、卤素、C₁-C₄烷基、三卤代甲基、C₁-C₄烷氧基、三卤代甲氧基、C₁-C₄酰氧基、C₁-C₄烷硫基、C₁-C₄烷基亚磺酰基、C₁-C₄烷基磺酰基、羟基(C₁-C₄)烷基、-CO₂H、-CN、-CONHR_1B、-NH₂、-NH(C₁-C₄烷基)、-N(C₁-C₄烷基)₂、-NHSO₂R_1B、NHCOR_1B、-NO₂或任选被1-3个(C₁-C₄)烷基取代的苯基组成的组；或

d)R_7B和R_8B连接成含有一个氮杂原子的7-元饱和杂环，该杂环任选被1-3个取代基取代，所述的取代基独立地选自氢、羟基、卤素、C₁-C₄烷基、三卤代甲基、C₁-C₄烷氧基、三卤代甲氧基、C₁-C₄酰氧基、C₁-C₄烷硫基、C₁-C₄烷基亚磺酰基、C₁-C₄烷基磺酰基、羟基(C₁-C₄)烷基、-CO₂H、-CN、-CONHR_1B、-NH₂、-NH(C₁-C₄烷基)、-N(C₁-C₄烷基)₂、-NHSO₂R_1B、NHCOR_1B、-NO₂或任选被1-3个(C₁-C₄)烷基取代的苯基组成的组；或

e)R_7B和R_8B连接成含有一个氮杂原子的8-元饱和杂环，该杂环任选被1-3个取代基取代，所述的取代基独立地选自氢、羟基、卤素、C₁-C₄烷基、三卤代甲基、C₁-C₄烷氧基、三卤代甲氧基、C₁-C₄酰氧基、C₁-C₄烷硫基、C₁-C₄烷基亚磺酰基、C₁-C₄烷基磺酰基、羟基(C₁-C₄)烷基、-CO₂H、-CN、-CONHR_1B、-NH₂、-NH(C₁-C₄烷基)、-N(C₁-C₄烷基)₂、-NHSO₂R_1B、NHCOR_1B、-NO₂或任选被1-3个(C₁-C₄)烷基取代的苯基组成的组；或

f)R_7B和R_8B连接成含有6-12个桥连或稠合的碳原子并含有一个氮杂原子的饱和二环杂环，该杂环任选被1-3个取代基取代，所述的取代基独立地选自氢、羟基、卤素、C₁-C₄烷基、三卤代甲基、C₁-C₄烷氧基、三卤代甲氧基、C₁-C₄酰氧基、C₁-C₄烷硫基、C₁-C₄烷基亚磺酰基、C₁-C₄烷基磺酰基、羟基(C₁-C₄)烷基、-CO₂H、-CN、-CONHR_1B、-NH₂、-NH(C₁-C₄烷基)、-N(C₁-C₄烷基)₂、-NHSO₂R_1B、NHCOR_1B、-NO₂或任选被1-3个(C₁-C₄)烷基取代的苯基组成的组。

另一种选的雌激素激动剂/拮抗剂是通式Va的化合物或其旋光异构体或几何异构体或其药物上可接受的盐、N-氧化物、酯、季铵盐或前体药物：

其它优选的雌激素激动剂/拮抗剂包括如下通式III(EM-652)或通式IV(EM-800)的化合物或其旋光异构体或几何异构体或其药物上可接受的盐、N-氧化物、酯、季铵盐或前体药物：

本领域技术人员认为可以将其它骨合成代谢药、也称作骨质量增加剂与本发明的化合物联用。骨质量增加剂是将骨质量增加至如世界卫生组织研究组在“骨折危害的评价及其在筛选绝经后骨质疏松症中的应用(1994)中具体描述的骨折阈值以上的水平，世界卫生组织研究组-世界卫生组织技术系列843报告”。

本发明的化合物还能够与其它EP₂激动剂联用。优选的EP₂激动剂包括7-[(4-丁基-苄基)-甲磺酰基-氨基]-庚酸一钠盐或美国专利US6,288,120中公开的其它化合物。

本领域技术人员认为IGF-1、氟化钠、甲状旁腺素(PTH)、甲状旁腺素的活性片段、生长激素或生长激素促分泌素也可以与本发明的化合物联用。

本发明的化合物还可以与前列腺素联用。下面描述并涉及各种前列腺素。不过，其它前列腺素对本领域技术人员而言也是公知的。典型的前列腺素公开在美国专利US 4,171,331和US 3,927,197中。Norrdin等在Prostaglandins Leukotriene Essential Fatty Acids 41，139-150，1990中的前列腺素在体内骨中的作用是有关骨合成代谢前列腺素的综述。

可以与本发明化合物联用的其它化合物包括那些公开在下列文献中的化合物：美国专利US 3,932,389中公开了用于骨生成活性的2-脱羧-2-(四唑-5-基)-11-脱氧-15-取代的-ω-pentanorprostaglandins；美国专利US 4,018,892中公开了用于骨生成活性的16-芳基-13，14-二氢-PGE₂对-联苯酯类；美国专利US 4,219,483中公开了用于骨生成活性的2，3，6-取代的-4-吡喃酮类；美国专利US 4,132,847公开了用于骨生成活性的2，3，6-取代的-4-吡喃酮类；美国专利US 4,000,309中公开了用于骨生成活性的16-芳基-13，14-二氢-PGE₂对-联苯酯类；美国专利US 3,982,016中公开了用于骨生成活性的16-芳基-13，14-二氢-PGE₂对-联苯酯类；美国专利US 4,621,100中公开了用于骨生成活性的取代的环戊烷类；且美国专利US 5,216,183中公开了用于骨生成活性的环戊酮类。

氟化钠也可以与本发明的化合物联用。术语“氟化钠”指的是所有形式的氟化钠(例如缓释氟化钠、持续释放的氟化钠)。持续释放的氟化钠公开在美国专利US 4,904,478中，将该文献的内容引入本文作为参考。氟化钠的活性易于由本领域技术人员根据生物技术方案测定(例如，参见Eriksen E.F.等，Bone Histomorphometry，Raven Press，New York，1994，1-74页；Grier S.J.等，双能X射线分析法在动物中的应用-Inv.Radiol.，1996，31(1)：50-62；WahnerH.W.和Fogelman I.，骨质疏松症的评价：双能X射线分析法用于临床实践，Martin Dunitz Ltd.，London 1994，1-296页)。

骨形态发生蛋白也可以与本发明的化合物联用(例如，参见Ono等，前列腺素E1对重组人骨形态发生蛋白的骨发生活性的促进- Bone，1996，19(6)，581-588)。

此外，任何甲状旁腺素(PTH)均可以与本发明的化合物联用。术语“甲状旁腺素”指的是甲状旁腺素、其片段或代谢物及其可以刺激骨生成并增加骨质量的结构类似物。还包括甲状旁腺素相关肽类和甲状旁腺素相关肽类的活性片段和类似物(参见PCT公开号WO 94/01460)。这类骨合成代谢功能活性易于由本领域技术人员根据标准测定法测定(例如，参见Eriksen E.F.等，BoneHistomorphometry，Raven Press，New York，1994，1-74页；Grier S.J.等，双能X射线分析法在动物中的应用-Inv.Radiol.，1996，31(1)：50-62；Wahner H.W.和Fogelman I.，骨质疏松症的评价：双能X射线分析法用于临床实践，MartinDunitz Ltd.，London 1994，1-296页)。下文描述并涉及了这些化合物的各种类型。不过，甲状旁腺素是本领域技术人员所公知的。下面的参考文献中公开了典型的甲状旁腺素。

“脊骨骨质疏松症的人甲状旁腺肽疗法”-Osteoporosis Iut.，3，(Supp 1)：199-203。

“与激素替代疗法联用的PTH 1-34疗法治疗骨质疏松症：生物化学、动力学和组织学反应”-Osteoporosis Iht.1：162-170。

此外，任何生长激素或生长激素促分泌素均可以与本发明的化合物联用。术语生长激素促分泌素指的是刺激生长激素释放或模拟生长激素作用(例如增加骨生成，从而使骨质量增加)的化合物。这类作用易于由本领域技术人员根据本领域技术人员众所周知的标准测定法测定。各种类型的这些化合物公开在下列公开的PCT专利申请中：WO 95/14666；WO 95/13069；WO94/19367；WO 94/13696；和WO 95/34311。不过，其它生长激素或生长激素促分泌素是本领域技术人员所公知的。

特别优选的生长激素促分泌素是N-[1(R)-[1，2-二氢-1-甲磺酰基螺[3H-吲哚-3，4′-哌啶]-1′-基]羰基]-2-(苯基甲氧基)乙基]-2-氨基-2-甲基丙酰胺：MK-677。

其它优选的生长激素促分泌素包括：

2-氨基-N-(2-(3a-(R)-苄基-2-甲基-3-氧代-2，3，3a，4，6，7-六氢-吡唑并-[4，3-c]吡啶-5-基)-1-(R)-苄氧基甲基-2-氧代-乙基)-异丁酰胺(美国专利US 6,107,306)或其L-酒石酸盐；

2-氨基-N-{1(R)-苄氧基甲基-2-[1，3-二氧代-8a-(S)-吡啶-2-基甲基-2-(2，2，2，-三氟-乙基)-六氢-咪唑并-[1，5a]吡嗪-7-基]-2-氧代-乙基}-2-甲基-丙酰胺(美国专利US 6,251,902)或其盐酸盐；

2-氨基-N-(1-(R)-苄氧基甲基-2-(3a-(R)-(4-氟-苄基)-2-甲基-3-氧代-2，3，3a，4，6，7-六氢-吡唑并[4，3-c]吡啶-5-基)-2-氧代-乙基)异丁酰胺；

2-氨基-N-(2-(3a-(R)-苄基-3-氧代-2，3，3a，4，6，7-六氢-吡唑并[4，3-c]吡啶-5-基)-1-(R)苄氧基甲基-2-氧代-乙基)异丁酰胺；和

2-氨基-N-(1-(2，4-二氟-苄氧基甲基)-2-氧代-2-(3-氧代-3a-吡啶-2-基甲基-2-(2，2，2-三氟-乙基)-2，3，3a，4，6，7-六氢-吡唑并[4，3-c]吡啶-5-基)-乙基)-2-甲基-丙酰胺(美国专利US 6,110,932)或其L-酒石酸盐。

一般以药物组合物的形式给药本发明的化合物，该药物组合物包括至少一种本发明的化合物与药物上可接受的赋形剂或稀释剂。就口服给药而言，药物组合物可以采用溶液、混悬液、片剂、丸剂、粉剂等的形式。可以使用含有诸如柠檬酸钠、碳酸钙和磷酸钙这样的各种赋形剂以及诸如淀粉且优选马铃薯淀粉或木薯淀粉和某些络合硅酸盐这样的各种崩解剂和诸如聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、明胶和阿拉伯胶这样的粘合剂的片剂。另外，诸如硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠和滑石这样的润滑剂通常用于压片目的。相似类型的固体组合物还可以用作软胶囊和硬胶囊的填充剂；在这方面优选的材料还包括乳糖以及高分子量聚乙二醇类。当需要含水混悬剂和/或酏剂进行口服给药时，可以将本发明的化合物与各种增甜剂、调味剂、着色剂、乳化剂和/或悬浮剂与诸如水、乙醇、丙二醇、甘油及其不同组合这类稀释剂合并。

就非肠道给药而言，可以使用芝麻油或花生油或含水丙二醇的溶液以及相应水溶性盐的无菌水溶液。如果必要，应将这类水溶液适当缓冲且液体稀释剂首先与足量的盐或葡萄糖等渗。这些水溶液适合于静脉内、肌内、皮下和腹膜内注射目的。在这方面，所用的无菌含水介质均易于通过本领域技术人员众所周知的标准技术得到。

为了经皮(例如局部)给药的目的，制备无菌的稀水溶液或部分水溶液(通常浓度约为0.1％-5％)，否则制备与上述非肠道用溶液相似的溶液。

通过将所述化合物与合适的稀释剂混合并将适量的该混合物填充入胶囊来制备胶囊。常用的稀释剂包括惰性粉状物质，诸如许多不同类型的淀粉；粉状纤维素，尤其是结晶纤维素和微晶纤维素；糖类，诸如果糖、甘露糖醇和蔗糖；谷粉和类似的可食用粉。

