CN102268067A

CN102268067A - 一种含ldv序列短肽的聚乙二醇化衍生物

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Publication number: CN102268067A
Application number: CN2011101808977A
Authority: CN
Inventors: 赵铁华; 朱鸣阳; 史子惠; 甄晓兰
Original assignee: Hebei Normal University
Current assignee: Hebei Normal University
Priority date: 2011-06-29
Filing date: 2011-06-29
Publication date: 2011-12-07

Abstract

本发明公开了一种含LDV序列短肽的聚乙二醇化衍生物，其制备方法，含它们的组合物。本发明的含LDV序列短肽的聚乙二醇化衍生物由含LDV序列短肽和与含LDV序列短肽C端共价连接的聚乙二醇组成，其中含LDV序列短肽具有下式结构：X-Y₁-Ile-Leu-Asp-Val-Y₂-Y₃-Z或X-Leu-Asp-Val-Y₃-Z以上结构中，X是H或Ac；Y₁是Lys或Glu；Y₂是Pro或Ala；Y₃是Cys或高Cys或Lys或Arg或His，是PEG修饰的残基；Z是OH或NH₂。本发明给出的含LDV序列短肽的聚乙二醇化衍生物可用于制备防治慢性炎症和自身免疫性疾病的药物或药物的前体化合物。

Description

一种含LDV序列短肽的聚乙二醇化衍生物

技术领域

本发明涉及一种含阻断FN及VCAM-1等配体与整合蛋白α4β1结合的关键序列LDV短肽的聚乙二醇化衍生物，属于医药技术领域。

背景技术

整合蛋白α4β1主要表达在淋巴细胞、嗜酸性粒细胞等炎症细胞表面，其与配体纤维粘连蛋白(FN)、血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)的相互作用是炎症启动和发展过程中的关键步骤，在许多慢性炎症和自身免疫性疾病如哮喘、类风湿性关节炎、多发性硬化症、炎性肠道疾病中发挥重要作用。干扰整合蛋白α4β1与配体的结合可达到治疗许多慢性炎症和自身免疫性疾病的目的。

LDV(Leu-Asp-Val)是FN、VCAM-1与整合蛋白α4β1结合的关键序列，近年来整合蛋白α4β1的肽类拮抗剂研究较多以LDV序列为基础进行。但是，与其它肽类药物的性质相似，目前已经合成的众多整合蛋白α4β1拮抗肽由于分子量小，易被清除和酶解破坏，其体内代谢时间很短，较大的治疗剂量和频繁、较短的给药时间间隔可能成为其应用的重要障碍。

利用聚乙二醇(Polyethlene glycol，PEG)修饰可以增加蛋白质和多肽药物的稳定性、延长血浆半衰期、增加生物利用度等性能，我们进行了LDV及其相关肽的PEG修饰研究工作。研究提示，对于基于配体序列设计合成的LDV及其衍生的整合蛋白α4β1拮抗肽，由于能够部分解释整合素-配体相互作用的结构特征，因此其PEG修饰是可行的，甚至对提高药物生物利用度、降低给药剂量和延长给药间隔时间前景乐观。

2004年，Pepinsky RB等报告了PEG修饰LDV衍生物BOI5192及其构效关系分析的研究结果(Aspetournals，2005，2：742-750)。研究表明，修饰产物血浆半衰期明显增加(修饰前后分别为1.1h和17.9h)、清除率显著降低(修饰前后分别为426ml/h/kg和6.2ml/h/kg)。未经修饰的BOI5192在S.C途径给药时对EAE模型的实验治疗有效剂量高达30mg/kg，而BIO5192的PEG修饰产物剂量降低至每周1mg/kg仍可维持锁定整合蛋白α4β1功能的水平。PepinskyRB等的研究验证了对LDV及其衍生的整合蛋白α4β1拮抗肽进行PEG修饰的可行性。

分析蛋白类药物PEG修饰的既往研究资料，对同一被修饰对象，PEG修饰位点、共价连接PEG的数量及PEG的种类，都可能对修饰产物活性产生较大影响。并且，在被修饰物和PEG之间，PEG分子量越大，可能引起修饰产物的活性下降越多，被修饰物分子量越小则其活性部位被屏蔽的可能性越大。

根据以上分析，适当分子量PEG及种类的选择是保证有效延长被修饰物半衰期，增加被修饰物生物活性，同时避免被修饰物活性部位被较多屏蔽的首要因素。另一方面，Pepinsky RB等以LDV衍生物氨基基团作为修饰位点的PEG修饰方案仍存在反应条件不易控制，以及影响修饰产物产率及纯度、增加合成(生产)成本等不利因素。

发明内容

本发明的目的是提供一种含LDV序列短肽的聚乙二醇化衍生物，为科学研究和临床治疗提供一种新的结构简单，合成反应条件温和、简便、可控的药物分子或前体化合物，也为肽类药物的改造和聚乙二醇化修饰研究提供新的方法和思路。

本发明的技术解决方案是：对采用化学合成和基因重组方法制备的含LDV序列短肽进行C末端的聚乙二醇定点修饰，获得具有较长体内半衰期和良好抗炎免疫药理活性的含LDV序列短肽的聚乙二醇化衍生物。

