CN1687439A

CN1687439A - 微生物发酵法生产腺苷的生产工艺

Info

Publication number: CN1687439A
Application number: CN 200510063223
Authority: CN
Inventors: 李英辉; 厉市生
Original assignee: JIANGSU CHENG YI PHARMACEUTICAL Co Ltd
Current assignee: JIANGSU CHENG YI PHARMACEUTICAL Co Ltd
Priority date: 2005-04-07
Filing date: 2005-04-07
Publication date: 2005-10-26

Abstract

本发明公开了微生物发酵法生产腺苷的生产工艺，生产工艺为：用腺苷生产菌作为生产菌种，经过斜面菌种培养及种子罐扩大培养后，接入发酵罐进行发酵生产得到发酵液，发酵液通过无机膜过滤、浓缩、结晶、离心、重结晶、离心、干燥、粉碎整粒工序制得成品。本发明采用微生物发酵法生产腺苷，该生产工艺具有合成法与酵母提取法无法比拟的优点：工艺简单、生产成本低、质量好、产量大，不会造成环境污染，最关键的是将大大降低国产腺苷的生产成本和产品价格，使腺苷产品不但在国内市场而且在国际市场上具有很强的竞争力。

Description

微生物发酵法生产腺苷的生产工艺

所属技术领域

本发明涉及微生物发酵法生产腺苷的生产工艺。

背景技术

腺苷是人体细胞中具有重要生理功能的内源性核苷，可直接进入心肌经磷酸化生成腺苷酸而参与心肌的能量代谢，同时还参与扩张冠脉血管，增加血流量。腺苷对心血管系统和肌体的许多其它系统及组织均有生理作用。腺苷在治疗和诊断心脑血管疾病方面的作用，已经被越来越多的人所发现和接受，在美国FDA已经批准腺苷注射剂作为转复阵发性室上性心动过速PSVT的一线药物，也是经FDA批准的用于心脏药物负荷试验的常规药物之一，已成为急诊处理快速性心律失常的药物负荷试验的两种常规药物。在国内，腺苷注射液作为新药已经获得SFDA的新药注册批准，这为我国腺苷产品的生产和销售提供了十分广阔的发展前景。此外，腺苷是合成ATP、腺嘌呤、腺苷酸及阿糖腺苷的最主要原料，国内市场需求量很大，以前由于国产腺苷成本高所以主要依赖从国外进口。

目前，国内市场上生产腺苷的方法有：

1、合成方法：

以次黄嘌呤为原料与三氯氧磷反应制得6-氯嘌呤、6-氯嘌呤再与四乙酰核糖缩合、氨解制得腺苷，此方法存在合成路线长，原材料成本高，收率低的缺点。

2、酵母提取法：

从酵母中提取RNA，RNA再经过降解分离得到腺苷。从酵母生产到RNA降解工艺路线长，操作过程繁杂，此外在RNA降解中共产生四种核苷，腺苷只占其中1/4，这样不但限制了腺苷的产量，而且给提取分离造成困难，增加成本。

发明内容

本发明的目的在于：提供一种微生物发酵法生产腺苷的生产工艺，简化工艺，降低成本，提高产量，减小环境污染。

本发明的技术解决方案是：腺苷又称腺嘌呤核苷，化学名为6-氨基-9-β-D-呋喃核糖嘌呤(Adenosine，Chartl，A)，本发明的生产工艺为：用腺苷生产菌作为生产菌株，经过斜面菌种制备及种子罐培养后，接入发酵罐中进行发酵生产，得到的发酵液通过无机膜过滤、浓缩、结晶、离心、重结晶、离心、干燥、粉碎整粒工序制得成品。

一、生产过程：

1、发酵：

腺苷生产菌经过斜面菌种培养及种子罐的扩大培养后，接入发酵罐中，进行微生物发酵生产而得到发酵液。

2、提取：发酵液经膜过滤与其它物质分离，经浓缩、离心、结晶而得粗品。

3、精制：

粗品经纯化水溶解，加入活性炭脱色后冷却结晶而制得成品。

二、工艺步骤：

1、发酵：

(1)、菌种培养：

a：菌种培养基：菌种培养基配方：葡萄糖：1.7％-2.3％、酵母膏：1.0％-1.5％、蛋白胨：1.0％-1.5％、玉米浆：1.3％-1.8％、尿素：0.3％-0.8％、氯化钠：0.2％-0.6％、琼脂：1.8％-2.5％、黄嘌呤：5％-10％。

