CN1675367A

CN1675367A - 制备玉米黄素和/或其生物合成中间体和/或次级产物的方法

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Publication number: CN1675367A
Application number: CNA038197510A
Authority: CN
Inventors: C·R·朔普费尔; R·弗拉赫曼; K·赫伯斯; I·孔策; M·绍尔; M·克勒布萨特尔
Original assignee: SunGene GmbH
Current assignee: SunGene GmbH
Priority date: 2002-08-20
Filing date: 2003-08-18
Publication date: 2005-09-28
Also published as: IL166767A0; IL166507A0; AU2003260423A1; AU2003264062B2; WO2004018694A3; US7381541B2; NO20050703L; US20070094749A1; WO2004018694A2; WO2004017749A2; AU2003260424A1; US20060031963A1; NO20050598L; MXPA05001899A; MXPA05001944A; EP1532266A2; US7385123B2; EP1531683A2; EP1531683B1; CA2495235A1

Abstract

本发明涉及通过培养与野生型相比由于双链ε－环化酶核糖核酸序列而具有降低的ε－环化酶活性的经遗传修饰植物制备玉米黄素和/或其生物合成中间体和/或次级产物的方法，并且涉及经遗传修饰植物以及其作为食品和饲料的用途和用于生产类胡萝卜素提取物的用途。

Description

制备玉米黄素和/或其生物合成中间体和/或次级产物的方法

发明描述

本发明涉及通过培养与野生型相比由于双链ε-环化酶核糖核酸序列而具有降低的ε-环化酶活性的经遗传修饰植物制备玉米黄素和/或其生物合成中间体和/或次级产物(secondary products)的方法，并且涉及经遗传修饰植物及其作为食品和饲料的用途和生产类胡萝卜素提取物的用途。

类胡萝卜素，诸如番茄红素、叶黄素、β-胡萝卜素或玉米黄素，可在细菌、藻类、真菌和植物中从头合成。含有至少一个酮基的酮类胡萝卜素，即类胡萝卜素，例如虾青素、角黄素、β-胡萝卜素-4-酮、3-羟基β-胡萝卜素-4-酮、3’-羟基β-胡萝卜素-4-酮、金盏花玉红质(adonirubin)和金盏花黄质(adonixanthin)，是由某些藻类和微生物作为次级代谢物产生的天然抗氧化剂和色素。

由于其着色特性，类胡萝卜素可用作着色剂和着色辅助剂。例如玉米黄素和叶黄素用于卵黄着色，β-胡萝卜素在食品和饮料中作为橙色色素，虾青素在家畜类喂养，尤其是在红鳟、鲑鱼和虾养殖中，用作着色辅助剂。

此外，由于其抗氧化特性，类胡萝卜素如叶黄素、玉米黄素、番茄红素、β-胡萝卜素和虾青素，用于补充人类和家畜类营养以治疗和预防疾病。

研发一种经济的制备天然类胡萝卜素的生物技术方法是非常重要的。

在专利WO 00/32788中公开了通过将过表达类胡萝卜素生物合成基因和反义操作相联合影响万寿菊属花瓣中特定类胡萝卜素比率的方法。

尽管专利WO 00/32788中公开的方法提供了与野生型相比具有改变了的类胡萝卜素含量的经遗传修饰植物，但所述的方法具有以下缺点，即例如“β-类胡萝卜素途径”的类胡萝卜素如β-胡萝卜素或玉米黄素的含量水平，和所述类胡萝卜素的纯度，以及“β-类胡萝卜素途径”的类胡萝卜素如β-胡萝卜素或玉米黄素，与“α-类胡萝卜素途径”的类胡萝卜素如α-胡萝卜素或叶黄素的比率，仍然不令人满意。

因此，本发明的目的是提供通过培养植物制备玉米黄素和/或生物合成中间体和/或其次级产物的另一种方法，并且，分别地提供另外的可产生玉米黄素和/或其生物合成中间体和/或其次级产物的转基因植物而且这些转基因植物具有优化的特性，如与“α-类胡萝卜素途径”的类胡萝卜素相比玉米黄素和/或生物合成中间体和/或其次级产物的含量更高，并且该方法没有所报导的现有技术的缺点。

因此，建立了通过培养与野生型相比由于双链ε-环化酶核糖核酸序列而具有降低的ε-环化酶活性的经遗传修饰植物制备玉米黄素和/或其生物合成中间体和/或次级产物的方法。

ε-环化酶活性是指ε-环化酶的酶活性。

ε-环化酶是指具有将末端、直链番茄红素基团转化为ε-紫罗酮环的酶活性的蛋白质。

因此，ε-环化酶具体而言是指具有将番茄红素转化为δ-胡萝卜素的酶活性的蛋白质。

所以，ε-环化酶活性是指在特定时间内由ε-环化酶蛋白质转化的番茄红素的量或产生的δ-胡萝卜素的量。

因此，当与野生型相比ε-环化酶活性降低时，与野生型相比在特定时间内由ε-环化酶蛋白质转化的番茄红素的量或产生的δ-胡萝卜素的量减少。

降低的ε-环化酶活性优选地是指基于不同的细胞生物学机制，部分或基本上完全停止或阻断植物细胞、植物或其部分、组织、器官、细胞或由其产生的种子中的ε-环化酶功能。

与野生型相比，例如通过减少植物中ε-环化酶蛋白质的量或ε-环化酶mRNA的量，可以降低ε-环化酶活性。因此，通过直接测定或通过测定本发明植物中与野生型相比ε-环化酶蛋白质的量或ε-环化酶mRNA的量可以测定与野生型相比降低的ε-环化酶活性。

ε-环化酶活性的降低包括ε-环化酶的量减少至基本上完全缺乏所述ε-环化酶(即缺乏可检测到的ε-环化酶活性或缺乏免疫学可检测的所述ε-环化酶)。与野生型相比，植物中，特别优选地是在花中，ε-环化酶活性(或ε-环化酶蛋白质的量或ε-环化酶mRNA的量)优选地降低至少5％，更加优选地降低至少20％，更加优选地降低至少50％，更加优选地为降低100％。具体而言“降低”也是指完全缺乏ε-环化酶活性(或完全缺乏ε-环化酶蛋白质或ε-环化酶mRNA)。

优选地是在下述条件下测定本发明经遗传修饰植物或野生型或参照植物中ε-环化酶活性：

按照Fraser和Sandmann(Biochem.Biophys.Res.Comm.185(1)(1992)9-15)的方法可以体外测定ε-环化酶活性，测定时将磷酸钾缓冲液(pH 7.6)、底物番茄红素、红甜椒(paprika)基质蛋白质、NADP+、NADPH和ATP加入特定量植物提取物中。

特别优选地是按照Bouvier、d’Harlingue和Camara(类胡萝卜素环化酶抑制的分子分析，Arch.Biochem.Biophys.346(1)(1997)53-64)的方法测定本发明经遗传修饰植物或野生型或参照植物中ε-环化酶活性。

体外测定在0.25ml体积中进行。反应混合物包括50mM磷酸钾缓冲液(pH 7.6)、不同量的植物提取物、20nM番茄红素、0.25mg红甜椒色质体基质蛋白质、0.2mM NADP+、0.2mM NADPH和1mM ATP。将NADP/NADPH和ATP溶解于0.01ml含1mg吐温80的乙醇中后立即加入孵育介质。在30℃反应60分钟后，加入氯仿/甲醇(2∶1)终止反应。通过HPLC法分析提取入氯仿的反应产物。

使用放射性底物的另一种测定方法描述于Fraser和Sandmann(Biochem.Biophys.Res.Comm.185(1)(1992)9-15)。另一种分析方法描述于Beyer、Krncke和Nievelstein(在黄水仙(Narcissus pseudonarcissus L.)色质体中番茄红素异构酶/环化酶的反应机制，J.Biol.Chem.266(26)(1991)17072-17078)。

根据上下文，术语“植物”可以指亲本植物(野生型)或本发明的经遗传修饰植物或两者。

并且优选地且特别地当其中植物或野生型不能清楚归类的情况下，用于降低ε-环化酶活性和增加玉米黄素和/或生物合成中间体和/或其次级产物含量的“野生型”是指参照植物。

所述参照植物为万寿菊(Tagetes erecta)、孔雀草(Tagetes patula)、香叶万寿菊(Tagetes lucida)、普林万寿菊(Tagetes pringlei)、Tagetespalmeri、小万寿菊(Tagetes minuta)或钟形万寿菊(Tagetes campanulata)，特别优选地是万寿菊。

在本发明方法中，通过将至少一种双链ε-环化酶核糖核酸序列，在下文中也称为ε-环化酶dsRNA，或者保证其表达的一个表达盒或多个表达盒导入植物来降低ε-环化酶活性。

也包括这些方法，其中所述ε-环化酶dsRNA直接针对ε-环化酶基因(即诸如启动子序列的基因组DNA序列)或ε-环化酶转录本(即mRNA序列)。

根据本发明，与野生型相比，通过双链ε-环化酶核糖核酸序列降低ε-环化酶活性的经遗传修饰植物是指利用双链ε-环化酶核糖核酸序列降低ε-环化酶活性。这种利用双链RNA(“双链RNA干扰”，也称为dsRNA加工)进行基因调控的方法本身是已知的并描述于如Matzke MA等(2000)Plant Mol Biol 43：401-415；Fire A等(1998)Nature 391：806-811；WO 99/32619；WO 99/53050；WO 00/68374；WO 00/44914；WO 00/44895；WO 00/49035或WO 00/63364中。根据描述于所列引文中的过程和方法制备表达参照。

根据本发明，“双链核糖核酸序列”是指一个或多个这样的核糖核酸序列，它们或者在理论上属于互补序列，如按照Watson和Crick的碱基配对原则，和/或实际上，如由于杂交实验，能够在体外和/或体内形成双链RNA结构。

技术人员认为双链RNA结构的形成代表一种平衡态。双链分子与相应的解链形式的比率优选地至少为1∶10，优选地为1∶1，特别优选地为5∶1，最优选地为10∶1。

双链ε-环化酶核糖核酸序列或ε-环化酶dsRNA优选地是指具有双链结构区域并在所述区域内含有如下核酸序列的RNA分子，所述核酸序列

a)与所述植物固有的至少部分ε-环化酶转录本相同和/或

b)与所述植物固有的至少部分ε-环化酶-启动子序列相同。

因此，在本发明的方法中，优选地通过将具有双链结构区域并在所述区域内含有如下核酸序列的RNA导入植物降低ε-环化酶活性，其中所述核酸序列

a)与所述植物固有的至少部分ε-环化酶转录本相同和/或

b)与所述植物固有的至少部分ε-环化酶-启动子序列相同。

术语“ε-环化酶转录本”是指ε-环化酶基因的转录部分，其中除了ε-环化酶-编码序列之外，还包括非编码序列，如UTR。

“与所述植物固有的至少部分ε-环化酶-启动子序列相同”的RNA优选地意思是指RNA序列与至少部分ε-环化酶-启动子序列的理论转录本即相应RNA序列相同。

植物固有的ε-环化酶转录本的“部分”或植物固有的ε-环化酶启动子序列的“部分”是指可以从涵盖转录本或启动子序列少数几个碱基到多至全部序列的部分序列。技术人员通过常规实验方法可以快速测定所述部分序列的最佳长度。

部分序列的长度通常为至少10个碱基且不多于2kb，优选地为至少25个碱基且不多于1.5kb，特别优选地为至少50个碱基且不多于600个碱基，非常特别优选地为至少100个碱基且不多于500个碱基，最优选地为至少200个碱基或至少300个碱基且不多于400个碱基。

为了获得尽可能高的特异性且不降低其它酶的活性(其中其它酶活性的降低是不期望的)优选地对部分序列进行选择。因此选择ε-环化酶转录本的ε-环化酶dsRNA部分序列部分和/或在其它序列中不存在的ε-环化酶启动子序列的部分序列是有利的。

因此，在一个特别优选的实施方案中，ε-环化酶dsRNA包含与植物固有ε-环化酶部分转录本相同的且含有植物固有的编码ε-环化酶的核酸的5’端或3’端的序列。转录本5’或3’端的非翻译区特别适于制备选择型双链结构。

本发明进一步涉及当导入植物有机体(或细胞、组织、器官或从其得到的繁殖材料)时引起ε-环化酶降低的双链RNA分子(dsRNA分子)。

在上下文中，降低ε-环化酶(ε-环化酶dsRNA)表达的双链RNA分子优选地包含

a)含有至少基本上与至少部分有意-RNA ε-环化酶转录本相同的核糖核苷酸序列的有意-RNA链，和

b)基本上，优选地完全，与a)中RNA有意链互补的反义-RNA链。

关于dsRNA分子，ε-环化酶核酸序列或相应的转录本优选地是指SEQID No.4的序列或其部分。

“基本上相同”意思是指与ε-环化酶靶序列相比，dsRNA序列也可以具有插入、缺失或单一位点突变，而且引起表达有效降低。抑制性dsRNA的有意链和ε-环化酶基因至少部分有意-RNA转录本之间的同源性或反义链和ε-环化酶基因互补链之间的同源性优选地为至少75％，特别优选地为80％，非常优选地为至少90％，最优选地为100％。

为了引起ε-环化酶表达有效降低，dsRNA和ε-环化酶基因转录本之间100％的序列一致性不是绝对必须的。因此，该方法允许由于遗传突变、多态性或进化多样性而存在的序列差异是有利的。因此，例如利用产生于第一有机体ε-环化酶序列的dsRNA抑制第二有机体中ε-环化酶的表达是可能的。为了该目的，dsRNA优选地包含与保守区域对应的ε-环化酶基因转录本的序列区域。所述保守区域可以容易地来自于序列比较。

此外，“基本上相同的”dsRNA也可以定义为能够与部分ε-环化酶基因转录本杂交的核酸序列，例如在400mM NaCl、40mM PIPES pH 6.4、1mM EDTA中50℃或70℃杂交12至16小时)。

“基本上互补”意思是与有意-RNA链的互补链相比，反义-RNA链也可以具有插入、缺失和单一位点突变。反义-RNA链和有意-RNA链互补链之间的同源性优选地为至少80％，特别优选地为至少90％，非常特别优选地为至少95％，最优选地为100％。

