CN1678729A

CN1678729A - 具有多室的毛细管灌注生物反应器

Info

Publication number: CN1678729A
Application number: CNA038204894A
Authority: CN
Inventors: 约翰·P·威克思沃; 费朗茨·J·鲍德巴赫; 爱尔丝·波克; 尤金·里博福; 郑昌龙; 大卫·克里福; 费雷德里克·R·哈赛顿; 威廉·H·豪姆斯特; 查尔斯·P·林; 利萨·J·麦考丽; 兰德尔·S·瑞斯芮; 马克·斯萃姆雷
Original assignee: Vanderbilt University
Current assignee: Vanderbilt University
Priority date: 2002-08-27
Filing date: 2003-08-27
Publication date: 2005-10-05
Also published as: AU2003262906A8; US20110294202A1; US8129179B2; EP1546299A4; WO2004020341A2; WO2004020342A2; WO2004020590A2; AU2003268202A1; AU2003268201A8; EP1546299A2; EP1545750A2; CN1678731A; WO2004020573A1; WO2004020590A3; AU2003268200A1; US20060166354A1; AU2003268201A1; WO2004020341A3; EP1543101A4; EP1545750A4

Abstract

一种用于在液体介质中培养活细胞的生物反应器(1100)(见图2A1)。在本发明一个实施方式中，所述生物反应器(1100)包括一第一基片(1124)，其具有第一表面(1124a)、相对第二表面(1124b)和边缘。所述生物反应器(1100)进一步包括一第二基片(1121)，其具有第一表面(1121a)和相对第二表面(1121b)，界定了一带有底面(1121d)的腔体(1121c)，其中所述底面(1121d)位于所述第一表面(1121a)和所述第二表面(1121b)之间。所述第一基片(1124)的所述第一表面(1121a)被所述第二基片(1121)的所述第二表面(1121b)容纳，覆盖到所述腔(1121c)，从而形成用于接收细胞和液体介质的通道(1101)。在形成的所述生物反应器中，所述通道(1101)的尺寸设为允许细胞层在一生物相容涂层上生长和液体在所述通道(1101)中流动。所述液体的流动可被控制以向细胞层提供已知剪切力。所述液体的流动还可被进一步控制以在所述通道(1101)内提供一种模拟脉管空间的环境。

Description

具有多室的毛细管灌注生物反应器

本申请是由美国法人范德比尔特大学作为除美国外全部指定国的申请人，以及美国公民且居住在美国的约翰·P·威克思沃(John P.Wikswo)、弗朗茨·J·鲍德巴赫(Franz J.Baudenbacher)、爱尔丝·波克(AlesProkop)及尤金·里博福(Eugene LeBoeuf)作为美国的申请人，于2003年8月27日提出PCT国际专利申请。

本发明是在国防高级研究项目局和海军研究办公室授予基金拨款号N66001-01-C-8064的政府资助下完成的。本发明也是在国家健康研究院授予基金拨款号5R43 RR016124-02的政府资助下完成的。美国政府可以基于这些拨款资助对本发明享有一定权利。

在参考文献目录中引述了包括专利、专利申请和各种出版物在内的一些参考文献，并在本发明的说明中予以论述。这些参考文献的引述和/或论述仅为了阐明本发明的说明而提供的，并不是承认任何这些参考文献相对在此说明的本发明是现有技术。在下文的符号表示中，″[n]″表示在参考文献目录中第n个被引述的参考文献。例如，[¹¹]表示在参考文献目录中第11个被引述的参考文献，即Hu，W.S.and Aunins，J.G.，Large-ScaleMammalian Cell Culture，Curr.Opin.Biotechnol.，8，148-153，1997。

发明领域

本发明通常涉及一种用于培养和维持生物系统的装置及方法。本发明特别涉及一种装置和方法，其具有允许灌注液在扩散交换下流向组织细胞而没有细胞迁移的通路结构。另外，本发明涉及一种装置和方法，其能够培养和维持诸如原生动物等活微生物有机体。

本发明还涉及一种装置和方法，其用于诸如生物膜等细胞集合的动态分析。本发明特别涉及一种装置和方法，其用于测量生物膜对在生物膜不同深度的诸如化学应激物等物质的一个或多个动态流的响应。

本发明的一些实施方式包含了用于培养和维持诸如细胞或细胞集合等的生物系统且监测此生物系统代谢活性状态和对环境变化响应的装置和方法，其中各细胞代谢活性可以由特征时间来表征。该装置和方法特别包含多室生物反应器及使用其的方法。

本发明的一些其他实施方式包含了用于培养和维持诸如细胞或细胞集合等生物系统且监测此生物系统代谢活性状态和对环境变化响应的装置和方法，其中各细胞代谢活性可以由特征时间来表征。该装置和方法特别包含排置有用公共馈送线的数个室的生物反应器及使用其的方法。

本发明的某些另外的实例包含了用于培养和维持诸如细胞或细胞集合等的生物系统且监测此生物系统代谢活性状态和对环境变化响应的装置和方法，其中各细胞代谢活性可以由特征时间来表征。该装置和方法特别包含毛细管灌注的生物反应器及使用其的方法。

本发明的一些进一步的实施方式包含了用于培养和维持诸如细胞或细胞集合等的生物系统且监测此生物系统代谢活性状态和对环境变化响应的装置和方法，其中各细胞代谢活性可以由特征时间来表征。该装置和方法特别包含有物质注射能力的生物反应器及使用其的方法。

发明背景技术

生物反应器是能用于培养活细胞的一种设备。生物反应器特别是能提供适当物理和化学环境，及快速传送底物和产物以使细胞生物反应理想地快速有效地发生的容器。最简单的生物反应器是培养皿：在常规的利用孔板、培养皿和烧瓶的细胞培养中，典型地培养基容量为细胞容量的200至1000倍。当结合使用培养基缓冲时，这个比率允许细胞在不改变介质的情况下生长至少24小时。然而，这个比率的另一个结果是细胞产生的任何细胞外因子及其另外提供的旁分泌细胞至细胞交流的相应稀释减弱，而这在组织中是可能的，因为细胞外容量可能仅是细胞内容量的10％。

生物反应器的发展多定向在功能性组织或生物化学品和药品的生成。例如，最近20年在皮肤、胰腺、软骨、肝脏、角膜和膀胱生成上的研究具有特殊重要性¹。仅在美国，就有超过80,000人在等待器官移植，因此发展改进生物反应器技术的需要是不言而喻的。人们也逐渐认识到，在了解细胞运动和趋化信号发出以及其它复杂细胞过程上的进步往往被可用于在过程中观察和在不同点干预的实验技术所束缚。许多这些过程能够在适当装备的生物反应器中得到很好地检测。

生物反应器有广泛的种类，包括搅拌容器、泡罩塔式反应器、填充床反应器²、气升式反应器、及包括板、旋转台、螺旋缠绕及中空的纤维的膜反应器³。中空纤维反应器特别重要，因为(取决于其结构)它们可以允许每立方米模块容量的膜面积多达30,000平方米^4-6。然而，假设哺乳动物的细胞对于剪切力非常敏感^7-9(其主要由搅动和通气引起)，在细胞生长的反应器中尽可能减小该力是很重要的^9，10。膜已用于生物反应器中以增加细胞存活。例如，众所周知在一些反应器模型中产生的液气相界面对哺乳动物细胞显著有害。这个潜在的致命界面能通过使用疏水膜来消除⁹。

生物反应器也可以按它们操作模式分类：分批式、流加式和连续式培养(也称为灌注式培养)。在第一或分批模式中，不添加培养基，也不移除介质；在流加模式的情况下，连续进料但不移除任何东西直到反应结束且反应器放空。这些系统用于过程控制效果微弱，与灌注式体系相比其生产率低，在这第三种模式中培养基持续流入且介质持续流出。除了高的生产率外，在这类反应器¹¹中还有较好的细胞生理学控制，且在哺乳动物细胞培养情况下也已显示出比静态方法明显更有优势^12，13。

当培养大的三维组织时一个局限性是缺少用于营养物和代谢物传送的适当的维管联结。大量的研究已经分析了人造维管网^14-18，并且对构造功能性微制支架(microfabricated scaffolds)已有大量尝试^{3，16，19-21}。已生产这些网络的技术包括等离子蚀刻、光刻蚀、软刻蚀、微接触印刷、使用微通道的微流成型、层流成型和模版成型^22-25。在等离子蚀刻技术中，我们可以认为高深宽比微加工技术(High Aspect Ratio Micromachining，HARMS)是一个强有力的工具，因为其允许蚀刻实际上无限深的通道而不会增加已经由刻蚀得到的宽度²²。它也可以在PDMS中用综合拓扑学和几何学构造三维微通道系统¹⁵。

