CN101835886A - 用于灌注的中等尺寸生物反应器平台 - Google Patents

Abstract

本发明公开了中等尺寸生物反应器(101)平台，其包含两个或更多个与培养室(103)流体联通的液体贮器(102)，所述培养室与出口(104)流体联通，其中平台被提供有能使所述室被来自一个或多个液体贮器的液流灌注的装置。集成的液体贮器使得在需要灌注液体的细胞培养实验期间无需从外部供应液体至培养室。而且，由于有两个或更多个贮器，能够向培养室供应不同类型的液体。

Description

用于灌注的中等尺寸生物反应器平台

技术领域

本发明涉及中等尺寸生物反应器平台和用于生物反应器平台的控制单元以及包含中等尺寸生物反应器平台和用于生物反应器平台的控制单元的系统。该中等尺寸生物反应器平台适于培养生物细胞，尤其适于培养哺乳动物细胞，如胚胎或干细胞。该中等尺寸生物反应器更特别适合用于体外受精操作。

现有技术

当前在用于胚胎培养的体外受精中所用的方法依赖于在静止条件下于培养皿中培养胚胎。这种方法是劳动密集的，因为更换生长培养基需要大量的人工操作。人工操作总会有引入污染的风险，而且静止条件与体内条件的相似性不高，其难以满足胚胎不断改变的需求。与当前体外静止条件相比，体内胚胎处于不断改变的环境，而且一个发育阶段中胚胎的需求可能与另一个发育阶段中胚胎的需求有很大不同。一个发育阶段的体内条件甚至可能对后面发育阶段的胚胎有害。

基于静止的培养皿培养系统的一些缺点可以通过下述而避免：在能够向胚胎灌注适合其发育阶段的生长培养基的培养系统中培养胚胎。这种系统应该有与胚胎尺寸相匹配的适当尺寸并且更近似于体内条件。此外，以小规模进行运作是重要的，以减小此类哺乳动物细胞通常所需的昂贵的生长培养基的消耗。

现在许多所谓的微流体装置已经被描述用于进行各种类型的分析或用于培养细胞。这些装置常常用各种原理制造，这些原理通常受到二十世纪七十年代基于硅的微电子学技术的发展的启发。微流体应用的实例为DNA分析，涉及的原理如用于例如检测单核苷酸多态性的聚合酶链反应或使用例如毛细管电泳法的蛋白质分析。

然而，‘真正的’微流体装置(例如具有约100μm或更小直径的流体通道)确实具有许多缺点，其中一些缺点对于为灌注型操作设计的细胞培养装置特别明显。正如从Hagen-Poiseuille方程可见，在有液流的例如100μm通道中压力降变得很大，对于欲在此规模运行的泵提出了高要求，因为这样的泵必须能对抗相当大的反压精确地泵出很小的体积。由于这个原因，在此规模经常使用所谓的电渗流产生液流，其在盐水溶液中通过暴露于巨大的电位下生成液流。但是这样的电渗流不适于涉及活(哺乳动物)细胞的系统。

微流体中遇到的另一个问题是关于“与外界的联接”的问题。生物学实验室中所用的大部分设备，如泵和分析设备，比微流体设备大得多以至于两个级别的整合变得问题重重。如250μm直径(容易得到的)这样小的管与芯片的联接点对于实验室工作人员而言难以操作，而且可能迅速引入几倍于微流体系统体积大小的死体积。这个问题对于灌注型细胞培养装置尤其重要，其中操作复杂性和流体在联接至微流体系统的管中的长滞留时间增加了逆流污染的风险。在培养哺乳动物胚胎的情况下，培养时间可能达五天或更长。

对于以小规模工作的生物反应器系统，当然能够根据预设的事件序列在不同的生长培养基和条件之间切换。但是，为了更充分地优化生物反应器中细胞的生长条件，生物反应器可装备适当的可与电脑通信或类似的能够发送命令到生物反应器的执行元件的传感器。这样可生成反馈系统以对环境的变化做出反应，例如用于维持恒定的环境条件。

如下面所讨论，为解决上述问题已采取了一些手段。

WO07/044699描述了安装有集成流体进样器的微型生物反应器，其中流体进样器可能包含液体贮器(reservoir)。这些生物反应器可用于在代谢工程研究领域中建立商业上相关的生产生物体尤其是微生物菌株的平行研究。WO07/044699的生物反应器的生长室中的集成传感器使传感器的信号在反馈控制装置中用于通过从贮器中注射液体来调整生长室中的环境条件，通常是pH。

WO07/044699的反应器流体进样器的贮器通常由弹性材料构建并且还包含阀，以使来自贮器的液流可采用气动(pneumatic actuation)进行控制。

为优化通过可渗透的聚二甲基硅氧烷(PDMS)膜提供给生长室的气体供应，WO07/044699的室一般为扁平的(即生长室的一个空间维度比生长室的另外两个空间维度至少小约10倍)，PDMS膜朝向两个较大表面之一。生长室的典型体积为5到500μL。生长室中的液体也经PDMS膜采用气动而得以混合。

WO07/044699的微型生物反应器的基本原理使得它们通过向生长室中脉冲液体以维持恒定的环境条件而适于进行分批补料型细胞发酵。但是，液体的脉冲式供应和贮器的相对于生长室尺寸而言的有限尺寸(即15-25μL)使系统不适于进行长期类似灌注的运行，如恒化培养或向室中细胞连续供应培养基(即由于25μL的贮器尺寸和～270nL的脉冲大小，有不到100次的脉冲可用)。此原理似乎也不适于培养在它们的生长周期中具有不断改变的需求的细胞。此外，虽然生长室的扁平设计使细胞得到有效的氧供应，但是同一设计也使剧烈搅拌以混合脉冲的液体成为必需。这样的条件可能会对比细菌或真菌细胞更脆弱的细胞造成损坏。

WO07/047826描述了微流体细胞培养装置，其使用油覆盖层以阻止液体从微流体室中蒸发并使得可以进入该装置中的生长室。所述装置包含漏斗形的生长室和经微通道联接的贮器，微通道在包含该室的PDMS基片(substrate)的底部中。在由弹性材料制成的膜和所谓的销式(pin)传动装置的帮助下，在室间产生液体的蠕动是可能的。该蠕动可用于产生“往复型流体供应，其中孔中的流体水平周期性地增加和减少”。但是，也可用外部供应向WO07/047826的装置的生长室供应液体。