b：根据菌种培养基配方，配制培养基，将配制好的培养基用30％NaOH调PH6.7-7.5，装于斜面试管或茄子瓶，在0.105Mpa蒸汽压力灭菌30分钟，自然冷却至45℃，倾斜45°摊平，待凝固放置34±1℃培养箱培养，48小时后无菌条件下接种，在34±1℃培养24-36h，放置冰箱保管。

c：取长得丰满无杂菌的24-36h茄子瓶培养菌种，每瓶加入生理盐水，刮下菌体，倒入抽滤瓶内得菌液。

(2)、种子培养：

a：种子培养基：种子培养基配方：葡萄糖：1.7％-2.3％、酵母膏：1.0％-1.5％、蛋白胨：1.0％-1.5％、玉米浆：1.4％-2.0％、尿素：0.5％-1.1％、氯化钠：0.3％-0.7％、黄嘌呤：5％-10％。

b：根据种子培养基配方配制培养基，将配制好的培养基投入罐后加水定容，调PH至6.8-7.2左右，关闭罐盖，夹套加热至90℃，直接进蒸汽加热至121℃，0.1Mpa压力，保温10分钟，灭菌完毕冷却降温至36℃，采用压差法将菌液接入罐内，在温度35-37℃，风量1：0.5，培养9-14h得种子液。

(3)、发酵培养：

培养成熟的种子液移入发酵罐，在适宜条件下，菌体发酵代谢产生腺苷。

a：发酵培养基：发酵培养基配方：葡萄糖：8％-15％、硫酸铵：0.5％-1.5％、尿素：0.4％-1.0％、硫酸镁：0.05％-0.15％、硫酸锰：0.001％-0.003％、氯化钾：0.1％-0.3％、磷酸二氢钾：0.2％-0.5％、酵母膏：1.4％-2.0％、多糖茸精：0.4％-0.8％、氯化钠：0.03％-0.08％、消泡剂：适量。

b：根据发酵培养基配方配制发酵培养基，将配制好的培养基投入罐后加水定容，关闭罐盖，预热至95℃，直接进蒸汽加热至121℃，0.1Mpa压力，保温20分钟，冷却降温至36℃，调PH7.0±0.2，采用压差法将种子液压入罐内，在风量80-500m³/h、PH 6.0±0.1、温度36-37℃、罐压0.05Mpa下培养55h。

(4)、发酵液预处理

发酵到终点时，在发酵罐内用氨调PH至7.5，升温至90℃后迅速降温至60℃，对发酵液进行搅拌，并用约50m³/h风量通气，10分钟后再次调整PH到7.5送至发酵液贮罐。

2、提取：

(1)、发酵液的处理：核定发酵液体积，开搅拌并维持2小时，使可溶蛋白充分絮凝，PH控制在7.0-7.5，维持时间结束后开始膜过滤。

(2)、膜过滤

将贮罐中的发酵液打到加热罐中，进料量约至加热罐的3/4为宜，将温度控制在65-75℃间进行膜过滤，滤液PH值保持7.0-8.0，打入浓缩器。

(3)、浓缩

滤液量达到规定的液位后进行浓缩，浓缩温度65-75℃，真空度-0.07--0.095Mpa，在浓缩终点时，浓缩液的浓度应控制在15-18Be°，浓缩过程中PH值控制在6.5-7.5。

(4)、粗品结晶

浓缩液进入结晶罐后即用稀释后的NaOH调整PH值到7.5-8.0，打开循环冷却水进行冷却，浓缩液液面碰到搅拌叶后再开搅拌，当浓缩液体积达粗结晶釜内容积的2/3时，当釜内温度下降到40℃时，切换到冷冻盐进行冷冻结晶，当釜内温度≤10℃时停止搅拌，达到0-4℃时，开始计时保温8小时。

(5)、离心

料液放入离心机规定位置后，开离必机，离心结束时，用约25-50kg的冰饮用水均匀对粗品进行清洗，并离干，腺苷粗品湿品称重后将其掰碎放入不锈钢托盘内。

(6)、烘干、粉碎、包装

将粗品湿品均匀地摊放于不锈钢盘内，温度60-65℃干燥6-8小时，将烘干后的腺苷粗品经颗粒机20目不锈钢网筛过筛筛入清洁的周转桶内，待其冷却后进行包装。

3、精制

(1)精制

精制投料配比为折纯粗品∶纯水∶活性炭＝1∶18∶0.05，腺苷粗品折纯计算公式为：粗品重量×(1-干燥失重)×含量

将按配料比计算而得的纯水泵入精制釜内，接着投入粗品，投料结束后，加热料液至温度90±5℃，使之全熔，再用NaOH或Hcl调节PH值为6.5，维持40分钟，加入活性炭，脱色30分钟后再调节PH值为6.5，过滤。

