CN1259171A - 在杆状病毒表达系统中产生的反转录病毒载体颗粒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种组合物。此组合物含有至少一种杆状病毒成分和至少一种反转录病毒成分,其中的反转录病毒成分能够被包装在反转录病毒颗粒中。

Description

在杆状病毒表达系统中产生的反转录病毒载体颗粒

本发明涉及一种组合物。

具体地说，本发明涉及一个产生反转录病毒颗粒的新型系统。

更具体地说，本发明涉及一种能够表达反转录病毒颗粒的组合物，此反转录病毒颗粒能够将一个所研究的核苷酸序列(此后简写为“NOI”)或者甚至是许多NOIs传递至所需的部位。

更具体地说，本发明涉及一种在基因治疗中有效的组合物。

基因治疗包括如下任何一种或几种形式：在例如一个或几个靶标部位如靶细胞中，加入，置换，删除，补充，控制其一个或几个核苷酸序列。如果此靶标部位是靶细胞，那么这些细胞可能是组织或器官的一部分。关于基因治疗的一般性指导可在“分子生物学”(Ed Robert Meyers，Put VCH，如p 556-558)中找到。

作为进一步的例证，基因治疗还提供了一种方法，借此，可用任何一种或几种核苷酸序列如基因置换或补充缺陷基因，可删除任何一种或几种致病基因或基因产物，为了例如，产生一种更满意的表型，可加入一种或几种新基因，可在分子水平控制细胞，以便治疗癌症(Schmidt-Wolf and Schmidt-Wolf，1994，血液学年刊69：273-279)或其它病症-如免疫性疾病，心血管病，神精学疾病，炎症或感染性疾病，还可操纵和/或导入抗原，以便诱发免疫应答-如作基因疫苗接种。

近年来，已提议将反转录病毒用于基因治疗。反转录病毒基本上是RNA病毒，具有不用于裂解性病毒的生命周期。就此而言，当反转录病毒感染细胞时，它的基因组将转变成DNA形式。换句话说，反转录病毒是一种通过DNA媒介物复制的感染性实体。

后面将提供关于反转录病毒感染等的更多详情。

存在许多种反转录病毒，例如包括：鼠白血病病毒(MLV)，人免疫缺损病毒(HIV)，马感染性贫血病毒(EIAV)，小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)，Rous肉瘤病毒(RSV)，Fujinami肉瘤病毒(FuSV)，Moloney鼠白血病病毒(Mo-MLV)，FBR-鼠骨肉瘤病毒(FBRMSV)，Moloney鼠肉瘤病毒(Mo-MSV)，Abelson鼠白血病病毒(A-MLV)，鸟白细胞增多症病毒-29(Avian myelocytomatosisvirus-29)(MC29)，以及鸟成红细胞增多症病毒(AEV)。

在Coffin等的“反转录病毒”(1997，Cold Spring HarbourLaboratory Press Eds：JM Coffin.SM Hughes，HE Varmus pp 758-763)中可找到反转录病毒的详细名单。

在本领域还可找到有关某些反转录病毒基因组结构的详情。例如，从NCBI Genbank可了解HIV的详细结构(即基因组检索号AFO33819)。

所有的反转录病毒都含有编码基本病毒粒子蛋白的3个主要的编码结构域gag，pol，env。然而，可以概括地将反转录病毒分成2类，即“简单型”和“复杂型”。借助于它们基因组的组织结构可将这二类病毒区分开。简单型反转录病毒通常只携带有基本的信息。相比之下，复杂型反转录病毒还编码从多剪接信息产生的辅助性调节蛋白。

甚至还可以将反转录病毒进一步分为7个类群。其中5个类群代表具有致癌潜能的反转录病毒。剩下的2个类群是慢病毒和泡沫病毒。在“反转录病毒”(1997 Cold Spring Harbour Laboratory Press Eds：JMCoffin，SM Hughes，HE Varmus pp 1-25)中提供了关于这些反转录病毒的述评。

除了人T-细胞白血病病毒-牛白血病病毒群之外(HTLV-BLV)其余所有的致癌性成员都属于简单型反转录病毒。HTLV，BLV以及慢病毒和泡沫病毒是复杂型反转录病毒。研究最多的一些致癌性反转录病毒是Rous肉瘤病毒(RSV)，小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)，以及鼠白血病病毒和人T-细胞白血病病毒(HTLV)。

甚至还可以将慢病毒群分成“灵长动物型”和“非灵长动物型”。灵长动物型慢病毒包括人自身免疫缺损综合症(AIDS)的病原体人免疫缺损病毒(HIV)，和猿猴免疫缺损病毒(SIV)。非灵长动物型慢病毒群包括，原型“慢病毒”维斯纳/梅迪病毒(VMV)，以及有关的公山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)，马感染性贫血病毒(EIAV)和比较新近发现的猫免疫缺损病毒(FIV)及牛免疫缺损病毒(BIV)。

慢病毒家族和其它类型反转录病毒之间的区别在于，慢病毒具有感染分裂性细胞和非分裂性细胞的能力(Lewis et al 1992 EMBO，J11；3053-3058，Lewis and Emerman 1994 J.Virol.68：510-516)。相比之下，其它反转录病毒如MLV不能感染非分裂性细胞，如构成肌肉，脑，肺和肝脏组织的细胞。

在感染过程中，反转录病毒开始是附着于特定的细胞表面受体。进入易感性宿主细胞之后，反转录病毒RNA基因组被母体病毒内携带的病毒编码的反转录酶复制成DNA。此DNA被转运至宿主细胞核，在此，它随后整合进入宿主细胞基因组。在此阶段，它通常被称为前病毒。在细胞分裂过程中，前病毒在宿主细胞染色体内是稳定的，并象其它细胞蛋白质一样被转译。该前病毒编码制造更多病毒所需的蛋白质和包装装置，产生的病毒可通过有时被称为“出芽”的方式离开细胞。

如已经指出的，每个反转录病毒基因组包含有编码病毒粒子蛋白和酶的被称为gag，pol和env的基因。在两个末端，这些基因的二侧有称为长末端重复(LTRs)的区域。LTRs负责前病毒的整合，以及转录。它们还起增强子-启动子序列的作用。换句话说，LTRs可以控制病毒基因的表达。借助于位于病毒基因组5′末端的psi序列对反转录病毒RNAs进行包裹。

LTRs本身是可被分为3个元件的锯齿状序列，此三个元件被称为U3，R和U5。U3来自只有其RNA的3′末端才有的序列。R来自在RNA二端的重复序列，U5来自只有此RNA 5′末端才有的序列。在不同的反转录病毒，这三个成分的大小可有相当大的改变。

为便于理解，下面提供了一个显示LTRs，gag，pol和env基本外观的，简单的反转录病毒基因组图解(未按大小比例)。

对于病毒基因组，转录起始位点是在左侧LTR中(如上面所示)U3和R之间的分界线处，加poly(A)(终止)位点是在右侧LTR中(如上面所示)R和U5之间的分界线处。U3包含在前病毒的大多数转录控制成分，这些成分包括对细胞，以及某些情况下对病毒转录激活蛋白敏感的启动子和多增强子序列。某些反转录病毒具有如下任何一种或几种编码与基因表达调节有关的蛋白质的基因：tat，rev，tax和rex。

如在上面图解中所示，反转录病毒RNA基因组的基本分子组成是(5′)R-U5-gag，pol，env-U3-R(3′)。在反转录载体基因组中，gag，pol和env不存在，或者没有功能。在该RNA二端的R区是重复的序列。U5和U3分别代表只有该RNA基因组5′和3′末端才有的序列。这三套末端序列在前病毒DNA中形成了长末端重复(LTRs)，它是整合进入被感染细胞基因组中的基因组形式。野生型反转录病毒中LTRs由(5′)U3-R-U5(3′)组成，因此U3和U5都含有对前病毒整合作用重要的序列。基因组中其它为了发挥适当功能作用所必须的序列包括，为第一条链反转录的引物结合部位，为第二条链反转录的引物结合部位，以及包装信号。