WO07/047826的装置可以含有光学传感器、电传感器或机电传感器以测定微流体装置元件的状态或液流特性。该文献还提及如下选项：采用由弹性膜和销式传动装置组合产生的活动部分，应用多个贮器用于供应营养物、生长因子等。但是，由于需要使用外部的流体供应，该装置似乎不适于进行长期灌注型生长实验。

Petronis等(2006，生物技术(BioTechniques)40：368-376)描述了用于HeLa细胞的长期培养的微流体生物反应器装置。此装置由热塑性聚合材料构建并含有用于加热生长室的集成的氧化锡铟膜。所述室还含有温度传感器和使传感器和加热元件协作的带有电脑的装置，从而使室的温度可以以反馈的方式进行控制。Petronis等(2006)的生物反应器的小尺寸使得能够迅速控制室中的温度。但是，该装置只是用外部的泵从外部贮器供应液体的经典发酵罐的缩小版。这种外部液体供应的设计使实际上不受限的培养时间成为可能，尽管建立实验的复杂性使该装置最适于学术研究使用。另外，所述反馈装置主要适于维持恒定条件，并没有指出如何用其控制施用至生长室的液体。

WO2005/123258也描述了微流体生物反应器装置，其使用传感器以反馈机制控制生长于室中的细胞的环境。WO2005/123258中的生物反应器利用相对于培养室位于外部的预混合室。但是，生物反应器似乎不适于进行‘传统的’灌注型细胞培养，因为预混合室和生长室以回路联接，该回路可选择用从外部贮器供应的液体调节液体组成(在预混合室中)。

但是，迄今描述的大部分微流体装置是分析装置，其目的在于提供关于装置中样品液体中的细胞或生物学化合物的抽象数据。相反地，体外受精操作的目标是培养过程中得到的胚胎。因此，为灌注细胞如受精的卵母细胞设计的装置，应使得易于进入(access)培养室以能够在室中放置细胞，而且尤其在培养期后也能轻柔地移动细胞。这种特征在仅设计用于数据采集的流体装置中是非必需的，其中适当的传感器可以整合至装置中，使数据从系统中导出而无需物理移动细胞。

WO2003/087292描述了自动化的组织工程学系统。该系统尤其是包含由外壳支持的生物反应器，其中生物反应器可促进生理细胞功能和/或组织构造的产生。该系统还包含含有液体贮器的流体包容系统。该生物反应器可以有盖子，其提供经取样口进入生物反应器的通路，并且该生物反应器可以有例如氧气、温度和pH传感器并且还可以装备有相机。WO2003/087292的装置适于以下操作：如组织活检的消化、细胞分选、细胞洗涤、细胞浓缩、细胞播种、细胞增殖、细胞分化、细胞储藏、细胞运输、组织形成、植入物形成，其中所述组织可以来源于骨和软骨。因此，此系统适于细胞，如胚胎干细胞、成人干细胞、成骨细胞、前成骨细胞、软骨细胞、前软骨细胞、髓核细胞、骨骼细胞、源于骨骼骨髓或血液的骨骼祖细胞，包括干细胞。

虽然相关地提及100-500mg人软骨活检，但是WO2003/087292的生物反应器系统的尺寸未被明确指出。其进一步提及100mg活检组织可以在系统中产生约200,000到500,000个细胞。因此，该生物反应器中的细胞数表明此系统不适于体外受精的目的，体外受精的目标是几个分裂周期后衍生自单一受精卵的一群细胞。

而且没有指出“取样口”的确切性质。具体地讲，没有描述可以在灌注操作期间进入生物反应器。

WO2003/087292的系统如WO2005/116186中所述那样被进一步发展。在WO2005/116186中，其要求保护用于植入物形成的分化生物反应器，其设计已被改进。但是，WO2005/116186没有详述可以如何经盖子进入生物反应器，也没有指明在灌注操作期间可以如何进入生物反应器。

不管上面讨论的成果怎样，仍需要有解决了在流体装置中整合流体供应的问题的系统，所述流体装置用于在适合哺乳动物胚胎的规模和时间上进行灌注型操作。本发明的目的是提供中等尺寸生物反应器平台，将在胚胎发育期间对生长条件的不同需求以及这样的培养所需的时间考虑在内，其适于培养哺乳动物卵母细胞和胚胎。

发明内容

本发明涉及中等尺寸生物反应器平台，其包含两个或更多个液体贮器，液体贮器与培养室流体联通(fluid communication)，所述室与出口流体联通，其中所述平台被提供有能使所述室被来自一个或多个液体贮器的液流灌注的装置。集成的液体贮器使得在需要灌注液体的细胞培养实验期间无需从外部供应液体至培养室，此外，使逆流污染的风险降至最低。而且，由于有两个或更多个贮器，能够向培养室供应与每个贮器的内容物相应的不同液体，或可将来自两个或更多个贮器的混合物供应给培养室。

在某些实施方案中，对中等尺寸生物反应器平台进行构建，以使得可以经可闭合元件或弹性膜物理(physically)进入培养室。这种构造使得能够对培养室的内容物进行操作，同时保持最小限度的逆流污染风险。中等尺寸生物反应器平台的可闭合元件可采取盖子的形式，所述盖子可以是铰接(hinged)或滑动的(sliding)，且弹性膜可具有自动封闭的能力。

在一个实施方案中，对中等尺寸生物反应器平台进行构建，从而能使培养室被灌注的装置包含能够调节贮器的体积的柔软区(flexible region)。柔软区可以由膜形式的柔韧材料制成。另一个实施方案中，能使培养室被灌注的装置包含使外部与贮器联接的进气孔，该进气孔包含约0.1μm到约0.5μm孔径的过滤器。在这两个实施方案的任何一个中，将正的相对压力施加至膜或过滤器的外部，或将负的相对压力施加至中等尺寸生物反应器平台的出口，这将产生含在贮器中的液体的流向培养室的液流。

本发明的中等尺寸生物反应器平台可有利地用于培养哺乳动物细胞，并且在此实施方案中，培养室包含一个或多个哺乳动物细胞。本发明的中等尺寸生物反应器平台尤其适合用于体外受精操作。当用于培养哺乳动物细胞时，贮器包含培养基、生物学或生物化学活性分子和/或缓冲液。