(2)结晶：

将滤液压至结晶釜中用循环水进行冷却，开搅拌，当温度≤40℃时，切换到冰盐水，温度降至0-5℃时停搅拌，冷冻结晶4小时。

(3)离心：

料液离心甩干，用95％乙醇淋洗，甩干，将物料从离心袋中取出，称量。

(4)烘干：

将物料湿品装入真空回旋干燥器，开水浴箱蒸汽阀，控制水浴箱水温在95℃以上真空干燥，真空度0.08-0.09Map，开始干燥时双锥每半小时旋转三圈，待物料温度达到60℃后开始连续旋转，转速控制在6转/min，干燥时间6-8小时，干燥终点温度控制在95℃，干燥结束，降温至40℃出料装入不锈钢周转桶中。

(5)整粒、包装：

将干燥好的成品经20目不锈钢筛筛入清洁的不锈钢专用周转桶内，将过筛后的腺苷成品包装。

本发明采用微生物发酵法生产腺苷，该生产工艺具有合成法与酵母提取法无法比拟的优点：工艺简单、生产成本低、质量好、产量大，不会造成环境污染，最关键的是将大大降低国产腺苷的生产成本和产品价格，使腺苷产品不但在国内市场而且在国际市场上具有很强的竞争力。

附图说明

图1为本发明生产流程框图

图2为本发明发酵生产流程框图

图3为本发明提取生产流程框图

图4为本发明精制生产流程框图

具体实施方式

一、生产过程

1、发酵：

腺苷生产菌经过斜面菌种培养及种子罐的扩大培养后，接入发酵罐中进行发酵生产而得发酵液。

2、提取：发酵液经膜过滤与其它物质分离，经浓缩、结晶而得粗品。

3、精制：

二、工艺过程

(一)发酵

1、菌种培养：

(1)菌种培养基：菌种培养基配方：葡萄糖：1.7％-2.3％、酵母膏：1.0％-1.5％、蛋白胨：1.0％-1.5％、玉米浆：1.3％-1.8％、尿素：0.3％-0.8％、氯化钠：0.2％-0.6％、琼脂：1.8％-2.5％、黄嘌呤：5％-10％。

(2)根据菌种培养基配方配制培养基，将配制好的培养基用30％NaOH调PH7.0-7.2，装于斜面试管或茄子瓶，加棉塞，用牛皮纸包装，在0.105Mpa蒸汽压力灭菌30分钟，自然冷却至45℃左右，倾斜45°摊平，待凝固放置34±1℃培养箱培养，48小时后无菌条件下接种，在34±1℃培养箱培养24-36h，放置冰箱保管。

(3)取长得丰满无杂菌的24-36h茄子瓶培养菌种，每瓶加入生理盐水，刮下菌体，倒入抽滤瓶内得菌液。

2、种子培养：

(1)、精过滤器灭菌：灭菌压力0.11Mpa，保压30分钟，

后用空气吹干备用。

(2)、空罐灭菌：0.15Mpa-0.2Mpa，保压30分钟。

(3)种子培养基：种子培养基配方：葡萄糖：1.7％-2.3％、酵母膏：1.0％-1.5％、蛋白胨：1.0％-1.5％、玉米浆：1.4％-2.0％、尿素：0.5％-1.1％、氯化钠：0.3％-0.7％、黄嘌呤：5％-10％。

(4)实罐灭菌：将配制好的培养基投入罐后加水定容，调PH至7.0左右，关闭罐盖，夹套加热至90℃，直接进蒸汽加热至121℃，0.1Mpa压力，保温10分钟。

(5)冷却：灭菌完毕冷却降温至36℃，接种。

(6)接种：采用压差法将菌液接入罐内。

(7)培养：温度35-37℃；风量1∶0.5培养9-14h。

3、发酵培养：

培养成熟的种子液移入发酵罐后，在适宜条件下，菌体发酵代谢产生腺苷。

(1)精过滤器灭菌：在0.11Mpa压力，灭菌30分钟，然后用空气吹干备用。

(2)空消：培养基在0.15-0.17Mpa压力，温度128±2℃，灭菌30分钟。

(3)发酵培养基：发酵培养基配方：葡萄糖：8％-15％、硫酸铵：0.5％-1.5％、尿素：0.4％-1.0％、硫酸镁：0.05％-0.15％、硫酸锰：0.001％-0.003％、氯化钾：0.1％-0.3％、磷酸二氢钾：0.2％-0.5％、酵母膏：1.4％-2.0％、多糖单精：0.4％-0.8％、氯化钠：0.03％-0.08％、消泡剂：适量。