利用被导入所述植物并在所述植物中转录成ε-环化酶dsRNA的核酸构建体进行用ε-环化酶dsRNA转化植物是优选的。

因此本发明还涉及这样的核酸构建体，该核酸构建体可转录成

b)基本上，优选地完全，与a)中RNA有意链互补的反义-RNA链。

这些核酸构建体也称为表达盒或下文中的表达载体。

在另一个实施方案中，ε-环化酶dsRNA包括

a)含有至少基本上与至少部分ε-环化酶基因启动子区的有意-RNA转录

本相同的核糖核苷酸序列的有意-RNA链，和

b)基本上，优选地完全，与a)中RNA有意链互补的反义-RNA链。

优选地，ε-环化酶启动子区是指SEQ ID No.13的序列或其部分。

优选地用于植物转化的相应核酸构建体包含

a)基本上与至少部分ε-环化酶基因启动子序列相同的有意-DNA链，和

b)基本上，优选地完全，与a)中DNA有意链互补的反义-DNA链。

特别优选地利用以下部分序列制备用于降低，特别是用于降低万寿菊ε-环化酶活性的ε-环化酶dsRNA序列且特别是其表达盒：

SEQ ID No.6：ε-环化酶5’-末端区域的有意片段

SEQ ID No.7：ε-环化酶5’-末端区域的反义片段

SEQ ID No.8：ε-环化酶3’-末端区域的有意片段

SEQ ID No.9：ε-环化酶3’-末端区域的反义片段

SEQ ID No.13：ε-环化酶启动子的有意片段

SEQ ID No.14：ε-环化酶启动子的反义片段

dsRNA可以由一条或多条多核糖核苷酸链组成。为了实现相同的目的，当然将多种含有上面所定义的核糖核苷酸序列片段之一的单独dsRNA分子导入细胞或有机体也是可行的。

双链dsRNA结构可以由两条互补的、单独的RNA链形成，优选地由单一一条自身互补的RNA链形成。在后一情况下，有意-RNA和反义-RNA链优选地以反向重复序列彼此共价连接。

例如在专利WO 99/53050中所述，dsRNA也可以含有通过连接序列(“接头”；例如内含子)将有意和反义链连接的发夹结构。自身互补dsRNA结构是优选的，这是因为它们只需要表达一条RNA序列并且它们总含有等摩尔比例的互补RNA链。连接序列优选地是内含子(例如马铃薯ST-LS1基因内含子；Vancanneyt GF等(1990)Mol Gen Genet 220(2)：245-250)。

编码dsRNA的核酸序列可以进一步包括一些元件，例如转录终止信号或多腺苷酸化信号。

然而，如果dsRNA直接针对ε-环化酶启动子序列，优选地为不包含任何转录终止信号或多腺苷酸化信号。这能够使dsRNA滞留在细胞核中并阻止dsRNA散布于植物体各处。

如果dsRNA的两条链在细胞或植物体内组装，可以下述方式进行，例如：

a)用包含两个表达盒的载体转化细胞或植物，

b)用两个载体，一个含有具有有意链的表达盒，另一个含有具有反义链的表达盒，共转化细胞或植物。

c)两个不同植物品系杂交，其中所述不同植物品系一个含有具有有意链的表达盒，另一个含有具有反义链的表达盒。

可以在细胞外或细胞内起始RNA双链体的形成。

可以在体内或体外合成dsRNA。为了该目的，将编码dsRNA的DNA序列置于至少一个遗传控制元件(例如启动子)控制下的表达盒中是可能的。多聚腺苷酸化作用是非必需的，也不需要任何存在以起始翻译的元件。MPdsRNA表达盒优选地存在于转化构建体或转化载体上。

在一个优选的实施方案中，使用了其花具有最低ε-环化酶表达率的经遗传修饰植物。

这是优选地通过以花特异，特别优选地是以花瓣特异的方式降低ε-环化酶活性实现的。

在上述特别优选的实施方案中，这是通过在花特异启动子或，甚至更优选的在花瓣特异启动子控制下转录ε-环化酶dsRNA序列实现的。

因此，在一个特别优选的实施方案中，dsRNA的表达是由在花特异启动子的功能控制下，特别优选地是在SEQ ID No.10所述的启动子或其功能等同部分控制下的表达构建体起始进行的。

为了该目的优选地将编码ε-环化酶dsRNA反义链和/或有意链或者编码所述dsRNA的自身互补链的表达盒插入转化载体并利用上述方法将其导入植物细胞。对于本发明的目的稳定插入基因组是有利的。

可以以尽可能使每个细胞至少一个拷贝的量将dsRNA导入细胞。根据需要，较大量(例如每个细胞至少5、10、100、500或1000个拷贝)可以引起更有效的降低。

dsRNA方法，利用反义RNA和VIGS(病毒诱导的基因沉默)方法共抑制也称为转录后基因沉默(PTGS)或转录基因沉默(TGS)。

在本发明方法优选的实施方案中，所使用的植物选自：毛茛科(Ranunculaceae)、小檗科(Berberidaceae)、罂粟科(Papaveraceae)、大麻科(Cannabaceae)、蔷薇科(Rosaceae)、豆科(Fabaceae)、亚麻科(Linaceae)、葡萄科(Vitaceae)、芸苔科(Brassicaceae)、葫芦科(Cucurbitaceae)、报春花科(Primulaceae)、石竹科(Caryophyllaceae)、苋科(Amaranthaceae)、龙胆科(Gentianaceae)、牻牛儿苗科(Geraniaceae)、忍冬科(Caprifoliaceae)、木犀科(Oleaceae)、旱金莲科(Tropaeolaceae)、茄科(Solanaceae)、玄参科(Scrophulariaceae)、菊科(Asteraceae)、百合科(Liliaceae)、石蒜科(Amaryllidaceae)、禾本科(Poaceae)、兰科(Orchidaceae)、锦葵科(Malvaceae)、木兰科(Illiaceae)或唇形科(Lamiaceae)。特别优选的是选自以下植物属的植物：金盏菊属(Marigold)、万寿菊属(Tagetes)、金合欢属(Acacia)、乌头属(Aconitum)、侧金盏花属(Adonis)、阿尼菊属(Arnica)、耧斗菜属(Aquilegia)、紫菀属(Aster)、黄芪属(Astragalus)、紫葳属(Bignonia)、金盏花属(Calendula)、驴蹄草属(Caltha)、风铃草属(Campanula)、美人蕉属(Canna)、矢车菊属(Centaurea)、桂竹香属(Cheiranthus)、茼蒿属(Chrysanthemum)、柑桔属(Citrus)、还阳参属(Crepis)、番红花属(Crocus)、南瓜属(Curcurbita)、金雀儿属(Cytisus)、凤凰木属(Delonia)、翠雀属(Delphinium)、石竹属(Dianthus)、异果菊属(Dimorphotheca)、多榔菊属(Doronicum)、花菱草属(Eschscholtzia)、连翘属(Forsythia)、Fremontia、勋章菊属(Gazania)、断肠草属(Gelsemium)、染料木属(Genista)、龙胆属(Gentiana)、老鹳草属(Geranium)、扶郎花属(Gerbera)、水杨梅属(Geum)、银桦属(Grevilla)、堆心菊属(Helenium)、向日葵属(Helianthus)、獐耳细辛属(Hepatica)、独活属(Heracleum)、木槿属(Hibiscus)、赛菊芋属(Heliopsis)、金丝桃属(Hypericum)、猫儿菊属(Hypochoeris)、凤仙花属(Impatiens)、鸢尾属(Iris)、蓝花楹属(Jacaranda)、棣棠属(Kerria)、毒豆属(Laburnum)、香豌豆属(Lathyrus)、狮齿菊属(Leontodon)、百合属(Lilium)、亚麻属(Linum)、百脉根属(Lotus)、番茄属(Lycopersicon)、珍珠菜属(Lysimachia)、合囊蕨属(Maratia)、苜蓿属(Medicago)、沟酸浆属(Mimulus)、水仙属(Narcissus)、月见草属(Oenothera)、木犀属(Osmanthus)、碧冬茄属(Petunia)、石楠属(Photinia)、酸浆属(Physalis)、牧根草属(Phyteuma)、委陵菜属(Potentilla)、火棘属(Pyracantha)、毛茛属(Ranunculus)、杜鹃花属(Rhododendron)、蔷薇属(Rosa)、金光菊属(Rudbeckia)、千里光属(Senecio)、蝇子草属(Silene)、松香草属(Silphium)、白芥属(Sinapsis)、花楸属(Sorbus)、鹰爪豆属(Spartium)、黄钟花属(Tecoma)、蝴蝶草属(Torenia)、婆罗门参属(Tragopogon)、金莲花属(Trollius)、旱金莲属(Tropaeolum)、郁金香属(Tulipa)、款冬属(Tussilago)、荆豆属(Ulex)、堇菜属(Viola)或百日草属(Zinnia)。

非常特别优选的是选自以下植物物种的植物：金盏菊、万寿菊或孔雀草。

本发明制备玉米黄素和/或其生物合成中间体和/或次级产物的方法中，培养经遗传修饰植物，下文中也称为转基因植物，的步骤之后优选地为收获植物并从植物，特别优选地为从植物花瓣，分离玉米黄素和/或其生物合成中间体和/或次级产物。

转基因植物以本身已知的方式生长于营养培养基中并如前所述进行收获。

以本身已知的方式从收获的花瓣中分离玉米黄素和/或其生物合成中间体和/或次级产物，例如通过干燥和随后的提取以及，根据需要，进一步化学或物理纯化过程，例如沉淀方法、结晶法、诸如精馏法的热分离方法或诸如层析的物理分离方法。例如，通过诸如丙酮、己烷、醚或甲基叔丁基醚的有机溶剂优选地从花瓣中分离玉米黄素和/或生物合成中间体和/或其次级产物。

其它分离酮类胡萝卜素，特别是从花瓣分离酮类胡萝卜素，的方法描述于，例如，Egger和Kleinig(Phytochemistry(1967)6，437-440)以及Egger(Phytochemistry(1965)4，609-618)中。

玉米黄素生物合成中间体和/或其次级产物优选地选自：番茄红素、β-胡萝卜素、虾青素、角黄素、β-胡萝卜素-4-酮、3-羟基β-胡萝卜素-4-酮、3’-羟基β-胡萝卜素-4-酮、金盏花玉红质和金盏花黄质、堇菜黄素、花药黄质、新黄素、辣椒红素、辣椒红。

玉米黄素生物合成中间体是指生物合成图解中玉米黄素生物化学途径中的类胡萝卜素。所述中间体优选地为番茄红素和/或β-胡萝卜素。

玉米黄素生物合成次级产物是指生物合成图解中来源于玉米黄素的类胡萝卜素，例如花药黄质、堇菜黄素和新黄素。然而，具体而言，玉米黄素生物合成次级产物也指例如通过将其它酶活性导入植物而生物合成的玉米黄素及其中间体来源的那些类胡萝卜素。

例如，通过在经遗传修饰植物中引入酮酶活性，如通过将编码酮酶的核酸导入亲本植物，可能使经遗传修饰植物由β-类胡萝卜素途径的类胡萝卜素，如β-胡萝卜素或玉米黄素，起始产生酮类胡萝卜素诸如虾青素、角黄素、β-胡萝卜素-4-酮、3-羟基β-胡萝卜素-4-酮、3’-羟基β-胡萝卜素-4-酮、金盏花玉红质或金盏花黄质。

因此，玉米黄素生物合成次级产物也特别是指虾青素、角黄素、β-胡萝卜素-4-酮、3-羟基β-胡萝卜素-4-酮、3’-羟基β-胡萝卜素-4-酮、金盏花玉红质或金盏花黄质。

特别优选的玉米黄素次级产物是虾青素。

本发明还涉及制备经遗传修饰植物的方法，其中含有上述核酸构建体的表达盒被导入亲本植物。

表达盒含有调节信号，即控制宿主细胞中编码序列表达的调节性核酸序列。在一个优选的实施方案中，表达盒含有上游启动子，即在编码序列的5’端，和下游多腺苷酸化信号，即在3’端，并且，根据需要，还含有其它定位于5’端和3’端之间可操作连接于编码序列的用于至少一个上述基因的调节元件。可操作连接意思是指依次排列启动子、编码序列、终止子以及，根据需要，以每个调节元件在试图表达编码序列时均能够行使其功能方式连接的其它调节元件。

下面以举例的方式描述了优选的用于植物的核酸构建体、表达盒和载体以及产生转基因植物的方法，以及转基因植物本身。

优选地用于可操作连接的序列(但不限于此)是靶向性序列以保证亚细胞定位于质外体、液泡、质体、线粒体、内质网(ER)、细胞核、油质体或其它腔隙中，以及是翻译增强子如来自烟草花叶病毒的5’前导序列(Gallie等，Nucl.Acids Res.15(1987)，8693-8711)。

表达盒适当的启动子大体而言可以是能够控制植物中外源基因表达的任意启动子。

“组成型”启动子是指在植物发育期间相对宽的期间内，优选地为植物发育期的所有时间，在多数优选地为全部组织中保证表达的启动子。

特别优选地使用植物启动子或来源于植物病毒的启动子。所给出的特别优选的启动子是花椰菜花叶病毒(cauliflower mosaic virus)35S转录本的CaMV启动子(Franck等(1980)Cell 21：285-294；Odell等(1985)Nature313：810-812；Shewmaker等(1985)Virology 140：281-288；Gardner等(1986)Plant Mol Biol 6：221-228)，或者19S CaMV启动子(US 5,352,605；WO 84/02913；Benfey等(1989)EMBO J 8：2195-2202)。

更加适当的组成型启动子是pds启动子(Pecker等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci USA 89：4962-4966)或核酮糖二磷酸羧化酶加氧酶小亚基(SSU)启动子(US 4,962,028)、豆球蛋白B启动子(GenBank Acc.No.X03677)、农杆菌属(agrobacterium)胭脂碱合酶启动子、TR双启动子、农杆菌属OCS(章鱼碱合酶)启动子、遍在蛋白启动子(Holtorf S等(1995)Plant Mol Biol29：637-649)遍在蛋白1启动子(Christensen等(1992)Plant Mol Biol18：675-689；Bruce等(1989)Proc Natl Acad Sci USA 86：9692-9696)、Smas启动子、肉桂醇脱氢酶启动子(US 5,683,439)、液泡ATP酶亚基启动子或来自小麦的富含脯氨酸的蛋白质启动子(WO 91/13991)、Pnit启动子(Y07648.L，Hillebrand等(1998)，Plant.Mol.Biol.36，89-99，Hillebrand等(1996)，Gene，170，197-200)，以及其它为技术人员所熟知的其在植物中组成型表达基因的启动子。