关于结构基因gag，pol和env本身，更详细地说，gag是编码病毒内部的结构蛋白。gag被蛋白水解处理后得到成熟的蛋白质MA(基质)，CA(衣壳)，NC(核蛋白壳)。基因pol编码反转录酶(RT)，既包含DNA聚合酶，又包含相关的RNA酶H活性和整合酶(IN)，介导基因组的复制。基因env编码病毒粒子的表面(SU)糖蛋白和跨膜(TM)蛋白，它们形成一个可同细胞受体蛋白特异性相互作用的复合体。这种相互作用最终将导致病毒膜与细胞膜相融合。

反转录病毒的被膜糖蛋白复合物包括二种多肽：外部的糖基化亲水多肽(SU)和跨膜蛋白(TM)。它们一起在病毒粒子表面形成低聚的“突起”或“突出的尖峰”。这二种多肽都由env基因编码，并以多蛋白前体的形式被合成，在转运至细胞表面的过程中此前体被蛋白水解切割。虽然未切割的Env蛋白也能够与受体结合，但是，切割事件本身对激活该蛋白质的融合能力是必需的，而这种能力对病毒进入宿主细胞是必不可少的。一般情况是，SU和TM蛋白都在多个部位被糖基化了。但是，对于某些病毒，例如MLV，其TM未被糖基化。

虽然对于装配病毒微粒而言，不一定需要SU和TM蛋白质，但是它们在进入过程中确实有必不可少的作用。关于这方面，是SU的功能区与靶细胞上的受体分子结合，并且通常是特异性的受体分子。据认为，这种结合事件可激活TM蛋白质诱导膜融合的潜力，此后病毒和细胞膜发生融合。对于某些病毒，显著的是MLV，被认为导致除去其一小部分TM细胞质尾部的切割事件，对于充分展现此蛋白质的融合活性，起关键性的作用(Brody et al 1994，病毒学杂志：4620-4627，Rein etal 1994，病毒学杂志：68：1773-1781)。TM跨膜区段末端的这种细胞质尾部仍保留在病毒膜的内侧，并且在不同的反转录病毒，其长度有相当大的改变。

因此，SU/受体相互作用的特异性，可解释反转录病毒的宿主范围和组织趋向性。在某些情况下，这种特异性可能限制重组反转录载体的转导能力。由于这个原因，许多基因治疗实验都使用了MLV。一种具有被膜蛋白4070A的特殊MLV被称为双嗜性病毒(amphotropicvirus)，这种病毒也能感染人细胞，因为它的被膜蛋白可同在人和小鼠中保守的磷酸运载蛋白“相对接”。由于这种运载体是普遍存在的，所以这些病毒能够感染多种细胞类型。但是在某些情况下，特别是从安全的观点考虑，特异性地对准局限的细胞可能是有益的。为此，几个研究组已构建了一种小鼠亲嗜性反转录病毒(ecotropic retrovirus)，它不象相对正常情况下只能感染小鼠细胞的双嗜性病毒，而能够特异性地感染特定的人细胞。用促红细胞生成素区段取代被膜蛋白的一个片段，产生了一个重组反转录病毒，然后特异性地与在其表面表达促红细胞生成素受体的人细胞如血红细胞前体相结合(Maulik and Patel 1997“分子生物技术：治疗应用和策略”，Wiley-Liss Inc.pp 45)。

除gag，pol和env之外，复杂型反转录病毒还含有编码附带的或辅助性蛋白质的“附带”基因。附带的或辅助性蛋白质被定义为，除了那些由通常的复制或结构基因gag，pol和env编码的蛋白质之外的，由附带基因编码的蛋白质。这些附带的蛋白质不同于包含在基因表达调节中的蛋白质，如那些由tat，rev，tax和rex编码的蛋白质。附带基因的例子包括vif，vpr，vpx，vpu和nef中的一种或几种。例如可在HIV中找到这些附带基因(参见例如“反转录病毒”中的p 802和803，Ed.Coffin et al Pub.CSHL 1997)。非-必需的附带蛋白质可能在特化的细胞类型中发挥功能，提供至少部分与细胞蛋白重叠的功能。一般来说，附带基因是位于pol和env之间，正好在env的下游，包括LTR的U3区，或者env及彼此的重叠部分。

复杂型反转录病毒已发展了使用病毒编码的转录激活物以及细胞转录因子的调节机制。这些反式作用的病毒蛋白起了由LTR指导的RNA转录激活物的作用。慢病毒es的反式转录激活物是由病毒基因tat编码的。Tat连接在被称为TAR的稳定的茎-环RNA二级结构上，此结构的功能之一是将Tat显然最佳地安置在反式激活转录位置上。

如前面所述，已经有人提出将反转录病毒作为传递系统(另一种方式是被表达为传递运载器或载体)，用于特别是将一个或许多NOI转运至一个或几个所需的部位。这种转运可在体外，从体内(ex vivo)，在体内发生，或者以它们的组合形式发生。当以这种方式使用时，一般将这种反转录病毒称为反转录病毒载体或重组反转录病毒载体。甚至已将反转录病毒载体开发用于研究反转录病毒生命周期的各个方面，包括受体使用，反转录和RNA包装(见Miller的述评，1992，Curr TopMicrobiol Immunol 158：1-24)。

在用于基因治疗的典型的重组反转录病毒载体中，至少可将gag，pol和env蛋白编码区的一个或多个的一部分从病毒中除去。这使该反转录病毒载体具有复制缺损。甚至还可以用NOI替换此除去的部分，以便产生能够将其基因组整合进入宿主基因组的病毒，但是其中经修饰的病毒基因组由于缺乏结构蛋白而不能增殖。在整合进入宿主基因组之后，例如NOI开始表达，产生治疗作用。因此，一般是通过下列方式达到将NOI转运进入所需部位的目的：使NOI整合进入重组病毒载体，将经修饰的病毒载体包装进病毒粒子包衣中，以及使之能对所需的部位进行转导，如靶细胞或靶细胞群。

通过组合应用包装或辅助细胞系以及重组载体，有可能增殖和分离出大量反转录病毒载体(例如制备适当滴度的反转录病毒载体)，用于随后对例如所需部位进行转导。

在某些情况下，增殖和分离过程可能要求分离出反转录病毒的gag，pol和env基因，并将它们单独转导进入宿主细胞，而产生“包装细胞系”。此包装细胞系可产生包装反转录病毒DNA所需要的蛋白质，但是由于缺乏psi区而不能进行包装。然而，当携带有NOI和psi区的重组载体被转导进入此包装细胞系时，辅助蛋白可以包装psi-阳性重组载体而产生重组病毒原种。可用它感染细胞而将NOI导入此细胞的基因组。重组病毒由于它的基因组缺乏制造病毒蛋白所需的全套基因，只可以感染一次，但不能增殖。因此，将NOI导入宿主细胞基因组，不会产生可能有害的反转录病毒。在“反转录病毒”(1997，Cold Spring Harbour LaboratoryPress Eds：JM Coffin，SM Hughes，HE Varmus pp 449)中提供了关于已有包装细胞系的概述。但是，在滴度水平通常处于不令人满意水平的情况下，这种技术是成问题的。然而，对反转录病毒包装细胞系的设计，已逐步致力于早期设计经常遇到的，特别是辅助病毒自发产生的问题。因为同源性可大大促进重组作用，减少或消除载体基因组和辅助病毒基因组之间的同源性，减少了辅助病毒产生的问题。

最近已发展了其中gag，pol和env病毒编码区携带在分别的表达质粒上的包装细胞，将这种表达质粒单独地转染进入包装细胞，这样，为了产生野生型病毒需要3次重组事件。有时将这种策略称为三质粒转染法(Soneoka et al 1995核酸研究23：628-633)。