本发明的含LDV序列短肽的聚乙二醇化衍生物由含LDV序列短肽和与含LDV序列短肽共价连接的聚乙二醇组成，其中的含LDV序列短肽具有下式结构：

X-Y₁-Ile-Leu-Asp-Val-Y₂-Y₃-Z或X-Leu-Asp-Val-Y₃-Z

其中，X是H或Ac；Y₁是Lys或Glu；Y₂是Pro或Ala；Y₃是Cys或高Cys或Lys或Arg或His，是PEG修饰的残基；Z是OH或NH₂。

本发明所说的含LDV序列短肽的聚乙二醇化衍生物的制备方法，包括以下步骤：

用化学合成方法或基因工程方法制备供修饰的前体含LDV序列短肽；前体含LDV序列短肽C端与聚乙二醇进行共价连接。

本发明中的含LDV序列短肽的制备方法可使用本领域公知的任何方法进行制备，此制备方法优选为固相和液相化学合成法。固相方法包括使用Fmoc或Boc保护的氨基酸，用多肽合成仪或手工合成法进行氨基酸序列的合成，再经切除，经高效液相(HPLC)分离纯化，冻干，所得肽段为进行聚乙二醇修饰的中间体前体。

本发明中的含LDV序列短肽也可用基因工程法制备，包括以下步骤：

(1)按含LDV序列短肽的氨基酸序列合成基因片段。

(2)基因片段经连接，转化，筛选得到阳性菌株。

(3)菌株经发酵，收集菌体，破壁，抽提得到包涵体。

(4)包涵体裂解，分离得到粗品，经HPLC分离纯化，冻干，所得肽段为进行聚乙二醇修饰的中间体前体。

本发明的含LDV序列短肽的聚乙二醇化衍生物，该聚乙二醇在含LDV序列短肽的C端进行修饰，其特点是含LDV序列短肽的C端可以连接在聚乙二醇的一个末端或其两个末端。聚乙二醇的分子量范围为2000Da-80000Da，优选为5000Da-40000Da。

本发明的含LDV序列短肽的聚乙二醇化衍生物的制备方法包括以下步骤：

(1)制备或获得含迈克尔加成反应(Michael addition reaction)受体的聚乙二醇与含迈克尔加成反应给体的含LDV序列短肽；或含迈克尔加成反应给体的聚乙二醇与含迈克尔加成反应受体的含LDV序列短肽。

(2)进行迈克尔加成反应，用其受体或给体的聚乙二醇和含LDV序列短肽进行反应，形成含LDV序列短肽的聚乙二醇化衍生物，如含马来酰亚胺衍生的聚乙二醇与含半胱氨酸的含LDV序列短肽反应而形成产品。

如果如本发明所述含LDV序列短肽结构中Y₃是Cys或高Cys，则聚乙二醇是用硫醚键或双硫键共价结合；如果Y₃是Lys，则聚乙二醇是用酰胺键或二级胺而共价结合；如果Y₃是His，则聚乙二醇是用组氨酸的咪唑环而共价结合；如果Y₃是Arg，则聚乙二醇是通过杂环而连接的。

本发明的化合物是含LDV序列短肽的聚乙二醇化衍生物，亦包括为进行聚乙二醇修饰而产生的新的中间体，是用于制备防治慢性炎症或自身免疫病的药物或药物的前体化合物。

药代学研究证实，较大分子量mPEG修饰含LDV序列短肽较原型(前体)含LDV序列短肽血浆半衰期和相对生物利用度明显增高。mPEG修饰含LDV序列短肽对豚鼠和小鼠的实验性哮喘及其支气管EOS的浸润和渗出，对哮喘小鼠血清和BALF中Eotaxin水平、肺组织Eotaxin、CCR3蛋白及其mRNA的表达、病理组织学检查的炎症表现表现了较强的拮抗作用。在含LDV序列短肽等摩尔浓度剂量下，以及修饰物含原型含LDV序列短肽分别为1/9.74和1/4.12时药效优于其原型(前体化合物)。修饰用mPEG分子量较大时产物活性较强。实验肯定了PEG修饰后产物相对生物利用度的增加，证明LDV类肽的PEG修饰达到了预期充分暴露配体结合部位、保留原化合物药理活性的合成目的。

本发明取得了以下技术进步：

与未经聚乙二醇修饰的含LDV序列短肽前体比较，适当分子量的聚乙二醇修饰提高了含LDV序列短肽前体的体内半衰期和抗炎免疫药理活性。

不同PEG修饰方法研究发现，与例如Pepinsky RB等进行的LDV衍生物BOI5192的氨基修饰，以及其他不确定位点的聚乙二醇修饰技术(含氨基、羧基和巯基修饰)比较，本发明所提供的在C端巯基修饰的含LDV序列短肽的聚乙二醇衍生物，反应条件便于控制，合成修饰产物产率和纯度较高。如本发明提供的优选实施例中，在被修饰的含LDV序列短肽EILDVP的C端加入带巯基的Cys，采用Rink树脂合成后，用活化的mPEG-MAL进行巯基修饰，与N端氨基修饰比较，反应条件便于控制，合成修饰产物产率和纯度较高。并且本发明所提供的在C端的定点修饰，可克服不确定位点聚乙二醇修饰可能屏蔽前体化合物、尤其是分子量较小的肽类化合物活性部位的缺点。