本发明还涉及用于中等尺寸生物反应器平台的控制单元，该控制单元包含用于控制从两个或更多个贮器至培养室的液体流速的装置。当中等尺寸生物反应器平台与控制单元联接时，控制单元可因此在中等尺寸生物反应器平台中产生来自贮器的用于灌注培养室的液流。

控制流速的装置可以例如能够施加正的相对压力至所述贮器和/或施加负的相对压力至所述出口。压力可以由物理样机(specimen)如活塞、或空气/气体压力产生。对于提供给液流而言，优选使用来自气体的压力。施加正的相对压力至贮器中的液体还可能使液体被所使用的气体饱和。

在另一个实施方案中，控制单元还包含至少一个能测量pH、溶解氧(O₂)、二氧化碳(CO₂)、葡萄糖、营养素、维生素、代谢产物、流速、温度、光密度、荧光信号、特异蛋白或酶、或DNA’s或RNA’s的传感器。传感器可以被安置用于测量培养室或培养室的下游中的液体的参数值。

在另一个实施方案中，控制单元还包含数据处理单元，该数据处理单元能够收集来自传感器的信号并且用来自收集的信号的信息控制来自两个或更多个贮器中每一贮器的流速。任选的混合部件的存在可以进一步确保来自两个或更多个贮器的液体被混合。在该实施方案中，因此可用传感器记录的信号以反馈的方式控制从贮器到培养室的液流。例如，可以将参数值设置在预设范围内，并且如果来自传感器的信号表明参数值可能移出了此范围，来自贮器的液流可以被调节以使参数值返回至预设范围内。

本发明还涉及包含中等尺寸生物反应器平台和控制单元的系统，其中中等尺寸生物反应器平台包含在适配于控制单元的盒子(cartridge)中。该系统使中等尺寸生物反应器平台能够快速并容易地插入控制单元中。所述插入确保贮器与控制单元的压力供应相联接。

附图说明

图1显示中等尺寸生物反应器平台的示意透视图。

图2显示中等尺寸生物反应器平台的培养室的示意图。

图3显示中等尺寸生物反应器平台的俯视图，其显示了平台具体实施方案的元件。

图4显示用于中等尺寸生物反应器平台的控制单元。

图5a为温度反馈调节的算法简图。

图5b为采用改变温度的算法，温度对时间的绘图。

发明详述

本发明涉及中等尺寸生物反应器平台、用于生物反应器平台的控制单元和包含所述平台与控制单元的系统。

本发明的术语“生物反应器”涵盖适于培养生物细胞的系统和装置。公开的生物反应器尤其适于哺乳动物细胞。在优选的实施方案中，哺乳动物细胞为与体外受精相关的细胞，所述细胞将包括精子、卵母细胞和/或胚胎。但是，对本领域技术人员而言显而易见的是，所述生物反应器平台还可以用于其它哺乳动物细胞类型，如干细胞或免疫系统细胞如单核细胞、树突细胞、T细胞等等。在优选的实施方案中，哺乳动物细胞为人细胞。此外，本发明中公开的中等尺寸生物反应器平台还可用于培养哺乳动物细胞以外的细胞类型。例如，在本文公开的生物反应器平台中还可培养细菌、酵母、真菌、植物或昆虫细胞。

本发明的上下文中，术语“中等尺寸”意指涵盖这样的尺寸范围，其中通道的最小尺寸为约100μm到约3mm，尽管通道还可能包含收缩部(constrictions)。同样，培养室可以具有约500μm到约5mm或更深的深度，并且最大的水平尺寸可以为约1mm到约50mm。贮器的尺寸必须足够在灌注条件下培养细胞。总而言之，中等尺寸流体系统中的流体将在层流(laminar)条件下流动，并且只要系统中包含的流体在层流条件下流动，具有不同于上面所定义的通道或室的流体系统可以称为“中等尺寸”。

在某实施方案中，培养室的最大水平尺寸在约2到约6mm的范围内。在另一个实施方案中，培养室的最大水平尺寸在约20到约30mm的范围内。在本发明的中等尺寸生物反应器中所用的典型流速范围内，液体基本上以层流移动。

本发明的生物反应器平台适于在灌注条件下运行。上下文中术语“灌注”是一般的连续流(continuous flow)被应用于装置的培养室。此连续流不局限于某一流速，而在使用本发明的生物反应器平台的实验过程期间可使用几种不同的流速。适合的流速为约100nL/min到约200μL/min或更多。应该强调的是，如有必要所述的流也可被停止，例如用于进行涉及培养室内容物的各种操作。此外，还要考虑使生物细胞静止(rest)的中间操作。

在一些实施方案中，以允许物理进入室的方式构建培养室。上下文中术语“物理进入”是指可以将工具插入到培养室的液体中，以操作培养室的内容物。该操作可以是从培养室插入或移除一个或多个细胞，或它可以涉及对培养室中已经存在的细胞的操作。

在一个实施方案中，本发明的控制单元包含“数据处理单元”。此术语是指电脑或类似装置，其能够收集来自控制单元中的传感器的信号并将它们转换为操作员能够理解的数据。数据处理单元还能够向控制培养室中细胞所经受的环境参数的设备发送命令。

数据处理单元可以进一步被设置，从而能够产生针对中等尺寸生物反应器平台的“临时日志”。术语“临时日志”是指控制单元的传感器产生的信号或其他数据以及收集信号的时间被数据处理单元收集。因此，对于每个中等尺寸生物反应器平台，可能能够知道在培养期间在给定时间点培养室中任何细胞所经受的条件。培养期结束前此信息已经是同样可用的，从而例如基于对临时日志中的数据的认知可以作出决定。

本发明的中等尺寸生物反应器平台101特别适用于体外受精操作。中等尺寸生物反应器平台101更特别适用于培养胚胎或卵母细胞201(在卵母细胞201与精子受精后)。对于此目的，在工具202如吸管或皮下针头帮助下，将受精的卵母细胞201置于培养室103中。在优选的实施方案中，中等尺寸生物反应器平台101的培养室103设计为允许物理进入培养室。中等尺寸生物反应器平台101还可用于未受精卵母细胞的受精。对于此目的，贮器102可包含纯化或未纯化的精子，或用于丘(cumulus)移除的透明质酸酶。图1中简要地图示说明了中等尺寸生物反应器平台101，图2中图示说明了所述平台的培养室103。图3中图示说明了生物反应器平台101的具体实施方案的附加特征。