另外，需要认识到临床可移植组织的培养要求最终生物降解和组织支架的机械性能¹⁶。这些性能直接涉及到选择构成组织的材料的结晶度、分子量、玻璃化转变温度和单体疏水性⁹。已经使用了诸如胶原质等自然衍生的原料²⁶，以及合成的和半合成的材料。聚羟基乙酸(PGA)具有高多孔性且可以使装置构成容易，因此PGA纤维网孔被考虑用于移植细胞。然而，它们不能抵抗重大的压缩力。解决这个问题可选择的办法是用乳酸和羟基乙酸的聚合物，可以调整其比率以控制材料的结晶性从而控制降解速率和机械性能。已经由这些聚合物构制成纤维基管²⁷。

用由现有的微制细胞灌注生物反应器(microfabricated cell-perfusionbioreactor)系统提供的性能比较活组织维管性能是重要的。在组织中，动脉渐渐分成较小维管，最后到达细动脉然后是毛细管。细动脉很重要，因为它们包含前毛细血管括约肌，其可控制各毛细血管床的灌注，还提供大多个外周阻力从而提供与动脉供应关联的压降。结果，穿过毛细血管内皮膜的压差保持足够低以允许营养物和代谢物扩散传送过膜，以及组织维持和控制感染所需的免疫细胞的放行。如果毛细管中的压力与细动脉中压力一样高，毛细管壁厚度会太大以至不能允许这些重要的迁移现象。虽然压力较低，在许多方面静脉回流系统就象上动脉系统的镜面。活的维管系统的另一特征是上述的分流过程允许所有细胞在50-200微米的毛细管中，取决于特定的组织。结果，动脉供给和静脉回流系统是如此设置，以使每个灌注了大量细胞的毛细管与较大的供给和回流系统相连接，其有自相似性以确保相同灌注和通过毛细管压力。这个设置过程是很难用微制造技术(microfabrication)来复制的。例如，鲍仁斯坦(Borenstein)等人²²所描述的建立两维空间维管系统的过程，其建立一个多尺度灌注系统用于维持内皮细胞，但是没有提供穿过最小毛细管的选择性限定扩散传送以灌注位于灌注网络外侧的细胞。更重要的是，他们所展示的网络有很大的装置区域，其被大的器皿覆盖，且限定于毛细血管的生物反应器的区域实际上很小。

因此，对于微制迁移生物反应器(microfabricated migration bioreactor)有要求，模仿体外正常组织微环境与瘤、感染组织及创伤组织的微环境一样好，同时提供化学激素(chemokine)和生长因子梯度、剪切力、细胞灌注及物理屏障对细胞迁移渗透性的独立控制，因此当细胞迁移、内渗、外渗和血管生成时，允许对正常、免疫、及癌细胞进行详细的光学和电化学观测。血管生成、瘤转移及白细胞浸润入组织是复杂的过程，不仅通过对单一化学激素的细胞响应来调节，也能由外部因素，例如多重竞争化学激素和生长因子信号，自分泌反馈环、细胞-细胞相互作用及诸如脉管剪应力等机械力来调节。目前评价穿过细胞屏障的迁移的方法包括博伊德(Boyden)小室和侵袭(transwell)小室，其提供穿过过滤器迁移的综合荧光分析以进行迁移测定^28-34，平行板流动室^35-38，其中可以被评价在剪应力下在内皮细胞上的粘着和旋转^35，39-44，以及体外活体镜检法，其观测活的动物中的细胞迁移^45-48。这些方法每个都有局限性，包括无法维持和控制趋化梯度(全部体系)，无法实时或在生理剪应力下观测迁移(博伊德小室和侵袭小室)，无法观测下面深的细胞基质(平行板流动室)中外渗或血管生成，以及无法控制实验的所有方面，例如限定细胞密度和控制微流控技术(microfluidics)用于独立控制剪切和组织灌注(全部体系，特别是活体镜检法)。发展移动/转移模型体系独立控制内皮切应力、化学激素梯度、组织灌注及通过不同端口加不同细胞类型的能力，再结合艺术成像技术和传感器性能，将代表超过现有可用系统的巨大前进。

当然，对于这种性能需要是非常急迫的。血管生成是一个动态过程，受细胞微环境的影响并与迁移有联系。已经证明VEGF和血管生成素/酪氨酸激酶(Ang/Tie2)功能对于瘤血管生成^51-53是必需的。然而，来自这两个受体体系的信号如何被整合以调节血管生成并没有确定，部分由于缺乏好的模型体系。下一步应研究在内皮细胞迁移、血管芽生和成熟、及瘤穿过内皮迁移中VEGF和血管紧张素信号的协调和整合。随着血管生成、多重环境输入影响了瘤转移和白细胞浸润。瘤细胞中一化学激素受体的激活影响瘤细胞中其他配体和受体的感应，同样内皮细胞和白细胞也一样，但是这个机制很少被了解⁵⁴。

需要了解在瘤细胞移动通过复合基质时化学激素受体内化变化和/或与接合体分子例如AP-2或β阻止因子(beta-arresting)关联受体的变化如何影响化学激素受体活性。外部因素例如细胞-细胞粘着力、细胞-基质交互作用、及脉管剪应力在移动通过组织期间如何影响细胞骨架重组也是很少被了解的。肌动蛋白结合蛋白(cortactin)过度表达增加了乳癌细胞向骨骼的转移⁵⁵，然而该机制仍不清楚。同样地，人类WASp蛋白的缺乏会导致伴性的免疫紊乱，其由信令、增生或趋化性缺陷产生⁵⁶。需要研究在包括可控制剪切、细胞-细胞相互作用及化学激素梯度的复杂多细胞环境中肌动蛋白结合蛋白和WASp蛋白在乳癌和HL60细胞的趋化中的作用。作为最后的例子，基质金属蛋白酶(MMPS)是可以在多种类型癌中找到的细胞外表达的酶，且被认为在肿瘤发生、生长、侵袭和转移中很重要。最近发现发生在缺乏MMP-3的老鼠(MMP-3缺乏老鼠)中的皮肤瘤发育和生长快于正常、野生型老鼠的皮肤瘤。这个差异与在MMP-3缺乏老鼠的瘤和周围组织中免疫细胞数量减少相关联。这个研究的合理进展是确定失去MMP如何影响免疫细胞的能力，即单核细胞和中性白细胞从外周血液循环侵润到肿瘤位置。控制实验环境的能力，包括多重限定细胞密度，对于阐明在MMP-3诱导细胞趋化中肿瘤-宿主相互作用的相对重要性是很关键的。

尽管这些年取得了进步，但是，现在可用的生物反应器不能提供更多生理性的环境，其包括多细胞型态的体外三维区域、刺激物及测量能力，并且允许对趋化反应的分子研究。因此，很需要开发体外模仿瘤和组织的微环境，同时提供化学激素和生长因子梯度、剪切力、细胞灌注及物理屏障对细胞迁移渗透性的独立控制，因此当细胞迁移、内渗、外渗和血管生成时，允许对正常和癌细胞进行详细的光学和电化学观测的生物反应器。

因此现有技术中存在这种迄今未解决的需求表明了上述缺陷和不足。

发明概述

一方面，本发明涉及用于在液体介质中培养活细胞的生物反应器。在一个实施例中，所述生物反应器包括具有一第一表面和一相对的第二表面和边缘的第一基片。所述生物反应器进一步包括具有一第一表面和一相对的第二表面的一第二基片，其界定具有一底面的一腔体，其中所述的底面位于所述的第一表面和所述的第二表面之间。所述的第一基片的所述第一表面被所述的第二基片的所述第二表面容纳，覆盖到所述腔体上，从而形成用于接收细胞和液体介质的一通道。所述第二基片由玻璃、聚脂薄膜、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、硅、聚合物、半导体、或它们的任何组合所构成。所述第一基片是至少部分地光学透明的，从而所述通道中细胞的动态活性可通过光学检测的方法检测。

一凹槽在所述第二基片内形成，其具有一底面并可与所述通道进行流体传送。此外，设置一屏障用于覆盖所述凹槽从而形成一外室。所述屏障具有多孔性以便允许所述通道和所述外室进行流体传送，并控制至少一个预定类型的细胞在所述通道和所述外室之间移动。在一个实施例中，所述屏障包括多个柱体(post)，彼此被间隙间隔开。所述柱体在一些位置上可以涂上物质，以阻止细胞，特别是内皮细胞进入。在一些位置上所述柱体之间的间隙允许特殊细胞类型被传送到所述外室。