通过直接压制、通过湿法成粒或通过干法成粒制备片剂。该制剂中通常混有稀释剂、粘合剂、润滑剂和崩解剂以及所述的化合物。典型的稀释剂包括：例如，各种类型的淀粉、蔗糖、甘露糖醇、高岭土、磷酸钙或硫酸钙；无机盐，诸如氯化钠和糖粉。也可以使用粉状纤维素衍生物。典型的片剂粘合剂是诸如淀粉、明胶和糖、诸如乳糖、果糖、葡萄糖等这样的物质。天然和合成的树胶也是常用的，包括阿拉伯胶、藻酸盐、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。聚乙二醇、乙基纤维素和蜡也可以用作粘合剂。

润滑剂在片剂中是必不可少的以便防止片剂与模头粘结。润滑剂选自如滑石、硬脂酸镁和硬脂酸钙、硬脂酸和氢化植物油这类润滑的固体。

片剂崩解剂是当片剂变湿润时促进片剂崩解以释放化合物的物质。它们包括淀粉、粘土、纤维素、藻酸钠和树胶、玉米淀粉和马铃薯淀粉、甲基纤维素、琼脂、膨润土、木纤维素、粉状天然海绵状物、阳离子交换树脂、藻酸、瓜尔胶、柑橘属果浆和羧甲基纤维素，例如，它们可以与十二烷基硫酸钠联用。

通常给片剂包糖衣作为调味剂和密封剂或给片剂包成膜保护剂以改变片剂的溶出特性。还可以通过在制剂中使用大量味道舒适的物质、诸如甘露糖醇将所述的化合物配制成咀嚼片且目前在本领域中得到充分确立。

当需要将化合物作为栓剂给药时，可以使用典型的基质。可可脂是传统的栓剂基质，可以通过添加蜡对其进行改性以便适度升高其熔点。广泛应用特别包括各种分子量聚乙二醇类的水混溶性栓剂基质。

可以通过适当配制使所述化合物的作用可以得到延缓或延长。例如，可以制备化合物的缓慢溶解性颗粒并将其混入片剂或胶囊。可以通过制备几种不同溶出速率的颗粒并用该颗粒的混合物填充胶囊对该项技术进行改进。可以给片剂或胶囊包薄膜衣，这种薄膜衣可以将溶出防止可预计的时间期限。甚至可以通过将所述化合物溶于或悬浮于使其仅缓慢分散于血清中的乳化赋形剂而使非肠道用制剂发挥长效作用。

本发明的药物组合物可以含有0.1％-95％的本发明化合物、优选1％-70％。在任何情况中，所给药的组合物或制剂均含有治疗所述疾病/病症有效量的一些化合物。

下面的段落描述了用于非人的动物的典型制剂和剂量。例如，可以通过注射经口服或非口服的方式给药本发明的化合物。可以给药一定量的本发明化合物，使得可以接受有效量，即对动物口服给药时通常为0.01-100mg/kg体重、优选0.1-50mg/kg体重的一般每日剂量。注意到每天可能需要一次以上剂量且兽医可以根据对特定情况的考虑确定有效量。

便利的情况是使所述化合物进入饮水以便化合物的治疗剂量通过每日的饮水摄入。可以将化合物直接计量入饮水，优选液体、水溶性浓缩物形式(诸如水溶性盐的水溶液)。便利的情况是还可以照此将所述化合物直接加入到饲料中或作为动物饲料添加剂形式、也称作预混合物或浓缩物。化合物在载体中的预混合物或浓缩物更常用于包含饲料中的活性剂。如果需要，合适的载体是液体或固体，诸如水；各种膳食粉，诸如苜蓿粉、大豆粉、棉子油粉、亚麻子油粉、玉米穗轴粉和玉米粉、糖蜜、尿素、骨粉；而诸如矿物混合物常用于家禽饲料。特别有效的载体是相应的动物饲料自身；即少部分这类饲料。载体有利于化合物在与预混合物混合的最终饲料中的均匀分布。重要的是使化合物充分混入预混合物和随后的饲料中。在这方面，可以将化合物分散或溶于合适的油载体、诸如大豆油、玉米油、棉子油等或挥发性有机溶剂且然后与载体混合。可以理解的是浓缩物中化合物的比例能够广泛改变，因为可以通过将适当比例的预混合物与饲料混合来调节最终饲料中活性化合物的量而得到所需浓度的化合物。

可以由饲料生产者将高效浓缩物与蛋白质载体，诸如大豆油粉和如上所述的其它膳食粉混合而生产浓缩的添加剂，它们适合于直接饲喂动物。在这类情况中，允许动物消耗通常的饮食。另一方面，可以将这类浓缩的添加剂直接加入到饲料中而产生营养平衡的含有治疗有效浓度的本发明化合物的成品饲料。通过标准步骤、诸如使用双壁混合器充分混合该混合物以确保均匀性。

如果将所述的添加剂用作饲料的顶肥，它同样有助于确保化合物通过追肥上部的化合物分布均匀。

为了对动物进行非肠道给药，可以将本发明的化合物制成糊剂或丸剂的形式并作为通常在动物头或耳部皮肤下的植入物给药。

可以通过使本发明的化合物分散于药物上可接受的油、诸如花生油、芝麻油、玉米油等中来制备糊剂。

可以通过将本发明的化合物与稀释剂、诸如聚乙二醇、巴西棕榈蜡等混合来制备含有有效量本发明化合物的丸剂。可以加入诸如硬脂酸镁或硬脂酸钙这样的润滑剂以改善成粒过程。

当然，认为可以给药动物一丸以上以便获得所需浓度。此外，已经发现在对动物的治疗过程中也可以定期埋入植入物以便在动物体内维持适当的活性剂浓度。

本文所用的“治疗”包括预防(例如预防性)和缓解性治疗且本文所用的“治疗”指的是通过预防和/或缓解性治疗的作用。

术语“治疗有效量”指的是改善疾病或疾患的一种或多种症状或预防或延缓疾病或疾患的一种或多种症状发作的本发明的化合物用量或本发明化合物与其它化合物的联合用药物的用量。

本文所用的“患者”指的是哺乳动物、特别是人。

“葡糖醛酸”是转化成代谢物或转化成母体化合物而由II相葡糖醛酸化共轭反应生成代谢物的取代基。葡糖醛酸与代谢物或母体化合物上的酸或醇或酚部分反应而生成“葡糖苷酸”。在本文的通式中将葡糖苷酸取代基缩写为“Glu”或“葡糖苷酸”。

“硫酸”是转化成代谢物或转化成母体化合物而由硫酸化共轭反应生成代谢物的取代基。硫酸与代谢物或母体化合物上的醇或酚基团反应而生成“硫酸酯”或“硫酸酯共轭物”。

给药本发明化合物与另一种化合物或其它化合物的联合用药物意味着可以将这些化合物作为组合物或作为同一单位剂型的组成部分或单独的剂型共通给药、在同时或在不同时间给药。

普通技术领域的化学工作者公认本发明的化合物含有一个或多个可以为特定立体化学、互变异构或几何构型形式的原子，从而产生立体异构体、互变异构体、区域和构型异构体。所有这类异构体及其混合物均包括在本发明中。还包括本发明化合物的水合物和溶剂合物。

本发明还包括同位素标记的化合物，它们与本发明的化合物相同，但一个或多个原子被具有原子量或原子数不同于实际通常发现的原子量或原子数的原子替代。可以混入本发明化合物的同位素的实例包括氢、碳、氮、氧、磷、硫、氟和氯的同位素，诸如分别有²H、³H、¹³C、¹⁴C、¹⁵N、¹⁸O、¹⁷O、³¹P、³²P、³⁵S、¹⁸F和⁶Cl。含有上述同位素和/或其它原子的其它同位素的本发明化合物、其前体药物和所述化合物或所述前体药物的药物上可接受的盐均属于本发明的范围。某些同位素标记的本发明化合物、例如那些混入了诸如³H和¹⁴C这样放射性同位素的化合物用于药物和/或底物组织分布试验中。特别优选氚化、即³H和碳-14同位素以便于制备和检测。此外，用较重的同位素、诸如氘、即²H取代因较大的代谢稳定性而可以提供一定的治疗优势，例如体内半衰期增加或剂量需求减少且由此可以优选在某些情况中使用。一般可以通过进行如下典型的方法或本领域中公知的方法制备同位素标记的本发明化合物及其前体药物。

本发明的化合物可以用作体外或体内代谢研究的分析标准品或用作新化学本体的化学合成或生物合成的中间体。可以将代谢物以固体或溶液形式分离。本发明的化合物还可以用于鉴定已经给药了(3-{[4-叔丁基-苄基]-(吡啶-3-磺酰基)-氨基}-甲基}-苯氧基)-乙酸或其药物上可接受的盐或前体药物或前体药物的盐的患者。为了鉴定已经给药了(3-{[4-叔丁基-苄基]-(吡啶-3-磺酰基)-氨基]-甲基}-苯氧基)-乙酸或其药物上可接受的盐或前体药物或前体药物的盐的患者，从患者中取血清、尿、粪便或胆汁样品并分析样品中是否存在一种或多种本发明的化合物。一种分析本发明化合物的方法通过使用色谱法和质谱法进行。其它分析方法对本领域技术人员而言是众所周知的。血清、尿、粪便或胆汁样品中存在一种或多种本发明的化合物表明患者已经被给药了(3-{[4-叔丁基-苄基)-(吡啶-3-磺酰基)-氨基]-甲基}-苯氧基)-乙酸或其药物上可接受的盐或前体药物或前体药物的盐。

在本发明的治疗方法中，可以直接对患者给药本发明的化合物，诸如以片剂形式；或可以给药通过患者身体代谢产生的所述化合物。此外，如果需要，给药途径和通过代谢产生的本发明化合物的剂量可以改变以获得所需的本发明化合物体内浓度和产生比例。

本发明化合物的药物上可接受的酸加成的盐可以由该化合物自身或任意其酯类形成且包括通常用于药物化学的药物上可接受的盐。例如，可以用无机酸或有机酸形成盐，所述的无机酸或有机酸有例如：盐酸；氢溴酸；氢碘酸；磺酸，包括诸如萘磺酸、甲磺酸和甲苯磺酸这样的试剂；硫酸；硝酸；磷酸；酒石酸；焦硫酸；偏磷酸；琥珀酸；甲酸；苯二甲酸；乳酸等；最优选用盐酸、柠檬酸、苯甲酸、马来酸、乙酸和丙酸成盐。

当用作药物时，对人或其它患者给药的本发明化合物的剂量变化得相当广泛且由参与的临床医师或兽医进行判断。应注意当以诸如月桂酸盐(laureate)这样的成盐部分具有相当大分子量的盐形式给药时，调整化合物的剂量可能是必不可少的。所述化合物的有效给药比例的一般范围约为0.001mg/天-约200mg/天。优选的范围约为0.01mg/天-100mg/天。当然，实际上通常在当天的不同时间给药每日剂量的化合物。然而，在任何指定的情况中，所给药的化合物的量取决于诸如活性成分的溶解性、所用的制剂和给药途径这类因素。

前体药物是在体内转化成本发明化合物的化合物。这种转化可以通过各种机制，诸如通过血液中的水解发生。T.Higuchi和W.Stella在 A.C.S. Symposium Series中的Vol.14“作为新转运系统的前体药物”和 Bioreversible Carriers in Drug Design ed.Edward B.Roche，American PharmaceuticalAssociation and Pergamon Press，1987中提供了对前体药物的应用的详细讨论。

例如，如果本发明的化合物含有羧酸官能基，那么前体药物可以包括通过用如下基团取代酸基团上的氢原子而形成的酯：诸如(C₁-C₈)烷基、(C₂-C₁₂)烷酰氧基甲基、含有4-9个碳原子的1-(烷酰氧基)乙基、含有5-10个碳原子的1-甲基-1-(烷酰氧基)-乙基、含有3-6个碳原子的烷氧羰基氧基甲基、含有4-7个碳原子的1-(烷氧羰基氧基)乙基、含有5-8个碳原子的1-甲基-1-(烷氧羰基氧基)乙基、含有3-9个碳原子的N-(烷氧羰基氧基)氨基甲基、含有4-10个碳原子的1-(N-(烷氧羰基)氨基)乙基、3-苯并[c]呋喃酮基、4-巴豆酸内酯基、γ-丁内酯-4-基、二-N，N-(C₁-C₂)烷氨基(C₂-C₃)烷基(诸如α-二甲氨基乙基)、氨基甲酰基(C₁-C₂)烷基、N，N-二(C₁-C₂)烷基氨基甲酰基-(C₁-C₂)烷基，和哌啶子基，吡咯烷-1-基-或吗啉代(C₂-C₃)烷基。

