CN1687044A

CN1687044A - 一种紫杉醇纯品的生产方法

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Publication number: CN1687044A
Application number: CN 200510063054
Authority: CN
Inventors: 杨雪峰; 谢曼
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2005-04-05
Filing date: 2005-04-05
Publication date: 2005-10-26

Abstract

本发明采用紫杉醇含量大于万分之一的红豆杉枝叶或树皮为原料，经过浸提、脱脂、脱胶后得到含量大于百分之一点五的浸膏。将浸膏用溶剂溶解，加入吸附剂混合浓缩吸附，采用工业固－液相柱色谱分离技术，用极性、弱极性溶剂或混合溶剂洗脱，分段除去与紫杉醇极性不同的杂质，将富含紫杉醇段经过浓缩、结晶、真空干燥后得到纯度大于99％的紫杉醇精品。按紫杉醇量计算，产品直接收率大于70％，总收率大于85％。

Description

一种紫杉醇纯品的生产方法

技术领域紫杉醇，英文名为Paclitaxel，系统命名为5β，20-环氧-1，2α，4，7β，10β，13α-六羟基紫杉烷-11-烯-9-酮-4，10-二乙酸酯-2-苯甲酸酯-13-[(2’R，3’S)-N-苯甲酰-3’苯基异丝氨酸酯]。其分子式为C₄₇H₅₁NO₁₄，分子量为853.9，是制造紫杉醇类抗癌药物的重要原料。本发明以天然或人工红豆杉枝叶及树皮为原料，经过浸提、粗分离、精制等工艺过程获得纯度大于99％的精品，属于生物化工领域。

背景技术紫杉醇能够与微管蛋白结合，促进微管蛋白聚合装配成微管二聚体，从而抑制细胞中微管的生理解聚，使细胞有丝分裂停止在G2期及M期，阻止了癌细胞的快速繁殖，这一机理与其它纺锤体毒性的抗癌药物的作用机制恰好相反，至今仍是独一无二的。临床研究表明，紫杉醇治疗晚期卵巢癌总响应率为56％，治疗转移性乳腺癌，总响应率为30％，治疗非小细胞肺癌总响应率为24％，而且对前列腺癌、上胃肠道癌、头颈癌、白血病等亦有较好疗效。早在1856年Lucas就从浆果红豆杉(Taxus baccataL.)中分离得到了碱性物质Taxine，但直到本世纪60年代，在现代光谱技术发展的基础上，有关这方面的研究才得以全面展开。1967年，美国化学家M.E.Wall和M.C.Wani首先从短叶红豆杉中分离得到紫杉醇，1971年由M.C.Wani及其同事鉴定了结构并说明其有抗癌活性。1979年，美国爱因斯坦医学院的Susan B.Horwitz等发现紫杉醇独特的抗癌机理。1980年进行给药规程研究，1982年美国开始I期临床试验，1986年开始II期临床试验。1992年12月29日，美国食品及药品管理局(FDA)首先批准紫杉醇作为治疗晚期卵巢癌的新抗癌药上市，一年后又批准用于治疗乳腺癌。90年代以来，紫杉醇的研究空前发展，主要集中在原料浸出率的提高、分离方法的改进、细胞组织培养法的工业化、半合成及全合成法的工业化、低毒及水溶新剂型的研究等等。

现有的紫杉醇浸提方法一般均是将原料干燥、粉碎后，先用甲醇、乙醇浸出，加水稀释，用己烷或石油醚萃取脱脂，二氯甲烷或氯仿萃取，浓缩后得到浸膏。其缺点是萃取有机溶剂用量大，乳化严重，浸出收率难以超过85％，浸膏纯度低。

国内外目前分离紫杉醇的方法一般是用将浸膏经多级硅胶柱层析、硅胶键合C-18柱层析或吸附树脂柱层析，再经结晶、重结晶后得到产品。上述方法分离紫杉醇与邻近衍生物Cephalomannine是比较困难的，且产量很小，因而有时需要经过溴化或氧化后再用硅胶柱层析将二者分开。上述方法所得产品纯度＞98％，但存在如下缺陷：(1)收率低。硅胶对紫杉醇存在不可逆吸附，造成产品损失，生产纯度大于98％的紫杉醇，总收率小于60％。(2)操作繁琐、产量小。(3)溶剂消耗量大，成本高。(4)吸附树脂抗压能力弱，柱效低。(5)难以利用可再生的红豆杉枝叶为原料进行工业化生产。