第二基片进一步界定一第一孔和一相对的第二孔，其适合允许液体流基本沿一第一方向，通过所述第一孔导进所述通道，并通过所述第二孔导离所述通道。

所述生物反应器进一步包括一生物相容涂层施于所述通道周围的所述第二基片的内表面。所述的生物相容涂层包含可以抑制细胞粘着于所述生物相容涂层、增强细胞粘着于所述生物相容涂层、促进细胞构成和生长、或起荧光标记或细胞状态指示剂作用的材料。在形成所述生物反应器过程中，所述通道的尺寸以允许细胞层在所述生物相容涂层上生长及液体在所述通道中的流动为宜。液体的流动被控制，从而为细胞层提供已知的剪切力。液体的流动可以被进一步控制，从而在所述通道内提供一种模拟脉管空间的环境。

细胞可以是任何类型的活细胞，包括细菌、原生动物、或两者、常规细胞、内皮细胞、瘤细胞，或它们的任何组合，但所述细胞不限于此。细胞可以分别地、以细胞集合的方式、或以生物膜(biofilm)形式引入所述通道中。在一个实施例中，细胞层在所述通道中基本形成内皮细胞排列的毛细管。所述通道的尺寸设定以当至少一个细胞被引入所述通道时，可以在内皮细胞排列的毛细管中进行内渗为宜，其中所说的细胞不是内皮细胞之一，例如瘤细胞。

所述第二基片进一步界定一个或多个注射口，与所述通道进行流体传送以便允许物质流基本沿一第二方向，通过所述注射口分别引入所述通道中。所述第二方向与所述第一方向基本上是垂直的。所述物质流被控制，从而为所述通道提供一梯度。所述物质流动包括影响细胞生长的物质，如化学激素。

所述外室的尺寸设为允许一群细胞的生长为宜。一群细胞包括至少一第一类型细胞和一与所述第一类型细胞不同的第二类型细胞。换句话，所述外室的尺寸为允许两种类型细胞的生长为宜。在一个实施例中，第一类型细胞包括常规细胞，第二类型细胞包括瘤细胞。在所述第二基片内形成一端口和一连接通道，从而所述连接通道与所述外室和所述端口可进行流体传送。所述生物反应器进一步包括多个电极，其适合电气化学测量一群细胞。而且，所述生物反应器进一步包括多个控制端口，和多个连接通道，其中每个所述连接通道分别与相应的一个控制端口和所述外室进行流体传送。

所述生物反应器可以被用作毛细管灌注移动生物反应器(capillaryperfused migration bioreactor)，用于研究存在两个竞争的化学激素梯度下癌细胞或中性粒细胞外溢。特别地，一第一化学激素流通过一端口被注入，因此在所述外室和所述通道中产生一第一化学激素梯度。此外，一第二化学激素流通过一端口被注入，因此在所述外室和所述通道中产生第二化学激素梯度。

在另一方面，本发明涉及另一个类型的生物反应器以及变化形式，用于在液体媒介中培养活细胞。在一个实施例中，所述生物反应器包括具有一第一表面和一相对的第二表面的第一基片，其间界定用于接收细胞和液体媒介的一室。所述第一基片可以由玻璃、聚脂薄膜、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、硅、聚合物、半导体、或它们的任何组合所构成。

在所述第一基片内形成一入口和一第一连接通道，其中所述第一连接通道与所述入口和所述室进行流体传送，从而允许物质流被传送到所述室。此外，在所述第一基片内形成一出口和一第二连接通道，其中所述第二连接通道与所述出口和所述室进行流体传送，从而允许物质流从所述室移出。

而且，所述生物反应器具有限制装置，位于所述室的一区域内，接近所述第一连接通道，以限制细胞。在一个实施例中，所述限制装置包括多个阱，其中多个阱中的每一个能够接收至少一细胞或一细胞集合。多个阱中的每一个包括界定一凹槽的一结构，从而在其中接收和限制一或多个细胞。该结构可以部分的由过滤器形成，以允许所述凹槽与所述室进行流体传送。所述过滤器可以由多个彼此由间隙g分隔开的柱体形成。阱可以具有各种形状和不同的物理特性。所述多个阱可以被排列为阵列。

此外，所述第一基片界定一第一备用端口和一第三连接通道，其与所述第一备用端口和所述第一连接通道进行流体传送，从而允许另外的物质可被引入所述室。而且，所述第一基片进一步界定一第二备用端口、一第三连接通道，以及一第二室，其中所述第三连接通道与第二备用端口和所述第二室进行流体传送，所述第二室与所述第一连接通道进行流体传送。而且，所述第二室由可透氧结构形成，从而为细胞提供氧气。

所述生物反应器进一步包括具有一第一表面和一相对的第二表面的一第二基片，以及适合电气化学测量所述室中细胞的装置。所述用于电气化学测量的装置相对于所述第二基片的位置设定，以使当所述第二基片的所述第一表面被所述第一基片的所述第二表面容纳时，所述用于电气化学测量的装置位于相应的测量位置为宜。所述用于电气化学测量的装置包括至少一个电极监视细胞进入所述室，至少一个电极监视细胞离开所述室，以及多个电极检测所述室中各种化学物质。

所述生物反应器进一步包括具有一第一表面和一相对的第二表面的一第三基片，以及适合光学测量的装置。所述用于光学测量的装置相对于所述第三基片的位置设定，以使当所述第三基片的所述第一表面被所述第一基片的所述第二表面容纳时，所述用于光学测量的装置位于相应的测量位置为宜。所述用于光学测量的装置包括多个光学传感器，其放置的设定以检测所述室内的化学物质和生物物种以及所述室内细胞的生理状态为宜。所述第三基片至少是部分地透明。

在又一个方面，本发明涉及有创造性的生物反应器及其变化形式。在一个实施例中，所述生物反应器包括具有一第一表面和一相对的第二表面的一第一基片，其间界定一室，用于接收细胞和液体媒介。所述第一基片可以由玻璃、聚脂薄膜、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、硅、聚合物、半导体、或它们的任何组合所构成。所述生物反应器进一步包括一第二基片，其尺寸以使当所述第二基片被所述第一基片容纳时所述室被覆盖为宜。

在所述第一基片内形成一入口和一第一连接通道，其中所述第一连接通道与所述入口和所述室进行流体传送，从而允许物质流被传送到所述室。

此外，在所述第一基片内形成一出口和一第二连接通道，其中所述第二连接通道与所述出口和所述室进行流体传送，从而允许物质流从所述室移出。

所述生物反应器进一步具有限制装置，其位于所述室中形成限制区域以限制那里的细胞。在一个实施例中，所述限制装置包括一第一过滤器和一第二过滤器，其中所述第一过滤器位于接近所述第一连接通道的位置，所述第二过滤器位于接近所述第二连接通道的位置，并且所述第一过滤器和所述第二过滤器彼此基本平行。所述第一过滤器和所述第二过滤器中的每一个包括多个彼此分隔的柱体，不允许细胞通过。相邻两个柱体间的距离可以不同。

所述第一基片进一步界定一第一备用端口和一第三连接通道，其与所述第一备用端口和所述室的所述限制区域进行流体传送，从而允许种子细胞(seed cell)只在所述室的所述限制区域外灌注。

所述生物反应器进一步包括一个或多个支撑单元，位于所述室的所述限制区域外，以支撑所述第二基片。此外，所述生物反应器进一步包括至少一个支撑单元，位于所述室的所述限制区域内部，以支撑所述第二基片。应该指出所述室由所述室的侧壁形成，其在所述连接通道与所述室的交叉处逐渐变细，分别形成倾角α和闭合角度β，其中α优选处于与垂直线大约10-45°范围内，β优选处于大约30-80°范围内，以减小锐角转角产生的剪切力。

再一个方面，本发明涉及另一个有创造性的生物反应器及其变化形式。在一个实施例中，所述生物反应器包括具有一第一表面和一相对的第二表面的一第一基片，其间界定用于接收第一类型细胞和液体介质的一第一室。在所述第一基片内形成一个或多个第二室，以接收第二类型细胞和液体介质。而且在所述第一基片内形成一个或多个连接通道，其中每个连接通道与相应第二室和所述第一室进行流体传送，从而允许所述第一类型细胞和所述第二类型细胞彼此互相作用。例如，连接通道与相应第二室和所述第一室进行流体传送。所述第一类型细胞包括原生动物，所述第二类型细胞包括细菌。