在一个实施方案中，培养室103可以包含具有自动封闭能力的材料的弹性膜。因此，当工具202，如针头、皮下针头、刺血针或套管(canula)穿过膜时，工具202将进入包含膜的培养室103中含有的流体。一旦移除工具202，自动封闭能力将确保室被密封并防止发生不希望的泄漏。因此，受精的卵母细胞201可通过以下操作被置于培养室103中：在注射器的帮助下将其置于例如皮下针头中，用皮下针头的尖穿过弹性膜，并将卵母细胞201注射到培养室的适当位置中。然后，培养室103可以被来自一个或多个贮器102的适当生长培养基灌注。

在另一个实施方案中，培养室103包含使得能够进入室的可闭合元件105。对可闭合元件105进行设计，从而在一种设置情况(setting)下，可闭合元件105用于密封培养室103中的液体并且当用液体灌注培养室103时防止泄漏；在另一种设置情况下，可闭合元件105将允许用工具202如吸管、针头、皮下针头、刺血针或套管或其他工具物理进入室中，以操作培养室的内容物。可闭合元件105可作为中等尺寸生物反应器平台101的一部分，或可以作为控制单元的一部分。在优选的实施方案中，可闭合元件105是透明的。

可闭合元件105可有利地采取盖子的形式，所述盖子可以是铰接或滑动的。当可闭合元件105为盖子形式时，它通常由刚性材料如一种或多种热塑性聚合物构成，但是它还可以包含弹性材料，如PDMS或橡胶。在此实施方案中，打开盖子将允许例如含有受精的卵母细胞的吸管尖插入，以将卵母细胞201适当地置于培养室103中，然后关闭盖子并用来自一个或多个贮器的适当生长培养基灌注培养室103。

在另一个实施方案中，中等尺寸生物反应器平台101的培养室103中的液体包括水性(aq ueous)液体204和另一种与水性液体204基本不混溶的液体203。这种基本不混溶的液体203可以为比水性液体204的密度低的油，如石蜡油，而且它可以作为覆盖层203存在于水性液体204之上。培养室中含有的细胞例如卵母细胞201主要存在于水性液体204的较低层。此覆盖油层203可使培养室中水性液体204的灌注体积降至最低，阻止水相中生长培养基的蒸发，并使水性液体204的生物污染降至最低。特别是，油层的应用可通过阻止CO₂的蒸发帮助保持μH。油层还可帮助维持培养室的正确温度。当中等尺寸生物反应器平台101被装配了弹性、自动封闭膜或盖子时，覆盖油层203的应用是有益的。

本发明的中等尺寸生物反应器平台101的培养室103不限于特定的形状。但是，在优选的实施方案中，培养室103的形状通常可被描述为具有基本上圆的圆周线的圆柱体。该圆周线的直径可比圆柱体的高更大或更小。圆柱体的高通常沿着垂直轴。在一个实施方案中，圆柱形培养室103的直径可以为约2到约6mm，在另一个实施方案中，其可以为约20到约30mm。这些圆柱形培养室的深度可以为约0.5到约2mm。

在其它实施方案中，培养室103通常可以为盒形的(box-shaped)。该盒形可采取有矩形侧面的一般扁平盒的形式，或盒子可近似于立方体形状。在一个实施方案中，培养室103可具有约5至约10mm的宽度，最多约50mm的长度。这样的盒形培养室的深度可以为约0.5到约2mm。

本发明的培养室103还可在室底面中配置一个或多个凹陷205。这些凹陷205一般可为具有相似大小的水平和垂直尺寸的圆柱形。所述尺寸通常为约500μm。凹陷205适于保留一个或多个哺乳动物细胞201。特别适于保留受精的卵母细胞201。因此，在培养胚胎前，可用例如吸管或皮下针头将受精或未受精的卵母细胞201置于培养室103的凹陷中。如果仅有一个凹陷存在，它一般可以位于培养室底面的中心。如果存在不止一个凹陷，这些凹陷可沿一条线位于底面中，或它们可以以适当的模式布置，如由矩形、三角形或六角形单元的网格、或类似于蜘蛛网的网格的交叉点所确定的模式，或沿同心圆的周长所确定的模式布置。

本发明的中等尺寸生物反应器平台101不限于单个培养室。实际上，在一些实施方案中，生物反应器平台101包含数个培养室，例如10-20个培养室。这些培养室可以以一组或多组串联(serially)连接的培养室排列。每组可并联地(in parallel)与所述的贮器连接。因此，平台可包含单个培养室、以单一串联连接的多个培养室、并联连接的多个培养室或串联连接的培养室的组(其中每组并联连接)。

在优选的实施方案中，本发明的中等尺寸生物反应器平台101含有10个圆柱形培养室，每个培养室直径约4mm，深约1.5mm，具有位于底面中的单个凹陷，每个培养室的体积约为20μL或更小。此实施方案中，培养室串联地与贮器连接。

在另一个优选的实施方案中，本发明的中等尺寸生物反应器平台101含有一个直径约20-40mm的圆柱形培养室103。此实施方案中，培养室103含有8-20个凹陷。

培养室的内表面可以是光滑或粗糙的，但是对于某些应用，培养室可以装有支持细胞生长的支架(scaffold)206。这样的支架206可为构成培养室的材料的一部分，或它可以以可插入的印迹(imprint)的形式提供。支架206可以被成形，以与生物学上存在的界面相类似，并且它可以包含物理印记模式(pattern)，或具有不同模式的亲水和疏水位点的模式，或以上两种模式的组合。在另一个实施方案中，支架206可以被适合细胞结合的物种(species)如蛋白质、荷电基团、细胞、细胞碎片等化学功能化。

中等尺寸生物反应器平台101的流体性结构还可进一步包含混合部件301，混合部件301一般置于贮器102和培养室103之间。因此，来自两个或更多个贮器102中的流体流可在流体到达培养室之前被混合。这样的混合部件301可以包括在通道部件的内表面上的内部结构，如鲱骨式结构或无秩(chaotic)混合器，或者它可以包括增加长度的(length contributing)元件，如曲折(meander)通道或螺旋通道，其使液体通过扩散混合。所述平台还可包含将来自贮器102的液流分至数个通道中的歧管302或类似结构。

