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CN1643164A - 以重组牛免疫缺陷病毒为基础的基因转移系统 - Google Patents

以重组牛免疫缺陷病毒为基础的基因转移系统 Download PDF

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CN1643164A CNA038072858A CN03807285A CN1643164A CN 1643164 A CN1643164 A CN 1643164A CN A038072858 A CNA038072858 A CN A038072858A CN 03807285 A CN03807285 A CN 03807285A CN 1643164 A CN1643164 A CN 1643164A
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M·卡勒克
D·格里特雷
R·莫里那
李孟陶
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Abstract

本发明提供了重组慢病毒载体和产生所述载体的基因转移系统，产生所述重组慢病毒载体中所用的细胞系，以及所述重组载体和基因转移系统所用的牛免疫缺陷病毒DNA序列。

Description

以重组牛免疫缺陷病毒为基础的基因转移系统
[001]本申请要求于2002年2月4日递交的美国临时申请60/353,177以及2002年12月18日递交的美国临时申请60/433,956的优先权，特此将两者都全文并入作为参考。
                      发明领域
[002]本发明一般地涉及病毒载体领域，并且更具体地涉及新的重组慢病毒载体，产生所述载体的基因转移系统，以及用于表达基因转移系统和包装及递送重组载体的细胞系。
                       发明背景
[003]本公开文本及其它材料在文中用于阐释本发明的背景，并且特别地，将提供了有关实施本发明的附加细节的案例特此并入作为参考，并且为方便计，在下文中以作者和日期引用，并在所附的参考文献列表中分别分组。
[004]慢病毒含有基因gag、pol、env以及具有调控或结构功能的其它基因。慢病毒能够侵染分裂和非分裂细胞，这与致肿瘤逆转录病毒大不相同，例如后者只能侵染分裂的细胞。正是这种侵染非分裂细胞的能力使得慢病毒成为体内和离体基因治疗尤为有用的系统。
[005]在将慢病毒用于基因治疗时的一个重要考虑是用作为载体的“安全”慢病毒的可获得性。安全的逆转录病毒载体能够将目的基因递送到细胞中，但此过程中产生有复制能力病毒颗粒的能力下降。使这些载体安全的方法之一是在不同的DNA构建体上分离必需基因，其中病毒RNA包装所需的必需基因如gag、pol和env基因，与向侵染的细胞核和染色体递送异源目的基因所必需的DNA序列和基因在不同DNA构建体上提供。已研发了包装细胞系和载体产生细胞系以满足这种需要。简要地，这种方法使用两种组分，即慢病毒载体和包装细胞系。慢病毒载体含使原病毒DNA整合到宿主染色体所必需的长末端重复(LTR)、要转移的异源核苷酸序列以及使得病毒RNA能够包装进入传染性但复制缺陷型载体的包装序列。向真核细胞进行基因递送所用的病毒载体通常如此构建，从而许多必需的病毒基因缺失并替换为目的基因。复制缺陷型慢病毒载体自身不会复制，因为编码结构和包膜蛋白如GAG、POL和ENV的基因不包含在载体基因组内。从载体上缺失掉的基因通常由包装细胞系中的一个或多个辅助或包装构建体提供。包装细胞系含有编码必需的GAG、POL和ENV蛋白的基因，但这些基因构建体不含包装信号(文中也称之为“包装序列”)。从而，包装细胞系自身只能够形成空的病毒粒子颗粒。然而，为了包装目的基因以递送到靶细胞中，必须反式提供必需的病毒基因，从而重组病毒载体构建体能够组装为传染性但复制缺陷型载体。
[006]当将具有包装信号的慢病毒载体构建体引入到包装细胞系中时，细胞系将产生含有慢病毒载体构建体基因组的载体颗粒，而无其它必需慢病毒基因。通过从载体构建体中除去必需基因，所产生的传染性病毒颗粒或载体能够将异源目的基因递送到侵染的细胞中，而不会产生有复制能力的病毒。在这种方式下，只有当反式提供必需基因时，宿主细胞才能生产包含带目的基因的载体构建体的重组复制缺陷型载体(PCT申请号PCT/US00/33725(WO 01/44458))。
[007]不过，目前应用的载体和包装构建体细胞系存在若干缺点。一个问题涉及生产者细胞产生有复制能力的慢病毒。简要地，例如当含载体DNA的构建体与含另外的必需病毒基因的构建体相互重组时，或者当载体DNA或含另外的必需病毒基因的构建体与生产者细胞中同源的隐含内源逆转录病毒元件重组时，有复制能力的病毒可在常规的生产者细胞中产生。此外，在转染载体构建体后，如果重组慢病毒载体遇到宿主细胞中的同源序列，侵染的宿主细胞很可能允许载体基因组和存在于宿主细胞内的内源病毒序列之间的重组。
[008]最近的一个构建更为安全的包装细胞系的途径涉及使用辅助病毒元件的互补部分，其分割在两个不同的质粒间，一个含gag和pol，而另一个含env(见Markowitz等，J.Virol.62：1120-1124；以及Markowitz等，Virology 167：600-606，1988)。这种双质粒系统的一个有益之处在于产生有复制能力的基因组需要三个重组事件。该途径使得野生型病毒基因组多组分共包装和随后转移的能力降至最低程度，而且由于包装细胞中包含重组慢病毒系统的不同DNA组分的存在，显著降低了重组频率。然而，双组分系统的缺点包含与载体构建体同源的DNA部分，因而保留了通过构建体之间的同源重组产生有复制能力的病毒的可能性。
[009]基于人类免疫缺陷病毒(HIV)的基因转移系统是迄今为止研发得最多的慢病毒系统，文档记载的有体内大鼠大脑、视网膜和肌肉以及肝细胞的转导。然而，HIV是AIDS的致病因子。另外，已用HIV-1衍生的载体离体转导了人类角膜组织，而且体外转染的未刺激的造血干细胞已发育为淋巴细胞发育体内模型中的成熟T和B细胞(Douglas等，Hum Gene Ther.12(4)：401-413(2001)；Miyoshi等，Virol.72：8150-8157(1999))。基于HIV的重组慢病毒载体引起了基因治疗的多种安全顾虑。例如，已假设如果复制缺陷型HIV载体要与潜伏或瞬时侵染细胞的内源人类慢病毒重组，则将会存在产生有复制能力的HIV的几率。非人或者特别是非灵长类慢病毒例如BIV在同一宿主细胞内遭遇同源病毒序列的几率是极不可能发生的。
[0010]为规避与基于HIV的慢病毒载体相关的安全顾虑，动物慢病毒例如猫免疫缺陷病毒(FIV)、马传染性贫血病病毒(EIAV)、绵羊髓鞘脱落病毒(visna virus)已被用来产生基因转移载体。不过，已经证明由这些动物慢病毒衍生的载体不如由HIV衍生的载体性能好(PriceMA等，2002，Molecular Therapy；O′Rourke JP等，2002，Journal ofVirology；Ikeda Y等，2002，Gene Therapy；Berkowitz RD等，2001，Virology)。
[0011]牛免疫缺陷病毒(BIV)被分类在逆转录病毒亚科慢病毒科。慢病毒是外生的非致瘤性逆转录病毒，并且其中包含马传染性贫血病病毒(EIAV)、猿免疫缺陷病毒(SIV)、绵羊髓鞘脱落病毒和行进性绵羊肺炎病毒、猫免疫缺陷病毒(FIV)和人免疫缺陷病毒(HIV-1和HIV-2)。在慢病毒中，科之间具有截然不同的同源性等级。
[0012]牛免疫缺陷病毒与HIV、SIV、FIV、EIAV、绵羊髓鞘脱落病毒没有明显的总体同源性(Garvey KJ等，1990，Virology；Gonda MA等，1994，Virus Research)。在系统发生分析中，BIV是离HIV和SIV最远的慢病毒(Gonda MA等，1994，Virus Research)。与其它慢病毒不同，BIV尚未深入研究，某些重要的BIV元件例如包装信号序列和Rev应答元件(RRE)的定位尚未鉴定。因此，由该病毒得到改进的基因转移系统构成重大挑战。在深入研究后，本发明绘制了BIV包装信号序列和RRE序列，并产生了改进的BIV载体。由BIV衍生的载体在滴度、转导效率以及体外和体内的基因表达持续时间上同基于HIV的载体性能一样好。
[0013]BIV感染奶牛，且有害作用不明。同HIV一样，BIV具有辅助基因，但多数与HIV的截然不同。BIV在系统发生上与HIV截然不同，并且不轻易感染T细胞。其在体内主要地见于单核细胞和脾的巨噬细胞。水泡性口膜炎病毒G蛋白(VSV-G)与其它病毒的基因组和基质组分有效地形成假型病毒粒子。含VSV-G包膜的重组BIV病毒构建体已被成功地引入到人类细胞中，具有接近于HIV基因转移系统中所看到的异源基因的转导和表达效率(Berkowitz等，J.Virol.7(7)：3371-3382(2001))。
[0014]Olsen的美国专利6,277,633描述了基于EIAV的重组慢病毒载体表达系统，包含属于gag/pol表达载体的第一载体，具有载体基因组反转录所必需的顺式作用序列元件的第二载体，包装序列，而且额外包含可插入异源基因的多克隆位点。Olsen所述的系统也利用表达病毒包膜蛋白的第三载体。第一和第三载体是包装信号缺陷型的。
[0015]本发明提供了优化的基于BIV基因组的基因转移系统，用以向广范围的真核细胞转移异源基因。设计本发明的系统、载体和包装细胞系以使系统中不同构建体之间的同源性最小化，由此减小产生有复制能力的BIV载体的可能性。
                       发明概述
[0016]本发明包含基因转移系统，其中包装病毒RNA和将原病毒DNA整合到侵染的细胞染色体中所必需的BIV慢病毒包装基因和顺式作用基因在不同的DNA构建体上提供，其中一个或多个构建体含一个或多个BIV包装基因，其可与另外的DNA构建体互补以提供将异源目的基因递送给靶细胞的复制缺陷型传染颗粒。构建体的多种组分可在同一个或不同的DNA分子上提供，并且可包含3、4或5个单独的构建体。
[0017]在一个实施方案中，本发明包含重组慢病毒基因转移系统，其中产生重组复制缺陷型载体所必需的基因在三个不同的DNA构建体上提供，该系统包含：包装构建体，包含BIV gag基因和BIV pol基因；病毒表面蛋白基因构建体，包含病毒表面蛋白基因；以及转移载体构建体，含DNA片段，所述片段包含异源目的基因和最小化的用以将异源目的基因包装到复制缺陷型载体中的BIV包装序列。在优选的实施方案中，本发明提供了三构建体系统，包含：
(a)包装构建体，包含DNA片段，所述DNA片段包含可操作地连接于BIV gag基因和BIV pol基因的第一启动子；
(b)病毒表面蛋白基因构建体，包含DNA片段，所述DNA片段包含可操作地连接于病毒表面蛋白基因的第二启动子；和
(c)转移载体构建体，包含DNA片段，所述DNA片段包含的第三启动子可操作地顺序连接于第一R区、U5区、UTR(非翻译区)区、最小BIV包装序列、RRE序列、可操作地连接于异源目的基因的第四启动子、3′聚嘌呤带、U3区、第二R区以及任选地第二U5区；
位于所述包装构建体、病毒表面蛋白基因构建体及转移载体构建体之一上的rev基因；其中所有的启动子可以相同或不同。
[0018]在另一个实施方案中，本发明包含重组慢病毒基因转移系统，其中产生重组复制缺陷型载体所必需的基因在四个不同的DNA表达构建体上提供，该系统包含包装构建体，含包含BIV gag基因和BIV pol基因的DNA片段；rev构建体，含包含BIV rev基因的DNA片段；病毒表面蛋白基因构建体，含包含病毒表面蛋白基因的DNA片段；以及转移载体构建体，含包含异源目的基因和BIV包装序列的DNA片段，所述包装序列用以将异源目的基因包装到复制缺陷型载体中。
[0019]在另一个优选的实施方案中，本发明提供了一种四构建体系统，包含重组慢病毒基因转移系统，其包含：
(a)包装构建体，包含DNA片段，所述DNA片段包含可操作地连接于BIV gag基因和BIV pol基因的第一启动子；
(b)病毒表面蛋白基因构建体，包含DNA片段，所述DNA片段包含可操作地连接于病毒表面蛋白基因的第二启动子；
(c)rev构建体，包含DNA片段，所述DNA片段包含可操作地连接于rev基因的第三启动子；和
(d)转移载体构建体，包含DNA片段，所述DNA片段的第四启动子包含可操作地顺序连接于第一R区、U5区、UTR区、最小BIV包装序列、RRE序列、可操作地连接于异源目的基因的第五启动子、3′聚嘌呤带、U3区、第二R区以及任选地第二U5区；其中所有的启动子可以相同或不同。
[0020]又在另一实施方案中，本发明包含重组慢病毒基因转移系统，其中产生重组复制缺陷型载体所必需的基因在五个不同的DNA表达构建体上提供，该系统包含第一包装构建体，包含BIV gag基因；第二包装构建体，包含BIV pol基因；rev构建体，包含rev基因；病毒表面蛋白基因构建体，包含病毒表面蛋白基因；以及转移载体构建体，含DNA片段，所述片段包含异源目的基因和BIV包装序列，后者用以将异源目的基因包装到复制缺陷型载体中。
[0021]在另一个优选的实施方案中，本发明提供了一种五构建体系统，包含：
(a)第一包装构建体，包含DNA片段，所述DNA片段包含可操作地连接于包含BIV gag基因的DNA片段的第一启动子；
(b)第二包装构建体，包含DNA片段，所述DNA片段包含可操作地连接于包含BIV pol基因的DNA片段的第二启动子；
(c)病毒表面蛋白基因构建体，包含DNA片段，所述DNA片段包含可操作地连接于病毒表面蛋白基因的第三启动子；
(d)rev构建体，包含可操作地连接于rev基因的第四启动子；和
(e)转移载体构建体，包含DNA片段，所述DNA片段包含的第五启动子可操作地顺序连接于第一R区、U5区、UTR区、BIV包装序列、RRE序列、可操作地连接于异源目的基因的第六启动子、3′聚嘌呤带、U3区、第二R区以及任选地第二U5区；其中所有的启动子可以相同或不同。
[0022]在一个实施方案中，一个或多个启动子是调控型启动子。例如，在多个例示性的实施方案中，调控型启动子选自诱导和抑制型启动子、诱导型启动子、抑制型启动子以及组织特异性启动子。在另一个实施方案中，可操作地连接于异源基因的启动子是组成型启动子。在另一个实施方案中，可操作地连接于异源基因的启动子是调控型启动子。在另一个实施方案中，可操作地连接于异源基因的启动子是组织特异性启动子。在另一个实施方案中，可操作地连接于异源基因的启动子是诱导型或抑制型的。在另一个实施方案中，可操作地连接于gag或pol基因中至少之一的启动子是调控型的。在另一个实施方案中，可操作地连接于gag或pol基因中至少之一的启动子是诱导型或抑制型的。在另一个实施方案中，可操作地连接于病毒表面蛋白基因的启动子是调控型的。在另一个实施方案中，可操作地连接于病毒表面蛋白基因的启动子是诱导型或抑制型的。
[0023]在优选的实施方案中，具有BIV包装序列和异源目的基因的转移载体构建体包含的启动子可操作地连接于第一R区、U5区、UTR区、BIV包装序列、BIV RRE序列、可操作地连接于异源目的基因的启动子、U3区和第二R区以及任选地第二U5区。
[0024]在一个实施方案中，本发明的多种基因转系统包含重新编码的(密码子优化的)核酸序列，其中重新编码的序列编码野生型BIV基因功能，但与以前的BIV基因转移系统相比，在系统的不同DNA构建体之间具有降低的序列同源性。
[0025]在另一实施方案中，本发明的多种基因转系统包含重新编码的核酸序列，其中重新编码的序列编码野生型BIV基因功能，但包含重新编码的真核细胞中蛋白翻译的最佳使用的密码子。在尤其优选的实施方案中，真核细胞是人类细胞。
[0026]本发明进一步提供了利用本发明的基因转移系统的包装细胞和包装细胞系。所述包装细胞和细胞系包含包装构建体(单个或数个)和病毒表面蛋白基因构建体。
[0027]本发明进一步提供了利用本发明的基因转移系统的生产者细胞和生产者细胞系，其包含包装构建体(单个或数个)、病毒表面蛋白构建体以及转移载体构建体。
[0028]本发明另外提供了利用本发明的基因转移系统、细胞和细胞系产生复制缺陷型重组慢病毒载体的方法。
[0029]本发明也提供了通过在生产者细胞中表达本发明的基因转移系统产生的载体。向包装细胞中加入转移载体构建体则导致形成生产者细胞。生产者细胞产生病毒粒子或含载体RNA的载体。用载体侵染细胞则导致异源目的基因转移到细胞中和异源目的基因在细胞中的表达。
[0030]又在另一实施方案中，本发明提供了治疗动物的方法，包含使动物细胞与本发明的重组慢病毒载体接触。动物细胞的接触可在体内或体外发生。
[0031]本发明进一步提供了用于人类的具有提高的安全性的重组慢病毒基因转移系统，其中当被引入到例如被野生型HIV侵染的编码和表达HIV包装基因的细胞中时，系统中基于BIV的载体RNA不能被包装到传染性载体中。
[0032]本发明进一步提供了基因转移载体以及基因转移和表达的方法，其可用于基因功能研究中改变特定细胞类型中的基因表达模式。
[0033]根据本发明，已确定了含BIV包装序列中将病毒RNA有效包装到传染性载体中所必需的最小核酸序列在BIV基因组中的遗传定位。
[0034]也已经确定了BIV基因组的含cPPT(中心聚嘌呤带)遗传定位，所述cPPT促进含原病毒核酸的慢病毒预整合复合体进入侵染细胞的核膜。已经证明cPPT增强慢病毒预整合复合体核输入到非分裂细胞中，尽管cPPT不是慢病毒载体转导非分裂细胞绝对必需的。也已经确定了BIV基因组的含核糖体移码位点的遗传定位，所述位点使得BIV gag和pol基因能够从单个mRNA转录物共同翻译。
[0035]在一个实施方案中，运用gag和pol基因之间移码位点的知识重新编码这些基因。结果，重新编码的gag和pol以更大的效率在宿主细胞中翻译，提供了具有提高的病毒滴度的重组慢病毒基因转移系统。同样，重新编码的gag和pol基因提供了在包装构建体和载体构建体之间具有减小的同源性的重组慢病毒基因转移系统。此外，并非束缚于任何理论，相信重新编码的gag和pol基因序列在由其表达的mRNA中具有改变的二级结构，由此提供了无需RRE序列而在载体产出细胞中功能性表达gag和pol的重组慢病毒基因转移系统。从gag/pol构建体中消除RRE消除了与载体构建体中RRE序列的所有同源性，由此进一步消除了产生有复制能力的重组慢病毒的可能性。本发明的这个方面提供了附加的安全措施。
[0036]也已经确定了BIV pol基因的RNA编码序列。在一个实施方案中，本发明提供了由SEQ ID NO：50所示的野生型pol组成的核酸序列。在另一个实施方案中，本发明提供了如SEQ ID NO：52所示的重新编码的pol序列。在另一个实施方案中，本发明提供了编码BIV pol基因产物的多肽序列的如SEQ ID NO：51所示的分离的核酸。又在另一个实施方案中，本发明提供了如SEQ ID NO：53所示的合成的核酸，它是在野生型BIV pol基因序列中添加了ATG密码子的合成序列。又在另一个实施方案中，本发明提供了如SEQ ID NO：54所示的合成的核酸，它是在重新编码的BIV pol基因序列中添加了ATG密码子的合成序列。
[0037]在另一个实施方案中，本发明的gag/pol构建体含有如PCR申请PCT/EP02/02807(WO 02/072851)中所述的突变，其中蛋白酶编码序列包含与编码的慢病毒蛋白酶中T26S取代相应的突变。
[0038]也已经确定了BIV基因组中rev基因的遗传定位。利用rev定位的知识，合成了在单个开放读框中编码rev基因的DNA。从而构建了重组慢病毒基因转移系统，其中rev基因在不同于gag和pol的表达载体上提供。rev基因可以作为包含在两个外显子中的剪接信息，或者作为在一个外显子和开放读框中编码的单个信息表达。
[0039]也已经确定了BIV基因组中BIV RRE的遗传定位。它是位于BIV env区含BIV RRE基因序列的312个核苷酸序列，如SEQ ID NO：40所示。
[0040]本发明进一步包含在培养基中培养细胞，培养基包含组蛋白脱乙酰基酶抑制剂，由此与无组蛋白脱乙酰基酶抑制剂的条件相比，产生具有更高滴度和更高宿主细胞侵染性的重组复制缺陷型载体。
                         附图简述
[0041]图1是表示BIV三基因转移系统的示意图。
[0042]图2是表示BIV四基因转移系统的示意图。
[0043]图3显示了由含不同量的gag序列的BIV载体转导的细胞中eGFP表达的流式细胞仪分析。图A)假侵染的，B)来自pBSV4MGppt的BIV载体，C)来自pBIVminivec的BIV载体，D)来自含28 bp gag序列的pBV28的BIV载体，E)来自含54 bp gag序列的pBV54的BIV载体，F)来自含101 bp gag序列的pBV101的BIV载体。
[0044]图4显示了含BIV或HIV cPPT的BIV载体的转导效率的功能比较。
[0045]图5显示了BIV Pol翻译核糖体移码位点。
[0046]图6显示了表示重新编码的BIV gag/pol表达构建体的示意图。
[0047]图7显示了在病毒载体生产期间添加组蛋白脱乙酰基酶抑制剂对基于牛免疫缺陷病毒的慢病毒载体生产的成效。
[0048]图8显示了在病毒载体生产期间添加组蛋白脱乙酰基酶抑制剂对基于牛免疫缺陷病毒的慢病毒载体转导效率的成效。
                  序列表的简短说明
[0049]伴随本公开文本的序列表特此并入作为本公开文本的参考。以下是对该序列表中所含序列的说明：
[0050]SEQ ID NO：1        牛免疫缺陷病毒。
[0051]SEQ ID NO：2-9      寡核苷酸。
[0052]SEQ ID NO：10       Rev基因。
[0053]SEQ ID NO：11-38    寡核苷酸。
[0054]SEQ ID NO：39       BIV包装信号。
[0055]SEQ ID NO：40       含BIV RRE序列的312 bp BIV env序列。
[0056]SEQ ID NO：41-48    寡核苷酸。
[0057]SEQ ID NO：49       重新编码的BIV gag/pol的DNA序列。
[0058]SEQ ID NO：50        BIV pol DNA序列。
[0059]SEQ ID NO：51        BIV pol氨基酸序列。
[0060]SEQ ID NO：52        重新编码的BIV pol DNA序列。
[0061]SEQ ID NO：53        带ATG的野生型BIV Pol序列。
[0062]SEQ ID NO：54        带ATG的重新编码的BIV pol DNA序列。
[0063]SEQ ID NO：55        HIV蛋白酶的部分氨基酸序列。
[0064]SEQ ID NO：56        BIV蛋白酶的部分氨基酸序列。
[0065]SEQ ID NO：57        突变HIV HXB2蛋白酶的部分氨基酸序列。
[0066]SEQ ID NO：58        突变BIV蛋白酶的部分氨基酸序列。
[0067]SEQ ID NO：59        具有蛋白酶突变的重新编码的gag/pol。
[0068]SEQ ID NO：60        小鼠RdCVF1 cDNA。
[0069]SEQ ID NO：61        翻译的小鼠RdCVF1 cDNA的氨基酸序列。
[0070]SEQ ID NO：62    人类RdCVF1 cDNA。
[0071]SEQ ID NO：63    翻译的人类RdCVF1 cDNA的氨基酸序列。
[0072]SEQ ID NO：64    小鼠RdCVF2 cDNA。
[0073]SEQ ID NO：65    翻译的小鼠RdCVF2 cDNA的氨基酸序列。
[0074]SEQ ID NO：66    人类RdCVF2 cDNA。
[0075]SEQ ID NO：67    翻译的人类RdCVF2 cDNA的氨基酸序列。
[0076]SEQ ID NO：68    索戈托病毒包膜。
[0077]SEQ ID NO：69    翻译的索戈托病毒包膜的氨基酸序列。
[0078]SEQ ID NO：70    重新编码的索戈托病毒包膜。
[0079]SEQ ID NO：71    翻译的重新编码的索戈托病毒包膜的氨基酸序列。
                       发明详述
[0080]除非另行指出，本发明的实施将使用本领域技术人员所熟知的细胞生物、分子生物、细胞培养、病毒学、免疫学等常规技术。这些技术充分公开在当前的文献中，并且可参照例如Molecular Cloning，ALaboratory Manual，第二版，Sambrook等(1989)；Cell Biology，ALaboratory Handbook，Celis(1994)；Bahnson等，J.of Virol.Methods，54：131-143(1995)；Culture of Animal Cells，A Manualof Basic Techniques.Freshney(1994)；Rigg等，Virology 218：290-295。
[0081]如本文所用，单数形式的“一”、  “一个”以及“该”包含复数援引，除非上下文另行明确指出。例如，援引“载体颗粒”将包含复数个的载体颗粒。
[0082]术语“构建体”在质粒上下文中通常是指DNA序列，但在同一个质粒上可提供多个构建体。
[0083]术语“基因”和“编码序列”在文中互换使用，并且指编码蛋白的“开放读框”。
[0084]术语“缺陷型”在文中是指与野生型相比在生物活性、编码或表达其基因产物或作为顺式作用核酸序列方面没有功能或具有下降的功能的病毒载体或核酸序列。以非限制性的实例举例说明：缺陷型env基因序列将不会编码ENV蛋白；缺陷型包装信号将不会与天然包装信号以相同的效率促进该缺陷型信号所定位的核酸分子的包装；而复制“缺陷型”慢病毒颗粒在进入宿主细胞后将不能够复制和产生新的传染性病毒颗粒。所述核酸序列可通过本领域公知的任何方法制备，包含缺失某些或全部序列、使序列置于框外、或以其它方式封闭序列。
[0085]如本文所用，术语“缺失掉”或“缺失”是指特定片段的整体缺失，或者特定片段中按照标准用法足以使该片段无效或无功能的部分缺失。如本文所用的术语“复制缺陷型”是指编码BIV结构蛋白的构建体在生产者或包装细胞中不能被核衣壳包裹或者以可忽略的水平被核衣壳包裹。所得的慢病毒颗粒是复制缺陷型的，是因为包装的载体不包含核衣壳化所需的所有病毒结构蛋白，至少一个所需的结构蛋白从中缺失掉，从而包装的载体不能够复制全部的病毒基因组。
[0086]如本文所用的短语“必需基因”或“BIV必需基因”是指编码BIV基因组核衣壳化(如包装)所需的蛋白以产生传染性慢病毒颗粒的基因，并且包含gag、pol、env和rev，载体基因组RNA反转录为原病毒DNA以及原病毒DNA整合到靶细胞基因组中所需的顺式作用元件(如BIV LTR)。
[0087]“表达构建体”是指包含一个或多个基因的DNA片段，或者包含在该DNA片段上的基因的一部分，其中基因或基因的一部分可包含启动子和增强子区的组合，包含本领域公知的编码的蛋白或核酸转录和翻译的所有附属区、编码蛋白的开放读框、顺式作用调控元件等。另外，此类构建体可含有复制起点，从而整个构建体可在宿主细胞中复制。
本发明的构建体在一个或多个DNA构建体中提供。在优选的实施方案中，
本发明的每一个构建体都在不同的DNA分子上提供。
[0088]“病毒表面蛋白基因构建体”是指编码和表达病毒表面蛋白基因的DNA片段。
[0089]如本文所用的术语“核酸序列”或“基因序列”旨在指核酸分子(优选DNA或RNA)。此类核苷酸序列可源自于许多来源，包含基因组DNA、cDNA、合成DNA、原病毒DNA、病毒RNA、mRNA、合成RNA或其组合。此类基因序列可包含基因组DNA，它可能或可能不包含天然存在的内含子。而且，此类基因DNA可与启动子序列或多聚腺苷酰化序列一起获得。基因组或cDNA可以本领域普通技术人员熟知的许多方法获得。例如，基因组DNA可通过本领域熟知的方法从合适的细胞中提取和纯化。或者，可从细胞中分离mRNA，并通过反转录或其它方法用于制备cDNA。
[0090]术语“可操作地连接于”用来描述基因序列和启动子或其它调控或加工序列之间的链接，从而所述基因序列的转录由可操作连接的启动子序列指导，所述基因序列的翻译由可操作连接的翻译调控序列指导，和/或所述基因序列的翻译后加工由可操作连接的加工序列指导。非限制性的实例包含ATG起始密码子、输出多肽的前导序列、核糖体结合位点等。例如，可操作地连接于基因的启动子将维系该基因在宿主细胞中的表达。如果基因序列不含其自身的启动子和ATG起始密码子，就像BIV pol基因序列的情况一样，这些附属序列可利用本领域熟知的技术提供。
[0091]术语“同一的”或“同一性”百分比在两个或多个核酸或蛋白序列的上下文中是指，当比较和比对最大一致性时，通过使用文中所述的序列比较算法之一如Smith-Waterman算法或通过视觉观察判断，两个或多个序列或亚序列是相同的，或者特定百分比的氨基酸残基或核苷酸是相同的。对于序列比较，典型地是一个序列作为参照序列，测试序列与之进行比较。当使用序列比较算法时，将测试和参照序列输入计算机，如有必要设计亚序列坐标，并设计序列算法程序参数。序列比较算法进而根据设计的程序参数，计算测试序列相对于参照序列的序列同一性百分比。
[0092]例如，用于比较的最佳序列比对可通过Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.2：482(1981)的局部同源性算法、通过Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48：443(1970)的同源性对比算法、通过Pearson和Lipman，Proc.Nat′1.Acad.Sci.USA 85：2444(1988)查找相似性的方法、通过这些算法的计算机化执行(Wisconsin遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，Wis.)、通过BLAST算法，Altschul等，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)，其软件公众可通过国家生物技术信息中心(http：//www.ncbi.nlm.n ih.gov/)获得，或者通过视觉观察(大致参见Ausubel等，下文)进行。对于本发明的目的，用于比较的最佳序列比对最优选通过Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.2：482(1981)的局部同源性算法进行。
[0093]在本发明的上下文中，术语“分离的”是指通过人工远离其天然环境存在因而不是天然产物的核酸分子、多肽、病毒或细胞。分离的核酸分子或多肽可以纯化的形式存在，或可存在于非天然环境中例如象重组宿主细胞中。分离的病毒或细胞可以纯化的形式存在，例如在细胞培养物中，或者可存在于非天然环境中例如重组或异种生物体中。
[0094]术语“天然的”是指存在于野生型病毒或细胞基因组中的基因。
[0095]术语“天然存在的”或“野生型”用来描述能够在自然中见到的与人工制备的截然不同的物质。例如，存在于生物体(包含病毒)中的蛋白或核苷酸序列，其可以从自然来源分离，并且未在实验室中被人为地故意修饰，是天然存在的。
[0096]谈及特定核酸序列的术语“基本上包含”是指该特定序列在5’或3’端或两端可具有多达20个附加残基，其中附加残基实质上不影响所述序列基本的和新的特征。
[0097]本发明的启动子序列可包含真核或原核起源的启动子，并且将足以指导位于远端的序列(即连接该启动子3’端的序列)在细胞中的转录。启动子区也可以包含增强或阻遏转录的控制元件。合适的启动子有巨细胞病毒即早期启动子(pCMV)、劳斯肉瘤病毒长末端重复启动子(pRSV)、以及SP6、T3或T7启动子。任选地，启动子上游的增强子序列或编码区下游的终止子序列可包含在本发明的载体中以促进表达。本发明的载体也可以包含附加的核酸序列，例如多聚腺苷酰化序列，并且可编码定位序列或信号序列，足以使细胞快速和有效地加工由载体核酸表达的蛋白。优选的多聚腺苷酰化序列的实例是SV40早区多聚腺苷酰化位点(C.V.Hall等，J Molec.App.Genet.2，101(1983))和SV40晚区多聚腺苷酰化位点(S.Carswell和J.C.Alwine，Mol.Cell Biol.9，4248(1989))。如果期望转录，则将此类附加序列插入到载体中，从而它们可操作地与启动子序列连接，或者如果期望翻译和加工，则额外具有起始和加工序列。或者，插入序列可放置在载体的任何位置上。
[0098]术语“包装构建体”有时也称之为“辅助者构建体”，是指DNA序列，通常存在于质粒上，但其可以掺入到生产者细胞的基因组中，它能够指导反式提供的一个或多个慢病毒必需基因表达为获得慢病毒载体颗粒所必需的蛋白。
[0099]如本发明中所用的“包装信号”或“包装信号序列”是指将病毒载体RNA有效包装为传染性病毒粒子所必需的病毒RNA(或DNA)。
[00100]“重新编码的”基因是指以此种方式改变的基因(单个或数个)，即核酸编码的多肽仍与未变的序列相同，但编码该多肽的核酸序列改变了。本领域熟知由于遗传密码的简并性，存在可编码相同氨基酸翻译产物的多个DNA和RNA密码子。例如，在一个实施方案中，编码BIV gag和/或pol基因的DNA序列被“重新编码”，从而核苷酸序列被改变，但GAG和POL多肽的氨基酸翻译序列仍与野生型氨基酸序列完全相同。此外，也公知不同的生物体具有使用特定密码子合成氨基酸的不同的偏好。
[00101]术语“载体”是指当编码病毒载体构建体序列的RNA包装到病毒载体颗粒中时获得的重组复制缺陷型慢病毒载体。因而，重组慢病毒载体既指颗粒又指其中所含的RNA。
[00102]“载体构建体”是指DNA序列，通常是在质粒的上下文中，编码将产生能够包装到传染性病毒载体颗粒中的RNA的序列。
[00103]一般而言，慢病毒共有复制循环的基本特征，包含将病毒RNA包装到病毒载体颗粒中、侵染靶细胞、产生RNA基因组的DNA原病毒拷贝、将DNA运输到宿主细胞核中、将原病毒DNA整合到靶细胞染色体中、由整合的DNA转录病毒mRNA、表达gag、pol和env基因、以及将RNA病毒转录物包装到从宿主细胞中释放的成熟病毒颗粒中。慢病毒基因组的长末端重复(LTR)含有对于反转录、病毒DNA整合和转录以及腺苷酰化重要的顺式作用序列，并且一个或多个这些元件可掺入到本发明的构建体中。优选地，本发明的载体构建体包含与LTR 5’端足够数目的核苷酸相应的核苷酸以产生功能性LTR，它能够指导载体RNA反转录为原病毒DNA，并将原病毒DNA整合到靶细胞基因组中。所述构建体也可以包含3′LTR区并且包含U3区、R区以及任选地U5区。
[00104]gag基因是慢病毒基因组中最5′端的基因，并且编码形成成熟病毒颗粒的结构蛋白。所述gag基因被翻译产生前体多肽，其随后被切割产生3到5个结构蛋白。
[00105]pol基因编码酶，参与切割慢病毒聚蛋白产物、反转录病毒RNA和整合原病毒DNA进入宿主染色体。
[00106]env基因编码包膜蛋白，其包含BIV和逆转录病毒的病毒表面蛋白。如本公开文本中所用的，env基因不仅包含天然env基因序列，而且包含env基因的修饰(包含改变逆转录病毒和慢病毒靶特异性的修饰)，或者包含用于产生假型逆转录病毒/慢病毒的env基因(如参见WO 92/14829)。一般而言，术语“包膜表面蛋白基因”和“env基因”意味着具有相同的含义，除非另行具体指出。env基因可来源于任何病毒，包含逆转录病毒。env优选允许转导人类或其它物种的细胞。可能期望通过用抗体或靶向受体或特定细胞类型的特定配体连接包膜蛋白以靶向所述重组病毒。在这样的实施方案中，与包膜蛋白组合的抗体或配体都将包含病毒表面蛋白基因。优选地，配体是在遗传上掺入到ENV蛋白中的肽序列。例如，载体可通过插入糖脂、蛋白或肽而变成靶特异性的。此外，靶向可通过利用抗体或重组抗体类分子如单链抗体的抗原结合部分实现，以靶向慢病毒载体。此外，载体趋向性或特异性靶向可通过载体包膜蛋白的特异性修饰完成，例如向包膜中插入配体(如硫酸肝素蛋白聚糖结合基序)。包膜包含但不限于VSV-G包膜、LCMV包膜(Beyer等，J Virol.，1；76(3)：1488-95)、突变VSV-G包膜或突变体LCMV包膜。在另一个实施方案中，配体可在亲嗜性包膜蛋白上表达，它将作为支架展示所述配体。在优选的实施方案中，亲嗜性包膜被修饰以提高载体稳定性(PCT申请PCT/USO 1/2903 6(WO 02/22663))。本领域技术人员将会知晓，或者无需过度实验能够容易地确定实现向特定靶递送慢病毒载体的特定方法。
[00107]BIV的基本基因组组织在Garvey等(Virology，175：391-409，1990)和美国专利5,380,830中公开。BIV克隆127的原病毒LTR长度为589个核苷酸，并且由U3、R和U5元件组成(见美国专利5,380,830)。根据本文提供的以及来自保藏中心和数据库的公开内容如美国典型培养物保藏中心(ATCC)，例如ATCC保藏号68092和ATCC保藏号68093以及GENBANK，适用于制备载体构建体的编码BIV的序列以及含慢病毒基因组的质粒可容易地获得。
[00108]如本发明中所用的“最小包装信号”是指含有效包装病毒载体RNA必需的所有序列，而同时消除了有效包装非必需的多数核苷酸的包装信号。以这种方式，有可能最小化包装信号和存在于慢病毒基因转移系统的重组构建体中的其它病毒基因或核酸片段之间的同源性。BIV的最小包装信号示于SEQ ID NO：39，它含非翻译区(在5’LTR和gag起始密码子以及gag编码序列的头101个核苷酸之间)。本领域技术人员将会容易地意识到有可能进一步缺失核苷酸而同时能够有效包装病毒载体RNA。
[00109]文中报道了另外的BIV核酸序列，包含最小BIV RRE，位于gag和pol基因之间的核糖体移码位点，以及重新编码的gag和pol序列，其保障了本发明的包装构建体和载体构建体之间减小的同源性。
[00110]“RRE”或“RRE序列”是指与rev基因产物相互作用以促进病毒RNA从侵染细胞的细胞核中输出的核酸序列。“最小RRE”或“最小RRE序列”是指包含从宿主细胞核中有效输出含RRE的RNA必需的所有序列，而同时消除了有效RNA输出非必需的多数核苷酸的RRE。以这种方式，有可能最小化RRE和存在于慢病毒基因转移系统的重组构建体中的其它病毒基因或核酸片段之间的同源性。本领域技术人员将会容易地意识到有可能进一步缺失而仍然保留RRE功能。BIV的最小RRE描述在SEQ ID NO：40中。
[00111]以前已经描述过在不同的DNA片段上包含多种BIV基因组组分的一、二和三构建体系统。如参见WO 01/44458。这些系统包含利用BIV gag和pol基因的包装构建体，编码病毒表面蛋白基因的env构建体，以及具有BIV包装信号的载体构建体，以将目的异源序列包装到重组慢病毒粒子中。以前描述的包装BIV RNA必需的包装信号据报道跨越BIV gag基因的头200个碱基对。以前描述的三组分系统包含BIV载体构建体，含包装序列和转基因(或异源目的基因)，BIV包装构建体，含来自BIV的gag和pol基因，以及env构建体，含编码病毒表面蛋白的基因。
[00112]本发明提供了三组分慢病毒基因转移系统，包含(i)包装构建体，含BIV gag和BIV pol基因，(ii)病毒表面蛋白基因构建体，含病毒表面蛋白基因；和(iii)转移载体构建体，含异源目的基因和BIV包装信号以及位于所述构建体之一上的rev基因。
[00113]本发明也提供了四组分慢病毒基因转移系统，包含(i)包装构建体，含BIV gag和BIV pol基因，(ii)病毒表面蛋白基因构建体，含病毒表面蛋白基因，(iii)转移载体构建体，含异源目的基因和BIV包装信号，和(iv)包含rev基因的rev表达构建体。
[00114]本发明进一步提供了五组分慢病毒基因转移系统，包含第一包装构建体，含BIV gag基因，第二包装构建体，含BIV pol基因，病毒表面蛋白基因构建体，含病毒表面蛋白基因，转移载体构建体，含异源目的基因和BIV包装信号，以及rev基因构建体。
[00115]本发明的转移载体构建体也提供了功能性基因转移载体必需的顺式作用病毒序列。此类序列包含包装序列(Ψ)、反转录信号、引物结合位点、整合信号以及多聚腺苷酰化序列。转移载体构建体也可以包含将目的异源序列转移到分裂或非分裂细胞中的克隆位点。在优选的实施方案中，具有BIV包装信号和异源目的基因的转移载体构建体按5′到3′次序包含：可操作地连接于R区的启动子、U5区、UTR区、BIV包装信号、RRE、可操作地连接于异源目的基因的启动子、3′聚嘌呤带、U3区、第二R区以及任选地第二U5区。
[00116]转移载体构建体中的异源核酸序列可操作地连接于调控核酸序列。如本文所用，术语“异源基因”或“异源核酸序列”是指起源于外来物种的序列，或者如果来自于同一物种，则它在其核苷酸或氨基酸序列或表达水平上例如由其原始形式被充分修饰。该术语也涵盖无变化的核酸序列，其正常地不在细胞中表达，或者以不同于作为异源基因存在时的表达水平的水平表达。优选地，异源序列是可操作地连接于启动子的开放读框，形成嵌合基因。异源核酸序列优选处于病毒LTR启动子-增强子信号或内部启动子的调控之下，并且慢病毒LTR内保留的信号仍然能够使载体有效地整合到宿主细胞基因组中。
[00117]广范围的启动子可用于表达目的异源序列，包含病毒或哺乳动物启动子。细胞或组织特异性启动子可用于靶向基因序列在特定细胞群中的表达。本发明合适的哺乳动物和病毒启动子是可获得的并且是本领域熟知的。
[00118]另一个实施方案利用诱导型启动子。可控型启动子系统的一个实例是的Tet-On TM和Tet-Off TM系统，目前可由Clontech(PaloAlto，CA)获得。该启动子系统允许四环素或四环素衍生物如强力霉素控制转基因可调控的表达。该系统可用于控制本发明中异源目的基因的表达。其它调控型启动子系统描述在PCT/EP01/08190(WO 02/06463)和PCT/EP00/10430(WO 01/30843)中。
[00119]本发明的基因转移系统的另一个构建体是含BIV gag和pol基因的包装构建体。BIV gag和pol基因处于不同的读框中，并彼此重叠。在本发明的一个实施方案中，基因转移系统包含两个包装构建体，一个包含gag基因，而一个包含pol基因。当gag和pol基因在不同的构建体上提供时，蛋白酶由pol基因编码。
[00120]BIV rev基因由两个外显子构成。第一个位于靠近中心区的3′端，并与5′端的env基因重叠。第二个rev外显子见于env的3′端，但处于不同的读框中。REV蛋白运输含内含子的病毒mRNA到胞浆中，包含编码GAG和POL以及病毒粒子包装信号的全长RNA，无需剪接。REV蛋白通过与称之为“Rev应答元件”或RRE的病毒基因组顺式作用序列相互作用行使功能。
[00121]期望本发明的基因转移系统中的BIV转移载体构建体包含5′序列，包含可操作地连接于含R、U5、以及包装序列的DNA片段的启动子、BIV RRE序列、可操作地连接于另一启动子的异源目的基因、以及BIV 3′LTR。在优选的实施方案中，包装序列是BIV包装序列。在另一个优选的实施方案中，BIV包装序列是最小包装序列或“最小包装信号”。
[00122]可利用从任何BIV株系或克隆中获得的BIV基因组核酸片段构建本发明的构建体。应当理解对于BIV基因组核苷酸序列，不改变疾病病理生理学的天然变体可存在于BIV病毒之间。这些变体可导致一个或多个核苷酸的缺失、取代、插入、置换或添加，只要基因(单个或多个)的功能不丧失。编码此类变体的DNA序列可通过标准克隆方法产生。类似地，熟练技术人员应当理解本发明的核苷酸和氨基酸序列可容易地改变而不改变相应核酸或多肽的功能，或者说不偏离本发明的范围。