当载体形成时，也可以用瞬时转染法测定载体的产生。关于这方面，瞬时转染可避免为产生稳定的载体形成性细胞系所需的较长的时间，如果此载体或反转录病毒包装可能对细胞是有毒的，则可使用瞬时转染。通常用于产生反转录病毒载体的成分包括，编码Gag/Pol蛋白质的质粒，编码Env蛋白质的质粒，和含有NOI的质粒。载体的产生包括将一种或一种以上这些成分瞬时转染进入含有其它所需成分的细胞。如果此载体编码毒性基因或干扰宿主细胞复制的基因如细胞周期抑制剂或者是诱导凋亡的基因，那么可能难以产生稳定的载体形成细胞系，但是，可将瞬时转染作用用于在细胞死亡之前产生此载体。并且，已用瞬时转染法形成了几个细胞系，可产生与稳定的载体形成性细胞系相当的载体滴度水平(Pear et al 1993，PNAS 90：8392-8396)。

鉴于某些HIV蛋白的毒性可以使之难以产生稳定的基于HIV的包装细胞，因此通常是借助于载体和辅助病毒的瞬时转染作用来制备HIV载体。一些研究者甚至已用水泡性口炎病毒(VSV)的Env蛋白质代替了HIV的Env蛋白质。插入VSV的Env蛋白质可提高载体浓度，例如通过瞬时转染作用产生了具有5×10⁵滴度(浓缩后为10⁸)的HIV/VSV-G载体(Naldini et al 1996，科学272：263-267)。因此，HIV载体的瞬时转染可能为产生高滴度载体提供了一个有用的策略(Yee etal 1994 PNAS 91：9564-9568)。但是，这种方法的缺点是，VSV-G蛋白对细胞相当有毒。

因此，如所指出的，反转录病毒载体可广泛地用于生物医学研究和基因治疗。目前用于产生反转录病毒载体的方法是利用如下的事实：可以使野生型反转录病毒基因组的二个作用解偶联，此二个作用即为蛋白质编码和作为新基因组拷贝的模板(例如Soneoka et al 1995，核酸研究23：628以及其中的参考文献)。装配新病毒颗粒，以及用于酶和调节功能所需的蛋白质，可由例如哺乳动物包装细胞系中的非基因组序列产生(例如Miller 1990，人类基因治疗1，5)。可提供一个缺乏蛋白质编码功能的基因组序列，以致使形成的反转录病毒载体粒子能够感染，但不能在靶细胞内复制。还可以设计基因组序列用于传递和整合治疗基因(Vile and Russel 1995英国医学公报51，12)。例如，用于产生基于鼠白血病病毒(MLV)的载体的标准方法，包括使用表达MLV的gag-pol和env基因(包装成分)的细胞系。这些成分将包装通过转导或用适当的质粒转染导入的可共存反转录病毒载体基因组。另一种方法包括，同时将gag-pol，env和载体基因组质粒转染进入适当的细胞。

虽然对这些系统的原理已充分了解，但是在实践中，重新构建的病毒装配系统常常不能产生在用于基因治疗实践中所需要的大量载体粒子。一般是通过从载体粒子生成性细胞的培养物中除去上清液来收获反转录病毒载体粒子。可应用物理方法，将形成的悬液对载体粒子进行浓缩，但是只能达到有限的程度，因为将出现如凝固和损伤的问题。因此，只可能将载体粒子悬液浓缩大约达到100倍。

本发明寻求提供一个改进的系统，用于制备随后在医疗中可能有用的病毒颗粒。

特别是，本发明寻求提供一个改进的系统，用于制备随后在医疗中可能有用的高滴度病毒颗粒。

本发明的第一方面是提供了一种组合物，包含至少一种杆状病毒成分和至少一种反转录病毒成分，其中的反转录病毒成分能够被包装进入反转录病毒颗粒中。

本发明的第二方面是提供了一种组合物，其中该组合物是含有至少一种反转录病毒成分的杆状病毒表达系统，其中的反转录病毒成分能够被包装进入反转录病毒颗粒中。

本发明的第三方面是提供了一种可从本发明组合物的表达获得的反转录病毒颗粒。

本发明的第四方面是提供了一种方法，用于制备包含表达本发明组合物的反转录病毒颗粒。

本发明的第五方面是提供了一种包含本发明组合物的昆虫细胞。

本发明的第六方面是提供了一种反转录病毒载体颗粒产生系统，它含有在昆虫细胞中的本发明的组合物。

本发明的第七方面提供了一种由本发明的反转录病毒载体颗粒产生系统产生的反转录病毒载体颗粒。

本发明的第八方面提供了一种表达载体，含有编码具有5′和3′末端的反转录病毒基因组的多核苷酸序列，该反转录病毒载体基因组能够在杆状病毒表达系统中被表达，并被包装进入反转录病毒载体颗粒中。

优选地是，该反转录病毒成分相当于一个反转录病毒基因组。

优选地，该组合物含有反转录病毒载体基因组的RNA转录起始位点，并且其中编码反转录病毒成分的核苷酸序列有效地连接于一个启动子，此启动子包含位于RNA转录起始位点上游的上游启动子成分，以及位于RNA转录起始位点下游的下游启动子成分。

优选地此下游启动子成分是在编码反转录病毒载体基因组的多核苷酸序列的上游。

在一个实施方案中，该启动子优选地是杆状病毒启动子。

优选地该启动子是多角体蛋白启动子，p10启动子和/或polh启动子。

在一个实施方案中，优选地此启动子是非杆状病毒启动子。

优选地，此启动子是T7启动子或sp6沙门氏菌噬菌体启动子。

优选地此组合物含有至少一个RNA切割成分。

优选地，对至少一个RNA切割成分的控制将产生没有任何杆状病毒成分的反转录病毒基因组。

优选地，至少一个RNA切割成分是位于启动子和编码反转录病毒成分的序列之间。

为了随后能在载体成分的5′末端切割，优选地至少一个RNA切割成分紧邻编码反转录病毒载体成分的序列。

优选地至少一个RNA切割成分是位于编码该反转录病毒成分序列的下游。

为了随后能在该载体成分的3′末端切割，优选地该RNA切割成分具有一个切割位点，此位点紧邻编码反转录病毒载体成分的序列。

为了随后能使之切割，优选地至少一个RNA切割成分是核酶切割位点。

为了随后能使之切割，优选地每个RNA切割成分都是核酶切割位点。

每个核酶切割位点都可以被单独来自该组合物的核酶切割。但是优选地，任何一个或几个核酶切割位点可被来源于第二个病毒成分的核酶切割。

核酶是细胞内在没有必须的蛋白质参与下，可以发挥催化特异性化学反应功能的RNA分子，例如，I类核酶是采取内含子的形式，此内含子可以介导从自我剪接的RNA前体切除它们自身。其它的核酶是来源于病毒RNA分子复制所必需的自我切割性RNA结构。象蛋白质酶一样，核酶可以折叠形成二级和三级结构，为底物及辅助因子如金属离子提供特异性结合位点。这类结构的实例包括：锤头型，发夹型或茎-环，假结，已有人描述了肝炎δ-抗基因组核酶。

每种单独的核酶都具有一个可识别和结合于靶标RNA中识别位点的基元序列。这种基元序列可采取一个或几个“结合臂”的形式，但是一般是双结合臂的形式。在锤头型核酶中，此结合臂是位于Helix II二侧的侧翼序列Helix I和Helix III。这种序列可以有不同的长度，通常每个长度为6-10个核苷酸，但是可以短些或长些。侧翼序列的长度可以影响切割的速度。例如已发现，将侧翼序列中核苷酸的总数从20个减少至12个，可使核酶切割HIV序列的转化率增加10倍(Goodchild，JVK，1991，Arch Biochem.Biophys 284：386-391)。在锤头型核酶中，核酶Helix II内的催化基元序列，在称为切割位点的位置切割靶标RNA。核酶是否能切割任何一个给定的RNA，可根据此含有适当切割位点的酶存在或不存在识别位点来确定。