本发明的中等尺寸生物反应器平台101的贮器102的体积一般比培养室的大。在优选的实施方案中，贮器102的体积比室体积至少大10倍。在另一个优选的实施方案中，贮器102的体积比室体积至少大20倍。本发明的一个方面是来自贮器102的液流可以通过下述产生：对贮器102施加正的相对压力，或对中等尺寸生物反应器平台101的出口104施加负的相对压力，出口104经培养室与贮器102流体联通。

在一个实施方案中，围绕贮器102的结构部分包含能调节贮器体积的柔软区106。此实施方案中，对柔韧材料的外表面施加正的相对压力将产生贮器中含有的液体流向中等尺寸生物反应器平台的培养室103的液流。柔软区106优选地包含聚合材料，如PDMS、橡胶、聚乙烯等。所述材料可用本领域公知的方法附着于包含基片(substrate)的贮器102，所述方法例如用胶粘附、超声波焊接、激光焊接、热焊接、夹合(clamping)、缝合(stitching)等。

在优选的实施方案中，贮器102包含使外部与贮器联接的进气口107。此进气口107优选包含具有约0.1μm至约0.5μm的孔径的过滤器，以便可以例如阻止颗粒物质进入贮器。进气口107可与气体供应(gas supply)联接，以施加正的相对压力使液体流出贮器并流入培养室。进气口107还使得施加至中等尺寸生物反应器平台101的出口104的负的相对压力汲取贮器的液体到培养室中。施加至贮器102或出口104的正和负的相对压力分别可进一步用于控制培养室103中的液体体积。

在这些实施方案中，通过使用阀303控制空气或气体经进气口107进入贮器102，还能够控制分别来自不同贮器102a、b的液体的分布。例如，通过关闭与一个贮器102联接的阀303，将确保流向培养室103的液流来自其他的贮器102。这样的阀303将置于相对于中等尺寸生物反应器平台而言的外部。阀303可应用于预期通过施加负的相对压力至平台101的出口104进行操作的中等尺寸生物反应器平台，以及用于预期通过施加正的相对压力至贮器进行操作的平台。

中等尺寸生物反应器平台101的贮器102可采取通常的扁平圆柱体的形式或者它们可采取长通道的形式。这样的通道可以以曲折结构排列。当贮器102为圆柱体形状时，进气口107一般位于圆柱体的顶部或与之接近的位置，与培养室103联接的通道一般位于圆柱体的底部或与之接近的位置。圆柱体的底部可以有扁平的表面，或者该表面可为圆锥形或漏斗形的，它可以是倾斜或具有结合以上特征的更复杂的形状。

在一个实施方案中，中等尺寸生物反应器平台101进一步装有射频识别(RFID)标签304。该RFID标签使得可以快速和方便地识别生物反应器平台。当RFID标签中含有的信息与提供在指定生物反应器平台中被培养的细胞的人的身份相联系时，生物反应器平台101的识别是有利的。

虽然也可使用明确界定区域的疏水性表面，但是本发明的中等尺寸生物反应器平台优选由具有亲水性表面的基本透明的材料构建。虽然也可使用其他材料，如玻璃、硅、金属、弹性聚合物，但是构建材料优选为一种或多种热塑性聚合物。

本发明的中等尺寸生物反应器平台的通道和室可通过将包含与通道和室对应的结构的第一基片(substrate)与第二基片接合而形成。这样，一旦将各层基片接合，在两个基片之间形成通道和室。中等尺寸生物反应器平台不限于两个基片层。在某些实施方案中，可使用多个基片，其中在适当时每一基片可包含通道和室的结构。然后将这些多个基片(在各层中)接合起来，来组装为中等尺寸生物反应器平台。

基片中与通道和室相应的结构可通过使用任何适当的方法制造。在优选的实施方案中，基片材料为热塑性聚合物，适当的方法包括铣削(milling)、微铣(micromilling)、钻、切割、激光烧蚀、热凹凸印刷(hotembossing)、注射模制(injection moulding)和微注射模制。这些以及其他技术为本领域众所周知的。通道还可在其它基片材料中使用适当的方法如铸造、模制、软石版印刷术(soft lithography)等制造。

可使用任何适当的方法接合基片材料。在优选的实施方案中，基片材料为热塑性聚合物，且适当的接合方法包括胶粘、溶剂结合(solventbonding)、夹合、超声波焊接和激光焊接。

本发明还涉及用于中等尺寸生物反应器平台101的控制单元401。此控制单元401能够施加正的相对压力至生物反应器平台的贮器102和/或施加负的相对压力至生物反应器平台的出口104。这样的压力的应用将产生从一个或多个贮器流向生物反应器平台的培养室103的液流。通过正的相对压力被施加至贮器102的气体或由于施加至出口104的负的相对压力而被吸入贮器102的气体可具有任何组成。因此，气体可以为空气或者它可以与例如2-10％CO₂预混合和/或它可以是含有2-20％O₂的三元气体(trigas)。根据本发明的一个实施方案的控制单元401以示意图例示在图4中。

在一个实施方案中，控制单元401包含经适当的管路(conduit)与生物反应器平台的出口流体联通的液体泵404，因此泵404可用于经出口104从生物反应器平台抽吸液体并因此产生从贮器到培养室的液流。此泵404可为蠕动泵、活塞泵、注射泵、膜泵、隔膜泵、齿轮泵、微环(microannular)齿轮泵或任何其他适当类型的泵。

在另一个实施方案中，控制单元401包含一个或多个适于泵送气体的泵404。在此实施方案中，一个或多个泵404与生物反应器平台的进气口流体联通。对于生物反应器平台每个贮器，控制单元401可包含泵404；或它可以包含单个泵404；或泵404的数目可以在这两个值之间。如果控制单元401含有的泵404比贮器数少，控制单元401还将包含适当的阀，该阀能根据贮器的内容物控制供应给中等尺寸生物反应器平台的生长室的液体组成。此实施方案中所用的泵404可为活塞泵、注射泵、膜泵、隔膜泵或任何其他适当类型的泵。

在另一个实施方案中，控制单元401包含一个或多个适于泵送气体至生物反应器平台的进气口的泵404和与生物反应器平台出口流体联通的液体泵404。

本发明的控制单元401优选包含一个或多个传感器402，其用于测量中等尺寸生物反应器中液体的环境参数。这些参数通常为pH、溶解氧(O₂)、二氧化碳(CO₂)、葡萄糖、营养素、维生素、代谢产物、流速、温度、光密度、荧光信号、特异蛋白或酶、或RNA或DNA，尽管其他参数也可能是合适的。可将这些传感器402整合进与中等尺寸生物反应器出口相联接的管路中，以便对从培养室流出的液体进行测量。另一个实施方案中，传感器被安装用于测量培养室中的液体。