[00123]在以前描述的BIV病毒载体中，所有或部分BIV gag基因被掺入到包含BIV包装序列的DNA片段中，它是在转移载体构建体上提供的。BIV gag基因大约为1,431个核苷酸(Garvey等，Virology，175：391-409，1990)。期望的安全和有效的复制缺陷型重组慢病毒载体系统的目的特征将最小化包装构建体和转移载体构建体之间的同源性。通过最小化构建体之间的同源性，同源重组的发生率将被降低，从而降低不促进包装和输出转移载体必需的程度上包含gag基因的5′部分。优选地，最小BIV包装序列将含有多于头54bp的gag基因和少于头200bp的gag基因。更优选地，最小BIV包装序列将含有多于头75bp的gag基因序列且优选多于头90bp但少于头150bp，优选小于头125bp的gag基因序列。更优选地，BIV包装序列将只含有头101bp的gag基因序列。在优选的实施方案中，作为包装序列一部分的gag基因片段中ATG起始密码子被突变，以防止由含所述最小包装序列的DNA构建体或任何所得的重组体蛋白合成GAG多肽。
[00124]在一个实施方案中，转移载体构建体以及任选地包装构建体编码最小BIV RRE。所述最小BIV RRE具有SEQ ID NO：40所示的核苷酸序列。
[00125]在一个实施方案中，本发明的转移载体构建体将包含中心聚嘌呤带(cPPT)。cPPT可来自BIV或另一种慢病毒，包含例如HIV的cPPT。在尤其优选的实施方案中，载体构建体的U3元件中的一个或多个序列被突变或缺失，以降低或完全消除U3介导的任何下游基因的转录。该实施方案从而提供了自身失活(SIN)载体构建体(Yu等，PNAS 83(10)：3194-3198(1986))。在这样的实施方案中，异源目的基因可操作地连接于内部启动子，并且优选U3元件额外包含增强多聚腺苷酰化的序列。在一个特别的实施方案中，利用增强子元件上游的SV40晚期多聚腺苷酰化信号的多聚腺苷酰化序列。
[00126]在一个实施方案中，rev和RRE分别包含来自BIV的rev和RRE序列。在其它实施方案中，本发明的基因转移系统可包含来自除BIV以外的慢病毒的rev和RRE片段，只要RRE和REV能够彼此互补，促进病毒RNA从宿主细胞核的运输。在一个这样的实施方案中，REV和RRE均来自于HIV。在优选的实施方案中，REV和RRE均来自于BIV。
[00127]本发明的基因转移系统的第二构建体是病毒表面蛋白基因构建体。在优选的实施方案中，病毒表面蛋白基因是env基因。在一个实施方案中，env基因编码淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)包膜或突变的LCMV包膜。优选的LCMV包膜是来自LCMV-GP(WE-HPI)株的包膜(Beyer等，J Virol.，1；76(3)：1488-95)。在尤其优选的实施方案中，env基因编码VSV-G包膜。例如参见Burns等，Proc.Natl.Acad.Sci.90：8033-8037(1993)，Yee等，Proc.Natl.Acad.Sci.91：9563-9568(1994)以及Yee等的美国专利No.5,817,491。尽管由于VSV-G赋予重组病毒广泛的宿主范围，VSV-G蛋白是期望的env基因，但是VSV-G对生产者或包装细胞有害。因而，当使用例如VSV-G的基因时，优选使用诱导型启动子系统，从而可调控VSV-G的表达以在无需表达VSV-G时使对生产者或包装细胞的毒性降至最小化。例如，可使用Gossen和Bujard(Proc.Natl.Acad.Sci.(1992)89：5547-5551)的四环素调控型基因表达系统以提供VSV-G的诱导型表达。所述tet/VP16翻译激活剂可存在于第一载体上，而VSV-G编码序列可克隆到另一载体中受tet操纵子控制的启动子的下游。
[00128]可用于实施本发明的env基因的非限制性实例包含VSV-Genv、MoMLV env、长臂猿白血病病毒(如GaLV)env以及Phabdoviridae科(如狂犬病毒、莫科拉病毒和恐水病病毒)的env基因、甲病毒属(如罗斯河病毒、辛德毕斯病毒)、副粘病毒属(如仙台病毒)、黄热病病毒属(如埃博拉病毒、马尔堡病毒)、逆转录病毒属(如MLV、10A1、Xeno)、沙粒病毒属(如LCMV或LCMV Env突变体)、索戈托病毒、杆状病毒属和副流感病毒的env基因。尤其优选的env来自LCMV-GP(WE-HPI)株(Beyer等，J Virol.，1：76(3)：1488-95(2002))或VSVG。
[00129]在本发明的另一方面，提供了稳定的包装细胞系，包含包装构建体、包膜构建体以及任选地本发明的rev基因构建体。尤其优选的包装细胞系是此类细胞系，其能够稳定的表达至少10ng/ml的BIV反转录酶(RT)蛋白。由于包装细胞系缺少编码包装信号和其它顺式作用元件的慢病毒核酸，没有载体构建体就不能产生传染性载体。包装细胞系的构建体可以是游离的或者整合到细胞染色体中。
[00130]一般地，本发明的细胞系包含多种不同的构建体，它们提供了包装重组载体所需的全部功能，例如gag、pol、env和rev，如上文所讨论的那样。对于所用的构建体的数目没有限制，只要它们能够用来转化并产生包装细胞系，以便在细胞中也存在载体构建体时，产生重组复制缺陷型慢病毒颗粒。
[00131]多种构建体通过转染或侵染引入到包装细胞系中。包装细胞系产生含载体基因组的病毒颗粒。转染或侵染的方法是本领域技术人员熟知的。因而，包装构建体可通过例如磷酸钙转染、脂转染或电穿孔，通常连同显性选择标记如neo、DHFR、Gln合酶或ADA一起引入到人类细胞系中，继之以在合适的药物存在下选择和分离克隆。
[00132]包装细胞用转移载体构建体转染以制备生产者细胞。培养生产者细胞，并且它产生大量本发明的重组复制缺陷型慢病毒载体颗粒。所述载体用于侵染期望的靶细胞，由此将异源目的基因转移到靶细胞中。
[00133]在优选的实施方案中，本发明的生产者细胞系进一步的特征在于能够产生至少105转导单位/ml的慢病毒载体滴度。合适的宿主细胞系可包含例如293细胞、293T细胞、COS细胞、HeLa细胞、Cf2TH细胞等。
[00134]慢病毒载体颗粒可由本发明的稳定的生产者细胞系获得。产生慢病毒载体颗粒的方法包含用慢病毒载体构建体转染本发明的稳定包装细胞系、分离并在合适的培养基中繁殖所述生产者细胞、并由培养基中获得慢病毒载体颗粒制备物的步骤。
[00135]本发明从而进一步提供了通过收集用本发明的基因转移系统转染的细胞上清获得的重组慢病毒载体贮备库。
[00136]本发明基于BIV的重组慢病毒载体可单独使用或者联合使用以转导几乎任何宿主细胞或细胞系。许多靶细胞，包含细胞系和人类及非人来源的原代细胞，可由本发明的重组载体在体外或体内侵染。本发明的载体尤其可用于侵染非分裂原代人类细胞如造血细胞，例如包含干细胞、红细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞、血小板、肥大细胞、嗜曙红细胞、嗜碱细胞以及B和T淋巴细胞。
[00137]在一个实施方案中，本发明提供了能够侵染分裂和非分裂细胞的重组慢病毒载体。所述重组慢病毒包含BIV GAG蛋白、BIV POL蛋白、病毒ENV蛋白、可操作地连接于调控核酸序列的异源核酸序列以及包装、反转录和整合所必需的顺式作用LTR核酸序列，其中包装信号来自BIV。本发明的重组慢病毒能够侵染分裂细胞以及非分裂细胞。
[00138]本发明的重组慢病毒因此在遗传上如此修饰，从而天然病毒的某些结构、调控基因已被除去，并替换为待递送到靶细胞中的核酸序列。在由病毒载体颗粒侵染细胞后，病毒载体颗粒释放其核酸进入细胞，慢病毒载体构建体被反转录，然后整合到宿主细胞基因组中。转移的慢病毒遗传物质接着在宿主细胞内被转录并翻译为蛋白。
[00139]本发明通过用如上所述的三、四或五DNA构建体系统转染合适的宿主细胞并回收重组病毒，提供了产生能够侵染分裂或非分裂细胞的重组慢病毒的方法。一般地，基因在宿主真核细胞中表达，从中回收成熟重组病毒颗粒或载体。
[00140]一般地，利用标准技术收集病毒上清，例如在合适的时间点过滤上清。收集由转染细胞产生的病毒粒子的方法描述在Riggs(Virology 218：290-295)中。载体制备物可随后利用本领域公知的技术在体外或在体内用于侵染靶细胞。
[00141]本发明的基因转移系统可用于提供向分裂或非分裂细胞转移核酸的方法，以提供特定核酸序列的表达。因此，在另一个实施方案中，本发明通过用本发明的重组病毒载体颗粒侵染非分裂细胞、并在非分裂细胞中表达异源核酸序列，提供了在非分裂细胞中引入和表达异源核酸序列的方法。
[00142]通称为转基因的广泛种类的核苷酸序列可作为异源目的基因由本发明基于BIV的转移载体构建体携带。所述核苷酸序列应当具有足够的大小以允许产生病毒颗粒或载体。优选地，基于BIV的转移载体构建体的大小在1KB到10KB之间。此类转基因的非详尽性的列表包含编码蛋白、抗原、核酶、反义序列、RNAi(Clin Exp Pharmacol Physiol30(1-2)：96-102，2003)、剪接体介导的RNA反式剪接(Nat Biotechnol17(3)：246，1999；J Invest Dermatol 115(2)：332，2000)、寡核苷酸等的序列。
[00143]任选地，选择标记基因可与转基因一起存在。标记基因被用来测定载体的存在从而确认侵染和整合。标记基因也可用于选择已被载体转导的细胞。选择标记基因的存在确保仅仅那些含载体构建体的宿主细胞生长。典型的选择基因编码赋予对抗生素和其它毒性物质例如组氨醇、嘌呤霉素、潮霉素、新霉素、氨甲喋呤等抗性的蛋白。文中某些举例说明性的实例利用β-半乳糖苷酶、萤光素酶或增强型绿色荧光蛋白(eGFP)报告基因或标记系统。
[00144]反义核酸是与至少部分特定的mRNA分子互补的DNA或RNA分子(Weintraub，Scientific American，262：40，1990)。在细胞中，反义核酸与相应的mRNA杂交，形成双链分子。反义核酸干扰mRNA的翻译，因为细胞不会翻译呈双链的mRNA。利用反义方法抑制基因的体外翻译是本领域熟知的(如Marcus-Sakura，Anal.Biochem.，172：289，1988)。反义核酸可用于封闭突变蛋白或显性活性基因产物的表达，例如在阿尔茨海默氏病中累积的淀粉状蛋白前体蛋白。此类方法也可用于治疗Huntington′s病、遗传性帕金森病及其它疾病。反义核酸也可用于抑制与毒性相关的蛋白的表达。
[00145]利用寡核苷酸停止转录公知为三螺旋体策略，因为寡聚体缠绕双螺旋DNA，形成三链螺旋。因此，可设计这些三螺旋体化合物识别选定基因上的独特位点(Maher等，Antisense Res.and Dev.，1(3)：227，1991；Helene，C.，Anticancer Drug Design，6(6)：569，1991)。
[00146]核酶是具有以类似于DNA限制性内切酶的方式特异性切割其它单链RNA的能力的RNA分子。通过修饰编码这些RNA的核苷酸序列，有可能设计分子识别RNA分子中的特定核苷酸序列并对其切割(Cech，J.Amer.Med.Assn.，260：3030，1988)。该方法的主要优势在于，因为它们是序列特异性的，所以只有具有特定序列的mRNA被失活。
[00147]也可能需要转移表达具有抗血管生成效应的产物的核酸序列。此类化合物和编码其的基因是公知的并且以前已有描述。血管生成可通过抑制分子例如α-干扰素、凝血栓蛋白-1、血管他丁(angiostatin)、内皮他丁(endotatin)。另外，已发现某些比天然存在的更短的色氨酰-tRNA合成酶来源的多肽，在抑制血管生成中有活性，尤其是眼部新血管形成中(Otani等，PNAS 99(1)：178-183(January 2002)；Wakasugi等，PNAS 99(1)：173-177(January 2002))。其它可用于本发明的抗血管生成基因包含但不限于METH-1、METH-2、TrpRS片段、增殖蛋白相关蛋白、催乳素片段、PEDF、血管抑制素(vasostatin)、多种胞外基质蛋白片段以及生长因子/细胞因子抑制剂。多种胞外基质蛋白片段包含但不限于血管他丁、内皮他丁、激肽抑制素(kininostatin)、纤维蛋白原-E片段、凝血栓蛋白、肿瘤抑制素(tumstatin)、canstatin和restin。生长因子/细胞因子抑制剂包含但不限于VEGF/VEGFR拮抗剂、可溶性VEGF受体、sFlt-1、sFlk、sNRP1、血管生成素(angiopoietin)/tie拮抗剂、sTie-2、趋化因子(IP-10、PF-4、Gro-β、IFN-γ(Mig)、IFNα、FGF/FGFR拮抗剂(sFGFR)、Ephrin/Eph拮抗剂(sEphB4和sephrinB2)、PDGF、TGFβ和IGF-1。通过本发明的重组慢病毒载体递送此类肽或蛋白将可用于调节与眼疾相关的新血管形成的生长和增殖，例如老年性黄斑变性、糖尿病眼并发症、红变青光眼、糖尿病增殖性视网膜病、糖尿病增殖性视网膜病、未成熟儿视网膜病变、角膜炎、局部缺血性视网膜病等。介由本发明的重组慢病毒载体通过向肿瘤递送抗血管生成因子，有可能抑制新血管生成及与之相关的病理学效应。此类抑制肽的实例可见于PCT申请号PCT/US02/05185(WO02/067970)和PCT/US02/23868中，特此全文并入作为参考。
[00148]具有Eph B受体或ephrin B配体的某些或全部氨基酸序列的可溶性肽也是有效的血管生成抑制剂，如递交于2001年9月28日的PCT申请PCT/EP01/11252(WO 02/26827)所证明的那样，特此全文并入作为参考。从而，本发明将可用于向动物尤其是人类递送编码且能够表达此类肽的核酸。此类肽已对肿瘤细胞表现出抗血管生成和抗肿瘤效应。
[00149]转基因也可以包含编码生物应答调节剂的核酸。包含在此范畴之内的是免疫增效剂，包含编码许多归类为“白介素”细胞因子的核酸。同样包含在此范畴之内的，尽管未必根据相同的机制运转，是干扰素，并且尤其是γ干扰素(γ-IFN)、肿瘤坏死因子(TNF)以及粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。可能期望向骨髓细胞或巨噬细胞递送此类核酸以治疗酶不足或免疫缺陷。也可将编码生长因子、毒性肽、配体、受体或其它生理学上重要的蛋白的核酸引入到特定细胞中。例如，本发明的载体可用于修饰宿主免疫应答，例如在同种异体骨髓移植后发生的移植物抗宿主疾病中。
[00150]被用本发明的慢病毒载体侵染的宿主细胞和动物可进一步用诸如生长因子、神经节苷脂、抗生素、神经递质、神经激素、毒素、神经突促进分子和抗代谢物以及这些分子的前体如多巴胺前体L-DOPA的药物治疗。
[00151]此外，存在许多其中缺陷基因可替换的遗传性神经疾病，包含：例如，溶酶体贮存病例如那些涉及β-氨基己糖苷酶或葡糖脑苷脂酶的疾病；次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶活性不足(“Lesch-Nyhan综合症”)；淀粉状蛋白多发性神经病(-前白蛋白)；Duchenne′s肌肉萎缩症以及成例如视网膜细胞瘤。在另一实施方案中，本发明提供了治疗眼疾的方法。这些疾病包含但不限于原发性开角型青光眼(POAG)、增殖性玻璃体视网膜病、涉及光感受器累积性退行性变和最终死亡的疾病以及由眼新血管形成导致的疾病。可用本发明的方法治疗的眼疾包含例如湿性AMD(老年性黄斑变性)、糖尿病增殖性视网膜病、糖尿病性黄斑水肿、由糖尿病性视网膜病导致的新血管形成、非糖尿病性视网膜病、分支静脉阻塞、视网膜中央静脉阻塞、未成熟婴儿视网膜病变、虹膜红变、新生血管性青光眼、凹周围毛细血管扩张、镰状细胞视网膜病、Eale′s病、视网膜血管炎、Von Hippel Lindau病、放射性视网膜病变、视网膜冷冻损伤、视网膜色素变性、视网膜脉络膜缺损、因单纯疱疹病毒性角膜炎所致的角膜新血管形成、角膜溃疡、角膜移植术、pterigyia或创伤。治疗眼疾(包含上文所指出的那些眼疾)的方法，包含向个体施用表达一个或多个编码选自抗血管生成基因、视杆细胞源的视锥生存因子(Rod-derived Cone Viability Factor)(RdCVF)、抗-细胞凋亡基因、视神经碱(optineurin)基因以及小梁网蛋白基因(TIGR)的基因的BIV视神经碱(optineurin)基因以及小梁网蛋白基因(TIGR)的基因的BIV转移载体。载体优选通过直接眼内注射递送到眼中。向眼中注射的方法是本领域熟知的。这些方法包含但不限于注射到眼前房或后房，例如注射到水状液或玻璃体液。或者，注射可以是视网膜下的，例如通过在视网膜后面注射小份(例如每小份1到10μl)含载体的溶液，之后溶液被吸收，并且传染性载体颗粒侵染眼组织的局部细胞。此类给药可包含同一天给药的单次注射、多次注射，为期数周或数月给药的单次注射，或者为期数周或数月给药的多次注射。
[00152]已发现视杆细胞源的视锥生存因子(RdCVF)是的视锥保护性因子(PCT申请PCT/EP02/03810(WO 02/081513))。在优选的实施方案中，本发明的BIV载体含至少一个编码如SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：65或SEQ ID NO：67中所编码的RdCVF多肽的核酸序列。从而，在另一个实施方案中，本发明提供了通过利用本发明的BIV载体系统向细胞中转移RdCVF基因而在体外或在体内展示视锥保护效应的方法。在优选的实施方案中，BIV载体编码人类RdCVF1和/或RdCVF2。
[00153]表达RdCVF的BIV载体可用于治疗多种与眼相关的疾病。因而，在另一个优选的实施方案中，本发明提供了治疗患有视网膜营养不良的人的方法，例如色素性视网膜炎(retinitus pigmentosa)、老年性黄斑变性、Bardet-Biedel综合症、Bassen-kornzweig综合症、卵黄状黄斑变性、无脉络膜、回旋状萎缩、先天性黑曚(congenitalamourosis)、Refsun综合症、Stargard病和Usher综合症。
[00154]对于因蛋白产物不足引起的疾病，基因转移可将正常基因引入到患病的组织中用于替换治疗。基因递送技术也可用于产生转基因动物。
[00155]在一个实施方案中，BIV载体可用作为鉴定基因功能的工具。从而，该载体可用于在体外将表达盒转移到细胞中，以过度表达特定基因或降低特定基因的表达。通过观察与特定基因表达上调或下调相关的表型，有可能确定该基因的功能。这种信息在确定基因产物是否为药物研发的有效靶中具有极大的价值。
且包含表达核酶、反义寡核苷酸或指向待降低表达的基因的mRNA的RNAi。降低表达的另一策略可以是编码终止密码子的3′外显子序列的反式剪接。另一个替代策略是表达功能为待降低功能的蛋白的显性失活物的蛋白。
[00157]在另一实施方案中，BIV载体可用于在体内鉴定基因功能。从而，该载体可用于将表达盒转移到体内细胞中，以过度表达特定基因或降低特定基因的表达。这可通过经由直接注射到组织或体腔中向动物给药载体或通过直接向循环中给药载体而实现。备选地，载体可在体外向细胞给药，然后将细胞注射到或植入到动物中。合适的注射部位或植入装置是本领域技术人员公知的。在体内鉴定基因功能在确定基因产物是否为药物研发的有效靶中将具有极大的价值。
[00158]在另一个实施方案中，载体可用于筛选文库以克隆具有特定功能的基因。在该实施方案中，文库，有可能是cDNA文库，可由转移载体构建体编码。转移载体构建体然后可用于产生载体，而载体在体外或在体内施用于细胞。表现出期望功能的细胞将被分离。目的基因可容易地从BIV载体整合物中回收。利用整合载体进行基因克隆的方法是本领域技术人员熟知的。文中描述的技术相对于用于基因克隆的逆转录病毒载体系统具有显著的优势，因为BIV载体将会在体内有效地转导细胞，而逆转录病毒不会。
[00159]在另一个实施方案中，BIV载体可用于建立针对特定蛋白的强免疫应答。向动物给药BIV载体，尤其是经静脉内注射，导致脾脏内细胞的有效转导。在这种设置中，编码的转基因的表达可导致针对表达蛋白的强免疫应答。这种技术可用于提高用于研究、诊断或治疗目的的抗体(包含单克隆抗体)产生效率。该技术也可直接在人类中用于免疫治疗的目的。
[00160]本发明优选的载体来自于BIV。可从感染病毒的细胞中分离天然BIV核酸，并由其制备载体。例如，可利用本领域公知的方法，通过反转录由BIV RNA制备cDNA。然后可以产生双链BIV cDNA并克隆到克隆载体中，例如细菌克隆载体。可使用本领域技术人员公知和使用的任何克隆载体，例如细菌、酵母或真核载体。
[00161]包含本发明的DNA构建体的大量核酸可通过如下制或：(a)利用本领域熟知的技术在适合的宿主或转基因动物中复制或(b)化学合成。制备用于引入原核或真核宿主的构建体可包含为宿主识别的复制系统，包含编码目的多肽的所需的多核苷酸片段，并且优选也将包含转录和翻译起始调控序列，可操作地连接于所述多肽编码片段。这些可包含，例如复制起点或自主复制序列(ARS)以及表达调控序列，启动子、增强子以及必要的加工信息位点，例如核糖体结合位点、RNA剪接位点、多聚腺苷酰化位点、转录终止子序列以及mRNA稳定序列。适当的时候也可以包含分泌信号，其将允许蛋白穿越和/或嵌在细胞膜中，从而获得其功能拓扑结构，或者从细胞中分泌。此类载体可通过本领域熟知的标准重组技术制备。
[00162]根据上文，构思本发明的下列实施方案并构成部分发明。
[00163]1.重组慢病毒基因转移系统，包含：
(a)(i)包装构建体，包含DNA片段，所述DNA片段包含可操作地连接于BIV gag基因和BIV pol基因的启动子，或(ii)包含DNA片段的第一包装构建体，所述DNA片段包含可操作地连接于包含BIV gag基因的DNA片段的第一启动子；以及包含DNA片段的第二包装构建体，所述DNA片段包含可操作地连接于包含BIV pol基因的DNA片段的第二启动子；
(b)病毒表面蛋白基因构建体，包含DNA片段，所述DNA片段包含可操作地连接于病毒表面蛋白基因的启动子；
(c)转移载体构建体，包含DNA片段，所述DNA片段包含的启动子可操作地连接于第一R区、U5区、UTR区、BIV包装序列、RRE序列、可操作地连接于异源目的基因的启动子、3′聚嘌呤带、U3区以及第二R区；和
(d)(i)rev基因，位于所述包装构建体、病毒表面蛋白基因构建体及转移载体构建体之一上，或(ii)包含DNA片段的rev构建体，所述DNA片段包含可操作地连接于rev基因的启动子。
[00164]2. 1中的基因转移系统，包含含DNA片段的包装构建体，所述DNA片段包含可操作地连接于BIV gag基因和BIV pol基因的启动子。
[00165]3. 1中的基因转移系统，包含第一包装构建体，包含DNA片段，所述DNA片段包含可操作地连接于包含BIV gag基因的DNA片段的第一启动子；以及第二包装构建体，包含DNA片段，所述DNA片段包含可操作地连接于包含BIV pol基因的DNA片段的第二启动子。
[00166]4. 2中的基因转移系统，其中包装构建体进一步包含RRE序列。
[00167]5. 3中的基因转移系统，其中至少一个包装构建体进一步包含RRE序列。
[00168]6. 1中的基因转移系统，其中rev基因和RRE序列来自BIV。
[00169]7. 2中的基因转移系统，其中gag基因包含重新编码的核苷酸序列。
[00170]8. 2中的基因转移系统，其中gag和pol基因分别包含重新编码的核苷酸序列。
[00171]9. 2中的基因转移系统，其中pol基因包含重新编码的核苷酸序列。
[00172]10. 3中的基因转移系统，其中gag基因包含重新编码的核苷酸序列。
[00173]11. 3中的基因转移系统，其中pol基因包含重新编码的核苷酸序列。
[00174]12. 11中的基因转移系统，其中pol基因在5′端包含ATG起始密码子。
[00175]13. 1中的基因转移系统，其中pol基因的蛋白酶区在蛋白酶催化中心的三氨基酸基序中发生突变，且其中所述的突变蛋白酶与未突变的BIV蛋白酶相比对宿主细胞毒性较小。
[00176]14. 13中的基因转移系统，其中蛋白酶区编码蛋白酶多肽氨基酸26位上Thr到Ser的突变。
[00177]15. 1中的基因转移系统，其中BIV包装序列包含不超过BIV gag基因开放读框序列的头101个碱基对。
[00178]16. 15中的基因转移系统，其中包装序列基本上由SEQ IDNO：39的核苷酸序列组成。
[00179]17. 1中的基因转移系统，其中转移载体构建体包含DNA片段，所述DNA片段包含的启动子可操作地连接于第一R区、U5区、UTR区、BIV包装序列、RRE序列、可操作地连接于异源目的基因的启动子、3′聚嘌呤带、U3区、第二R区和第二U5区。
[00180]18. 2中的基因转移系统，其中包装构建体进一步包含rev基因。
[00181]19. 1中的基因转移系统，其中病毒表面蛋白基因构建体包含env基因。
[00182]20. 19中的基因转移系统，其中env基因选自VSV-G env、LCMV env、LCMV-GP(WE-HPI)env、MoMLV env、长臂猿白血病病毒(GaLV)env、Phabdoviridae科成员的env基因、甲病毒属env基因、副粘病毒属env基因、黄热病病毒属env基因、逆转录病毒属env基因、沙粒病毒属env基因、副流感病毒env基因、索戈托病毒env基因以及杆状病毒属env基因。
[00183]21. 1中的基因转移系统，其中病毒编码蛋白基因编码VSV-G env。
[00184]22. 1中的基因转移系统，包含位于所述包装构建体、病毒表面蛋白基因构建体及转移载体构建体之一上的rev基因。
[00185]23. 1中的基因转移系统，包含含DNA片段的rev构建体，所述DNA片段包含可操作地连接于rev基因的启动子。
[00186]24. 6中的基因转移系统，其中rev基因不包含天然BIVrev内含子。
[00187]25. 24中的基因转移系统，其中rev基因包含SEQ ID NO：10。
[00188]26. 22中的基因转移系统，包含可操作地连接于rev基因的EF-1启动子。
[00189]27. 23中的基因转移系统，其中可操作地连接于rev基因的启动子是EF-1启动子。
[00190]28. 6中的基因转移系统，其中RRE序列基本上由SEQ IDNO：40的核酸序列组成。
[00191]29. 1中的基因转移系统，其中至少两个启动子是相同的。
[00192]30. 1中的基因转移系统，其中所有的启动子都不同。
[00193]31. 1中的基因转移系统，其中至少一个启动子是调控型启动子。
[00194]32. 1中的基因转移系统，它不含cPPT。
[00195]33. 1中的基因转移系统，其中转移载体构建体进一步包含cPPT。
[00196]34. 33中的基因转移系统，其中cPPT是来自人类免疫缺陷病毒的cPPT。
[00197]35. 33中的基因转移系统，其中cPPT是BIV cPPT。
[00198]36. 35中的基因转移系统，其中cPPT基本上由与SEQ IDNO：1从碱基对4758到5293包含端点在内的核苷酸相对应的535个碱基对组成。
[00199]37. 1中的基因转移系统，其中U3区包含多聚腺苷酰化增强子。
[00200]38. 37中的基因转移系统，其中多聚腺苷酰化增强子基本上由SV40晚期多聚腺苷酰化增强子元件组成。
[00201]39. 1中的基因转移系统，它不编码BIV的vif、vpw、vpy或tat基因中至少之一。
[00202]40. 1中的基因转移系统，它不编码BIV的vif、vpw、vpy、tmx和tat基因。
[00203]41. 1中的基因转移系统，其中U3区的一个或多个核苷酸改变或缺失，从而U3介导的转录减低或消除。
[00204]42. 1中的基因转移系统，包含可操作地连接于异源目的基因的土拨鼠肝炎病毒调控应答元件。
[00205]43. 1中的基因转移系统，其中异源目的基因编码选自T2-TrpRS、Eph B受体、ephrin B配体、血纤蛋白原E片段、VEGF可溶性受体、血管他丁、内皮他丁、视神经碱、小梁网蛋白、视杆细胞源的视锥生存因子(RdCVF)以及抗-细胞凋亡基因产物的多肽。
[00206]44. 1中的基因转移系统，其中异源目的基因编码选自SEQID NO：61、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：65和SEQ ID NO：67的RdCVF多肽。
[00207]45. 生产者细胞，包含1-44中任一项的基因转移系统。
[002 08]46. 45中的生产者细胞，其中基因转移系统稳定地整合到生产者细胞的基因组中。
[00209]47. 45中的生产者细胞，其中基因转移系统短暂转染到生产者细胞中。
[00210]48. 产生复制缺陷型慢病毒载体颗粒的方法，包含：
(a)在足以允许所述细胞产生复制缺陷型慢病毒载体颗粒的细胞培养条件下，在细胞培养基中培养45中的生产者细胞；和
(b)从培养基中收集所述复制缺陷型慢病毒载体颗粒。
[00211]49. 根据48中的方法，进一步包含向培养基中添加组蛋白脱乙酰基酶抑制剂。
[00212]50. 根据49中的方法，其中组蛋白脱乙酰基酶抑制剂是丁酸。
[00213]51. 复制缺陷型慢病毒载体颗粒，由根据48中的方法产生。
[00214]52. 在具有或处于感染疾病风险的动物中治疗或预防所述疾病的方法，包含用根据51中的复制缺陷型重组慢病毒载体颗粒侵染该动物的一个或多个细胞，其中异源目的基因编码能有效治疗或预防所述疾病的治疗产物。
[00215]53. 52中的方法，其中动物是人类。
[00216]54. 52中的方法，其中一个或多个细胞是眼细胞。
[00217]55. 54中的方法，其中疾病选自眼新血管形成、湿性AMD(老年性黄斑变性)、糖尿病增殖性视网膜病、非糖尿病性视网膜病、糖尿病性黄斑水肿、视网膜分支静脉阻塞、视网膜中央静脉阻塞、未成熟婴儿视网膜病变、虹膜红变、新生血管性青光眼、凹周围毛细血管扩张、镰状细胞视网膜病、Eale′s病、视网膜血管炎、Von Hippel Lindau病、放射性视网膜病变、视网膜冷冻损伤、视网膜色素变性、视网膜脉络膜缺损、因单纯疱疹病毒性角膜炎所致的角膜新血管形成、角膜溃疡、角膜移植术、pterigyia，或创伤性视网膜营养不良、病理性衰老、色素性视网膜炎(retinitus p gmentosa)、Bardet-Biedel综合症、Bassen-kornzweig综合症、卵黄状黄斑变性、无脉络膜、回旋状萎缩、先天性黑曚(congenital amourosis)、Refsun综合症、Stargardt病和Usher综合症。
[00218]56. 55中的方法，其中治疗产物选自T2-TrpRS、Eph B受体、ephrin B配体、血纤蛋白原E片段、VEGF可溶性受体、血管他丁、内皮他丁、视神经碱(optineurin)、小梁网蛋白、视杆细胞源的视锥生存因子(RdCVF)以及抗-细胞凋亡基因产物。
[00219]57. 55中的方法，其中治疗产物是选自SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：65和SEQ ID NO：67的Rdcvf多肽。
[00220]58. 52中的方法，其中疾病选自癌症、与同种异体骨髓移植相关的移植物抗宿主病以及神经疾病。
[00221]59. 52中的方法，其中一个或多个细胞在体内侵染。
[00222]60. 52中的方法，其中一个或多个细胞在体外侵染。
[00223]61. 在体外用重组慢病毒载体颗粒转导细胞的方法，包含使细胞与根据51中的重组慢病毒载体颗粒接触，藉此细胞得以转导。
[00224]62. 在体内用重组慢病毒载体颗粒转导细胞的方法，包含使细胞与根据51中的重组慢病毒载体颗粒接触，藉此细胞得以转导。
[00225]63. 在细胞中表达异源目的基因的方法，包含用根据51中的重组慢病毒载体颗粒转导细胞，藉此异源目的基因在细胞中表达。
[00226]64. 包装细胞，包含：
(a)(i)包装构建体，包含DNA片段，所述DNA片段包含可操作地连接于BIV gag基因和BIV pol基因的启动子，或(ii)含DNA片段的第一包装构建体，所述DNA片段包含可操作地连接于包含BIV gag基因的DNA片段的第一启动子；以及含DNA片段的第二包装构建体，所述DNA片段包含可操作地连接于包含BIV pol基因的DNA片段的第二启动子；
(b)病毒表面蛋白基因构建体，包含DNA片段，所述DNA片段包含可操作地连接于病毒表面蛋白基因的启动子；和
(c)(i)rev基因，位于所述包装构建体、病毒表面蛋白基因构建体及转移载体构建体之一上，或(ii)含DNA片段的rev构建体，所述DNA片段包含可操作地连接于rev基因的启动子。
[00227]65. 64中的包装细胞，包含DNA片段，所述DNA片段包含可操作地连接于BIV gag基因和]BIV pol基因的启动子。
[00228]66. 64中的包装细胞，包含含DNA片段的第一包装构建体，所述DNA片段包含可操作地连接于包含BIV gag基因的DNA片段的第一启动子；以及含DNA片段的第二包装构建体，所述DNA片段包含可操作地连接于包含BIV pol基因的DNA片段的第二启动子。
[00229]67. 65中的包装细胞，其中gag基因包含重新编码的核苷酸序列。
[00230]68. 65中的包装细胞，其中gag和pol基因分别包含重新编码的核苷酸序列。
[00231]69. 65中的包装细胞，其中pol基因包含重新编码的核苷酸序列。
[00232]70. 66中的包装细胞，其中gag基因包含重新编码的核苷酸序列。
[00233]71. 66中的包装细胞，其中pol基因包含重新编码的核苷酸序列。
[00234]72. 64中的包装细胞，其中pol基因的蛋白酶区在蛋白酶催化中心的三氨基酸基序中发生突变，且其中所述的突变蛋白酶与未突变的BIV蛋白酶相比对宿主细胞毒性较小。
[00235]73. 72中的包装细胞，其中蛋白酶区在蛋白酶多肽氨基酸26位上编码Thr到Ser的突变。
[00236]74. 64中的包装细胞，其中病毒表面蛋白基因构建体包含env基因。
[00237]75. 74中的包装细胞，其中env基因选自VSV-Genv、LCMVenv、LCMV-GP(WE-HPI)env、MoMLV env、长臂猿白血病病毒(GaLV)env、Phabdoviridae科成员的env基因、甲病毒属env基因、副粘病毒属env基因、黄热病病毒属env基因、逆转录病毒属env基因、沙粒病毒属env基因和副流感病毒env。
[00238]76. 64中的包装细胞，其中病毒表面蛋白基因编码VSV-Genv。
[00239]77. 64中的包装细胞，包含位于所述包装构建体、病毒表面蛋白基因构建体及转移载体构建体之一上的rev基因。
[00240]78. 64中的包装细胞，包含含DNA片段的rev构建体，所述DNA片段包含可操作地连接于rev基因的启动子。
[00241]79. 64中的包装细胞，其中rev基因来自BIV但不包含天然BIV rev内含子。
[00242]80. 79中的包装细胞，其中rev基因包含SEQ ID NO：10。
[00243]81. 77中的包装细胞，包含可操作地连接于rev基因的EF-1启动子。
[00244]82. 78中的包装细胞，其中可操作地连接于rev基因的启动子是EF-1启动子。
[00245]83. 64中的包装细胞，其中至少两个启动子是相同的。
[00246]84. 64中的包装细胞，其中所有的启动子都不同。
[00247]85. 64中的包装细胞，其中细选自由293细胞、293T细胞、COS细胞、HeLa细胞和Cf2TH细胞。
[00248]86. 分离的BIV POL蛋白，包含与SEQ ID NO：51所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。
[00249]87. 86中的分离的BIV POL蛋白，包含SBQ ID NO：51。
[00250]88. 86中的分离的BIV POL蛋白，在所述POL蛋白的N-末端包含甲硫氨酸。
[00251]89. 分离的核酸分子，包含编码86-88中任一项的BIV POL蛋白的核苷酸序列。
[00252]90. 分离的核酸分子，包含编码87中的BIV POL蛋白的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列基本上由SEQ ID NO：50组成。
[00253]91. 分离的核酸分子，包含编码88中的BIV POL蛋白的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列基本上由SEQ ID NO：53组成。
[00254]92. 分离的核酸分子，包含最小的BIV包装序列，其中所述的最小BIV包装序列与SEQ ID NO：39所示的核苷酸序列具有至少90％的同一性。
[00255]93. 92中的分离的核酸分子，其中的最小BIV包装序列基本上由SEQ ID NO：39所示的核苷酸序列组成。
[00256]94. 分离的核酸分子，包含编码BIV REV蛋白的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码与SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。
[00257]95. 94中的分离的核酸分子，其中编码BIV REV蛋白的核苷酸序列编码由SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列编码的同一个氨基酸序列。
[00258]96. 94中的分离的核酸分子，其中的核苷酸序列与SEQ IDNO：10所示的核苷酸序列具有至少90％的同一性。
[00259]97. 94中的分离的核酸分子，其中的核苷酸序列基本上由SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列组成。
[00260]98. 分离的核酸分子，包含最小的BIV RRE序列，其中所述的最小BIV RRE序列与SEQ ID NO：40所示的核苷酸序列具有至少90％的同一性。
[00261]99. 98中的分离的核酸分子，其中的最小BIV RRE序列基本上由SEQ ID NO：40所示的核苷酸序列组成。
[00262]本发明进一步在以下实施例中详述，所述实施例是作为举例说明提供的而并非旨在以任何方式限制本发明。利用本领域熟知的标准技术或者下文具体描述的技术。
                     实施例
                     实施例1
[00263]SEQ ID NO：1显示了牛免疫缺陷病毒原病毒的DNA序列。
                     实施例2
                     质粒构建
[00264]包装构建体通过将必要的BIV构建体连接到哺乳动物表达质粒pCI(Promega，Madison，WI)中产生。主要剪接供体(MSD)位点以及gag和pol的编码序列作为4485个碱基对的BspEI-BstUI片段由BIV原病毒中分离(Garvey等Virology.1990 Apr；175(2)：391-409，Genbank登录号NC_001413和M32690)。该片段通过Klenow处理平末端化，并连接到由EcoRI线性化并且也通过Klenow处理平末端化的pCI中以产生pCIigp。下一步，由引物RRE65′NotI(5′-AAAGCGGCCGCTCCGGTGGATTCTTGTAAAGG-3′)(SEQ ID NO：2)和RRE63′NotI(5′-AAAGCGGCCGCGGCGCCTCCAAGTATGAAACTC-3′)(SEQ ID NO：3)对BIV原病毒的PCR扩增产生最小RRE片段。该344个碱基对的PCR片段用NotI消化，并连接到也用NotI消化且磷酸酶(CIP)处理的pCIigp中。产生的质粒命名为pCIigpRRE，并用于四组分系统。最后，融合了两个外显子的邻近的rev编码序列，通过两种不同的方法RT-PCR和PCRSOEing如下文所述产生。
[00265]四组分系统中所用的rev序列通过RT-PCR产生。简要地，接种在10-cm培养皿中的239T细胞利用ProFectin哺乳动物转染系统(Promega)由20ug pBH2质粒(Berkowitz等，2001)转染。转染后48小时，收集细胞并用Trizol试剂(Invitrogen)纯化总RNA。RT-PCR用GeneRacer试剂盒(Invitrogen)按照制造商的说明进行。利用5ug总RNA合成cDNA。rev cDNA序列利用引物Rev15Af13(5′-GGACGCGTCGACTCTAGATCTAGGAATCAACTATGG-3′)(SEQ ID NO：4)和Rev23Age12(5′-TTTACCGGTCGCGAGCTTAGCTTACAATCTACTGAGAACC-3′)(SEQ ID NO：5)扩增。PCR反应在如下条件下进行：94℃1分；25个循环的94℃1分，54℃1分和72℃1分；以及72℃另外10分钟。在1％琼脂糖凝胶上检测到0.7kb的rev cDNA片段，并随后按照TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen)的说明克隆到pCR4-TOPO载体中。鉴定了具有rev cDNA插入物的两个克隆。Rev插入物的取向通过限制性酶消化确定。在通过自动序列分析确认rev cDNA克隆之后，将rev基因亚克隆到pTracerA质粒(Invitrogen)中用于在哺乳动物细胞中表达。Rev序列插入在PmeI和NotI位点之间，处于EF-1a启动子的调控之下，产生pTracerARev。PCIigpRRE和pTracerARev都进行DNA测序以确认构建体的完整性。连接到用于三构建体系统的pCIigpRRE中的rev编码序列通过PCR SOEing(通过重叠延伸的剪接)产生。rev的第一个外显子利用引物Rev155868(5′-GTTCTAGATGGCTGGCTTTTCTGG-3′)(SEQ ID NO：6)和Rev13(新)(5′-GAGAATCGTTATTGATCCATGTTTG-3′)(SEQ ID NO：7)通过PCR由BIV原病毒扩增。第二外显子也利用引物Rev25(新)(5′-GGATCAATAACGATTCTCCTAGGTATGT-3′)(SEQ ID NO：8)和Rev237526(5′-TTACTAGTGGTTATTTTGTTCCCTGG-3′)(SEQ ID NO：9)由原病毒扩增。两产物以等摩尔比的量混合，并利用引物Rev155868和Rev237526扩增。最终698个碱基对的产物用XbaI和SpeI消化，并连接到用XbaI消化的pCIigpRRE中。所得的质粒命名为pBIVminipack，并且仅含CMV即早期启动子驱动BIV gag/pol编码序列，接着是融合的rev编码序列，最小RRE，以及最后的SV40多聚腺苷酰化信号。仍然保留gag起点上游的MSD位点和rev剪接受体(SA)位点。然后对包装构建体进行DNA序列分析以确认构建体的完整性。没有居间内含子的rev基因序列示于SEQ IDNO：10。在一个实施方案中，本发明提供了其中rev基因不含天然BIV居间内含子的基因转移系统，而在另一个实施方案中，rev基因不含任何居间内含子。