所述连接通道的形成以允许原生动物在其中移动为宜。然而，可以使用多种结构可以用来限制原生动物的移动性，以便进行不同的应用。例如，可以使用尺寸限制或排除柱体以限制原生动物的移动性，其可以被用于评价原生动物的移动性。可选地，所述连接通道之一是如此形成的：其横截面尺寸可沿所述连接通道的长度而不同，这种通道可以用于限制原生动物的移动性，也可以被用于评价原生动物的移动性。此外，位于一连接通道内的一屏障可以被用于分离细菌和原生动物，其可以被用于评价原生动物的趋化性。

从以下优选实施例的描述，结合如下附图，将体现出本发明的这些及其它方面，然而其变化和改进可能仍未脱离本发明公开新颖性内容的精神和范围。

附图说明

图1A1-3是显示了依照本发明一个实施例的生物反应器的示意图：1A1，顶部横截面图；1A2，横向横截面图；以及1A3，侧部横截面图。

图1B是显示依照本发明另一实施例的生物反应器的顶部横截面图。

图1C是显示依照本发明又一实施例的生物反应器的顶部横截面图。

图1D是显示依照本发明再一实施例的生物反应器的顶部横截面图。

图2A1-2是显示了依照本发明一个实施例的具有多个阱的生物反应器的示意图：2A1，透视图；以及2A2，透视分解图。

图2B是显示了依照本发明另一个实施例的具有多个阱的生物反应器的透视图。

图2C是显示了依照本发明一个实施例的具有限制区域的生物反应器的顶部横截面图。

图2D是显示了依照本发明另一个实施例的具有限制区域的生物反应器的顶部横截面图。

图2E是显示了依照本发明又一个实施例的具有限制区域的生物反应器的顶部横截面图。

图2F是显示了依照本发明再一个实施例的具有限制区域的生物反应器的顶部横截面图。

图2G是显示了依照本发明一个实施例的具有多个阱的生物反应器的顶部横截面图。

图2H是显示了依照本发明另一个实施例的具有多个阱的生物反应器的顶部横截面图。

图2I是显示了依照本发明又一个实施例的具有多个阱的生物反应器的顶部横截面图。

图3A-D是显示了依照本发明一个实施例的具有多个室的生物反应器的顶部横截面图。

发明详述

现在详细描述本发明的不同实施例。关于附图，除非在文中清楚指示其它，附图中相同的部分始终用相同的数字标记标示。在这里和如下全部权利要求描述中的所使用的，“一”和“所述的”的意思包括多个，除非在文中清楚的指示其它含义。而且在这里和如下全部权利要求描述中所使用的“在……中”包括“在……中”和“在……上”，除非在文中清楚的指示其它含义。另外，在本说明书中所使用的一些术语在以下明确定义。

定义

在本发明内容中，本说明书中所使用的术语一般在现有技术中，以及每个术语使用在特定内容处，是有通常含义。例如，依照本发明可以使用在分子生物学、微生物学和重组基因技术的常规技术。这些技术和相关术语的含义在文献中被充分解释。参见，例如Sambrook，Fitsch & Maniatis.Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Second Edition(1989)Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York(此处查阅″SAMBROOK ET AL.，1989″)；DNA CLONING：A PRACTICALAPPROACH，VOLUMES I AND II(D.N.Glover ed.1985)；OligonucleotideSynthesis(M.J.Gait ed.1984)；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames & S.J.Higgins，eds.1984)；Animal Cell Culture(R.I.Freshney，ed.1986)；Immobilized Cells and Enzymes(IRL Press，1986)；B.E.Perbal，A PracticalGuide to Molecular Cloning(1984)；F.M.Ausubel et al.(eds.)，CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，Inc.(1994)。也可见，PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications，Innis et al.，eds.，Academic Press，Inc.，New York(1990)；Saiki et al.，Science 1998，239：487；and PCR Technology：Principles and Applications for DNA Amplification，H.Erlich，Ed.，Stockton Press。

用于描述本发明的某些术语将在以下或说明书其它位置论述，以给专业人员在描述本发明设备和方法及如何制造和使用它们时提供附加指导。为方便起见，某些术语被突出了，例如使用斜体字和/或引号标记。突出的使用对术语的范围和含义没有影响；术语的范围和含义在相同语境中相同，无论其是否被突出。应意识到同一东西可能用多于一个的方式叙述。因此，可选择的语言和同义词可以用于任何一个或多个在此论述的术语，无论术语是否在此详细阐述或论述都没有被赋予任何特定意义。某些术语提供了同义词。一个或多个同义词的叙述不排除使用其它同义词。在这个说明书中无论何处使用例子包括在此论述的任何术语的例子，仅是例证性的，且决不是限制本发明或任何示例术语的范围和含义。同样地，本发明不受在此说明书中给出的各种实施例的限制。

这里所用的“大约”或“近似地”一般意味在给出值或范围的20％以内，优选在10％以内，且更优选在5％以内。这里给出的数字数量是近似的，如果没有特别说明，其意味术语“大约”或“近似地”能够被推断出。

术语“分子”意味任何包含一个或多个原子的、清楚或可识别的物质结构单元，且包括例如多肽和多聚核苷酸。

这里所用的“细胞”意味着任何细胞，以及病毒或任何其他具有微观尺寸的质粒，例如与生物细胞尺寸类似的大小，且包括任何原核生物或真核生物的细胞，如细菌、真菌、植物和动物细胞。细胞典型为球形，但也可以是细长的、扁平的、可变形的和不对称的，例如非球形。一个细胞的尺寸或直径典型的范围在大约0.1至120微米，且典型为从大约1至50微米。细胞可以是活的或死的。如这里所用的，细胞一般为活的除非另外说明。如这里所用的，细胞可以是带电的或非带电的。例如，带电颗粒可以被用于促进流动或探测，或者作为指示剂。活的或死的生物细胞可以带电，例如通过使用表面活性剂，如SDS(十二烷基硫酸钠)。细胞或多个细胞也可以包含细胞系。细胞系的例子包括肝脏细胞，巨噬细胞，成神经细胞瘤细胞，内皮细胞，肠细胞，杂交瘤、CHO、纤维原细胞细胞系、红血球、电应激细胞(electrically excitable cells)，例如心脏细胞，肌细胞(AT1细胞)，共培养生长细胞，NG108-15细胞(广泛用于成神经细胞瘤X神经胶质瘤杂交细胞系，ATCC#HB-12317)，初生神经元，由动物新生仔心室或心房分离出的初生心脏肌细胞，AT-1心房瘤心脏细胞，肝脏细胞也称为肝细胞，分泌细胞(去极化且它分泌东西)胰腺β细胞分泌胰岛素，HELA细胞(Helen Lane)，HEK293人上皮肾细胞，红细胞(初生红血球)，淋巴细胞等等。每个细胞系可以包括一种或多种相同或不同的细胞。例如，肝脏细胞包含人肝细胞癌(″HEPG2″)细胞、CCL-13细胞和H4IIE细胞中的至少一种，巨噬细胞包括外周血单核细胞(″PBMC″)、和皮肤纤维细胞中的至少一种，成神经细胞瘤细胞包含U937细胞，内皮细胞包含人脐静脉内皮细胞(″Huv-ec-c″)，且肠细胞包含CCL-6细胞。

“培养”意味在可控制的人工环境中活细胞的生长。它可是微生物培养，如细菌，或动物或植物细胞之一的培养，如组织培养。依照本发明所述的生物反应器可用于这两种培养或更多的培养类型。培养要求适当养料和能量来源，其由培养基提供，以及适当的物理环境。组织培养自身可以成为用于病毒的培养基，其仅与活细胞生长。仅一种细胞的培养被称为纯培养，其不同于混合或污染培养。

“组织”意味形态和机能或多或少相似的细胞的集合。动物体由四个初级组织组成，即上皮细胞、结缔组织(包括骨胳、软组织和血液)、肌肉和神经组织。组织分化和成熟过程被称为组织发生。

“传感器”广义定义为能够测量可测量性质的任何仪器。例如传感器可以是一热探测器、电探测器、化学探测器、光学探测器、离子探测器、生物探测器、放射性同位元素探测器、电化学探测器、辐射探测器、声学探测器、磁探测器、电容探测器、压力探测器、超声波探测器、红外线探测器、微波运动探测器、电波探测器、电眼、图像传感器、它们的任何组合等等。本发明中可以选择应用多种传感器。