发明内容本发明的目的是提供一种稳定、工业化、低成本地提纯获得高纯度紫杉醇的方法。本发明采用紫杉醇含量大于万分之一的红豆杉枝叶或树皮为原料，经过浸提、脱脂、脱胶后得到含量大于百分之一点五的浸膏。将浸膏用溶剂溶解，加入吸附剂混合浓缩吸附，采用工业固-液相柱色谱分离技术，用极性、弱极性溶剂或混合溶剂洗脱，分段除去与紫杉醇极性不同的杂质，将富含紫杉醇段经过浓缩、结晶、真空干燥后得到高纯度的紫杉醇精品，纯度大于99％。按紫杉醇量计算，产品直接收率大于70％，总收率大于85％。其工艺步骤详述如下：

A.提取将红豆杉枝叶或树皮阴干，粉碎过5mm直径筛，分三次加入浸提液进行三级间歇浸提，粉碎原料∶浸提液＝1∶7(W/V)，浸提液为甲醇\乙醇，优选甲醇。其中第三级浸提液用作下批投料时的一级浸提液。第一、二级浸提液合并浓缩，得到浓缩液，有机溶剂回收利用。

B.脱酯将步骤A产生的浓缩液分两次加入脱脂液进行二级间歇脱脂，浓缩液∶脱脂液＝1∶1(V/V)，脱脂液为石油醚\正己烷\环己烷\6号溶剂油等，优选石油醚。搅拌20分钟，静置60分钟，弃去下层胶状或絮状沉淀物，收集下层液，上层液合并回收溶剂。

C.脱胶将步骤B的下层液加入二氯甲烷，下层液∶二氯甲烷＝1∶1(V/V)，搅拌15分钟，静置30分钟，弃去下层胶状或絮状沉淀物，得混合液。

D.反萃取将步骤C的混合液加入含1％NaCl的水，搅拌20分钟，静置60分钟，弃去上层液，混合液∶盐水＝1∶1(V/V)；下层液中分两次再加入甲醇及盐水，每次搅拌20分钟，静置60分钟，弃去上层液，下层液∶甲醇∶盐水＝1∶1∶1(V/V/V)，得下层有机相。

E.浓缩将步骤C的下层有机相于60℃减压浓缩回收有机溶剂，得到含紫杉醇1.5％以上的浸膏。

F.制料将步骤E所得浸膏加丙酮溶解，加入吸附剂，紫杉醇净含量∶吸附剂＝1∶200(W/W)，在60℃减压浓缩至干。吸附剂为活性炭\硅藻土\活性白土\硅胶\氧化铝\离子交换树脂\吸附树脂等，优选硅胶。

G.一次固-液色谱分离将步骤F制好的物料装入预柱，自由沉降压实。将预柱与分离柱串联，用极性溶剂及弱极性溶剂的混合液进行梯度洗脱，洗脱收集液通过TLC及HPLC检测进行分段处理。洗脱梯度为极性溶剂∶弱极性溶剂＝10∶90～100∶0的阶梯梯度。上述极性溶剂为甲醇\乙醇\异丙醇\乙腈\叔丁醇\丙酮\乙酸乙酯，优选乙酸乙酯。上述弱极性溶剂为氯仿\四氯化碳\二氯甲烷\1，2-二氯乙烷\石油醚\正己烷\环己烷\6号溶剂油等，优选正己烷。上述预柱为300mm直径×1000mm长度的不锈钢或玻璃柱；上述分离柱为200mm直径×2000mm长度的不锈钢或玻璃柱，柱内为硅胶或氧化铝，优选硅胶。

H.再制料将步骤G所得富含紫杉醇段的收集液，加入吸附剂，紫杉醇净含量∶吸附剂＝1∶200(W/V)，在60℃减压浓缩。吸附剂为活性炭\活性白土\硅胶\氧化铝\离子交换树脂\吸附树脂等，优选吸附树脂。