表达盒也可以含有化学可诱导启动子(综述文章：Gatz等(1997)AnnuRev Plant Physiol Plant Mol Biol 48：89-108)，通过化学可诱导启动子能够在特定时间控制植物中酮酶基因的表达。同样能够使用该种类型的其它启动子，例如PRP1启动子(Ward等(1993)Plant Mol Biol 22：361-366)、水杨酸可诱导启动子(WO 95/19443)、苯磺酰胺可诱导启动子(EP 0 388 186)、四环素可诱导启动子(Gatz等(1992)Plant J 2：397-404)、脱落酸可诱导启动子(EP 0 335 528)或者乙醇-或环己酮-可诱导启动子(WO 93/21334)。

更加优选的启动子是那些通过生物或非生物胁迫诱导的启动子，例如PRP1基因的病原体-可诱导启动子(Ward等(1993)Plant Mol Biol22：361-366)、热诱导的番茄hsp70或hsp80启动子(US 5,187,267)、冷诱导的马铃薯α-淀粉酶启动子(WO 96/12814)、光诱导的PPDK启动子或创伤诱导的pinII启动子(EP375091)。

病原体-可诱导的启动子包括那些由于病原体攻击而诱导基因的启动子，所述基因例如PR蛋白质基因、SAR蛋白质基因、β-1，3-葡聚糖酶基因、几丁质酶基因等等(例如Redolfi等(1983)Neth J Plant Pathol 89：245-254；Uknes等(1992)The Plant Cell 4：645-656；Van Loon(1985)Plant Mol Viral4：111-116；Marineau等(1987)Plant Mol Biol 9：335-342；Matton等(1987)Molecular Plant-Microbe Interactions 2：325-342；Somssich等(1986)ProcNatl Acad Sci USA 83：2427-2430；Somssich等(1988)Mol Gen Genetics2：93-98；Chen等(1996)Plant J 10：955-966；Zhang和Sing(1994)Proc NatlAcad Sci USA 91：2507-2511；Warner等(1993)Plant J 3：191-201；Siebertz等(1989)Plant Cell 1：961-968(1989)。

作为创伤可诱导启动子还包括诸如pinII基因启动子(Ryan(1990)AnnRev Phytopath 28：425-449；Duan等(1996)Nat Biotech 14：494-498)、wun1和wun2基因启动子(US 5,428,148)、win1和win2基因启动子(Stanford等(1989)Mol Gen Genet 215：200-208)、系统素启动子(McGurl等(1992)Science 255：1570-1573)、WIP1基因启动子(Rohmeier等(1993)Plant MolBiol 22：783-792；Ekelkamp等(1993)FEBS Letters 323：73-76)、MPI基因启动子(Corderok等(1994)The Plant J 6(2)：141-150)等等。

其它适当的启动子的实例为果实成熟特异的启动子，例如番茄果实成熟特异的启动子(WO 94/21794、EP 409 625)。因为一些组织的形成天然依赖于发育，所以发育依赖的启动子包括一些组织特异性启动子。

其它特别优选的启动子是那些保证在植物组织或部分例如发生酮类胡萝卜素或其前体生物合成的部分中表达的启动子。优选的实例是具有花药、子房、花瓣、萼片、花、叶子、蒂和根以及其组合特异性的启动子。

对块茎、贮藏根或根特异的启动子的实例为patatin启动子I类(B33)或马铃薯组织蛋白酶D抑制剂启动子。

叶特异性启动子的实例为马铃薯胞质FBP酶启动子(WO 97/05900)、核酮糖二磷酸羧化酶加氧酶(核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶)SSU启动子(小亚基)或马铃薯ST-LSI启动子(Stockhaus等(1989)EMBO J 8：2445-2451)。

花特异性启动子的实例为八氢番茄红素合酶启动子(WO 92/16635)、P-rr基因启动子(WO 98/22593)或，特别优选地为，花特异的拟南芥菜(Arabidopsis thaliana)AP3启动子(AL132971：核苷酸区域9298-10200；Hill等(1998)Development 125：1711-1721)的修饰形式AP3P。

花药特异性启动子的实例为5126启动子(US 5,689,049、US 5,689,051)、glob-l启动子或g-玉米醇溶蛋白启动子。

其它适于在植物中表达的启动子描述于Rogers等(1987)Meth inEnzymol 153：253-277；Schardl等(1987)Gene 61：1-11和Berger等(1989)Proc Natl Acad Sci USA 86：8402-8406。

本申请中所述的所有启动子通常能够使双链ε-环化酶核糖核酸序列在本发明的植物中表达。

在本发明方法中和本发明经遗传修饰植物中特别优选的是花特异启动子。

优选地通过将适当的启动子融合于上述转录双链ε-环化酶核糖核酸序列的核酸序列上，且优选地融合于被插入到启动子和核酸序列之间并编码质体特异转运肽的核酸序列上，并且通过如描述于T.Maniatis、E.F.Fritsch和J.Sambrook，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY(1989)，以及T.J.Silhavy、M.L.Berman和L.W.Enquist，Experiments with GeneFusions，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY(1984)，以及Ausubel，F.M.等，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Assoc.和Wiley-Interscience(1987)中的常规重组和克隆技术融合多腺苷酸化信号产生表达盒。

优选插入的编码质体转运肽的核酸确保定位于质体且特别是定位于色质体。

特别优选的转运肽来自于烟草(Nicotiana tabacum)质体转酮酶或另一种转运肽(例如核酮糖二磷酸羧化酶加氧酶小亚基(rbcS)的转运肽或铁氧还蛋白NADP氧化还原酶的转运肽，以及异戊烯焦磷酸异构酶2的转运肽)或其功能等同物。

特别优选的是在三个阅读框内作为在NcoI切割位点中具有ATG密码子的KpnI/BamHI片段的烟草质体转酮酶质体转运肽三个盒的核酸序列：

pTP09

KpnI_GGTACCATGGCGTCTTCTTCTTCTCTCACTCTCTCTCAAGCTATCCTCTCTCGTTCTGTC

CCTCGCCATGGCTCTGCCTCTTCTTCTCAACTTTCCCCTTCTTCTCTCACTTTTTCCGGCCTTAA

ATCCAATCCCAATATCACCACCTCCCGCCGCCGTACTCCTTCCTCCGCCGCCGCCGCCGCCGTCG

TAAGGTCACCGGCGATTCGTGCCTCAGCTGCAACCGAAACCATAGAGAAAACTGAGACTGCGGGA

TCC_BamHI

pTP10

KpnI_GGTACCATGGCGTCTTCTTCTTCTCTCACTCTCTCTCAAGCTATCCTCTCTCGTTCTGTC

CCTCGCCATGGCTCTGCCTCTTCTTCTCAACTTTCCCCTTCTTCTCTCACTTTTTCCGGCCTTAA

ATCCAATCCCAATATCACCACCTCCCGCCGCCGTACTCCTTCCTCCGCCGCCGCCGCCGCCGTCG

TAAGGTCACCGGCGATTCGTGCCTCAGCTGCAACCGAAACCATAGAGAAAACTGAGACTGCGCTG

GATCC_BamHI

pTP11

KpnI_GGTACCATGGCGTCTTCTTCTTCTCTCACTCTCTCTCAAGCTATCCTCTCTCGTTCTGTC

CCTCGCCATGGCTCTGCCTCTTCTTCTCAACTTTCCCCTTCTTCTCTCACTTTTTCCGGCCTTAA

ATCCAATCCCAATATCACCACCTCCCGCCGCCGTACTCCTTCCTCCGCCGCCGCCGCCGCCGTCG

TAAGGTCACCGGCGATTCGTGCCTCAGCTGCAACCGAAACCATAGAGAAAACTGAGACTGCGGGG

ATCC_BamHI

质体转运肽的其它实例是拟南芥菜质体异戊烯焦磷酸异构酶2(IPP-2)的转运肽和豌豆核酮糖二磷酸羧化酶小亚基(rbcS)的转运肽(Guerineau，F、Woolston，S、Brooks，L、Mullineaux，P(1988)，将外源蛋白靶向色质体的表达盒，Nucl.Acids Res.16：11380)。

本发明的核酸能够合成制备或天然获得或者可以包含合成或天然核酸成分的混合物，并且含有来自不同有机体的多种异源基因。

终止子的实例是35S终止子(Guerineau等(1988)Nucl Acids Res.16：11380)、nos终止子(Depicker A、Stachel S、Dhaese P、Zambryski P、Goodman HM，胭脂碱合酶：转录本图谱和DNA序列，J Mol Appl Genet.1982；1(6)：561-73)或ocs终止子(Gielen，J、de Beuckeleer、M，Seurinck，J、Debroek，H、de Greve，H、Lemmers，M、van Montagu，M、Schell，J(1984)，根癌农杆菌质粒pTiAch5的TL-DNA的全长序列，EMBO J.3：835-846)。

而且，使用提供适当的限制性切割位点或去除冗余DNA或限制性切割位点的操作法是可能的。关于插入、缺失或替代，例如转换或颠换，用于体外诱变、引物修复、限制性酶切或连接是可能的。

使用适当的操作方法，诸如限制性酶切、回切(chewing back)或填充突出端形成钝末端，以提供连接片段的互补末端是可能的。

优选的多腺苷酸化信号是植物多腺苷酸化信号，优选地为那些基本上符合根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)T-DNA多腺苷酸化信号的多腺苷酸化信号，特别是Ti质粒pTiACH5的T-DNA基因3(章鱼碱合酶)(Gielen等，EMBO J.3(1984)，835 ff)的多腺苷酸化信号或其功能等同物。

将核酸序列转移进入植物基因组称为转化。

为了该目的，使用本身已知的方法从瞬时或稳定转化的植物组织或植物细胞进行植物的转化和再生是可能的。

转化植物的适当方法是通过聚乙二醇诱导DNA摄入的原生质体转化法、称为粒子轰击法的使用基因枪的生物弹射击(biolistic)法、电穿孔、干燥胚在含有DNA的溶液中孵育、微注射和上述农杆菌属(Agrobacterium)介导的基因转移。所述方法描述于，例如B.Jenes等，基因转移技术，在：Transgenic Plants，Vol.1，Engineering and Utilization(S.D.Kung和R.Wu编辑，Academic Press)(1993)一书中的128-143页和Potrykus，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Molec.Biol.42(1991)，205-225。

欲表达的构建体优选地克隆入适于转化根癌农杆菌的载体中，例如pBin19(Bevan等，Nucl.Acids Res.12(1984)，8711)或特别优选的是pSUN2、pSUN3、pSUN4或pSUN5(WO 02/00900)。

用表达盒转化的农杆菌能够用于以已知的方法转化植物，例如在农杆菌溶液中浸浴创伤的叶子或叶片并随后在适当的培养基中培养。

对于优选地产生经遗传修饰植物，下文也称为转基因植物，将融合表达盒克隆入适于转化根癌农杆菌的载体，例如pBin19或，特别是，pSUN5。

然后用此种载体转化的农杆菌能够以已知的方式用于转化植物，特别是作物植物，例如通过在农杆菌溶液中浸浴创伤的叶子或叶片并随后在适当的培养基中培养。

通过农杆菌转化植物的方法尤其公开于F.F.White，高等植物中用于基因转移的载体；在Transgenic Plants，Vol.1，Engineering and Utilization(S.D.Kung和R.Wu编辑，Academic Press，1993)一书中的第15-38页。含有整合入表达盒以表达编码酮酶的基因的转基因植物能够以已知的方式从创伤叶子或叶片的转化细胞再生形成。

为了用双链ε-环化酶核酸序列转化宿主细胞，将表达盒整合并插入重组载体，该重组载体的载体DNA含有额外的功能调节信号，例如用于复制或整合的序列。适当的载体尤其描述于“Methods in Plant MolecularBiology and Biotechnology”(CRC Press)，6/7章，71-119页(1993)。

利用上面引用的重组和克隆技术，能够将表达盒克隆入使其能够在诸如大肠杆菌(E.coli)中复制的适当的载体中。适当的克隆载体尤其为pJIT117(Guerineau等(1988)Nucl.Acids Res.16：11380)、pBR322、pUC系列、M13mp系列和pACYC184。在大肠杆菌和农杆菌中均能够复制的双元载体是特别优选的。

本发明进一步涉及与野生型相比，具有由于双链ε-环化酶核糖核酸序列引起降低的ε-环化酶活性的经遗传修饰植物。

如上所述，在特定的实施方案中，经遗传修饰植物含有具双链结构区域并在所述区域内含有以下核酸序列的RNA，所述核酸序列

a)与所述植物固有的至少部分ε-环化酶转录本相同和/或

b)与所述植物固有的至少部分ε-环化酶启动子序列相同。

经遗传修饰植物优选地选自毛茛科、小檗科、罂粟科、大麻科、蔷薇科、豆科、亚麻科、葡萄科、芸苔科、葫芦科、报春花科、石竹科、苋科、龙胆科、牻牛儿苗科、忍冬科、木犀科、旱金莲科、茄科、玄参科、菊科、百合科、石蒜科、禾本科、兰科、锦葵科、木兰科或唇形科。

特别优选的经遗传修饰植物是选自以下植物属的植物：金盏菊属、万寿菊属、金合欢属、乌头属、侧金盏花属、阿尼菊属、耧斗菜属、紫菀属、黄芪属、紫葳属、金盏花属、驴蹄草属、风铃草属、美人蕉属、矢车菊属、桂竹香属、茼蒿属、柑桔属、还阳参属、番红花属、南瓜属、金雀儿属、凤凰木属、翠雀属、石竹属、异果菊属、多榔菊属、花菱草属、连翘属、Fremontia、勋章菊属、断肠草属、染料木属、龙胆属、老鹳草属、扶郎花属、水杨梅属、银桦属、堆心菊属、向日葵属、獐耳细辛属、独活属、木槿属、赛菊芋属、金丝桃属、猫儿菊属、凤仙花属、鸢尾属、蓝花楹属、棣棠属、毒豆属、香豌豆属、狮齿菊属、百合属、亚麻属、百脉根属、番茄属、珍珠菜属、合囊蕨属、苜蓿属、沟酸浆属、水仙属、月见草属、木犀属、碧冬茄属、石楠属、酸浆属、牧根草属、委陵菜属、火棘属、毛茛属、杜鹃花属、蔷薇属、金光菊属、千里光属、蝇子草属、松香草属、白芥属、花楸属、鹰爪豆属、黄钟花属、蝴蝶草属、婆罗门参属、金莲花属、旱金莲属、郁金香属、款冬属、荆豆属、堇菜属或百日草属。

非常特别优选的遗传修饰选自以下植物属：金盏菊、万寿菊或孔雀草。

此外本发明还涉及转基因植物，涉及其繁殖材料并涉及其植物细胞、组织或部分，尤其是其花瓣。

如上述的经遗传修饰植物可以用于制备玉米黄素和/或其生物合成中间体和/或次级产物，特别是用于制备番茄红素、β-胡萝卜素、虾青素、角黄素、β-胡萝卜素-4-酮、3-羟基β-胡萝卜素-4-酮、3’-羟基β-胡萝卜素-4-酮、金盏花玉红质或金盏花黄质，并且特别是用于制备虾青素。