附图说明

图1是药代动力学实验A组：EILDVPY-¹²⁵I的r值-浓度标准曲线。

图2是药代动力学实验B组：EILDVP-Cys-(mPEG₂₀₀₀-MAL)-Y-¹²⁵I的r值-浓度标准曲线。

图3是药代动力学实验C组：EILDVP-Cys-(mPEG₂₀₀₀₀-MAL)-Y-¹²⁵I的r值-浓度标准曲线。

具体实施方式

除非特殊指明，本发明所用到但未明确阐述或简单阐述的技术和方法是指本技术领域通常使用的技术和方法，可以一般的按照本领域公知的技术和方法进行。

除非特殊定义，本发明所用的术语是在有关技术领域中公知的术语。标准的化学符号及缩写符号可以与其全名互换使用。

除非特殊指明，本发明中所用氨基酸为L-氨基酸。

本发明中的缩写词具有下面的含义：

α4β1：粘附分子整合素超家族成员，是α4(155kDa)和β1(150kDa)亚单位的非共价异源二聚体，主要表达在淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞等炎症细胞表面。

FN：纤维粘连蛋白

VCAM-1：血管细胞粘附分子-1

LDV：为NF、VCAM-1等配体与整合蛋白α4β1结合的关键序列，氨基酸序列为：Leu-Asp-Val

EILDVP：含LDV序列的被修饰原型肽，为整合蛋白α4β1识别FN的CS1区的基本序列，氨基酸序列为：Glu-Ile-Leu-Asp-Val-Pro

PEG：聚乙二醇

mPEG：单甲氧基聚乙二醇

PEG-MAL：马来酰亚胺基聚乙二醇

Val：缬氨酸

Tyr：酪氨酸

Leu：亮氨酸

Ile：异亮氨酸

Pro：脯氨酸

Cys：半胱氨酸

Glu：谷氨酸

Asp：天冬氨酸

Lys：赖氨酸

Tyr：酪氨酸

Ala：丙氨酸

Leu：亮氨酸

Ile：异亮氨酸

Pro：脯氨酸

Cys：半胱氨酸

Glu：谷氨酸

Asp：天冬氨酸

Lys：赖氨酸

Arg：精氨酸

His：组氨酸

Fmoc：芴甲氧羰基

Boc：叔丁氧羰基

DCC：二环己基碳二亚胺

DIEA：N，N-二异丙基乙胺

DMAP：4-二甲氨基吡啶

HOBT：1-羟基苯并三氮唑

HBTU：2-(1H-1-羟基苯并三氮唑)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸

TFA：三氟乙酸

Ts-Cl：对甲苯磺酰氯

EDT：1，2-乙二硫醇

Et₃N：三乙胺

DMF：二甲基甲酰胺

DCM：二氯甲烷

TCA：三氯乙酸

TIS：三异丙基硅烷

NaI：碘化钠

RP-HPLC：反相高效液相色谱

MS：质谱

MALDI-TOF-MS：基质辅助激光吸收离子化飞行时间质谱

t1/2：半衰期

AUC：生物利用度

TIS：三异丙基硅烷

CL：清除率

V(c)：分布容积

AHR：气道高反应性

BALF：支气管肺泡灌洗液

CCR3：C-C趋化因子受体3

Eotaxin：嗜酸粒细胞趋化子

EOS：嗜酸性粒胞

ELISA：联免疫吸附实验

mRNA：信使核糖核酸

OVA：卵白蛋白

下述实施例代表本发明的说明性实施方案，但本发明不受这些实施例的限制。

在本发明优选的实施例1和实施例2中，PEG化试剂为Fluka产品，Rink树脂、DCC、HOBT、HBTU、TFA、NMM、Fmoc-保护氨基酸为上海吉尔生化产品，Ts-Cl、EDT、Et₃N为常规购置的分析纯试剂。

实施例1 固相化学合成法制备供聚乙二醇修饰的前体C端半胱氨酸EILDVP(EILDVA-Cys-NH₂)和C端半胱氨酸LDV(LDV-Cys-NH₂)：

所采用的氨基酸包括Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH；其中tBu为叔丁基(tert-butyl)、Trt为三苯甲基(trityl)，Fmoc为芴甲氧羰基。

多肽序列的合成采用多肽合成仪(美国CS公司产品，CS136XT型)操作进行。

操作步骤：

1、DVA-Cys-NH₂和KILDVA-Cys-NH₂的合成(以DVA-Cys-NH₂为例，EILDVP-Cys-NH₂参照同样方法进行)：

(1)取4g Rink Amide AM树脂(0.5mmol/g)，溶胀20min；

(2)将所需Fmoc-Cys(Trt)-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH，Fmoc-Val-OH以及HBTU分别溶于65％DCM/DMF(v/v)制得浓度为1.6mmol/L和1.44mmol/L各的溶液，DIEA溶于65％DCM/DMF(v/v)制得浓度为3.2mmol/L的溶液，分别加入对应的多肽合成仪的储存罐中，按照LDV-Cys的多肽顺序设定程序，从C端向N端次序连接；