各种类型的核酶识别它自己的切割位点。锤头型核酶切割位点具有正对上游的核苷酸碱基三联体GUX，在此G是鸟嘌呤，U是尿嘧啶，X是任何一种核苷酸碱基。发夹型核酶具有切割位点BCUGNYR，在此B是除腺嘌呤外的任何一种核苷酸碱基，N是任何一种核苷酸，Y是胞嘧啶或胸腺嘧啶，R是鸟嘌呤或腺嘌呤。发夹型核酶引起的切割发生在切割位点中的G和N之间。

在“分子生物学和生物技术学”(Ed.RA Meyers 1995 VCHPublishers Inc p 831-8320)和“反转录病毒”(Ed.JM Coffin et al 1997Cold Spring Harbour Laboratory Press pp 683)中可找到关于核酶的更详细说明。

本发明此实施方案的主要方面涉及一个组合物，它至少包含可从第一种病毒获得的第一病毒成分，以及可从第二种病毒获得的第二病毒成分；其中第一种病毒不同于第二种病毒；第二病毒成分二侧至少有二个切割位点(它们可以是相同的或不同的位点)；至少第二病毒成分的一部分能够被包装在一种病毒颗粒中，该病毒颗粒基本上不存在任何第一病毒成分。

在此，优选地至少一个切割位点是核酶切割位点。

在此，优选地每个切割位点都是核酶切割位点。

根据本发明的这一方面，该核酶切割位点可以被单独来源于该组合物的核酶切割。但是，优选地是，任何一个或几个核酶切割位点可被来源于第二病毒成分的核酶切割。

在此，优选的第一种病毒是杆状病毒。

在此，优选的第二种病毒是反转录病毒。

优选地，其下游启动子成分是位于编码反转录病毒成分的序列内。

优选地，其下游启动子成分是位于编码反转录病毒载体的序列内。

优选地，该反转录病毒成分，在编码反转录病毒载体基因组的序列任一端含有一个反转录病毒R区，其中的下游启动子成分是位于5′R区内，并在3′R区内具有一个相对应的序列。

在一个实施方案中，该组合物优选地按下行方向含有：一个上游杆状病毒启动子成分，一个下游杆状病毒启动子成分，一个核酶序列，一个反转录病毒5′R区，一个反转录病毒U5区，一个反转录病毒载体区，用于插入一个或几个将被此载体传递的基因，一个反转录病毒U3区，一个反转录病毒3′R区，以及任选地一个第二核酶序列。

在一个实施方案中，该组合物优选地按下行方向含有：一个上游杆状病毒启动子成分，一个含有下游启动子成分的反转录病毒5′R区，一个反转录病毒U5区，一个反转录病毒载体区，用于插入一个或几个将被此反转录病毒载体传递的基因，一个反转录病毒U3区，一个反转录病毒3′R区，以及任选地一个核酶序列。

优选地，该组合物包含一个或几个编码一个或几个包装成分，用于产生反转录病毒载体颗粒的核苷酸序列，该颗粒含有反转录病毒成分。

优选地，此组合物另外还含有至少一个待研究的核苷酸序列(NOI)。

此NOI优选的是对医疗有用的。

优选地此NOI是反转录病毒成分的一部分。

在此根据本发明所用的名词“组合物”，可能包括一个实体(如一种物质的组合物)，或者二个或二个以上实体。例如，本发明第一或第二方面的组合物可能是一个实体，如一个修饰的杆状病毒基因组，其中至少此杆状病毒基因组的一部分已用本发明的反转录病毒成分代替了。名词“修饰”包括对野生型基因组的实际修饰，或者对来自野生型基因组的已被修饰的实体进行从头构建(例如通过连接二个或二个以上的片断，以致形成与所修饰基因组相应的实体)。进一步举例说，本发明的包装成分可以包含在不同于刚才所述的实体中。又例如，本发明的组合物可以是反转录病毒颗粒的生成体和/或载体。

该组合物甚至可以是一个试剂盒，包含包括杆状病毒成分的第一部分，以及包括反转录病毒成分的第二部分。任选地，该试剂盒还可能包括一种或几种其它成分，如一种或几种适合的限制性酶等。

名词“反转录病毒载体基因组”包括能够感染的反转录病毒核酸，但是这种核酸本身不能够复制。因此，它是复制缺损的。反转录病毒载体基因组携带有，或者能够携带非反转录病毒来源的多聚苷酸序列，以便传递给靶细胞。反转录病毒载体基因组还可以包含另一些非反转录病毒序列，如在U3区包含非反转录病毒对照序列，一旦这种序列作为前病毒被整合进入靶细胞，它将影响此基因组的表达。此反转录病毒载体基因组不必含有仅来自单一反转录病毒的成分。例如，WO 96/37623描述了来源于二种不同反转录病毒的，具有杂合LTRs的反转录病毒载体。

名词“反转录载体颗粒”指的是已包装的反转录病毒载体基因组，优选地它能够结合于，并进入靶细胞。如已经对此载体基因组所论述的，该颗粒成分相对于野生型反转录病毒可能被修饰了。例如，为了改变其靶标特异性或者为了获得某些其它的所需功能，可以对此颗粒蛋白质包衣中的被膜蛋白进行遗传修饰。

如果该反转录病毒成分包含env核苷酸序列，那么此序列的全部或一部分可以任选地用另一env核苷酸序列的全部或一部分代替。用异源性env基因取代该env基因，是被称为假型化(pseudotyping)技术或策略的一个实例。假型化不是一种新的现象，可在如下文献中找到实例：WO-A-98/05759，WO-A-98/05754，WO-A-97/17457，WO-A-96/09400，WO-A-91/00047，和Mebatsion et al 1997细胞90，841-847。

假型化可使之具有一个或几个优点。例如，对于慢病毒载体，以HIV为基础载体的env基因产物，将限制这种载体仅能感染表达称为CD4蛋白质的细胞。但是，如果这种载体中的env基因已经用来自其它RNA病毒的env序列取代了，那么它们可能具有更广泛的感染范围(Verma andSomia 1997自然389：239-242)。例如，研究工作者已经使一种带有来自VSV的糖蛋白的以HIV为基础的载体假型化(Verma and Somia1997，同上)。

根据本发明，我们惊奇地发现，在杆状病毒表达系统中可产生功能性反转录病毒载体颗粒，并且这些颗粒能成功地将一个或几个NOI传递至靶细胞。

本发明的另一个重要优点是，与在哺乳动物系统中相比较，可产生较高滴度的载体颗粒。这也是一个意外的发现。

而且，还有附加的优点是，杆状病毒表达系统可以没有内源性哺乳动物遗传物质，因此，减少了在所形成的反转录病毒载体制备物中存在哺乳动物污染物的危险性。关于这点，昆虫污染物在哺乳动物系统中很可能没有生物活性，因此预期比哺乳动物污染物较少引起问题。

如所指出的，本发明的组合物包含有杆状病毒成分。

简单地说，杆状病毒是一种发现主要在昆虫中的多样性病毒群，据推测没有已知的节肢动物宿主(O′Reilly et al杆状病毒表达载体，实验室手册，1994，牛津大学出版社)，它们可以接纳相对较大的异源性DNA插入物，如本发明的NOI(O′Reilly et al杆状病毒表达载体，实验室手册，1994，牛津大学出版社)。它们具有非常强的表达异源性基因DNA，如本发明NOI的潜力，例如已报导了达总细胞蛋白质25％-50％的表达水平。

较详细地说，杆状病毒的杆形衣壳内具有双链的大环形DNA基因组。在其衣壳中，DNA浓聚成称为核心的核蛋白结构。衣壳加核心合在一起被称为核蛋白壳。

杆状病毒DNA的长度约80-120千碱基对(kbp)。通常被利用作为表达载体的杆状病毒，苜蓿银纹夜蛾多核多角体病毒(AcMNPV)(Miller et al 1987，基因工程vol 8，eds Setler，JK and Hollaender APlenum Press，New York)和蚕病毒，家蚕核型多角体病毒(BmNPV)(Maeda et al 1985，自然315：592-594)，二者都大约是130kbp。