(4)实消：将配制好的发酵培养基投入罐后加水定容，关闭罐盖，预热至95℃，直接进蒸汽加热至121℃，0.1Mpa压力，保温20分钟。冷却降温至36℃，调PH7.0±0.2后移种。

(5)移种：采用压差法将种子液压入罐内，移种管道在接种前用0.15Mpa蒸汽压力下灭菌60分钟。

(6)培养：在风量80-500m3/h、PH6.0±0.1、温度36-37℃、罐压0.05Mpa下培养55h左右。

4、发酵液预处理

(1)发酵到达终点时，在封闭状态发酵罐内用氨调PH至7.5。

(2)在发酵罐内将发酵液升温至90℃后迅速降温至60℃左右，对发酵液进行搅拌，并用约50m3/h风量通气，10分钟后再次检查PH值并调整到7.5，将发酵液送至的发酵液贮罐中。

(二)提取：

采用膜过滤将发酵液与其它物质分离，经真空减压浓缩、结晶而得粗品。

1、发酵液的处理：

核定发酵液体积，开搅拌并维持2小时，使可溶蛋白充分絮凝，用精密试纸重新测试PH，如低于7.5，则用稀释后的NaOH溶液调整PH7.5，维持时间结束后开始膜过滤。

2、膜过滤

(1)将贮罐中的发酵液打到加热罐中，进料量约至加热罐的3/4为宜，将温度控制在60℃间进行过滤，过滤过程中每1小时取滤液进行含量检测，并用精密试纸检查滤液PH值，如低于7.5，用NaOH溶液调至7.5。

(2)当发酵液过滤后的残渣体积为1/10时，加饮用水，加水量为残渣体积的1-1.5倍，再升温至60℃进行膜过滤。当二次残液体积与加水前相同时，取残液检测其含量。

①当残液中腺苷含量＞1g/L时，继续加水进行膜过滤。

②当残液中腺苷含量＜1g/L时，将残液排入废水池中。

(3)膜过滤结束后，要按程序对膜过滤设备用碱、酸进行清洗，洗完后用清水冲洗干净，每一批次的膜过滤结束后都要进行，以保持过滤流量。

3、浓缩

(1)浓缩前，先对浓缩设备进行检查，是否已清洗干净，同时检查蒸气，并排尽蒸气管内的冷凝水，确认完成后，进滤液进行浓缩。注意：每次浓缩时，不要等膜过滤结束后在进行，当滤液够一批浓缩时，调PH值后就可进行。

(2)每批料液在进到规定的液位后，一般在双效中央视镜的中部，约2吨料液进行浓缩，一效温度65-75℃，真空度-0.07--0.085Mpa；二效温度55-65℃，真空度-0.09--0.095Mpa。

(3)在浓缩时，进一批、浓缩一批、结束一批，严禁中途补加料液，每批次浓缩结束时，测料液的浓度，应控制在15-18Be°，或浓缩液降到规定位置，也就是浓缩到起始体积的20-25％，如所浓缩的过滤液为加水后过滤的，则应浓缩到起始体积的30％。

(4)浓缩过程中要随时检查PH值，PH值不得低于6.5。

(5)每批次浓缩结束时，要对滤液收集罐、双效浓缩罐及其管道等进行清洗，第一遍清液当粗品母液处理。

4、粗品结晶

(1)首批次料液进行浓缩的同时，检查粗结晶釜，检查是否已做好接收料液的准备。

①检查粗结晶釜内是否已清洗干净。

②粗结晶釜夹套内的冷冻盐水是否被全部压出。

(2)浓缩液进入结晶罐后即用稀释后的NaOH调整PH值到7.5-8.0，当有浓缩液进入粗结晶釜时，打开循环冷却水进行冷却，浓缩液液面碰到搅拌叶后再开搅拌，当浓缩好的料液体积达粗结晶釜内容积的2/3时，当釜内温度下降到40℃时，切换到冷冻盐水进行冷冻结晶。