(3)抽掉溶胀的DMF溶液；

(4)DMF×2×0.5min；

(5)20％哌啶×1×5min；

(6)20％哌啶×1×20min；

(7)DMF×2×0.5min；

(8)DCM×1×0.5min；

(9)DMF×2×0.5min；

(10)仪器暂停，取少量树脂，参照Kziser法用茚三酮试剂检测(以下简称“检测)反应呈阳性；

(11)Fmoc-Cys(Trt)-OH 8mmol，HBTU 7.2mmol，DIEA 16mmol，2×1h；

(12)DMF×2×0.5min；

(13)仪器暂停，取少量树脂，检测呈阴性；

(14)20％哌啶×1×5min；

(15)20％哌啶×1×20min；

(16)DMF×2×0.5min；

(17)DCM×1×0.5min；

(18)DMF×2×0.5min；

(19)仪器暂停，取少量树脂，检测呈阳性；

(20)Fmoc-Val-OH 8mmol，HBTU 7.2mmol，DIEA 16mmol，2×1h；

(21)DMF×2×0.5min；

(22)仪器暂停，取少量树脂，检测呈阴性；

(23)20％哌啶×1×5min；

(24)20％哌啶×1×20min；

(25)DMF×2×0.5min；

(26)DCM×1×0.5min；

(27)DMF×2×0.5min；

(28)仪器暂停，取少量树脂，检测呈阳性；

(29)Fmoc-Asp(otBu)-OH 8mmol，HBTU 7.2mmol，DIEA 16mmol，2×1h；

(30)DMF×2×0.5min；

(31)仪器暂停，取少量树脂，检测呈阴性；

(32)20％哌啶×1×5min；

(33)20％哌啶×1×20min；

(34)DMF×2×0.5min；

(35)DCM×1×0.5min；

(36)DMF×2×0.5min；

(37)仪器暂停，取少量树脂，检测呈阳性；

(38)Fmoc-Leu-OH 8mmol，HBTU 7.2mmol，DIEA 16mmol，2×1h；

(39)DMF×2×0.5min；

(40)仪器暂停，取少量树脂，检测呈阴性；

(41)20％哌啶×1×5min；

(42)20％哌啶×1×20min；

(43)DMF×2×0.5min；

(44)DCM×1×0.5min；

(45)DMF×2×0.5min；

(46)仪器暂停，取少量树脂，检测呈阳性；

(47)CH₃OH 2×10ml，收缩并抽干直至颗粒状，称重为6.87克；

(48)RinkAmide AM树脂的切割：将脱掉Fmoc的肽树脂置于100ml茄型瓶中，加入TFA∶TIS∶EDT∶间甲酚＝92.5∶2.5∶2.5∶2.5，40ml，0℃，搅拌反应90min。G₃漏斗过滤，取滤液，旋转蒸发至无液体蒸出。向瓶中缓慢滴入无水冰乙醚，沉淀出白色物质，3000r/min，离心3min，倒掉上清液用无水冰乙醚洗涤，再离心，反复3次，真空干燥得粗肽0.99g。

2、合成产物的纯化

RP-HPLC方法，C18半制备型色谱柱，流动相为A相：水+0.1％TFA，B相：纯乙腈+0.1％TFA，采用线性梯度，流动相流速为3ml/min，检测波长为215nm。

样品稀释后，取20μl上样，采用B相梯度5％-95％，30min，流速为1ml/min。HPLC图谱得出峰时间，计算最佳出峰梯度(B流动相最佳梯度)和线性梯度。

最佳出峰梯度＝(出峰时间-柱体积)×(梯度差/总时间)+初梯度

线性梯度＝最佳出峰梯度±5％

根据以上计算的线性梯度，不同合成产物的纯化条件如下：

LDV-Cys-NH₂：B相梯度为10％～30％，时间为20min。

EILDVP-Cys-NH₂：B相梯度为20％～40％，时间为20min。

3、合成产物的分析和鉴定

(1)HPLC分析鉴定^]

采用Kr100-5-C₁₈分析型色谱柱。检测条件：流动相为A液(0.1％TFA水溶液)和B液(100％乙腈+0.1％TFA)，采用线性梯度，流动相流速为1ml/min，检测波长为215nm。面积归一法计算合成产物纯度。

(2)MS分析鉴定^]

采用基质辅助激光吸收离子化飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)，委托湖北大学生命科学学院和ChinaTech Peptide Co.，Ltd进行。

分析鉴定结果见表1。

实施例2 含LDV序列短肽前体与聚乙二醇反应，合成含LDV序列短肽的聚乙二醇化衍生物

1、mPEG-MAL的生成(以mPEG₂₀₀₀-MAL的生成为例，mPEG₅₀₀₀-MAL、mPEG₂₀₀₀₀-MAL的生成参照同样方法操作)

(1)称取mPEG₂₀₀₀-OH40.0g(20mmol)，溶于100ml CH₂Cl₂中，搅拌溶解后加入15ml三乙胺和19g对甲基苯磺酰氯，室温下搅拌反应约6h，以TLC检测反应完全后，旋转蒸发除去溶剂，加入100ml无水乙醚沉淀出固体，得到mPEG₂₀₀₀-OTs。

(2)对得到的mPEG₂₀₀₀-OTs进行纯化：将粗品mPEG₂₀₀₀-OTs溶于水，先使用分液漏斗用乙醚萃取对甲基苯磺酰氯，弃去乙醚层，再用CH₂Cl₂提取水中的mPEG₂₀₀₀-OTs，弃去水层，无水硫酸镁干燥，旋转蒸发除去CH₂Cl₂，加乙醚沉淀出mPEG₂₀₀₀-OTs，滤去乙醚，五氧化二磷真空干燥。产物不纯时可多次提纯。

(3)取18.0g mPEG₂₀₀₀-OTs溶于50ml DMF，加入5g(27mol)邻苯二甲酰亚胺钾盐，120℃反应4h。减压蒸去溶剂，将残余物溶于50ml无水乙醇，然后加入13.5ml水合肼，回流反应4h。旋转蒸发去溶剂，将残余物溶于CH₂Cl₂，再用无水乙醚沉淀出固体。再以无水乙醇乙醚重结晶。得mPEG₂₀₀₀-NH₂14.2g。