与野生型相比，本发明经遗传修饰植物具有含量增加的至少一种选自玉米黄素和/或生物合成中间体和/或其次级产物的类胡萝卜素。

在这种情况下，增加的含量也是指已经被引起变化的酮类胡萝卜素、或虾青素的含量。

具有含量增加的玉米黄素和/或其生物合成中间体和/或次级产物并被人类和动物食用的经遗传修饰植物也可以，例如，直接或经本身已知的加工后，用于作为食品或饲料或作为饲料添加剂和食品添加剂。经遗传修饰植物也可以用于制备所述植物的含类胡萝卜素提取物和/或制备饲料添加剂和食品添加剂。

经遗传修饰植物也可以用作园艺领域的装饰植物。

现在将通过下面的实施例，但并不限于此，阐述本发明：

一般实验条件：

重组DNA序列分析

按照Sanger的方法(Sanger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74(1977)，5463-5467)，使用Licor激光荧光DNA序列分析仪(购自MWG Biotech，Ebersbach，Germany)对重组DNA分子测序。

实施例1：用于在万寿菊中进行ε-环化酶dsRNA花特异性表达的双链ε-环化酶核糖核酸序列表达盒的克隆载体的制备

由ε-环化酶片段组成的反向重复转录本在花特异的拟南芥菜启动子AP3(AL132971：核苷酸区域9298-10200；Hill等(1998)Development 125：1711-1721)的修饰形式AP3P调控下在万寿菊中表达。

在每一情况中反向重复转录本包括一个正向的片段(有意片段)和一个序列完全相同的反向片段(反义片段)，这两个片段通过功能内含子即马铃薯ST-LH1基因PIV2内含子彼此相互连接(Vancanneyt G.等(1990)Mol Gen Genet 220：245-50)。

利用基因组DNA(通过标准方法从拟南芥菜分离得到)和引物PR7(SEQ ID No.15)和PR10(SEQ ID No.18)，通过PCR方法制备编码拟南芥菜AP3启动子(-902到+15)的cDNA。

PCR条件如下：

扩增编码AP3启动子片段(-902到+15)的DNA的PCR反应在含有以下成分的50μl反应混合物中进行：

-1μl 拟南芥菜基因组DNA(1∶100稀释，如上述制备)

-0.25mM dNTPs

-0.2mM PR7(SEQ ID No.15)

-0.2mM PR10(SEQ ID No.18)

-5μl 10X PCR缓冲液(Stratagene)

-0.25μl Pfu聚合酶(Stratagene)

-28.8μl 蒸馏水

在以下循环条件下进行PCR：

1X 94℃ 2分钟

35X 94℃ 1分钟

50℃ 1分钟

72℃ 1分钟

1X 72℃ 10分钟

使用标准方法将922bp扩增子克隆入PCR克隆载体pCR2.1(Invitrogen)产生质粒pTAP3。pTAP3克隆序列分析证实其序列与所公开的AP3序列(AL132971，核苷酸区域9298-10200)仅存在一个插入(AL132971序列9765位点插入一个G)和一个碱基替换(AL132971序列9726位点用G替换A)(位点33：用T替换G，位点55：用T替换G)的不同。在不同的扩增实验中再现了这些核苷酸的差别，从而代表了所用拟南芥菜植物中的核苷酸序列。

通过利用pTAP3质粒的重组PCR方法制备了修饰形式AP3P。以PR7(SEQ ID No.15)和PR9(SEQ ID No.17)为引物扩增了10200-9771区域(扩增子A7/9)，以PR8(SEQ ID No.16)和PR10(SEQ ID No.18)为引物扩增了9526-9285区域(扩增子A8/10)。

PCR条件如下：

扩增编码AP3启动子10200-9771和9526-9285区域的DNA片段的PCR反应在含有以下成分的50μl反应混合物中进行：

-100ng AP3扩增子(上述)

-0.25mM dNTPs

-0.2mM PR7(SEQ ID No.15)或PR8(SEQ ID No.16)

-0.2mM PR9(SEQ ID No.17)或PR10(SEQ ID No.18)

-5μl 10X PCR缓冲液(Stratagene)

-0.25μl Pfu Taq聚合酶(Stratagene)

-28.8μl 蒸馏水

在以下循环条件下进行PCR：

1X 94℃ 2分钟

35X 94℃ 1分钟

50℃ 2分钟

72℃ 3分钟

1X 72℃ 10分钟

重组PCR包括对25个核苷酸序列重叠的扩增子A7/9和A8/10的退火、完全形成双链和随后的扩增。从而形成AP3启动子的修饰形式AP3P，其中已经缺失了9670-9526位。将两个扩增子A7/9和A8/10在17.6μl含下述成分的反应混合物中变性(95℃5分钟)和退火(室温缓慢冷却至40℃)：

-0.5μg A7/9

-0.25μg A8/10

在20μl含以下成分的反应混合物中填补3’端(30℃30分钟)：

-17.6μl A7/9和A8/10退火反应物(如上述制备)

-50μM dNTPs

-2μl 1X Klenow缓冲液

-2U Klenow酶

通过利用有意特异引物(PR7 SEQ ID No.15)和反义特异引物(PR10SEQ ID No.18)的PCR法扩增编码启动子修饰形式AP3P的核酸。PCR条件如下：

扩增AP3P片段的PCR反应在50μl含以下成分的反应混合物中进行：

-1μl 退火反应物(如上述制备)

-0.25mM dNTPs

-0.2mM PR7(SEQ ID No.15)

-0.2mM PR10(SEQ ID No.18)

-5μl 10X PCR缓冲液(Stratagene)

-0.25μl Pfu Taq聚合酶(Stratagene)

-28.8μl 蒸馏水

PCR在以下循环条件下进行：

1X 94℃ 2分钟

35X 94℃ 1分钟

50℃ 1分钟

72℃ 1分钟

1X 72℃ 10分钟

利用引物PR7，SEQ ID No.15和PR10 SEQ ID No.18的PCR扩增形成编码启动子修饰形式AP3P的778bp片段。将扩增子克隆入克隆载体pCR2.1(Invitrogen)中。利用引物T7和M13的序列分析反应证实该序列与AL132971序列10200-9298区域除缺失了内部区域9285-9526外其余是相同的。因此将该克隆用于克隆入表达载体pJIT117(Guerineau等1988，Nucl.Acids Res.16：11380)。

通过从pTAP3P分离771bp SacI-HindIII片段并将其连接入SacI-HindIII-酶切的pJIT117载体进行克隆。以启动子AP3P代替原来的启动子d35S的克隆命名为pJAP3P。

通过利用p35SGUS INT质粒DNA(Vancanneyt G.等(1990)Mol GenGenet 220：245-50)和引物PR40(Seq ID No.20)和PR41(Seq ID No.21)的PCR方法制备含有ST-LS1基因PIV2内含子的DNA片段。

PCR条件如下：

扩增ST-LS1基因PIV2内含子序列的PCR反应在50μl含以下成分的反应混合物中进行：

-1μl p35SGUS INT

-0.25mM dNTPs

-0.2μM PR40(SEQ ID No.20)

-0.2μM PR41(SEQ ID No.21)

-5μl 10X PCR缓冲液(TAKARA)

-0.25μl R Taq聚合酶(TAKARA)

-28.8μl 蒸馏水

PCR反应在以下循环条件下进行：

1X 94℃ 2分钟

35X 94℃ 1分钟

53℃ 1分钟

72℃ 1分钟

1X 72℃ 10分钟

利用PR40和PR41的PCR扩增形成206bp的片段。利用标准方法，将扩增子克隆入PCR克隆载体pBluntII(Invitrogen)，形成克隆pBluntII-40-41。利用引物SP6的该克隆序列分析反应证实该序列与p35SGUS INT载体的相应序列相同。

因此该克隆用于克隆入pJAP3P载体(如上述)。

通过从pBluntII-40-41分离206bp SalI-BamHI片段并将其与SalI-BamHI酶切pJAP3P载体连接进行克隆。含有位于rbcs转运肽3’端下游的正向ST-LS1基因PIV2内含子的克隆命名为pJAI1并且其适于制备花特异地表达反向重复转录本的表达盒。

在图2中，AP3P片段含有修饰的AP3P启动子(771bp)，rbcs片段含有豌豆rbcS转运肽(204bp)，内含子片段含有马铃薯ST-LS1基因PIV2内含子，并且term片段(761bp)含有CaMV多腺苷酸化信号。

实施例2：用于在万寿菊中花特异表达ε-环化酶dsRNA的反向重复表达盒的制备(直接针对ε-环化酶cDNA5’区域)

利用有意特异引物(PR42 SEQ ID No.22)和反义特异引物(PR43SEQ ID No.23)通过聚合酶链式反应(PCR)从万寿菊cDNA扩增得到含有ε-环化酶cDNA(GenBank登陆号AF251016)5’-末端435bp区域的核酸。万寿菊ε-环化酶cDNA 5’-末端435bp区域由138bp 5’-非翻译序列(5’UTR)和对应N末端的297bp编码区。

为了从万寿菊花制备总RNA，将100mg冰冻、粉碎的花转移至反应器中并用0.8ml Trizol缓冲液(LifeTechnologies)提取。用0.2ml氯仿提取上清。12000g离心15分钟后，取出水相上清液并转移至新反应器中并用一倍体积的乙醇进行提取。用一倍体积的异丙醇沉淀RNA，用75％乙醇洗涤并将沉淀物溶于DEPC水(室温将含1/1000体积焦碳酸二乙酯的水孵育过夜，随后高压灭菌)中。分光光度法测定RNA浓度。对于cDNA合成，将2.5μg总RNA在60℃变性10分钟，冰上冷却2分钟，并使用cDNA试剂盒(Ready-to-go-you-prime-beads，Pharmacia Biotech)按照制造商的说明，利用反义特异引物(PR17 SEQ ID No.19)将其转录为cDNA。

随后PCR反应的条件如下：

扩增含ε-环化酶5’-末端435bp区域的PR42-PR43 DNA片段的PCR反应在50μl含以下成分的反应混合物中进行：

-1μl cDNA(如上述制备)

-0.25mM dNTPs

-0.2μM PR42(SEQ ID No.22)

-0.2μM PR43(SEQ ID No.23)

-5μl 10X PCR缓冲液(TAKARA)

-0.25μl R Taq聚合酶(TAKARA)

-28.8μl 蒸馏水

扩增含ε-环化酶5’-末端435bp区域的PR44-PR45 DNA片段的PCR反应在50μl含以下成分的反应混合物中进行：

-1μl cDNA(如上述制备)

-0.25mM dNTPs

-0.2μM PR44(SEQ ID No.24)

-0.2μM PR45(SEQ ID No.25)

-5μl 10X PCR缓冲液(TAKARA)

-0.25μl R Taq聚合酶(TAKARA)

-28.8μl 蒸馏水

PCR反应在以下循环条件下进行：

1X 94℃ 2分钟

35X 94℃ 1分钟

58℃ 1分钟

72℃ 1分钟

1X 72℃ 10分钟

使用引物PR42和PR43的PCR扩增产生443bp片段，而使用引物PR44和PR45的PCR扩增产生444bp片段。

使用标准方法，将两个扩增子，PR42-PR43(HindIII-SalI有意)片段和PR44-PR45(EcoRI-BamHI反义)片段，克隆入PCR-克隆载体pCR-BluntII(Invitrogen)。使用SP6引物的序列分析反应证实在每一情况下除了所导入的限制性酶切位点外，序列与已公布的AF251016序列(SEQ ID No.4)完全相同。因此这些克隆被用于制备pJAI1克隆载体中的反向重复构建体(见

实施例1)。

通过从pCR-BluntII克隆载体(Invitrogen)分离444bp PR44-PR45BamHI-EcoRI片段并将其与BamHI-EcoRI-酶切的pJAI1载体连接进行第一次克隆步骤。含有反义方向ε-环化酶5’-末端区域的克隆命名为pJAI2。连接反应导致ε-环化酶5’-末端区域和CaMV多腺苷酸化信号之间的转录融合。

通过从pCR-BluntII克隆载体(Invitrogen)分离443bp PR42-PR43HindIII-SalI片段并将其与HindIII-SalI-酶切的pJAI2载体连接进行第二次克隆步骤。含有有意方向ε-环化酶cDNA 435bp 5’-末端区域的克隆命名为pJAI3。连接反应形成AP3P和ε-环化酶5’-末端区域有意片段之间的转录融合。

利用矮牵牛基因组DNA(按照标准方法制备)和引物PRCHRC5(SEQ ID No.42)和PRCHRC3(SEQ ID No.43)，通过扩增CHRC启动子片段制备CHRC启动子控制下的反向重复序列表达盒。将扩增子克隆入pCR2.1克隆载体(Invitrogen)。利用引物M13和T7对所得克隆pCR2.1-CHRC进行序列分析证实该序列与AF099501序列相同。因此该克隆可用于克隆入pJAI3表达载体。

通过从pCR2.1-CHRC分离1537bp SacI-HindIII片段并将其连接入SacI-HindIII-酶切的pJAI3载体进行克隆。含有CHRC启动子以代替原来的AP3P启动子的克隆命名为pJCI3。

使用双元载体pSUN5(WO02/00900)制备用于在万寿菊中进行农杆菌介导的AP3P-或CHRC-控制的反向重复转录本转化的表达载体。

通过将pJAI3 2622bp SacI-XhoI片段与SacI-XhoI-酶切的pSUN5载体连接制备表达载体pS5AI3(图3，构建体图谱)。

在图3中，AP3P片段包括修饰的AP3P启动子(771bp)，5sense片段包括有意方向的万寿菊ε-环化酶5’区域(435bp)，intron片段包括马铃薯ST-LS1基因PIV2内含子，5anti片段包括反义方向的万寿菊ε-环化酶5’区域(435bp)并且term片段(761bp)包括CaMV多聚腺苷酸化信号。

通过将pJCI3 3394bp SacI-XhoI片段与SacI-XhoI-酶切的pSUN5载体相连接制备表达载体pS5CI3(图4，构建体图谱)。

在图4中，CHRC片段包括启动子(1537bp)，5sense片段包括有意方向的万寿菊ε-环化酶5’区域(435bp)，intron片段包括马铃薯ST-LS1基因PIV2内含子，5anti片段包括反义方向的万寿菊ε-环化酶5’区域(435bp)，并且term片段(761bp)包括CaMV多腺苷酸化信号。