[00266]转移载体构建体pBIVminivec衍生自pBC4MGppt，其先前已有描述(Berkowitz等，2001)。为促进克隆，将完整的BIV转移载体编码序列克隆到表达质粒pBS II KS+(Stratagene，La Jolla，Ca.)中，通过用BspMI消化pBC4MGppt并连接到事先由HincII消化的pBSIIKS+中，作为钝端连接产生质粒pBSV4MGppt。质粒pBSV4MGppt用BglII和EcoNI消化，Klenow处理并重新连接，以除去297bp的gag基因片段产生质粒pBSV4MGpptΔGAG。由于在紧接着增强型绿色荧光蛋白(eGFP)报告基因之后缺乏独特和便利的限制性位点，利用引物WPRE5(5′-GAGCTGTACAAGTAAAGCGGCCAACCCTCCTGCAG-AAACTCCTTTGGG-3′)(SEQID NO：11)和WPRE3(5′-GGAACAAAAGCTGGGTACCGGGCCCCCCC-3′)(SEQ IDNO：12)掺入独特的PstI位点，产生质粒pBSV4MGpptΔGAG PstI。然后将土拨鼠肝炎转录后调控元件(PRE)克隆到主链上，pBSV4MGpptΔGAGPstI事先由PstI消化，用Klenow处理，并连接到PRE片段上，产生质粒pBSV4MGpptΔGAG PRE。质粒pBSV4MGpptΔGAG PRE作进一步修饰，通过除去所有推定的rev应答元件(RRE)，其在原始BIV转移载体中大约是778bp(Berkowitz等，2001)，并将其替换为312bp的我们发现充分负责RRE功能的RRE片段。首先，质粒pBSV4MGpptΔGAG PRE用KasI和BbvCI消化。该区域然后利用引物RRE1(5′-GTTGGCGCCCAACGTGGGGCTCGAGTAAGAGAG-3′)(SEQ ID NO：13)、RRE2(5′-AGATCTGAATTCTAAGTG-ACCTATTTC-3′)(SEQ ID NO：14)、RRE3(5′-GAATTCAGATCTTATG-GGAATGAAAGACC-3′)(SEQ ID NO：15)和RRE4(5′-AACTGCTGAGGGCGGGACCGCATCTGG-3′)(SEQ ID NO：16)PCR扩增。RRE1和RRE2扩增所述推定的RRE的上游区域，而引物RRE3和RRE4扩增所述推定的RRE的下游区域。然后以等摩尔比混合产物，并用引物RRE1和RRE4扩增。终产物掺入了KasI和BbvCI位点，而全部推定的RRE被缺失掉。此外，构建了独特的EcoRI和BglII位点，以在引物RRE2和RRE3之间产生接合位点，用于终产物退火的目的，但主要是为了随后克隆RRE的多个区域。该PCR策略产生质粒pBSV4MGpptΔGAGΔRRE PRE。推定的RRE然后用7对引物(表1)在均编码5′EcoRI位点和3′BglII位点的不同区域进行PCR扩增，以便克隆到主链pBSV4MGpptΔGAGΔRREPRE中。一经建立，各片段用EcoR1和BglII消化，并如前所述克隆(表1)。含RRE6的载体构建体命名为pBIVminivec。
[00267]含本实施例中所用的病毒表面蛋白基因构建体、表达VsV-G的质粒以前已有描述(Burns等，1993，PNAS.USA 90：8033-8037)。
                                             表1
    构建体   碱基对     引物序列   转导效率
  +对照pBSV4MGpptΔGAG   6783-7561    N/A     100％
1.pBSV4MGpptΔGAGRRE1 6783-7030    5′ggcgaattcgatctaggaaaaaattttccg-3′SEQ ID NO：17SEQ ID NO：183′ggaagatctccacaaacccatagctgg-5′ 1％
2.pBSV4MGpptΔGAGRRE2 7005-7290    5′cccgaattcaaaggtccccagc-3 ′SEQ ID NO：19SEQ ID NO：203′ggaagatctctctatggtgtaggac-5′ 65％
3.pBSV4MGpptΔGAGRRE3 7288-7561    5′ccggaattcgagtttcatacttggag-3′SEQ ID NO：21SEQ ID NO：223′ggaagatcttgcactaaatggtc-5′ 9％
4.pBSV4MGpptΔGAGRRE4 6908-7181    5′ccggaattccctaatactatgcc-3′SEQ ID NO：23SEQ ID NO：243′ggaagatctcttagccgtcgtgtgc-5′ 38％
5.pBSV4MGpptΔGAGRRE5 7192-7431    5′ggcgaattcgggttgtgcaaaatgtg-3′SEQ ID NO：25SEQ ID NO：263′cctagatctcattccaagttttgct-5′ 3％
6.pBSV4MGpptΔGAGRRE6 6993-7304    5′ccggaattcgtggattcttgtaaagg-3′SEQ ID NO：27SEQ ID NO：283′ggaagatctctccaagtatgaaactc-5′ 106％
7.pBSV4MGpptΔGAGRRE7 7048-7345    5′ccagaattccaccaccatccctcc-3′SEQ ID NO：29SEQ ID NO：303′ggaagatctcaaccaaagaatact-5′ 98％
[00268]为进一步缺失最小载体中剩余的212bp gag序列，构建体pBSV4MGpptΔGAGΔRRE PRE(为简化命名为pBvΔRRE)用作为PCR反应的模板，进行gag序列的缺失，以确定包装信号的定位。上文描述的构建体pBvΔRRE通过用ClaI和Hind III消化，由klenow处理，然后重新连接用于缺失184bp的GAG。这个克隆策略产生含28bp Gag编码序列的构建体，产生质粒pBv28ΔRRE。下一步，我们产生含54bp gag序列的载体构建体。首先，模板pBvΔRRE用KasI和EcoRI消化并用碱性磷酸酶处理。Gag编码区利用引物NRS1(5′AACAGTTGGCGCCCAACGTGGGGCTC-3′)(SEQ ID NO：31)、NRS2(5′ATGCATCACGTGGGGTGTCACCCTAACCTTACGAA-3′)(SEQ ID NO：32)、NRS3(5′CACGTGATGCATCGATCTAAAAGACAGATTGGC-3′)(SEQ ID NO：33)和NRS4(5′CATAAGATCTGAATTCAATGATCTAAGTG-3′)(SEQ ID NO：34)扩增。NRS1和NRS2用于扩增Gag起始密码子(ATG)5′区到Gag碱基对54。NRS3和NRS4扩增Gag 3′终止密码子直到BIV cPPT。然后以等摩尔比混合产物并用引物NRS1和NRS4扩增。终产物掺入了KasI和EcoRI位点，缺失了模板内后面的158bp Gag，产生含54bp Gag编码序列的构建体。此外，掺入了独特的NsiI和PmlI位点，以在引物NRS2和NRS3之间产生接合位点，用于终产物的退火和筛选。该PCR策略产生质粒pBv54ΔRRE。执行相同的PCR策略产生构建体pBv104ΔRRE。NRS1和NRS4用作为外部引物，而新的内部引物是NRS 32(5′ATGCATCACGTGATTCTAATGGCCCATTGAAGATTC-3′)(SEQ ID NO：35)以及NRS33(5′CACGTGATGCATCGATCTAAAAGACAGATTGGC-3′)(SEQ ID NO：36)。NRS1和NRS32用于扩增Gag起始密码子(ATG)5′区到Gag碱基对101。NRS33和NRS4扩增Gag 3′终止密码子3′直到BIV cPPT。然后以等摩尔比混合产物并用引物NRS1和NRS4扩增。终产物掺入了KasI和EcoRI位点，缺失了模板pBv104RRE内Gag后面的111bp。并且，如上文所述，掺入了独特的NsiI和PmlI位点，以在引物NRS32和NRS33之间产生接合位点，用于终产物的退火和筛选。最后，所有三个构建体pBv28ΔRRE、pBv54ΔRRE和pBv104ΔRRE都用EcoRI和Bg1II消化，碱性磷酸酶处理，然后将上文所述的最小RRE6作为EcoRI和Bg1II片段克隆进来，分别产生质粒pBv28、pBv54和pBv101。对所有这些转移载体构建体进行DNA序列分析，以确认构建体的完整性。pBv101被命名为pBIVfinalvecATG。
[00269]为突变BIV gag的起始密码子，我们利用QuickChangestrategy(Stratagene，LaJolla，CA)。pBSIIKS+(Stratagene，LaJolla，CA)用NotI和HindIII消化，并用碱性磷酸酶处理(CIP)。下一步，pBIVminivec用NotI和HindIII消化。将来自pBIVminivec的NotI至HindIII片段亚克隆到pBSIIKS+主链中。用于QuickChange反应的引物是：KOATG正向(5′-GCGTGTTTTCCCCGGGGTGAAGAGAAGGGAG-3′)SEQ ID NO：37以及KOATG反向(5′-CTCCCTTCTCTTCACCCCGGGGAAAACACGC-3′)SEQ IDNO：38。
[00270]该质粒被称之为pBSIIKS+NHΔATG。然后对产物进行DNA序
[00270]该质粒被称之为pBSIIKS+NHΔATG。然后对产物进行DNA序列分析以确认产物的完整性。然后pBSIIKS+NHΔATG用NotI和HindIII消化，接着克隆回pBIVfinalvecATG中。产生的终产物命名为pBIVfinalvec，且gag的ATG被突变。然后对整个pBIVfinalvec进行DNA序列分析以确认构建体的完整性。
                     实施例3
                       3.1
[00271]现在参照图1，显示了代表BIV三组分基因转移系统的示意图，含有：(i)包装构建体，(ii)转移载体构建体，和(iii)病毒表面蛋白基因构建体。包装构建体pBIVminipack和转移载体构建体pBIVfinalvec的质粒构建在实施例2中描述。包装构建体pBIVminipack，仅含驱动BIV gag/pol编码序列的CMV即早期启动子，接着是融合的rev编码序列，最小RRE，以及最后的SV40多聚腺苷酰化信号。仍然保留gag起点上游的MSD位点和rev剪接受体(SA)位点。转移载体构建体pBIVfinalvec具有CMV启动子，继之以R、U5、UTR、cPPT、RRE、驱动转基因的内部启动子、修饰的U3(SIN)、R和U5(CMV：CMV早期启动子；Δ：包装信号序列缺失；MSD：主要剪接供体位点；SA：剪接受体位点；rev：BIV rev；RRE：BIV Rev应答元件；UTR：非翻译的前导序列；ΔGAG：头101bp的BIV gag序列；cPPT：中心聚嘌呤带；SIN：自身失活；SV40USE：增强子元件上游的SV40多聚腺苷酰化信号；VSV-G：水泡性口膜炎病毒包膜糖蛋白G)。
                        3.2
[00272]现在参照图2，显示了代表BIV四组分基因转移系统的示意图，其含有(i)无rev的包装构建体，(ii)rev表达构建体，(iii)转移载体构建体，和(iv)病毒表面蛋白基因表达构建体。包装构建体pCIigpRRE、rev表达构建体pTracerARev、转移载体构建体pBIVfinalvec以及病毒表面蛋白基因表达构建体的质粒构建在实施例2中描述。EF-1á：EF1á启动子。
                       实施例4
                  BIV包装信号序列的鉴定
[00273]转移载体pBIVminivec具有gag缺失导致只有212bp残余的gag，其与具有509bp gag序列的亲本载体pBC4MGppt以相同的效率转导293T细胞。对用含509bp gag序列或212bp gag序列的BIV载体转导的细胞进行eGFP表达的流式细胞仪分析。eGFP表达通过流式细胞仪分析测量。如下结果是以eGFP阳性细胞的百分比给出的：假转导0.1％；用载体pBSV4MGppt转导的细胞85％；用pBIVminivec转导的细胞95.5％。此外，从pBIVminivec 3′端缺失另外的gag序列，分别产生只含28(pBV28)、54(pBv54)或101(pBv101)bp gag序列的pBIVfinalvec。存在于pBv101和pBIVfinalvecATG中的101bp gag序列示于SEQ ID NO：39。由构建体pBv101产生的载体是具有完全功能的，并且能够有效地转导细胞，而pBv28和pBv54是缺陷型的(图3)。因此，含101bp gag序列的pBv101被命名为pBIVfinalvecATG。有趣的是，我们也发现即使是pBIVfinalvecATG，RRE依然是载体转导靶细胞的生物功能绝对必需的，因为彻底除去RRE则废止了转导效率(图3，表B)。我们推断起始于gag ATG的前101bp BIV gag序列含BIV包装信号。该101bp的BIV gag序列，连同位于5′U5和gag起始密码子ATG之间的非翻译前导序列，构成了如SEQ ID NO：39中所描绘的最小BIV包装信号序列。
                        实施例5
                  BIV Rev应答元件的鉴定
[00274]质粒pBC4MGppt含有778bp包膜编码区中推定的RRE序列(Berkowitz等，2001；PCT专利申请WO 01/44458)。为确定BIV RRE的精确定位，产生了具有推定的RRE区的数个独立部分的多个构建体。产生这些不同的构建体以鉴定核输出所必需的最小核酸序列。进行最小RRE的确定，以致力于减小具有BIV包装信号的载体构建体与BIVgag/pol表达包装构建体之间的序列同源性。总共产生了掺入了推定的同BIV包装构建体pBH2(Berkowitz等，2001；PCT专利申请PCT/US00/33725(WO 01/44458))和VSV-G表达质粒分别地转染到293T细胞中。转染后48小时，收集病毒上清。各上清通过测定反转录酶(RT)活生的量(Reverse Transcriptase Assay，Roche MolecularBiochemicals，Indianapolis，IN，Cat.#1828657)标准化，并且含相同量RT的载体上清被用来转导相同数目的293T细胞。RT是载体颗粒的精确度量，相同量的RT输入代表相同数目的载体颗粒输入。在产生的7个构建体中，由载体构建体pBSV4MGpptΔGAGPRERRE6产生的载体与由构建体pBSV4MGpptΔGAGPRE产生的具有全长778bp推定的RRE序列(表1)的亲本载体以等同的效率转导细胞。该数据证明含有312bp SEQ ID NO：40的序列的这个载体，含有足够的负责核输出的RRE序列。该312bp的最小RRE被用于我们所有的需要RRE的BIV包装和转移载体构建体中。
                   实施例6
               6.1.细胞系和培养条件
[00275]293T细胞(ATCC；CRL 11268)和HeLa(ATCC；CCL-2)细胞在Dulbecco′s改良Eagle培养基(DMEM；BRL Life Technology，Rockville，MD)中培养，补充有10％热失活的胎牛血清(Hyclone，SaltLake City，UT)、50IU青霉素/ml、50ug链霉素/ml以及2mm L-谷氨酰胺(Complete DMEM)。小鼠神经元和阿米巴状干细胞(Neuro-2A)获自美国典型培养物保藏中心(Manassas，Va.)。Neuro-2A细胞在最低必需培养基(BRL Life Technology，Rockville，MD)中培养，补充有10％热失活的胎牛血清、50IU青霉素/ml、50ug链霉素/ml、1.0mm丙酮酸钠、2mM L-谷氨酰胺、1.5g/L碳酸氢钠以及0.1mM非必需氨基酸。人类原代骨骼肌细胞(SkMC)(BioWhittaker，Walkersville，MD)在SkBM基础培养基中用含0.1％人类表皮生长因子、1％胰岛素、5％BSA、5％胎球蛋白、1％庆大霉素-两性霉素B以及0.5M地塞米松的SkGM子弹试剂盒培养。细胞系在潮湿的温箱中由5％CO2于37℃维持。
                6.2.病毒载体的生产
[00276]293T细胞以4×106的密度接种在10cM皿中过夜。第二天排出培养基，并替换为新鲜的完全DMEM。4小时后，所述293T细胞利用Profection哺乳动物转染系统由磷酸钙共沉淀法(Promega，Madison，WI)转染。典型地，利用15μg转移载体构建体、15μg包装构建体和4.5μg VSV-G病毒表面蛋白基因构建体转染各皿中接种的细胞。在四构建体系统的情况下，利用15μg转移载体构建体、15μg包装构建体(pCIigpRRE)、9μg rev表达构建体(pTracerARev)、4.5μg VSV-G病毒表面蛋白基因构建体转染各皿中接种的细胞。24小时后，排出培养基，并替换为新鲜的完全DMEM。转染后48小时收集病毒上清，于2000 RPM离心10分钟，以清除细胞碎片，并以小份于-80℃冷冻贮存。裂解5μl清除后的上清并利用商业试剂盒(Reverse Transcriptase Assay，RocheMolecular Biochemicals，Indianapolis，IN，Cat.#1828657)分析反转录酶(RT)活性。编码eGFP的VSV-G假型鼠白血病病毒(MLV)载体的产生以前已有描述(Berkowitz等，2001)。
                       6.3.转导
[00277]为转导分裂细胞，将2×105细胞接种到6-孔板的每孔中。24小时后，抽出培养基，并且典型地向细胞中添加2ml病毒上清(含大约2×106转导单位的载体颗粒)。然后以8μg/ml的终浓度向孔中添加鱼精蛋白硫酸盐。细胞然后在潮湿的温箱中由5％CO2于37℃维持3小时。3小时后，抽出病毒上清，并替换为新鲜的培养基，并在潮湿的温箱中由5％CO2于37℃温育48小时。为转导非分裂细胞，将1×105细胞接种到6-孔板的每孔中。24小时后，以4μg/ml的终浓度添加阿非迪霉素。用阿非迪霉素处理16小时后，抽出培养基，并且典型地在阿非迪霉素的存在下向细胞中添加2ml病毒上清。然后以8μg/ml的终浓度向孔中添加鱼精蛋白硫酸盐。细胞在潮湿的温箱中由5％CO2于37℃维持3小时。抽出病毒上清，并替换为含2μg/ml终浓度的阿非迪霉素的新鲜培养基，并且细胞在潮湿的温箱中由5％CO2于37℃温育48小时。
             6.4.流式细胞仪分析及滴定方法
[00278]为分析eGFP表达，从孔中抽出培养基。细胞用2ml磷酸缓冲盐溶液(PBS)冲洗。然后抽出PBS，并且细胞用胰蛋白酶消化，洗涤并重悬于含5％热失活的胎牛血清的PBS中。细胞在FACS Calibur(BectonDickinson Biosciences)中分析eGFP表达。
[00279]为确定编码eGFP的BIV载体的滴度，6-孔板中的Cf2Th细胞(4×105细胞/孔)用2ml含不同稀释度病毒载体的培养基在鱼精蛋白硫酸盐的存在下转导。3小时后，抽出病毒上清并替换为新鲜培养基，并且细胞在潮湿的温箱中由5％CO2于37℃温育48小时。然后回收细胞，并通过流式细胞仪测定eGFP的表达。载体滴度以如下方式计算：滴度(转导单位/ml)＝％阳性细胞×4×105细胞×稀释系数。
                     实施例7
由基于BIV三构建体的基因转移系统产生的载体介导的基因表达
                  7.1.分裂和非分裂细胞的转导
[00280]编码eGFP的BIV载体如实施例6.2中所描述的那样，通过用包装和转移构建体连同VSV-G病毒表面蛋白基因构建体共转染293T细胞产生。测定载体上清的反转录酶(RT)活性(Reverse TranscriptaseAssay，Roche Molecular Biochemicals，Indianapolis，IN，Cat.#1828657)。含等量RT的未浓缩载体上清(2ml中的40ng RT等同载体颗粒)(除了不测定RT的基于MLV的肿瘤逆转录病毒载体之外)以等体积使用。MLV载体用作为对照确认细胞的分裂或非分裂状态，因为基于MLV的肿瘤逆转录病毒载体仅转导分裂细胞，但不能转导非分裂细胞。然后利用MLV载体转导分裂和非分裂(见实施例6.3)的HeLa和Neuro-2A细胞(表2)。尽管VSV-G假型MLV有效地转导分裂的HeLa和Neuro-2A细胞，阿非迪霉素处理的细胞(阿非迪霉素以1μg/ml的终浓度应用)如预期的那样，对MLV介导的转导是完全抗性的(表2)，说明阿非迪霉素处理的细胞在我们的实验条件下很可能不分裂。不过，非分裂HeLa和Neuro-2A都相对高效地被未浓缩的最小化BIV载体转导，说明由最小化BIV包装和最小化转移载体构建体产生的载体完全能够介导分裂和非分裂细胞中的转基因表达。
                        表2
                      HeLa细胞
载体                            eGFP阳性细胞百分比分裂                                          非分裂
    假模拟侵染   0.1％   0.01％
    MLV病毒载体   51.8％(SD＝I.99)   0.44％(SD＝0.11)
    BIV病毒载体   36.1％(SD＝0.47)   39.5％(SD＝4.3)
                             Neuro-2A细胞
载体                             eGFP阳性细胞百分比分裂                                         非分裂
    假模拟侵染     0.12％     0.12％
    MLV病毒载体     44.6％(SD＝0.72)     0.83％(SD＝0.07)
    BIV病毒载体     57.2％(SD＝0.56)     30.4％(SD＝0.15)
                   人类原代骨骼肌细胞
载体                            eGFP阳性细胞百分比分裂                                         非分裂
    假模拟侵染   0.03％   0.05％
    MLV病毒载体   25.6％(SD＝1.5)   0.23％(SD＝0.5)
    BIV病毒载体   55.1％(SD＝5.8)   69.4％(SD＝3.2)
              7.2.人类原代细胞的转导
[00281]为检查最小化BIV载体转导和在原代细胞中表达的能力，人类原代骨骼肌细胞(BioWhittaker，Walkersville，MD)用阿非迪霉素(阿非迪霉素以1μg/ml的终浓度应用)或不用阿非迪霉素处理。基于MLV的载体很好地转导分裂的原代细胞，但在非分裂细胞中未获得任何显著的转导(表2)。相反，未浓缩的最小化BIV载体有效地转导分裂和非分裂原代细胞(表2)，证明BIV包装和转移载体构建体的显著最小化并不影响载体转导人类原代非分裂细胞的能力。
                      实施例8
由基于BIV三组分和四组分的基因转移系统产生的载体的比较
[00282]表3显示了由基于BIV三构建体和四构建体的基因转移系统产生的载体在转导的293T细胞中eGFP表达的流式细胞仪分析的比较。293T细胞用假模拟物(假模拟物在文中是指在没有载体转染时由293T细胞收集的细胞培养基)、用由BIV三组分系统产生的载体或用由BIV四组分系统(表3)产生的载体如实施例6.2所述转导。由RT活性所测量的等量载体颗粒(40ng RT等同载体颗粒)用于BIV三和四组分系统。结果(表3)显示基于BIV四组分的基因转移系统产生与由三组分系统产生的载体等同质量的载体。而且，四组分系统是BIV REV依赖性的，因为在缺乏BIV rev表达构建体pTracerARev时，没有功能性载体产生(表3：-Rev)。
             表3
                                                           eGFP阳性细胞百分比
假模拟侵染     0％
BIV三组分系统     15.26％
BIV四组分系统-Rev     0％
BIV四组分系统+Rev     14.92％
                       实施例9
HIV中心聚嘌呤带(HIVcPPT)对BIV中心聚嘌呤带(BIVcPPT)的替换
[00283]为最小化包装和转移载体构建体之间的重叠，BIV转移载体构建体中的cPPT由HIVcPPT替换。具体地，pBIVminivec用ClaI和EcoRI消化以除去BIVcPPT、平末端化并作为平末端连接与HIVcPPT连接。HIVcPPT由Charneau等描述(Charneau等，1992.J.Virology，65：2415-2421)。产生载体，并通过RT使含不同cPPT的载体颗粒标准化。相同量的RT用于转导分裂和非分裂HeLa细胞。结果提示具有BIVcPPT或HIVcPPT的载体同样好地转导分裂和非分裂的靶细胞，说明BIVcPPT在功能上可替换为HIVcPPT(图4)。BIV最小cPPT基本上由与BIV RNA基因组序列(BIV分离物127)pol编码区中从碱基对4374到4909的核苷酸相应的535个碱基对组成。
[00284]
                     实施例10
         BIV GAG/POL表达中核糖体移码位点的鉴定
[00285]对于某些逆转录病毒和慢病毒，gag和pol基因位于不同的翻译读框中，gag的3′端与pol的5′端重叠。因此，产生GAG-POL融合蛋白将需要信使RNA加工或翻译移码。后一种机制已在劳氏肉瘤病毒(RSV)、禽肉瘤/造白细胞组织增生病毒(ASLV)、鼠乳腺瘤病毒(MMTV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、猿免疫缺陷病毒(SIV)以及猫免疫缺陷病毒(FIV)的GAG-POL蛋白合成中证明。对这些病毒的研究证明核糖体移码需要移码位点处的7碱基序列和该位点下游紧接着的二级结构元件(即茎环)。移行(如本文所用的术语“移行”是指核糖体翻译复合体向后移动一个核苷酸并利用同一mRNA起始另一个蛋白的翻译)序列的实例有A AAU UUA(SEQ ID NO：41；ASLV)、U UUU UUA(SEQ ID NO：42；HIV-1)、A AAA AAC(SEQ ID NO：43；MMTV)和G GGA AAC(SEQ ID NO：44；FIV)。因而，移码位点的通用形式为序列X XXY YYZ，其中三联体是最初的(或″0″)翻译框架，且X可与Y相同。
[00286]与HIV或SIV不同，BIV未被深入研究。BIV pol基因翻译起点翻译移码的精确定位以前未曾确定。曾提出移码发生在序列C AAAAAT(SEQ ID NO：45，其中C处于BIV病毒基因组RNA株系127的核苷酸1576处(Garvey等，Virology，175：391-409，1990)处。然而，我们鉴定到翻译移码改为发生在序列A AAA AAC(SEQ ID NO：46)中，相应于BIV病毒基因组RNA中的核苷酸1629到1635，并且相应于BIV原病毒DNA序列SEQ ID NO：1中的核苷酸2013到2019。此外，我们发现了如图5中的附图所示的紧接着移码序列的茎环。图5所示的并且也在SEQ ID NO：47(DNA)和SEQ ID NO：48(RNA)中显示的病毒序列和结构，构成了牛免疫缺陷病毒Gag/Pol核糖体移码位点。
                      实施例11
        具有重新编码的gag/pol序列的BIV包装构建体
[00287]认为慢病毒例如HIV、SIV和BIV在其病毒RNA中含有导致RNA不稳定的核酸序列，从而阻止了病毒RNA的有效核输出。这被认为是由于慢病毒采用稀有密码子选择的事实和/或由RNA序列决定的RNA二级结构的缘故。没有rev/RRE，含这些稀有密码子的病毒RNA就不能被有效地运输到细胞核外。为从包装构建体中消除RRE，以最小化或消除包装和转移载体构建体之间的重叠，并提高BIV gag/pol基因的表达水平，我们利用优选的人类密码子重新编码BIV gag/pol编码序列(SEQID NO：49)。将重新编码的gag/pol编码序列克隆到pCI哺乳动物表达载体中，产生pCIigpSyn(图6)。合成的BIV gag/pol基因利用本领域公知的技术和PCT申请WO01/68835中描述的那些技术构建。具体地，在合成重新编码的gag/pol时，将XhoI位点和XbaI位点分别掺入到重新编码的gag/pol编码区的5′和3′端两翼。然后用XhoI和XbaI消化重新编码的gag/pol，并克隆到事先用XhoI和XbaI消化的pCI表达构建体(Promega，Madison，WI)中，创建pCIgpSyn。pCIigpSyn的产生允许我们通过共转染CIigpSyn，、pTracerARev、pBIVfinalvec和pCMVVSV-G，由四组分系统中制备BIV载体。由该系统产生的具有重新编码的gag/pol的BIV载体具有完全的功能，如通过其有效转导细胞的能力所指示的那样。表4显示了293T细胞中eGFP表达的流式细胞仪分析结果。293T细胞用由四组分系统中产生的BIV载体转导，除了在“Rev-”的情况下，其中病毒载体的生产在不存在表达组分时进行。该实验将由野生型BIV gag/pol表达组分产生的病毒载体与由重新编码的BIV gag/pol表达组分产生的病毒载体进行比较(表4)。
                表4
                                                                eGFP阳性细胞百分比
假模拟转导     0.02％
野生型BIV gag/pol     85％
重新编码的BIV gag/pol-Rev     0.9％
重新编码的BIV gag/pol+Rev     50％
[00288]基因或基因的一部分的重新编码可利用本领域熟知的技术进行。作为非限制性的实例，Casimiro DR等描述了用于基因合成的基于PCR的方法(Structure 1997 Nov 15；5(11)：1407-12)(也参见Brocca等″Design，total synthesis，and functional overexpressionof the Candida rugosa lip 1 gene coding for a major industriallipase″Protein Sci 1998 Jun；7(6)：1415-22；Withers-MartinezC等，″PCR-based gene synthesis as an efficient approach forexpression of the A+T-rich malaria genome″Protein Eng 1999 Dec；12(12)：1113-20；以及Stemmer等，″Single-step assembly of a geneand entire plasmid from large numbers ofoligodeoxyribonucleotides″Gene 1995 Oct 16；164(1)：49-53))。
[00289]为比较具有重新编码的gag/pol的包装构建体与具有野生型gag/pol的重组包装构建体，测试了包装构建体补充载体生产的能力。BIV载体如实施例6.2所述产生。具有重新编码的gag/pol的BIV包装构建体比具有野生型BIV gag/pol的包装构建体更有效。BIV载体用pCIigpRRE或用pCIigpSyn以低10倍的质粒输入(1.5μg对15μg)产生。由重新编码的gag/pol产生的载体与由含野生型gag/pol的包装构建体产生的载体转导的细胞百分比(27％)相比，可转导更高的细胞百分比(47％)，如通过FACS分析eGFP表达所显示的那样。假的模拟转导细胞转导0％的细胞。对重新编码的gag/pol和野生型gag/pol样品使用等体积的载体。数据显示具有重新编码的gag/pol的包装构建体pCIigpSyn比具有野生型gag/pol的包装构建体pCIigpRRE更有效。同样，重新编码gag/pol的无RRE元件存在时具有完全功能。重新编码的gag/pol构建体中RRE的缺乏起进一步最小化或消除与含野生型RRE的转移载体的同源性的作用。
[00290]既然如实施例10已确定了核糖体移码位点，则利用标准DNA密码子和开放读框分析确定BIV pol基因的氨基酸序列。野生型BIVpol基因示于SEQ ID NO：50。BIV pol基因推断的氨基酸序列是建立在gag和pol基因之间核糖体移码位点的鉴定的基础上的，示于SEQ ID NO：51。由于已确定了BIV pol的氨基酸序列，这易化了BIV pol基因的重新编码。既然已确定了BIV pol基因的氨基酸序列，本领域的普通技术人员可修饰该序列，进行重新编码，以优化在特定细胞类型中的表达。利用类似于重新编码gag/pol组合DNA片段所用的那些方法，也重新编码了pol基因的DNA。重新编码的BIV DNA pol基因示于SEQ ID NO：52。
[00291]如SEQ ID NO：51中所表明的，BIV pol基因不编码起始met氨基酸，并且如SEQ ID NO：52中所表明的，这里该基因的5′端不含met和蛋白合成起始的密码子。为构建其中gag和pol基因在不同构建体上提供的BIV转移系统，构建编码pol基因的在开放读框5′端具有额外的密码子的合成DNA，它能够合成具有起始的met密码子的POL多肽。该合成DNA的序列示于SEQ ID NO：53。pol已经重新编码并且也含有met起始密码子的合成DNA的序列示于SEQ ID NO：54。
                       实施例12
组蛋白脱乙酰基酶抑制剂提高慢病毒载体的产量并增强载体转导效率
[00292]与慢病毒载体广泛应用有关的技术障碍之一是相对低的滴度(大约105到107转导单位/ml，取决于不同的载体系统)。为克服该障碍，可通过超速离心浓缩载体。重要的是通过不会影响载体质量的手段提高慢病毒载体的滴度。在本发明的一个实施方案中，组蛋白脱乙酰基酶抑制剂丁酸(BA)显著提高基于牛免疫缺陷病毒的慢病毒载体的产量5到10倍，如通过在载体生产的细胞的培养基中反转录酶活性所指示的那样(图7)。具体地，在收集载体之前24小时，以5mM的终浓度向载体生产者细胞中添加丁酸(Sigma，St.Louis，MO)。反转录酶活性是对载体颗粒的度量。此外，如通过转导效率所测量的那样在丁酸存在下产生的载体更具有传染性(图8)。BIV载体颗粒如实施例6.2所述生产。
                     实施例13
         BIV载体的视网膜色素上皮细胞的体内转导
[00293]视网膜色素上皮细胞(RPE)是眼睛内眼基因治疗的靶之一。为测试用BIV载体的RPE转导效率，由三组分系统产生编码eGFP的BIV载体，并通过视网膜下注射(5×105转导单位/眼)注射到小鼠眼中。在从注射后1周到10周的不同时间点内收集眼组织、切片并检查eGFP的表达。切片的组织通过免疫荧光显微镜检直接检查eGFP的表达或由免疫组织化学染色检测。如通过eGFP表达所指示的那样，显著部分的视网膜色素上皮(RPE)细胞被BIV载体转导。在载体注射后1、2、8和10周对眼进行低温切片。1周时在RPE层观察到GFP的表达。载体注射后2周eGFP的表达在RPE层观察到，并且也在视网膜、光感受器和神经胶质细胞中检测到。载体注射后8周，在RPE层和视网膜中都观察到eGFP的表达。载体注射后10周，表达eGFP的RPE细胞清晰地见于眼底。
                      实施例14
           小鼠大脑中BIV载体介导的转基因表达
[00294]慢病毒载体介导的基因表达在许多治疗人类疾病的应用中具有极大的潜力。神经元和眼疾病代表了最适合基于慢病毒载体基因治疗的两个有前景的领域。测试了本发明基于重组BIV的慢病毒载体在小鼠大脑中介导转基因表达的能力。将编码eGFP的BIV载体(1×106转导单位，2μl)注射到小鼠黑质中。注射后17天，通过免疫组织化学染色检查小鼠大脑切片中eGFP的表达。小鼠大脑中的细胞被相对高效地转导。某些细胞的确是神经元细胞，正如通过eGFP(绿色)和NeuN(红色，神经元细胞特异性标志)共染色产生黄斑所指示的那样。
                      实施例15
       全身递送后大鼠脾脏中BIV载体介导的转基因表达
[00295]将编码萤光素酶载体的BIV载体(1×109转导单位，250μl)通过静脉内注射(尾静脉)注射到大鼠中。作为对照，也将TBS(Tris缓冲盐)注射到作为阴性对照的对照组大鼠中。载体注射后15天，向大鼠给药荧光素(萤光素酶底物)，并用Xenogen成像系统检查大鼠。大鼠脾脏被BIV载体有效地转导，而且通过成像系统观察到高水平的萤光素酶表达。相同的条件下在阴性对照大鼠中检测不到显著的信号。
                      实施例16
由BIV载体介导的抗血管生成基因表达对眼新生血管形成的体内抑制
[00296]举例来说，许多新生血管形成相关的眼疾例如老年性黄斑变性(AMD)尚无有效的疗法，并代表了主要的尚未满足的医学需求。如实施例13所示，本发明基于重组BIV的载体有效地转导小鼠视网膜色素上皮细胞。通过视网膜下注射象转基因小鼠(IRBP/rtTA-TRE/VEGFtgMICE)给药编码鼠内皮他丁(一种抗血管生成基因)的BIV载体(O′Reilly等，Cell；88(2)：277-85(1997))，所述转基因小鼠在强力霉素诱导下表达来自小鼠光感受器细胞的血管内皮生长因子。将BIV载体注射到小鼠右眼中，而左眼作为对照不注射载体。载体注射后3周，将0.5mg/ml的强力霉素置于转基因小鼠的饮用水中。强力霉素诱导5天后分析结果。如通过荧光素血管造影照片显示的那样，强力霉素诱导的VEGF表达导致转基因小鼠左眼重度的新血管形成。VEGF诱导的新血管形成被同一动物右眼中BIV载体介导的内皮他丁表达完全封闭。
                   实施例17
               HIV和BIV不交叉包装
[00297]与基于慢病毒载体的基因治疗相关的议题之一就是安全性。人们能够想象如果患者感染了HIV，野生型HIV可潜在地行使包装功能，通过动用进行治疗的慢病毒载体产生新的重组子。为解决该问题，进行了交叉包装实验，其中采用基于BIV的包装构建体产生基于BIV的载体(BIV/BIV)，或者采用基于HIV的包装构建体产生基于HIV的载体(HIV/HIV)。为测试交叉包装，我们利用基于BIV的包装构建体尝试并产生基于HIV的载体包装到载体中(BIV/HIV)，或者利用基于HIV的包装构建体尝试并产生基于BIV的载体(HIV/BIV)包装到载体中。产生载体，并利用如通过RT活性测定所指示的等量的载体颗粒转导相等数目的Cf2Th细胞。在转导了HIV载体、BIV载体、HIV/BIV交叉包装载体或BIV/HIV交叉包装载体的Cf2Th细胞中eGFP表达分析通过FACS分析。由BIV/BIV产生的BIV载体和由HIV/HIV产生的HIV载体分别转导31％和21％的细胞。然而，由BIV/HIV或HIV/BIV对产生的载体颗粒不产生可检测的eGFP阳性细胞，说明由所述两对产生的载体是空的或缺陷型颗粒。假的模拟转导用作为阴性对照，0％的细胞是eGFP阳性的。在假的模拟、BIV/HIV或HIV/BIV侵染的细胞之间未观察到差异。我们的数据说明HIV包装构建体不能交叉包装BIV载体的生产，而BIV包装构建体不能交叉包装HIV载体。在进一步的分析中，HIV包装构建体由BIV载体构建体和BIV Rev构建体共转染，以确保BIV载体RNA的核输出。再次地未观察到靶细胞的转导，进一步说明HIV不能包装，或至少不能有效地包装BIV载体。
                      实施例18
                   BIV蛋白酶的突变
[00298]在产生稳定的基于慢病毒的包装细胞系时遭遇的主要障碍之一是不能维持GAG和POL蛋白的高水平表达。HIV蛋白酶的催化中心包含包含三氨基酸基序Asp-Thr-Gly(Konvalinka，J.等，J.Virol.69：7180-7186，1995)。这三个氨基酸在迄今为止文献记载的HIV和SIV分离物中是保守的(Korber B，Theiler J，Wolinsky S，Science 1998 Jun19 280：5371 1868-71)。Konvalinka，J.等将Thr残基(相应于HIV分离物HXB2中蛋白酶从起点起的氨基酸26)突变为Ser。他们发现突变的HIV蛋白酶在保留蛋白酶活性的同时具有显著降低的毒性。这个信息使得可能产生表达高水平慢病毒Gag/Pol蛋白的稳定细胞系。为了建立用于慢病毒载体、尤其是用于以HIV或BIV为基础的慢病毒载体的稳定包装细胞系，这些蛋白的表达是绝对必需的。Asp-Thr-Gly基序也存在于BIV蛋白酶的相同位置上。比较HIV和BIV蛋白酶的头29个氨基酸揭示氨基酸编号25到29在HIV和BIV蛋白酶之间是完全相同的，包含所述Asp-Thr-Gly基序：
HIV蛋白酶(HXB2)：
1-PQVTLWQRPLVTIKIGGQLKEALL DTGAD(SEQ ID NO：55)
BIV蛋白酶(127分离物)：
1-SYIRLDKQPFIKVFIGGRWVKGLV DTGAD(SEQ ID NO：56)
HIV蛋白酶突变：
1-PQVTLWQRPLVTIKIGGQLKEALL DSGAD(SEQ ID NO：57)
相应的BIV蛋白酶突变：
1-SYIRLDKQPFIKVFIGGRWVKGLV DSGAD(SEQ ID NO：58)
[00299]在包装构建体pCIigpSyn SEQ ID NO：40的氨基酸Thr处进行点突变，其中氨基酸26处的Thr(由相应于BIV病毒基因组RNA分离物127的核苷酸1806-1808的核苷酸ACT编码，Garvey等，1990；SEQ ID NO：56和SEQ ID NO：58代表了BIV蛋白酶的部分序列，其全序列在本发明载体的一个实施方案中编码，以突变或重新编码的形式存在)在相同的位置上由Ser替换，而包装构建体的任何其它编码区无任何改变。具有Thr到Ser突变的这个包装构建体被命名为pCIigpSynSer。比较pCIigpSynSer和pCIigpSyn支持BIV载体生产的能力以及所述BIV载体达到的转导效率。
[00300]具体地，10-CM皿中的8×106 293T细胞用pCIigpSyn或pCIigpSynSer(1ug)、pTracerARev(10ug)、pBIVminiVec(15ug)及pCMVVSV-G(4.5ug)转染。转染后48小时，从转染的细胞中收集载体。HeLa细胞用如反转录酶(RT)活性所指示的等数目的载体颗粒转导。转导后48小时，进行流式细胞仪分析以计分eGFP阳性的HeLa细胞。如表5所示，由具有Thr到Ser突变的包装构建体pCIigpSynSer产生的载体与由包装构建体pCIigpSyn产生的载体同样有效地转导HeLa细胞。该突变的gag/pol基因的核苷酸序列示于SEQ ID NO：59。
                表5
包装构建体    转导效率    平均GFP强度
模拟            0％          0
pCIigpSyn       91％         1000
pCIigpSynSer    92％         1050
比较HeLa细胞中BIV载体介导的eGFP表达。编码GFP的BIV载体通过包装构建体pCIigpSyn或pCIigpSynSer产生，并比较其对HeLa细胞的转导效率以及eGFP表达的强度。转导效率通过阳性HeLa细胞百分比测量。平均eGFP强度以相对荧光强度计分。转导效率和平均eGFP强度都通过FACS Calibur(Becton Dickinson Biosciences)上的流式细胞仪分析予以分析。
                      实施例19
                从BIV转移载体中除去cPPT
[00301]BIV转移载体构建体之一具有推定的cPPT(Berkowitz等，2001b；Matukonis等，2002；Molina等，2002)。为确定所述BIV cPPT是否为体外或体内转导效率必需的，我们在非分裂的培养的HeLa细胞和大鼠视网膜中比较了有或无cPPT的载体。无推定的cPPT的载体形式通过用ClaI和EcorI消化pBIVminivec去除cPPT、使片段平末端化并重新连接而产生。
[00302]有或无cPPT的载体以相等的载体颗粒输入分别转导35％和34％非分裂的HeLa细胞。此外，对于如下实验，去除cPPT并不显著影响体内的基因转移效率。将有或无cPPT的编码eGFP的BIV载体注射到大鼠右眼的视网膜下空间(4.8×105T.U./眼)，而左眼作为对照，每组5只大鼠。注射后两周，直接在荧光显微镜下检查视网膜平面封固标本的eGFP表达。