类似地，如果本发明的化合物含有醇官能基，那么可以通过用诸如(C₁-C₆)烷酰氧基甲基、1-((C₁-C₆)烷酰氧基)乙基、1-甲基-1-((C₁-C₆)烷酰氧基)乙基、(C₁-C₆)烷氧羰基氧基甲基、N-(C₁-C₆)烷氧羰基氨基甲基、琥珀酰基、(C₁-C₆)烷酰基、α-氨基(C₁-C₄)烷酰基、芳酰基和α-氨基酰基或α-氨基酰基-α-氨基酰基这样的基团取代醇基上氢原子而形成前体药物，其中α-氨基酰基各自独立地选自天然存在的L-氨基酸、P(O)(OH)₂、-P(O)(O(C₁-C₆)烷基)₂或糖基(从碳水化合物的半缩醛形式中除去羟基而产生的基团)。

如果本发明的化合物含有胺官能基，那么可以通过用诸如R^X-羰基、R^XO-羰基、NR^XR^X1-羰基这样的基团取代胺基上的氢原子而形成前体药物，其中R^X和R^X1各自独立为((C₁-C₁₀)烷基、(C₃-C₇)环烷基、苄基或R^X-羰基为天然α-氨基酰基或天然α-氨基酰基-天然α-氨基酰基、-C(OH)C(O)OY^X，其中Y^X是H、(C₁-C₆)烷基或苄基、-C(OY^X0)Y^X1，其中Y^X0为(C₁-C₄)烷基且Y^X1为((C₁-C₆)烷基、羧基(C₁-C₆)烷基、氨基(C₁-C₄)烷基或一-N-或二-N，N-(C₁-C₆)烷氨基烷基、-C(Y^X2)Y^X3，其中Y^X2为H或甲基且Y^X3为一-N-或二-N，N-(C₁-C₆)烷氨基、吗啉代、哌啶-1-基或吡咯烷-1-基。

有利的是本发明还提供了由消费者使用治疗疾病的试剂盒。该试剂盒包括：a)含有本发明化合物和药物上可接受载体、赋形剂或稀释剂的药物组合物；和b)描述治疗具体疾病的药物组合物的使用方法的说明书。

本申请中所用的“试剂盒”中包括含有独立的单位剂型的容器、诸如分开的小瓶或分开的箔包装。该容器可以是本领域中公知的由药物上可接受的材料制成的任意常用的形状或形式，例如纸或薄纸版盒、玻璃或塑料小瓶或罐、再密封袋(例如，为“再装满”放置的片剂而制成的不同容器)或装有为按照治疗方案挤出包的单个剂量的泡罩包。所用的容器可以取决于所包含的确切剂型，例如一般不将常用的薄纸版盒用于装液体混悬液。可行的是为了销售单一剂型而将一种以上容器彼此用于单一包装中。例如，可以将片剂装入小瓶，然后将小瓶装入盒。

这类试剂盒的实例是所谓的泡罩包。泡罩包在包装工业中是众所周知的且广泛用于包装单位药物剂型(片剂、胶囊等)。泡罩包一般由覆盖有优选透明塑料的箔的相对坚硬的材料组成。在包装过程中，在塑料箔中形成凹穴。这种凹穴具有所包装的各个片剂或胶囊的大小和形状或可以具有容纳所包装的多片和/或胶囊的大小和形状。下一步将片剂或胶囊放入凹穴且由此将相对坚硬的材料板与形成凹穴相对的方向的塑料箔表面的箔密封。结果是如果需要，在塑料箔与板之间的凹穴上分别或共同密封片剂或胶囊。优选板的强度使得可以通过用手在凹穴上施压、由此在凹穴表面的板上形成开口而从泡罩包内取出片剂或胶囊。然后可以通过所述开口取出片剂或胶囊。

需要提供书面的存储用具，其中书面存储用具属于含有临床医师、药剂师或受试者所用信息和/或说明的类型，例如下一次所用片剂或胶囊的数量的形式，其中所述的数量相当于应摄取特定片剂或胶囊的方案天数或包含相同类型信息的卡片。这类存储用具的另一个实例是印刷在卡片上的日程表，例如如下：“第一周，星期一、星期二、”...等....“第二周，星期一、星期二、...”等。存储用具的其它变化形式易于得知。“每日剂量”可以是在指定当天给药的单片或单粒胶囊或几片或几粒胶囊。

实际上的另一个具体实施方案是用于每次配每日剂量的配药器。优选给该配药器安装存储器以便进一步有利于与方案的依从性。这类存储器的实例是机械计数器，它指示了已经配好的每日剂量数。这类存储器的另一个实例是以电池为能量的微芯片存储器，它与液晶读出器或例如读出已经摄取的最后一次每日剂量的日期和/或在下一次服药时提醒患者的声音提醒信号连接。

在试剂盒的另一个实施方案中，药物组合物还可以含有可以与本发明化合物联用的另一种化合物；或该试剂盒可以包括两种药物组合物：一种含有本发明的化合物，而另一种含有可以与本发明化合物联用的另一种化合物。

将本文引用的参考文献、包括任何专利和专利申请引入本文作为参考。

本文提供的实施例用于解释本发明的具体实施方案，而不以任何方式来限制本说明书或权利要求。

实施例

¹⁴C-(3-{[4-叔丁基-苄基)-(吡啶-3-磺酰基)-氨基]-甲基}-苯氧基)-乙酸在Sprague Dawley大鼠体内的放射性标记质量平衡和代谢分布

目的

为了测定在静脉内给药15mg/kg单剂量的¹⁴C-(3-{[4-叔丁基-苄基]-(吡啶-3-磺酰基)-氨基]-甲基}-苯氧基)-乙酸后(3-{[4-叔丁基-苄基)-(吡啶-3-磺酰基)-氨基]-甲基}-苯氧基)-乙酸在Sprague-Dawley大鼠尿、粪便、胆汁和血浆中的放射性质量平衡和代谢分布。

材料和方法

放射性标记的化合物

¹⁴C-(3-{[4-叔丁基-苄基)-(吡啶-3-磺酰基)-氨基]-甲基}-苯氧基)-乙酸(特异活性4.36mCi/mmol)显示出的放射性纯度＞99％。

*¹⁴C-标记位置

可以按照下列方案制备¹⁴C-(3-{[4-叔丁基-苄基)-(吡啶-3-磺酰基)-氨基]-甲基}-苯氧基)-乙酸。

在室温下在二氯甲烷中将放射性标记的醛(ChemSyn Laboratories，Lenexa，KS)和胺A搅拌过夜(由等分试样加入NaBH₄中抑制和用HPLC分析监测亚胺形成)并用NaBH₄处理而得到化合物B，然后将其在二氯甲烷中用过量吡啶-3-磺酰氯和Hunig碱(二异丙基乙胺)处理而生成化合物C，使其与三氟乙酸在二氯甲烷中反应而形成¹⁴C-(3-{[4-叔丁基-苄基)-(吡啶-3-磺酰基)-氨基]-甲基}-苯氧基)-乙酸。

可以如下制备化合物A：

步骤1

·1eq(当量)醛、1eq碳酸酯、1.25eq溴乙酸叔丁基酯的丙酮溶液

·回流20-24小时

·用水抑制

·提取入乙酸乙酯、用2-丙醇(IPO)取代用于下一步

步骤2

·1eq化合物D、2eq羟基胺HCl、2eq吡啶(Py)的IPO溶液

·在回流状态下加热3-4小时

·用乙酸乙酯和HCl处理

·用2B乙醇(用甲苯变性)取代用于下一步

步骤3

·化合物E的2B乙醇溶液、30％RaNi(阮内镍)加载量、28％铵

·异丙醚提取；浓缩至得到油状物

·将油溶于IPO并加入马来酸的IPO溶液

·加入异丙醚以使盐析出

动物模型

使一组3只雄性和3只雌性颈静脉插套管的Sprague-Dawley大鼠(230-240g)各自寄居在用于采集尿和粪便的不锈钢代谢笼内并通过静脉内给药15mg/kg单剂量的¹⁴C-(3-{[4-叔丁基-苄基)-(吡啶-3-磺酰基)-氨基]-甲基}-苯氧基)-乙酸。

为了进行药动学和血浆鉴定，通过静脉内对两组动物给药15mg/kg单剂量的¹⁴C-(3-{[4-叔丁基-苄基)-(吡啶-3-磺酰基)-氨基]-甲基}-苯氧基)-乙酸(3只雄性和3只雌性动物用于药动学鉴定，而2只雄性和2只雌性动物用于血浆鉴定)。

对第四组动物(胆管和颈静脉插套管，2只雄性和2只雌性)给药用于采集胆汁和尿以便评价分泌途经和胆汁代谢物。

样品采集

在给药剂量后0-24、24-48、48-72、72-96、96-120、120-144和144-168小时时从第I组动物中采集尿和粪便、持续7天。在给药剂量后5分钟、15分钟、1、2、4、6、8、24和48小时时采全血用于药动学分析并在给药剂量后1和4小时时采全血用于鉴定循环的代谢物。通过离心从全血中分离血浆。在给药剂量后0-8、8-24和24-48小时时从插套管的动物中采集胆汁和尿。

样品分析

放射性测定

通过液体闪烁计数测定尿、胆汁和血浆中的放射性。将尿(0.1g)、胆汁(0.025g)或血浆(0.025g)的等分试样与5ml Ecolite(+)闪烁混合物混合并用Wallac#1409液体闪烁计数器(Gaithersburg，MD)计数。用水将每一时间点上采集的粪便样品匀化并记录粪便匀化物的总重。用Packard氧化剂(PackardInstrument Co.，Downer′s Grove，IL)氧化该匀化物的等分试样(0.1-0.3g)，此后进行闪烁计数。

将所述剂量中的放射性定为100％的总放射性。将每一时间点上采集的尿和粪便中的放射性定义为相应基质中分泌的剂量百分比。

基于给药赋形剂的19.75dpm/ng的特异活性将在血浆中测定的放射性转化成ng当量的(3-{[4-叔丁基-苄基)-(吡啶-3-磺酰基)-氨基]-甲基}-苯氧基)-乙酸。

代谢物分泌的定量评价

通过使用β-RAM(IN/US，Win-flow)测定各自分离的HPLC峰面积对代谢物进行定量。β-RAM在CPM中提供了典型积分峰的打印输出以及放射性物质的百分比。使用固体闪烁元件操作β-RAM。

从生物样品中提取代谢物

在氮气环境中将尿样(约10ml)蒸发过夜。用1ml 0.1％甲酸/乙腈(50∶50)将样品残留物再溶解。将这些溶液涡动约1分钟，转入1.5ml eppendoff管且然后以14,000rpm离心约2分钟。不经进一步纯化而将上清液的等分试样(10-20μl)注入HPLC柱。

收集含有最高水平分泌放射性的粪便匀化物(0-48小时)。将来自采集样品(约80-135g)的等分试样(约5g)悬浮于15ml乙腈中。将混悬液进行超声处理(约30分钟)、涡动并以3200rpm离心10分钟。在将上清液转入清洁的15ml锥形管后，如上所述用15ml乙腈进一步将残余物提取2次。用液体闪烁计数器对来自每次提取的等分试样(200ul)计数。提取的放射性回收率在92-96％的范围。在氮气环境中的Turbo Vap LV蒸发器(Zymark，Hopkinton，MA)内将上清液蒸发至干并用2ml流动相将残余物再溶解。将浓缩粪便提取物的等分试样(10-20ul)注入HPLC柱。

使用2个体积的乙腈沉淀用于鉴定循环代谢物的血浆。将混悬液进行超声处理(约30分钟)、涡动并以3200rpm离心10分钟。在将上清液转入清洁的15ml锥形管后，如上所述用2×15ml乙腈进一步提取残余物。合并上清液并在氮气环境中的Turbo Vap LV蒸发器内将上清液蒸发至干且用0.5ml流动相将残余物再溶解。将浓缩血浆提取物的等分试样(50-100ul)注入HPLC柱。