(4)将5.0g mPEG₂₀₀₀-NH₂溶于10ml二氧六环，加入马来酸酐2.0g，80℃搅拌反应30min。减压蒸去溶剂，加入50ml无水乙醚，冷却沉淀出固体，过滤掉乙醚，干燥后所得固体溶于15ml乙酸酐，加入5.0g乙酸钠，100℃搅拌反应45min。减压蒸去溶剂，将残余物用CH₂Cl₂溶解，滤去不溶物，在滤液中加入适量活性炭，放置30min，滤去活性炭，旋转蒸发除去CH₂Cl₂，加入无水乙醚，沉淀出mPEG₂₀₀₀-MAL滤去乙醚，五氧化二磷真空干燥。产物不纯时可多次提纯。最终得到纯化的mPEG₂₀₀₀-MAL。

2、多肽前体的PEG修饰

经工艺优化，确定采用pH值8、反应时间2h、25℃、活化PEG与肽的用量为按1∶1摩尔比值为合成肽的PEG修饰条件。

经RP-HPLC纯化EILDVP-Cys-NH₂溶于少量水中，用NaHCO₃调pH值至8，分别加入适量的mPEG₂₀₀₀-MAL、mPEG₅₀₀₀-MAL和mPEG₂₀₀₀₀-MAL室温反应，用RP-HPLC监测反应进程，得EILDVP-Cys(mPEG₂₀₀₀-MAL)-NH₂、EILDVP-Cys(mPEG₅₀₀₀-MAL)-NH₂、EILDVP-Cys(mPEG₂₀₀₀₀-MAL)-NH₂粗品。

3、PEG修饰产物的纯化

采用C18半制备型色谱柱，流动相为A液(水溶+0.1％TFA)和B液(乙腈+0.1％TFA)，线性梯度，流动相流速为3ml/min，检测波长为215nm。B相梯度为5％到95％，30min方法分离纯化EILDVP-Cys(mPEG₂₀₀₀-MAL)-NH₂、EILDVP-Cys(mPEG₅₀₀₀-MAL)-NH₂、EILDVP-Cys(mPEG₂₀₀₀₀-MAL)-NH₂。

4、PEG修饰产物的分析和鉴定

(1)HPLC分析鉴定

检测条件同实施例1。

(2)MS分析鉴定

检测条件同实施例1。

分析鉴定结果见表1。

表1 合成和修饰产物的基本条件、产率和HPLC、MS分析结果

实施例3 药效实验-合成肽的抗炎免疫药理活性检测：

本实施例测定了本发明实施例1、2制备的5种含LDV序列短肽及聚乙二醇修饰物的抗炎免疫药理活性，具体包括：

DVP-Cys-NH₂

EILDVP-Cys-NH₂

EILDVP-Cys(mPEG₂₀₀₀-MAL)-NH₂

EILDVP-Cys(mPEG₅₀₀₀-MAL)-NH₂

EILDVP-Cys(mPEG₂₀₀₀₀-MAL)-NH₂

以上受试物使用时分别按对照药地塞米松的等摩尔浓度，以生理盐水溶解，0.45μm滤膜过滤除菌，腹腔注射给药。

本实施例的对照药物为地塞米松(浙江仙琚制药股份有限公司，批号：080629)。使用时按动物与人公斤体重折算的临床等效剂量(1mg/kg)，以无菌生理盐水稀释，腹腔注射给药。

本实施例使用的其他主要试剂包括：卵蛋白(V级，Sigma产品)；氢氧化铝凝胶(石家庄五岳制药厂，批号：H 35021085)；小鼠Eotaxin ELISA试剂盒(美国R&D公司)；兔抗小鼠Eotaxin蛋白多克隆抗体(武汉博士德生物技术有限公司)；免疫组化SP试剂盒(武汉博士德生物技术有限公司)。

本实施例使用的实验动物为BALB/C小鼠(清洁级，6-8周龄，体重18-22g，由河北医科大学实验动物中心提供，合格证号：2006A028)。

本实施例对受试物抗炎药理活性的测定采用的动物模型为卵白蛋白诱发的小鼠实验性哮喘。

操作方法如下：

BALB/C小鼠随机分为正常对照、模型对照、阳性药物地塞米松对照组，和LDV-Cys-NH₂、EILDVP-Cys-NH₂及其mPEG修饰衍生物组。卵白蛋白(OVA)雾化吸入诱发制备BALB/C小鼠过敏性哮喘模型。模型组和各给药组小鼠于第0、7、14天腹腔注射0.1ml致敏液(含OVA20μg，氢氧化铝凝胶2.25mg)。自第25天开始用1％OVA生理盐水溶液雾化吸入，每天1次，每次30min，连续5天。雾化前30min地塞米松组腹腔注射地塞米松液0.2ml(1mg/kg)，各合成肽组腹腔注射用生理盐水稀释的合成肽0.2ml(1.57mmol/只)，模型组和正常对照组腹腔注射0.2ml生理盐水。分别观察各组小鼠雾化激发后的行为活动。末次雾化后24h各小鼠采血，采取支气管肺泡灌洗液，采取小鼠左上叶肺组织制备切片。分别检测小鼠的肺泡和支气管局部组织白细胞和嗜酸性粒细胞的浸润和渗出、小鼠血清和BALF上清中Eotaxin水平、肺组织Eotaxin及CCR3蛋白及其mRNA的表达，并进行病理组织学检查。