I.二次固-液色谱分离将步骤H制好的物料装入预柱，自由沉降压实。将预柱与分离柱串联，用极性溶剂及水的混合液进行梯度洗脱，洗脱收集液通过TLC及HPLC检测进行分段处理。洗脱梯度为极性溶剂∶水＝40∶60～100∶0的阶梯梯度。上述极性溶剂为甲醇\乙醇\异丙醇\乙腈\叔丁醇\丙酮，优选丙酮。上述预柱为300mm直径×1000mm长度的不锈钢或玻璃柱；上述分离柱为200mm直径×2000mm长度的不锈钢或玻璃柱，柱内为键合十八烷基填料或以硅胶\氧化锆为基质包覆聚苯乙烯\聚苯乙烯-二乙烯基苯\聚丁二烯\聚丙烯酸酯\聚丙烯腈\聚环氧乙烷\聚醚\聚丙烯酰胺等的填料，优选硅胶\氧化锆为基质包覆聚丙烯酸酯。

J.结晶将步骤I所得富含紫杉醇段的收集液于60℃减压浓缩，静置12小时，过滤，得一次结晶。

K.重结晶将步骤J所得一次结晶加丙酮溶解，溶解液浓度为8g/L，搅拌加入二氯甲烷，搅拌陈化4小时，过滤，滤液中搅拌加入正己烷，搅拌陈化8小时，过滤，得重结晶滤饼。丙酮∶二氯甲烷∶正己烷＝1∶1∶7(V/V/V)。

L.干燥将步骤K所得重结晶滤饼在60℃温度减压干燥得到高纯度的紫杉醇精品，纯度大于99％，直接收率大于70％。

M.将步骤I所得低含紫杉醇段的收集液及步骤J、K所得回收母液减压浓缩，重复步骤F～L，继续得到高纯度的紫杉醇精品，纯度大于99％，总收率大于85％。

附图说明附图1为本发明提取过程工艺流程图；附图2为本发明精制过程工艺流程图；附图3为本发明的预柱与分离柱的连接示意图。

具体实施方式

实施例1：1.前处理取云南红豆杉树皮400kg，含紫杉醇为0.016％用甲醇2800L，三级浸提，提取液浓缩至480L，用480L的正己烷进行二级脱脂；用480L二氯甲烷，按甲醇∶二氯甲烷∶1％盐水＝1∶1∶1(V/V/V)的比例，连续三次反萃取，将下层有机相浓缩得膏状物2.6kg，经HPLC检测紫杉醇含量为2.2％。

2.制料将步骤1所得紫杉醇浸膏2.6Kg，加丙酮溶解，加入硅胶11Kg，在60℃减压浓缩至干。

3.洗脱将步骤2制好的物料装入预柱，自由沉降压实。将预柱与分离柱串联，洗脱梯度为乙酸乙酯∶正己烷＝10∶90～100∶0的阶梯梯度。上述预柱为300mm直径×1000mm长度的不锈钢柱；上述分离柱为200mm直径×2000mm长度的不锈钢柱，柱内为硅胶。

4.再制料将步骤3所得富含紫杉醇段的收集液，加入硅藻土11Kg，在60℃减压浓缩至干。

5.二次固-液色谱分离将步骤4制好的物料装入预柱，自由沉降压实。将预柱与分离柱串联，洗脱梯度为丙酮∶水＝40∶60～100∶0的阶梯梯度。上述预柱为300mm直径×1000mm长度的不锈钢柱；上述分离柱为200mm直径×2000mm长度的不锈钢柱，柱内为硅胶基质包覆\聚丙烯酸酯填料。

6.结晶将步骤5所得富含紫杉醇段的收集液于60℃减压浓缩，静置12小时，过滤，得一次结晶。将一次结晶加丙酮溶解，溶解液浓度为8g/L，搅拌加入二氯甲烷，搅拌陈化4小时，过滤，滤液中搅拌加入正己烷，搅拌陈化8小时，过滤，得重结晶滤饼。丙酮∶二氯甲烷∶正己烷＝1∶1∶7(V/V/V)。

7.干燥将步骤6所得重结晶滤饼在60℃温度减压干燥得到高纯度的紫杉醇精品49.9g，纯度99.6％，直接收率77.9％。

实施例2 以人工种植Media红豆杉枝叶400kg，含紫杉醇为0.025％，其工艺过程完全与实施例1相同，所得紫杉醇精品99.70％，直接收率75％。

Claims

1.本发明采用紫杉醇含量大于万分之一的红豆杉枝叶或树皮为原料，经过浸提、脱脂、脱胶后得到含量大于百分之一点五的浸膏。将浸膏用溶剂溶解，加入吸附剂混合浓缩吸附，采用工业固-液相柱色谱分离技术，用极性、弱极性溶剂或混合溶剂洗脱，分段除去与紫杉醇极性不同的杂质，将富含紫杉醇段经过浓缩、结晶、真空干燥后得到高纯度的紫杉醇精品。其工艺步骤详述如下：