术语“分析物”意味能由细胞消耗或生产的材料。感兴趣的分析物例子包括pH、钾、氧、乳酸盐、葡萄糖、抗坏血酸盐、5-羟色胺、多巴胺、铵、谷氨酸盐、嘌呤、钙、钠、钾、NADH、质子、胰岛素、NO(氧化氮)等等。

术语“流动”意味流体如液体或固体通过本发明装置或在本发明方法中的任何移动，且包括但不限于任何流体流，及与所述流、在所述流中或逆着所述流的任何材料，无论材料是否由所述流携带。例如分子或细胞通过本发明装置或在本发明方法中的移动，如在本发明的微流控芯片(microfluidic chip)上基片中通道的运动，包含流动。也就是，依照本发明，无论分子或细胞是否由流体流携带，或者无论分子或细胞是由一些其他直接或间接的力或驱动引起移动，及无论任何驱动力的性质是否是已知的或了解，也都包含流动。任何力的应用都可被用于产生流动，包括但不限于，压力、毛细管现象、电渗、电泳、双向电泳、光镊、及它们的组合，而不论任何特别的理论或作用机制，只要依照本发明分子或细胞可被导引来检验、测量或分类。

“液体或介质”是一流体，其可以包含一种或多种影响细胞生长的物质，一种或多种分析物、或任何它们的组合。介质可提供被一种或多种细胞消耗的一种或多种分析物。介质可以有由一种或多种细胞生成的一种或多种分析物。介质也可以同时有由一种或多种细胞消耗的一种或多种分析物和由一种或多种细胞生成的一种或多种分析物。介质可由天然材料组成，例如酶消化液、酵母或牛肉浸膏、牛奶、土豆片、或鸡胚胎。人造介质可依照特定配方由混合多种成份制备。复合介质包含至少一种来源于天然材料的原材料成分，因而有未知的化学组分。化学方法定义的或合成的介质有已知化学结构和每个组分含量。

“输入区”是接收分子或细胞或液体的生物反应器的一个区域。所述输入区可以包含入口和通道，井或贮藏器、开口、及可使分子或细胞进入设备的其他特征。如果需要，生物反应器可以包含多于一个的输入区。所述输入区与通道进行流体传送且由此为上游。

“输出区”是收集或分配分子或细胞或液体的生物反应器一个区域。输出区在识别区下游，且可以包含输出通道或出口。如果需要，生物反应器可包含多于一个的输出区。

“分析单元”是微制造基片，如微制芯片，其有至少一个输入区，至少一个通道和室，至少一个探测区及至少一个输出区。本发明设备可以包括多个分析单元。

“通道”是本发明生物反应器的路径，其允许分子或细胞流动以经过用于探测(识别)或测量的一探测区。所述探测和识别区可以位于或构成在通道内。所述通道典型地在入口或输入区进行流体传送，其允许分子或细胞或液体流动至通道内。所述通道也典型地在输出区或出口进行流体传送，其允许分子或细胞或液体流动至通道外。所述通道也能用作生长细胞的室，反之亦然。

“探测区”或“传感区”或“室”是生物反应器内的一区域，典型地与在通道内或与通道(或其中一部分)重合，和/或在探测环路中或与探测环路重合，生长、被识别、表征、杂交、测量、分析或维持(等等)的分子或细胞在此基于预定特性被检测。在一个实施例中，分子或细胞每次检测一个。在另一个实施例中，分子、细胞或样品被一起检测，例如按组、按排、快速、同时或同期连续或平行排列，或采用亲合色谱法。

“反应时间”是关注的体系需要响应变化的时间。例如，细胞反应时间是用于至少一个细胞生理过程适应或响应其环境变化所需要的时间。每种类型的细胞对于其环境中特定变化都有其自己的的特征反应时间。传感器反应时间是用于传感器响应其探测量变化所需要的时间。例如电化学传感器的反应时间由传感器大小及传感器活性表面保护涂层的厚度和性质确定。微流控体系(microfluidic system)反应时间通过对环境变化的细胞反应时间、化学物扩散过传感区所需时间、传感器反应时间和由驱动器控制的分析物扩散时间来决定。

“细菌”是非常小的—通常直径0.3-2.0微米—且相对简单的微生物，具有原核细胞类型结构。每个细菌细胞由有相似特征的已存在细胞分离，或通过两个这种细胞在有性过程中的结合而产生。

“原生动物”意味着传统动物界分出的一组真核微生物。尽管名称表示原始动物，一些原生动物(植物鞭毛虫和粘液菌)表现很多类似植物特性以证明他们是植物。原生动物尺寸范围从1至10⁶微米。鞭毛虫、纤毛虫和肉足纲是已知的群体。尽管生殖和体游动孢子的显著区别可以标记某些群体，如团藻，原生动物不产生组织和器官。

现在参考图1-3描述几个实施例，在图1-3中相同数字标记相同部分。

发明综述

本发明的发明人克服了现有技术中的缺陷，开发了新的生物反应器，除其他新颖性和创造性特征外，其能提供控制的化学激素梯度独立于灌注流动，并且允许细胞基质外渗。

将近来在纳米滤层制作^57-61上的发展用于制造依照本发明的灌注-膜生物反应器，其在所说的设备中可控制的、稳定的化学激素或生长因子梯度的条件下，允许在1毫米×1毫米×100微米体积内在接近组织的密度下细胞混合培养生长，以模仿体内瘤微环境。

本发明的一个优点是可以构造定制设备以使分离的灌注和细胞输送系统允许在实验过程中独立控制剪应力和化学激素梯度。此外，光学和电化学代谢微传感器安置在这些生物反应器中，以允许在反应器选择区域同时定量局部代谢和化学环境(乳酸盐、pH、O₂等)，其间细胞移动或细胞信号发放事件可由荧光显微镜成像。因此，根据本发明所述生物反应器可以被认为是下一代移动生物反应器，其可越过简单的MTW系统(MicroTransWell)迈向那种更接近复制体外微环境活组织的体系。

此外，根据本发明的生物反应器应用微制造技术(microfabricationtechniques)、微流控(microfluidics)、及微生物传感器(microbiosensors)，给瘤血管生成及白细胞和癌细胞外渗的分子机制研究提供了机会。例如，在脉管形成和再造中Tie2和VEGF作用的系统检查及识别更多特定的用于抗血管生成治疗的分子靶标。类似的微设备模型(microdevice model)可以用于检查白细胞和癌细胞外渗。这些设备给寄主鼠瘤外植体提供了适当的细胞环境，因此潜在提供了用于瘤活组织检查材料的转移分析。这些生物反应器中的代谢传感将帮助提供对瘤微环境的更清楚了解和确定我们的体外系统的有效性^62-65。

另外，平面鲍仁斯坦(Borenstein)设计的局限性是可用的毛细管表面区太小以至于不支持细胞实际体积的增长，这点已被本发明克服，改进这个问题是建造一个多层插入供给和返回的生物反应器，其允许平面生物反应器全部表面被毛细管覆盖，及毛细管灌注的细胞。

更为明确的一方面，本发明涉及生物反应器。这些生物反应器是生物微电动机械式系统((BioMEMS)，其用作移动微环境以研究瘤血管生成、瘤转移和白细胞迁移的分子机制，也可起到更常规的组织生物反应器和灌注系统的作用。除其他方面外，这些微流控设备的一个独特方面是适当细胞培养和微制造技术的结合，其允许细胞在小的、限定的、很好灌注的体积组织密度下生长，提供多化学激素和生长因子梯度、剪切力、组织灌注、及物理屏蔽对细胞迁移渗透性的独立控制，并且允许在细胞移动、内渗、外渗、血管生成和其他细胞过程中对正常和癌细胞的细致的光学和电化学观测。

近来在纳米滤层(nanofilter)制作^57-61上的发展可用于实施本发明以提供灌注-膜生物反应器，其在设备中在可控制的、稳定的化学激素或生长因子梯度的条件下，允许在1毫米×1毫米×100微米体积内在接近组织的密度下细胞混合培养生长，以模仿体内瘤微环境。本发明的一个优点是可以构造定制设备以使分离的灌注和细胞输送系统允许在实验过程中独立控制剪应力和化学激素梯度。此外，光学和电化学代谢微传感器可安置在这些生物反应器中，以允许在反应器选择区域同时定量局部代谢和化学环境(乳酸盐、pH、O₂等)，其间细胞移动或细胞信号发放事件可由荧光显微镜成像。因此，移动生物反应器的下一代最终将越过简单MTW系统(MicroTransWell)迈向一个更接近复制体外微环境活组织的体系。