实施例3：用于在万寿菊中花特异表达ε-环化酶dsRNA的反向重复表达盒的制备(直接针对ε-环化酶cDNA 3’区域)

使用有意特异引物(PR46 SEQ ID No.26)和反义特异引物(PR47SEQ ID No.27)，通过聚合酶链式反应法(PCR)从万寿菊cDNA中扩增含ε-环化酶cDNA 3’-末端区域(384bp)的核酸(GenBank登陆号AF251016)。万寿菊ε-环化酶cDNA 3’-末端区域(384bp)包括140bp 3’-非翻译序列(3’UTR)和244bp对应C末端的编码区。

如实施例2所述从万寿菊花制备总RNA。

如实施例1所述，使用反义特异引物PR17(SEQ ID No.19)进行cDNA合成。

随后PCR反应的条件如下：

扩增含ε-环化酶3’-末端384bp区域的PR46-PR47 DNA片段的PCR反应在50μl含以下成分的反应混合物中进行：

-1μl cDNA(如上述制备)

-0.25mM dNTPs

-0.2μM PR46(SEQ ID No.26)

-0.2μM PR47(SEQ ID No.27)

-5μl 10X PCR缓冲液(TAKARA)

-0.25μl R Taq聚合酶(TAKARA)

-28.8μl 蒸馏水

扩增含ε-环化酶3’-末端384bp区域的PR48-PR49 DNA片段的PCR反应在50μl含以下成分的反应混合物中进行：

-1μl cDNA(如上述制备)

-0.25mM dNTPs

-0.2μM PR48(SEQ ID No.28)

-0.2μM PR49(SEQ ID No.29)

-5μl 10X PCR缓冲液(TAKARA)

-0.25μl R Taq聚合酶(TAKARA)

-28.8μl 蒸馏水

在以下循环条件下进行PCR反应：

1X 94℃ 2分钟

35X 94℃ 1分钟

58℃ 1分钟

72℃ 1分钟

1X 72℃ 10分钟

使用SEQ ID No.26和SEQ ID No.27进行PCR扩增产生392bp片段，而使用SEQ ID No.28和SEQ ID No.29进行PCR扩增形成396bp片段。

使用标准方法，将两个扩增子，PR46-PR47片段和PR48-PR49片段，克隆入PCR-克隆载体pCR-BluntII(Invitrogen)中。使用SP6引物的序列分析反应证实在每一情况下除了所导入的限制性酶切位点外，其序列与所公布的AF251016序列(SEQ ID No.4)完全相同。因此这些克隆能够用于制备pJAI1克隆载体中的反向重复构建体(见实施例1)。通过从pCR-BluntII克隆载体(Invitrogen)分离396bp PR48-PR49BamHI-EcoRI片段并将其与BamHI-EcoRI-酶切pJAI1载体连接进行第一次克隆步骤。含有反义方向ε-环化酶3’-末端区域的克隆命名为pJAI4。该连接导致在ε-环化酶3’-末端区域反义片段和CaMV多腺苷酸化信号之间形成转录融合。

通过从pCR-BluntII克隆载体(Invitrogen)分离392bp PR46-PR47HindIII-SalI片段并将其与HindIII-SalI-酶切pJAI4载体连接进行第二次克隆步骤。含有有意方向392bpε-环化酶3’-末端区域的克隆命名为pJAI5。该连接导致在AP3P和ε-环化酶3’-末端区域有意片段之间形成转录融合。

使用双元载体pSUN5(WO02/00900)制备用于在万寿菊中进行农杆菌介导在AP3P-控制下的反向重复转录本转化的表达载体。通过将pJAI52523bp SacI-XhoI片段与SacI-XhoI-酶切的pSUN5载体连接制备表达载体pS5AI5(图5，构建体图谱)。

在图5中，AP3P片段包括修饰的AP3P启动子(771bp)，sense片段包括有意方向的万寿菊ε-环化酶3’区域(435bp)，intron片段包括马铃薯ST-LS1基因IV2内含子，anti片段包括反义方向的万寿菊ε-环化酶3’区域(435bp)，并且term片段(761bp)包括CaMV多腺苷酸化信号。

实施例4：ε-环化酶启动子的克隆

利用基因组DNA(通过标准方法从万寿菊，“Orangenprinz”品系，分离得到)，通过两个独立的克隆策略，反向PCR(采用Long等，Proc.Natl.Acad.Sci USA 90：10370)和TAIL-PCR(Liu Y-G.等(1995)Plant J.8：457-463)，分别分离ε-环化酶启动子的199bp片段和312bp片段。

对于反向PCR方法，用EcoRV和RsaI在25μl反应混合物中消化2μg基因组DNA，然后稀释至300μl并用3U连接酶16℃重新连接过夜。使用引物PR50(SEQ ID No.30)和PR51(SEQ ID No.31)的PCR扩增产生在每一情况下含有为有意方向的354bpε-环化酶cDNA(GenBank登陆号AF251016)的片段，并将该片段连接于300bpε-环化酶启动子和70bpε-环化酶cDNA 5’-末端区域(见图6)。

PCR反应条件如下：

扩增尤其是含ε-环化酶312bp启动子片段的PR50-PR51 DNA片段的PCR反应在含以下成分的50μl反应混合物中进行：

-1μl连接混合物(如上述制备)

-0.25mM dNTPs

-0.2μM PR50(SEQ ID No.30)

-0.2μM PR51(SEQ ID No.31)

-5μl 10X PCR缓冲液(TAKARA)

-0.25μl R Taq聚合酶(TAKARA)

-28.8μl 蒸馏水

在以下循环条件下进行PCR反应：

1X 94℃ 2分钟

35X 94℃ 1分钟

53℃ 1分钟

72℃ 1分钟

1X 72℃ 10分钟

使用引物PR50和PR51的PCR扩增反应产生含有尤其是ε-环化酶312bp启动子片段的734bp片段(图6)。

使用标准方法，将扩增子克隆入PCR-克隆载体pCR2.1(Invitrogen)。使用引物M13和T7进行测序反应产生序列SEQ ID No.11。在独立的扩增实验中重新产生该序列并因此代表所使用的万寿菊“Orangenprinz”品系中的核酸序列。

对于TAIL-PCR方法，进行三个连续的PCR反应，每个反应使用不同的基因特异引物(巢式引物)。

在20μl含以下成分的反应混合物中进行TAIL1-PCR：

-1ng 基因组DNA(如上述制备)

-0.2mM 每种dNTP

-0.2μM PR60(SEQ ID No.32)

-0.2μM AD1(SEQ ID No.35)

-2μl 10X PCR缓冲液(TAKARA)

-0.5μl R Taq聚合酶(TAKARA)

-加至20μl蒸馏水

在上下文中，AD1最初是序列(a/c/g/t)tcga(g/c)t(a/t)t(g/c)g(a/t)gtt的引物混合物。

在以下循环条件下进行PCR反应TAIL1：

1X 93℃：1分钟，95℃：1分钟。

5X 94℃：30秒，62℃：1分钟，72℃：2.5分钟。

1X 94℃：30秒，25℃：3分钟，3分钟内上升至72℃。

72℃：2.5分钟

15X 94℃：10秒，68℃：1分钟，72℃：2.5分钟；

94℃：10秒，68℃：1分钟，72℃：2.5分钟；

94℃：10秒，29℃：1分钟，72℃：2.5分钟。

1X 72℃：5分钟。

在21μl含以下成分的反应混合物中进行TAIL2-PCR：

-1μl 1∶50稀释的TAIL1反应混合物(如上述制备)

-0.8mM dNTP

-0.2μM PR61(SEQ ID No.33)

-0.2μM AD1(SEQ ID No.35)

-2μl 10X PCR缓冲液(TAKARA)

-0.5μl R Taq聚合酶(TAKARA)

-加至21μl 蒸馏水

在以下循环条件下进行PCR反应TAIL2：

12X94℃：10秒，64℃：1分钟，72℃：2.5分钟；

94℃：10秒，64℃：1分钟，72℃：2.5分钟；

94℃：10秒，29℃：1分钟，72℃：2.5分钟；

1X 72℃：5分钟

在100μl含以下成分的反应混合物中进行TAIL3-PCR：

-1μl 1∶10稀释的TAIL2反应混合物(如上述制备)

-0.8mM dNTP

-0.2μM PR63(SEQ ID No.34)

-0.2μM AD1(SEQ ID No.35)

-10μl 10X PCR缓冲液(TAKARA)

-0.5μl R Taq聚合酶(TAKARA)

-加至100μl蒸馏水

在以下循环条件下进行PCR反应TAIL3：

20X 94℃：15秒，29℃：30秒，72℃：2分钟1X 72℃：5分钟

使用引物PR63和AD1的PCR扩增反应产生含有尤其是ε-环化酶199bp启动子片段的280bp片段(图7)。

使用标准方法，将扩增子克隆入PCR-克隆载体pCR2.1(Invitrogen)。使用引物M13和T7的序列分析反应产生序列SEQ ID No.12。该序列与利用IPCR策略分离的序列SEQ ID No.11内的ε-环化酶区域相同，并因此代表所使用的万寿菊“Orangenprinz”品系中的核酸序列。

含有通过IPCR策略分离的ε-环化酶启动子312bp片段(SEQ IDNo.11)的pCR2.1克隆命名为pTA-ecycP并用于制备IR构建体。

实施例5：用于在万寿菊中花特异表达ε-环化酶dsRNA的反向重复表达盒的制备(直接针对ε-环化酶cDNA的启动子区)。

由ε-环化酶启动子片段组成的反向重复转录本在花特异的拟南芥菜启动子AP3的修饰形式AP3P(见实施例1)或花特异启动子CHRC(GenBank登陆号AF099501)的控制下在万寿菊中表达。反向重复转录本在每一情况下含有正向的ε-环化酶启动子片段(有意片段)和序列相同的反向ε-环化酶启动子片段(反义片段)，这两个片段通过功能内含子彼此相连(见实施例1)。

利用质粒DNA(pTA-ecycP克隆，见实施例4)并分别利用引物PR124(SEQ ID No.36)和PR126(SEQ ID No.38)，以及引物PR125(SEQ IDNo.37)和PR127(SEQ ID No.39)，通过PCR方法制备启动子片段。

PCR反应条件如下：

扩增含ε-环化酶启动子片段的PR124-PR126 DNA片段的PCR反应在50μl含以下成分的反应混合物中进行：

-1μl cDNA(如上述制备)

-0.25mM dNTPs

-0.2μM PR124(SEQ ID No.36)

-0.2μM PR126(SEQ ID No.38)

-5μl 10X PCR缓冲液(TAKARA)

-0.25μl R Taq聚合酶(TAKARA)

-28.8μl 蒸馏水

扩增含312bpε-环化酶启动子片段的PR125-PR127 DNA片段的PCR反应在50μl含以下成分的反应混合物中进行：

-1μl cDNA(如上述制备)

-0.25mM dNTPs

-0.2μM PR125(SEQ ID No.37)

-0.2μM PR127(SEQ ID No.39)

-5μl 10X PCR缓冲液(TAKARA)

-0.25μl R Taq聚合酶(TAKARA)

-28.8μl蒸馏水

在以下循环条件下进行PCR反应：

1X 94℃ 2分钟

35X 94℃ 1分钟

53℃ 1分钟

72℃ 1分钟

1X 72℃ 10分钟

使用引物PR124和PR126的PCR扩增反应产生358bp片段，而使用引物PR125和PR127的PCR扩增反应产生361bp片段。

使用标准方法，将两个扩增子，PR124-PR126(HindIII-SalI有意)片段和PR125-PR127(EcoRI-BamHI反义)片段，克隆入PCR-克隆载体pCR-BluntII(Invitrogen)中。使用SP6引物的序列分析反应证实在每一情况下，除了所导入的限制性酶切位点外，其序列与SEQ ID No.11完全相同。因此这些克隆可用于制备pJAI1克隆载体中的反向重复构建体(见实施例1) 。

通过从pCR-BluntII克隆载体(Invitrogen)分离358bp PR124-PR126HindIII-SalI片段并将其与BamHI-EcoRI-酶切pJAI1载体连接进行第一次克隆步骤。含有意方向ε-环化酶启动子片段的克隆命名为cs43。连接反应使ε-环化酶启动子有意片段插入到AP3P启动子和内含子之间。

通过从pCR-BluntII克隆载体(Invitrogen)分离361bp PR125-PR127BamHI-EcoRI片段并将其与BamHI-EcoRI-酶切cs43载体连接进行第二次克隆步骤。含反义方向ε-环化酶启动子片段的克隆命名为cs44。连接反应在内含子与ε-环化酶启动子反义片段之间产生转录融合。

使用矮牵牛基因组DNA(通过标准方法制备)和引物PRCHRC3’(SEQID No.43)和PRCHRC5’(SEQ ID No.42)，通过扩增CHRC启动子片段制备在CHRC启动子控制下的反向重复表达盒。将扩增子克隆入pCR2.1克隆载体(Invitrogen)。使用M13和T7引物对所得克隆进行序列分析证实该序列与AF099501序列相同。因此该克隆可用于克隆入表达载体cs44。

通过分离pCR2.1-CHRC 1537bp SacI-HindIII片段并将其连入SacI-HindIII-酶切的cs44载体进行克隆。含有CHRC启动子而非原来的AP3P启动子的克隆命名为cs45。

通过将AP3P启动子以反义方向克隆入cs45中ε-环化酶反义片段3’端制备在两个启动子，CHRC启动子和AP3P启动子，控制下的反向重复表达盒。使用引物PR128和PR129扩增pJAI1的AP3P启动子片段。将扩增子克隆入pCR2.1克隆载体(Invitrogen)。使用M13和T7引物的序列分析证实该序列与序列SEQ ID No.1相同。该克隆，pCR2.1-AP3PSX，用于制备在两个启动子控制下的反向重复表达盒。

通过从pCR2.1-AP3PSX分离771bp SalI-XhoI片段并将其连接入XhoI-酶切cs45载体进行克隆。含有3’端反向重复、反义方向AP3P启动子的克隆命名为cs46。

使用双元载体pSUN5(WO02/00900)制备对AP3P-控制的反向重复转录本进行万寿菊中农杆菌介导转化的表达盒。

通过将cs44的1685bp SacI-XhoI片段与SacI-XhoI-酶切pSUN5载体连接制备表达载体pS5AI7(图8，构建体图谱)。

在图8中，AP3P片段包括修饰的AP3P启动子(771bp)，P-sense片段包括有意方向的ε-环化酶312bp启动子片段，intron片段包括马铃薯ST-LS1基因IV2内含子，并且P-anti片段包括反义方向的ε-环化酶312 bp启动子片段。