(3)当釜内温度≤10℃时停止搅拌，达到0-4℃时，开始计时保温8小时以上。在保温过程中，每一小时开始搅拌3分钟。

5、离心

(1)腺苷浓缩液结晶的同时，要对离心和烘干设备进行检查，使它们始终处于完好待用状态。

(2)料液放入离心机规定位置后，料液在机内静置5分钟，并记录好离心开始时间，开离必机，开始应点动，慢慢加速，使离心机在动转过程中不抖动、无异常噪音，更不能使料液溅出。

(3)离心结束时，用冰饮用水均匀对粗品进行清洗，并离干，判断离干的标准为：母液流出视镜在1分钟内不再出现水珠流动。

(4)离心出的腺苷粗品倒入不锈钢周转桶中，离心出的腺苷粗品称重后将其掰碎放入不锈钢托盘内。

6、烘干、粉碎、包装

(1)将粗品湿品均匀地摊放于不锈钢盘内3-4cm厚，逐盘自上而下放入温度在60-65℃下干燥6-8小时。在这过程中，每一小时记录一次，烘干过程中应每2小时对烘盘中的物料进行翻动，使烘干均匀，还要随时观察烘箱内温度变化。干品出料，自下而上逐盘取出。

(2)烘干后的腺苷粗品经颗粒机20目不锈钢网筛过筛筛入清洁的周转桶内。

(3)待其冷却后进行包装，按15kg/桶称量装桶，桶外贴上标签，按规定办理入库手续。

(4)包装结束后，要对所有设备进行清洁，以备用。

(三)、精制

精制投料配料比：

所得折纯粗品∶纯水∶活性炭＝1∶18∶0.05，腺苷粗品折纯计算公式为：粗品重量×(1-干燥失重)×含量

1、精制

(1)将按配料比计算而得的纯水泵入精制釜内，接着投入折纯粗品，投料结束后，加热料液至温度90±5℃，使之全熔，取样检查釜内料液是否溶清，再用NaOH或Hcl调节PH值为6.5并维持40分钟，加入活性炭，脱色30分钟后再调节PH值为6.5，过滤。

(2)脱色液趁热过滤，在打入结晶釜前，精制釜、压滤机、精制釜，先循环滤液，检查是否漏炭。方法：滤液循环5分钟后，肉眼观察流过玻璃视镜的脱色液是否还有活性炭颗粒，并记录，直至无活性炭颗粒止，再循回2分钟后，把脱色液压滤机、微孔过滤器泵入结晶釜。

(3)精制釜料液放完，关闭放料阀。将洗炭用的纯化水约100kg加入精制釜内，搅拌加热约70-80℃，然后放出该洗液经原过滤装置滤入结晶釜，并用真空抽干。

2、结晶

将滤液及洗液压至结晶釜中用循环水进行冷却，开搅拌，当温度≤40℃时，切换到冰盐水，温度降至0-5℃时，停搅拌，冷冻结晶4小时以上。

3、离心

离心机检查好后，放料液离心甩干，用约10-20kg 95％乙醇淋洗，甩干，即视境内的液滴不滚动，再离心5分钟，将物料从离心袋中取出，称量。

4、烘干

将湿品物料装入真空回旋干燥器，开水浴箱蒸汽阀，控制水浴箱水温在95℃以上真空干燥，真空度0.08-0.09Map，开始干燥时双锥每半小时旋转三圈，待物料温度达到60℃后开始连续旋转，转速控制在6转/min，干燥时间6-8小时，从升温开始计时，每1时记录一次，干燥终点温度控制在95℃，干燥结束，降温至40℃以下出料装入不锈钢周转桶中，移往过筛间。

5、整粒、包装

检查整粒机，开启捕尘器，将干燥好的成品经20目不锈钢筛，筛入清洁的不锈钢专用周转桶内，将过筛后的腺苷成品移入包装区域包装。

(1)肉眼检查纸板桶是否平整无凹凸不平，应清洁，无异物，桶与盖应紧密吻合，塑料扣领用数与外观。将经检查符合要求的包装桶置传递窗内，每只包装桶内装两只聚乙烯袋，塑料扣、标签置清洁的专用消毒盘中经传递窗送入消毒存放间。肉眼检查聚乙烯袋，是否清洁无污点，是否破损、漏气。将开口的包装桶及聚乙烯袋置紫外灯下照射灭菌30分钟后，传入包装区域内，并核对标签的品名及数量是否正确。