核蛋白壳是在被感染的细胞核中产生，随后借助于二种方式之一进行包衣(即，它们获得膜)。核蛋白壳可以通过感染细胞的质膜出芽，或者可以在产生它们的核中获得被膜。膜包衣的核蛋白壳被称为病毒颗粒或病毒粒子。质膜出芽形成的病毒被称为芽生型病毒(BV)。

在正常的感染过程中，病毒产生核闭合体，它们含有埋藏在结晶蛋白基质中的被包衣核蛋白壳，此基质的主要成分是病毒编码的称为多角体蛋白的蛋白质。多角体蛋白是杆状病毒基因组单一基因的产物，是在感染后产生的，估计全部蛋白质的50％或50％以上是由感染的昆虫细胞产生。多角体蛋白基因(polh)的转录是由极有活性的启动子所驱动，因此，作为驱动外来基因表达的启动子它是非常适合的。如果此多角体蛋白基因被外来的基因取代，也可以产生类似水平的蛋白质产量。因此，表达载体的构建包括在多角体蛋白启动子的正好下游处插入一个外来的编码序列。但是，还不能直接达到此目的，因为病毒DNA巨大(约130kbp)使之不可能在体外简单地操作(Old and Primose 1989“基因操作原理”4th Ed.Blackwell Scientific Publicarions pp 290-291)。

昆虫杆状病毒表达系统提供了一个真核环境，即对某些真核蛋白质生物学活性所需要的适当折叠，二硫键形成，低聚化作用和/或其它的翻译后修饰，一般是有利的。已报导的在杆状病毒感染的昆虫细胞中发生的翻译后修饰包括：信号切割，蛋白水解切割，N-糖基化作用，O-糖基化作用，酰化作用，酰胺化作用，磷酸化作用，异戊二烯化作用，及羧化作用。这些修饰作用的位点，对在昆虫和哺乳动物细胞中产生的蛋白质，通常在相同的位置(O′Reilly et al同上)。

杆状病毒表达载体的一个有利特点是具有非常强的表达异源性基因DNA-如本发明NOI的潜力。已报导的用杆状病毒表达载体的最高表达水平是总细胞蛋白质的25％-50％。此水平等同于polh基因(多角体蛋白)的表达水平，相当于每109个细胞(例如1升培养物)大约1克蛋白质产物。

但是，不是所有的异源性蛋白质都能以同多角体蛋白一样的水平产生，并且，仅在少数情况下达到了接近总细胞蛋白质25％的水平。在涉及其它病毒家族结构基因表达的多数情况下，其产物是非常稳定的。大多数异源性蛋白质，是以10mg-100mg/10⁹细胞的水平产生。然而，在对不同的真核表达系统进行比较的情况下，总蛋白质产生方面杆状病毒系统通常优于其它的表达系统。

因此，从广泛的方面来说，本发明提供了一种用于产生大量NOI或其表达产物的生产装置(例如一种容器，或者甚至是一种生物体或其细胞)，其中该装置包括一种培养基，此培养基含有一种包含NOI的杆状病毒组合物。优选地，此杆状病毒组合物是本发明第一方面的组合物。

使用非常晚期启动子(例如polh和p10启动子)，为以杆状病毒作基础的表达系统提供了明显的优势，此启动子是在病毒复制的唯一潜伏期内被激活和强烈地被转录。因为此潜伏期不同于包括BV形成的晚期时相，所以，异源性基因DNA如本发明NOI的表达最低限度地干扰BV的产生，并且对病毒向异源性基因缺失或失活的突变具有非常小的选择性压力。

非常晚期表达作用对于异源性基因DNA，如本发明的NOI的表达可能是特别有利的，这种异源性表达对必要的细胞功能如细胞毒基因产物具有破坏作用。在病毒感染的非常晚期时相内表达基因的负面作用是，在晚期时相内，细胞翻译后的修饰能力看来会下降。

杆状病毒的杆形核蛋白壳可以提供容纳较大的病毒DNA基因组，并且很可能杆状病毒载体可能容纳100kbp或100kbp以上的附加DNA。可用杆状病毒载体系统同时表达的基因数量也可能很高。但是，为了形成非常大的插入，可能必须构建一系列转移质粒，使有可能以连续增加的方式构筑插入。这种限制与在体外大DNA的脆性有直接关系，而与载体系统本身无关，同样，如待表达的基因多于3个，那么需要附加的转移质粒。

所有的特征性杆状病毒非常晚期基因都是非剪接的，但能有效地表达。因此，该杆状病毒系统对表达非剪接的cDNA基因特别有效。但是，杆状病毒表达系统确能实现至少某些剪接，并且已注意到它在从多基因家族中鉴定和获得特异性基因产物的用途。

因此，从一个广泛的方面，本发明提供了利用杆状病毒组合物表达含有至少一个内含子的NOI。优选地，此杆状病毒组合物是一种根据本发明第一方面的组合物。

杆状病毒载体是辅助病毒依赖性的，所以使用比较简单。与构建一个克隆的高表达性重组真核细胞系相比较，构建重组的杆状病毒相当快捷且简便。

虽然使用基于AcMNPV和使用基于BmNPV的载体的基本技术是类似的，但是基于AcNPV的系统对于大多数普通的应用具有许多优点。与支持BmNPV复制的细胞系相比较，支持AcMNPV复制的细胞系在生长特征和表达水平方面更优越。此外，与基于BmNPV的系统相比较，可用于基于AcMNPV系统的转移质粒和母体病毒的范围要大得多。而且，使用遗传修饰的基于AcMNPN的载体是有利的，因为它只在昆虫细胞内复制，并且能够携带大的插入(大于15kb)(Boyce and Butcher 1996PNAS 93：2348-2352)。

更经常与基于AcNPV的载体一起使用的细胞系是草地夜蛾(SF)细胞系，因为它们已被充分测定，具有卓越的生长和操作特性。已报导这种细胞能以总细胞蛋白质的大约20％或以上的水平产生某些蛋白质，任何其它一般可利用的细胞系将不可能提供比此高三倍蛋白质的产量，使用SF细胞系，如SF细胞系的IPBL-SF 21 AE株(Vaughn etal(1997)，体外试验，13，213-217)是特别优选的。衍生细胞系Sf9或Sf8也可能是优选的。但是，还可以使用其它细胞系，如Tricoplusia ni 386(Kurstack and Marmorosch(1976)无脊椎动物细胞培养在医学，生物学和农业中的应用，Academic Press，New York，USA)。这些细胞系，以及适合用于本发明的其它昆虫细胞系如pBCC4-1are都可购得(例如从Stratagene，La Jolla，CA，USA和Novagen)。

虽然推测基于AcMNPV的载体，其宿主特异性是局限于节肢动物，但是已证明，重组AcMNPV病毒可以感染多种哺乳动物细胞系(Boyceand Butcher 1996 PNAS 93：2348-2352)。不象反转录病毒和腺病毒载体，不能使之专门感染肝脏，已显示证明基因修饰的AcMNPV杆状病毒对肝细胞有强趋向性(Sandig et al 1996人基因治疗7：1937-1945，Hofmann et al 1995 PNAS 92：10099-10103)。

一般通过等位基因取代将NOI导入杆状病毒基因组。按照等位基因取代策略，将外来基因插入转移质粒中，致使它位于所需病毒启动子的下游，二侧有将使此基因和启动子定向于此病毒基因组中特定区域的病毒序列。将此质粒和母体病毒DNA共转染进入宿主细胞，细胞中的酶对此DNA进行重组。此过程主要包括外来基因侧翼的质粒DNA区和在病毒基因组中它们的同源对应物之间的同源重组。