[00303]结果：未注射的左眼不表现出任何可检测的GFP表达。相反，注射了eGFP BIV载体的右眼表现出大量的GFP表达。含cPPT的和cPPT缺失的BIV载体都转导眼中近似量的细胞(数据未显示)。
[00304]这证明体外和体内转导可利用不含推定的cPPT的BIV载体实现。同时，去除cPPT消除了与包装构建体364bp区段的序列相似性。这些修饰形成这样的系统，即其中转移载体和包装构建体只共有101bp的序列(包装信号)相似性，而同一性不长于8bp。如实施例11中所述重新编码gag/pol将去除所述101bp区段的同源性。
                     实施例20
[00305]POAG的治疗可通过向患者递送本发明的编码视神经碱(Optineurin)基因(Rezaie等，Science 295：1077-1079(2002))和/或小梁网蛋白基因(TIGR；Stone等，Science 275：668-670)的载体实现。载体将优选通过直接眼内注射到眼中递送。向眼中注射的方法是本领域熟知的。
[00306]光感受器退行变性导致的疾病包含但不限于遗传性视网膜营养不良(例如，视网膜色素变性、老年性黄斑变性、Bardet-Biedel综合症、Bassen-kornzweig综合症、卵黄状黄斑变性、无脉络膜、回旋状萎缩、先天性黑曚(congenital amourosis)、Refsun综合症、Stargardt病和Usher综合症)、视网膜脱离、老年性黄斑变性及其它黄斑病变。这些疾病的治疗可通过向患者递送本发明的编码视杆源生的视锥生存因子(RdCVF；PCT申请PCT/EP02/03810(WO 02/081513))或抗-细胞凋亡基因的载体实现。
[00307]另外，本发明的载体可用于表达视神经碱(optineurin)、TIGR、血管生成基因等，以治疗诸如归因于组织胞浆菌和病理性近视的脉络膜新血管形成的疾病，以及由血管样条纹症、前部缺血性视神经病变、细菌性心内膜炎、卵黄状黄斑变性、鸟枪视网膜脉络膜病变(birdshot retinochoroidopathy)、脉络膜血管瘤、脉络膜痣、脉络膜不满(choroidal nonperfusion)、脉络膜骨瘤、脉络膜破裂、无脉络膜、慢性视网膜脱离、视网膜缺损、Drusen、内生性假丝酵母眼内炎、视网膜色素上皮乳头外错构瘤、眼底黄色斑点症、特发症、黄斑裂孔、恶性黑素瘤、膜增生血管球性肾炎(II型)、金属眼内异物、牵牛椎间盘综合症、多发易散性白斑综合症(MEWDS)、锯状缘新血管形成、手术显微镜烧伤、视神经头伤痕、光凝固术、点状内部膜脉络膜病变、风疹、肉状瘤病、匐行脉络膜炎或局域性脉络膜炎(serpiginous orgeographic choroiditis)、视网膜下积液引流、倾斜性椎间盘综合症、错浆视网膜脉络膜炎(Taxoplasma retinochoroiditis)、肺结核或Vogt-Koyanagi-Harada综合症等引起的脉络膜新血管形成。
                      实施例21
         BIV载体对RdCVF基因的治疗性转移和表达
[00308]光感受器是特化的负责视觉的视网膜神经元亚群。光感受器由视杆和视锥组成，它们是视网膜的感光细胞。每个视杆和视锥精细地构造为特化的纤维管胞，称之为外节段，其容纳光传导机器。视杆含特殊的光吸收视色素视紫质。人类存在三类视锥，以表达截然不同的视色素为特征：蓝锥、绿锥和红锥色素。各类视色素蛋白调整在不同的波长最大限度地吸收光。视杆视紫质介导暗视觉(在暗光下)，而视锥色素负责亮视觉(在亮光下)。所述红、蓝和绿色素也构成了人类色觉的基础。视杆和视锥中的视色素响应光，并在输出细胞视杆双极神经元中产生动作电位，它随即由视网膜神经节神经元传递在视皮层中产生视觉刺激。
[00309]在人类中，许多视网膜疾病涉及光感受器的累积性退行变性和最终死亡，无情地导致失明。光感受器退行变性例如遗传性视网膜营养不良(如视网膜色素变性)、老年性黄斑变性、青光眼及其它黄斑病变、或者视网膜脱离，都以光感受器外节段的累积性萎缩和功能丧失为特征。另外，光感受器死亡或光感受器功能丧失在视网膜营养不良患者中导致二级视网膜神经元(视杆双极细胞和水平细胞)的部分传入神经阻滞，由此降低光感受器产生的电信号传播的总体效率。光感受器退行变性继发的二级神经胶质和色素上皮改变导致血管改变，引起局部缺血和神经胶质增生。能够拯救光感受器免于细胞死亡和/或恢复功能障碍(萎缩或营养不良)光感受器的功能的营养因子可能代表了治疗此类病况的有用的疗法。另外，表达RdCVF基因的BIV转移载体能够在细胞中可调控地表达，以测定这些基因的过度表达或表达不足的生理学效应，以及表达与多种眼疾的关系。
[00310]这些病况的发展指向了两类光感受器的相继丧失：最初视杆作为遗传或环境或未知损伤的直接结果而丧失，导致夜盲症和视野的下降，接着是不可避免的视锥丧失，导致完全失明。从而，视锥间接地死亡，因为它们不表达原发性损伤。
[00311]已发现视杆源生的视锥生存因子(RdCVF)是视锥保护性因子(PCT申请PCT/EP02/03810(WO 02/081513))。视杆源生的视锥生存因子(RdCVF)在眼组织中表达，并且尤其是在视杆细胞中生产。RdCVF基因可由其它细胞类型在视杆细胞的局部区域表达，而仍然提供保护益处。在患有视网膜营养不良的人中，RdCVF的产生在量上相对于未患视网膜营养不良的人的相应组织中的表达下降。由RdCVF基因转录的信使RNA，以及由此mRNA翻译的蛋白，存在于视杆组织和/或与此组织相关的组织中，其量为未患视网膜营养不良的人的相应组织中发现的mRNA和蛋白的水平的至少一半，优选比其少至少大约5倍，更优选少至少10倍的量，最优选少至少大约100倍。RdCVF mRNA转录的这种下降在文中称之为“下降的转录”。
[00312]在优选的实施方案中，BIV载体含有编码RdCVF的核酸序列。SEQ ID NO：60和SEQ ID NO：62分别为鼠RdCVF1和RdCVF2基因，而SEQ ID NO：61和SEQ ID NO：63分别编码鼠RdCVF1和RdCVF2多肽(Genbank登录号XM_134263、BC017153和BC021911)。SEQ ID NO：64和SEQ ID NO：66分别是人类RdCVF1和人类RdCVF2的基因，且进一步在Genbank登录号NM_138454和BC014127中描述。人类RdCVF1和RdCVF2多肽的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：65和SEQ ID NO：67。
[00313]本领域普通技术人员将会意识到编码RdCVF的核酸可通过改变密码子而不改变最终RdCVF蛋白的氨基酸序列加以修饰。同样提供的是编码RdCVF的核酸的变体，其中变体编码RdCVF蛋白氨基酸序列的相应功能变体。功能变体可能在氨基酸序列上有一个或多个取代、添加、缺失或截短的差异，其可以任意组合存在，但将保留与参照RdCVF相同的生物功能。
[00314]在本申请含义之内的“生物功能”应在广义上理解。它包含但不限于本申请公开的RdCVF蛋白的独特功能。因而，生物功能不仅是多肽在其生理环境下即作为活生物体或细胞的一部分所展示的那些功能，而且包含它在非生理设置中如在体外可能表现的生物功能。例如，在本申请含义之内RdCVF蛋白的生物功能是例如在体外或体内表现出视锥保护功效的能力。评估所需性质的方法是本领域普通技术人员熟知的。
[00315]同样，可进行细小的密码子取代、缺失和插入，而不消除RdCVF蛋白的治疗功效。因而，尽管SEQ ID NO 61、63、65和67编码RdCVF蛋白，本发明包含编码具有相同或相似治疗功效或生物功能的任何RdCVF蛋白的BIV载体。在优选的实施方案中，所述BIV载体编码人类RdCVF1和/或RdCVF2。
[00316]表达RdCVF的BIV载体可用于治疗与眼相关的多种疾病。这样的载体也可用于分析RdCVF表达在细胞中的生理功效。将RdCVF基因(单个或多数)插入到本发明的BIV载体中，并将载体转移到眼细胞中，其中RdCVF基因以等同于正常眼细胞中的水平表达。
[00317]如本申请所述的含异源目的基因的载体将具有多种用途，包含但不限于表达异源目的基因用于基因治疗。正如本领域普通技术人员将容易地理解的那样，这些载体可用于修饰基因表达，以测定此修饰对细胞生长、存活和功能的影响。例如，基因表达的修饰可提供对多种生理学现象的洞悉，例如象美国专利6,465,715(秀丽线虫(C.elegans)发育)；美国专利6,465,246(肿瘤发生)和美国专利6,461,807(通过修饰药物靶筛选药物)。
                     实施例22
         索戈托病毒包膜糖蛋白假型慢病毒载体
[00318]VSV-G已被广泛地用作为多种假型慢病毒载体的包膜糖蛋白。可是，VSV-G对细胞是毒性的。测试了索戈托病毒包膜糖蛋白对假型BIV载体的能力。将索戈托病毒糖蛋白编码序列(SEQ ID NO：68)作为平末端连接克隆到pCI表达质粒的XhoI位点处。对所得的构建体pCIThogotoGP进行DNA序列分析以确认构建体的完整性。然后通过用pCIgpSynSer(包装构建体)、pTracerA Rev(Rev表达构建体)、pBIVfinalvec(转移载体构建体)和pCIThogotoGP(索戈托病毒包膜糖蛋白表达构建体)通过实施例6.2(病毒载体生产)中所描述的方法共转染293T细胞产生BIV载体。检查由索戈托病毒包膜假型的BIV载体的滴度、稳定性和在多种人类和动物细胞包含人类原代细胞中的转导效率。进一步分别如实施例13和实施例14中所述测试载体转导视网膜细胞、神经元细胞的能力。
[00319]为增强索戈托病毒包膜糖蛋白在人类细胞中的表达效率，索戈托病毒包膜糖蛋白的编码序列被优化(重新编码)。重新编码的序列示于SEQ ID NO：70。
[00320]表达索戈托病毒包膜蛋白的细胞可用作为BIV载体的包装细胞系。
                      实施例23
           杆状病毒包膜蛋白假型慢病毒载体
[00321]可用于BIV载体系统的另一种病毒包膜是杆状病毒包膜蛋白。优选是来自于加利福尼亚病毒(Autographa Californica virus)的GP64。GP64区的DNA编码区通过本领域技术人员公知的技术克隆。将该编码序列克隆到与上文所述的BIV系统相容的表达构建体中。例如，将其克隆到pCi质粒中。这可以与实施例22中描述的索戈托病毒包膜或者Burns等(1993，PNAS.USA 90：8033-8037)用于VSV-G的相似的方式进行。
[00322]含GP64包膜的BIV病毒载体通过用pCIgpSynSer(包装构建体)、pTracerA Rev(Rev表达构建体)、pBIVfinalvec(转移载体构建体)和pCIGP64(杆状病毒包膜糖蛋白表达构建体)通过实施例6.2中描述的方法共转染293T细胞产生。
[00323]如实施例7中大致描述的那样，使用这种带GP64包膜的BIV病毒载体转导分裂和非分裂原代RPE(ARPE)和HUVEC细胞。结果示于表6。非分裂ARPE和HUVEC细胞都相对高效地被BIV载体转导，这说明由最小化的BIV包装及最小化的转移载体构建体产生的载体完全有能力介导分裂和非分裂细胞中的转基因表达。
                        表6
                        ARPE
载体                             eGFP阳性细胞百分比分裂                                          非分裂
    假的模拟侵染     0.1％(SD＝0.01)     0.12％(SD＝0.1)
    MLV病毒载体     88.2％(SD＝0.8)     0.62％(SD＝0.3)
    BIV病毒载体     93.3％(SD＝0.03)     93％(SD＝1.1)
                          HUVEC
载体                              eGFP阳性细胞百分比分裂                                          非分裂
    假的模拟侵染   0.12％(SD＝0.02)   0.11％(SD＝0.06)
    MLV病毒载体   55.3％(SD＝1.0)   0.6％(SD＝0.1)
    BIV病毒载体   66.9％(SD＝0.7)   53％(SD＝1.9)
[00324]并且，根据其耐受超速离心的能力，发现BIV-GP64颗粒是稳定的。
[00325]通过视网膜下注射，BIV-GP64也被注射到大鼠的视网膜下空间。这个发现提示P64假型BIV病毒载体可用于在体内转导视网膜色素上皮细胞。
[00326]表达杆状病毒包膜蛋白的细胞可用作为BIV载体的包装细胞系。
[00327]尽管在本专利申请中本发明是参照本发明优选实施方案的细节公开的，应当理解这种公开旨在举例说明，而并非限制性意义的，因为考虑到在本发明的精神和所附权利要求书的范围之内，本领域技术人员很容易想到修饰。
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tctcctatca gaggtaagga ggaggtggcc ataaaaaata ctctgaaggt tttctggtcc    960
ctgctggcgg ggtacaaacc agagagtaca gaaacggccc taggatattg ggaggccttt   1020
acatatagag aaagggaggc cagagctgat aaggaaggcg aaattaagag tatttaccct   1080
tccctaacac agaacacaca gaataagaag cagacatcga atcagacaaa cactcaatca   1140
ttaccagcta tcactactca agatggtact cctaggtttg atcctgacct catgaagcag   1200
cttaagatct ggtcagacgc cactgaaaga aatggggttg accttcatgc agtgaatata   1260
ttaggggtca ttacagcaaa cctagtacag gaagaaatta aactcctctt gaatagtaca   1320
cccaagtgga gattagatgt acaacttata gaatcaaaag taagagagaa agaaaatgcc   1380
cacagaacgt ggaaacagca tcatccagaa gccccaaaaa cagatgaaat catcggtaag   1440
gggcttagtt ctgctgaaca agccaccctg atctcagtag aatgcagaga aactttcaga   1500
cagtgggtgc tgcaggcagc tatggaggtg gcacaggcaa aacatgctac cccaggtccc   1560
atcaacattc atcagggacc caaggagccg tacacagact ttataaatag attagtggca   1620
gcccttgaag gtatggcggc tccagaaacc acaaaagaat acttactcca acatctatct   1680
attgatcatg ccaatgaaga ctgccagtct attctaagac ctttgggacc caacacccca   1740
atggagaaaa aattagaagc atgtagggta gtgggatctc agaaatcaaa gatgcaattt   1800
ttggtagcag ctatgaaaga aatggggatc caatcaccaa ttccagcagt cttgcctcac    1860
acaccagaag catatgcctc ccaaacctca gggcccgagg atggtaggag atgttacgga    1920
tgtgggaaga caggacattt gaagaggaat tgtaaacagc aaaaatgcta ccattgtggc    1980
aaacctggcc accaagcaag aaactgcagg tcaaaaaacg ggaagtgctc ctctgcccct    2040
tatgggcaga ggagccaacc acagaacaat tttcaccaga gcaacatgag ttctgtgacc    2100
ccatctgcac cccctcttat attagattag acaaacagcc ttttataaag gtgttcatag    2160
ggggaagatg ggtaaaaggg ttagtagaca ctggagcaga tgaggtagtg cttaagaaca    2220
tacattggga taggataaaa gggtatccag ggacaccaat taaacaaatt ggggtaaatg    2280
gagtaaatgt ggccaaaagg aagacccacg tagagtggag atttaaggat aagactggga    2340
taattgatgt cttgttctca gatactcctg taaacctttt tgggagatct cttctacgta    2400
gcatagtgac ttgcttcacc ctacttgttc acacagaaaa aatcgaaccc ctacccgtca    2460
aggtaagggg accagggcct aaggtacccc agtggccctt gacaaaagaa aagtatcagg    2520
ctcttaagga aattgtgaaa gatcttttag cagaaggaaa aatttccgaa gctgcttggg    2580
ataacccata taatacccca gtttttgtta taaagaaaaa gggaacggga agatggagga    2640
tgctaatgga ttttagggaa ttaaataaga taacagttaa aggacaagaa ttctctacag    2700
gcttacctta ccctccagga attaaggaat gtgaacactt aactgcaata gatataaaag    2760
atgcctactt tactatccct ttacatgagg actttagacc ctttacagcc ttctctgtag    2820
tccctgtaaa tcgagaagga cctatagaga ggttccagtg gaatgttcta ccacaaggat    2880
gggtatgtag ccctgccatt tatcagacta ccacccagaa gattatagaa aacattaaaa    2940
agagtcaccc agatgtcatg ttgtatcaat atatggatga tttgttgatt gggtctaata    3000
gggatgatca taagcaaata gtgcaggaaa tcagggataa gttaggatca tatggtttca    3060
agactccaga tgaaaaggtc caggaagaga gagtgaaatg gatcggtttt gagctcacac    3120
ccaagaaatg gcgttttcag cccaggcaac taaagataaa aaacccactc acagtaaatg    3180
aattacagca attagtaggt aattgtgttt gggtacagcc agaagtaaaa atccctctat    3240
accccttaac cgatctactg agggataaga ccaatctcca agaaaagata caactaacac    3300
cagaagccat caagtgtgta gaagaattca atctaaaact aaaagatcca gaatggaaag    3360
atagaataag agaaggagca gaattagtca taaaaataca gatggttcct cggggcatag    3420
tatttgatct gttgcaagat ggaaatccca tatggggagg agtaaaagga ctaaattatg    3480
atcattcaaa caaaataaaa aagatactta gaactatgaa tgagctgaac agaacagtgg    3540
taattatgac aggaagagaa gctagtttcc tgcttcctgg gtcttctgaa gattgggaag    3600
cggcactcca gaaggaagaa agtctaacac aaatattccc agtaaagttt tataggcact    3660
cctgcagatg gacctccata tgtgggccag taagagaaaa tctaaccacc tactatactg    3720
acggagggaa gaaagggaaa acagctgcag cagtatattg gtgtgaagga aggactaagt    3780
caaaggtatt tccaggaacc aatcaacagg cggaattgaa ggccatatgc atggctctct    3840
tggatggacc accaaaaatg aatatcataa cagatagtag atacgcctat gagggaatga    3900
gagaagaacc agaaacgtgg gccagggaag gaatctggct ggagattgcc aagatattgc    3960
cctttaagca gtacgtgggg gtcgggtggg tgcctgcaca taaagggata ggaggaaata    4020
cagaggcaga tgaaggagtt aagaaagcct tagaacagat ggccccgtgt agccctcctg    4080
aggccattct attaaaacca ggagaaaaac aaaatctgga gacagggatc tacatgcagg    4140
ggcttagacc acaaagcttc ctcccaagag cagacttacc agtagccatc acaggaacca    4200
tggtagattc agagctacag ctacagctac ttaacatagg aactgagcat ataagaatcc    4260
aaaaagatga ggtcttcatg acctgtttcc tagaaaatat cccctcagcc actgaagatc    4320
atgagagatg gcatacctca ccagacattt tggttaggca gttccatctc cctaagagaa    4380
tagctaaaga gatagtagcc agatgccaag aatgtaaaag gacaaccact agcccagtca    4440
gaggaacaaa ccccagaggt cgattcttat ggcagatgga caatactcac tggaataaaa    4500
caattatttg ggtagcagta gagacaaatt caggattagt ggaagctcag gtgatccctg    4560
aagaaacagc actacaagta gctctctgca ttttacagct aatccagaga tatacagttc    4620
ttcacttaca tagtgacaac gggccgtgct ttactgcaca caggatagaa aatctatgta    4680
agtatctggg gatcacaaaa actacgggaa taccctacaa cccacaatcc cagggagttg    4740
tagaaagagc ccacagagat ctaaaagaca gattggcagc ttatcaggga gattgtgaaa    4800
ccgtagaagc agcccttagc ctcgcattag tttctttaaa taaaaaaaga gggggaatag    4860
ggggccatac accatatgaa atatacctag aatcagaaca taccaaatac caagaccaac    4920
tagaacaaca attttcaaaa caaaaaattg aaaagtggtg ttacgtaagg aacagaagaa    4980
aggaatggaa aggaccctac aaagtgttgt gggacggaga cggggcagca gtaatagagg    5040
aagagggaaa aacagcctta tatccacacc gtcatatgcg cttcatcccc cccccagatt    5100
cagatatcca agatgggagt tcgtgaggca gacagaatac agcatgaccg cgtgcgtaag    5160
aaaagggaaa ttagtcctta cttaccagta cgcgatctgg aaaagagtct ggacgataga    5220
aacaggattt acagatccaa gtctgtttat gaccccagct ggaacacaca ccactgaaga    5280
aataggtcac ttagatctct tttggcttag gtactgttca tgtccgcatg agatgccccc    5340
gtggctagac ttccttagag gcaccctcaa tctacgcatt tcctgtcgac gcgctcttca   5400
agcgtcagtg ttgactagca cccctagaca ctccctccaa cgcttagctg cacttcagct   5460
gtgcactaac gcatgtctct gttggtaccc gttaggacgc atcaacgaca ccaccccgtt   5520
gtggttgaac ttttcgtctg ggaaggaacc aacgatccaa caactgagtg gccaccccta   5580
actcgtcgta acattcatag attgtggcaa tatgcccgga ccttgggtgg cgatgataat   5640
gttgccacag cccaaagaaa gctttggagg aaagccaatt ggctggcttt tctggaacac   5700
gtgcaaagga cctaggcggg actgtccaca ttgttgttgt cccatatgta gttggcattg   5760
tcagctttgc tttttgcaga aaaatctagg aatcaactat ggatcaggac ctagacggcg   5820
cggaacgcgg ggaaagggga ggaggatccg aagaactgct tcaggaggag atcaacgaag   5880
ggaggctgac agccagagaa gctttacaaa catggatcaa taacggtgag atccaccctt   5940
gggtcctggc aggaatgctg tccatgggag taggaatgct actaggagta tattgtcagt   6000
taccagacac actgatttgg atactaatgt ttcaattatg cctttattgg ggtttgggtg   6060
aaacatctag agaattagac aaggatagtt ggcagtgggt cagaagtgta tttataatag   6120
caatattggg aactctcact atggcaggaa ctgctttggc cgacgacgat caaagtactt   6180
taatccccaa tatcacaaaa attcctacaa aggacacgga acccggttgc acctatccgt   6240
ggatattaat cctcttgatt ttggctttca tactgggaat tctgggtata atacttgtct   6300
tgagacgcag caactcggag gatatattgg cagccagaga taccatagat tggtggctct   6360
cagctaatca ggaaatacct ccaaagtttg ctttcccaat aatattaata tcttcccctc   6420
tagcaggcat aataggatat tatgtcatgg aaaggcactt agagatcttc aaaaagggat   6480
gtcaaatttg tgggagcctg agcagcatgt ggggaatgct tttggaagaa attggcaggt   6540
ggctcgcacg tagggaatgg aatgttagta gagtaatggt tatcctctta atcagcttca   6600
gttggggaat gtatgtcaat agggtaaatg cctcagggtc acatgtagcc atggtcacca   6660
gccctccagg gtaccgcata gtgaatgata ccagccaggc accttggtat tgcttctcct   6720
cggcaccaat cccaacgtgt agttcctctc agtggggaga caaatatttt gaggagaaaa   6780
taaacgagac actggtcaaa caggtgtatg aacaggccgc gaaacattcg agagccacat   6840
ggattgaacc tgatctattg gaggaagcag tctatgagct agctctgtta tcagctaatg   6900
acagtcgtca ggtggtggta gaaaatggta cagacgtatg tagctcacag aactcgagca   6960
caaacaaagg ccacccaatg acgcttctaa agttgagagg gcaggtgtca gaaacttgga   7020
tagggaattc ctccctccag ttttgtgtcc agtggccata tgtcttggta ggtcttaata   7080
atagtgatag taatattagc ttcaattcgg gagattggat agcaaccaat tgtatgcacc   7140
caattacact aaataaaagt gcacaagatc taggaaaaaa ttttccgaga ctaacatttc   7200
ttgacggaca actgtcccag ttgaagaaca cactgtgcgg acataacaca aactgtttga   7260
aatttggaaa caagtccttc agtacaaatt ccctaatact atgccaagac aaccccatcg   7320
gcaacgacac cttttatagc ctaagtcatt ccttctcaaa acaggcctct gcccggtgga   7380
ttcttgtaaa ggtccccagc tatgggtttg tggtagtaaa tgacacagat acaccaccat   7440
ccctccgcat ccgaaagcct cgagcagtcg gactagcaat attcctgctt gtgctggcta   7500
tcatggccat cacatcctcc ttggtggcag ctacaacgct cgtgaaccag cacacgacgg   7560
ctaaggttgt ggagagggtt gtgcaaaatg tgtcatatat tgctcaaacc caggaccaat   7620
tcacccacct gttcaggaat ataaacaaca gattaaatgt cctacaccat agagtttcat   7680
acttggagta tgtagaggaa atcagacaaa aacaagtatt ctttggttgc aaacctcatg   7740
gaaggtattg ccactttgac tttggaccag aggaagttgg atggaacaat agttggaata   7800
gcaaaacttg gaatgatcta caagatgagt atgataagat agaagaaaaa atattaaaaa   7860
ttcgagtgga ctggctcaat agctccctga gtgacacaca ggacaccttt ggcctggaga   7920
cctctatttt tgaccattta gtgcaattgt ttgattggac ttcttggaaa gactggataa   7980
aaatcattat agtaatcatt gtactttggc ttctgataaa gattctccta ggtatgttaa   8040
gaagctgcgc caaggtcagc cagaattacc aacatctccc ggcggaggag gaggacgggg   8100
acacagagcc agaaagctcc ccggcgagag gagacccggc ttctggaagt ctctacgaga   8160
attggttgaa caaaatagga gaaagcaaga acgacgccta tcgggtctgg acagaagaat   8220
acaacagctt gaggatcttg ttcgccacat gtcgctggga tctcctgacc cctcaactcc   8280
ttcagcttcc gttctttctg ttaaccctcc tgctcaaact cctttgggac atcttccgcc   8340
acgctcctat tttaaactta aaagggtgga ctgtggggca gggtgggacc tcaggacaac   8400
agcagccccc ggacttccca tatgtgaatt ggactggatc cagggaacaa aataacccag   8460
aagggggatt agactctggg gcttggtatg aaggcctgag aggttctcag tagattgtaa   8520
gtcttcggcg agactgcatg tctgcacgta gacaggaaat gtttatcttc tcagctgatt   8580
gtggttaggc cgattactgg aaactagaca acctgattca ttagtggtta agattatgca   8640
taagtgctcg caatgatgta gctgcttacg cttgcttact ccgccctgaa acgcctacct   8700
taacacgcaa cacgcccacc tgtaagaata tataaaccat atcttcactc tgtacttcag   8760
ctcgtgtagc tcattagctc cgagctcccc aacctacagc ctgagaggca ctggctcggt   8820
tgggtagcca gcctttcggg taataaaggc ttgttggcat tcggcatcta cccgtgcctc   8880
ctgtcttgtc ttactcgagc gaacccacaa ctccgtcctg ctgagctcac agctcgcggg    8940
gcggtgaaga acacccaaca                                                8960
<210>  2
<211>  32
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  引物：RRE65′NotI
<400>  2
aaagcggccg ctccggtgga  ttcttgtaaa gg                                 32
<210>  3
<211>  33
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  引物：RRE63′NotI
<400>  3
aaagcggccg cggcgcctcc aagtatgaaa ctc                                 33
<210>  4
<211>  36
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  引物：Rev15Af13
<400>  4
ggacgcgtcg actctagatc taggaatcaa ctatgg                              36
<210>  5
<211>  40
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  引物：Rev23Age12
<400>  5
tttaccggtc gcgagcttag cttacaatct actgagaacc                          40
<210>  6
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  引物：Rev155868
<400>  6
gttctagatg gctggctttt ctgg                                           24
<210>  7
<211>  25
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  引物：Rev13
<400>  7
gagaatcgtt attgatccat gtttg                                          25
<210>  8
<211>  28
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  引物：Rev25
<400>  8
ggatcaataa cgattctcct aggtatgt                                       28
<210>  9
<211>  26
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  引物：Rev237526
<400>  9
ttactagtgg ttattttgtt ccctgg                                        26
<210>  10
<211>  561
<212>  DNA
<213>  牛免疫缺陷病毒
<220>
<221>  misc_feature
<223>  Rev gene
<400>  10
atggatcagg acctagacgg cgcggaacgc ggggaaaggg gaggaggatc cgaagaactg     60
cttcaggagg agatcaacga agggaggctg acagccagag aagctttaca aacatggatc    120
aataacgatt ctcctaggta tgttaagaag ctgcgccaag gtcagccaga attaccaaca    180
tctcccggcg gaggaggagg acggggacac agagccagaa agctccccgg cgagaggaga    240
cccggcttct ggaagtctct acgagaattg gttgaacaaa ataggagaaa gcaagaacga    300
cgcctatcgg gtctggacag aagaatacaa cagcttgagg atcttgttcg ccacatgtcg    360
ctgggatctc ctgacccctc aactccttca gcttccgttc tttctgttaa ccctcctgct    420
caaactcctt tgggacatct tccgccacgc tcctatttta aacttaaaag ggtggactgt    480
ggggcagggt gggacctcag gacaacagca gcccccggac ttcccatatg tgaattggac    540
tggatccagg gaacaaaata a                                              561
<210>  11
<211>  48
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  引物WPRE5
<400>  11
gagctgtaca agtaaagcgg ccaaccctcc tgcagaaact cctttggg                 48
<210>  12
<211>  29
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  引物：WPRE3
<400>  12
ggaacaaaag ctgggtaccg ggccccccc                                      29
<210>  13
<211>  33
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  引物：RRE1
<400>  13
gttggcgccc aacgtggggc tcgagtaaga gag                                 33
<210>  14
<211>  27
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  引物：RRE2
<400>  14
agatctgaat tctaagtgac ctatttc                                        27
<210>  15
<211>  29
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  引物：RRE3
<400>  15
gaattcagat cttatgggaa tgaaagacc                                      29
<210>  16
<211>  27
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  引物：RRE4
<400>  16
aactgctgag ggcgggaccg catctgg                                        27
<210>  17
<211>  30
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  PCR引物：5′GAGRRE1
<400>  17
ggcgaattcg atctaggaaa aaattttccg                                     30
<210>  18
<211>  27
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  PCR引物3′GAGRRE1
<400>  18
ggaagatctc cacaaaccca tagctgg                                        27
<210>  19