(2)戴上医用乳胶手套，将过筛后的腺苷成品装入已称量过的衬有两层聚乙烯袋的纸板桶内，抽样后按规定包装规格称量。在成品标签上印上批号、实际毛重、净重，核实无误后将标签贴在纸桶外，每只聚乙烯袋用两条塑料扣扎紧，桶与盖密封，并对标签、塑料扣进行盘点。包装完毕后入成品仓库，按批记录要求逐项进行填写记录。

(3)每批精制生产完毕，精制釜、过滤器及管道、微孔过滤器、结晶釜、离心机、旋转干燥器、FZ粉碎整粒机、不锈钢专用桶必须进行清洗，清洗结束挂上“清洁”状态牌。

生产过程中的原辅材料质量标准如下：

1、纯化水：(CP2000版二部)

性状：无色、透明、无味

酸碱度：符合规定

硝酸盐：≤0.06ppm

亚硝酸盐：≤0.02ppm

氯化物、硫酸镁、钙盐：符合规定

2、活性炭：(企业标准)

性状：黑色无臭的细粉

鉴别：符合规定

干燥失重：≤10.0％

炽灼残渣：≤3.0％

酸中溶解度：≤10mg

氯化物：≤0.1％

硫酸盐：≤0.05％

重金属：≤30ppm

未炭化物：符合规定

3、氯化物(企业标准)

性状：白色或黄白色，无杂质，味咸

鉴别：应符合规定

水份：≤4.20％

含量：≥94.0％

4、葡萄糖：(企业标准)

性状：为无色或白色结晶粉末，无臭、味甜，易溶于水，在乙醇中微溶。

比旋度：≤+52°-+53.5°

酸度：应符合规定

干燥失重：≤9.5％

灼烧残渣：≤0.1％

5、硫酸镁(企业标准)

性状：无色结晶、无臭、味苦、咸味、有风化性

含量(GC)：≥99.5％

鉴别：应符合规定

酸碱度：应符合规定

灼烧失重：48.0％-52.0％

6、尿素(企业标准)

性状：无色颗粒状或白色结晶粉末，味咸凉

炽灼残渣：≤0.1％

总氮：≥46.2％

7、酵母膏：(企业标准)

性状：棕黄色粘稠液体，有酵母特有的香味

检查：干燥失重：≤30％

灰份：≤15％

总氮：≥7％

8、消泡剂：(企业标准)

性状：淡黄色透明粘稠液体

水分：≤0.5％

9、玉米浆：(企业标准)

性状：淡黄色至淡棕色液体

干物质：≥40％

含蛋白质量：≥40％

10、淀粉：(企业标准)

性状：白色或微黄色粉末，无臭，无味，在冷水和乙醇中不容解

鉴别：应符号规定

水份：≤14.0％

灰份：≤0.15％

11、盐酸：(企业标准)

性状：本品为无色或淡黄色发烟的透明液体

含量：≥31.0％

12、烧碱：(企业标准)

性状：无色透明液体

含量：≥30.0％

13、酵母粉：(企业标准)

性状：并品为淡黄色至淡黄棕色颗粒或粉末，有酵母的特嗅，不应有异嗅显微镜下检视，多数呈圆形、卵圆开、柱形或集结成块。

干燥失重：≤8.5％C

灰份：≤8.0％

含蛋白质量：≥44.0％

生产过程中包装材料规格、质量标准如下：

1、腺苷成品包装桶

装量与材质：20kg/纸板桶

内径：35cm

内高：45cm

外观：桶身无明显凹凸，桶的金属部分要求镀锌，桶的表面及金属部件与纸板桶的接口处平整光滑

2、腺苷成品包装袋

装量与材质： 20kg/聚乙烯袋

长： 100cm±1cm

宽： 64cm±1cm

厚： 0.8mm±0.1cm

无污染：合格

无破损：合格

生产过程中检测项目和检测方法如下：

1、PH值的测定：

仪器：PHS-25数显计

测定步骤：吸取发酵液约100ml放入取样杯中，迅速将电极插入，轻轻摇动，稳定30秒后读数。

2、OD值测定

仪器：581-S光电比色计

测定步骤：

吸取发酵液或种子液1ml于10-25ml的具塞比色管中，摇匀，放置于581-S光电比色计中，滤光板65处测定，读出OD值。(根据发酵液、浓度、色素、稀释不同倍数)