通过将cs45 2445bp SacI-XhoI片段与SacI-XhoI-酶切pSUN5载体连接制备表达载体pS5CI7(图9，构建体图谱)。

在图9中，CHRC片段包括CHRC启动子(1537bp)，P-sense片段包括有意方向的ε-环化酶312bp启动子片段，intron片段包括马铃薯ST-LS1基因IV2内含子，并且P-anti片段包括反义方向的ε-环化酶312bp启动子片段。

通过将cs46 3219bp SacI-XhoI片段与SacI-XhoI-酶切pSUN5载体连接制备表达载体pS5CI7(图10，构建体图谱)。

在图10中，CHRC片段包括CHRC启动子(1537bp)，P-sense片段包括有意方向的ε-环化酶312bp启动子片段，intron片段包括马铃薯ST-LS1基因IV2内含子，P-anti片段包括反义方向的ε-环化酶312 bp启动子片段，并且AP3P片段包括反义方向的771bp AP3P启动子片段。

实施例6：转基因万寿菊植物的制备

将万寿菊种子灭菌并放置于发芽培养基上(MS培养基；Murashige和Skoog，Physiol.Plant.15(1962)，473-497)pH 5.8，2％蔗糖)。发芽发生于18-28℃/20-200μE/3-16周的温度/光/时间间隔内，但是优选地为21℃，20-70μE，4-8周。

然后收获体外发育形成的植物的所有叶子并垂直切割至中脉。在制备期间将以这种方式产生的大小为10-60mm²的叶外植体室温贮存于液体MS培养基最多2小时。

用双元质粒PS5AI3转化根癌农杆菌EHA105株。转化的根癌农杆菌EHA105株在以下条件下生长过夜：将单菌落接种于含25mg/l卡那霉素的YEB(0.1％酵母提取物、0.5％牛肉膏、0.5％蛋白胨、0.5％蔗糖、0.5％硫酸镁×7H₂O)中并在28℃生长16-20小时。然后6000g离心10分钟收获细菌悬液并重悬于液体MS培养基中直至OD₆₀₀产生为大约0.1-0.8。该悬液用于与叶材料共培养。

共培养之前，立即用细菌悬液代替其中已经贮存叶子的MS培养基。将叶子孵育于农杆菌悬液中并室温轻轻振荡30分钟。将感染的外植体放置于含生长调节剂例如3mg/l苄氨基嘌呤(BAP)和1mg/l吲哚乙酸(IAA)，并已经用琼脂(例如0.8％植物琼脂(Duchefa，NL))固化的MS培养基上。叶在培养基上的方向没有影响。将外植体培养1-8天，但是优选地为6天，在此期间使用以下条件：光强度：30-80μmol/m²×s，温度：22-24℃，16/8小时光/暗交替。然后将共培养的外植体转移至新鲜MS培养基中，优选地含有相同的生长调节剂，此外该第二培养基还含有抗生素以抑制细菌生长。200-500mg/l浓度的特美汀(Timentin)非常适于该目的。所应用的第二选择性成分是一种用于筛选成功转化子的成分。1-5mg/l浓度的膦丝菌素选择非常有效，但其它选择成分也可按照所用方法使用。

一至三周后，在每一情况下，将外植体转移至新鲜培养基直至形成胚芽和小芽，并且然后将其转移至含特美汀和PPT或含其它用于生根的生长调节剂的成分即例如0.5mg/l吲哚丁酸(IBA)和0.5mg/l赤霉酸GA₃的相同基础培养基中。可将生根的芽体转移至温室中。

除了上述方法，也可进行以下有利的改进：

-用细菌感染外植体之前，可以将外植体在上述培养基上预孵育以共培养1-12天，优选地为3-4天。然后如上述进行感染、共培养和选择再生。

-用于再生的pH(通常为5.8)能够降低至pH 5.2。这可改善对农杆菌生长的控制。

-在再生培养基中加入AgNO₃(3-10mg/l)以改善培养条件，包括再生本身。

-降低酚形成并为技术人员所熟知的成分，例如柠檬酸、抗坏血酸、PVP和许多其他成分，对培养具有有益的作用。

-液体培养基也能够用于全过程。培养物也能够孵育于定位在液体培养基的商业可得的支持物上。

根据上述转化方法，利用以下表达构建体获得以下品系：

使用pS5AI3获得CS30-1、CS30-3和CS30-4

实施例7：转基因植物的特性

将实施例6的转基因万寿菊植物的花材料在液氮中压挤并用100％丙酮提取(三次，每次500μl)粉末(大约250-500mg)。蒸发溶剂并将类胡萝卜素重悬于100μl丙酮。

利用C30反相柱能够区分出类胡萝卜素单酯和二酯。HPLC运行条件实际上与已公开方法相同(Frazer等(2000)，Plant Journal 24(4)：551-558)。基于UV-VIS谱鉴定类胡萝卜素是可能的。

表1描述了按照上述实施例制备的转基因万寿菊植物和对照万寿菊植物万寿菊花瓣中的类胡萝卜素谱。所有类胡萝卜素的量以[μg/g]鲜重给出，与对照植物相比变化的百分比显示于括弧中。

与未遗传修饰的对照植物相比，经遗传修饰植物具有明显增加的“β-胡萝卜素途径”的类胡萝卜素例如β-胡萝卜素和玉米黄素含量，并具有明显降低的“α-类胡萝卜素途径”的类胡萝卜素例如叶黄素含量。

表1

植物	叶黄素	β-胡萝卜素	玉米黄素	堇菜黄素	总类胡萝卜素
植物	叶黄素	β-胡萝卜素	玉米黄素	堇菜黄素	总类胡萝卜素	对照	260	4.8	2.7	36	304
CS 30-1	35(-86％)	13(+170％)	4.4(+62％)	59(+63％)	111(-63％)	对照	260	4.8	2.7	36	304
CS 30-1	35(-86％)	13(+170％)	4.4(+62％)	59(+63％)	111(-63％)	对照	456	6.4	6.9	58	527
CS 30-3	62(-86％)	13(+103％)	8.9(+29％)	75(+29％)	159(-70％)	对照	456	6.4	6.9	58	527
CS 30-3	62(-86％)	13(+103％)	8.9(+29％)	75(+29％)	159(-70％)	CS 30-4	68(-85％)	9.1(+42％)	5.7(-17％)	61(+5％)	144(-73％)
对照	280	4.1	2.6	42	329	CS 30-4	68(-85％)	9.1(+42％)	5.7(-17％)	61(+5％)	144(-73％)
对照	280	4.1	2.6	42	329	CS 32-9	69(-75％)	5.5(+34％)	2.3(-12％)	25(-38％)	102(-69％)

比较实施例1：通过反义降低万寿菊中ε-环化酶活性

使用技术人员熟知的常规方法，如比较实施例制备万寿菊反义品系CS32-9，其中ε-环化酶活性已通过反义降低。通过上述方法测定的该品系(CS32-9)中的类胡萝卜素谱同样描述于表1。

序列表

<110>太阳基因两合公司

<120>制备玉米黄素和/或其生物合成中间体和/或次级产物的方法

<130>NAE 439/02

<160>43

<170>PatentIn版本3.1

<210>1

<211>777

<212>DNA

<213>拟南芥菜(Arabidopsis thaliana)

<220>

<221>启动子

<222>(1)..(777)

<223>

<400>1

gagctcactc actgatttcc attgcttgaa aattgatgat gaactaagat caatccatgt 60

tagtttcaaa acaacagtaa ctgtggccaa cttagttttg aaacaacact aactggtcga 120

agcaaaaaga aaaaagagtt tcatcatata tctgatttga tggactgttt ggagttagga 180

ccaaacatta tctaeaaaca aagacttttc tcctaacttg tgattccttc ttaaacccta 240

ggggtaatat tctattttcc aaggatcttt agttaaaggc aaatccggga aattattgta 300

atcatttggg gaaacatata aaagatttga gttagatgga agtgacgatt aatccaaaca 360

tatatatctc tttcttctta tttcccaaat taacagacaa aagtagaata ttggctttta 420

acaccaatat aaaaacttgc ttcacaccta aacacttttg tttactttag ggtaagtgca 480

aaaagccaac caaatccacc tgcactgatt tgacgtttac aaacgccgtt aagtcgatgt 540

ccgttgattt aaacagtgtc ttgtaattaa aaaaatcagt ttacataaat ggaaaattta 600

tcacttagtt ttcatcaact tctgaactta cctttcatgg attaggcaat actttccatt 660

tttagtaact caagtggacc ctttacttct tcaactccat ctctctcttt ctatttcact 720

tctttcttct cattatatct cttgtcctct ccaccaaatc tcttcaacaa aaagctt 777

<210>2

<211>195

<212>DNA

<213>马铃薯

<220>

<221>内含子

<222>(1)..(195)

<223>

<400>2

tacgtaagtt tctgcttcta cctttgatat atatataata attatcatta attagtagta 60

atataatatt tcaaatattt ttttcaaaat aaaagaatgt agtatatagc aattgctttt 120

ctgtagttta taagtgtgta tattttaatt tataactttt ctaatatatg accaaaattt 180

gttgatgtgc agctg 195

<210>3

<211>212

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>内含子

<222>(1)..(212)

<223>

<400>3

gtcgactacg taagtttctg cttctacctt tgatatatat ataataatta tcattaatta 60

gtagtaatat aatatttcaa atattttttt caaaataaaa gaatgtagta tatagcaatt 120

gcttttctgt agtttataag tgtgtatatt ttaatttata acttttctaa tatatgacca 180

aaatttgttg atgtgcaggt atcaccggat cc 212

<210>4

<211>1830

<212>DNA

<213>万寿菊(Tagetes erecta)

<220>

<221>CDS

<222>(141)..(1691)