<211>  22
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  PCR引物5′GAGRRE2
<400>  19
cccgaattca aaggtcccca gc                                             22
<210>  20
<211>  25
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  PCR引物3′GAGRRE2
<400>  20
ggaagatctc tctatggtgt aggac                                          25
<210>  21
<211>  26
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  PCR引物5′GAGRRE3
<400>  21
ccggaattcg agtttcatac ttggag                                         26
<210>  22
<211>  23
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  PCR引物：3′GAGRRE3
<400>  22
ggaagatctt gcactaaatg gtc                                            23
<210>  23
<211>  23
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  PCR引物：5′GAGRRE4
<400>  23
ccggaattcc ctaatactat gcc                                            23
<210>  24
<211>  25
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  PCR引物3′GAGRRE4
<400>  24
ggaagatctc ttagccgtcg tgtgc                                          25
<210>  25
<211>  26
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  PCR引物5′GAGRRE5
<400>  25
ggcgaattcg ggttgtgcaa aatgtg                                         26
<210>  26
<211>  25
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  PCR引物：3′GAGRRE5
<400>  26
cctagatctc attccaagtt ttgct                                          25
<210>  27
<211>  26
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  PCR引物5′GAGRRE6
<400>  27
ccggaattcg tggattcttg taaagg                                         26
<210>  28
<211>  26
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  PCR引物3′GAGRRE6
<400>  28
ggaagatctc tccaagtatg aaactc                                         26
<210>  29
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  PCR引物5′GAGRRE7
<400>  29
ccagaattcc accaccatcc ctcc                                           24
<210>  30
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  PCR引物3′GAGRRE7
<400>  30
ggaagatctc aaccaaagaa tact                                           24
<210>  31
<211>  26
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  PCR引物NRS1
<400>  31
aacagttggc gcccaacgtg gggctc                                         26
<210>  32
<211>  34
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  PCR引物NRS2
<400>  32
atgcatcacg tgggtgtcac cctaacctta cgaa                                34
<210>  33
<211>  33
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  PCR引物NRS3
<400>  33
cacgtgatgc atcgatctaa aagacagatt ggc                                 33
<210>  34
<211>  29
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  PCR引物NRS4
<400>  34
cataagatct gaattcaatg atctaagtg                                      29
<210>  35
<211>  36
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  PCR引物NRS32
<400>  35
atgcatcacg tgattctaat ggcccattga agattc                              36
<210>  36
<211>  33
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  PCR引物NRS33
<400>  36
cacgtgatgc atcgatctaa aagacagatt ggc                                 33
<210>  37
<211>  31
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  QuickChange反应引物：KOATAG正向
<400>  37
gcgtgttttc cccggggtga agagaaggga g                                   31
<210>  38
<211>  31
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  QuickChange反应引物：KOATAG反向
<400>  38
ctcccttctc ttcaccccgg ggaaaacacg c                                    31
<210>  39
<211>  210
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  BIV包装信号序列
<400>  39
gttggcgccc aacgtggggc tgagtaagag agactcggct cgagtaaaag aagacccagc     60
tcgaacgaga agactccgga caggtgagta gttgcgtgtt ttccccgggg tgaagagaag    120
ggagttagaa aagaagcttc gtaaggttag ggtgacaccc caacaggata aatattatac    180
tatagggaat  cttcaatggg ccattagaat                                    210
<210>  40
<211>  312
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  312bp的BIV env序列含有BIV RRE序列
<400>  40
gtggattctt gtaaaggtcc ccagctatgg gtttgtggta gtaaatgaca cagatacacc    60
accatccctc cgcatccgaa agcctcgagc agtcggacta gcaatattcc tgcttgtgct    120
ggctatcatg gccatcacat cctccttggt ggcagctaca acgctcgtga accagcacac    180
gacggctaag gttgtggaga gggttgtgca aaatgtgtca tatattgctc aaacccagga    240
ccaattcacc cacctgttca ggaatataaa caacagatta aatgtcctac accatagagt    300
ttcatacttg ga                                                        312
<210>  41
<211>  7
<212>  RNA
<213>  禽肉瘤/白血病病毒
<400>  41
aaauuua                                                               7
<210>  42
<211>  7
<212>  RNA
<213>  人免疫缺陷病毒
<400>  42
uuuuuua                                                               7
<210>  43
<211>  7
<212>  RNA
<213>  鼠哺乳动物肿瘤病毒
<400>  43
aaaaaac                                                               7
<210>  44
<211>  7
<212>  RNA
<213>  猫免疫缺陷病毒
<400>  44
gggaaac                                                               7
<210>  45
<211>  7
<212>  DNA
<213>  牛免疫缺陷病毒
<400>  45
caaaaat                                                               7
<210>  46
<211>  7
<212>  DNA
<213>  牛免疫缺陷病毒
<400>  46
aaaaaac                                                               7
<210>  47
<211>  48
<212>  DNA
<213>  牛免疫缺陷病毒
<400>  47
aaaaaacggg aagtgctcct ctgcccctta tgggcagagg agccaacc                  48
<210>  48
<211>  48
<212>  RNA
<213>  牛免疫缺陷病毒
<400>  48
aaaaaacggg aagugcuccu cugccccuua ugggcagagg agccaacc                  48
<210>  49
<211>  4427
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  重新编码的BIV gag/pol的DNA序列
<400>  49
atgaagcgga gagagctgga gaagaaactg aggaaagtgc gcgtgacacc tcaacaggac    60
aagtactata ccatcggcaa cctgcagtgg gccatccgca tgatcaacct gatgggcatc    120
aagtgcgtgt gcgacgagga atgcagcgcc gctgaggtcg ccctgatcat cacccagttt    180
agcgccctcg acctggagaa ctcccctatc cgcggcaagg aagaggtggc catcaagaat    240
accctgaagg tgttttggag cctgctggcc ggatacaagc ctgagagcac cgagaccgcc    300
ctgggatact gggaagcctt cacctacaga gagagggaag ctagagccga caaggaggga    360
gagatcaaga gcatctaccc tagcctgacc cagaacaccc agaacaagaa acagaccagc    420
aatcagacaa acacccagag cctgcccgct atcaccacac aggatggcac ccctcgcttc    480
gaccccgacc tgatgaagca gctgaagatc tggtccgatg ccacagagcg caatggagtg    540
gacctgcatg ccgtgaacat cctgggagtg atcacagcca acctggtgca agaagagatc    600
aagctcctgc tgaatagcac acccaagtgg cgcctggacg tgcagctgat cgagagcaaa    660
gtgagagaga aggagaacgc ccaccgcacc tggaagcagc atcaccctga ggctcccaag    720
acagacgaga tcattggaaa gggactgagc tccgccgagc aggctaccct gatcagcgtg    780
gagtgcagag agaccttccg ccagtgggtg ctgcaggctg ccatggaggt cgcccaggct    840
aagcacgcca cacccggacc tatcaacatc catcaaggcc ctaaggaacc ctacaccgac    900
ttcatcaacc gcctggtggc tgccctggaa ggaatggccg ctcccgagac cacaaaggag    960
tacctcctgc agcacctgag catcgaccac gccaacgagg actgtcagtc catcctgcgc   1020
cctctgggac ccaacacacc tatggagaag aaactggagg cctgtcgcgt ggtgggaagc   1080
cagaagagca agatgcagtt cctggtggcc gctatgaagg aaatggggat ccagtctcct   1140
attccagccg tgctgcctca cacacccgaa gcctacgcct cccaaacctc agggcccgag   1200
gatggtagga gatgttacgg atgtgggaag acaggacatt tgaagaggaa ttgtaaacag   1260
caaaaatgct accattgtgg caaacctggc caccaagcaa gaaactgcag gtcaaaaaac   1320
gggaagtgct cctctgcccc ttatgggcag aggagccaac cacagaacaa ttttcaccag   1380
agcaacatga gttctgtgac cccatctgca ccccctctta tattagatta gacaaacagc   1440
cttttataaa ggtgttcatt ggcggccgct gggtgaaggg actggtggac acaggcgctg   1500
acgaggtggt gctgaagaac atccactggg accgcatcaa aggctaccct ggaacaccca   1560
tcaagcagat cggcgtgaac ggcgtgaacg tggctaagcg caaaacacat gtggagtgga   1620
gattcaaaga caagaccggc atcattgacg tcctcttcag cgacacacct gtgaacctgt   1680
ttggcagaag cctgctcaga tccatcgtga cctgctttac cctgctggtg cacaccgaga   1740
agatcgagcc actgcctgtg aaggtgcgcg gccctggacc taaggtgcca caatggcccc   1800
tgaccaagga gaaataccag gccctgaagg agatcgtgaa ggacctgctg gccgagggaa   1860
agatcagcga agctgcctgg gacaaccctt acaacacacc cgtgttcgtg atcaagaaga   1920
aaggcaccgg ccgctggcgc atgctgatgg acttccgcga gctgaataag atcaccgtga   1980
aaggccaaga gttcagcaca ggactccctt atccacccgg catcaaggag tgtgagcacc   2040
tgaccgccat cgacatcaag gacgcctact tcaccatccc tctgcacgag gacttcagac   2100
ccttcacagc cttcagcgtg gtcccagtga accgcgaggg ccccatcgag cgcttccagt   2160
ggaacgtcct gcctcaaggc tgggtgtgct cccctgccat ctaccagacc acaacccaga   2220
agatcattga gaacatcaag aagagccatc ccgacgtgat gctgtatcag tacatggatg   2280
acctcctgat tggcagcaat cgcgatgacc acaagcagat cgtgcaggag atcagagaca   2340
agctgggcag ctatggcttc aagacacccg acgagaaagt gcaggaagag cgcgtgaagt   2400
ggatcggctt cgagctgaca cctaagaaat ggagattcca gcctaggcaa ctgaagatca   2460
agaacccact gaccgtgaac gaactccagc agctggtcgg caactgtgtg tgggtgcagc   2520
ccgaggtgaa gatccctctg tacccactga ccgatctgct ccgcgacaag accaacctgc   2580
aggaaaagat ccagctgaca cccgaggcca tcaagtgcgt ggaagagttc aacctgaagc   2640
tgaaagatcc cgagtggaag gacagaattc gcgaaggagc cgagctggtg atcaagatcc   2700
aaatggtccc tcgcggcatc gtgttcgacc tgctgcaaga cggcaatcct atctggggag   2760
gcgtgaaagg actgaactac gaccacagca acaagatcaa gaagatcctg cgcaccatga   2820
acgagctgaa ccgcaccgtg gtgatcatga ccggacgcga agctagcttt ctcctgcctg   2880
gatccagcga ggattgggag gccgccctgc agaaggaaga gagcctgacc caaatctttc   2940
ccgtgaagtt ctaccgccat agctgtagat ggacaagcat ctgtggaccc gtccgcgaga   3000
acctgaccac ctactatacc gacggcggga agaaaggaaa gacagctgcc gcagtgtact   3060
ggtgtgaagg aagaactaag agcaaagtgt tccctggaac caatcaacag gctgagctga   3120
aggcaatctg catggctctg ctggacggac ctcccaagat gaacatcatc accgacagcc   3180
gctacgctta tgagggcatg agagaggaac ctgagacctg ggctcgcgag ggcatctggc   3240
tggagattgc aaagatcctg ccattcaagc aatacgtcgg agtgggctgg gtccctgctc   3300
acaaaggcat tggaggcaat accgaggctg acgaaggagt gaagaaagcc ctggagcaaa   3360
tggcaccatg ttcccctccc gaggctatcc tgctcaaacc tggcgagaag caaaacctgg   3420
agaccggcat ctacatgcaa ggcctgagac ctcagagctt cctgccccgc gctgacctcc   3480
ctgtcgcaat cactggcacc atggtggact ccgagctgca gctccaactg ctgaacatcg   3540
gcaccgagca cattcgcatc cagaaggacg aggtgttcat gacatgcttc ctggagaaca   3600
tccctagcgc caccgaagac cacgagagat ggcacacatc cccagacatc ctggtccgcc   3660
agttccacct gcccaagcgc atcgccaagg agatcgtcgc ccgctgccag gagtgcaaga   3720
gaaccacaac ctccccagtg cgcggcacca accctagagg acgcttcctg tggcagatgg   3780
acaacacaca ctggaacaaa accatcattt gggtcgcagt ggagactaac agcggactgg   3840
tggaggctca ggtgattccc gaagagaccg cactgcaagt ggccctgtgt atcctccagc   3900
tgatccaacg ctacaccgtc ctgcacctgc acagcgacaa cggaccctgc ttcacagctc   3960
accgcatcga gaacctgtgc aagtacctgg gcatcaccaa gacaaccggc attccctaca   4020
atcctcagag ccaaggagtc gtggaaagag cccatcgcga cctgaaggac agactggctg    4080
cctatcaagg cgactgcgag accgtggaag ctgcactgag cctcgccctg gtcagcctga    4140
acaagaagag aggaggcatc ggcggacaca caccctacga gatctatctg gagagcgagc    4200
acaccaagta tcaggaccaa ctggagcagc aattcagcaa gcagaagatc gagaaatggt    4260
gctacgtccg caacagacgc aaggagtgga agggccctta caaggtgctg tgggatggcg    4320
acggagctgc agtgatcgag gaagagggca agaccgctct gtatccccac cggcacatgc    4380
gcttcatccc acctcccgac agcgatatcc aggacggctc cagctga                  4427
<210>  50
<211>  3108
<212>  DNA
<213>  牛免疫缺陷病毒
<220>
<221>  misc_feature
<223>  BIV Pol DNA序列
<400>  50
cgggaagtgc tcctctgccc cttatgggca gaggagccaa ccacagaaca attttcacca     60
gagcaacatg agttctgtga ccccatctgc accccctctt atattagatt agacaaacag    120
ccttttataa aggtgttcat agggggaaga tgggtaaaag ggttagtaga cactggagca    180
gatgaggtag tgcttaagaa catacattgg gataggataa aagggtatcc agggacacca    240
attaaacaaa ttggggtaaa tggagtaaat gtggccaaaa ggaagaccca cgtagagtgg    300
agatttaagg ataagactgg gataattgat gtcttgttct cagatactcc tgtaaacctt    360
tttgggagat ctcttctacg tagcatagtg acttgcttca ccctacttgt tcacacagaa    420
aaaatcgaac ccctacccgt caaggtaagg ggaccagggc ctaaggtacc ccagtggccc    480
ttgacaaaag aaaagtatca ggctcttaag gaaattgtga aagatctttt agcagaagga    540
aaaatttccg aagctgcttg ggataaccca tataataccc cagtttttgt tataaagaaa    600
aagggaacgg gaagatggag gatgctaatg gattttaggg aattaaataa gataacagtt    660
aaaggacaag aattctctac aggcttacct taccctccag gaattaagga atgtgaacac    720
ttaactgcaa tagatataaa agatgcctac tttactatcc ctttacatga ggactttaga    780
ccctttacag ccttctctgt agtccctgta aatcgagaag gacctataga gaggttccag    840
tggaatgttc taccacaagg atgggtatgt agccctgcca tttatcagac taccacccag    900
aagattatag aaaacattaa aaagagtcac ccagatgtca tgttgtatca atatatggat    960
gatttgttga ttgggtctaa tagggatgat cataagcaaa tagtgcagga aatcagggat   1020
aagttaggat catatggttt caagactcca gatgaaaagg tccaggaaga gagagtgaaa   1080
tggatcggtt ttgagctcac acccaagaaa tggcgttttc agcccaggca actaaagata   1140
aaaaacccac tcacagtaaa tgaattacag caattagtag gtaattgtgt ttgggtacag   1200
ccagaagtaa aaatccctct atacccctta accgatctac tgagggataa gaccaatctc   1260
caagaaaaga tacaactaac accagaagcc atcaagtgtg tagaagaatt caatctaaaa   1320
ctaaaagatc cagaatggaa agatagaata agagaaggag cagaattagt cataaaaata   1380
cagatggttc ctcggggcat agtatttgat ctgttgcaag atggaaatcc catatgggga   1440
ggagtaaaag gactaaatta tgatcattca aacaaaataa aaaagatact tagaactatg   1500
aatgagctga acagaacagt ggtaattatg acaggaagag aagctagttt cctgcttcct   1560
gggtcttctg aagattggga agcggcactc cagaaggaag aaagtctaac acaaatattc   1620
ccagtaaagt tttataggca ctcctgcaga tggacctcca tatgtgggcc agtaagagaa   1680
aatctaacca cctactatac tgacggaggg aagaaaggga aaacagctgc agcagtatat   1740
tggtgtgaag gaaggactaa gtcaaaggta tttccaggaa ccaatcaaca ggcggaattg   1800
aaggccatat gcatggctct cttggatgga ccaccaaaaa tgaatatcat aacagatagt   1860
agatacgcct atgagggaat gagagaagaa ccagaaacgt gggccaggga aggaatctgg   1920
ctggagattg ccaagatatt gccctttaag cagtacgtgg gggtcgggtg ggtgcctgca   1980
cataaaggga taggaggaaa tacagaggca gatgaaggag ttaagaaagc cttagaacag   2040
atggccccgt gtagccctcc tgaggccatt ctattaaaac caggagaaaa acaaaatctg   2100
gagacaggga tctacatgca ggggcttaga ccacaaagct tcctcccaag agcagactta   2160
ccagtagcca tcacaggaac catggtagat tcagagctac agctacagct acttaacata   2220
ggaactgagc atataagaat ccaaaaagat gaggtcttca tgacctgttt cctagaaaat   2280
atcccctcag ccactgaaga tcatgagaga tggcatacct caccagacat tttggttagg   2340
cagttccatc tccctaagag aatagctaaa gagatagtag ccagatgcca agaatgtaaa   2400
aggacaacca ctagcccagt cagaggaaca aaccccagag gtcgattctt atggcagatg   2460
gacaatactc actggaataa aacaattatt tgggtagcag tagagacaaa ttcaggatta    2520
gtggaagctc aggtgatccc tgaagaaaca gcactacaag tagctctctg cattttacag    2580
ctaatccaga gatatacagt tcttcactta catagtgaca acgggccgtg ctttactgca    2640
cacaggatag aaaatctatg taagtatctg gggatcacaa aaactacggg aataccctac    2700
aacccacaat cccagggagt tgtagaaaga gcccacagag atctaaaaga cagattggca    2760
gcttatcagg gagattgtga aaccgtagaa gcagccctta gcctcgcatt agtttcttta    2820
aataaaaaaa gagggggaat agggggccat acaccatatg aaatatacct agaatcagaa    2880
cataccaaat accaagacca actagaacaa caattttcaa aacaaaaaat tgaaaagtgg    2940
tgttacgtaa ggaacagaag aaaggaatgg aaaggaccct acaaagtgtt gtgggacgga    3000
gacggggcag cagtaataga ggaagaggga aaaacagcct tatatccaca ccgtcatatg    3060
cgcttcatcc cccccccaga ttcagatatc caagatggga gttcgtga                 3108
<210>  51
<211>  1035
<212>  pRT
<213>  牛免疫缺陷病毒
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<223>  BIV Pol氨基酸序列
<400>  51
Arg Glu Val Leu Leu Cys Pro Leu Trp Ala Glu Glu Pro Thr Thr Glu
1               5                   10                  15
Gln Phe Ser Pro Glu Gln His Glu Phe Cys Asp Pro Ile Cys Thr Pro
            20                  25                  30
Ser Tyr Ile Arg Leu Asp Lys Gln Pro Phe Ile Lys Val Phe Ile Gly
        35                  40                  45
Gly Arg Trp Val Lys Gly Leu Val Asp Thr Gly Ala Asp Glu Val Val
    50                  55                  60
Leu Lys Asn Ile His Trp Asp Arg Ile Lys Gly Tyr Pro Gly Thr Pro
65                  70                  75                  80
Ile Lys Gln Ile Gly Val Asn Gly Val Asn Val Ala Lys Arg Lys Thr
                85                  90                  95
His Val Glu Trp Arg Phe Lys Asp Lys Thr Gly Ile Ile Asp Val Leu
            100                 105                 110
Phe Ser Asp Thr Pro Val Asn Leu Phe Gly Arg Ser Leu Leu Arg Ser
        115                 120                 125
Ile Val Thr Cys Phe Thr Leu Leu Val His Thr Glu Lys Ile Glu Pro
    130                 135                 140
Leu Pro Val Lys Val Arg Gly Pro Gly Pro Lys Val Pro Gln Trp Pro
145                 150                 155                 160
Leu Thr Lys Glu Lys Tyr Gln Ala Leu Lys Glu Ile Val Lys Asp Leu
                165                 170                 175
Leu Ala Glu Gly Lys Ile Ser Glu Ala Ala Trp Asp Asn Pro Tyr Asn
            180                 185                 190
Thr Pro Val Phe Val Ile Lys Lys Lys Gly Thr Gly Arg Trp Arg Met
        195                 200                 205
Leu Met Asp Phe Arg Glu Leu Asn Lys Ile Thr Val Lys Gly Gln Glu
    210                 215                 220
Phe Ser Thr Gly Leu Pro Tyr Pro Pro Gly Ile Lys Glu Cys Glu His
225                 230                 235                 240
Leu Thr Ala Ile Asp Ile Lys Asp Ala Tyr Phe Thr Ile Pro Leu His
                245                 250                 255
Glu Asp Phe Arg Pro Phe Thr Ala Phe Ser Val Val Pro Val Asn Arg
            260                 265                 270
Glu Gly Pro Ile Glu Arg Phe Gln Trp Asn Val Leu Pro Gln Gly Trp
        275                 280                 285
Val Cys Ser Pro Ala Ile Tyr Gln Thr Thr Thr Gln Lys Ile Ile Glu
    290                 295                 300
Asn Ile Lys Lys Ser His Pro Asp Val Met Leu Tyr Gln Tyr Met Asp
305                 310                 315                 320
Asp Leu Leu Ile Gly Ser Asn Arg Asp Asp His Lys Gln Ile Val Gln
                325                 330                 335
Glu Ile Arg Asp Lys Leu Gly Ser Tyr Gly Phe Lys Thr Pro Asp Glu
            340                 345                 350
Lys Val Gln Glu Glu Arg Val Lys Trp Ile Gly Phe Glu Leu Thr Pro
        355                 360                 365
Lys Lys Trp Arg Phe Gln Pro Arg Gln Leu Lys Ile Lys Asn Pro Leu
    370                 375                 380
Thr Val Asn Glu Leu Gln Gln Leu Val Gly Asn Cys Val Trp Val Gln
385                 390                 395                 400
Pro Glu Val Lys Ile Pro Leu Tyr Pro Leu Thr Asp Leu Leu Arg Asp
                405                 410                 415
Lys Thr Asn Leu Gln Glu Lys Ile Gln Leu Thr Pro Glu Ala Ile Lys
            420                 425                 430
Cys Val Glu Glu Phe Asn Leu Lys Leu Lys Asp Pro Glu Trp Lys Asp
        435                 440                 445
Arg Ile Arg Glu Gly Ala Glu Leu Val Ile Lys Ile Gln Met Val Pro
    450                 455                 460
Arg Gly Ile Val Phe Asp Leu Leu Gln Asp Gly Asn Pro Ile Trp Gly
465                 470                 475                 480
Gly Val Lys Gly Leu Asn Tyr Asp His Ser Asn Lys Ile Lys Lys Ile
                485                 490                 495
Leu Arg Thr Met Asn Glu Leu Asn Arg Thr Val Val Ile Met Thr Gly
            500                 505                 510
Arg Glu Ala Ser Phe Leu Leu Pro Gly Ser Ser Glu Asp Trp Glu Ala
        515                 520                 525
Ala Leu Gln Lys Glu Glu Ser Leu Thr Gln Ile Phe Pro Val Lys Phe
    530                 535                 540
Tyr Arg His Ser Cys Arg Trp Thr Ser Ile Cys Gly Pro Val Arg Glu
545                 550                 555                 560