在杆状病毒表达系统中可使用“晚期”和“早期”启动子。polh和p10启动子是在感染晚期表达的强启动子实例。尽管已鉴定了许多对转录可能有重要意义的病毒基因产物(Hasnain et al 1997基因190：113-118)，但是，对于这些启动子对转录的调节作用目前尚不充分了解。在感染过程早期驱动基因表达的启动子，也被认为是用于在杆状病毒感染的细胞中缓慢形成的非毒性蛋白质的启动子。杆状病毒表达系统还具有作为非融合蛋白表达基因的出色运行记录(也就是，使用天然翻译起始密码子和N-末端序列表达基因)，但是因为融合，对某些蛋白质的表达可达到较高的水平。

已知已将昆虫杆状病毒表达系统用于产生反转录病毒样颗粒(VLP)(例如参阅Gheysen et al，1989细胞59，103；Morikawaet al，1991病毒学，183，288；Griffiths et al，1993病毒学杂志，67，3191；Sommerfelt et al，1993病毒学，192，298)。这种昆虫杆状病毒系统已被广泛地用于分析Gag装配反应，并且所作的许多观察是与产生基因治疗载体有关。蛋白酶和聚合酶基因的共表达(应用gag-pol构建物)，导致此病毒颗粒成熟，在最后的病毒颗粒内提供全部的功能性Gag和Pol抗原(Konvalinka et al，1995，欧洲生化杂志，228，191；Wagner et al，1992，病毒学档案127，117)。并且，存在于VLP-表达细胞表面的被膜抗原也掺入进VLP(Yamshchikovet al，1995，病毒学214，50；Garnier et al，1995，病毒学杂志69，4060)。

但是，应该注意到，VLP是没有病毒基因组的蛋白质颗粒。因此，VLP是非感染性的，缺乏复制所要求的病毒(或其它DNA/RNA)。VLP在宿主细胞内确实不复制。绵羊试验显示，与亚单位疫苗(病毒蛋白质)或通过化学失活作用杀死的病毒相比较，VLPs具有更强的致免疫性。此外，它们对于诱发体液、细胞-介导的、以及粘膜免疫性也更有效。VLP的生产和操作也是安全的。用于制备VLPs的杆状病毒载体和宿主细胞不是由哺乳动物来源产生。因此它们不含有哺乳动物来源的病原体(Roy.P.1996 Inter Virology 39：62-71。参见OBM 10 spec text page2，lines 20-30 and page 3，lines 1-10)。

并且已证明，单一gag基因的表达对于满足形成反转录病毒VLP的要求是足够的，所产生的反转录病毒VLP的量，似乎与编码前体蛋白质的gag的表达水平成正比。因此，不存在任何限制反转录病毒VLP出芽过程的次级修饰，并且VLP的产量超过所产生杆状病毒的水平。

WO 95/22617曾建议应用杆状病毒系统产生反转录病毒载体，但是重要的是，它没有指出可能达到此目的任何方法。

因此，尽管有一些与反转录病毒蛋白质有关的观察结果，以及尽管几年来文献中已有可利用的资料，但是，以前从来没有将杆状病毒系统用于产生反转录病毒载体。其原因之一是当在昆虫杆状病毒系统中成功地产生了反转录病毒的蛋白质成分时，没有料想到能够满足功能性反转录病毒载体颗粒的要求。这些要求包括，正确地包装载体基因组，以及形成的载体颗粒感染靶细胞的能力和以前病毒整合进入靶细胞的能力。特别的考虑是需要一个载体基因组，它能够在靶细胞中进行从RNA变成前病毒DNA的准确反转录，并且能够产生可以成功地整合进入靶细胞基因组的前病毒DNA。这要求此RNA含有适当的反转录所需的引发和其它识别位点(Luciw和Leung的评述：反转录病毒，Ed.J.A.Levy 1992Plenum)，并要求此DNA产物具有实现整合所必需的末端序列(Luciw和Leung的述评，Op.cit；Cannon et al，1996，病毒学杂志70，8234)。此外，被整合的前病毒必须含有在随后的整合过程中基因表达所必需的控制成分。

本发明的结果是非常令人吃惊的，因为杆状病毒表达系统具有某些不平常的特征，使之对用于产生反转录病毒载体的杆状病毒载体的设计远非直接了当。其有效性所部分需要的杆状病毒启动子成分，是位于RNA转录起始位点的下游(Posse and Howard，1987，核酸研究，15，10233；Rankin et al，1988，基因70，39；Oni et al，1989，分子生物学杂志，210，721)。这意味着为了有效地转录(这要求提供高滴度载体)反转录病毒载体基因组在其5′末端必须具有杆状病毒序列。为了反转录和整合作用，需要特异性反转录病毒末端序列，则存在这种非反转录病毒序列原则上是不希望的，并且可以预料将干扰正常的反转录载体基因组的功能。

如前指出的，本发明通过提供杆状病毒表达系统，用于产生反转录病毒载体和/或反转录病毒颗粒(它可能作为载体起作用)而克服了以往的技术问题。

由本发明的组合物产生的或来自本发明组合物的反转录病毒颗粒(也可以表述为“反转录病毒颗粒载体”)，可用于在体内和体外将一个或几个NOI传递给细胞，特别是传递有治疗活性的NOIs。可将一个或几个所选择的NOIs掺入载体基因组而在靶细胞内表达。此NOI可能具有一个或几个其自身的表达控制序列，或者可以由载体LTR控制它们的表达。为了适当地表达NOI，可在LTRs内或者在其之间包含启动子，此启动子是在某些条件下，或者在某些细胞类型中优选地具有活性。此NOI可以是有义序列或反义序列。而且，如果有多种NOI，那么这些NOI可以是有义序列或反义序列，或者是它们的组合。

在优选的情况下，本发明的反转录病毒载体基因组一般可包含在5′和3′末端的LTR，一个或几个NOI(包括有治疗活性的基因和/或标记基因)，或者用于插入一个或几个NOI的适合插入位点。在某些情况下，可能有包装信号使基因组在生产细胞内包装成载体颗粒。甚至还可能有适合的引物结合位点和整合位点，使载体RNA可反转录成DNA，并且将前病毒DNA整合进入靶细胞的基因组。在优选的实施方案中，该反转录病毒载体颗粒具有反转录系统(匹配的反转录和引物结合位点)和整合系统(匹配的整合酶和整合位点)。

根据本发明，有可能对此病毒基因组或反转录病毒载体核苷酸序列进行操作，以便可用一个或几个NOI代替或补充病毒的基因。NOI可能是任何一种或几种选择的基因，标记基因和治疗性基因。已成功地将多种不同的适合标记物用于反转录病毒载体。在“反转录病毒”(1997 ColdSpring Harbour Laboratory Press Eds：JM Coffin，SM Hughes，HEVarmus pp 444)对这种标记物进行了评定，这种标记物包括，但不局限于，分别赋予对G 418和潮霉素抗性的细菌新霉素和潮霉素磷酸转移酶基因；赋予对氨甲喋呤抗性的突变小鼠二氢叶酸还原酶基因；使细胞能生长在含有霉酚酸，黄嘌呤和氨基喋呤的培养基中生长的细菌gpt基因，使细胞能在没有组氨酸但含有组氨醇的培养基中生长；赋予对多种药物抗性的多药物抗性基因(mdr)；以及赋予对嘌呤霉素或腐草霉素抗性的细菌基因。所有这些标记物是显性选择的，使之可以对多数表达这些基因的细胞进行化学选择。

本发明的组合物可用于特别是医学应用，如诊断或治疗应用。

因此，根据本发明，NOI可以是一个治疗性基因-其含意是此基因本身可能能够诱发治疗作用，或者它可以编码能够诱发治疗作用的产物。

治疗性NOIs的非限制性实例包括编码如下物质的基因：肿瘤抑制蛋白，细胞因子，抗病毒蛋白，免疫调节分子，抗体，工程类免疫球蛋白样分子，融合蛋白质，激素，膜蛋白，血管活性蛋白或肽，生长因子，核酶，反义RNA，酶，药物前体如药物前体激活性酶，细胞毒性剂，以及酶抑制剂。