除了这些传感器402，控制单元401可装备光学检测和观测系统。这些光学系统可能包含光源405，如发光二极管(LED)、灯泡、汞灯等，适当的滤器406和光检测器407。LED可为发射白光型的或发射相对窄范围波长的光的类型。后一类型的LED适于测量LED对应的特征波长的光密度或用于激发荧光体发射特征波长的光，其可以作为荧光信号而被检测。或者当与合适的光滤器406和光检测器407联合时，汞灯也作为用于荧光信号检测的适当元件。

在一优选的实施方案中，控制单元401装备有数字或光学显微镜408。此实施方案中，控制单元401还可装备有一个或多个光源405。另一个实施方案中，控制单元401进一步装备有显示器409，其使培养室和其内容物经显微镜408而被监控。仍然在另一个实施方案中，控制单元401进一步包含可视化软件，该软件能够监控培养室中生长的任何细胞，并根据细胞的形态学，向控制施加至贮器和/或中等尺寸生物反应器平台的出口的压力的设备、产生空气层流的气体供应413以及调节中等尺寸生物反应器平台的温度的加热/冷却系统410发送命令。细胞的形态学可包括数目、大小、细胞的形状或方向或其组合。形态学也可包括来自光学检测系统的荧光信号或比色信号。

控制单元401还可安装调节中等尺寸生物反应器平台的温度的系统410。在一优选的实施方案中，此系统410进一步包含一个或多个与数据处理单元403配合的温度传感器411，使温度经数据处理单元403而被控制。温度调节系统410可以包含例如成形的用于容纳生物反应器平台的铝块体(block)并包含导电线圈、珀耳帖(peltier)元件、用于加热和/或冷却液体的管等。在一优选的实施方案中，控制单元401装备有带加热元件410和温度传感器411的铝块体；此温度传感器411与数据处理单元403联接。另一个优选的实施方案中，控制单元401装备有含加热元件410的透明材料如玻璃的块体。在此实施方案中，数据处理单元403可使用来自温度传感器411的信号按所谓的模型预测控制(MPC)算法通过控制加热元件的电力供应精确调节中等尺寸生物反应器平台的温度。

包含中等尺寸生物反应器平台的控制单元401可有利地含有环绕中等尺寸生物反应器平台的隔室412，可向隔室412供应气体，以在生物反应器平台周围产生空气层流(LAF)413。此“空气层流”413描述了这样的情况，空气以几乎没有湍流的模式流经隔室412，这些条件可用于使空气中漂浮的特别物质远离培养室从而防止室中细胞的污染，例如当为了物理进入而打开培养室时。在一个实施方案中，从生物反应器平台的下面到生物反应器平台上面的一个或多个出口向隔室412供应空气层流413，从而空气基本按向上的方向运动。另一个实施方案中，空气层流沿生物反应器平台表面定向流动，即以基本水平方向流动。空气层流413可由空气组成，但是在一优选的实施方案中CO₂的含量相对于空气增加到例如约2-10％，或更优选5％。在其他实施方案中，O₂的含量也可增加或降低。空气层流的压力与环境空气的压力基本相同。但是，所述压力相对于环境空气优选是增加的。当空气层流的CO₂或O₂或其他气体的含量增加时，该气流可以进一步被控制，从而可以调节生物反应器平台中液体的pH。空气层流的线性流速通常在50μm/s到0.1m/s范围内。

在一个实施方案中，控制单元401进一步包含数据处理单元403。此数据处理单元403能够从控制单元401的传感器402和/或411收集信号，并发送控制施加至贮器的正的相对压力和/或控制施加至生物反应器平台出口的负的相对压力的命令，用于控制生物反应器平台101中的液体流速，以及发送在适当时调节温度或空气层流的命令。

控制这些操作参数可基于预设的按时间顺序的事件系列，或者命令可基于从控制单元401中的传感器402和/或411收集的信号，例如在反馈环路中。如果使用预设的命令序列，这可以例如包括在给定流速用来自贮器102a的生长培养基灌注胚胎，持续设定的天数，然后在剩余的培养期中改用来自贮器102b中的生长培养基以相同或不同流速灌注，同时在所有时间维持温度为37℃。

使用来自传感器402和/或411的信号确定操作参数的设置的实例可以为，如果温度传感器411显示温度超出设定区间，则数据处理单元403将发送命令加热或冷却中等尺寸生物反应器平台，以使温度再次回到设定区间。同样pH传感器402显示pH偏离设定范围，气体供应413可以例如被调节，以使增加量的CO₂被施用到包含中等尺寸生物反应器平台的隔室412。O₂、葡萄糖和其他代谢产物(丙酮酸盐和乳酸盐)和能量(ATP/ADP)的水平也可用于控制操作参数。

操作参数的控制还可包括应用来自传感器402和/或411的信号的更复杂的指令集。例如，当来自传感器402或411的信号或观测显示培养室中有事件发生，指令集可包含用于数据处理单元403的指令以应对事件并维持参数如pH、温度或灌注培养室的营养素的稳定参数值，或者指令集可包含用于数据处理单元403的指令以对培养室中的细胞应用一组新的条件。这可能是例如当观测到培养室中的胚胎的某形态时，液流从一个贮器中含有的生长培养基变换为另一个贮器中含有的生长培养基。因此，这些条件可能包括参数如流速、温度、pH、来自不同贮器的液流分布等。

数据处理单元403还可包含用户界面，其使操作者能够手动控制操作参数(通道和室中的流速、来自不同贮器的液流的分布、温度、pH等)。因此，控制单元401可被装配为以下述方式控制中等尺寸生物反应器平台的参数值：全自动预设事件序列、或由来自控制单元401的传感器402的信号确定的全自动事件序列、手动操作事件序列、或这些操作原理的任何组合。

无论操作原理如何，数据处理单元403可生成从控制单元401的传感器收集的信号的临时日志。此临时日志还可包含例如中等尺寸生物反应器平台的培养室中的事件的信息或用于控制平台的环境参数的命令。临时日志可有利地与来自中等尺寸生物反应器平台上的RFID标签的信息相结合，在一个实施方案中，控制单元401包含读取RFID-标签的传感器。此方式使临时日志可容易地与含有关于生物反应器平台中细胞来源的信息如提供细胞的人的名字和身份、以及操作者身份的数据标签相联系。