使用SPSS12.0软件进行统计学处理，检测数据以均数±标准差表示，多组间比较采用方差分析及q检验，2组间比较用配对资料t检验，以P＜0.05为有显著性差异。

实验结果如下：

1、实验小鼠的行为学改变

各组小鼠在激发前一般状态良好。激发后，正常对照组小鼠无明显变化。哮喘模型组小鼠出现烦躁不安、呼吸加快、点头呼吸、咳嗽、呈哮喘样、口周发绀、反应迟钝等表现。合成药物治疗组和地塞米松组大鼠呼吸急促、呼吸节律不整、呼吸幅度增强等较模型组减轻，引喘潜伏期较模型组延长。

2、受试物对小鼠支气管肺泡灌洗液中酸性粒细胞渗出的影响

由表2结果可见，模型组小鼠白细胞总数及EOS计数较正常对照组明显升高(P＜0.01)；受试化合物治疗各组BALF中的白细胞总数及EOS计数较模型组均有一定程度降低，其中mPEG₂₀₀₀₀及mPEG₅₀₀修饰的EILDV-Cys-NH₂降低明显(P＜0.01)，与修饰用mPEG分子量相关性明显。

表2 LDV及其衍生的合成和修饰产物对小鼠支气管肺泡灌洗液中酸性粒细胞渗出的影响(

n＝10)

注：1、细胞计数单位为：个数×10⁴·L^-1；2、受试物腹腔注射，容积0.2ml，腹腔注射，合成肽剂量分别为以原型化合物计算1.57mmol/只，地塞米松剂量1mg/kg；3、与模型对照比较^**P＜0.01，^*P＜0.05。

3、受试物对小鼠血清和支气管肺泡盥洗液(BALF)中Eotaxin水平的影响

用ELISA方法检测小鼠血清和支气管肺泡盥洗液(BALF)中Eotaxin水平。实验结果，标准品各稀释浓度的OD值分别为2.353±0.09、1.612±0.07、1.135±0.05、0.601±0.04、0.321±0.03、0.162±0.02和0.080±0.01。利用curveexert1.3制成标准曲线，求得函数解析式为y＝-4.4456+522.7078x-461.2050x²+465.6419x³-89.3341x⁴。利用解析式求得小鼠血清正常对照组Eotaxin蛋白浓度为296.13±21.51pg/ml，BALF正常对照组为86.71±12.12pg/ml。

表3结果，模型组血清和BALF的Eotaxin值较正常对照组明显升高(P＜0.01)；受试化合物治疗各组血清和BALF的Eotaxin值较模型组均有一定程度降低。其中mPEG₂₀₀₀₀以及mPEG₅₀₀₀修饰EILDV-Cys-NH₂降低明显(P＜0.01)，与修饰用mPEG分子量相关性明显。

表3 LDV及其衍生的合成和修饰产物对小鼠血清和支气管肺泡盥洗液(BALF)中Eotaxin水平的影响(

n＝10)

注：1、单位为：pg/m l；2、受试物腹腔注射，容积0.2ml，腹腔注射，合成肽剂量分别为以原型化合物计算1.57mmol/只，地塞米松剂量1mg/kg；3、与模型对照比较^**P＜0.01，^*P＜0.05。

4、受试物对小鼠实验性哮喘治疗作用的病理组织学观察

病理学组织学检查可见，正常对照组小鼠气道、血管周围及肺实质几乎无炎胞及Eos浸润，上皮完整；哮喘模型对照组小鼠气道、血管周围可见大量炎细胞和EoS浸润，并波及到肺实质，上皮脱落、不完整。DMX组、受试物治疗组小鼠气道及血管可见较多炎性细胞侵润较模型对照组均有程度不同的降低，其中较大分子量mPEG修饰合成肽效果明显，上皮基本完整。

5、受试物对小鼠气道上皮Eotaxin、CCR3蛋白表达的影响

免疫组化方法检测小鼠气道上皮Eotaxin及CCR3蛋白的表达，实验结果见表4。

表4结果，模型组气道上皮CCR3及Eotaxin阳性细胞表达量明显高于正常对照组(P＜0.01)。受试化合物治疗各组气道上皮CCR3及Eotaxin阳性细胞表达量较模型组均有一定程度降低。其中mPEG₂₀₀₀₀以及mPEG₅₀₀₀、mPEG₂₀₀₀修饰的EILDV降低明显(P＜0.01)，与修饰用mPEG分子量相关性明显。

表4 LDV及其衍生的合成和修饰产物对小鼠气道上皮Eotaxin、CCR3蛋白表达的影响(

n＝10)

注：1、受试物腹腔注射，容积0.2ml，腹腔注射，合成肽剂量分别为以原型化合物计算1.57mmol/只，地塞米松剂量1mg/kg；2、与模型对照比较^**P＜0.01，^*P＜0.05。

免疫组化染色，气道上皮Eotaxin和CCR3蛋白的表达为棕黄色，胞浆定位。模型对照组胞浆大量Eotaxin阳性表达。地塞米松及各受试物组Eotaxin和CCR3蛋白表达阳性增强，但均明显低于模型组，且阳性表达程度的降低与mPEG对原型化合物的修饰及修饰物mPEG的分子量负相关。

6、受试物对小鼠小鼠气道上皮Eotaxin及CCR3mRNA表达的影响

用原位杂交方法检测小鼠气道上皮Eotaxin及CCR3mRNA的表达，实验结果见表5。

表5结果，模型组气道上皮Eotaxin及CCR3mRNA表达量较正常对照组明显升高(P＜0.01)。受试化合物治疗各组气道上皮Eotaxin及CCR3mRNA表达量较模型组均明显降低。其中CCR3mRNA表达量降低明显(P＜0.01和0.05)，与mPEG的修饰和修饰用mPEG分子量相关性明显。