药物前体的实例包括但不局限于鬼臼乙叉苷磷酸盐(同碱性磷酸酶一起使用)，5-氟代胞嘧啶(同胞嘧啶脱酰胺酶一起使用)，Doxorubin-N-对羟基苯氧基乙酰胺(同青霉素-V-酰胺酶一起使用)；对-N-双(2-氯乙基)氨苄基谷氨酸盐(同羧肽酶G2一起使用)；头孢菌素氮芥氨基甲酸酯(同B-内酰胺酶一起使用)；SR 4233(同p 450还原酶一起使用)；丙氧鸟苷(同HSV胸腺嘧啶激酶一起使用)；芥子药物前体(同硝基还原酶一起使用)，以及环磷酰胺或异环磷酰胺(同细胞色素p 450一起使用)。

可能治疗的疾病包括但不局限于：癌症，心脏病，中风，神经变性性疾病，关节炎，病毒感染，细菌感染，寄生虫感染，免疫系统疾病，病毒感染，肿瘤，血液凝固性疾病，以及遗传性疾病-如慢性肉芽肿，Lescg-Hyhan综合症，帕金森病，脓胸(empysema)，苯丙酮尿症，镰状细胞性贫血，α-地中海贫血症，β-地中海贫血症，戈谢病。

应用反转录载体进行基因治疗的靶细胞包括但不局限于：造血细胞(包括单核细胞，巨噬细胞，淋巴细胞，粒细胞，或者这些细胞任何一种的前身细胞)；内皮细胞，肿瘤细胞，基质细胞，星形细胞，或胶质细胞，肌肉细胞，上皮细胞，神经元，成纤维细胞，肝细胞，星形细胞，和肺细胞。

在本发明的反转录病毒载体内，一个或几个NOIs可以在病毒LTR的转录控制之下。按另一种方式，为了实现较高水平表达的目的，可以存在增强子-启动子成分的组合形式。此启动子-增强子成分优选地具有强活性，或者能够在靶细胞内被强烈地诱导。强活性启动子-增强子组合的一个实例是人细胞肥大病毒(HCMV)主要中早期(MIE)启动子/增强子组合。此启动子-增强子组合的活性可能是组织或时序限制性的。适合的组织限制性启动子-增强子组合的实例是那些在肿瘤细胞中具有高活性的组合，如来自MUC1基因或CEA基因的启动子-增强子组合。

低氧或局部缺血可调节表达在某些情况下也特别有用。低氧对广泛不同类型的细胞都是基因表达的有力调节剂，并且是通过诱导低氧诱发性转录因子如低氧诱发性因子-1(HIF-1)而起作用(Wang andSemenza 1993 PNAS(USA)90：430)，此诱发性因子结合于相关的DNA识别位点，即在各种基因启动子上的低氧反应元件(HRE)。已将来自小鼠磷酸甘油酸激酶-1(PGK-1)基因的HRE多聚体形式，用于控制人肌纤维瘤细胞在体外和在体内实体瘤低氧反应中对标记基因和治疗基因的表达(Firth et al 1994，PNAS 91(14)：6496-6500；Dachs et al 1997 Nature Med，5：515)。另一方面，在肿瘤的局部缺血区也存在葡萄糖缺乏的事实，可被用于激活异源性基因DNA-如本发明的NOI-在肿瘤中的特异性表达。已发现grp 78基因启动子的截短的632个碱基对序列能够在体内鼠肿瘤中驱动报告基因高水平表达，此序列已知可被葡萄糖缺乏而特异性激活(Gazit et al 1995癌症研究55：1660)。

为了随后用于基因治疗，本发明的反转录载体基因组优选地含有为有效地发挥载体功能所必需的最少量反转录病毒物质。这样做的目的是为了给NOI(s)的掺入留出空隙，并且也为了安全的原因。由于不存在编码一个或几个由gag-pol和env基因所编码的结构(或包装)成分的功能性基因，反转录病毒载体基因组优选地是复制缺损性的。形成颗粒所需的缺少成分可在生产细胞内按反式提供。此基因组内不存在病毒结构成分也意味着，所产生的不希望有的免疫应答可以减少或避免，这些应答是针对在靶细胞中表达的病毒的。而且，当打算体内使用时，优选地应避免感染性病毒颗粒有重建的可能。因此，优选地应尽可能远地将病毒结构成分排除出该基因组，为的是减少任何成功重组的机会。

本发明的反转录病毒载体颗粒一般是在适当的生产细胞中产生。

因此，本发明还涉及一种包含本发明组合物的生产细胞。

生产细胞可能是一种包装细胞，它含有正常被整合进入其基因组的病毒结构基因。然后为了产生感染性的，复制缺损性载体颗粒用编码该载体基因组的核酸转染此包装细胞。按另一种方法，可用编码该载体基因组和结构成分的核酸序列，和/或同存在于一种或几种如下表达载体上的核酸序列共转染此生产细胞：质粒，腺病毒载体，疱疹病毒载体，痘苗病毒载体，或者任何一种已知可将功能性DNA传递进入靶细胞的方法。

适合的生产细胞包括昆虫细胞和哺乳动物细胞，但也可以是其它适合的细胞。优选地此生产细胞是昆虫细胞。

本发明还提供了一种通过基因治疗法治疗病人的药物组合物，其中该组合物包含治疗有效剂量的本发明组合物，或者由该组合物产生的，或来自该组合物的病毒颗粒。该药物组合物可以用于人或动物。通常，内科医生可确定对某一病人最适合的精确剂量，此剂量将随年龄，体重和特定病人的反应而改变。

该组合物还可任选地包含药剂学允许的载体，稀释剂，赋形剂或佐剂。可根据打算采用的给药途径和标准的药剂学规程选择药剂载体，赋形剂或稀释剂。除了载体，赋形剂或稀释剂之外，此药物组合物还可以包含任何适合的粘合剂，润滑剂，混悬剂，包衣剂，溶解剂和其它的可以帮助或增加该病毒进入靶标位点的运载剂(例如脂质投递系统)。

在适当的情况下，此药物组合物可通过如下任何一种或几种方式给药：吸入，以栓剂或阴道栓剂的形式，以洗剂，溶液，乳膏或粉剂的形式局部给药，通过皮肤贴剂使用，以含有赋形剂如淀粉或乳糖的片剂形式口服，或者以单独或同赋形剂混合的胶囊或卵状小体(ovule)的形式，或者以含有芳香剂或着色剂的酏剂、溶液或悬液的形式，或者可以将它们非肠道注射给药，例如腔内注射，静脉内注射，肌内注射或皮下注射。为了注射给药，此组合物可以最好以无菌水溶液的形式使用，此溶液可含有其它一些物质如足够的盐或单糖，使此溶液与血液等张。为了含服或舌下给药，此组合物可以以常规方法配制的片剂或锭剂的形式给药。

一方面，本发明提供了一个表达载体，它含有编码具有5′和3′末端的反转录载体基因组的多核苷酸序列，该反转录载体基因组能够在杆状病毒表达系统中被表达并包装进入反转录载体颗粒中。因此，5′和3′末端在反转录和整合中可发挥功能。

在此描述了三个方案，用于克服具有RNA转录起始位点上游和下游成分的杆状病毒启动子的问题。此三个方案被显示在图1-3中。

在第一个方案中(见图1)，是将该启动子的下游成分，在编码反转录病毒载体基因组序列的上游末端掺入其R区(被称为5′R区)。这样就使RNA转录起始位点直接安置在编码反转录病毒载体基因组序列的前面。如果将此启动子下游成分的对应物，在编码反转录病毒载体基因组序列的下游末端也掺入此R区(被称为3′R区)，使这二个R区可相同或非常相似地将载体RNA基因组转变成DNA病毒前体，此载体基因组将正确地发挥功能。