A.提取将红豆杉枝叶或树皮阴干，粉碎过5mm直径筛，分三次加入浸提液进行三级间歇浸提，粉碎原料∶浸提液＝1∶7(W/V)。其中第三级浸提液用作下批投料时的一级浸提液。第一、二级浸提液合并浓缩，得到浓缩液，有机溶剂回收利用。

B.脱酯将步骤A产生的浓缩液分两次加入脱脂液进行二级间歇脱脂，浓缩液∶脱脂液＝1∶1(V/V)。搅拌20分钟，静置60分钟，弃去下层胶状或絮状沉淀物，收集下层液，上层液合并回收溶剂。

D.反萃取将步骤C的混合液加入含1％NaCl的水，搅拌20分钟，静置60分钟，弃去上层液，混合液∶盐水＝1∶1(V/V)；下层液中分两次再加入甲醇及盐水，下层液∶甲醇∶盐水＝1∶1∶1(V/V/V)，每次搅拌20分钟，静置60分钟，弃去上层液，得下层有机相。

F.制料将步骤E所得浸膏加丙酮溶解，加入吸附剂，紫杉醇净含量∶吸附剂＝1∶200(W/W)，在60℃减压浓缩至干。

G.一次固-液色谱分离将步骤F制好的物料装入预柱，自由沉降压实。将预柱与分离柱串联，用极性溶剂及弱极性溶剂的混合液进行梯度洗脱，洗脱收集液通过TLC及HPLC检测进行分段处理。

H.再制料将步骤G所得富含紫杉醇段的收集液，加入吸附剂，紫杉醇净含量∶吸附剂＝1∶200(W/V)，在60℃减压浓缩。

I.二次固-液色谱分离将步骤H制好的物料装入预柱，自由沉降压实。将预柱与分离柱串联，用极性溶剂及水的混合液进行梯度洗脱，洗脱收集液通过TLC及HPLC检测进行分段处理。洗脱梯度为极性溶剂∶水＝40∶60～100∶0的阶梯梯度。上述预柱为300mm直径×1000mm长度的不锈钢或玻璃柱；上述分离柱为200mm直径×2000mm长度的不锈钢或玻璃柱。

2.权利要求1所指红豆杉是指各种天然红豆杉及人工种植的红豆杉。

3.权利要求1之步骤A所述浸提液为甲醇\乙醇，优选甲醇。

4.权利要求1之步骤B采用甲醇与脱脂液两相分配脱脂，不加水。所述脱脂液为石油醚\正己烷\环己烷\6号溶剂油等，优选石油醚。

5.权利要求1之步骤C采用甲醇与二氯甲烷混合脱胶，不加水。

6.权利要求1之步骤D采用1％浓度的盐水反萃取。

7.权利要求1之步骤F所述吸附剂为活性炭\硅藻土\活性白土\硅胶\氧化铝\离子交换树脂\吸附树脂等，优选硅胶。

8.权利要求1之步骤H所述吸附剂为活性炭\硅藻土\活性白土\硅胶\氧化铝\离子交换树脂\吸附树脂等，优选吸附树脂。

9.权利要求1之步骤I所述极性溶剂为甲醇\乙醇\异丙醇\乙腈\叔丁醇\丙酮，优选丙酮。

10.权利要求1之步骤I所述分离柱内填料为键合十八烷基填料或以硅胶\氧化锆为基质包覆聚苯乙烯\聚苯乙烯-二乙烯基苯\聚丁二烯\聚丙烯酸酯\聚丙烯腈\聚环氧乙烷\聚醚\聚丙烯酰胺等的填料，优选硅胶\氧化锆为基质包覆聚丙烯酸酯。

11.权利要求1之步骤J所述重结晶步骤为将一次结晶加丙酮溶解，搅拌加入二氯甲烷，搅拌陈化4小时，过滤，滤液中搅拌加入正己烷，搅拌陈化8小时，过滤，得重结晶滤饼。

12.权利要求1之步骤J所述重结晶溶剂比例为丙酮∶二氯甲烷∶正己烷＝1∶1∶7(V/V/V)。