不经进一步纯化而将胆汁直接注入HPLC/MS系统用于分析。

高效液相色谱

HPLC系统由HP-1100溶剂转运系统、HP-1100膜脱气装置、HP-1100自动注射器(Hewlett Packard)和IN/US放射性监测器(β-RAM)组成。用YMCAQ(C-18)柱(4.6mm×150mm，3um)(Waters，Milford，MA)进行色谱。流动相最初由pH5.0的10mM甲酸铵(溶剂A)和乙腈(溶剂B)组成。如下进行溶剂转运步骤梯度程序：

时间(分钟)	％溶剂A	％溶剂B
时间(分钟)	％溶剂A	％溶剂B	0-33-2525-2626-2929-3131-35	903510109090	106590901010

使该系统平衡10分钟，此后进行下一次注射。在整个分析过程中将流速维持在1.0ml/分钟。为了对血浆代谢物进行定量，使HPLC流出液进入β-ram放射性检测器的流动池。使用ARC(精确放射性同位素计数)系统在外部控制β-ram和HPLC以便进行低水平放射性计数。

质谱

使用安装了API-2电喷雾界面(Finnigan，San Jose，CA)的Finnigan TSQ7000三联四极质谱仪对代谢物进行鉴定。分离HPLC柱流出液以便以约50μl/分钟导入API界面。使剩余的流出液进入β-RAM的流动池。用MS数据采集系统记录β-RAM响应作为实时类似物信号。根据从MS流入放射性检测器的停留体积(相当于约0.2分钟的停留时间)从放射性和MS检测器中分离采集的数据。电喷雾电压以-4.5eV运转作为以正离子方式采集的质谱仪数据。在Q2(Q2是第二个四极)中使用氩气、应用30-35eV的碰撞能量和约2.1mTorr的碰撞气体稠度进行碰撞诱导解离(CID)研究。

结果与讨论

代谢物鉴定

代谢物M8

代谢物M8具有的保留时间为10:26-11:35(分:秒)且在m/z351处显示出质子化分子离子。在尿(雄性动物)和胆汁中检测到它。M8的CID碎裂方式在m/z 305、146和131处具有主碎片。从该分子离子中失去46amu的m/z 305处的离子提示存在羧酸部分。在m/z 131和146处的离子是分别因羧基异丙基苄基和羧基异丙基苄胺部分产生的，其中存在失去甲酸的污染物。基于碎裂方式和分子离子认为M8是由苯氧基乙酸部分N-脱苄基化、随后将叔丁基部分氧化成羧酸并使吡啶环羟基化而形成的。该代谢物与三氯化钛(20％的磷酸溶液)的反应使该代谢物的保留时间增加约1分钟且所得的M+H⁺离子减少了16amu，从而提示该代谢物是N-氧化物。基于这一数据，将M8鉴定为2-{4-[吡啶-N-氧化物-3-磺酰氨基]-甲基}-苯基}-2-甲基-丙酸。

代谢物M13

代谢物M13在HPLC上具有的保留时间约为10:47(分:秒)且仅在胆汁(雄性动物)中检测到它。它在m/z 661处显示出质子化分子离子，高于母体化合物192amu。其CID产物离子光谱在m/z 485、467、342、324、165和145处显示了主碎片离子。在m/z 485处的离子是因从分子离子中失去葡糖醛酸而产生的。在m/z 467处的离子从m/z 485处的离子中失去水而产生。在m/z 342和324处的离子因随后失去磺酰基吡啶部分和水而生产。与母体化合物的离子类似，m/z 165处的离子是由质子化甲基苯氧基乙酸部分产生的。在m/z 145处的离子表示从羟基叔丁基苄基部分上失去水。基于这些数据将M13鉴定为(3-{[[4-(2-羟基-1，1-二甲基-乙基)-苄基]-(吡啶-3-磺酰基)-氨基}-甲基)-苯氧基)-乙酸葡糖苷酸。

代谢物M9

代谢物M9在m/z 417处具有质子化分子离子且仅在雌性大鼠的尿中检测到它。它在HPLC上具有的保留时间约为11:35(分:秒)。在m/z 417处的质子化分子离子低于母体化合物52amu这一结果提示M9是裂解产物。M9的CID产物离子光谱在m/z 319、160和145处显示出主离子。在m/z 319处的离子低于质子化分子离子98amu这一结果提示从该分子中失去了水和硫酸分子。在m/z 145处的离子低于m/z 147处的母体化合物2amu这一结果提示叔丁基苄基已经被羟基化且在碎裂过程中失去了水分子。另外，该代谢物与三氯化钛(20％的磷酸溶液)的反应使该代谢物的保留时间增加约2分钟且所得的M+H⁺离子减少了16amu，从而提示该代谢物是N-氧化物。基于这些数据，认为M9的结构为吡啶-N-氧化物-3-磺酸4-(2-羟基-1，1-二甲基-乙基)-苄酰胺的硫酸酯共轭物。

代谢物M6

代谢物M6在HPLC上具有的保留时间约为11:23-12:37(分:秒)仅在粪便、胆汁和血浆中均发现了它。它在m/z 565处显示出质子化分子离子(高于母体化合物96amu)，从而提示加入了氧原子和硫酸基。M6的CID产物的离子光谱在m/z 485、467、342、324、165和145处显示了主碎片。在m/z 485和467处的离子是因随后从质子化分子离子中失去硫酸和水所产生的。在m/z 165处的离子与母体化合物的离子相似，表明甲基苯氧基乙酸部分没有改变。m/z 342(高于母体化合物中观察到的16amu)处的离子表明已经在叔丁基苄基部分上加入了氧原子。m/z 324和145处的离子低于母体化合物光谱中的相应数值2amu，从而再次提示在叔丁基苄基部分上加入了氧且在碎裂时失去了水分子。基于该数据，将M6鉴定为(3-{[[4-(2-羟基-1，1-二甲基-乙基)-苄基]-(吡啶-3-磺酰基)-氨基]-甲基}-苯氧基)-乙酸的硫酸酯共轭物。

代谢物M10

代谢物M10在m/z 401处具有质子化分子离子且仅在粪便和雌性动物尿中发现了它。它在HPLC上具有的保留时间约为13:26(分:秒)。在m/z 401处的分子离子低于母体化合物68道尔顿这一结果提示它是裂解产物。M10的CID产物离子光谱在m/z 303、160和145处显示了主离子。在m/z 303处的离子低于质子化分子离子98amu这一结果提示从该分子上失去了硫酸。m/z 145处的离子低于m/z 147处的母体化合物的离子2amu这一结果提示叔丁基苄基已经被羟基化且在碎裂过程中已经失去了水分子。基于这些数据，认为M10的结构为吡啶-3-磺酸4-(2-羟基-1，1-二甲基-乙基)-苄酰胺的硫酸酯共轭物。

代谢物M11

代谢物M11具有的保留时间约为12:04-14:20(分:秒)且在尿和胆汁中发现了它并在m/z 335处显示了质子化分子离子。在m/z 335处的分子离子低于母体化合物134道尔顿这一结果提示它是裂解产物。M11的CID碎裂方式在m/z 289、146和131处具有主碎片。在m/z 289处的离子从该分子离子中失去了46amu这一结果提示存在羧酸部分。m/z 131和146处的离子可能分别是由羧基异丙基苄基和羧基异丙基苄胺部分与失去甲酸的污染物产生的。基于这些数据，认为M11的结构为2-甲基-2-{4-[(吡啶-3-磺酰基氨基)-甲基]-苯基}-丙酸。

代谢物M3

代谢物M3在HPLC上具有的保留时间约为12:33-14:21(分:秒)且在(雄性动物)和粪便中发现了它。它在m/z 499处显示了质子化分子离子(高于母体化合物30amu)。CID产物离子光谱在m/z 453、356、310、165和131处显示了主碎片。在m/z 165处的离子与母体化合物的离子类似，从而提示甲基苯氧基乙酸部分没有改变。在m/z 356处的离子高于在母体化合物中观察到的30amu，从而提示加入了两个氧原子并失去了两个氢原子。m/z 310和131处的离子是因分别从m/z 356和177处的离子中失去46amu而产生的，从而提示存在羧酸部分。基于这些数据，将代谢物M3鉴定为2-(4-{[(3-羧基甲氧基-苄基)-(吡啶-3-磺酰基)-氨基]-甲基}-苯基)-2-甲基-丙酸。

代谢物M4

代谢物M4在HPLC上具有的保留时间约为13:20-15:00(分:秒)且在粪便、胆汁、血浆和雌性动物尿中发现了它。它在m/z 485处显示了质子化分子离子(高于母体化合物16amu)。在m/z 485的CID产物离子光谱在m/z 467、342、324、165和145处显示了主碎片离子。m/z 467处的离子是因从该分子中失去水而产生的。在m/z 342处的离子是因失去磺酰基吡啶部分且随后失去水而形成m/z 324处的离子而产生。与母体化合物离子类似的m/z 165处的离子是由质子化甲基苯氧基乙酸部分产生的。在m/z 145处的离子表明从羟基叔丁基苄基部分上失去了水。基于这些数据，将M4鉴定为(3-{[[4-(2-羟基-1，1-二甲基-乙基)-苄基]-(吡啶-3-磺酰基)-氨基]-甲基}-苯氧基)-乙酸。

代谢物M5

代谢物M5在HPLC上具有的保留时间约为15:23(分:秒)且在血浆和胆汁中发现了它。它在m/z 485处显示了质子化分子离子(高于母体化合物16amu)。M5的CID产物离子光谱在m/z 439、326、165和147处显示了主碎片离子。m/z 439处的离子是因从该分子中失去甲酸而产生的。在m/z 326、165和147处的离子与母体化合物的那些离子类似，从而提示甲基苯氧基乙酸和叔丁基苄基部分没有改变。基于这些数据，将M5鉴定为(3-{[(4-叔丁基-苄基)-(吡啶-N-氧化物-3-磺酰基)-氨基]-甲基}-苯氧基)-乙酸。

代谢物M14

代谢物M14在HPLC上具有的保留时间约为16:90且仅在胆汁中发现了它。它在m/z 645处显示了高于母体化合物176道尔顿的质子化分子离子，从而提示它是葡糖苷酸共轭物。在m/z 645的CID产物离子光谱在m/z 469、423、413、326、165和147处显示了主碎片离子。在m/z 469处的离子是因从该分子上失去葡糖醛酸部分而产生的。m/z 423处的离子是因从该分子上失去甲酸而产生的。失去叔丁基产生m/z 413处的离子。m/z 326处的离子是因失去磺酰基吡啶部分而产生的。m/z 165处的离子是由质子化甲基苯氧基乙酸部分产生的。基于这些数据，将该代谢物鉴定为(3-{[4-叔丁基-苄基)-(吡啶-3-磺酰基)-氨基]-甲基}-苯氧基)-乙酸葡糖苷酸。

代谢物M12

代谢物M12在HPLC上具有的保留时间为15:50-17:50(分:秒)且在粪便和胆汁中发现了它。它在m/z 485处显示了质子化分子离子(高于母体化合物16amu)。M12的CID产物离子光谱在m/z 485、342、305、181、162和147处显示了主碎片。在m/z 162和147处的离子与在母体化合物中观察到的那些离子类似，从而提示叔丁基苄基部分没有改变。m/z 181和342处的离子高于在母体化合物中观察到的离子(分别在m/z 165和m/z 326处)16amu，从而表明甲基苯氧基乙酸部分上加入了氧原子。m/z 305处的离子是因失去羟基苯氧基乙酸部分而产生的。基于这些数据，将M12鉴定为(5-{[(4-叔丁基-苄基)-(吡啶-3-磺酰基)-氨基]-甲基}-羟基-苯氧基)-乙酸。注意当在本申请中使用该化学名时，苯环上羟基的位置并没有特别指定且该名称用于包括羟基每一个可能的位置。