Asn Leu Thr Thr Tyr Tyr Thr Asp Gly Gly Lys Lys Gly Lys Thr Ala
                565                 570                 575
Ala Ala Val Tyr Trp Cys Glu Gly Arg Thr Lys Ser Lys Val Phe Pro
            580                 585                 590
Gly Thr Asn Gln Gln Ala Glu Leu Lys Ala Ile Cys Met Ala Leu Leu
        595                 600                 605
Asp Gly Pro Pro Lys Met Asn Ile Ile Thr Asp Ser Arg Tyr Ala Tyr
    610                 615                 620
Glu Gly Met Arg Glu Glu Pro Glu Thr Trp Ala Arg Glu Gly Ile Trp
625                 630                 635                 640
Leu Glu Ile Ala Lys Ile Leu Pro Phe Lys Gln Tyr Val Gly Val Gly
                645                 650                 655
Trp Val Pro Ala His Lys Gly Ile Gly Gly Asn Thr Glu Ala Asp Glu
            660                 665                 670
Gly Val Lys Lys Ala Leu Glu Gln Met Ala Pro Cys Ser Pro Pro Glu
        675                 680                 685
Ala Ile Leu Leu Lys Pro Gly Glu Lys Gln Asn Leu Glu Thr Gly Ile
    690                 695                 700
Tyr Met Gln Gly Leu Arg Pro Gln Ser Phe Leu Pro Arg Ala Asp Leu
705                 710                 715                 720
Pro Val Ala Ile Thr Gly Thr Met Val Asp Ser Glu Leu Gln Leu Gln
                725                 730                 735
Leu Leu Asn Ile Gly Thr Glu His Ile Arg Ile Gln Lys Asp Glu Val
            740                 745                 750
Phe Met Thr Cys Phe Leu Glu Asn Ile Pro Ser Ala Thr Glu Asp His
        755                 760                 765
Glu Arg Trp His Thr Ser Pro Asp Ile Leu Val Arg Gln Phe His Leu
    770                 775                 780
Pro Lys Arg Ile Ala Lys Glu Ile Val Ala Arg Cys Gln Glu Cys Lys
785                 790                 795                 800
Arg Thr Thr Thr Ser Pro Val Arg Gly Thr Asn Pro Arg Gly Arg Phe
                805                 810                 815
Leu Trp Gln Met Asp Asn Thr His Trp Asn Lys Thr Ile Ile Trp Val
            820                 825                 830
Ala Val Glu Thr Asn Ser Gly Leu Val Glu Ala Gln Val Ile Pro Glu
        835                 840                 845
Glu Thr Ala Leu Gln Val Ala Leu Cys Ile Leu Gln Leu Ile Gln Arg
    850                 855                 860
Tyr Thr Val Leu His Leu His Ser Asp Asn Gly Pro Cys Phe Thr Ala
865                 870                 875                 880
His Arg Ile Glu Asn Leu Cys Lys Tyr Leu Gly Ile Thr Lys Thr Thr
                885                 890                 895
Gly Ile Pro Tyr Asn Pro Gln Ser Gln Gly Val Val Glu Arg Ala His
            900                 905                 910
Arg Asp Leu Lys Asp Arg Leu Ala Ala Tyr Gln Gly Asp Cys Glu Thr
        915                 920                 925
Val Glu Ala Ala Lau Ser Leu Ala Leu Val Ser Leu Asn Lys Lys Arg
    930                 935                 940
Gly Gly Ile Gly Gly His Thr Pro Tyr Glu Ile Tyr Leu Glu Ser Glu
945                 950                 955                 960
His Thr Lys Tyr Gln Asp Gln Leu Glu Gln Gln Phe Ser Lys Gln Lys
                965                 970                 975
Ile Glu Lys Trp Cys Tyr Val Arg Asn Arg Arg Lys Glu Trp Lys Gly
            980                 985                 990
Pro Tyr Lys Val Leu Trp Asp Gly Asp Gly Ala Ala Val Ile Glu Glu
        995                 1000                1005
Glu Gly Lys Thr Ala Leu Tyr Pro His Arg His Met Arg Phe Ile
    1010                1015                1020
Pro Pro Pro Asp Ser Asp Ile Gln Asp Gly Ser Ser
    1025                1030                1035
<210>  52
<211>  3108
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  重新编码的BIV Pol的DNA序列
<400>  52
cgggaagtgc tcctctgccc cttatgggca gaggagccaa ccacagaaca attttcacca     60
gagcaacatg agttctgtga ccccatctgc accccctctt atattagatt agacaaacag    120
ccttttataa aggtgttcat tggcggccgc tgggtgaagg gactggtgga cacaggcgct    180
gacgaggtgg tgctgaagaa catccactgg gaccgcatca aaggctaccc tggaacaccc    240
atcaagcaga tcggcgtgaa cggcgtgaac gtggctaagc gcaaaacaca tgtggagtgg    300
agattcaaag acaagaccgg catcattgac gtcctcttca gcgacacacc tgtgaacctg    360
tttggcagaa gcctgctcag atccatcgtg acctgcttta ccctgctggt gcacaccgag    420
aagatcgagc cactgcctgt gaaggtgcgc ggccctggac ctaaggtgcc acaatggccc    480
ctgaccaagg agaaatacca ggccctgaag gagatcgtga aggacctgct ggccgaggga    540
aagatcagcg aagctgcctg ggacaaccct tacaacacac ccgtgttcgt gatcaagaag    600
aaaggcaccg gccgctggcg catgctgatg gacttccgcg agctgaataa gatcaccgtg    660
aaaggccaag agttcagcac aggactccct tatccacccg gcatcaagga gtgtgagcac    720
ctgaccgcca tcgacatcaa ggacgcctac ttcaccatcc ctctgcacga ggacttcaga    780
cccttcacag ccttcagcgt ggtcccagtg aaccgcgagg gccccatcga gcgcttccag    840
tggaacgtcc tgcctcaagg ctgggtgtgc tcccctgcca tctaccagac cacaacccag    900
aagatcattg agaacatcaa gaagagccat cccgacgtga tgctgtatca gtacatggat    960
gacctcctga ttggcagcaa tcgcgatgac cacaagcaga tcgtgcagga gatcagagac    1020
aagctgggca gctatggctt caagacaccc gacgagaaag tgcaggaaga gcgcgtgaag    1080
tggatcggct tcgagctgac acctaagaaa tggagattcc agcctaggca actgaagatc    1140
aagaacccac tgaccgtgaa cgaactccag cagctggtcg gcaactgtgt gtgggtgcag    1200
cccgaggtga agatccctct gtacccactg accgatctgc tccgcgacaa gaccaacctg    1260
caggaaaaga tccagctgac acccgaggcc atcaagtgcg tggaagagtt caacctgaag    1320
ctgaaagatc ccgagtggaa ggacagaatt cgcgaaggag ccgagctggt gatcaagatc    1380
caaatggtcc ctcgcggcat cgtgttcgac ctgctgcaag acggcaatcc tatctgggga    1440
ggcgtgaaag gactgaacta cgaccacagc aacaagatca agaagatcct gcgcaccatg    1500
aacgagctga accgcaccgt ggtgatcatg accggacgcg aagctagctt tctcctgcct    1560
ggatccagcg aggattggga ggccgccctg cagaaggaag agagcctgac ccaaatcttt    1620
cccgtgaagt tctaccgcca tagctgtaga tggacaagca tctgtggacc cgtccgcgag    1680
aacctgacca cctactatac cgacggcggg aagaaaggaa agacagctgc cgcagtgtac    1740
tggtgtgaag gaagaactaa gagcaaagtg ttccctggaa ccaatcaaca ggctgagctg    1800
aaggcaatct gcatggctct gctggacgga cctcccaaga tgaacatcat caccgacagc    1860
cgctacgctt atgagggcat gagagaggaa cctgagacct gggctcgcga gggcatctgg    1920
ctggagattg caaagatcct gccattcaag caatacgtcg gagtgggctg ggtccctgct    1980
cacaaaggca ttggaggcaa taccgaggct gacgaaggag tgaagaaagc cctggagcaa    2040
atggcaccat gttcccctcc cgaggctatc ctgctcaaac ctggcgagaa gcaaaacctg    2100
gagaccggca tctacatgca aggcctgaga cctcagagct tcctgccccg cgctgacctc    2160
cctgtcgcaa tcactggcac catggtggac tccgagctgc agctccaact gctgaacatc    2220
ggcaccgagc acattcgcat ccagaaggac gaggtgttca tgacatgctt cctggagaac    2280
atccctagcg ccaccgaaga ccacgagaga tggcacacat ccccagacat cctggtccgc    2340
cagttccacc tgcccaagcg catcgccaag gagatcgtcg cccgctgcca ggagtgcaag    2400
agaaccacaa cctccccagt gcgcggcacc aaccctagag gacgcttcct gtggcagatg    2460
gacaacacac actggaacaa aaccatcatt tgggtcgcag tggagactaa cagcggactg    2520
gtggaggctc aggtgattcc cgaagagacc gcactgcaag tggccctgtg tatcctccag    2580
ctgatccaac gctacaccgt cctgcacctg cacagcgaca acggaccctg cttcacagct    2640
caccgcatcg agaacctgtg caagtacctg ggcatcacca agacaaccgg cattccctac    2700
aatcctcaga gccaaggagt cgtggaaaga gcccatcgcg acctgaagga cagactggct    2760
gcctatcaag gcgactgcga gaccgtggaa gctgcactga gcctcgccct ggtcagcctg    2820
aacaagaaga gaggaggcat cggcggacac acaccctacg agatctatct ggagagcgag    2880
cacaccaagt atcaggacca actggagcag caattcagca agcagaagat cgagaaatgg    2940
tgctacgtcc gcaacagacg caaggagtgg aagggccctt acaaggtgct gtgggatggc    3000
gacggagctg cagtgatcga ggaagagggc aagaccgctc tgtatcccca ccggcacatg    3060
cgcttcatcc cacctcccga cagcgatatc caggacggct ccagctga                 3108
<210>  53
<211>  3111
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  带ATG的野生型BIV Pol序列
<400>  53
atgcgggaag tgctcctctg ccccttatgg gcagaggagc caaccacaga acaattttca     60
ccagagcaac atgagttctg tgaccccatc tgcaccccct cttatattag attagacaaa    120
cagcctttta taaaggtgtt cataggggga agatgggtaa aagggttagt agacactgga    180
gcagatgagg tagtgcttaa gaacatacat tgggatagga taaaagggta tccagggaca    240
ccaattaaac aaattggggt aaatggagta aatgtggcca aaaggaagac ccacgtagag    300
tggagattta aggataagac tgggataatt gatgtcttgt tctcagatac tcctgtaaac    360
ctttttggga gatctcttct acgtagcata gtgacttgct tcaccctact tgttcacaca    420
gaaaaaatcg aacccctacc cgtcaaggta aggggaccag ggcctaaggt accccagtgg    480
cccttgacaa aagaaaagta tcaggctctt aaggaaattg tgaaagatct tttagcagaa    540
ggaaaaattt ccgaagctgc ttgggataac ccatataata ccccagtttt tgttataaag    600
aaaaagggaa cgggaagatg gaggatgcta atggatttta gggaattaaa taagataaca    660
gttaaaggac aagaattctc tacaggctta ccttaccctc caggaattaa ggaatgtgaa    720
cacttaactg caatagatat aaaagatgcc tactttacta tccctttaca tgaggacttt     780
agacccttta cagccttctc tgtagtccct gtaaatcgag aaggacctat agagaggttc     840
cagtggaatg ttctaccaca aggatgggta tgtagccctg ccatttatca gactaccacc     900
cagaagatta tagaaaacat taaaaagagt cacccagatg tcatgttgta tcaatatatg     960
gatgatttgt tgattgggtc taatagggat gatcataagc aaatagtgca ggaaatcagg    1020
gataagttag gatcatatgg tttcaagact ccagatgaaa aggtccagga agagagagtg    1080
aaatggatcg gttttgagct cacacccaag aaatggcgtt ttcagcccag gcaactaaag    1140
ataaaaaacc cactcacagt aaatgaatta cagcaattag taggtaattg tgtttgggta    1200
cagccagaag taaaaatccc tctatacccc ttaaccgatc tactgaggga taagaccaat    1260
ctccaagaaa agatacaact aacaccagaa gccatcaagt gtgtagaaga attcaatcta    1320
aaactaaaag atccagaatg gaaagataga ataagagaag gagcagaatt agtcataaaa    1380
atacagatgg ttcctcgggg catagtattt gatctgttgc aagatggaaa tcccatatgg    1440
ggaggagtaa aaggactaaa ttatgatcat tcaaacaaaa taaaaaagat acttagaact    1500
atgaatgagc tgaacagaac agtggtaatt atgacaggaa gagaagctag tttcctgctt    1560
cctgggtctt ctgaagattg ggaagcggca ctccagaagg aagaaagtct aacacaaata    1620
ttcccagtaa agttttatag gcactcctgc agatggacct ccatatgtgg gccagtaaga    1680
gaaaatctaa ccacctacta tactgacgga gggaagaaag ggaaaacagc tgcagcagta    1740
tattggtgtg aaggaaggac taagtcaaag gtatttccag gaaccaatca acaggcggaa    1800
ttgaaggcca tatgcatggc tctcttggat ggaccaccaa aaatgaatat cataacagat    1860
agtagatacg cctatgaggg aatgagagaa gaaccagaaa cgtgggccag ggaaggaatc    1920
tggctggaga ttgccaagat attgcccttt aagcagtacg tgggggtcgg gtgggtgcct    1980
gcacataaag ggataggagg aaatacagag gcagatgaag gagttaagaa agccttagaa    2040
cagatggccc cgtgtagccc tcctgaggcc attctattaa aaccaggaga aaaacaaaat    2100
ctggagacag ggatctacat gcaggggctt agaccacaaa gcttcctccc aagagcagac    2160
ttaccagtag ccatcacagg aaccatggta gattcagagc tacagctaca gctacttaac    2220
ataggaactg agcatataag aatccaaaaa gatgaggtct tcatgacctg tttcctagaa    2280
aatatcccct cagccactga agatcatgag agatggcata cctcaccaga cattttggtt    2340
aggcagttcc atctccctaa gagaatagct aaagagatag tagccagatg ccaagaatgt    2400
aaaaggacaa ccactagccc agtcagagga acaaacccca gaggtcgatt cttatggcag    2460
atggacaata ctcactggaa taaaacaatt atttgggtag cagtagagac aaattcagga    2520
ttagtggaag ctcaggtgat ccctgaagaa acagcactac aagtagctct ctgcatttta    2580
cagctaatcc agagatatac agttcttcac ttacatagtg acaacgggcc gtgctttact    2640
gcacacagga tagaaaatct atgtaagtat ctggggatca caaaaactac gggaataccc    2700
tacaacccac aatcccaggg agttgtagaa agagcccaca gagatctaaa agacagattg    2760
gcagcttatc agggagattg tgaaaccgta gaagcagccc ttagcctcgc attagtttct    2820
ttaaataaaa aaagaggggg aatagggggc catacaccat atgaaatata cctagaatca    2880
gaacatacca aataccaaga ccaactagaa caacaatttt caaaacaaaa aattgaaaag    2940
tggtgttacg taaggaacag aagaaaggaa tggaaaggac cctacaaagt gttgtgggac    3000
ggagacgggg cagcagtaat agaggaagag ggaaaaacag ccttatatcc acaccgtcat    3060
atgcgcttca tccccccccc agattcagat atccaagatg ggagttcgtg a             3111
<210>  54
<211>  3111
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  带ATG的重新编码的BIV Pol的DNA序列
<400>  54
atgcgggaag tgctcctctg ccccttatgg gcagaggagc caaccacaga acaattttca     60
ccagagcaac atgagttctg tgaccccatc tgcaccccct cttatattag attagacaaa    120
cagcctttta taaaggtgtt cattggcggc cgctgggtga agggactggt ggacacaggc    180
gctgacgagg tggtgctgaa gaacatccac tgggaccgca tcaaaggcta ccctggaaca    240
cccatcaagc agatcggcgt gaacggcgtg aacgtggcta agcgcaaaac acatgtggag    300
tggagattca aagacaagac cggcatcatt gacgtcctct tcagcgacac acctgtgaac    360
ctgtttggca gaagcctgct cagatccatc gtgacctgct ttaccctgct ggtgcacacc    420
gagaagatcg agccactgcc tgtgaaggtg cgcggccctg gacctaaggt gccacaatgg    480
cccctgacca aggagaaata ccaggccctg aaggagatcg tgaaggacct gctggccgag    540
ggaaagatca gcgaagctgc ctgggacaac ccttacaaca cacccgtgtt cgtgatcaag    600
aagaaaggca ccggccgctg gcgcatgctg atggacttcc gcgagctgaa taagatcacc    660
gtgaaaggcc aagagttcag cacaggactc ccttatccac ccggcatcaa ggagtgtgag    720
cacctgaccg ccatcgacat caaggacgcc tacttcacca tccctctgca cgaggacttc    780
agacccttca cagccttcag cgtggtccca gtgaaccgcg agggccccat cgagcgcttc    840
cagtggaacg tcctgcctca aggctgggtg tgctcccctg ccatctacca gaccacaacc    900
cagaagatca ttgagaacat caagaagagc catcccgacg tgatgctgta tcagtacatg    960
gatgacctcc tgattggcag caatcgcgat gaccacaagc agatcgtgca ggagatcaga   1020
gacaagctgg gcagctatgg cttcaagaca cccgacgaga aagtgcagga agagcgcgtg   1080
aagtggatcg gcttcgagct gacacctaag aaatggagat tccagcctag gcaactgaag   1140
atcaagaacc cactgaccgt gaacgaactc cagcagctgg tcggcaactg tgtgtgggtg   1200
cagcccgagg tgaagatccc tctgtaccca ctgaccgatc tgctccgcga caagaccaac   1260
ctgcaggaaa agatccagct gacacccgag gccatcaagt gcgtggaaga gttcaacctg   1320
aagctgaaag atcccgagtg gaaggacaga attcgcgaag gagccgagct ggtgatcaag   1380
atccaaatgg tccctcgcgg catcgtgttc gacctgctgc aagacggcaa tcctatctgg   1440
ggaggcgtga aaggactgaa ctacgaccac agcaacaaga tcaagaagat cctgcgcacc   1500
atgaacgagc tgaaccgcac cgtggtgatc atgaccggac gcgaagctag ctttctcctg   1560
cctggatcca gcgaggattg ggaggccgcc ctgcagaagg aagagagcct gacccaaatc   1620
tttcccgtga agttctaccg ccatagctgt agatggacaa gcatctgtgg acccgtccgc   1680
gagaacctga ccacctacta taccgacggc gggaagaaag gaaagacagc tgccgcagtg   1740
tactggtgtg aaggaagaac taagagcaaa gtgttccctg gaaccaatca acaggctgag   1800
ctgaaggcaa tctgcatggc tctgctggac ggacctccca agatgaacat catcaccgac   1860
agccgctacg cttatgaggg catgagagag gaacctgaga cctgggctcg cgagggcatc   1920
tggctggaga ttgcaaagat cctgccattc aagcaatacg tcggagtggg ctgggtccct   1980
gctcacaaag gcattggagg caataccgag gctgacgaag gagtgaagaa agccctggag   2040
caaatggcac catgttcccc tcccgaggct atcctgctca aacctggcga gaagcaaaac   2100
ctggagaccg gcatctacat gcaaggcctg agacctcaga gcttcctgcc ccgcgctgac   2160
ctccctgtcg caatcactgg caccatggtg gactccgagc tgcagctcca actgctgaac   2220
atcggcaccg agcacattcg catccagaag gacgaggtgt tcatgacatg cttcctggag   2280
aacatcccta gcgccaccga agaccacgag agatggcaca catccccaga catcctggtc   2340
cgccagttcc acctgcccaa gcgcatcgcc aaggagatcg tcgcccgctg ccaggagtgc   2400
aagagaacca caacctcccc agtgcgcggc accaacccta gaggacgctt cctgtggcag   2460
atggacaaca cacactggaa caaaaccatc atttgggtcg cagtggagac taacagcgga   2520
ctggtggagg ctcaggtgat tcccgaagag accgcactgc aagtggccct gtgtatcctc   2580
cagctgatcc aacgctacac cgtcctgcac ctgcacagcg acaacggacc ctgcttcaca   2640
gctcaccgca tcgagaacct gtgcaagtac ctgggcatca ccaagacaac cggcattccc   2700
tacaatcctc agagccaagg agtcgtggaa agagcccatc gcgacctgaa ggacagactg   2760
gctgcctatc aaggcgactg cgagaccgtg gaagctgcac tgagcctcgc cctggtcagc   2820
ctgaacaaga agagaggagg catcggcgga cacacaccct acgagatcta tctggagagc   2880
gagcacacca agtatcagga ccaactggag cagcaattca gcaagcagaa gatcgagaaa   2940
tggtgctacg tccgcaacag acgcaaggag tggaagggcc cttacaaggt gctgtgggat   3000
ggcgacggag ctgcagtgat cgaggaagag ggcaagaccg ctctgtatcc ccaccggcac   3060
atgcgcttca tcccacctcc cgacagcgat atccaggacg gctccagctg a            3111
<210>  55
<211>  29
<212>  PRT
<213>  人免疫缺陷病毒
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<223>  HIV蛋白酶部分氨基酸序列
<400>  55
Pro Gln Val Thr Leu Trp Gln Arg Pro Leu Val Thr Ile Lys Ile Gly
1               5                   10                  15
Gly Gln Leu Lys Glu Ala Leu Leu Asp Thr Gly Ala Asp
            20                  25
<210>  56
<211>  29
<212>  PRT
<213>  牛免疫缺陷病毒
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<223>  BIV蛋白酶部分氨基酸序列
<400>  56
Ser Tyr Ile Arg Leu Asp Lys Gln Pro Phe Ile Lys Val Phe Ile Gly
1               5                   10                  15
Gly Arg Trp Val Lys Gly Leu Val Asp Thr Gly Ala Asp
            20                  25
<210>  57
<211>  29
<212>  PRT
<213>  人工序列
<223>  突变的HIV HXB2蛋白酶的部分氨基酸序列
<400>  57
Pro Gln Val Thr Leu Trp Gln Arg Pro Leu Val Thr Ile Lys Ile Gly
1               5                   10                  15
Gly Gln Leu Lys Glu Ala Leu Leu Asp Ser Gly Ala Asp
            20                  25
<210>  58
<211>  29
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  点突变的127分离物
<400>  58
Ser Tyr Ile Arg Leu Asp Lyg Gln Pro Phe Ile Lys Val Phe Ile Gly
1               5                   10                  15
Gly Arg Trp Val Lys Gly Leu Val Asp Ser Gly Ala Asp
            20                  25
<210>  59
<211>  4427
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  具有蛋白酶突变的重新编码的gag/pol
<400>  59
atgaagcgga gagagctgga gaagaaactg aggaaagtgc gcgtgacacc tcaacaggac     60
aagtactata ccatcggcaa cctgcagtgg gccatccgca tgatcaacct gatgggcatc    120
aagtgcgtgt gcgacgagga atgcagcgcc gctgaggtcg ccctgatcat cacccagttt    180
agcgccctcg acctggagaa ctcccctatc cgcggcaagg aagaggtggc catcaagaat    240
accctgaagg tgttttggag cctgctggcc ggatacaagc ctgagagcac cgagaccgcc    300
ctgggatact gggaagcctt cacctacaga gagagggaag ctagagccga caaggaggga    360
gagatcaaga gcatctaccc tagcctgacc cagaacaccc agaacaagaa acagaccagc    420
aatcagacaa acacccagag cctgcccgct atcaccacac aggatggcac ccctcgcttc    480
gaccccgacc tgatgaagca gctgaagatc tggtccgatg ccacagagcg caatggagtg    540
gacctgcatg ccgtgaacat cctgggagtg atcacagcca acctggtgca agaagagatc    600
aagctcctgc tgaatagcac acccaagtgg cgcctggacg tgcagctgat cgagagcaaa    660
gtgagagaga aggagaacgc ccaccgcacc tggaagcagc atcaccctga ggctcccaag    720
acagacgaga tcattggaaa gggactgagc tccgccgagc aggctaccct gatcagcgtg    780
gagtgcagag agaccttccg ccagtgggtg ctgcaggctg ccatggaggt cgcccaggct    840
aagcacgcca cacccggacc tatcaacatc catcaaggcc ctaaggaacc ctacaccgac    900
ttcatcaacc gcctggtggc tgccctggaa ggaatggccg ctcccgagac cacaaaggag    960
tacctcctgc agcacctgag catcgaccac gccaacgagg actgtcagtc catcctgcgc   1020
cctctgggac ccaacacacc tatggagaag aaactggagg cctgtcgcgt ggtgggaagc   1080
cagaagagca agatgcagtt cctggtggcc gctatgaagg aaatggggat ccagtctcct   1140
attccagccg tgctgcctca cacacccgaa gcctacgcct cccaaacctc agggcccgag   1200
gatggtagga gatgttacgg atgtgggaag acaggacatt tgaagaggaa ttgtaaacag   1260
caaaaatgct accattgtgg caaacctggc caccaagcaa gaaactgcag gtcaaaaaac   1320
gggaagtgct cctctgcccc ttatgggcag aggagccaac cacagaacaa ttttcaccag   1380
agcaacatga gttctgtgac cccatctgca ccccctctta tattagatta gacaaacagc   1440
cttttataaa ggtgttcatt ggcggccgct gggtgaaggg actggtggac tcaggcgctg   1500
acgaggtggt gctgaagaac atccactggg accgcatcaa aggctaccct ggaacaccca   1560
tcaagcagat cggcgtgaac ggcgtgaacg tggctaagcg caaaacacat gtggagtgga   1620
gattcaaaga caagaccggc atcattgacg tcctcttcag cgacacacct gtgaacctgt   1680
ttggcagaag cctgctcaga tccatcgtga cctgctttac cctgctggtg cacaccgaga   1740
agatcgagcc actgcctgtg aaggtgcgcg gccctggacc taaggtgcca caatggcccc   1800
tgaccaagga gaaataccag gccctgaagg agatcgtgaa ggacctgctg gccgagggaa   1860
agatcagcga agctgcctgg gacaaccctt acaacacacc cgtgttcgtg atcaagaaga   1920
aaggcaccgg ccgctggcgc atgctgatgg acttccgcga gctgaataag atcaccgtga   1980