本发明的控制单元可简单地设计为容纳单个中等尺寸生物反应器平台。但是，另一个实施方案中，控制单元可包含例如至多六个中等尺寸生物反应器平台(在一个控制单元中)。

本发明还涉及包含中等尺寸生物反应器平台101和控制单元401的系统。此系统中，生物反应器平台101优选设计为适配于本发明的控制单元401中的盒414的形式。将盒414插入控制单元401中适当设计的底座或类似结构中将确保生物反应器平台的出口与控制单元的相应管路联接，并且平台的贮器的进气口与正的相对压力供应适当联接。

将含有生物反应器平台的盒414插入控制单元中的底座中，还将使控制单元的传感器能够监控来自生物反应器平台的液体，并且也将确保控制单元温度调节系统和生物反应器平台之间的有效热传递。当盒414插入控制单元中时，作为控制单元的一部分的任何光学检测或监控系统将与中等尺寸生物反应器平台中的培养室或通道适当地对准。

因此，适配于适当设计的控制单元的包含在盒414中的中等尺寸生物反应器平台的应用，使得中等尺寸生物反应器平台和控制单元之间快速联接，这将简化集成系统的操作。在包含生物反应器平台和控制单元的系统的实例中，控制单元可以含有具有适当的温度调节系统如珀耳帖元件或加热线圈的铝块体或玻璃块体、和集成管路及确保插入盒414后有效密封的O型圈415。铝块体或玻璃块体的物理形状为只有一种可能的方式插入盒414，以使出口与控制单元的管路联接，并且贮器的进气口将适当地联接。中等尺寸生物反应器平台101和匹配的控制单元401可这样设计：通过将出口置于中等尺寸生物反应器平台的上表面或下表面使出口104朝上或朝下。对于操作者而言，盒414的正确插入优选是很明显的。

实施例

实施例1，中等尺寸生物反应器平台的构建

由四层基片材料组成的原型中等尺寸生物反应器平台采用2D绘图软件Auto-CAD LT(Autodesk，San RafaeL，CA，USA)进行设计。该生物反应器平台设计含有两个直径16mm和深5mm(体积1mL)的圆柱形贮器，其通过两个通道与接合点联接。每个贮器具有使贮器与周围环境联接的通道。从接合点出来的通道使三个直径4mm和深1.5mm(体积约20μL)的培养室串联联接。每个培养室在底面中有直径约500μm和深约200μm的凹陷。从第三个培养室出来的排废通道通向周围环境。

生物反应器平台设计的底层为具有500μm直径的通孔和三个培养室凹陷的矩形板(尺寸5cm×8cm)。此板被设计与第二基片板(尺寸4.5cm×7.5cm)接合，第二基片板含有与培养室(直径4mm)相应的三个通孔和与上层中贮器位置相匹配的位置处的两个另外的通孔(直径500μm)。这两个直径500μm的孔分别与在接合点会合的通道(宽500μm)联接，形成从接合点至相应于培养室的第一个孔的通道(宽500μm)；此外通道与其它培养室孔联接，并且最终的通道被设计与底层中的通孔匹配(从而形成排废通道)。所有的通道被设计在第二层的底面中产生。第三层(尺寸4.5cm×2.5cm)仅含有两个与贮器相应的直径16mm的通孔。第四层(尺寸4.5cm×2.5cm)包含从与两个贮器中心相应位置至板的一个边的通道(宽500μm)。第四层的通道被设计在此板的底面中产生。

AutoCAD LT设计被用于使用Synrad Fenix Marker CO₂-laser(Synrad Inc.，Mukilteo，WA，USA)将结构烧蚀到聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)基片中。透明的PMMA基片由

GmbH&Co.(PlexiglasXT20070，GmbH&Co.，Darmstadt，Germany)提供；含有贮器的层厚5mm，其它层厚1.5mm。烧蚀前将AutoCAD LT设计转换为封装的(encapsulated)post-script文件并导入控制Synrad Fenix Marker CO₂-laser的WinMark Pro软件中。用本领域技术人员公知的激光设置进行烧蚀。

在80℃经适当的退火处理(用于防止PMMA基片应力开裂)后，将三种最上面基片的底面用IR-吸收剂染料(Clear-Weld LD130，Gentex Corp.，Carbondale，PA，USA)染色。使用能产生高强的～800nm激光的Fisba FLSIron激光扫描器(Fisba Optik AG，St.Gallen，Switzerland)将不同层焊接在一起。首先将第二基片层焊接至底部基片层，随后将第三和第四层焊接至增加的叠层。焊接期间，采用由对激光透明的玻璃制成的虎钳对基片适当加压。有效焊接的最佳激光设置为本领域技术人员所公知的。

此原型中等尺寸生物反应器平台的三个培养室是开放和可进入的。在灌注操作期间，培养室可用例如PDMS平板封闭。

实施例2，中等尺寸生物反应器平台的构建

除了用直径20mm的单一培养室(0.5mL体积)代替三个串联连接的培养室(在第二基片层中)外，按实施例1中所述设计和构建中等尺寸生物反应器平台。此单一培养室的底部含有六个凹陷(直径大约500μm且深大约200μm)，它们被置于位于室中心的直径10mm的圆的周边上。

实施例3，控制单元的构建

选择适当的聚合材料盒来构建用于容纳中等尺寸生物反应器平台的原型控制单元。盒子尺寸为约16×24×12cm³。盒子装配有由用于盛放铝块体(约10×7×2cm³)(其作为热调节元件起作用)的更小的盒子组成的隔室，以及实施例1或实施例2中所述的任一中等尺寸生物反应器平台。铝块体被加工成刚好容纳生物反应器平台，并在它的与中等尺寸生物反应器平台出口相应的位置上钻孔(直径1mm)。扩大孔的开口以容纳O型橡胶圈(内径(ID)1mm)，并且出口孔装有一根内径0.5mm的聚四氟乙烯管，其与微尺寸pH-电极联接，微尺寸pH-电极进一步与2mL注射泵联接。pH-电极与传感器板(sensor board)联接，传感器板进一步与运行LabView(版本8，National Instruments，Austin，Texas，USA)的电脑联接。