合成方案1中给出了(3-{[4-叔丁基-苄基]-(吡啶-3-磺酰基)-氨基}-甲基)-苯氧基)-乙酸的代谢途经概述。主要的氧化途经是因叔丁基部分被氧化而得到羟甲基代谢物M4(雄性19.7％；雌性6.5％)而产生的。M4进一步被氧化成羧酸代谢物M3(雄性32.8％；雌性1.66％)或与硫酸共轭成代谢物M6(雄性12.7％；雌性36.2％)。其它少量代谢物是因吡啶环(M5)N-氧化以及甲基-苯氧基乙酸部分羟基化和N-脱烷基化、随后进行两相共轭而产生的。除母体化合物外，循环代谢物中也包括M4、M5和M6。

合成方案1.静脉内给药15mg/kg单剂量的¹⁴C-(3-{[4-叔丁基-苄基)-(吡啶-3-磺酰基)-氨基]-甲基}-苯氧基)-乙酸后(3-{[4-叔丁基-苄基)-(吡啶-3-磺酰基)-氨基]-甲基}-苯氧基)-乙酸在Sprague-Dawley大鼠体内的代谢途经。

大鼠、狗、猴和人的肝微粒体和肝细胞中(3-{[4-叔丁基-苄基)-(吡啶-3-磺酰基)-氨基]-甲基}-苯氧基)-乙酸的体外代谢物的鉴定

(3-{[4-叔丁基-苄基)-(吡啶-3-磺酰基)-氨基]-甲基}-苯氧基)-乙酸在大鼠、狗、猴和人的肝微粒体和肝细胞内广泛代谢。主要的代谢途经是因叔丁基部分被氧化成醇、吡啶部分氧化和/或甲基苯氧基乙酸部分N-脱烷基化所产生的。醇代谢物M4被进一步氧化成相应的羧酸M3。在肝细胞中，M4与硫酸共轭。在狗的肝细胞中，代谢物M12之一是由甲基苯氧基乙酸部分的芳香氧化所产生的。

目的

为了测定(3-{[4-叔丁基-苄基)-(吡啶-3-磺酰基)-氨基]-甲基}-苯氧基)-乙酸在人、大鼠、狗和猴的肝微粒体和肝细胞内的代谢途经。

材料

放射性标记的化合物

¹⁴C-(3-{[4-叔丁基-苄基)-(吡啶-3-磺酰基)-氨基]-甲基}-苯氧基)-乙酸(特异活性4.36mCi/mmol)显示的放射性纯度＞99％且如上所述合成。

微粒体培养

通过使用标准方法进行差速离心制备人(HL-混合物12)、大鼠、猴和狗的肝微粒体。在使用前，将肝微粒体在冰上融化并使用pH7.4的100mM磷酸钾再溶解。将[¹⁴C]-(3-{[4-叔丁基-苄基]-(吡啶-3-磺酰基)-氨基}-甲基)-苯氧基)-乙酸溶于100mM pH7.4的磷酸钾，使最终的底物浓度为20μM。在37℃下和振摇的水浴中将样品与微粒体(CYP 450；0.5uM)一起预培养3分钟。通过添加100μl辅因子(1.1mM NADPH，10mM MgCl₂)/1ml培养混合物开始培养。30分钟后通过添加等体积的冷乙腈终止培养。

肝细胞培养

人肝细胞由3个肝的混合物得到。使用SpragueDawley大鼠(12个肝)、猕猴(1个肝)和比哥猎犬(2个肝)得到大鼠和猴的肝细胞。将冷藏的肝细胞悬浮于含有10％FBS的William E培养基中至存活计数为2百万个细胞/ml并开始通入95/5O₂/CO₂气体且每隔1小时培养一次。在向25ml锥形瓶中加入20uM(3-{[4-叔丁基-苄基)-(吡啶-3-磺酰基)-氨基]-甲基}-苯氧基)-乙酸后，加入2.5ml肝细胞混悬液并在37℃下和振摇的水浴中培养4小时。

样品分析

定量评价

通过使用β-RAM(IN/US，Win-flow)测定各个分离的HPLC峰面积对代谢物进行定量。β-RAM在CPM中提供了典型积分峰的打印输出以及放射性物质的百分比。使用固体闪烁池操作β-RAM。

从体外基质中提取代谢物

通过添加等体积的冷乙腈终止培养、进行超声处理并以3000rpm离心10分钟。除去上清液并在氮气环境中蒸发至干。用50∶50(乙腈∶水)将残余物再溶解并将等分试样(50-90μl)注入HPLC柱用于分析。

高效液相色谱

HPLC系统由HP-1100溶剂转运系统、HP-1100膜脱气装置、HP-1100自动注射器(Hewlett Packard)和IN/US放射性监测器(β-RAM)组成。用YMCAQ(C-18)柱(4.6mm×150mm，3um)(Waters，Milford，MA)进行色谱。流动相最初由pH3.5的含有甲酸(溶剂A)和乙腈(溶剂B)的10mM乙酸铵组成。

如下进行溶剂转运步骤梯度程序：

时间(分钟) ％溶剂A ％溶剂B

0-3 90 10

3-25 35 65

25-26 10 90

26-29 10 90

29-31 90 10

31-35 90 10

使该系统平衡10分钟，此后进行下一次注入。在整个分析过程中将流速维持在1.0ml/分钟。

质谱

使用安装了API-2电喷雾界面的Finnigan TSQ 7000三联四极质谱仪对代谢物进行鉴定。分离HPLC柱流出液以便以约50μl/分钟导入API界面。使剩余的流出液进入β-RAM的流动池。用MS数据采集系统记录β-RAM响应作为实时类似物信号。根据从MS流入放射性检测器的停留体积(相当于约0.2分钟的停留时间)从放射性和MS检测器中分离采集的数据。电喷雾电压以-4.5eV运转成以正离子方式采集的质谱仪数据。在Q2中使用氩气、应用30-35eV的碰撞能量和约2.1mTorr的碰撞气体稠度进行碰撞诱导解离(CID)研究。

结果与讨论

在微粒体中的转化

(3-{[4-叔丁基-苄基]-(吡啶-3-磺酰基)-氨基}-甲基}-苯氧基)-乙酸在肝微粒体中的转化率在大鼠中最高(94.3％)、随后是人(92.8％)、猴(74.9％)和狗(41.6％)。微粒体培养的有代表性的HPLC放射色谱如图1中所示。通过联机放射性计数对代谢物定量并将相对百分比列在表1中。

在肝细胞中转化

将(3-{[4-叔丁基-苄基]-(吡啶-3-磺酰基)-氨基}-甲基)-苯氧基)-乙酸与大鼠、狗、猴和人肝细胞一起培养。对4个种类而言，相对转化率为大鼠＝猴子＞人＞狗。将代谢物在肝细胞培养中的相对百分比列在表2中。肝细胞培养的有代表性的HPLC放射色谱如图2中所示。

通过LC/MS/MS使(3-{[4-叔丁基-苄基)-(吡啶-3-磺酰基)-氨基]-甲基}-苯氧基)-乙酸碎裂

(3-{[4-叔丁基-苄基]-(吡啶-3-磺酰基)-氨基]-甲基}-苯氧基)-乙酸在HPLC上具有的保留时间为17-17:28(分:秒)且在m/z 469处显示了质子化分子离子。m/z 469的CID产物离子光谱在m/z 423、413、326、165和147处显示了主碎片离子(图3)。m/z 423处的离子因从该分子中失去甲酸而产生。失去叔丁基产生m/z 413处的离子。m/z 326处的离子因失去磺酰基吡啶部分而产生。m/z 165处离子由质子化甲基苯氧基乙酸部分产生，而m/z 147处的离子由叔丁基产生。提出的(3-{[4-叔丁基-苄基)-(吡啶-3-磺酰基)-氨基]-甲基}-苯氧基)-乙酸的碎裂如下所示：

代谢物的鉴定

代谢物M21

代谢物M21在m/z 321处具有质子化分子离子且在HPLC上具有的保留时间为10:58(分:秒)。在大鼠、狗和猴的肝细胞中发现了它。m/z 321处的分子离子提示母体化合物N-脱苄基化且羟基化。M21的CID产物离子光谱在m/z 178、160、145、133和78处显示了主离子(图4)。m/z 178处的离子因裂解磺酰胺键而产生。从在m/z 178处的离子中失去水而得到m/z 160处的离子。在m/z 145处的离子低于m/z 147处的母体化合物的离子2amu，从而提示该分子的叔丁基部分上被羟基化。在m/z 78处的离子因吡啶环上的电荷稳定而产生。基于这些数据，将M21的结构鉴定为吡啶-3-磺酸4-(2-羟基-1，1-二甲基-乙基)-苄酰胺。

代谢物M11

代谢物M11在HPLC上具有的保留时间为9:48-10:48(分:秒)且在m/z335处显示了质子化分子离子。在大鼠和猴的肝微粒体中发现了它。m/z 335处的分子离子低于母体化合物134道尔顿，从而提示它是裂解产物。M11的CID产物离子光谱在m/z 289、146和131处显示了碎片(图5)。在m/z 289处的离子从该分子离子上失去了46amu，从而提示存在羧酸部分。在m/z 131和146处的离子可能是因修饰的叔丁基苄基和叔丁基苄胺部分与失去甲酸的污染物而产生的。基于碎裂方式和分子离子提示M11因苯氧基乙酸部分N-脱苄基化、随后叔丁基部分被氧化成羧酸而形成。因此，将其鉴定为2-甲基-2-{4-[(吡啶-3-磺酰氨基)-甲基]-苯基}-丙酸。

代谢物M2

代谢物M2在HPLC上具有的保留时间为12:24(分:秒)且在m/z 501处显示了质子化分子离子(高于母体化合物32amu)。在大鼠和猴的肝细胞中发现了M2。它在m/z 483、342、324、165和145处显示了主碎片(图6)。在m/z 483处的离子因从该分子上失去水而产生。在m/z 342处的离子因失去磺酰基吡啶部分、随后失去水而形成m/z 324处的离子而产生。与母体化合物类似的在m/z 165处的离子是甲基苯氧基乙酸部分产生的。在m/z 145处的离子表明从修饰的叔丁基苄基部分上失去水。基于这些数据将M2鉴定为二羟基(3-{[4-叔丁基-苄基)-(吡啶-3-磺酰基)-氨基]-甲基}-苯氧基)-乙酸。注意当在本申请中使用该化学名时，吡啶基环上羟基的位置并没有特别指定且该名称用于包括羟基每一个可能的位置。

代谢物M3

代谢物M3在HPLC上具有的保留时间为11:55-13:54(分:秒)且在m/z499处显示了质子化分子离子(高于母体化合物30amu)。在大鼠、猴和人的所有种类的肝微粒体和肝细胞中均发现了它。M3的CID产物离子光谱在m/z 453、356、310、177、165和131处显示了主碎片(图7)。在m/z 165处的离子与母体化合物的离子类似，从而提示甲基苯氧基乙酸部分没有改变。m/z 356处的离子高于在母体化合物中观察到的离子30amu，从而提示加入了两个氧原子且失去了两个氢原子。在m/z 310和131处的离子因分别从m/z356和177处的离子上失去46amu而产生，从而提示存在羧酸部分。基于这些数据，将代谢物M3鉴定为羧基(3-{[4-叔丁基-苄基)-(吡啶-3-磺酰基)-氨基]-甲基}-苯氧基)-乙酸。

代谢物M4

代谢物M4在HPLC上具有的保留时间为13:29(分:秒)且在m/z 485处显示了质子化分子离子(高于母体化合物16amu)。在大鼠、猴和人的肝微粒体和人肝细胞中发现了它。其CID产物离子光谱在m/z 467、342、335、165和145处显示了主碎片离子(图8)。m/z 467处的离子由从该分子上失去水而产生。在m/z 342处的离子由失去磺酰基吡啶部分、随后失去水而形成m/z324处的离子而产生。与母体化合物离子类似的m/z 165处的离子由质子化甲基苯氧基乙酸部分产生。m/z 145处的离子表明从修饰的叔丁基苄基部分上失去了水。基于这些数据，将M4鉴定为羟基(3-{[4-叔丁基-苄基)-(吡啶-3-磺酰基)-氨基]-甲基}-苯氧基)-乙酸。