aaggccaaga gttcagcaca ggactccctt atccacccgg catcaaggag tgtgagcacc   2040
tgaccgccat cgacatcaag gacgcctact tcaccatccc tctgcacgag gacttcagac   2100
ccttcacagc cttcagcgtg gtcccagtga accgcgaggg ccccatcgag cgcttccagt   2160
ggaacgtcct gcctcaaggc tgggtgtgct cccctgccat ctaccagacc acaacccaga   2220
agatcattga gaacatcaag aagagccatc ccgacgtgat gctgtatcag tacatggatg   2280
acctcctgat tggcagcaat cgcgatgacc acaagcagat cgtgcaggag atcagagaca   2340
agctgggcag ctatggcttc aagacacccg acgagaaagt gcaggaagag cgcgtgaagt   2400
ggatcggctt cgagctgaca cctaagaaat ggagattcca gcctaggcaa ctgaagatca   2460
agaacccact gaccgtgaac gaactccagc agctggtcgg caactgtgtg tgggtgcagc   2520
ccgaggtgaa gatccctctg tacccactga ccgatctgct ccgcgacaag accaacctgc   2580
aggaaaagat ccagctgaca cccgaggcca tcaagtgcgt ggaagagttc aacctgaagc   2640
tgaaagatcc cgagtggaag gacagaattc gcgaaggagc cgagctggtg atcaagatcc   2700
aaatggtccc tcgcggcatc gtgttcgacc tgctgcaaga cggcaatcct atctggggag   2760
gcgtgaaagg actgaactac gaccacagca acaagatcaa gaagatcctg cgcaccatga   2820
acgagctgaa ccgcaccgtg gtgatcatga ccggacgcga agctagcttt ctcctgcctg   2880
gatccagcga ggattgggag gccgccctgc agaaggaaga gagcctgacc caaatctttc   2940
ccgtgaagtt ctaccgccat agctgtagat ggacaagcat ctgtggaccc gtccgcgaga   3000
acctgaccac ctactatacc gacggcggga agaaaggaaa gacagctgcc gcagtgtact   3060
ggtgtgaagg aagaactaag agcaaagtgt tccctggaac caatcaacag gctgagctga   3120
aggcaatctg catggctctg ctggacggac ctcccaagat gaacatcatc accgacagcc   3180
gctacgctta tgagggcatg agagaggaac ctgagacctg ggctcgcgag ggcatctggc   3240
tggagattgc aaagatcctg ccattcaagc aatacgtcgg agtgggctgg gtccctgctc   3300
acaaaggcat tggaggcaat accgaggctg acgaaggagt gaagaaagcc ctggagcaaa   3360
tggcaccatg ttcccctccc gaggctatcc tgctcaaacc tggcgagaag caaaacctgg   3420
agaccggcat ctacatgcaa ggcctgagac ctcagagctt cctgccccgc gctgacctcc   3480
ctgtcgcaat cactggcacc atggtggact ccgagctgca gctccaactg ctgaacatcg   3540
gcaccgagca cattcgcatc cagaaggacg aggtgttcat gacatgcttc ctggagaaca   3600
tccctagcgc caccgaagac cacgagagat ggcacacatc cccagacatc ctggtccgcc   3660
agttccacct gcccaagcgc atcgccaagg agatcgtcgc ccgctgccag gagtgcaaga   3720
gaaccacaac ctccccagtg cgcggcacca accctagagg acgcttcctg tggcagatgg   3780
acaacacaca ctggaacaaa accatcattt gggtcgcagt ggagactaac agcggactgg   3840
tggaggctca ggtgattccc gaagagaccg cactgcaagt ggccctgtgt atcctccagc   3900
tgatccaacg ctacaccgtc ctgcacctgc acagcgacaa cggaccctgc ttcacagctc   3960
accgcatcga gaacctgtgc aagtacctgg gcatcaccaa gacaaccggc attccctaca    4020
atcctcagag ccaaggagtc gtggaaagag cccatcgcga cctgaaggac agactggctg    4080
cctatcaagg cgactgcgag accgtggaag ctgcactgag cctcgccctg gtcagcctga    4140
acaagaagag aggaggcatc ggcggacaca caccctacga gatctatctg gagagcgagc    4200
acaccaagta tcaggaccaa ctggagcagc aattcagcaa gcagaagatc gagaaatggt    4260
gctacgtccg caacagacgc aaggagtgga agggccctta caaggtgctg tgggatggcg    4320
acggagctgc agtgatcgag gaagagggca agaccgctct gtatccccac cggcacatgc    4380
gcttcatccc acctcccgac agcgatatcc aggacggctc cagctga                  4427
<210>  60
<211>  468
<212>  DNA
<213>  小鼠
<220>
<221>  misc_feature
<223>  小鼠RdCVF1 cDNA
<400>  60
atcggatccc tctctgggtc cccagctcct tgcatactgc taccatggca tctctcttct     60
ctggacgcat cttgatcagg aacaacagcg accaggatga agtggagaca gaggcagagc    120
tgagccgtag gttagagaat cgtctggtgt tgctgttctt cggcgccggc gcctgtcccc    180
agtgccaggc ctttgcccca gtcctcaaag acttcttcgt gcggctcact gacgagttct    240
acgtgctgcg ggcagcacag ctggccctgg tctatgtgtc ccaggaccct acagaggagc    300
aacaggacct cttcctcagg gacatgcctg aaaaatggct cttcctgccg ttccatgatg    360
aactgaggag gtgaggcccc agggaagacc agggagggct tcctggagaa ggcatttccc    420
tggaggttta ctgtcctggt actacttgtg cataaagagg tattcctc                 468
<210>  61
<211>  109
<212>  PRT
<213>  小鼠
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<223>  翻译的小鼠RdCVF1 cDNA的氨基酸序列
<400>  61
Met Ala Ser Leu Phe Ser Gly Arg Ile Leu Ile Arg Asn Asn Ser Asp
1               5                   10                  15
Gln Asp Glu Val Glu Thr Glu Ala Glu Leu Ser Arg Arg Leu Glu Asn
            20                  25                  30
Arg Leu Val Leu Leu Phe Phe Gly Ala Gly Ala Cys Pro Gln Cys Gln
        35                  40                  45
Ala Phe Ala Pro Val Leu Lys Asp Phe Phe Val Arg Leu Thr Asp Glu
    50                  55                  60
Phe Tyr Val Leu Arg Ala Ala Gln Leu Ala Leu Val Tyr Val Ser Gln
65                  70                  75                  80
Asp Pro Thr Glu Glu Gln Gln Asp Leu Phe Leu Arg Asp Met Pro Glu
                85                  90                  95
Lys Trp Leu Phe Leu Pro Phe His Asp Glu Leu Arg Arg
            100                 105
<210>  62
<211>  353
<212>  DNA
<213>  人
<220>
<221>  misc_feature
<223>  人RdCVF1 cDNA
<400>  62
cccagcaccc aacccaggtt accatggcct ccctgttctc tggccgcatc ctgatccgca     60
acaatagcga ccaggacgag ctggatacgg aggctgaggt cagtcgcagg ctggagaacc    120
ggctggtgct gctgttcttt ggtgctgggg cttgtccaca gtgccaggcc ttcgtgccca    180
tcctcaagga cttcttcgtg cggctcacag atgagttcta tgtactgcgg gcggctcagc    240
tggccctggt gtacgtgtcc caggactcca cggaggagca gcaggacctg ttcctcaagg    300
acatgccaaa gaaatggctt ttcctgccct ttgaggatga tctgaggagg tga           353
<210>  63
<211>  109
<212>  PRT
<213>  人
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<223>  翻译的人RdCVF1 cDNA的氨基酸序列
<400>  63
Met Ala Ser Leu Phe Ser Gly Arg Ile Leu Ile Arg Asn Asn Ser Asp
1               5                   10                  15
Gln Asp Glu Leu Asp Thr Glu Ala Glu Val Ser Arg Arg Leu Glu Asn
            20                  25                  30
Arg Leu Val Leu Leu Phe Phe Gly Ala Gly Ala Cys Pro Gln cys Gln
        35                  40                  45
Ala Phe Val Pro Ile Leu Lys Asp Phe Phe Val Arg Leu Thr Asp Glu
    50                  55                  60
Phe Tyr Val Leu Arg Ala Ala Gln Leu Ala Leu Val Tyr Val Ser Gln
65                  70                  75                  80
Asp Ser Thr Glu Glu Gln Gln Asp Leu Phe Leu Lys Asp Met Pro Lys
                85                  90                  95
Lys Trp Leu Phe Leu Pro Phe Glu Asp Asp Leu Arg Arg
            100                 105
<210>  64
<211>  600
<212>  DNA
<213>  小鼠
<220>
<221>  misc_feature
<223>  小鼠RdCVF2 cDNA
<400>  64
ataaaataga gggtgggaga ggttgatggc gtggctctgc tttttggtgc ggggcaccca     60
gctgtcatcg ctgctgtcgc agcttctgga gtggccactg tgctctctcc tcccttcggc    120
tcaaggtgag ctgttccagc agaaggcggg gctgagaggc gcctagtgct gcgggaggct    180
cagtgtcatc ttccagctaa caggtggccg tgcagcccag ggctcgtctc tccactgtgt    240
cctcttcacg ccgagctcgt ggcgatggtg gacgtgctgg gcgggcggcg cctggtgacc    300
cgggagggca cggtggtgga ggccgaggtg gcgctgcaga acaaggtggt agctttgtac    360
tttgcggcgg gccggtgctc gcccagccgc gacttcacgc cgctgctctg cgacttctac    420
acggagctgg tgagcgaggc gcggcggccc gctcccttcg aggtggtttt cgtgtcggca    480
gacggcagtg cggaggagat gttggacttc atgcgcgagc tgcacggctc ctggctggca    540
ttgcccttcc acgaccccta ccggcagtga gtggggaccc aggggtcatg gggctggcgc    600
<210>  65
<211>  101
<212>  PRT
<213>  小鼠
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<223>  翻译的小鼠RdCVF2 cDNA的氨基酸序列
<400>  65
Met Val Asp Val Leu Gly Gly Arg Arg Leu Val Thr Arg Glu Gly Thr
1               5                   10                  15
Val Val Glu Ala Glu Val Ala Leu Gln Asn Lys Val Val Ala Leu Tyr
            20                  25                  30
Phe Ala Ala Gly Arg Cys Ser Pro Ser Arg Asp Phe Thr Pro Leu Leu
        35                  40                  45
Cys Asp Phe Tyr Thr Glu Leu Val Ser Glu Ala Arg Arg Pro Ala Pro
    50                  55                  60
Phe Glu Val Val Phe Val Ser Ala Asp Gly Ser Ala Glu Glu Met Leu
65                  70                  75                  80
Asp Phe Met Arg Glu Leu His Gly Ser Trp Leu Ala Leu Pro Phe His
                85                  90                  95
Asp Pro Tyr Arg Gln
            100
<210>  66
<211>  1472
<212>  DNA
<213>  小鼠
<220>
<221>  misc_feature
<223>  人RdCVF2 cDNA
<400>  66
gtgtgggcgg ggcgcagttg ggggagggtg cagagacctg agggcttgag gttgcctggc      60
tggccccgct cccagaggcg ggtgccgcgc tgtcgcccag gtatctgggg tctctggtgt     120
ctgagtgtct cattgtcggc gcgaacacaa ttgctccagc cacaggcgag gcctggccaa     180
ggtgtgggcg catctagggc aggtcttgag aggtccagcg cccggtggtg cggacagagg     240
cggggcaccg cggcgctcgc cgccgcctcc ccgcaggtga tcatcctcct gcaggtgtcc     300
tcgggtctca ggtggctgcg tgtctgcgcc atggttgaca ttctgggcga gcggcacctg     360
gtgacctgta agggcgcgac ggtggaggcc gaggcggcgc tgcagaacaa ggtggtggca     420
ctgtacttcg cggcggcccg gtgcgcgccg agccgcgact tcacgccgct gctctgcgac     480
ttctatacgg cgctggtggc cgaggcgcgg cggcccgcgc ccttcgaagt ggtcttcgtg     540
tcagccgacg gcagctgcca ggagatgctg gacttcatgc gcgagctgca tggcgcctgg     600
ctggcgctgc ccttccacga cccctaccgg caacggagtc tcgctctgtt gcccaggctg     660
gagtgcagtg gcgtgatctt agctcactgc aacctttgcc tcctgggttc aagtgattct     720
ctagccttag cctcctgagc atctgggact acagccattg ctgtgaatta cgtgagggaa     780
agatattgaa gaggagttgg acactccgag agtgcagctg ttctcccccc gcaccatccg     840
tgtcctgcat tctgcgagtc tgtgctcatt aacaatgtgc tgtgaccatg tgactcagca     900
atcctgctgc tgggtatata cccgaaagaa aggaaaagga agccagtata ttgaagaggt     960
atctgcaccc ccatgtttat tgcagcactg ttcacaacag ccaagatttg gaagcaacct    1020
aagtgtccat caacagatga atggataaag aaaacgtggt acatatacac aatggagtac    1080
tcttcagcca ttaaaaaaat gagattctgt catttgcaat aatatagatg gaaaaggagg    1140
cccttatgtg aagtgaaata agccaggcac agaaagacaa acatcacatg ttctcactta    1200
tttgtgggat ctaatgatca aaacaattga actcttggac atagagagta gaaggttggt    1260
taccagaagc tggaaaggaa agtggggttg ggaggaaggt gggaatggtt aataggtaca    1320
aaaaaataca aagaataaat aagacctaat atttgatagc acaacagtgt gactactgtc    1380
aataatcatt taattgtaca tttaaaaata actataattg cattgtttgt aacacaaaag    1440
ataaatgctt gaggagaaaa aaaaaaaaaa aa                                  1472
<210>  67
<211>  135
<212>  PRT
<213>  人
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<223>  翻译的人RdCVF2 cDNA的氨基酸序列
<400>  67
Met Val Asp Ile Leu Gly Glu Arg His Leu Val Thr Cys Lys Gly Ala
1               5                   10                  15
Thr Val Glu Ala Glu Ala Ala Leu Gln Asn Lys Val Val Ala Leu Tyr
            20                  25                  30
Phe Ala Ala Ala Arg Cys Ala Pro Ser Arg Asp Phe Thr Pro Leu Leu
        35                  40                  45
Cys Asp Phe Tyr Thr Ala Leu Val Ala Glu Ala Arg Arg Pro Ala Pro
    50                  55                  60
Phe Glu Val Val Phe Val Ser Ala Asp Gly Ser Cys Gln Glu Met Leu
65                  70                  75                  80
Asp Phe Met Arg Glu Leu His Gly Ala Trp Leu Ala Leu Pro Phe His
                85                  90                  95
Asp Pro Tyr Arg Gln Arg Ser Leu Ala Leu Leu Pro Arg Leu Glu Cys
            100                 105                 110
Ser Gly Val Ile Leu Ala His Cys Asn Leu Cys Leu Leu Gly Ser Ser
        115                 120                 125
Asp Ser Leu Ala Leu Ala Ser
    130                 135
<210>  68
<211>  1539
<212>  DNA
<213>  Thogoto病毒
<220>
<221>  CDS
<222>  (1)..(1539)
<400>  68
atg ttc ctt cag act gca ctg ctt ctg cta tcc tta ggg gta gca gaa     48
Met Phe Leu Gln Thr Ala Leu Leu Leu Leu Ser Leu Gly Val Ala Glu
1               5                   10                  15
cct gac tgc aat aca aaa aca gcc aca ggc cca tat ata ttg gac aga     96
Pro Asp Cys Asn Thr Lys Thr Ala Thr Gly Pro Tyr Ile Leu Asp Arg
            20                  25                  30
tat aaa ccc aag cca gtc act gta tcc aag aag ttg tat tcg gcc acc    144
Tyr Lys Pro Lys Pro Val Thr Val Ser Lys Lys Leu Tyr Ser Ala Thr
        35                  40                  45
aga tac aca acc tct gca caa aat gag cta ctt acc gct ggt tat cgc    192
Arg Tyr Thr Thr Ser Ala Gln Asn Glu Leu Leu Thr Ala Gly Tyr Arg
    50                  55                  60
aca gcc tgg gtg gct tac tgc tat aac ggt ggc ctc gtt gat tct aat    240
Thr Ala Trp Val Ala Tyr Cys Tyr Asn Gly Gly Leu Val Asp Ser Asn
65                  70                  75                  80
act ggt tgt aat gct agg cta ctg cat tac ccg ccc agc aga gat gag    288
Thr Gly Cys Asn Ala Arg Leu Leu His Tyr Pro Pro Ser Arg Asp Glu
                85                  90                  95
tta ctg ctt tgg gga tca tct cac cag tgt tca tac ggg gac atc tgc    336
Leu Leu Leu Trp Gly Ser Ser His Gln Cys Ser Tyr Gly Asp Ile Cys
            100                 105                 110
cat gat tgc tgg ggg agc gat tcc tat gca tgc ctg gga cag ctg gac     384
His Asp Cys Trp Gly Ser Asp Ser Tyr Ala Cys Leu Gly Gln Leu Asp
        115                 120                 125
cct gcc aaa cat tgg gcg cca agg aag gag ctc gtc aga aga gat gct     432
Pro Ala Lys His Trp Ala Pro Arg Lys Glu Leu Val Arg Arg Asp Ala
    130                 135                 140
aac tgg aaa ttc gca tac cat atg tgc aac atc gac tgg aga tgc gga     480
Asn Trp Lys Phe Ala Tyr His Met Cys Asn Ile Asp Trp Arg Cys Gly
145                 150                 155                 160
gtc acc acc tcc ccc gta ttc ttc aat ttg cag tgg gta aag aat gaa     528
Val Thr Thr Ser Pro Val Phe Phe Asn Leu Gln Trp Val Lys Asn Glu
                165                 170                 175
gta aag gtc agc act ctt ctg cct aat gga agc act gtg gaa cac tct     576
Val Lys Val Ser Thr Leu Leu Pro Asn Gly Ser Thr Val Glu His Ser
            180                 185                 190
gct ggg gag cct ctg ttc tgg act gag aag gac ttc tca tat ctg gtc     624
Ala Gly Glu Pro Leu Phe Trp Thr Glu Lys Asp Phe Ser Tyr Leu Val
        195                 200                 205
aaa gac aat ttc gaa ata cag agg gaa gaa gta aaa atc agc tgc ttc     672
Lys Asp Asn Phe Glu Ile Gln Arg Glu Glu Val Lys Ile Ser Cys Phe
    210                 215                 220
gta gat cca gac tat tgg gta gga gaa agg aag acc aag aaa gcg ttt     720
Val Asp Pro Asp Tyr Trp Val Gly Glu Arg Lys Thr Lys Lys Ala Phe
225                 230                 235                 240
tgc caa gac ggg acc aac ttc ttc gaa gtg act tca cac caa ttt tgt     768
Cys Gln Asp Gly Thr Asn Phe Phe Glu Val Thr Ser His Gln Phe Cys
                245                 250                 255
cat caa tat gca tgt tac aac ttc tct aag gac gaa ctg ctg gaa gct     816
His Gln Tyr Ala Cys Tyr Asn Phe Ser Lys Asp Glu Leu Leu Glu Ala
            260                 265                 270
gtc tac aaa gaa aga gct cac gag aaa agc aag gac ctg ccc ttt ggt     864
Val Tyr Lys Glu Arg Ala His Glu Lys Ser Lys Asp Leu Pro Phe Gly
        275                 280                 285
aat aaa agc tgg act gtg gtg aca gcc tcc ata gat gac ctc cac gca     912
Asn Lys Ser Trp Thr Val Val Thr Ala Ser Ile Asp Asp Leu His Ala
    290                 295                 300
ctc agt gca gca cag gca ttt gag ctg gaa ggg ctc aga gca tct ttt     960
Leu Ser Ala Ala Gln Ala Phe Glu Leu Glu Gly Leu Arg Ala Ser phe
305                 310                 315                 320
gct gaa ctg gat tca cga ttt agg cag ctg tca gaa att ttg gac aca    1008
Ala Glu Leu Asp Ser Arg Phe Arg Gln Leu Ser Glu Ile Leu Asp Thr
                325                 330                 335
gtg ata tcc agt atc gcc aag atc gac gag aga ctt atc ggc aga ctg    1056
Val Ile Ser Ser Ile Als Lys Ile Asp Glu Arg Leu Ile Gly Arg Leu
            340                 345                 350
atc aaa gca ccc gtt tct agc aga ttc atc tca gag gac aag ttt ctg    1104
Ile Lys Ala Pro Val Ser Ser Arg Phe Ile Ser Glu Asp Lys Phe Leu
        35                  360                 365
cta cat cag tgc gtg gac agt gtg gcc aac aac acc aac tgc gtg gga    1152
Leu His Gln Cys Val Asp Ser Val Ala Asn Asn Thr Asn Cys Val Gly
    370                 375                 380
gac agt gca tat gtg gac ggc agg tgg acc cat gtt ggg gac aac cat    1200
Asp Ser Ala Tyr Val Asp Gly Arg Trp Thr His Val Gly Asp Asn His
385                 390                 395                 400
cct tgc aca acc gtg gta gat gaa cca ata ggc att gac atc tat aac    1248
Pro Cys Thr Thr Val Val Asp Glu Pro Ile Gly Ile Asp Ile Tyr Asn
                405                 410                 415
ttc agt gcc ctc tgg tac cct tct gcc gcc gaa gtc gat ttt agg gga    1296
Phe Ser Ala Leu Trp Tyr Pro Ser Ala Ala Glu Val Asp Phe Arg Gly
            420                 425                 430
act gtc cag tca gaa gat ggt tgg tct ttt gtg gtc aaa tct aaa gac    1344
Thr Val Gln Ser Glu Asp Gly Trp Ser Phe Val Val Lys Ser Lys Asp
        435                 440                 445
gcg ctc atc cag acc atg atg tac acc aaa aac ggc ggt aaa ggg act    1392
Ala Leu Ile Gln Thr Met Met Tyr Thr Lys Asn Gly Gly Lys Gly Thr
    450                 455                 460
tct ctc acg gac ctc ttg gac tac cct tct ggt tgg ctt aag ggg cag    1440
Ser Leu Thr Asp Leu Leu Asp Tyr Pro Ser Gly Trp Leu Lys Gly Gln
465                 470                 475                 480
ctg ggg ggc ttg cta tat ggc aat atc ggt gtg tac ttg tta att gct    1488
Leu Gly Gly Leu Leu Tyr Gly Asn Ile Gly Val Tyr Leu Leu Ile Ala
                485                 490                 495
ttc gct ttt gtg cta ttg atc aga cta att aag agt gct gga tta tgc    1536
Phe Ala Phe Val Leu Leu Ile Arg Leu Ile Lys Ser Ala Gly Leu Cys
            500                 505                 510
taa                                                                1539
<210>  69
<211>  512
<212>  PRT
<213>  Thogoto病毒
<400>  69
Met Phe Leu Gln Thr Ala Leu Leu Leu Leu Ser Leu Gly Val Ala Glu
1               5                   10                  15
Pro Asp Cys Asn Thr Lys Thr Ala Thr Gly Pro Tyr Ile Leu Asp Arg
            20                  25                  30
Tyr Lys Pro Lys Pro Val Thr Val Ser Lys Lys Leu Tyr Ser Ala Thr
        35                  40                  45
Arg Tyr Thr Thr Ser Ala Gln Asn Glu Leu Leu Thr Ala Gly Tyr Arg
    50                  55                  60
Thr Ala Trp Val Ala Tyr Cys Tyr Asn Gly Gly Leu Val Asp Ser Asn
65                  70                  75                  80
Thr Gly Cys Asn Ala Arg Leu Leu His Tyr Pro Pro Ser Arg Asp Glu
                85                  90                  95
Leu Leu Leu Trp Gly Ser Ser His Gln Cys Ser Tyr Gly Asp Ile Cys
            100                 105                 110
His Asp Cys Trp Gly Ser Asp Ser Tyr Ala Cys Leu Gly Gln Leu Asp
        115                 120                 125
Pro Ala Lys His Trp Ala Pro Arg Lys Glu Leu Val Arg Arg Asp Ala
    130                 135                 140
Asn Trp Lys Phe Ala Tyr His Met Cys Asn Ile Asp Trp Arg Cys Gly
145                 150                 155                 160
Val Thr Thr Ser Pro Val Phe Phe Asn Leu Gln Trp Val Lys Asn Glu
                165                 170                 175
Val Lys Val Ser Thr Leu Leu Pro Asn Gly Ser Thr Val Glu His Ser
            180                 185                 190
Ala Gly Glu Pro Leu Phe Trp Thr Glu Lys Asp Phe Ser Tyr Leu Val
        195                 200                 205
Lys Asp Asn Phe Glu Ile Gln Arg Glu Glu Val Lys Ile Ser Cys Phe
    210                 215                 220
Val Asp Pro Asp Tyr Trp Val Gly Glu Arg Lys Thr Lys Lys Ala Phe
225                 230                 235                 240
Cys Gln Asp Gly Thr Asn Phe Phe Glu Val Thr Ser His Gln Phe Cys
                245                 250                 255