表5 LDV及其衍生的合成和修饰产物对小鼠小鼠气道上皮Eotaxin及CCR3mRNA表达的影响(

n＝10)

本实施例的实验结论是：

EILDVP-Cys-NH2的PEG修饰产物对卵白蛋白(OVA)诱发的和小鼠实验性哮喘、哮喘实验动物的肺泡和支气管局部组织白细胞和嗜酸性粒细胞的浸润和渗出、哮喘实验动物小鼠血清和BALF上清中Eotaxin水平、哮喘实验动物肺组织Eotaxin及CCR3蛋白及其mRNA的表达、病理组织学检查的炎症表现表现了较强的拮抗活性，在原型化合物等摩尔浓度剂量下药效优于其原型(前体)化合物。修饰用mPEG分子量较大时产物的抗炎免疫药理活性较强。

实施例4 药代动力学研究：

本实施例对3种合成产物进行了体内药代动力学的分析比较，具体合成物为EILDVP-Tyr、EILDVP-Cys-(mPEG₂₀₀₀-MAL)-Tyr、EILDVP-Cys-(mPEG₂₀₀₀₀-MAL)-Tyr。实验目的是初步分析PEG修饰含LDV序列短肽与被修饰的前体含LDV序列短肽的药代动力学特征和差异。

由于本发明被修饰含LDV序列短肽中不含有¹²⁵I标记需要的His或Tyr残基，为方便药代动力学研究采用的同位素标记方法，设计合成了EILDVP-Tyr和EILDVP-cys-Tyr两种被修饰短肽，并对EILDVP-cys-tyr进行了mPEG₂₀₀₀和mPEG₂₀₀₀₀的C末端Cys的巯基修饰。具体合成和修饰方法与实施例1、例2相同。HPLC分析合成产物的纯度分别为EILDVP-Tyr 99.46％、EILDVP-Cys-Tyr96.55％、EILDVP-Cys-(mPEG₂₀₀₀-MAL)-Tyr95.85％、EILDVP-Cys-(mPEG₂₀₀₀₀-MAL)-Tyr99.20％；经MS鉴定EILDVP-Tyr分子量847.60、EILDVP-Cys-Tyr分子量951.20，EILDVP-Cys-(mPEG₂₀₀₀-MAL)-Tyr在3050、EILDVP-Cys-(mPEG₂₀₀₀₀-MAL)-Tyr在21050.7附近有一组相差44的峰，与预期相符。

本实施例实验委托北方生物技术研究所采用氯胺T法对EILDVP-Tyr、EILDVP-Cys(mPEG₂₀₀₀-MAL)-Tyr、EILDVP-Cys-(mPEG₂₀₀₀₀-MAL)-Tyr进行¹²⁵I标记。经PR-HPLC分离纯化，标记物放射性比活度分别为27.15μCi/μg、9μCi/μg、7.13μCi/μg，放化纯度均高于95％。。放射性同位素测定使用的是西安凯普公司生产的MF-1000型γ计数器。

本实施例使用的主要试剂包括：碘化钠(NaI，天津大茂化学试剂厂提供，分析纯)，三氯乙酸(TCA，天津大茂化学试剂厂提供，分析纯)。

本实施例使用的实验动物为昆明小鼠(清洁级，4～6周龄，体重20～25g，由河北省实验动物中心提供，合格证编号810145)。

实验方法和结果如下：

1、标准曲线的制备

(1)正常小鼠血浆的制备

小鼠眶后静脉取血2～3ml，滴入加有肝素钠(20IU)的离心管中，4℃3000r/min离心25min，吸取上清-20℃保存备用。

(2)标准曲线的制备

采用TCA沉淀法，用双蒸水将三种¹²⁵I标记肽配制成浓度为3.75、7.5、15、30、60、120、240、480ng/ml的标准液。在γ计数测定管中各加入蒸馏水165μl、正常鼠血浆25μl、¹²⁵I标记肽10μl，混匀后加入20％TCA200μl，4000r/min离心10min，弃上清液，沉降物测定cpm值。

将三种¹²⁵I标记肽原液(浓度分别为27.93μg/ml、17.87μg/ml和48.63μg/ml)以双蒸水配制为3.7～480ng/ml的标准液，经以上方法处理正常小鼠血浆并测定cpm值。在3.75～480ng/ml测定浓度内，三种¹²⁴I标记肽γ数值(Y)与加入的¹²⁵I标记肽的浓度(X)均呈良好的线性关系，回归方程分别为：

EILDVP-Tyt-¹²⁵I：Y＝25.726X+61.018，R²＝0.9948；

EILDVP-Cys-(mPEG₂₀₀₀-MAL)-Tyt-¹²⁵I：Y＝33.057X+79.71，R²＝0.9916；

EILDVP-Cys-(mPEG₂₀₀₀₀-MAL)-Tyr-¹²⁵I：Y＝46.074X+2.6235，R²＝0.994。

三组标准曲线见图1-3。

(3)回收率试验

用正常小鼠血浆将三种¹²⁵I标记肽配制浓度为15、60、240ng/ml的样品，每浓度各6份，10μl加入蒸馏水190μl，按TCA沉淀法进行γ计数，代入回归方程得相应实际浓度。计算回收率。

回收率＝实际浓度/配制浓度 (6)