<223>

<400>4

ggcacgaggc aaagcaaagg ttgtttgttg ttgttgttga gagacactcc aatccaaaca 60

gatacaaggc gtgactggat atttctctct cgttcctaac aacagcaacg aagaagaaaa 120

agaatcatta ctaacaatca atg agt atg aga gct gga cac atg acg gca aca 173

Met Ser Met Arg Ala Gly His Met Thr Ala Thr

1 5 10

atg gcg gct ttt aca tgc cct agg ttt atg act agc atc aga tac acg 221

Met Ala Ala Phe Thr Cys Pro Arg Phe Met Thr Ser Ile Arg Tyr Thr

15 20 25

aag caa att aag tgc aac gct gct aaa agc cag cta gtc gtt aaa caa 269

Lys Gln Ile Lys Cys Asn Ala Ala Lys Ser Gln Leu Val Val Lys Gln

30 35 40

gag att gag gag gaa gaa gat tat gtg aaa gcc ggt gga tcg gag ctg 317

Glu Ile Glu Glu Glu Glu Asp Tyr Val Lys Ala Gly Gly Ser Glu Leu

45 50 55

ctt ttt gtt caa atg caa cag aat aag tcc atg gat gca cag tct agc 365

Leu Phe Val Gln Met Gln Gln Asn Lys Ser Met Asp Ala Gln Ser Ser

60 65 70 75

cta tcc caa aag ctc cca agg gta cca ata gga gga gga gga gac agt 413

Leu Ser Gln Lys Leu Pro Arg Val Pro Ile Gly Gly Gly Gly Asp Ser

80 85 90

aac tgt ata ctg gat ttg gtt gta att ggt tgt ggt cct gct ggc ctt 461

Asn Cys Ile Leu Asp Leu Val Val Ile Gly Cys Gly Pro Ala Gly Leu

95 100 105

gct ctt gct gga gaa tca gcc aag cta ggc ttg aat gtc gca ctt atc 509

Ala Leu Ala Gly Glu Ser Ala Lys Leu Gly Leu Asn Val Ala Leu Ile

110 115 120

ggc cct gat ctt cct ttt aca aat aac tat ggt gtt tgg gag gat gaa 557

Gly Pro Asp Leu Pro Phe Thr Asn Asn Tyr Gly Val Trp Glu Asp Glu

125 130 135

ttt ata ggt ctt gga ctt gag ggc tgt att gaa cat gtt tgg cga gat 605

Phe Ile Gly Leu Gly Leu Glu Gly Cys Ile Glu His Val Trp Arg Asp

140 145 150 155

act gta gta tat ctt gat gac aac gat ccc att ctc ata ggt cgt gcc 653

Thr Val Val Tyr Leu Asp Asp Asn Asp Pro Ile Leu Ile Gly Arg Ala

160 165 170

tat gga cga gtt agt cgt gat tta ctt cac gag gag ttg ttg act agg 701

Tyr Gly Arg Val Ser Arg Asp Leu Leu His Glu Glu Leu Leu Thr Arg

175 180 185

tgc atg gag tca ggc gtt tca tat ctg agc tcc aaa gtg gaa cgg att 749

Cys Met Glu Ser Gly Val Ser Tyr Leu Ser Ser Lys Val Glu Arg Ile

190 195 200

act gaa gct cca aat ggc cta agt ctc ata gag tgt gaa ggc aat atc 797

Thr Glu Ala Pro Asn Gly Leu Ser Leu Ile Glu Cys Glu Gly Asn Ile

205 210 215

aca att cca tgc agg ctt gct act gtc gct tct gga gca gct tct gga 845

Thr Ile Pro Cys Arg Leu Ala Thr Val Ala Ser Gly Ala Ala Ser Gly

220 225 230 235

aaa ctt ttg cag tat gaa ctt ggc ggt ccc cgt gtt tgc gtt caa aca 893

Lys Leu Leu Gln Tyr Glu Leu Gly Gly Pro Arg Val Cys Val Gln Thr

240 245 250

gct tat ggt ata gag gtt gag gtt gaa agc ata ccc tat gat cca agc 941

Ala Tyr Gly Ile Glu Val Glu Val Glu Ser Ile Pro Tyr Asp Pro Ser

255 260 265

cta atg gtt ttc atg gat tat aga gac tac acc aaa cat aaa tct caa 989

Leu Met Val Phe Met Asp Tyr Arg Asp Tyr Thr Lys His Lys Ser Gln

270 275 280

tca cta gaa gca caa tat cca aca ttt ttg tat gtc atg cca atg tct 1037

Ser Leu Glu Ala Gln Tyr Pro Thr Phe Leu Tyr Val Met Pro Met Ser

285 290 295

cca act aaa gta ttc ttt gag gaa act tgt ttg gct tca aaa gag gcc 1085

Pro Thr Lys Val Phe Phe Glu Glu Thr Cys Leu Ala Ser Lys Glu Ala

300 305 310 315

atg cct ttt gag tta ttg aag aca aaa ctc atg tca aga tta aag act 1133

Met Pro Phe Glu Leu Leu Lys Thr Lys Leu Met Ser Arg Leu Lys Thr

320 325 330

atg ggg atc cga ata acc aaa act tat gaa gag gaa tgg tca tat att 1181

Met Gly Ile Arg Ile Thr Lys Thr Tyr Glu Glu Glu Trp Ser Tyr Ile

335 340 345

cca gta ggt gga tcc tta cca aat acc gag caa aag aac ctt gca ttt 1229

Pro Val Gly Gly Ser Leu Pro Asn Thr Glu Gln Lys Asn Leu Ala Phe

350 355 360

ggt gct gct gct agc atg gtg cat cca gcc aca gga tat tcg gtt gta 1277

Gly Ala Ala Ala Ser Met Val His Pro Ala Thr Gly Tyr Ser Val Val

365 370 375

aga tca ctg tca gaa gct cct aat tat gca gca gta att gca aag att 1325

Arg Ser Leu Ser Glu Ala Pro Asn Tyr Ala Ala Val Ile Ala Lys Ile

380 385 390 395

tta ggg aaa gga aat tca aaa cag atg ctt gat cat gga aga tac aca 1373

Leu Gly Lys Gly Asn Ser Lys Gln Met Leu Asp His Gly Arg Tyr Thr

400 405 410

acc aac atc tca aag caa gct tgg gaa aca ctt tgg ccc ctt gaa agg 1421

Thr Asn Ile Ser Lys Gln Ala Trp Glu Thr Leu Trp Pro Leu Glu Arg

415 420 425

aaa aga cag aga gca ttc ttt ctc ttt gga tta gca ctg att gtc cag 1469

Lys Arg Gln Arg Ala Phe Phe Leu Phe Gly Leu Ala Leu Ile Val Gln

430 435 440

atg gat att gag ggg acc cgc aca ttc ttc cgg act ttc ttc cgc ttg 1517

Met Asp Ile Glu Gly Thr Arg Thr Phe Phe Arg Thr Phe Phe Arg Leu

445 450 455

ccc aca tgg atg tgg tgg ggg ttt ctt gga tct tcg tta tca tca act 1565

Pro Thr Trp Met Trp Trp Gly Phe Leu Gly Ser Ser Leu Ser Ser Thr

460 465 470 475

gac ttg ata ata ttt gcg ttt tac atg ttt atc ata gca ccg cat agc 1613

Asp Leu Ile Ile Phe Ala Phe Tyr Met Phe Ile Ile Ala Pro His Ser

480 485 490

ctg aga atg ggt ctg gtt aga cat ttg ctt tct gac ccg aca gga gga 1661

Leu Arg Met Gly Leu Val Arg His Leu Leu Ser Asp Pro Thr Gly Gly

495 500 505

aca atg tta aaa gcg tat ctc acg ata taa ataactctag tcgcgatcag 1711

Thr Met Leu Lys Ala Tyr Leu Thr Ile

510 515

tttagattat aggcacatct tgcatatata tatgtataaa ccttatgtgt gctgtatcct 1771

tacatcaaca cagtcattaa ttgtatttct tggggtaatg ctgatgaagt attttctgg 1830

<210>5

<211>516

<212>PRT

<213>万寿菊

<400>5

Met Ser Met Arg Ala Gly His Met Thr Ala Thr Met Ala Ala Phe Thr

1 5 10 15

Cys Pro Arg Phe Met Thr Ser Ile Arg Tyr Thr Lys Gln Ile Lys Cys

20 25 30

Asn Ala Ala Lys Ser Gln Leu Val Val Lys Gln Glu Ile Glu Glu Glu

35 40 45

Glu Asp Tyr Val Lys Ala Gly Gly Ser Glu Leu Leu Phe Val Gln Met

50 55 60

Gln Gln Asn Lys Ser Met Asp Ala Gln Ser Ser Leu Ser Gln Lys Leu

65 70 75 80

Pro Arg Val Pro Ile Gly Gly Gly Gly Asp Ser Asn Cys Ile Leu Asp

85 90 95

Leu Val Val Ile Gly Cys Gly Pro Ala Gly Leu Ala Leu Ala Gly Glu

100 105 110

Ser Ala Lys Leu Gly Leu Asn Val Ala Leu Ile Gly Pro Asp Leu Pro

115 120 125

Phe Thr Asn Asn Tyr Gly Val Trp Glu Asp Glu Phe Ile Gly Leu Gly

130 135 140

Leu Glu Gly Cys Ile Glu His Val Trp Arg Asp Thr Val Val Tyr Leu

145 150 155 160

Asp Asp Asn Asp Pro Ile Leu Ile Gly Arg Ala Tyr Gly Arg Val Ser

165 170 175

Arg Asp Leu Leu His Glu Glu Leu Leu Thr Arg Cys Met Glu Ser Gly

180 185 190

Val Ser Tyr Leu Ser Ser Lys Val Glu Arg Ile Thr Glu Ala Pro Asn

195 200 205

Gly Leu Ser Leu Ile Glu Cys Glu Gly Asn Ile Thr Ile Pro Cys Arg

210 215 220

Leu Ala Thr Val Ala Ser Gly Ala Ala Ser Gly Lys Leu Leu Gln Tyr

225 230 235 240

Glu Leu Gly Gly Pro Arg Val Cys Val Gln Thr Ala Tyr Gly Ile Glu

245 250 255

Val Glu Val Glu Ser Ile Pro Tyr Asp Pro Ser Leu Met Val Phe Met

260 265 270

Asp Tyr Arg Asp Tyr Thr Lys His Lys Ser Gln Ser Leu Glu Ala Gln

275 280 285

Tyr Pro Thr Phe Leu Tyr Val Met Pro Met Ser Pro Thr Lys Val Phe

290 295 300

Phe Glu Glu Thr Cys Leu Ala Ser Lys Glu Ala Met Pro Phe Glu Leu

305 310 315 320

Leu Lys Thr Lys Leu Met Ser Arg Leu Lys Thr Met Gly Ile Arg Ile

325 330 335

Thr Lys Thr Tyr Glu Glu Glu Trp Ser Tyr Ile Pro Val Gly Gly Ser

340 345 350

Leu Pro Asn Thr Glu Gln Lys Asn Leu Ala Phe Gly Ala Ala Ala Ser

355 360 365

Met Val His Pro Ala Thr Gly Tyr Ser Val Val Arg Ser Leu Ser Glu

370 375 380

Ala Pro Asn Tyr Ala Ala Val Ile Ala Lys Ile Leu Gly Lys Gly Asn

385 390 395 400

Ser Lys Gln Met Leu Asp His Gly Arg Tyr Thr Thr Asn Ile Ser Lys

405 410 415

Gln Ala Trp Glu Thr Leu Trp Pro Leu Glu Arg Lys Arg Gln Arg Ala

420 425 430

Phe Phe Leu Phe Gly Leu Ala Leu Ile Val Gln Met Asp Ile Glu Gly

435 440 445

Thr Arg Thr Phe Phe Arg Thr Phe Phe Arg Leu Pro Thr Trp Met Trp

450 455 460

Trp Gly Phe Leu Gly Ser Ser Leu Ser Ser Thr Asp Leu Ile Ile Phe

465 470 475 480

Ala Phe Tyr Met Phe Ile Ile Ala Pro His Ser Leu Arg Met Gly Leu

485 490 495

Val Arg His Leu Leu Ser Asp Pro Thr Gly Gly Thr Met Leu Lys Ala

500 505 510

Tyr Leu Thr Ile

515

<210>6

<211>445

<212>DNA

<213>万寿菊

<220>

<221>有意片段

<222>(1)..(445)

<223>

<400>6

aagcttgcac gaggcaaagc aaaggttgtt tgttgttgtt gttgagagac actccaatcc 60

aaacagatac aaggcgtgac tggatatttc tctctcgttc ctaacaacag caacgaagaa 120

gaaaaagaat cattactaac aatcaatgag tatgagagct ggacacatga cggcaacaat 180

ggcggctttt acatgcccta ggtttatgac tagcatcaga tacacgaagc aaattaagtg 240

caacgctgct aaaagccagc tagtcgttaa acaagagatt gaggaggaag aagattatgt 300

gaaagccggt ggatcggagc tgctttttgt tcaaatgcaa cagaataagt ccatggatgc 360

acagtctagc ctatcccaaa agctcccaag ggtaccaata ggaggaggag gagacagtaa 420

ctgtatactg gatttggttg tcgac 445

<210>7

<211>446

<212>DNA

<213>万寿菊

<220>

<221>反义片段

<222>(1)..(446)

<223>

<400>7

gaattcgcac gaggcaaagc aaaggttgtt tgttgttgtt gttgagagac actccaatcc 60

aaacagatac aaggcgtgac tggatatttc tctctcgttc ctaacaacag caacgaagaa 120

gaaaaagaat cattactaac aatcaatgag tatgagagct ggacacatga cggcaacaat 180

ggcggctttt acatgcccta ggtttatgac tagcatcaga tacacgaagc aaattaagtg 240

caacgctgct aaaagccagc tagtcgttaa acaagagatt gaggaggaag aagattatgt 300

gaaagccggt ggatcggagc tgctttttgt tcaaatgcaa cagaataagt ccatggatgc 360

acagtctagc ctatcccaaa agctcccaag ggtaccaata ggaggaggag gagacagtaa 420

ctgtatactg gatttggttg gatcct 446

<210>8

<211>393

<212>DNA

<213>万寿菊

<220>

<221>有意片段

<222>(1)..(393)

<223>

<400>8

aagctttgga ttagcactga ttgtccagat ggatattgag gggacccgca cattcttccg 60

gactttcttc cgcttgccca catggatgtg gtgggggttt cttggatctt cgttatcatc 120

aactgacttg ataatatttg cgttttacat gtttatcata gcaccgcata gcctgagaat 180

gggtctggtt agacatttgc tttctgaccc gacaggagga acaatgttaa aagcgtatct 240

cacgatataa ataactctag tcgcgatcag tttagattat aggcacatct tgcatatata 300

tatgtataaa ccttatgtgt gctgtatcct tacatcaaca cagtcattaa ttgtatttct 360

tggggtaatg ctgatgaagt attttctgtc gac 393

<210>9

<211>397

<212>DNA

<213>万寿菊

<220>

<221>反义片段

<222>(1)..(397)

<223>

<400>9

gaattctctt tggattagca ctgattgtcc agatggatat tgaggggacc cgcacattct 60

tccggacttt cttccgcttg cccacatgga tgtggtgggg gtttcttgga tcttcgttat 120

catcaactga cttgataata tttgcgtttt acatgtttat catagcaccg catagcctga 180

gaatgggtct ggttagacat ttgctttctg acccgacagg aggaacaatg ttaaaagcgt 240

atctcacgat ataaataact ctagtcgcga tcagtttaga ttataggcac atcttgcata 300

tatatatgta taaaccttat gtgtgctgta tccttacatc aacacagtca ttaattgtat 360

ttcttggggt aatgctgatg aagtattttc tggatcc 397

<210>10

<211>1537

<212>DNA

<213>-

<220>

<221>启动子

<222>(1)..(1537)

<223>

<400>10

gagctctaca aattagggtt actttattca ttttcatcca ttctctttat tgttaaattt 60

tgtacattta ttcaataata ttatatgttt attacaaatt ctcactttct tattcatacc 120

tattcactca agcctttacc atcttccttt tctatttcaa tactatttct acttcatttt 180

tcacgttttt aacatctttc tttatttctt gtccacttcg tttagggatg cctaatgtcc 240

caaatttcat ctctcgtagt aacacaaaac caatgtaatg ctacttctct ctacattttt 300

aatacaaata aagtgaaaca aaatatctat aaataaacaa atatatatat tttgttagac 360

gctgtctcaa cccatcaatt aaaaaatttt gttatatttc tactttacct actaaatttg 420

tttctcatat ttacctttta acccccacaa aaaaaaatta taaaaaagaa agaaaaaagc 480

taaaccctat ttaaatagct aactataaga tcttaaaatt atcctcatca gtgtatagtt 540

taattggtta ttaacttata acattatata tctatgacat atactctctc ctagctattt 600

ctcacatttt ttaacttaag aaaatagtca taacatagtc taaaattcaa acatccacat 660

gctctaattt gattaacaaa aagttagaaa tatttattta aataaaaaag actaataaat 720

atataaaatg aatgttcata cgcagaccca tttagagatg agtatgcttt cacatgctga 780

gattattttc aaaactaagg ttgtagcaat attaaatcaa taaaattatt ataaataaca 840

aaattaacct gctcgtgttt gctgtatatg ggaggctaca aaataaatta aactaaagat 900

gattatgttt tagacatttt ttctatctgt attagtttat acatattaat tcaggagctg 960

cacaacccaa ttctattttc gttccttggt ggctgggttt ctcacaaggt tcaatagtca 1020

atattaggtt ttattggact tttaatagta tcaaacaaat ctatgtgtga acttaaaaat 1080

tgtattaaat atttagggta acctgttgcc gtttttagaa taatgtttct tcttaataca 1140

cgaaagcgta ttgtgtattc attcatttgg cgcctcacat gcttcggttg gctcgcttta 1200

gtctctgcct tctttgtata ttgtactccc cctcttccta tgccacgtgt tctgagctta 1260

acaagccacg ttgcgtgcca ttgccaaaca agtcatttta acttcacaag gtccgatttg 1320

acctccaaaa caacgacaag tttccgaaca gtcgcgaaga tcaagggtat aatcgtcttt 1380

ttgaattcta tttctcttta tttaatagtc cctctcgtgt gatagttttt aaaagatttt 1440

taaaacgtag ctgctgttta agtaaatccc agtccttcag tttgtgcttt tgtgtgtttt 1500

gtttctctga tttacggaat ttggaaataa taagctt 1537

<210>11

<211>734

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>变异

<222>(1)..(734)

<223>

<400>11

ctaacaatca atgagtagag agctggacac atgacggcaa caatggcggc ttttacatgc 60

cctaggttta tgactagcat cagatacacg aagcaaatta agtgcaacgc tgctaaaagc 120

cagctagtcg ttaaacaaga gattgaggag gaagaagatt atgtgaaagc cggtggatcg 180

gagctgcttt ttgttcaaat gcaacagaat aagtccatgg atgcacagtc tagcctatcc 240

caaaaggtca ctccagactt aattgcttat aaataaataa atatgttttt taggaataat 300

gatatttaga tagattagct atcacctgtg ctgtggtgtg cagctcccaa gggtcttacc 360

gatagtaaaa tcgttagtta tgattaatac ttgggaggtg ggggattata ggctttgttg 420

tgagaatgtt gagaaagagg tttgacaaat cggtgtttga atgaggttaa atggagttta 480

attaaaataa agagaagaga aagattaaga gggtgatggg gatattaaag acggscaata 540

tagtgatgcc acgtagaaaa aggtaagtga aaacatacaa cgtggcttta aaagatggct 600

tggctgctaa tcaactcaac tcaactcata tcctatccat tcaaattcaa ttcaattcta 660

ttgaatgcaa agcaaagcaa aggttgtttg ttgttgttgt tgagagacac tccaatccaa 720

acagatacaa ggcg 734

<210>12

<211>280

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>变异

<222>(1)..(280)