3、糖的测定

仪器：721型分光光度计

试剂：碱性铜溶液，磷钼酸溶液等

测定步骤：

精密量取发酵液1ml(糖液)于100ml容量瓶中，加水不定期容至刻度，从中精密量取1ml于10-25ml的具塞比色管中，加入1ml的规定配制的碱性铜溶液，煮沸6秒放水中冷却后，加2ml的按规定配制的磷钼酸摇匀，加水定容25ml后于721型分光光度计，光程0.5×1.0cm比色皿，用蒸镏水作空白，波长560纳米处测A值，则含量＝A×斜率(标准曲线)

4、腺苷含量的测定：

仪器：紫外分光光度仪离心机

发酵液含苷测定步骤：

(1)直测：取发酵液于试管中煮沸5分钟，倒入TDL-40B离心机，以转速3000转/分，离心10分钟，精密吸取上清液5μl于5ml 0.1mol/L Hcl中，摇匀，于TU-1800紫处分光光度计，波长260nm处0.1mol/l Hcl作对照，测其吸收度A值。

(2)层析：吸取煮沸离心好的发酵液5μl点于色谱纸上行约16cm，取出凉干，于三用紫外254nm下检视画出大于斑点的圈，用剪细于干净的试管中，加0.1mol/L Hcl5ml，水浴60℃30分钟，于TDL-40B离心机中，以转速3000转/分，离心5分钟，以0.1mol/L Hcl作对照，测其吸收度A值。

(3)展开剂：正丁醇∶冰醋酸∶水＝4∶1∶1

(4)发酵液含苷计算：

含量(克/升)＝A×18.87

5、镜检：

仪器：XSP-2C型显微镜

步骤：用接种环沾取无菌水于载片上，并挑取少许菌落轻轻拔天，涂匀，再进行革蓝氏染色，最后油镜镜检

6、CO₂测定

仪器：CO₂测定仪

测定方法：

(1)先在相对没有CO2的地方校零。

(2)校准后吸气管口对准需测罐排气口，受捏洗球，然后松手，让洗球慢慢吸气，相隔10秒，再测一次，共需四次。待数值稳定，记下所测数值就是OD值。

Claims

1.微生物发酵法生产腺苷的生产工艺，腺苷又称腺嘌呤核苷，化学名为6-氨基-9-β-D-呋喃核糖嘌呤(Adenosine，Chartl，A)，其特征在于：生产工艺为：腺苷生产菌经过斜面培养及种子罐扩大培养后接入发酵罐中进行发酵生产得发酵液，发酵液通过无机膜过滤、浓缩、结晶、离心、重结晶、离心、干燥、粉碎整粒工序制得成品；

(1)、发酵：腺苷生产菌经过斜面培养及种子罐扩大培养后接入发酵罐中进行发酵生产得发酵液；

(2)、提取：发酵液经膜过滤与其它物质分离，经浓缩、结晶而得粗品；

(3)、精制：

粗品经纯化水溶解、加入活性炭脱色后冷却结晶而制得成品。

2.根据权利要求1所述的微生物发酵法生产腺苷的生产工艺，其特征在于：

(1)、发酵：

①、菌种培养：

a：菌种培养基：菌种培养基配方：葡萄糖：1.7％-2.3％、酵母膏：1.0％-1.5％、蛋白胨：1.0％-1.5％、玉米浆：1.3％-1.8％、尿素：0.3％-0.8％、氯化钠：0.2％-0.6％、琼脂：1.8％-2.5％、黄嘌呤：5％-10％；

b：根据菌种培养基配方，配制培养基，将配制好的培养基用，用30％NaOH调PH7.0-7.2，装于斜面试管或茄子瓶，在0.105Mpa蒸汽压力灭菌30分钟，自然冷却至45℃左右，倾斜45°摊平，待凝固放置34±1℃培养箱培养，48小时后无菌条件下接种，在34±1℃培养24-36h，放置冰箱保管；

取长得丰满无杂菌的24-36h茄子瓶培养菌种，每瓶加入生理盐水，刮下菌体，倒入抽滤瓶内得菌液；

(2)、种子培养：

a：种子培养基：种子培养基配方：葡萄糖：1.7％-2.3％、酵母膏：1.0％-1.5％、蛋白胨：1.0％-1.5％、玉米浆：1.4％-2.0％、尿素：0.5％-1.1％、氯化钠：0.3％-0.7％、黄嘌呤：5％-10％；

b：根据种子培养基配方配制培养基，将配制好的培养基投入罐后加水定容，调PH至7.0左右，关闭罐盖，夹套加热至90℃，直接进蒸汽加热至121℃，0.1Mpa压力，保温10分钟，灭菌完毕冷却降温至36℃，采用压差法将菌液接入罐内，在温度35-37℃，风量1∶0.5，培养9-14h得种子液；