微制造技术、微流控和微生物传感器的应用，给瘤血管生成、及白细胞和癌细胞外渗的分子机制研究提供了机会。例如，在脉管形成和再造中Tie2和VEGF的作用的系统检查及可识别更多特定的用于抗血管生成治疗的分子靶标。类似的微设备模型可以用于检查白细胞和癌细胞外渗。这些生物反应器给寄主鼠瘤外植体提供了适当的细胞环境，因此潜在提供了用于瘤活检材料的转移分析。在这些生物反应器中代谢传感将帮助提供对瘤微环境的更清楚的认识并确定我们的体外系统的有效性^62-65。

以下给出了根据本发明实施例的典型设备、它们的应用和有关观测，其并非是意图限定本发明范围。注意用在实施例中的标题或副标题是为了方便读者，其决不应限定本发明范围。此外在这里会提及和披露某些理论，然而，无论它们正确或是错误，都绝不应限定本发明范围，只要所用的设备或它们的应用是根据本发明实施的，没有关系任何特定理论或操作。

实施例

毛细管生物反应器

现在参考图1(A-D)，本发明可以结合有创造性的生物反应器1100及其在图1(A-D)所示的变化实现。首先参考图1A1、1A2，以及1A3，在一个实施例中，生物反应器1100包括具有第一表面1124a、相对的第二表面1124b以及边缘的第一基片1124。生物反应器1100进一步包括具有第一表面1121a和相对的第二表面1121b的第二基片1121，界定具有底面1121d的腔体1121c，其中，底面1121d位于第一表面1121a和第二表面1124b之间。第一基片1124的第一表面1124a被第二基片1121的第二表面1121b容纳，以覆盖腔体1121c，从而形成用于接收细胞和液体媒介的通道1101。第二基片1121由玻璃、聚脂薄膜、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、硅、聚合物、半导体、或它们的任何组合所构成。第一基片1124至少部分地是光学透明的，从而通道1101中细胞的动态活性可通过光学检测的方法检测。

在第二基片1121内形成凹槽1105c，其具有底面1105d并与通道1101进行流体传送。此外，放置屏障1106用于覆盖凹槽1105c从而形成外室1105。屏障1106具有多孔性，以允许通道1101和外室1105进行流体传送，并控制至少一个预定类型的细胞在通道1101和外室1105之间移动。在如图1A1所示的一个实施例中，屏障1106包括多个柱体，彼此被间隙隔开。柱体在某些位置可以涂物质层，以阻止细胞，特别是内皮细胞进入。某些位置柱体之间的间隙允许特殊细胞类型被传送到外室1105。

第二基片1121进一步界定第一孔1101a和相对的第二孔1101b，其适合允许液体流基本沿第一方向1101c，通过第一孔1101a引进通道1101，并通过第二孔1101b引离通道1101。

生物反应器1100进一步包括生物相容涂层1102，施于通道1101周围第二基片1121的内表面。生物相容涂层1102包含可以抑制细胞粘着于生物相容涂层、增强细胞粘着于生物相容涂层、促进细胞构成和生长、或起荧光标记或细胞状态指示剂作用的材料。

在形成生物反应器1100过程中，通道1101的尺寸为允许细胞层1103在生物相容涂层1102上生长和通道1101中液体的流动。液体的流动被控制，从而为细胞层1103提供已知的剪切力。液体的流动可以被进一步控制，从而提供一种环境，在通道1101内模拟脉管空间。例如，通道1101可以用于引入内皮细胞，以及其随后的灌注。

细胞可以是任何类型的活细胞，包括细菌、原生动物、或两者、常规细胞、内皮细胞、瘤细胞，或它们的任何组合，但细胞不限于此。细胞可以分别地，以细胞集合的方式，或以生物膜(biofilm)形式引导进入通道1101。在一个实施例中，细胞层1103在通道中基本形成内皮细胞排列的毛细管。通道1101的尺寸为当至少一个细胞1104被引导进入通道1101时，其可以在内皮细胞排列的毛细管中进行内渗，其中所述的细胞1104不是内皮细胞之一，例如瘤细胞。

在如图1C所示的可选的实施例中，第二基片1121进一步界定一个或多个注射口1140、1141，与通道1101进行流体传送，以允许物质流基本沿第二方向1148，通过注射口1140、1141分别引入通道1101。如图1C所示，第二方向1148与第一方向1101c基本垂直。物质流可被控制，从而为通道1101提供一梯度。物质流包括影响细胞生长的物质，如化学激素。

现在参考图1A1、1A2以及1A3，外室1105的尺寸设为允许一群细胞的生长。一群细胞至少包括第一类型细胞1107和与第一类型细胞1107不同的第二类型细胞1113。换句话，外室1105的尺寸为允许两种类型细胞的生长。在一个实施例中，第一类型细胞1107包括常规细胞，第二类型细胞1113包括瘤细胞。这些寄主细胞可以生长在外室1105中，或为避免不希望的内皮细胞在寄主细胞群生长，它们可以在生物反应器1100外部合适的基片上生长，然后作为完整单元或更小单元被引入外室1105，或者通过微流孔之一或者通过暂时移除第一基片1124，例如外室1105的玻璃盖。如图1A2所示，在第二基片1121内形成端口1122和连接通道1123，从而连接通道1123与外室1105和端口1122进行流体传送。生物反应器1100进一步包括多个电极1114、1115、1116，其适于电气化学测量一群细胞。而且，生物反应器1100进一步包括多个控制端口1108、1109、1110，和多个连接通道1108a、1109a、1110a，其中每个连接通道1108a、1109a、1110a分别与相应的控制端口1108、1109、1110之一和外室1105进行流体传送。

上述生物反应器1100及其变化形式可以找到许多应用。这种容易制造的装置适合于出现几率高并且长度相对短的毛细管的情况下，例如中性粒细胞结合到活化内皮细胞管。多个通道/端口允许不同细胞的传送，以及化学激素、营养物，和pH梯度的建立。电极测量代谢作用。因此它可能最适合于涉及活化或发炎内皮细胞的实验或应用。

例如，如图1B所示，生物反应器1100可以被用作毛细管灌注移动生物反应器，用于研究在两个竞争化学激素梯度存在下的癌细胞或中性粒细胞外溢。特别地，第一化学激素流1130a通过端口1130被注入，因此在外室1105和通道1101中建立化学激素第一梯度。此外，第二化学激素流1131a通过端口1131被注入，因此在外室1105和通道1101中建立化学激素第二梯度。可产生细胞动态谱(spectrum of dynamics)。例如，响应灌注流动或第一和第二化学激素梯度的出现，癌细胞或中性粒细胞1132沿通道1101移动，且癌细胞或中性粒细胞1133从通道1101外渗进入外室1105。

图1D说明了另一个应用。这里生物反应器1100可以被用作毛细管灌注移动生物反应器，用于研究由瘤细胞分泄的化学激素触发的内皮管的形成，其中足够大小的外室1105包括足够大体积的寄主细胞1108，这是确保内皮管的形成需要的。内皮管1140的形成是响应瘤细胞1113释放的化学激素，或血管内皮生长因子或其它物质通过微流端口1111的微流传送。应该指出另一个瘤细胞1112在活动中。电极1114能够检测与管形成和相关蛋白质水解相关的细胞外环境变化。

具有多个阱的生物反应器

现在参考图2(A-I)，结合图2(A-I)所示的有创造性的生物反应器1000及其变化形式，也可以实现本发明。首先参考图2A、10B、10G、10H以及10I，在一个实施例中，生物反应器1000包括具有第一表面1001a和相对的第二表面1001b的第一基片1001，其间界定用于接收细胞1008和液体介质的室1006。第一基片1001可以由玻璃、聚脂薄膜、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、硅、聚合物、半导体、或它们的任何组合所构成。

入口1021和第一连接通道1021a形成在第一基片1001内，其中第一连接通道1021a与入口1021和室1006进行流体传送，从而允许物质流被传送到室1006。此外，出口1005和第二连接通道1005a形成在第二基片1001内，其中第二连接通道1005a与出口1005和室1006进行流体传送，从而允许物质流从室1006移出。

而且，如图2A的插图所示，生物反应器1000具有限制装置1003，位于室1006的区域内，与第一连接通道1021a接近，以限制细胞1008。在一个实施例中，限制装置1003包括多个阱1007，其中多个阱1007中的每一个能够接收至少一个细胞或细胞集合1008。多个阱1007中的每一个包括界定凹槽1007a的结构，从而在其中接收和限制一个或多个细胞1008。该结构可以部分的由过滤器1007b形成，以允许凹槽1007a与室1006进行流体传送。过滤器1007b可以由多个彼此由间隙g隔开的柱体形成。阱可以具有各种形状和不同的物理特性。例如，在图2G所示的实施例中，阱1090具有不同的柱体和侧面。在图2H所示的实施例中，阱1092具有柱体和延伸到柱体的侧面。以及在图2I所示的实施例中，阱1093由单个柱体和侧面形成。多个阱1007可以被排列为阵列。