代谢物M19

代谢物M19在HPLC上具有的保留时间为14:40(分:秒)且在m/z 321处显示了质子化分子离子(低于母体化合物148amu)。在所分析的所有种类的微粒体中均发现了它。M19的CID产物离子光谱在m/z 321、265、162和147处显示了主碎片离子(图9)。在母体化合物的CID产物离子光谱中观察到了m/z 162和147处的离子，从而提示苯基叔丁基没有改变且该分子已经进行了N-脱烷基化。在m/z 265处的离子由失去叔丁基部分而产生，从而提示吡啶部分上已经发生了氧化。基于该数据，将M19鉴定为5-羟基-吡啶-3-磺酸4-叔丁基-苄酰胺。注意当在本申请中使用该化学名时，吡啶基环上羟基的位置并没有特别指定且该名称用于包括羟基每一个可能的位置。

代谢物M6

代谢物M6在HPLC上具有的保留时间为11:52(分:秒)且在m/z 565处显示了质子化分子离子，高于母体化合物96amu，从而提示加入了氧原子和硫酸部分。在大鼠、猴和人的肝细胞中发现了它。M6的CID产物离子光谱在m/z 485、467、342、324、165和145处显示了主碎片(图10)。在m/z 485和467处的离子因从质子化分子离子上失去硫酸和水而产生。在m/z 165处的离子与母体化合物的离子类似，表明甲基-苯氧基乙酸部分没有改变。在m/z 342处的离子(高于在母体化合物中观察到的16amu)表明叔丁基苄基部分上已经加入了氧原子。在m/z 324和145处的离子低于相应母体化合物光谱上的离子2amu，从而再次提示叔丁基苄基部分上加了氧且在碎裂时失去了水分子。基于这些数据将M6鉴定为羟基-(3-{[4-叔丁基-苄基)-(吡啶-3-磺酰基)-氨基]-甲基}-苯氧基)-乙酸的硫酸酯共轭物。

代谢物M5

代谢物M5在HPLC上具有的保留时间约为15:29且在m/z 485处显示了质子化分子离子(高于母体化合物16amu)。在大鼠、狗、猴和人的肝微粒体中发现存在M5。在m/z 485处的CID产物离子光谱在m/z 439、326、165和147显示了主碎片离子(图11)。在m/z 326、147和165处的离子均与在母体化合物CID光谱中观察到的类似且提示苯基叔丁基和苯氧基乙酸部分没有改变。在m/z 439处的离子高于在母体化合物中观察到的离子16amu。该数据提示吡啶部分羟基化。另外，用三氯化钛处理该代谢物在色谱图上使15.3分钟时的峰消失并使(3-{[4-叔丁基-苄基]-(吡啶-3-磺酰基)-氨基]-甲基}-苯氧基)-乙酸的相对面积增加，从而提示M5是母体化合物的N-氧化物。基于这些数据将M5鉴定为(3-{[4-叔丁基-苄基)-(吡啶-3-磺酰基)-氨基]-甲基}-苯氧基)-乙酸N-氧化物。

代谢物M12

代谢物M12在HPLC上具有的保留时间约为16:01(分:秒)且仅在狗的肝微粒体中发现了它。它在m/z 485处显示了质子化分子离子(高于母体化合物16amu)。代谢物M12的CID产物离子光谱在m/z 485、342、305、181、162和147处显示了主碎片(图12)。在m/z 162和147处的离子与在母体化合物中观察到的类似，从而提示叔丁基苄基部分没有改变。在m/z 181和342处的离子高于在母体化合物中观察到的离子(分别为m/z 165和326处)16amu，表明甲基-苯氧基乙酸部分上加入了氧原子。m/z 305处的离子因失去苯氧基乙酸部分产生。基于这些数据，将M12鉴定为羟基(3-{[4-叔丁基-苄基)-(吡啶-3-磺酰基)-氨基]-甲基}-苯氧基)-乙酸。再次注意当在本申请中使用该化学名时，苯环上羟基的位置并没有特别指定且该名称用于包括羟基每一个可能的位置。

代谢物M20

代谢物M20在HPLC上具有的保留时间约为19:45分钟且在m/z 305处显示了质子化分子离子(低于母体化合物16amu)。代谢物M12的CID产物离子光谱在m/z 485、342、305、181、162和147处显示了主碎片。M20的CID离子光谱在m/z 162和147处显示了主碎片离子(图13)。在母体化合物的CID产物离子光谱中观察到了这些离子且由此提示(3-{[4-叔丁基-苄基)-(吡啶-3-磺酰基)-氨基]-甲基}-苯氧基)-乙酸已经进行了N-脱烷基化，在m/z 305处产生裂解的代谢物。基于这些数据将M20鉴定为吡啶-3-磺酸4-叔丁基-苄酰胺。

(3-{[4-叔丁基-苄基)-(吡啶-3-磺酰基)-氨基]-甲基}-苯氧基)-乙酸在大鼠、狗、猴和人的肝微粒体和肝细胞中广泛代谢。提出的代谢途经如合成方案2中所示。主要的代谢途经因叔丁基部分被氧化成醇、吡啶部分氧化和/或甲基苯氧基乙酸部分N-脱烷基化而产生。醇代谢物M4进一步被氧化成相应的羧酸M3。在肝细胞中，M4与硫酸共轭。在狗的肝细胞中，代谢物M12之一因甲基苯氧基乙酸部分的芳香氧化而产生。

表1.(3-{[4-叔丁基-苄基)-(吡啶-3-磺酰基)-氨基]-甲基}-苯氧基)-乙酸的代谢物在大鼠、狗、猴和人肝微粒体中的百分比

代谢物序号放射性百分比

RT M/z 大鼠狗猴人

M11 9:48 335 20.7 - 7.97 -

M3 11:55 499 56.2 - 8.80 50.0

M4 13:29 485 4.38 11.5 47.3 26.5

M5 14:40 321 3.26 3.61 4.37 7.06

M19 15:29 485 7.80 20.1 5.21 -

母体 17:00 469 5.70 58.4 25.2 7.16

M20 19:45 305 - 1.96 - -

母体化合物为(3-{[4-叔丁基-苄基]-(吡啶-3-磺酰基)-氨基}-甲基)-苯氧基)-乙酸；RT是按分:秒计的保留时间。

表2.(3-{[4-叔丁基-苄基)-(吡啶-3-磺酰基)-氨基]-甲基}-苯氧基)-乙酸的代谢物在大鼠、狗、猴和人肝细胞中的百分比

代谢物序号放射性百分比

RT M/z 大鼠狗猴^* 人^*

M21 10:58 321 8.91 7.92 4.53 -

M6 11:52 565 9.55 - 52.9 29.6

M2 12:24 501 15.1 6.59 - -

M3 13:54 499 57.3 12.3 29.9 17.8

M4 13:29 485 - - - 41.2

M12 16:01 485 - 15.0 - -

母体 17:28 469 - 51.4 - 5.68

^*通过使用相同梯度和柱的HPLC分析猴和人的肝细胞样品，但流动相含有pH5.0的乙酸铵(10mM)。给出的保留时间对上述特定的梯度而言也是特定的。

合成方案2.提出的¹⁴C-(3-{[4-叔丁基-苄基)-(吡啶-3-磺酰基)-氨基]-甲基}-苯氧基)-乙酸在肝微粒体和肝细胞中体外培养后的代谢途经。

使用重组人P-450产生的代谢物

重组人细胞色素P-450同种型rCYP3A4、rCYP3A5和rCYP2C8购自Gentest(Woburn，Mass)。在每次培养中所用表达的rCYP的量约为1mg蛋白/ml培养液。在使用前，将微粒体在冰上融化并使用100mM pH7.4的含有(3-{[4-叔丁基-苄基]-(吡啶-3-磺酰基)-氨基}-甲基)-苯氧基)-乙酸(50uM)的磷酸钾再溶解。在37℃下和振摇的水浴中将样品与重组CYP一起预培养3分钟。通过添加100μl辅因子(1.1mM NADPH，10mM MgCl₂)开始培养。培养60分钟后，用乙酸将样品酸化至pH3.0并用等体积的甲基叔丁基醚(MTBE)提取。在氮气环境中蒸发MTBE层至干并用10mM乙酸铵∶乙腈(1∶1)再溶解以用于LC/MS分析。

P-450代谢物的L C/MS结构表征

HPLC系统由HP-1100溶剂转运系统、HP-1100膜脱气装置、HP-1100自动注射器(Hewlett Packard)和IN/US放射性监测器(β-RAM)组成。用YMCODS AQ(C-18)柱(4.6mm×150mm，3um)进行色谱。流动相最初由pH5.0的含有乙酸(溶剂A)和乙腈(溶剂B)的10mM乙酸铵组成。使用安装了电喷雾界面的Micromass Q-Tof 2(Beverly，MA)质谱仪对代谢物进行鉴定。分离HPLC柱流出液以便以约50μl/分钟导入API界面。使剩余的流出液进入β-RAM的流动池。用MS数据采集系统记录β-RAM响应作为实时类似物信号。根据从MS流入放射性检测器的停留体积(相当于～0.1分钟的停留时间)从放射性和MS检测器中分离采集的数据。电喷雾电压以-3eV运转成以正离子方式采集的质谱仪数据。在Q2中使用氩气，应用20-30eV的碰撞能量和～-5×10-5托的彭宁压力进行碰撞诱导解离(CID)研究。在整个分析过程中通过转位的Lockspray使用内锁质量(奎尼定，m/z 325.1916)，使得每隔5秒向质谱仪内导入一次校准(calibrant)。

代谢物M22：(3-{[[4-(1，2-二羟基-1-甲基-乙基)-苄基]-(吡啶-3-磺酰基)- 氨基)-甲基)-苯氧基)-乙酸

代谢物M22在HPLC上具有的保留时间为14分钟且在m/z 487处具有质子化分子离子(高于母体化合物18amu)。代谢物M2的CID产物离子光谱在m/z 469、451、423、395、335、326、165和147处显示了主碎片离子(图14)。在m/z 165处的离子与在母体药物中观察到的类似，从而提示苯氧基乙酸部分没有改变。在m/z 469和451处的离子连续从质子化分子离子中失去了两个18amu，从而提示已经失去了两个分子的水。实验式信息获自高分辨质谱(Q-Tof)提示的实验式C₂₄H₂₇N₂O₇S。基于这些数据和支持的LC-NMR数据，将M22鉴定为(3-{[[4-(1，2-二羟基-1-甲基-乙基)-苄基]-(吡啶-3-磺酰基)-氨基]-甲基}-苯氧基)-乙酸。

代谢物M23：(3-{[[4-(1-羟基-1-甲基-乙基)-苄基]-(吡啶-3-磺酰基)-氨基]- 甲基)-苯氧基)-乙酸

代谢物M23在HPLC上具有的保留时间约为16.9且在m/z 471处具有质子化分子离子(高于母体化合物2amu)。代谢物M23的CID产物离子光谱在m/z 453、335、310、165和131处显示了主碎片离子(图15)。在m/z 165处的离子与在母体药物中观察到的类似，从而提示苯氧基乙酸部分没有改变。在m/z 453处的离子从质子化分子离子中失去了18amu，从而提示已经失去了一个水分子。在m/z 310和131处的离子(低于在母体化合物中观察到的离子16amu)提示甲基被水分子取代，然后在碎裂过程中失去。基于这些数据和支持的LC-NMR数据，将M23鉴定为(3-{[[4-(1-羟基-1-甲基-乙基)-苄基]-(吡啶-3-磺酰基)-氨基]-甲基}-苯氧基)-乙酸。

代谢物M24：(3-{[[4-{1-二甲基-2-氧代-乙基)-苄基]-(吡啶-3-磺酰基)-氨基]-甲基}-苯氧基)-乙酸

代谢物M24在HPLC上具有的保留时间约为18.6分钟且在m/z 483处具有质子化分子离子(低于母体化合物14amu)。代谢物M24的CID产物离子光谱在m/z 483、437、409、340、165和161处显示了主碎片离子(图16)。在m/z 423、340和161处的离子均高于在母体药物光谱中观察的离子14amu，从而提示加入了氧原子与失去了两个氢原子的污染物。对该代谢物获得的高分辨质谱得到483.1590的分子量和C₂₅H₂₇N₂O₆S的实验式。基于这些数据和支持的LC-NMR数据，将M24鉴定为(3-{[[4-(1，1-二甲基-2-氧代-乙基)-苄基]-(吡啶-3-磺酰基)-氨基)-甲基}-苯氧基)-乙酸。