<223>

<400>12

gtcgagtatg gagttcaatt aaaataaaga gaagaraaag attaagaggg tgatggggat 60

attaaagacg gccaatrtag tgatgccacg taagaaaaag gtaagtgaaa acatacaacg 120

tggctttaaa agatggcttg gctgctaatc aactcaactc aactcatatc ctatccattc 180

aaattcaatt caattctatt gaatgcaaag caaagcaaag caaaggttgt ttgttgttgt 240

tgttgagaga cactccaatc caaacagata caaggcgtga 280

<210>13

<211>358

<212>DNA

<213>万寿菊

<220>

<221>(有意)启动子

<222>(1)..(358)

<223>

<400>13

aagcttaccg atagtaaaat cgttagttat gattaatact tgggaggtgg gggattatag 60

gctttgttgt gagaatgttg agaaagaggt ttgacaaatc ggtgtttgaa tgaggttaaa 120

tggagtttaa ttaaaataaa gagaagagaa agattaagag ggtgatgggg atattaaaga 180

cggccaatat agtgatgcca cgtagaaaaa ggtaagtgaa aacatacaac gtggctttaa 240

aagatggctt ggctgctaat caactcaact caactcatat cctatccatt caaattcaat 300

tcaattctat tgaatgcaaa gcaaagcaaa gcaaaggttg tttgttgttg ttgtcgac 358

<210>14

<211>361

<212>DNA

<213>万寿菊

<220>

<221>(反义)启动子

<222>(1)..(361)

<223>

<400>14

ctcgagctta ccgatagtaa aatcgttagt tatgattaat acttgggagg tgggggatta 60

taggctttgt tgtgagaatg ttgagaaaga ggtttgacaa atcggtgttt gaatgaggtt 120

aaatggagtt taattaaaat aaagagaaga gaaagattaa gagggtgatg gggatattaa 180

agacggccaa tatagtgatg ccacgtagaa aaaggtaagt gaaaacatac aacgtggctt 240

taaaagatgg cttggctgct aatcaactca actcaactca tatcctatcc attcaaattc 300

aattcaattc tattgaatgc aaagcaaagc aaagcaaagg ttgtttgttg ttgttggatc 360

c 361

<210>15

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>引物

<222>(1)..(28)

<223>

<400>15

gagctcactc actgatttcc attgcttg 28

<210>16

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>引物

<222>(1)..(37)

<223>

<400>16

cgccgttaag tcgatgtccg ttgatttaaa cagtgtc 37

<210>17

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>引物

<222>(1)..(34)

<223>

<400>17

atcaacggac atcgacttaa cggcgtttgt aaac 34

<210>18

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>引物

<222>(1)..(25)

<223>

<400>18

taagcttttt gttgaagaga tttgg 25

<210>19

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>引物

<222>(1)..(23)

<223>

<400>19

gaaaatactt catcagcatt acc 23

<210>20

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>引物

<222>(1)..(28)

<223>

<400>20

gtcgactacg taagtttctg cttctacc 28

<210>21

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>引物

<222>(1)..(26)

<223>

<400>21

ggatccggtg atacctgcac atcaac 26

<210>22

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>引物

<222>(1)..(28)

<223>

<400>22

aagcttgcac gaggcaaagc aaaggttg 28

<210>23

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>引物

<222>(1)..(29)

<223>

<400>23

gtcgacaacc aaatccagta tacagttac 29

<210>24

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>引物

<222>(1)..(30)

<223>

<400>24

aggatccaac caaatccagt atacagttac 30

<210>25

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>引物

<222>(1)..(28)

<223>

<400>25

gaattcgcac gaggcaaagc aaaggttg 28

<210>26

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>引物

<222>(1)..(25)

<223>

<400>26

aagctttgga ttagcactga ttgtc 25

<210>27

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>引物

<222>(1)..(29)

<223>

<400>27

gtcgacagaa aatacttcat cagcattac 29

<210>28

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>引物

<222>(1)..(29)

<223>

<400>28

ggatccagaa aatacttcat cagcattac 29

<210>29

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>引物

<222>(1)..(27)

<223>

<400>29

gaattctctt tggattagca ctgattg 27

<210>30

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>引物

<222>(1)..(23)

<223>

<400>30

cgccttgtat ctgtttggat tgg 23

<210>31

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>引物

<222>(1)..(24)

<223>

<400>31

ctaacaatca atgagtatga gagc 24

<210>32

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>引物

<222>(1)..(26)

<223>

<400>32

agagcaaggc cagcaggacc acaacc 26

<210>33

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>引物

<222>(1)..(26)

<223>

<400>33

ccttgggagc ttttgggata ggctag 26

<210>34

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>引物

<222>(1)..(26)

<223>

<400>34

tcacgccttg tatctgtttg gattgg 26

<210>35

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>引物

<222>(1)..(15)

<223>

<400>35

gtcgagtatg gagtt 15

<210>36

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>引物

<222>(1)..(28)

<223>

<400>36

aagcttaccg atagtaaaat cgttagtt 28

<210>37

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>引物

<222>(1)..(31)

<223>

<400>37

ctcgagctta ccgatagtaa aatcgttagt t 31

<210>38

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>引物

<222>(1)..(28)

<223>

<400>38

gtcgacaaca acaacaaaca acctttgc 28

<210>39

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>引物

<222>(1)..(28)

<223>

<400>39

ggatccaaca acaacaaaca acctttgc 28

<210>40

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>引物

<222>(1)..(28)

<223>

<400>40

gtcgactttt tgttgaagag atttggtg 28

<210>41

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>引物

<222>(1)..(28)

<223>

<400>41

ctcgagactc actgatttcc attgcttg 28

<210>42

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>引物

<222>(1)..(22)

<223>

<400>42

gagctctaca aattagggtt ac 22

<210>43

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>引物

<222>(1)..(23)

<223>

<400>43

aagcttatta tttccaaatt ccg 23

Claims

1.通过培养经遗传修饰植物制备玉米黄素和/或其生物合成中间体和/或次级产物的方法，其中经遗传修饰植物与野生型相比具有由于双链ε-环化酶核糖核酸序列引起的ε-环化酶活性降低。

2.根据权利要求1所述的方法，其中将这样的RNA导入植物，所述RNA具有双链结构区域并且在所述区域中包含下述核酸序列：

a)与所述植物固有的至少部分ε-环化酶转录本相同和/或

b)与所述植物固有的至少部分ε-环化酶-启动子序列相同。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述双链结构区域包含这样的核酸序列，其与所述植物固有的至少部分ε-环化酶转录本相同并包含所述植物固有的编码ε-环化酶的核酸的5’端或3’端。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其中在每一情况下所述双链结构区域包含含有至少一种基本上与至少部分有意-RNAε-环化酶转录本相同的核糖核苷酸序列的有意-RNA链，并且包含基本上与所述有意-RNA链互补的反义-RNA链。

5.根据权利要求1-4中任意一项所述的方法，其中所使用的经遗传修饰植物的花具有最低比率的ε-环化酶表达。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述双链ε-环化酶核糖核酸序列在花特异的启动子控制下转录，见序列+附图。

7.根据权利要求1-6中任意一项所述的方法，其中所使用的植物选自以下科：毛茛科、小檗科、罂粟科、大麻科、蔷薇科、豆科、亚麻科、葡萄科、芸苔科、葫芦科、报春花科、石竹科、苋科、龙胆科、牻牛儿苗科、忍冬科、木犀科、旱金莲科、茄科、玄参科、菊科、百合科、石蒜科、禾本科、兰科、锦葵科、木兰科或唇形科。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所使用的植物选自以下植物属：金盏菊属、万寿菊属、金合欢属、乌头属、侧金盏花属、阿尼菊属、耧斗菜属、紫菀属、黄芪属、紫葳属、金盏花属、驴蹄草属、风铃草属、美人蕉属、矢车菊属、桂竹香属、茼蒿属、柑桔属、还阳参属、番红花属、南瓜属、金雀儿属、凤凰木属、翠雀属、石竹属、异果菊属、多榔菊属、花菱草属、连翘属、Fremontia、勋章菊属、断肠草属、染料木属、龙胆属、老鹳草属、扶郎花属、水杨梅属、银桦属、堆心菊属、向日葵属、獐耳细辛属、独活属、木槿属、赛菊芋属、金丝桃属、猫儿菊属、凤仙花属、鸢尾属、蓝花楹属、棣棠属、毒豆属、香豌豆属、狮齿菊属、百合属、亚麻属、百脉根属、番茄属、珍珠菜属、合囊蕨属、苜蓿属、沟酸浆属、水仙属、月见草属、木犀属、碧冬茄属、石楠属、酸浆属、牧根草属、委陵菜属、火棘属、毛茛属、杜鹃花属、蔷薇属、金光菊属、千里光属、蝇子草属、松香草属、白芥属、花楸属、鹰爪豆属、黄钟花属、蝴蝶草属、婆罗门参属、金莲花属、旱金莲属、郁金香属、款冬属、荆豆属、堇菜属或百日草属。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所用植物是选自金盏菊(Marigold)、万寿菊(Tagetes erecta)或孔雀草(Tagetes patula)植物物种。

10.根据权利要求1-9中任意一项所述的方法，其中在培养之后收获经遗传修饰植物并且随后从所述植物中分离玉米黄素和/或其生物合成中间体和/或次级产物。

11.根据权利要求1-10中任意一项所述的方法，其中生物合成中间体和/或次级产物选自：番茄红素、β-胡萝卜素、虾青素、角黄素、β-胡萝卜素-4-酮、3-羟基β-胡萝卜素-4-酮、3’-羟基β-胡萝卜素-4-酮、金盏花玉红质、金盏花黄质、花药黄质、堇菜黄素、新黄素、辣椒红素、和辣椒红。

12.核糖核酸构建体，其包含具双链结构区域并且在所述区域中包含以下核酸序列的RNA：

a)与所述植物固有的至少部分ε-环化酶转录本相同和/或

b)与所述植物固有的至少部分ε-环化酶启动子序列相同。

13.核酸构建体，其可转录成

a)包含至少一种基本上与至少部分有意-RNAε-环化酶转录本相同的核糖核苷酸序列的有意-RNA链，和

b)基本上，优选地完全，与a)中的RNA有意链互补的反义-RNA链。

14.核酸构建体，其包含

a)基本上与至少部分ε-环化酶基因启动子区相同的有意-DNA链，和

b)基本上，优选地完全，与a)中的DNA有意链互补的反义-DNA链。

15.根据权利要求13所述的核酸构建体，其中SEQ ID No.4描述了可推导自ε-环化酶转录本的cDNA序列。

16.根据权利要求14所述的核酸构建体，其中SEQ ID No.13描述了ε-环化酶基因启动子区的核酸序列。

17.根据权利要求12-16中任意一项所述的核酸构建体，其中有意-RNA链和反义-RNA链以反向重复形式彼此共价连接。

18.根据权利要求12-17中任意一项所述的核酸构建体，其中该核酸构建体还包含功能性连接的启动子。

19.根据权利要求18所述的核酸构建体，其中使用了花特异的启动子。

20.制备经遗传修饰植物的方法，其中将包含根据权利要求12-19中任意一项所述的核酸构建体的表达盒导入亲本植物。

21.经遗传修饰植物，与野生型相比其具有由于双链ε-环化酶核糖核酸序列引起的ε-环化酶活性降低。

22.根据权利要求21所述的经遗传修饰植物，其中所述经遗传修饰植物包含具双链结构区域并且在所述区域中包含以下核酸序列的RNA：

a)与所述植物固有的至少部分ε-环化酶转录本相同和/或

b)与所述植物固有的至少部分ε-环化酶启动子序列相同。

23.根据权利要求21或22所述的经遗传修饰植物，其中植物选自以下科：毛茛科、小檗科、罂粟科、大麻科、蔷薇科、豆科、亚麻科、葡萄科、芸苔科、葫芦科、报春花科、石竹科、苋科、龙胆科、牻牛儿苗科、忍冬科、木犀科、旱金莲科、茄科、玄参科、菊科、百合科、石蒜科、禾本科、兰科、锦葵科、木兰科或唇形科。

24.根据权利要求23所述的经遗传修饰植物，其中植物选自以下植物属：金盏菊属、万寿菊属、金合欢属、乌头属、侧金盏花属、阿尼菊属、耧斗菜属、紫菀属、黄芪属、紫葳属、金盏花属、驴蹄草属、风铃草属、美人蕉属、矢车菊属、桂竹香属、茼蒿属、柑桔属、还阳参属、番红花属、南瓜属、金雀儿属、凤凰木属、翠雀属、石竹属、异果菊属、多榔菊属、花菱草属、连翘属、Fremontia、勋章菊属、断肠草属、染料木属、龙胆属、老鹳草属、扶郎花属、水杨梅属、银桦属、堆心菊属、向日葵属、獐耳细辛属、独活属、木槿属、赛菊芋属、金丝桃属、猫儿菊属、凤仙花属、鸢尾属、蓝花楹属、棣棠属、毒豆属、香豌豆属、狮齿菊属、百合属、亚麻属、百脉根属、番茄属、珍珠菜属、合囊蕨属、苜蓿属、沟酸浆属、水仙属、月见草属、木犀属、碧冬茄属、石楠属、酸浆属、牧根草属、委陵菜属、火棘属、毛茛属、杜鹃花属、蔷薇属、金光菊属、千里光属、蝇子草属、松香草属、白芥属、花楸属、鹰爪豆属、黄钟花属、蝴蝶草属、婆罗门参属、金莲花属、旱金莲属、郁金香属、款冬属、荆豆属、堇菜属或百日草属。

25.根据权利要求24所述的经遗传修饰植物，其中植物选自植物物种金盏菊、万寿菊或孔雀草。

26.根据权利要求21-25中任意一项所述的经遗传修饰植物的用途，用作装饰植物或用作饲料和食品。

27.根据权利要求21-25中任意一项所述的经遗传修饰植物的用途，用于制备含类胡萝卜素的提取物或用于制备饲料和食品添加剂。