实验结果见表6。

表6 回收率试验结果(n＝6，

)

注：A＝EILDVP-Tyr¹²⁵I；B＝EILDVP-Cys-(mPEG₂₀₀₀-MAL)-Tyr-¹²⁵I；C＝EILDVP-Cys-(mPEG₂₀₀₀₀-MAL)-Tyr-1²⁵I。

实验结果表明，三种¹²⁵I标记肽回收率在88.9％～106.66％之间，日内变异系数RSD＜10％，符合2005年版《中华人民共和国药典》二部附录XIXB中药物制剂人体生物利用度和生物等效性试验指导原则的规定。

2、血药浓度测定

(1)实验动物的处理及分组

取小鼠180只，雌雄各半，随机分为A组EILDVP-Tyt-¹²⁵I、B组EILDVP-Cys-(mPEG₂₀₀₀-MAL)Tyr-¹²⁵I、C组EILDVP-Cys-(mPEG₂₀₀₀₀-MAL)-Tyr-¹²⁵I 3组，每组各60只小鼠。以上各组小鼠随机分为12个时间点，每个时间点5只小鼠。给药前12h，每只小鼠肌肉注射2％NaI(W/V)溶液0.25ml饱和甲状腺。

(2)给药

将三种¹²⁵I标记肽分别以生理盐水配成不同浓度样品，每只小鼠尾静脉注射等体积的¹²⁵I标记肽0.1ml(放射量9·3μCi)。其中EILDVP-Tyr-¹²⁵I为13.7μg/kg、EILDVP-Cys-(mPEG₂₀₀₀-MAL)-Tyr-¹²⁵I为41.33μg/kgEILDVP-Cys-(mPEG₂₀₀₀₀-MAL)-Tyr-¹²⁵I为51.21μg/kg。

(3)血浆样品的采集和处理

以上受试样品注射后0.08、0.25、0.5、1、2、4、6、8、24、32、48和72h，各鼠眶后静脉取血，置于5ml肝素抗凝管，3000r/min离心20min，吸取血浆，-20℃冰箱保存备用。

以上血浆样品25μl，加入蒸馏水175μl，TCA法沉淀，再加入20％TCA200μl，混匀后4000r/min离心10min，弃上清液，沉降物测定cpm值。

(4)血药浓度测定结果

将以上血浆样品γ计数值代入标准曲线方程，求出血药浓度，并经3P97药动学统计软件处理计算药代动力学参数。实验结果见表3，其中血浆半衰期、生物利用度结果与预期相符。但血浆清除率与预期相反，EILDVP原型(前体)化合物血浆清除率低于PEG修饰肽。

实验结果见表7-8。

表7 3种¹²⁵I标记合成和修饰产物的血药浓度测定结果(n＝5，)

注：A＝EILDVP-Tyr¹²⁵I；B＝EILDVP-Cys-(mPEG₂₀₀₀-MAL)-Tyr-¹²⁵I；C＝EILDVP-Cys-(mPEG₂₀₀₀₀-MAL)-Tyr-¹²⁵I。

表8 ¹²⁵I标记3种合成和修饰产物的的小鼠体内代谢动力学参数(n＝5)

本实施例的实验结论是：

1、本项目设计合成的基本短肽EILDVP-Cys-NH₂及其分子量分别为2000和20000的PEG修饰产物在小鼠体内均呈二隔室吸收模型，权重系数均为1。

2、EILDVP-Cys-NH₂经PEG修饰后血浆半衰期(t1/2)、分布容积V(C)、生物利用度(AUC)等主要药代动力学参数数值明显增加。提示，PEG的修饰促进了机体对多肽的吸收-利用程度，延长了体内半衰期，有利于多肽药效的发挥；实验结果与本项目合成肽预期的设计目的相符。

3、EILDVP-Cys-NH₂经PEG修饰后，被修饰短肽血浆半衰期(t1/2)、分布容积V(C)、生物利用度(AUC)等主要药代动力学参数数值增加，与修饰物PEG在本实验范围内的分子量增加正相关。提示，加大修饰物PEG的分子量有利于进一步改善被修饰肽的体内代谢。实验结果与本项目合成肽预期的设计目的相符。

Claims

1.一种含LDV序列短肽的聚乙二醇化衍生物，其特征在于：由含LDV序列短肽和与LDV序列短肽共价连接的聚乙二醇组成，其中的含LDV序列短肽具有下式结构：

X-Y₁-Ile-Leu-Asp-Val-Y₂-Y₃-Z或X-Leu-Asp-Val-Y₃-Z

其中，X是H或Ac；Y₁是Lys或Glu；Y₂是Pro或L-Pro或Ala；Y₃是Cys或高Cys或Lys或Arg或His，是PEG修饰的残基；Z是OH或NH₂。

2.根据权利要求1所述的含LDV序列短肽的聚乙二醇化衍生物，其特征在于聚乙二醇在含LDV序列短肽的C端进行修饰。

3.根据权利要求1或2所述的含LDV序列短肽的聚乙二醇化衍生物，其特征是聚乙二醇的分子量范围是从大于2000Da至小于或等于80000Da。

4.根据权利要求1或2或3所述的含LDV序列短肽的聚乙二醇化衍生物，其特征在于脑啡肽类似物的C端可以连接在聚乙二醇的一个末端或其两个末端。

5.根据权利要求1或2或3或4所述的化合物或含该化合物的组合物的应用，其特征在于用于制备防治慢性炎症和自身免疫性疾病药物或药物的前体化合物。