此外，第一基片1001界定第一备用端口1022和第三连接通道1022a，其与第一备用端口1022和第一连接通道1021a进行流体传送，从而允许另外的物质被引导进入室1006。而且，第一基片1001进一步界定第二备用端口1011、第三连接通道1011a，以及第二室1009，其中第三连接通道1011a与第二备用端口1011和第二室1009进行流体传送，且第二室1009与第一连接通道1021a进行流体传送。而且，第二室1009由可透氧结构形成，从而为细胞提供氧气。

现在参考图2B，生物反应器1100进一步包括具有第一表面1050a和相对的第二表面1050b的第二基片1050，以及适合电气化学测量室1006中细胞的装置。用于电气化学测量的装置相对于第二基片1050的位置设定，以使当第二基片1050的第一表面1050a被第一基片1001的第二表面1001b容纳时，用于电气化学测量的装置位于相应的测量位置为宜。用于电气化学测量的装置包括至少一个监视细胞进入室1006的电极1051、至少一个监视细胞离开室1006的电极1052，以及多个检测室1006中化学物种的电极1053。

生物反应器1000进一步包括具有第一表面1060a和相对的第二表面1060b的第三基片1060，以及适合光学测量的装置。用于光学测量的装置相对于第三基片1060的位置设定，以使当第三基片1060的第一表面1060a被第一基片1001的第二表面1001b容纳时，用于光学测量的装置位于相应的测量位置。用于光学测量的装置包括多个光学传感器1061，其放置以使其可检测室1006内的化学物质和生物物种和室1006内细胞的生理状态为宜。第三基片1060至少是部分地透明。

具有限制区域的生物反应器

现在参考图2(C-F)，结合图2(C-F)所示的有创造性的生物反应器1000及其变化，也可以实现本发明。首先参考图2C、2D、2E以及2F，在一个实施例中，生物反应器1000包括具有第一表面1001a和相对的第二表面1001b的第一基片1001，其间界定用于接收细胞1008和液体介质的室1006。第一基片1001可以由玻璃、聚脂薄膜、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、硅、聚合物、半导体、或它们的任何组合所构成。生物反应器1000进一步包括第二基片(未示出)，其尺寸为当第二基片1050被第一基片1001容纳时，室1006被覆盖。

入口(未示出)和第一连接通道1021形成在第一基片1001内，其中第一连接通道1021与入口(未示出)和室1006进行流体传送，从而允许物质流被传送到室1006。

此外，出口(未示出)和第二连接通道1005形成在第一基片1001内，其中第二连接通道1005与出口(未示出)和室1006进行流体传送，从而允许物质流从室1006移出。

生物反应器1000进一步具有位于室1006中的限制装置，形成限制区域1006a以限制那里的细胞1008。在一个实施例中，限制装置包括第一过滤器1085a和第二过滤器1085b，其中第一过滤器1085a位于接近第一连接通道1021的位置，第二过滤器1085b位于接近第二连接通道1005的位置，并且第一过滤器1085a和第二过滤器1085b彼此基本平行。第一过滤器1085a和第二过滤器1085b中的每一个包括多个彼此隔开的柱体1086，不允许细胞通过。相邻两个柱体间的距离可以不同。例如，如图2C、2D、2E以及2F所示，柱体1086、1086a、1088以及1089分别表示其不同的间隙。

现在参考图2C，第一基片1001进一步界定第一备用端口1083和第三连接通道1083a，其与第一备用端口1083和室1006的限制区域1006a进行流体传送，从而允许种子细胞只在室1006限制区域1006a外灌注。

生物反应器1000进一步包括一个或多个支撑单元1082a、1082b，位于室1006的限制区域1006a外，以支撑第二基片1050。此外，生物反应器1000进一步包括至少一个支撑单元1087，位于室1006的限制区域1006a内部，以支撑第二基片1050。应该指出室1006由室1006侧壁形成，其在连接通道与室1006的交叉处逐渐变细，分别形成倾角α和闭合角度β，其中α优选处于与垂直线大约10-45°范围内，β优选处于大约30-80°范围内，以减小锐角转角产生的剪切力。

具有多个室的生物反应器

现在参考图3(A-D)，结合图3(A-D)所示的有创造性的生物反应器800及其变化，也可以实现本发明。首先参考图3A，在一个实施例中，生物反应器800包括具有第一表面和相对的第二表面的第一基片801，其间界定用于接收第一类型细胞和液体介质的第一室812。一个或多个第二室811a、811b、811c、811d形成在第一基片801内，以接收第二类型细胞和液体介质。而且一个或多个连接通道813a、813b、813c、813d形成在第一基片801内，其中每个连接通道813a、813b、813c、813d与相应第二室811a、811b、811c、811d和第一室812进行流体传送，从而允许第一类型细胞和第二类型细胞彼此互相作用。例如，连接通道813a与相应第二室811a和第一室812进行流体传送。第一类型细胞包括原生动物，第二类型细胞包括细菌。

连接通道813a、813b、813c、813d的形成以允许原生动物在其中移动为宜。然而，对不同的应用可以使用多种不同结构以限制原生动物的移动性。例如，在图3B所示的实施例804中，可以使用限制大小或排除柱体805以限制原生动物的移动性，其可以被用于评价原生动物的移动性。可选地，在图3C所示的实施例807中，形成连接通道813a、813b、813c、813d中的一个，其横截面尺寸808可沿连接通道长度变化，可以被用于限制原生动物的移动性，其也可以被用于评价原生动物的移动性。而且，在图3D所示的实施例809中，位于连接通道内的屏障810可以被用于分离细菌和原生动物，其可以被用于评价原生动物的趋化性。

尽管展示了本发明多种实施例，但应理解，如本领域技术人员所知，在设备元件形式排列和方法步骤上可以做出改变来实施本发明，其未背离权利要求所陈述的本发明的范围。此外，上述实施例仅用于举例说明本发明原理，且不是意图将权利要求限定于所披露的元素。的确，可以在不背离本发明精神和范围下做出本发明的很多实施方式，因此本发明存在于附加在下文中的权利要求中。

参考文献目录

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Claims

1、一种生物反应器，包含：

i).一第一基片，其具有一第一表面、一相对第二表面和边缘；

ii).一第二基片，其具有一第一表面、一相对第二表面，界定带有一底面的一腔体，其中所述底面位于所述第一表面和所述第二表面之间，且其中所述第一基片的所述第一表面被所述第二基片的所述第二表面容纳，以覆盖所述腔体形成用于接收细胞和液体介质的一通道；

iii).一凹槽，其在所述第二基片内形成，带有一底面，且与所述通道进行流体传送；以及

iv).一屏障，其位于覆盖所述凹槽处以形成一外室，其中所述屏障有多孔性以允许所述通道和所述外室进行液体传送，且控制至少一个预定类型细胞在所述通道和所述外室之间移动。

2、如权利要求1所述生物反应器，其中所述第二基片进一步界定一第一孔和一相对第二孔，其适于允许液体流基本沿第一方向通过所述第一孔导入所述通道中并通过所述第二孔从所述通道导出。

3、如权利要求2所述生物反应器，进一步包含一生物相容涂层，施于所述通道周围的所述第二基片的内表面。

4、如权利要求3所述生物反应器，其中所述生物相容涂层包含一材料，其可以抑制细胞粘着于所述生物相容涂层、增强细胞粘着于所述生物相容涂层、促进细胞构成和生长、或起荧光标记或细胞状态指示剂作用。