His Gln Tyr Ala Cys Tyr Asn Phe Ser Lys Asp Glu Leu Leu Glu Ala
            260                 265                 270
Val Tyr Lys Glu Arg Ala His Glu Lys Ser Lys Asp Leu Pro Phe Gly
        275                 280                 285
Asn Lys Ser Trp Thr Val Val Thr Ala Ser Ile Asp Asp Leu His Ala
    290                 295                 300
Leu Ser Ala Ala Gln Ala Phe Glu Leu Glu Gly Leu Arg Ala Ser Phe
305                 310                 315                 320
Ala Glu Leu Asp Ser Arg Phe Arg Gln Leu Ser Glu Ile Leu Asp Thr
                325                 330                 335
Val Ile Ser Ser Ile Ala Lys Ile Asp Glu Arg Leu Ile Gly Arg Leu
            340                 345                 350
Ile Lys Ala Pro Val Ser Ser Arg Phe Ile Ser Glu Asp Lys Phe Leu
        355                 360                 365
Leu His Gln Cys Val Asp Ser Val Ala Asn Asn Thr Asn Cys Val Gly
    370                 375                 380
Asp Ser Ala Tyr Val Asp Gly Arg Trp Thr His Val Gly Asp Asn His
385                 390                 395                 400
Pro Cys Thr Thr Val Val Asp Glu Pro Ile Gly Ile Asp Ile Tyr Asn
                405                 410                 415
Phe Ser Ala Leu Trp Tyr Pro Ser Ala Ala Glu Val Asp Phe Arg Gly
            420                425                  430
Thr Val Gln Ser Glu Asp Gly Trp Ser Phe Val Val Lys Ser Lys Asp
        435                 440                 445
Ala Leu Ile Gln Thr Met Met Tyr Thr Lys Asn Gly Gly Lys Gly Thr
    450                 455                 460
Ser Leu Thr Asp Leu Leu Asp Tyr Pro Ser Gly Trp Leu Lys Gly Gln
465                 470                  475                480
Leu Gly Gly Leu Leu Tyr Gly Asn Ile Gly Val Tyr Leu Leu Ile Ala
                485                 490                 495
Phe Ala Phe Val Leu Leu Ile Arg Leu Ile Lys Ser Ala Gly Leu Cys
            500                 505                 510
<210>  70
<211>  1567
<212>  DNA
<213>  Thogoto病毒
<220>
<221>  CDS
<222>  (19)..(1557)
<223>  重新编码的thogoto病毒包膜
<400>  70
ccgctcgagc gggccacc atg ttc ctg cag aca gct ctc ctg ctc ctg tcc     51
                    Met Phe Leu Gln Thr Ala Leu Leu Leu Leu Ser
                    1               5                   10
ctg gga gtg gcc gaa cct gac tgc aac acc aag acc gcc aca ggc ccc     99
Leu Gly Val Ala Glu Pro Asp Cys Asn Thr Lys Thr Ala Thr Gly Pro
            15                  20                  25
tac att ctg gac cgg tac aag ccc aag ccc gtg acc gtg agc aag aag    147
Tyr Ile Leu Asp Arg Tyr Lys Pro Lys Pro Val Thr Val Ser Lys Lys
        30                  35                  40
ctg tac tcc gcc acc aga tac acc acc agc gcc cag aac gag ctg ctg    195
Leu Tyr Ser Ala Thr Arg Tyr Thr Thr Ser Ala Gln Asn Glu Leu Leu
    45                  50                  55
aca gct ggc tac cgg acc gct tgg gtg gcc tac tgc tac aac ggc gga    243
Thr Ala Gly Tyr Arg Thr Ala Trp Val Ala Tyr Cys Tyr Asn Gly Gly
60                  65                  70                  75
ctg gtg gac agc aac aca gga tgc aac gcc aga ctg ctg cac tat cct    291
Leu Val Asp Ser Asn Thr Gly Cys Asn Ala Arg Leu Leu His Tyr Pro
                80                  85                  90
cct tcc cgg gac gaa ctg ctc ctg tgg ggc tcc agc cat cag tgt agc    339
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Leu Leu Trp Gly Ser Ser His Gln Cys Ser
            95                  100                 105
tac ggc gac atc tgt cac gac tgc tgg ggc tcc gat agc tsc gcc tgc    387
Tyr Gly Asp Ile Cys His Asp Cys Trp Gly Ser Asp Ser Tyr Ala Cys
        110                 115                 120
ctg ggc cag ctg gat cct gcc aag cac tgg gct cct cgg aag gaa ctg    435
Leu Gly Gln Leu Asp Pro Ala Lys His Trp Ala Pro Arg Lys Glu Leu
    125                 130                 135
gtg aga cgg gac gcc aac tgg aag ttc gcc tac cac atg tgc aac atc    483
Val Arg Arg Asp Ala Asn Trp Lys Phe Ala Tyr His Met Cys Asn Ile
 140                145                 150                 155
gac tgg cgg tgc ggc gtg acc aca agc cct gtc ttc ttc aac ctg cag    531
Asp Trp Arg Cys Gly Val Thr Thr Ser Pro Val Phe Phe Asn Leu Gln
                160                 165                 170
tgg gtc aag aac gaa gtg aag gtg agc acc ctg ctg ccc aat gga agc    579
Trp Val Lys Asn Glu Val Lys Val Ser Thr Leu Leu Pro Asn Gly Ser
            175                 180                 185
acc gtg gag cac agc gct ggc gag ccc ctg ttc tgg acc gag aag gac    627
Thr Val Glu His Ser Ala Gly Glu Pro Leu Phe Trp Thr Glu Lys Asp
        190                 195                 200
ttc agc tac ctg gtg aaa gac aac ttc gag atc cag cgg gag gag gtg    675
Phe Ser Tyr Leu Val Lys Asp Asn Phe Glu Ile Gln Arg Glu Glu Val
    205                 210                 215
aag atc agc tgc ttc gtg gat cct gac tac tgg gtg ggc gag cgg aag    723
Lys Ile Ser Cys Phe Val Asp Pro Asp Tyr Trp Val Gly Glu Arg Lys
220                 225                 230                 235
acc aag aaa gcc ttc tgt cag gac ggc acc aac ttc ttc gaa gtg acc    771
Thr Lys Lys Ala Phe Cys Gln Asp Gly Thr Asn Phe Phe Glu Val Thr
                240                 245                 250
agc cac cag ttc tgc cac cag tac gcc tgc tac aac ttc tcc aag gac    819
Ser His Gln Phe Cys His Gln Tyr Ala Cys Tyr Asn Phe Ser Lys Asp
            255                 260                 265
gag ctg ctg gaa gct gtg tac aag gag cgg gcc cac gag aag agc aag    867
Glu Leu Leu Glu Ala Val Tyr Lys Glu Arg Ala His Glu Lys Ser Lys
        270                 275                 280
gac ctg ccc ttc ggc aac aag tcc tgg acc gtg gtg acc gcc tcc atc    915
Asp Leu Pro Phe Gly Asn Lys Ser Trp Thr Val Val Thr Ala Ser Ile
    285                 290                 295
gac gac ctg cat gct ctg agc gcc gct cag gcc ttc gaa ctg gag gga    963
Asp Asp Leu His Ala Leu Ser Ala Ala Gln Ala Phe Glu Leu Glu Gly
300                 305                 310                 315
ctg cgg gct agc ttt gct gaa ctg gac tcc aga ttc cgg cag ctg agc   1011
Leu Arg Ala Ser Phe Ala Glu Leu Asp Ser Arg Phe Arg Gln Leu Ser
                320                 325                 330
gag atc ctg gac acc gtg atc agc agc atc gcc aag atc gac gag aga   1059
Glu Ile Leu Asp Thr Val Ile Ser Ser Ile Ala Lys Ile Asp Glu Arg
            335                 340                 345
ctg atc ggc aga ctc atc aaa gct cct gtg agc agc cgg ttc atc agc   1107
Leu Ile Gly Arg Leu Ile Lys Ala Pro Val Ser Ser Arg Phe Ile Ser
        350                 355                 360
gag gac aag ttc ctg ctg cac cag tgc gtg gac agc gtg gcc aac aac   1155
Glu Asp Lys Phe Leu Leu His Gln Cys Val Asp Ser Val Ala Asn Asn
    365                 370                 375
acc aac tgt gtg gga gac agc gcc tac gtg gac ggc cgg tgg aca cat   1203
Thr Asn Cys Val Gly Asp Ser Ala Tyr Val Asp Gly Arg Trp Thr His
380                 385                 390                395
gtg ggc gac aat cat ccc tgc acc aca gtg gtg gac gag ccc atc ggc   1251
Val Gly Asp Asn His Pro Cys Thr Thr Val Val Asp Glu Pro Ile Gly
                400                 405                 410
atc gat atc tac aac ttc tcc gct ctg tgg tat cct tcc gcc gct gaa    1299
Ile Asp Ile Tyr Asn Phe Ser Ala Leu Trp Tyr Pro Ser Ala Ala Glu
            415                 420                 425
gtg gac ttc cgg ggc aca gtg cag tcc gag gac ggc tgg agc ttc gtg    1347
Val Asp Phe Arg Gly Thr Val Gln Ser Glu Asp Gly Trp Ser Phe Val
        430                 435                 440
gtg aag agc aag gac gcc ctg atc cag acc atg atg tac acc aag aac    1395
Val Lys Ser Lys Asp Ala Leu Ile Gln Thr Met Met Tyr Thr Lys Asn
    445                 450                 455
gga ggc aag ggc aca agc ctg acc gac ctg ctg gac tac cct agc gga    1443
Gly Gly Lys Gly Thr Ser Leu Thr Asp Leu Leu Asp Tyr Pro Ser Gly
460                 465                 470                 475
tgg ctg aag gga caa ctg ggc gga ctg ctg tac ggc aac atc gga gtg    1491
Trp Leu Lys Gly Gln Leu Gly Gly Leu Leu Tyr Gly Asn Ile Gly Val
                480                 485                 490
tac ctg ctg atc gcc ttc gcc ttc gtg ctg ctg atc aga ctg atc aag    1539
Tyr Leu Leu Ile Ala Phe Ala Phe Val Leu Leu Ile Arg Leu Ile Lys
            495                 500                 505
agc gcc ggc ctg tgc tga gctctagagc    1567
Ser Ala Gly Leu Cys
        510
<210>  71
<211>  512
<212>  PRT
<213>  Thogoto病毒
<400>  71
Met Phe Leu Gln Thr Ala Leu Leu Leu Leu Ser Leu Gly Val Ala Glu
1                5                  10                  15
Pro Asp Cys Asn Thr Lys Thr Ala Thr Gly Pro Tyr Ile Leu Asp Arg
            20                  25                  30
Tyr Lys Pro Lys Pro Val Thr Val Ser Lys Lys Leu Tyr Ser Ala Thr
        35                  40                  45
Arg Tyr Thr Thr Ser Ala Gln Asn Glu Leu Leu Thr Ala Gly Tyr Arg
    50                  55                  60
Thr Ala Trp Val Ala Tyr Cys Tyr Asn Gly Gly Leu Val Asp Ser Asn
65                  70                  75                  80
Thr Gly Cys Asn Ala Arg Leu Leu His Tyr Pro Pro Ser Arg Asp Glu
                85                  90                  95
Leu Leu Leu Trp Gly Ser Ser His Gln Cys Ser Tyr Gly Asp Ile Cys
            100                 105                110
His Asp Cys Trp Gly Ser Asp Ser Tyr Ala Cys Leu Gly Gln Leu Asp
        115                 120                 125
Pro Ala Lys His Trp Ala Pro Arg Lys Glu Leu Val Arg Arg Asp Ala
    130                 135                 140
Asn Trp Lys Phe Ala Tyr His Met Cys Asn Ile Asp Trp Arg Cys Gly
145                 150                 155                 160
Val Thr Thr Ser Pro Val Phe Phe Asn Leu Gln Trp Val Lys Asn Glu
                165                 170                 175
Val Lys Val Ser Thr Leu Leu Pro Asn Gly Ser Thr Val Glu His Ser
            180                 185                 190
Ala Gly Glu Pro Leu Phe Trp Thr Glu Lys Asp Phe Ser Tyr Leu Val
        195                 200                 205
Lys Asp Asn Phe Glu Ile Gln Arg Glu Glu Val Lys Ile Ser Cys Phe
    210                 215                 220
Val Asp Pro Asp Tyr Trp Val Gly Glu Arg Lys Thr Lys Lys Ala Phe
225                 230                 235                 240
Cys Gln Asp Gly Thr Asn Phe Phe Glu Val Thr Ser His Gln Phe Cys
                245                 250                 255
His Gln Tyr Ala Cys Tyr Asn Phe Ser Lys Asp Glu Leu Leu Glu Ala
            260                 265                 270
Val Tyr Lys Glu Arg Ala His Glu Lys Ser Lys Asp Leu Pro Phe Gly
        275                 280                 285
Asn Lys Ser Trp Thr Val Val Thr Ala Ser Ile Asp Asp Leu His Ala
    290                 295                 300
Leu Ser Ala Ala Gln Ala Phe Glu Leu Glu Gly Leu Arg Ala Ser Phe
305                 310                 315                 320
Ala Glu Leu Asp Ser Arg Phe Arg Gln Leu Ser Glu Ile Leu Asp Thr
                325                 330                 335
Val Ile Ser Ser Ile Ala Lys Ile Asp Glu Arg Leu Ile Gly Arg Leu
            340                 345                 350
Ile Lys Ala Pro Val Ser Ser Arg Phe Ile Ser Glu Asp Lys Phe Leu
        355                 360                 365
Leu His Gln Cys Val Asp Ser Val Ala Asn Asn Thr Asn Cys Val Gly
    370                 375                 380
Asp Ser Ala Tyr Val Asp Gly Arg Trp Thr His Val Gly Asp Asn His
385                 390                 395                 400
Pro Cys Thr Thr Val Val Asp Glu Pro Ile Gly Ile Asp Ile Tyr Asn
                405                 410                 415
Phe Ser Ala Leu Trp Tyr Pro Ser Ala Ala Glu Val Asp Phe Arg Gly
            420                 425                 430
Thr Val Gln Ser Glu Asp Gly Trp Ser Phe Val Val Lys Ser Lys Asp
        435                 440                 445
Ala Leu Ile Gln Thr Met Met Tyr Thr Lys Asn Gly Gly Lys Gly Thr
    450                 455                 460
Ser Leu Thr Asp Leu Leu Asp Tyr Pro Ser Gly Trp Leu Lys Gly Gln
465                 470                 475                 480
Leu Gly Gly Leu Leu Tyr Gly Asn Ile Gly Val Tyr Leu Leu Ile Ala
                485                 490                 495
Phe Ala Phe Val Leu Leu Ile Arg Leu Ile Lys Ser Ala Gly Leu Cys
            500                 505                 510

Claims (99)

1.重组慢病毒基因转移系统，包含：
(a)(i)包装构建体，包含DNA片段，所述DNA片段包含可操作地连接于BIV gag基因和BIV pol基因的启动子，或(ii)第一包装构建体，包含DNA片段，所述DNA片段包含可操作地连接于包含BIV gag基因的DNA片段的第一启动子，以及第二包装构建体，其包含DNA片段，所述DNA片段包含可操作地连接于包含BIV pol基因的DNA片段的第二启动子；
(b)病毒表面蛋白基因构建体，包含DNA片段，所述DNA片段包含可操作地连接于病毒表面蛋白基因的启动子；
(c)转移载体构建体，包含DNA片段，所述DNA片段包含的启动子可操作地连接于第一R区、U5区、UTR区、BIV包装序列、RRE序列、可操作地连接于异源目的基因的启动子、3′聚嘌呤带、U3区以及第二R区；和
(d)(i)rev基因，位于所述包装构建体、病毒表面蛋白基因构建体及转移载体构建体之一上，或(iii)rev构建体，包含DNA片段，所述DNA片段包含可操作地连接于rev基因的启动子。
2.权利要求1的基因转移系统，包含包装构建体，所述构建体包含DNA片段，所述DNA片段包含可操作地连接于BIV gag基因和BIV pol基因的启动子。
3.权利要求1的基因转移系统，包含第一包装构建体，其包含DNA片段，所述DNA片段包含可操作地连接于包含BIV gag基因的DNA片段的第一启动子；以及第二包装构建体，其包含DNA片段，所述DNA片段包含可操作地连接于包含BIV pol基因的DNA片段的第二启动子。
4.权利要求2的基因转移系统，其中包装构建体进一步包含RRE序列。
5.权利要求3的基因转移系统，其中至少一个包装构建体进一步包含RRE序列。
6.权利要求1的基因转移系统，其中rev基因和RRE序列来自BIV。
7.权利要求2的基因转移系统，其中gag基因包含重新编码的核苷酸序列。
8.权利要求2的基因转移系统，其中gag基因和pol基因分别包含重新编码的核苷酸序列。
9.权利要求2的基因转移系统，其中pol基因包含重新编码的核苷酸序列。
10.权利要求3的基因转移系统，其中gag基因包含重新编码的核苷酸序列。
11.权利要求3的基因转移系统，其中pol基因包含重新编码的核苷酸序列。
12.权利要求11的基因转移系统，其中pol基因在5′端包含ATG起始密码子。
13.权利要求1的基因转移系统，其中pol基因的蛋白酶区在该蛋白酶催化中心的三氨基酸基序中发生突变，且其中所述的突变蛋白酶与未突变的BIV蛋白酶相比对宿主细胞毒性较小。
14.权利要求13的基因转移系统，其中蛋白酶区在蛋白酶多肽氨基酸26位上编码Thr到Ser的突变。
15.权利要求1的基因转移系统，其中BIV包装序列包含不超过BIVgag基因开放读框序列的头101个碱基对。
16.权利要求15的基因转移系统，其中包装序列基本上由SEQ ID NO：39的核苷酸序列组成。
17.权利要求1的基因转移系统，其中转移载体构建体包含DNA片段，所述DNA片段包含的启动子可操作地连接于第一R区、U5区、UTR区、BIV包装序列、RRE序列、可操作地连接于异源目的基因的启动子、3′聚嘌呤带、U3区、第二R区和第二U5区。
18.权利要求2的基因转移系统，其中包装构建体进一步包含rev基因。
19.权利要求1的基因转移系统，其中病毒表面蛋白基因构建体包含env基因。
20.权利要求19的基因转移系统，其中env基因选自VSV-G env、LCMV env、LCMV-GP(WE-HPI)env、MoMLV env、长臂猿白血病病毒(GaLV)env、Phabdoviridae科成员的env基因、甲病毒属env基因、副粘病毒属env基因、黄热病病毒属env基因、逆转录病毒属env基因、沙粒病毒属env基因、副流感病毒env基因、索戈托病毒env基因以及杆状病毒属env基因。
21.权利要求1的基因转移系统，其中病毒表面蛋白基因编码VSV-Genv。
22.权利要求1的基因转移系统，包含位于所述包装构建体、病毒表面蛋白基因构建体及转移载体构建体之一上的rev基因。
23.权利要求1的基因转移系统，包含rev构建体，所述rev构建体含DNA片段，所述DNA片段包含可操作地连接于rev基因的启动子。
24.权利要求6的基因转移系统，其中rev基因不包含天然BIV rev内含子。
25.权利要求24的基因转移系统，其中rev基因包含SEQ ID NO：10。
26.权利要求22的基因转移系统，包含可操作地连接于rev基因的EF-1启动子。
27.权利要求23的基因转移系统，其中可操作地连接于rev基因的启动子是EF-1启动子。
28.权利要求6的基因转移系统，其中RRE序列基本上由SEQ ID NO：40的核酸序列组成。
29.权利要求1的基因转移系统，其中至少两个启动子是相同的。
30.权利要求1的基因转移系统，其中所有的启动子都不同。
31.权利要求1的基因转移系统，其中至少一个启动子是调控型启动子。
32.权利要求1的基因转移系统，它不含cPPT。
33.权利要求1的基因转移系统，其中转移载体构建体进一步包含cPPT。
34.权利要求33的基因转移系统，其中cPPT是来自人类免疫缺陷病毒的cPPT。
35.权利要求33的基因转移系统，其中cPPT是BIV cPPT。
36.权利要求35的基因转移系统，其中cPPT基本上由与SEQ ID NO：1的从碱基对4758到5293包含端点在内的核苷酸相对应的535个碱基对组成。
37.权利要求1的基因转移系统，其中U3区包含多聚腺苷酰化增强子。
38.权利要求37的基因转移系统，其中多聚腺苷酰化增强子基本上由SV40晚期多聚腺苷酰化增强子元件组成。
39.权利要求1的基因转移系统，它不编码BIV的至少vif、vpw、vpy或tat基因之一。
40.权利要求1的基因转移系统，它不编码BIV的vif、vpw、vpy、tmx和tat基因。
41.权利要求1的基因转移系统，其中U3区的一个或多个核苷酸改变或缺失，从而U3介导的转录减低或消除。
42.权利要求1的基因转移系统，包含可操作地连接于异源目的基因的美国土拨鼠肝炎病毒调控应答元件。
43.权利要求1的基因转移系统，其中异源目的基因编码选自T2-TrpRS、Eph B受体、ephrin B配体、血纤蛋白原E片段、VEGF可溶性受体、血管他丁、内皮他丁、视神经碱(optineurin)、小梁网蛋白、视杆细胞源的视锥生存因子(Rod-derived Cone Viability Factor)(RdCVF)以及抗-细胞凋亡基因产物的多肽。
44.权利要求1的基因转移系统，其中异源目的基因编码选自SEQ IDNO：61、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：65和SEQ ID NO：67的RdCVF多肽。
45.生产者细胞，包含权利要求1-44中任一项的基因转移系统。
46.权利要求45的生产者细胞，其中基因转移系统稳定地整合到生产者细胞的基因组中。
47.权利要求45的生产者细胞，其中基因转移系统短暂地转染到生产者细胞中。
48.产生复制缺陷型慢病毒载体颗粒的方法，包含：
(a)在足以允许所述细胞产生复制缺陷型慢病毒载体颗粒的细胞培养条件下，在细胞培养基中培养权利要求45的生产者细胞；和
(b)从培养基中收集所述复制缺陷型慢病毒载体颗粒。
49.根据权利要求48的方法，进一步包含向培养基中添加组蛋白脱乙酰基酶抑制剂。
50.根据权利要求49的方法，其中组蛋白脱乙酰基酶抑制剂是丁酸。
51.复制缺陷型慢病毒载体颗粒，由根据权利要求48的方法产生。
52.在具有或处于感染疾病风险的动物中治疗或预防所述疾病的方法，包含用根据权利要求51的复制缺陷型重组慢病毒载体颗粒侵染该动物的一个或多个细胞，其中异源目的基因编码能有效治疗或预防所述疾病的治疗性产物。
53.权利要求52的方法，其中动物是人类。
54.权利要求52的方法，其中一个或多个细胞是眼细胞。
55.权利要求54的方法，其中疾病选自眼新血管形成、湿性AMD(老年性黄斑变性)、糖尿病增殖性视网膜病、非糖尿病性视网膜病、糖尿病性黄斑水肿、视网膜分支静脉阻塞、视网膜中央静脉阻塞、未成熟婴儿视网膜病变、虹膜红变、新生血管性青光眼、凹周围毛细血管扩张、镰状细胞视网膜病、Eale′s病、视网膜血管炎、Von Hippel Lindau病、放射性视网膜病变、视网膜冷冻损伤、视网膜色素变性、视网膜脉络膜缺损、因单纯疱疹病毒性角膜炎所致的角膜新血管形成、角膜溃疡、角膜移植术、pterigyia，或创伤性视网膜营养不良、病理性衰老、色素性视网膜炎(retinitus pigmentosa)、Bardet-Biedel综合症、Bassen-kornzweig综合症、卵黄状黄斑变性、无脉络膜、回旋状萎缩、先天性黑曚(congenital amourosis)、Refsun综合症、Stargardt病和Usher综合症。
56.权利要求55的方法，其中治疗产物选自T2-TrpRS、Eph B受体、ephrin B配体、血纤蛋白原E片段、VEGF可溶性受体、血管他丁、内皮他丁、视神经碱、小梁网蛋白、视杆细胞源的视锥生存因子(RdCVF)以及抗-细胞凋亡基因产物。
57.权利要求55的方法，其中治疗产物是选自SEQ ID NO：61、SEQID NO：63、SEQ ID NO：65和SEQ ID NO：67的Rdcvf多肽。
58.权利要求52的方法，其中疾病选自癌症、与同种异体骨髓移植相关的移植物抗宿主病以及神经疾病。
59.权利要求52的方法，其中一个或多个细胞在体内侵染。
60.权利要求52的方法，其中一个或多个细胞在体外侵染。
61.在体外用重组慢病毒载体颗粒转导细胞的方法，包含使细胞与根据权利要求51的重组慢病毒载体颗粒接触，藉此细胞得以转导。
62.在体内用重组慢病毒载体颗粒转导细胞的方法，包含使细胞与根据权利要求51的重组慢病毒载体颗粒接触，藉此细胞得以转导。
63.在细胞中表达异源目的基因的方法，包含用根据权利要求51的重组慢病毒载体颗粒转导细胞，藉此异源目的基因在细胞中表达。
64.包装细胞，包含：
(a)(i)包装构建体，包含DNA片段，所述DNA片段包含可操作地连接于BIV gag基因和BIV pol基因的启动子，或(ii)第一包装构建体，包含DNA片段，所述DNA片段包含可操作地连接于包含BIV gag基因的DNA片段的第一启动子；以及第二包装构建体，包含DNA片段，所述DNA片段包含可操作地连接于包含BIV pol基因的DNA片段的第二启动子；
(b)病毒表面蛋白基因构建体，包含DNA片段，所述DNA片段包含可操作地连接于病毒表面蛋白基因的启动子；和
(c)(i)rev基因，位于所述包装构建体、病毒表面蛋白基因构建体及转移载体构建体之一上，或(ii)rev构建体，包含DNA片段，所述DNA片段包含可操作地连接于rev基因的启动子。
65.权利要求64的包装细胞，包含含有DNA片段的包装构建体，所述DNA片段包含可操作地连接于BIV gag基因和BIV pol基因的启动子。
66.权利要求64的包装细胞，包含含DNA片段的第一包装构建体，所述DNA片段包含可操作地连接于包含BIV gag基因的DNA片段的第一启动子；以及含DNA片段的第二包装构建体，所述DNA片段包含可操作地连接于包含BIV pol基因的DNA片段的第二启动子。
67.权利要求65的包装细胞，其中gag基因包含重新编码的核苷酸序列。
68.权利要求65的包装细胞，其中gag基因和pol基因分别包含重新编码的核苷酸序列。
69.权利要求65的包装细胞，其中pol基因包含重新编码的核苷酸序列。
70.权利要求66的包装细胞，其中gag基因包含重新编码的核苷酸序列。
71.权利要求66的包装细胞，其中pol基因包含重新编码的核苷酸序列。
72.权利要求64的包装细胞，其中pol基因的蛋白酶区在蛋白酶催化中心的三氨基酸基序中发生突变，且其中所述突变的蛋白酶与未突变的BIV蛋白酶相比对宿主细胞毒性较小。
73.权利要求72的包装细胞，其中蛋白酶区在蛋白酶多肽的氨基酸26位上编码Thr到Ser的突变。
74.权利要求64的包装细胞，其中病毒表面蛋白基因构建体包含env基因。
75.权利要求74的包装细胞，其中env基因选自VSV-G env、LCMVenv、LCMV-GP(WE-HPI)env、MoMLV env、长臂猿白血病病毒(GaLV)env、Phabdoviridae科成员的env基因、甲病毒属env基因、副粘病毒属env基因、黄热病病毒属env基因、逆转录病毒属env基因、沙粒病毒属env基因和副流感病毒env基因。
76.权利要求64的包装细胞，其中病毒表面蛋白基因编码VSV-Genv。
77.权利要求64的包装细胞，包含位于所述包装构建体、病毒表面蛋白基因构建体及转移载体构建体之一上的rev基因。
78.权利要求64的包装细胞，包含rev构建体，所述rev构建体含DNA片段，所述DNA片段包含可操作地连接于rev基因的启动子。
79.权利要求64的包装细胞，其中rev基因来自BIV但不包含天然BIV rev内含子。
80.权利要求79的包装细胞，其中rev基因包含SEQ ID NO：10。
81.权利要求77的包装细胞，包含可操作地连接于rev基因的EF-1启动子。
82.权利要求78的包装细胞，其中可操作地连接于rev基因的启动子是EF-1启动子。
83.权利要求64的包装细胞，其中至少两个启动子是相同的。
84.权利要求64的包装细胞，其中所有的启动子都不同。
85.权利要求64的包装细胞，其中细胞选自293细胞、293T细胞、COS细胞、HeLa细胞和Cf2TH细胞。
86.分离的BIV POL蛋白，包含与SEQ ID NO：51所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。
87.权利要求86的分离的BIV POL蛋白，包含SEQ ID NO：51。
88.权利要求86的分离的BIV POL蛋白，其在所述POL蛋白的N-末端包含甲硫氨酸。
89.分离的核酸分子，包含编码权利要求86-88中任一项的BIV POL蛋白的核苷酸序列。
90.分离的核酸分子，包含编码权利要求87的BIV POL蛋白的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列基本上由SEQ ID NO：50组成。
91.分离的核酸分子，包含编码权利要求88的BIV POL蛋白的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列基本上由SEQ ID NO：53组成。
92.分离的核酸分子，包含最小的BIV包装序列，其中所述的最小BIV包装序列与SEQ ID NO：39所示的核苷酸序列具有至少90％的同一性。
93.权利要求92的分离的核酸分子，其中的最小BIV包装序列基本上由SEQ ID NO：39所示的核苷酸序列组成。
94.分离的核酸分子，包含编码BIV REV蛋白的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码与SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。
95.权利要求94的分离的核酸分子，其中编码BIV REV蛋白的核苷酸序列编码由SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列所编码的同一个氨基酸序列。
96.权利要求94的分离的核酸分子，其中的核苷酸序列与SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列具有至少90％的同一性。
97.权利要求94的分离的核酸分子，其中的核苷酸序列基本上由SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列组成。
98.分离的核酸分子，包含最小的BIV RRE序列，其中所述的最小BIV RRE序列与SEQ ID NO：40所示的核苷酸序列具有至少90％的同一性。
99.权利要求98的分离的核酸分子，其中该最小BIV RRE序列基本上由SEQ ID NO：40所示的核苷酸序列组成。
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