代谢物M26：(3-{[(4-异丙烯基-苄基)-(吡啶-3-磺酰基)-氨基]-甲基}-苯氧基)-乙酸

代谢物M26在HPLC上具有的保留时间为22分钟且在m/z 453处具有质子化分子离子(低于母体化合物16amu)。CID产物离子光谱在m/z453、407、310、165和131处显示了主碎片离子(图17)。在m/z 165处的离子与在母体化合物中观察到的离子类似，从而提示苯氧基乙酸部分没有改变。在407、310和131处的离子均低于在母体化合物光谱中观察到的离子16amu，从而提示从叔丁基部分上失去了16个质量单位。对该代谢物获得的高分辨质谱得到453.1487的分子量和C₂₄H₂₅N₂O₅S的实验式。对该代谢物的这些数据与LC-NMR的组合与形成作为(3-{[(4-异丙烯基-苄基)-(吡啶-3-磺酰基)-氨基]-甲基}-苯氧基)-乙酸的末端烯烃基一致。

合成方案

下列制备方法涉及用于合成实施例1和2化合物中所用中间体的合成。

制备1

{3-[(吡啶-3-磺酰氨基)-甲基]-苯氧基}-乙酸叔丁酯

步骤A

(3-甲酰基-苯氧基)-乙酸叔丁酯

向3-羟基苯甲醛(5.00g，40.9mmol)溶于DMF(40mL)所得到的溶液中加入1M叔丁醇钾的叔丁醇(40.9mL，40.9mmol)溶液。将该反应体系搅拌2分钟并加入溴乙酸叔丁酯(6.61mL，40.9mmol)。将该反应体系搅拌1小时并用200mL水抑制。将产物提取入EtOAc并用水洗涤有机溶液、用MgSO₄干燥、过滤并在真空中浓缩。通过硅胶快速色谱法纯化(9∶1己烷∶EtOAc)得到标题化合物，为澄清油状物(3.53g).¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ9.94(s，1H)，7.48(m，2H)，7.32(s，1H)，7.21(m，1H)，4.56(s，2H)，1.45(s，9H)。

步骤B

[3-(羟基亚氨基-甲基)-苯氧基]-乙酸叔丁酯

向(3-甲酰基-苯氧基)-乙酸叔丁酯(2.05g，8.68mmol)溶于MeOH(30mL)所得到的溶液中加入NH₂OH·HCl(0.66g，9.54mmol)和吡啶(3.5mL，43.4mmol)并将该反应体系搅拌2小时。在真空中除去MeOH并用EtOAc和1NHCl稀释残余物。分离各层并用EtOAc洗涤水溶液。用MgSO₄干燥合并的有机层、过滤并在真空中浓缩而得到标题化合物(1.99g)。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ8.07(s，1H)，7.23-7.28(m，2H)，7.12(m，1H)，6.93(d，1H)，4.51(s，2H)，1.46(s，9H)。

步骤C

(3-氨基甲基-苯氧基)-乙酸叔丁酯

向[3-(羟基亚氨基-甲基)-苯氧基]-乙酸叔丁酯(2.25g，5.96mmol)溶于EtOH(10mL)所得到的溶液中加入100mL乙醇中的阮内镍(约1g，用水、随后用EtOH洗涤的)。需要再加入EtOH(90mL)用于转移。加入氢氧化铵(10mL)并将该混合物在45psi的H₂中振摇4小时。通过经Celite^(硅藻土)过滤除去催化剂并将该溶液浓缩至得到澄清油状物。通过硅胶快速色谱法纯化(96.5/3.5/0.1-9/1/0.1CH₂Cl₂/MeOH/NH₄OH)得到标题化合物，为黄色油状物。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.23(m，1H)，6.92(m，2H)，6.72(d，1H)，4.50(s，2H)，3.82(s，2H)，1.96(m，2H)，1.46(s，9H)；MS 238(M+1)。

步骤D

{3-[(吡啶-3-磺酰氨基)-甲基]-苯氧基}-乙酸叔丁酯

在0℃下向(3-氨基甲基-苯氧基)-乙酸叔丁酯(296mg，1.25mmol)溶于CH₂Cl₂所得到的溶液中加入吡啶-3-磺酰氯盐酸盐(279mg，1.31mmol)，随后加入Et₃N(0.36mL，2.6mmol)。将该反应体系在室温下搅拌24小时并用1∶1的水溶液与饱和NaHCO₃水溶液抑制。用CH₂Cl₂(3x)洗涤该水溶液。将合并的有机溶液干燥(MgSO₄)、过滤并浓缩。进行中压色谱分离(1∶1己烷∶EtOAc)得到标题化合物，为白色固体(369.5mg)。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ9.04(s，1H)，8.75(m，1H)，8.09(d，1H)，7.44(m，1H)，7.15(m，1H)，6.76(m，3H)，5.23(bs，1H)，4.44(s，2H)，4.16(d，2H)，1.47(s，9H)；MS 379(M+1)。

制备2

2-(4-溴甲基-苯基)-2-甲基-丙酸乙酯

步骤A

2-甲基-2-对甲苯基-丙酸乙酯

用DMF洗涤NaH(60％重量的油分散体，3.9g，98.2mmol)并加入新鲜的DMF(175mL)。将该混合物冷却至0℃并加入Mel(6.1mL，98.2mmol)，随后加入对甲苯基乙酸乙酯(5.0g，28.05mmol)溶于DMF(15mL)所得到的溶液。将该反应体系在室温下搅拌48小时。加入水并用EtOAc(3x)洗涤该水溶液。用水(4x)和饱和NaHCO₃水溶液(1x)洗涤合并的有机溶液。将该有机溶液干燥(MgSO₄)、过滤并浓缩。进行中压色谱分离(95∶5己烷∶EtOAc)得到2-甲基-2-对甲苯基-丙酸乙酯(1.2g)。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.21(d，2H)，7.11(d，2H)，4.10(q，2H)，2.31(s，3H)，1.54(s，6H)，1.17(t，3H)。

步骤B

2-(4-溴甲基-苯基)-2-甲基-丙酸乙酯

向2-甲基-2-对甲苯基-丙酸乙酯(263mg，1.27mmol)和N-溴琥珀酰亚胺(272mg，1.53mmol)溶于CCl₄(15mL)所得到的溶液中加入1，1′-偶氮双(环己腈)(15.5mg，0.06mmol)。将该反应体系在回流状态下加热1小时并用水和CH₂Cl₂稀释。分离各层并用CH₂Cl₂(3x)洗涤水层。将合并的有机层干燥(MgSO₄)、过滤并浓缩。进行中压色谱分离(95∶5己烷∶EtOAc)得到2-(4-溴甲基-苯基)-2-甲基-丙酸乙酯(354mg)。¹HNMR(400MHz，CDCl₃)δ7.31(m，4H)，4.47(s，2H)，4.10(q，2H)，1.54(s，6H)，1.17(t，3H)。

制备3

[2-(4-溴甲基-苯基)-2-甲基-丙氧基]-叔丁基-二甲基-硅烷

步骤A

2-甲基-2-对甲苯基-丙-1-醇

在0℃下向2-甲基-2-对甲苯基-丙酸乙酯(510mg，2.47mmol)溶于THF(10mL)所得到的溶液中加入氢化铝锂(1M的Et₂O溶液，2.6mL，2.6mmol)。将该反应体系搅拌0.5小时并通过依次加入水(0.1mL)、15％ NaOH(0.1mL)和水(0.3mL)使反应被抑制。用EtOAc稀释该反应体系、干燥(MgSO₄)、过滤并浓缩得到2-甲基-2-对甲苯基-丙-1-醇(405mg)。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.27(d，2H)，7.15(d，2H)，3.58(s，2H)，2.32(s，3H)，1.31(s，6H)；MS 165(M+1)。

步骤B

叔丁基-二甲基-(2-甲基-2-对甲苯基-丙氧基)-硅烷

向2-甲基-2-对甲苯基-丙-1-醇(405mg，2.46mmol)溶于DMF(5mL)所得到的溶液中加入咪唑(335mg，4.92mmol)，随后加入叔丁基二甲基甲硅烷基氯(465mg，3.08mmol)。将该反应体系搅拌24小时并加入水。用EtOAc(3x)洗涤该水溶液。用水(4x)洗涤合并的有机溶液。将该有机溶液干燥(MgSO₄)、过滤并浓缩。进行中压色谱分离(己烷)得到叔丁基-二甲基-(2-甲基-2-对甲苯基-丙氧基)-硅烷(619mg)。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.26(d，2H)，7.10(d，2H)，3.49(s，2H)，2.31(s，3H)，1.27(s，6H)，0.85(s，9H)，-0.06(s，6H)。

步骤C

[2-(4-溴甲基-苯基)-2-甲基-丙氧基]-叔丁基-二甲基-硅烷

按照制备2步骤B中所述的方法，使用叔丁基-二甲基-(2-甲基-2-对甲苯基-丙氧基)-硅烷(398mg，1.42mmol)作为原料制备标题化合物。反应时间为24小时且通过中压色谱法纯化该化合物，将己烷用作洗脱剂。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.31(m，4H)，4.46(s，2H)，3.48(s，2H)，1.26(s，6H)，0.81(s，9H)，-0.10(s，6H)。

实施例1

2-(4-{[(3-羧基甲氧基-苄基)-(吡啶-3-磺酰基)-氨基]-甲基}-苯基)-2-甲基- 丙酸

步骤A

2-(4-{[(3-叔丁氧羰基甲氧基-苄基)-(吡啶-3-磺酰基)-氨基]-甲基}-苯基)-2-甲基-丙酸乙酯

用DMF(5mL)洗涤NaH(60％重量的油分散体，23mg，0.55mmol)并加入新鲜的DMF。将该反应体系冷却至0℃并加入{3-[(吡啶-3-磺酰氨基)-甲基]-苯氧基}-乙酸叔丁酯(184mg，0.486mmol)溶于DMF(1mL)所得到的溶液。将该反应体系搅拌1小时并加入2-(4-溴甲基-苯基)-2-甲基-丙酸乙酯(145mg，0.51mmol)的DMF(1mL)溶液。将该反应体系加热至室温并在100℃下加热2小时。加入水并用EtOAc(3x)洗涤该水溶液。用水(5x)洗涤合并的有机溶液、干燥(MgSO₄)、过滤并浓缩。进行中压色谱分离(2∶1己烷∶EtOAc)得到2-(4-{[(3-叔丁氧羰基甲氧基-苄基)-(吡啶-3-磺酰基)-氨基]-甲基}-苯基)-2-甲基-丙酸乙酯(138mg)。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ9.01(s，1H)，8.76(m，1H)，7.97(m，1H)，7.40(m，1H)，7.19(d，2H)，7.13(m，1H)，7.02(d，2H)，6.76(m，1H)，6.67(m，2H)，4.41(s，2H)，4.33(s，4H)，4.10(q，2H)，1.52(s，6H)，1.49(s，9H)，1.17(t，3H)。

步骤B

2-(4-{[3-羧基甲氧基-苄基)-(吡啶-3-磺酰基)-氨基]-甲基}-苯基)-2-甲基- 丙酸乙酯

向2-(4-{[(3-叔丁氧羰基甲氧基-苄基)-(吡啶-3-磺酰基)-氨基]-甲基}-苯基)-2-甲基-丙酸乙酯(138mg，0.237mmol)溶于MeOH(5mL)所得到的溶液中加入NaOH水溶液(2N，0.36mL，0.72mmol)。将该反应体系在100℃下加热1小时并冷却至室温。在真空中浓缩该反应体系并用水和EtOAc稀释。用1NHCl将pH调节至约5。用EtOAc(3x)洗涤该水溶液。将合并的有机溶液干燥(MgSO₄)、过滤并浓缩。向水溶液中加入氯化钠并用EtOAc(3x)洗涤该溶液。将合并的有机溶液干燥(MgSO₄)、过滤并浓缩。将合并的标题化合物(104mg)不经进一步纯化而用于下一步。MS 527(M+1)。