5、如权利要求3所述生物反应器，其中所述通道的尺寸设为允许细胞层在所述生物相容涂层上生长及液体在所述通道中流动。

6、如权利要求5所述生物反应器，其中所述液体的流动被控制以向细胞层提供已知剪切力。

7、如权利要求5所述生物反应器，其中所述液体的流动被控制以提供一种在所述通道内模拟脉管空间的环境。

8、如权利要求7所述生物反应器，其中所述细胞包含内皮细胞。

9、如权利要求8所述生物反应器，其中所述细胞层在所述通道中基本形成内皮细胞排列的毛细管。

10、如权利要求9所述生物反应器，其中所述通道尺寸设为当至少一个不是内皮细胞之一的细胞被引导进所述通道时，其可以在所述内皮细胞排列的毛细管中进行内渗。

11、如权利要求9所述生物反应器，其中所述至少一个不是内皮细胞之一的细胞为瘤细胞。

12、如权利要求9所述生物反应器，其中所述第二基片进一步界定至少一个注射口，其与所述通道进行流体传送，以允许物质流基本沿第二方向通过所述注射口引入所述通道中。

13、如权利要求12所述生物反应器，其中所述第二方向基本垂直于所述第一方向。

14、如权利要求12所述生物反应器，其中所述物质流被控制，以便向所述通道提供一梯度。

15、如权利要求14所述生物反应器，其中所述物质流包含化学激素。

16、如权利要求14所述生物反应器，其中所述物质流包含影响细胞生长的物质。

17、如权利要求1所述生物反应器，其中所述屏障包含彼此由一间隙隔开的多个柱体。

18、如权利要求1所述生物反应器，其中所述外室尺寸设为允许一群细胞生长。

19、如权利要求18所述生物反应器，其中所说的一群细胞包含至少一第一类型细胞和一第二类型细胞，所述第二类型细胞不同于所述第一类型细胞。

20、如权利要求19所述生物反应器，其中所述第一类型细胞包含正常细胞。

21、如权利要求20所述生物反应器，其中所述第二类型细胞包含瘤细胞。

22、如权利要求18所述生物反应器，进一步包含形成在所述第二基片中的一端口和形成在所述第二基片中的一连接通道，以使所述连接通道与所述外室和所述端口进行流体传送。

23、如权利要求18所述生物反应器，进一步包含多个电极，其适用于电化学测量所述一群细胞。

24、如权利要求18所述生物反应器，进一步包含多个控制口和多个连接通道，其中每个所述连接通道与相应控制口和所述外室进行流体传送。

25、如权利要求1所述生物反应器，其中所述第二基片由玻璃、聚脂薄膜、聚二甲基硅氧烷、硅、聚合物、半导体、或它们的任何组合所构成。

26、如权利要求1所述生物反应器，其中所述第一基片至少部分光学透明。

27、如权利要求26所述生物反应器，其中在通道中的所述细胞动态活性可通过光学检测装置检测。

28、一种生物反应器，包含：

i)一第一基片，其具有第一表面、相对第二表面，界定一室，其间用于接受细胞和液体介质；

ii)一入口，其在所述第一基片中形成；

iii)一第一连接通道，其在所述第一基片中形成，其中所述第一连接通道与所述入口和所述室进行流体传送，以便允许物质流向所述室输送；

iv)一出口，其在所述第一基片中形成；

v)一第二连接通道，其在所述第一基片中形成，其中所述第二连接通道与所述出口和所述室进行流体传送，以便允许物质流从所述室移出；

以及

vi)限制装置，其位于所述室中接近所述第一连接通道的一区域内，以限制所述细胞。

29、如权利要求28所述生物反应器，其中所述限制装置包含多个阱，其中多个阱中每一个能够接收至少一个细胞。

30、如权利要求29所述生物反应器，其中所述多个阱中每一个都包含一结构，其界定一凹槽，以使在其中接收和限制至少一个细胞。

31、如权利要求30所述生物反应器，其中所述结构部分由一过滤器形成，以允许所述凹槽与所述室进行流体传送。

32、如权利要求29所述生物反应器，其中所述多个阱形成一阵列。

33、如权利要求28所述生物反应器，其中所述第一基片进一步界定一第一备用口和一第三连接通道，所述第三连接通道与所述第一备用口和所述第一连接通道进行流体传送，以便允许向所述室引入另外的物质。

34、如权利要求28所述生物反应器，其中所述第一基片进一步界定一第二备用口、一第三连接通道和一第二室，其中所述第三连接通道与所述第二备用口和所述第二室进行流体传送，且所述第二室与所述第一连接通道进行流体传送。

35、如权利要求34所述生物反应器，其中所述第二室由可透氧结构形成，以向所述细胞供氧。

36、如权利要求28所述生物反应器，其中所述第一基片由玻璃、聚脂薄膜、聚二甲基硅氧烷、硅、聚合物、半导体、或它们的任何组合所构成。

37、如权利要求28所述生物反应器，进一步包含具有第一表面和相对第二表面的一第二基片，以及装置，其适用于电化学测量所述室中的细胞，其中用于电化学测量的所述装置相对于所述第二基片的位置设定，以使当所述第二基片的所述第一表面被所述第一基片的所述第二表面容纳时，用于电化学测量的所述装置位于相应的测量位上为宜。

38、如权利要求37所述生物反应器，其中用于电化学测量的所述装置包含：

i)至少一个电极，其监测细胞进入所述室；

ii)至少一个电极，其监测细胞离开所述室；和

iii)多个电极，其检测所述室中的各种化学物质。

39、如权利要求28所述生物反应器，进一步包含具有第一表面和相对第二表面的一第三基片，及装置，其适用于光学测量，其中用于光学测量的所述装置相对于所述第三基片的位置设定，以使当所述第三基片的所述第一表面被所述第一基片的所述第二表面容纳时，用于光学测量的所述装置位于相应的测量位上为宜。

40、如权利要求39所述生物反应器，其中用于光学测量的所述装置包含多个光学传感器，其位置设定以使其可检测所述室内各种化学物质和生物物种及所述室内细胞生理状态为宜。

41、如权利要求39所述生物反应器，其中所述第三基片至少为部分透明。

42、一种生物反应器，包含：

ii)一入口，其在所述第一基片中形成；

iv)一出口，其在所述第一基片中形成；

v)一第二连接通道，其在所述第一基片中形成，其中所述第二连接通道与所述出口和所述室进行流体传送，以便允许物质流从所述室移出；以及

vi)限制装置，其位于所述室中以形成一限制区，在其中限制细胞。

43、如权利要求42所述生物反应器，其中所述限制装置包括第一过滤器和第二过滤器，其中所述第一过滤器位于接近所述第一连接通道处，所述第二过滤器位于接近所述第二连接通道处，且所述第一过滤器和第二过滤器基本相互平行。

44、如权利要求43所述生物反应器，其中每个所述第一过滤器和所述第二过滤器包含相互间隔的多个柱体，不允许细胞通过。

45、如权利要求42所述生物反应器，其中所述第一基片进一步界定一第一备用口和一第三连接通道，所述第三连接通道与所述第一备用口和所述室的所述限制区进行流体传送，以便允许种子细胞仅灌注在所述室所述限制区外。

46、如权利要求42所述生物反应器，其中所述第一基片由玻璃、聚脂薄膜、聚二甲基硅氧烷、硅、聚合物、半导体、或它们的任何组合所构成。

47、如权利要求42所述生物反应器，进一步包含一第二基片，其具有第一表面和相对第二表面，其中所述第二基片尺寸设为当所述第二基片的所述第一表面被所述第一基片的所述第二表面容纳时，所述室被覆盖。

48、如权利要求47所述生物反应器，进一步包含至少一个支撑元件，其位于所述室的所述限制区外，用于支撑所述第二基片。

49、如权利要求47所述生物反应器，进一步包含至少一个支撑部件，其位于所述室的所述限制区内，用于支撑所述第二基片。

50、一种生物反应器，包含：

i)一第一基片，其具有第一表面和相对第二表面，界定了一第一室，其间用于接受第一类型细胞和液体介质；

ii)至少一个第二室，其在所述第一基片中形成，用于接受第二类型细胞和液体介质；

iii)至少一个连接通道，其在所述第一基片中形成，其中至少一个所述连接通道与相应第二室和所述第一室进行流体传送，以便允许所述第一类型细胞和所述第二类型细胞相互作用。

51、如权利要求50所述生物反应器，其中所述第一类型细胞包含原生动物。

52、如权利要求51所述生物反应器，其中所述第二类型细胞包含细菌。

53、如权利要求52所述生物反应器，其中所述连接通道的形成以允许原生动物在其中移动为宜。

54、如权利要求53所述生物反应器，进一步包含尺寸限制柱体，以限制原生动物移动性。

55、如权利要求53所述生物反应器，其中所述连接通道的形成以使其横截面尺寸可随所述连接通道长度而变化为宜。

56、如权利要求53所述生物反应器，进一步包含一屏障，其位于所述连接通道中，用于分离细菌和原生动物。

57、如权利要求50所述生物反应器，其中所述第一基片由玻璃、聚脂薄膜、聚二甲基硅氧烷、硅、聚合物、半导体、或它们的任何组合所构成。