将铝块体进一步加工以容纳温度调节元件，珀耳帖元件或加热线圈，其与直流电供应相联接。将电子温度传感器整合入铝块体中。用于加热元件的电子控制和温度传感器都与传感器板联接。使用定制的LabView应用软件执行基于温度传感器中的输入来控制温度的模型预测控制(MPC)算法。图5a中图示说明了算法的原理，并且图5b中的算法测试显示，随温度的程序变化，对铝块体测得的温度与时间的函数。

含有铝块体的隔室由具有可闭合盖子的透明塑料盒组成。此盒的底面有直径约1cm的圆孔，其与能向隔室供应围绕铝块体的空气层流的空气供应系统联接。

原型控制单元盒进一步装备有两个注射泵，每个注射泵装有一根(内径0.5mm)管，其使得能够与生物反应器平台进气口联接。

由LabView应用软件经传感器板对所有泵进行控制。

Claims (30)

1.中等尺寸生物反应器平台，其包含：

两个或更多个与培养室流体联通的液体贮器，所述室与出口流体联通，其中所述平台被提供有能使所述室被来自一个或多个液体贮器的液流灌注的装置。

2.根据权利要求1的中等尺寸生物反应器平台，其中培养室是可以经可闭合元件或弹性膜来物理进入的。

3.根据权利要求2的中等尺寸生物反应器平台，其中可闭合元件包括铰接的盖子或滑动的盖子。

4.根据权利要求2的中等尺寸生物反应器平台，其中弹性膜由具有自动封闭能力的材料制成。

5.根据权利要求1到4中任意一项所述的中等尺寸生物反应器平台，其中所述的能使培养室被灌注的装置包含能调节贮器体积的柔软区。

6.根据权利要求1到5中任意一项所述的中等尺寸生物反应器平台，其中所述的能使培养室被灌注的装置包含使外部与贮器联接的进气口，该进气口包含具有约0.1μm到约0.5μm的孔径的过滤器。

7.根据权利要求1到6中任意一项所述的中等尺寸生物反应器平台，其中两个或更多个贮器和培养室之间的流体联通由通道提供。

8.根据权利要求1到7中任意一项所述的中等尺寸生物反应器平台，其中生物反应器平台包含以一组或多组串联连接的培养室排列的多个培养室。

9.根据权利要求1到8中任意一项所述的中等尺寸生物反应器平台，其中生物反应器平台的培养室包含支持细胞生长的支架。

10.用于根据权利要求1到9中任意一项所述的中等尺寸生物反应器平台的控制单元，其包含用于诱导产生从两个或更多个贮器至培养室的液体流速的装置。

11.根据权利要求10的控制单元，其中所述装置能够施加正的相对压力至所述贮器和/或施加负的相对压力至所述出口。

12.根据权利要求11的控制单元，其中所述装置包含适于泵送气体至生物反应器平台进气口的泵和/或与生物反应器平台的出口流体联通的液体泵。

13.根据权利要求11的控制单元，其中所述能够施加正的相对压力至所述贮器的装置包括适于泵送气体的泵，如活塞泵、注射泵、膜泵或隔膜泵。

14.根据权利要求13的控制单元，其进一步包含气体供应，其具有含有2-10％CO₂和/或2-20％O₂的气体组成。

15.根据权利要求11的控制单元，其中所述的施加负的相对压力至所述出口的装置包含用于抽吸液体的泵，例如蠕动泵、活塞泵、注射泵、膜泵、隔膜泵、齿轮泵、微环齿轮泵。

16.根据权利要求10到15中任意一项所述的控制单元，其还包含至少一个能够测量pH、溶解氧(O₂)、二氧化碳(CO₂)、葡萄糖、营养素、维生素、代谢产物、流速、温度、光密度、荧光信号、特异蛋白或酶、或DNA’s或RNA’s的传感器。

17.根据权利要求10到16中任意一项所述的控制单元，其还包含光源，如发光二极管(LED)、灯泡、汞灯等，适当的滤器和光检测器。

18.根据权利要求10到17中任意一项所述的控制单元，其还包含数字或光学显微镜。

19.根据权利要求10到18中任意一项所述的控制单元，其还包含温度调节系统，该温度调节系系统包含成形以容纳生物反应器平台的金属块体，该块体包含导电线圈、珀耳帖元件、用于加热和/或冷却液体的管。

20.根据权利要求10到19中任意一项所述的控制单元，其包含围绕中等尺寸生物反应器平台的隔室，该隔室可以被供应气体以在生物反应器平台周围产生空气层流。

21.根据权利要求10到20中任意一项所述的控制单元，其还包含数据处理单元，该数据处理单元能够从传感器收集信号，并用来自收集的信号的信息控制来自两个或更多个贮器中每个贮器的流速、温度、气体组成和/或空气层流。

22.用于培养生物细胞的系统，其包含根据权利要求1到9中任意一项所述的中等尺寸生物反应器平台和根据权利要求10到21中任意一项所述的控制单元，其中中等尺寸生物反应器平台被包含在适配于控制单元的盒中。

23.根据权利要求22的系统，其中中等尺寸生物反应器还包含射频识别(RFID)标签，并且其中控制单元包含读取RFID标签的传感器。

24.培养生物细胞的方法，其包括以下步骤：

提供根据权利要求1到9中任意一项所述的中等尺寸生物反应器平台；

提供根据权利要求10到21中任意一项所述的控制单元；

将不同的培养基施加至各个贮器；

提供生物细胞至培养室；

用来自一个贮器或贮器组合的培养基灌注培养室；

从一个贮器到另一个贮器更换培养基或更换来自多个贮器的培养基的组合，以符合生物细胞的要求。

25.根据权利要求24的培养生物细胞的方法，其中基于预设的按时间顺序的事件系列更换培养基或培养基的组合。

26.根据权利要求24的培养生物细胞的方法，其中基于从控制单元中的传感器收集的信号更换培养基或培养基的组合。

27.根据权利要求24到26中任意一项所述的培养生物细胞的方法，其中生物细胞为哺乳动物细胞。

28.根据权利要求24到26中任意一项所述的培养生物细胞的方法，其中生物细胞为微生物细胞。

29.根据权利要求27的培养生物细胞的方法，其中哺乳动物细胞为干细胞或免疫系统细胞，如单核细胞、树突细胞或T细胞。

30.根据权利要求27的培养生物细胞的方法，其中哺乳动物细胞为未受精的或受精的卵母细胞。

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