步骤C

向2-(4-{[(3-羧基甲氧基-苄基)-(吡啶-3-磺酰基)-氨基]-甲基}-苯基)-2-甲基-丙酸乙酯(83mg，0.157mmol)溶于THF(10mL)所得到的溶液中加入水(1mL)和LiOH·H₂O(66mg，1.58mmol)。将该反应体系在回流状态下加热24小时。再加入LiOH·H₂O(66mg，1.58mmol)的水(2mL)溶液并将该反应体系在回流状态下加热30小时。在真空中浓缩该混合物并向残余物中加入THF(3mL)和水(1.5mL)。将该反应体系在回流状态下加热24小时并冷却至室温。用水稀释该溶液并通过添加1N HCl将pH调节至约5。加入氯化钠并用EtOAc(3x)洗涤该水溶液。将合并的有机溶液干燥(MgSO₄)、过滤并浓缩至得到标题化合物(74mg)。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ8.94(s，1H)，8.73(s，1H)，8.13(d，1H)，7.55(m，1H)，7.23(d，2H)，7.11(m，3H)，6.78(d，1H)，6.73(d，1H)，6.68(s，1H)，4.90(s，2H)，4.39(s，2H)，3.30(s，2H)，1.50(s，6H)；MS 497(M-1)。

实施例2

(3-{[[4-(2-羟基-1，1-二甲基-乙基)-苄基]-(吡啶-3-磺酰基)-氨基]-甲基}-苯氧基)-乙酸

步骤A

(3-{[{4-[2-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-1，1-二甲基-乙基]-苄基}-(吡啶-3- 磺酰基)-氨基]-甲基}-苯氧基)-乙酸叔丁酯

按照实施例1步骤A中所述的方法通过用[2-(4-溴甲基-苯基)-2-甲基-丙氧基]-叔丁基-二甲基-硅烷(121mg，0.339mmol)使{3-[(吡啶-3-磺酰氨基)-甲基]-苯氧基}-乙酸叔丁酯(122mg，0.322mmol)烷基化来制备标题化合物。反应时间为1小时。将粗产物(238mg)不经纯化而用于下一步。MS 655(M+1)。

步骤B

(3-{[[4-(2-羟基-1，1-二甲基-乙基)-苄基]-(吡啶-3-磺酰基)-氨基]-甲基}-苯氧基)-乙酸叔丁酯

向(3-{[{4-[2-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-1，1-二甲基-乙基]-苄基}-(吡啶-3-磺酰基)-氨基}-甲基)-苯氧基)-乙酸叔丁酯(210mg，0.321mmol)溶于THF(2mL)所得到的溶液中加入氟化四丁基铵(1mM的THF溶液，0.34mL，0.34mmol)。将该反应体系在回流状态下加热24小时并再加入氟化四丁基铵(1mM的THF溶液，0.34mL，0.34mmol)。将该反应体系在回流状态下加热24小时并再加入氟化四丁基铵(1mM的THF溶液，0.34mL，0.34mmol)。将该反应体系加热45分钟并冷却至室温。加入水和CH₂Cl₂并分离各层。用CH₂Cl₂(3x)洗涤该水溶液。将合并的有机层干燥(MgSO₄)、过滤并浓缩。进行中压色谱分离(1∶1己烷∶EtOAc-3∶2己烷∶EtOAc)而得到(3-{[[4-(2-羟基-1，1-二甲基-乙基)-苄基]-(吡啶-3-磺酰基)-氨基]-甲基}-苯氧基)-乙酸叔丁酯(108mg)。MS 541(M+1)。

步骤C

将(3-{[[4-(2-羟基-1，1-二甲基-乙基)-苄基]-(吡啶-3-磺酰基)-氨基]-甲基}-苯氧基)-乙酸叔丁酯(108mg，0.199mmol)溶于CH₂Cl₂(2mL)所得到的溶液冷却至0℃并加入三氟乙酸(1mL)。将该反应体系在室温下搅拌1小时。在真空中通过与CH₂Cl₂(3x)共沸浓缩该溶液。将残余物溶于THF并加入1NHCl(0.4mL)。在真空中通过与CH₂Cl₂(3x)共沸浓缩该溶液。通过使用溶剂梯度(CH₂Cl₂-20％MeOH的CH₂Cl₂溶液)的径向色谱法纯化而得到标题化合物(34mg)。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ8.79(s，1H)，8.69(s，1H)，8.11(d，1H)，7.52(m，1H)，7.21(d，2H)，7.09(m，1H)，7.02(d，2H)，6.76(d，1H)，6.70(m，2H)，4.86(s，2H)，4.32(m，4H)，3.48(s，2H)，1.22(s，6H)；MS 485.2(M+1)，483.4(M-1)。

用Varian Unity 400分光计(VarianCo.，Palo Alto，California)在约23℃下和400 MHz处对质子核记录MR波谱。用百万分之几表示化学位移。表示峰形如下：s，单峰；d，双峰；t，三重峰；q，四重峰；m，多重峰；bs，宽单峰。用FisonsPlatform II分光计(MicromassInc.，Beverly，Massachusetts)获得大气压化学电离(APCI)质谱。在描述含氯或溴的离子的强度时，观察到了预计的强度比例(对含³⁵Cl/³⁷Cl的离子而言约为3∶1，而对含⁷⁹Br/⁸¹Br-的离子而言为1∶1)且得到了唯一的低质量离子的强度。

使用Biotage纯化系统(Biotage，Dyax Corporation，Charlottesville，Virginia)在氮气压力下进行中压色谱分离。使用Baker Silica Gel(40μm)(J.T.Baker，Phillipsburg，N.J.)或Silica Gel 60(EM Sciences，Gibbstown，N.J.)在低氮气压力的玻璃柱上进行快速色谱分离。使用Chromatotron(7924T型，Harrison Research，Palo Alto，California)进行径向色谱分离。用作反应溶剂的二甲基甲酰胺(DMF)、四氢呋喃(THF)和二氯甲烷(CH₂Cl₂)是由AldrichChemical Company(Milwaukee，Wisconsin)提供的无水级。术语“浓缩”指的是在水的吸气压力下在旋转蒸发器上除去溶剂。术语“EtOAc”指的是乙酸乙酯。术语“二氯甲烷”和“亚甲基氯”同义且在本说明书的上下文和实施例以及制备部分中可以互换使用。

大鼠EP₂受体结合试验

前列腺素E₂受体结合试验

按照Nemoto等在Prostaglandins and other Lipid Mediators，1997，54，713-725中所公开的方法制备全长EP₂受体。将这种全长受体用于制备表达EP₂受体的293S细胞。

按照本领域技术人员所公知的方法制备表达大鼠EP₂前列腺素E₂受体的293S细胞。一般来说，按照上述公开的众所周知的方法制备相当于公布的全长受体的5′和3′端的PCR(聚合酶链反应)引物并将其用于使用来自大鼠肾作为来源的总RNA的RT-PCR反应。通过TA突出端法将PCR产物克隆入pCR2.1(Invitrogen，Carlsbad，CA)并通过DNA测序证实所克隆受体的同一性。为了进行表达，将证实的cDNA亚克隆入哺乳动物表达载体PURpCI，它是一种通过将嘌呤霉素抗性的选择标记亚克隆入哺乳动物表达载体pCl(Promega，Madison，WI)而产生的载体。

用在PURpCi中克隆的受体、通过脂类介导的转染来转染293S细胞。通过用嘌呤霉素筛选转染的细胞而建立表达所述受体稳定细胞系。

通过完整细胞³H-PGE₂结合试验、使用未标记的PGE₂作为竞争剂来选择表达最大数量受体的克隆细胞系。

膜的制备：全部操作均在4℃下进行。收集表达2型前列腺素E₂(EP₂)受体的转染细胞并将其在缓冲液A[50mM Tris-HCI(pH7.4)，10mM MgCl₂、1mM EDTA、1mM Pefabloc肽(Boehringer Mannheim Corp.，Indianapolis，IN)、10uM Phosporamidon肽(Sigma，St.Louis，MO)、1uM异胃酶肽A(Sigma，St.Louis，MO)、10uM弹性酶抑制剂肽(Sigma，St.Louis，MO)、100uM抗蛋白酶肽(Sigma，St.Louis，MO)]中悬浮至2百万个细胞/ml。通过用BransonSonifier(Branson Ultrasonics Corporation，Danbury，CT)以2次15秒冲击进行超声处理来裂解细胞。通过以100xg离心10分钟除去未裂解的细胞和碎片。然后通过以45,000xg离心30分钟收集膜。将沉淀的膜重新悬浮至3-10mg蛋白/ml，即按照Bradford的方法[Bradford，M.，Anal.Biochem.，72,248(1976)]测定的蛋白质浓度。随后将重新悬浮的膜冷冻在-80℃下至使用为止。

结合试验：使如上所述制备的冷冻的膜融化并用上述缓冲液A稀释至1mg蛋白/ml。将1个体积的膜制品与0.05个体积的测试化合物或缓冲液和1个体积的3nM ³H-前列腺素E₂(Amersham，Arlington Heights，IL)在缓冲液A中混合。将该混合物(205μL总体积)在25℃下培养1小时。然后经GF/C型玻璃纤维滤膜(Wallac，Gaithersburg，MD)过滤、使用Tomtec收集器(Tomtec，Orange，CT)回收膜。用所述滤膜俘获含有结合的³H-前列腺素E₂的膜，而使缓冲液与未结合的³H-前列腺素E₂通过滤膜成为废物。然后用3ml[50mMTris-HCl(pH7.4)、10mM MgCl₂、1mM EDTA]将每份样品洗涤3次。随后通过用微波炉加热干燥滤膜。为了测定与膜结合的³H-前列腺素的量，将干燥的滤膜放入含有闪烁液的塑料袋并用LKB 1205β平板读出器(Wallac，Gaithersburg，MD)计数。根据显示出50％³H-前列腺素E₂特异性结合所需的测试化合物浓度确定IC₅₀。

实施例1的大鼠EP₂结合IC₅₀＝750nM

实施例2的大鼠EP₂结合IC₅₀＝170nM

在本文中使用下列缩写：

I.V. 静脉内

HPLC 高效液相色谱法

CPM 每分钟计数

min 分钟

MS 质谱法

CID 碰撞诱导解离

AMU 原子质量单位

FBS 胎牛血清

LC 液相色谱法

DMF 二甲基甲酰胺

EtOAc 乙酸乙酯

MeOH 甲醇

NMR 核磁共振

Et₃N 三乙胺

THF 四氢呋喃

H 小时数

Claims

1.化合物2-(4-{[(3-羧基甲氧基-苄基)-(吡啶-3-磺酰基)-氨基]-甲基}-苯基)-2-甲基-丙酸或其药物上可接受的盐。

2.化合物(3-{[[4-(2-羟基-1，1-二甲基-乙基)-苄基]-(吡啶-3-磺酰基)-氨基]-甲基}-苯氧基)-乙酸或其药物上可接受的盐。

3.化合物(3-{[(4-叔丁基-苄基)-(吡啶-N-氧化物-3-磺酰基)-氨基]-甲基}-苯氧基)-乙酸或其药物上可接受的盐。

4.化合物(5-{[(4-叔丁基-苄基)-(吡啶-3-磺酰基)-氨基]-甲基}-羟基-苯氧基)-乙酸或其药物上可接受的盐。

5.下列化合物或其药物上可接受的盐：

2-{4-[吡啶-N-氧化物-3-磺酰氨基)-甲基]-苯基}-2-甲基-丙酸；

2-甲基-2-{4-[(吡啶-3-磺酰氨基)-甲基]-苯基}-丙酸；

6.患者是否被给药(3-{[4-叔丁基-苄基)-(吡啶-3-磺酰基)-氨基]-甲基}-苯氧基)-乙酸的测定方法，该方法包括测定获自所述患者的血浆、尿、胆汁或粪便样品中是否显示存在一种或多种选自下列化合物组成的组的化合物的步骤：

2-{4-[吡啶-N-氧化物-3-磺酰氨基)-甲基]-苯基}-2-甲基-丙酸；

2-甲基-2-{4-[(吡啶-3-磺酰氨基)-甲基]-苯基}-丙酸；

7.治疗骨质疏松症或辅助骨折愈合的方法，该方法包括根据患者需要对其给药治疗有效量的化合物或其药物上可接受的盐，所述的化合物选自：

8.药物组合物，包括一种或多种化合物或其药物上可接受的盐，所述的化合物选自：

2-{4-[吡啶-N-氧化物-3-磺酰氨基]-甲基}-苯基}-2-甲基-丙酸；

2-甲基-2-{4-[(吡啶-3-磺酰氨基)-甲基]-苯基}-丙酸；