(3)、发酵培养：

培养成熟的种子液移入发酵罐，在适宜条件下，菌体发酵代谢产生腺苷；

a：发酵培养基：发酵培养基配方：葡萄糖：8％-15％、硫酸铵：0.5％-1.5％、尿素：0.4％-1.0％、硫酸镁：0.05％-0.15％、硫酸锰：0.001％-0.003％、氯化钾：0.1％-0.3％、磷酸二氢钾：0.2％-0.5％、酵母膏：1.4％-2.0％、多糖茸精：0.4％-0.8％、氯化钠：0.03％-0.08％、消泡剂：适量；

b：根据发酵培养基配方配制发酵培养基，将配制好的培养基投入罐后加水定容，关闭罐盖，预热至95℃，直接进蒸汽加热至121℃，0.1Mpa压力，保温20分钟，冷却降温至36℃，调PH7.0±0.2，采用压差法将种子液压入罐内，在风量80-500m³/h、PH6.0±0.1、温度36-37℃、罐压0.05Mpa下培养55h；

(4)、发酵液预处理

发酵到终点时，在发酵罐内用氨调PH至7.5，升温至90℃后迅速降温至60℃，对发酵液进行搅拌，并用约50m3/h风量通气，10分钟后再次调整PH到7.5送至发酵液贮罐；

2、提取：

(1)、发酵液的处理：核定发酵液体积，开搅拌并维持2小时，使可溶蛋白充分絮凝，如PH低于7.5，则用稀释后的NaOH溶液调整PH7.5，维持时间结束后开始膜过滤；

(2)、膜过滤

将贮罐中的发酵液打到加热罐中，进料量约至加热罐的3/4为宜，将温度控制在65-75℃间进行膜过滤，滤液PH值如低于7.5，用NaOH溶液调至7.5；

(3)、浓缩

滤液在进到规定的液位后进行浓缩，一效温度65-75℃，真空度-0.07--0.085Mpa，二效温度55-65C，真空度-0.09--0.095Mpa，在浓缩时，滤液的浓度应控制在15-18Be°，浓缩过程中PH值大于或等于6.5；

(4)、粗品结晶

浓缩液进入结晶罐后即用稀释后的NaOH调整PH值到7.5-8.0，打开循环冷却水进行冷却，浓缩液液面碰到搅拌叶后再开搅拌，当浓缩液体积达粗结晶釜内容积的2/3时，当釜内温度下降到40℃时，切换到冷冻盐进行冷冻结晶，当釜内温度≤10℃时停止搅拌，达到0-4℃时，开始计时保温8小时；

(5)、离心

料液放入离心机规定位置后，开离必机，离心结束时，用冰饮用水均匀对粗品进行清洗，并离干，腺苷粗品湿品称重后将其掰碎放入不锈钢托盘内；

(6)、烘干、粉碎、包装

将粗品湿品均匀地摊放于不锈钢盘内，温度60-65℃干燥6-8小时，将烘干后的腺苷粗品经颗粒机20目不锈钢网筛过筛筛入清洁的周转桶内，待其冷却后进行包装；

3、精制

(1)精制

精制时投料配比为折纯粗品∶纯水∶活性炭＝1∶18∶0.05，腺苷粗品折纯计算公式为：粗品重量×(1-干燥失重)×含量

将按配料比计算而得的纯水泵入精制釜内，接着投入粗品，投料结束后，加热料液至温度90±5℃，使之全熔，再用NaOH或Hcl调节PH值为6.5，维持40分钟，加入活性炭，脱色30分钟后再调节PH值为6.5，过滤；

(2)结晶：

将滤液压至结晶釜中用循环水进行冷却，开搅拌，当温度≤40℃时，切换到冰盐水，温度降至0-5℃时停搅拌，冷冻结晶4小时以上；

(3)离心：

放料液离心甩干，用95％乙醇淋洗，甩干，将物料从离心袋中取出，称量；

(4)烘干：

将物料湿品装入真空回旋干燥器，开水浴箱蒸汽阀，控制水浴箱水温在95℃以上真空干燥，真空度0.08-0.09Map，转速控制在6转/min，干燥时间6-8小时，干燥终点温度控制在95℃，干燥结束，降温至40℃出料装入不锈钢周转桶中；

(5)整粒、包装：