在第二个方案中(见图2)，是使一个在RNA转录子中可被切割的序列，在杆状病毒启动子和编码反转录载体基因组的序列之间包含在此载体中。一旦产生了初始的RNA转录子，杆状病毒启动子的下游成分可因此被切割。优选地，切割位点是紧邻编码此反转录载体基因组的序列存在，导致产生了适当的载体基因组。核酶是可以实现这种功能并可以被构建进入DNA构建体的RNA酶。对适当核酶的结构和功能已进行了充分的研究(例如Cech 1992 Curr.Op.Struct.Biol.2，605)，实例包括锤头核酶，发夹核酶和肝炎δ抗基因组核酶。作为RNA切割序列核酶序列的内含物，在编码反转录病毒载体基因组的序列末端具有一个切割位点，此包含物可用于对全部转录物供给末端完整的RNA。每个被转录的分子都将含有核酶序列，并且在cis中的单独切割就能满足每个核酶产生正确模板的要求。

在第三个方案中(见图3)，应用了非杆状病毒启动子。适合的启动子实例包括T7噬菌体启动子和sp6沙门氏菌噬菌体启动子。对于T7启动子，可以将5′R区的末端G残基精确地安置在T7启动子的转录起始位点，以便在反转录病毒载体基因组内产生一个真正的5′末端残基。例如需要通过一个表达T7聚合酶的重组杆状病毒来提供T7聚合酶的来源(Polkinghorn and Roy 1995核酸研究23，188)。

优选地，编码反转录病毒载体基因组的表达载体是杆状病毒表达载体，即一个基于重组杆状病毒基因组的载体。一般来说，病毒载体比非病毒载体容易操作。例如，与用DNA质粒转染细胞相比较，可更可靠地实现将病毒载体转移进入细胞。但是按另一方面，此表达载体可以是非杆状病毒表达载体，或者是非病毒表达载体如DNA质粒。

在根据上述三个方案中任何之一的表达载体中，可能存在一个位于编码此反转录病毒载体的序列下游的RNA切割序列，以便确保正确地终止RNA转录和对于载体基因组的正确的3′末端。为了在此基因组的3′末端切割，优选地此切割序列具有一个切割位点，它紧邻编码此反转录病毒载体基因组的序列。核酶可以提供适合的RNA切割序列，如在此已论述的。核酶可能在核酶序列的5′或3′端具有一个切割位点。因此，当此载体基因组的两端都存在核酶时，它们通常是不同的。例如，锤头型核酶切割它本身的右侧，因此适合于此载体基因组的5′末端，然而发夹型核酶切割其左侧，而适合于此载体基因组的3′末端。

本发明的另一方面提供了一个反转录病毒载体颗粒产生系统，它包括在此所述的，在昆虫细胞中的表达载体，以及由此系统产生的反转录病毒载体颗粒。

为了产生反转录载体颗粒，还需要提供包装成分。它们通常是可以在一个或几个适合的表达载体上提供的gag-pol和env。该表达载体或载体必须能够在杆状病毒表达系统中表达此包装成分。因此，此包装成分将在一个或几个杆状病毒启动子的表达控制之下。携带此包装成分的表达载体或载体优选地是杆状病毒表达载体。另一种选择是，它们可以是非杆状病毒或非病毒表达载体，如质粒。一些或全部包装成分，可以作为反转录病毒载体基因组在相同的表达载体上被提供。

适合用于本发明的杆状病毒系统容易获得，并且是本领域熟知的。O′Reilly等1994(Op.cit)对杆状病毒表达载体作了详细的描述。一种适合用于重组杆状病毒载体的杆状病毒是被充分研究的苜蓿银纹夜蛾核型多角体病病毒(AcMNPV)。可以使用市场购买的重组杆状病毒如pBAC4 x-1(Novagen)。pBAC4 x-1含有四个插入位点，并可能构建成接纳编码反转录病毒载体基因组和包装成分的核酸序列。类似地，适合用于本发明的杆状病毒启动子也是本领域熟知的。通常使用的杆状病毒启动子是多角体蛋白和p10启动子。多角体蛋白启动子的DNA序列被显示在图18中。本发明还包括此序列的突变体，变异体，同源物或片断。

与编码本发明优选酶的核苷酸序列有关的名词“变异体”，“同源物”或“片断”包括，对一个(或几个)核酸，从其序列或对其序列进行任何一种取代，变异，修饰，替换，删除或增加，提供作为结果的、编码或能够编码启动子的核苷酸序列，优选地是至少可象图18中所显示的序列那样具有生物活性。具体而言，“同源物”是指结构和/或功能同源性使所得的核苷酸序列编码或能够编码启动子。就序列的同源性而论，优选地与SEQ ID NO.1所显示的序列的同源性为至少75％，更优选地是至少85％，再优选地是至少90％。较优选地是与图18中所显示的序列的同源性至少为95％，更优选地至少为98％。

特别是在此使用的名词“同源性”(homology)可以与名词“相同性”等同。可借助于购得的计算机程序确定序列的相对同源性(即序列相同性)，此程序可以计算二个或几个序列之间的同源性百分比。这种计算机程序的一个典型实例是CLUSTAL。

这些名词“变异体”，“同源物”或“片断”与序列的等位基因变异同义。

名词“变异体”还包括与能同在此所提供核苷酸序列杂交的序列互补的序列。优选地，此名词“变异体”包括与能同在此所提供核苷酸序列在严格条件下(例如65℃和0.1×SSC{1×SSC＝0.15M NaCl，0.015柠檬酸三钠pH 7.0})杂交的序列互补的序列。

本发明还涉及可以同本发明的核苷酸序列(包括在此所提供序列的互补序列)杂交的核苷酸序列。优选的方面是，本发明涉及可同本发明的核苷酸序列在严格条件下(例如65℃和0.1×SSC)杂交的核苷酸序列，同在此所提供核苷酸序列(包括在此所提供序列的互补序列)杂交的序列。

根据本发明，还可以使用其它的杆状病毒启动子，以及这种启动子的突变体，变异体，同源物或片段。

与本发明的表达载体一起使用的昆虫细胞系也易获得。实例之一是sf8昆虫细胞系。要求所采用的昆虫细胞与选用的特殊表达载体是相兼容的。昆虫细胞需要支持编码反转录载体基因组的表达载体的复制，支持反转录病毒载体基因组表达。某些糖基化缺乏的细胞系可能特别适合，因为哺乳动物和昆虫细胞系统之间糖基化作用是不同的。预计糖基化差异不会存在问题；临床使用实例，如用在昆虫细胞中产生的HIV gp 120所作的临床试验表明，任何次级修饰作用的差异都没有意义。

可用于本发明的反转录病毒类型并不局限于任何特定的反转录病毒。致癌反转录病毒(Oncoretrovirnses)如鼠C-型病毒MLV，或者慢病毒如HIV，或者一些熟知的反转录病毒如ASLV，SNV和RSV都可以使用。本发明特别可使用基于慢病毒的反转录病毒载体，因为它们很难产生高滴度。慢病毒载体的滴度通常比鼠载体如MLV低二个数量级(例如Naldini et al.1996，Science 272，263)。此外，因为可以在杆状病毒表达系统中如此有效地产生反转录病毒RNA，以致有可能从反转录病毒载体基因组中省略慢病毒成分如HIV Rev和RRE(Gheysenet al.1989 Op.cit.)(在所引用的文献中)。在反转录病毒载体中避免不必要的反转录病毒成分是有利的，特别是当使用HIV，或其它慢病毒时，因为这些成分可能有副作用。

下面将通过实施例来描述本发明，并参照如下的附图-其中：

图1是示意原理图；图2是示意原理图；图3是示意原理图；图4是示意原理图；图5是示意原理图；图6是示意原理图；图7是示意原理图；图8是示意原理图；图9是示意原理图；图10是示意原理图；图11是示意原理图；图12是示意原理图；图13是示意原理图；图14是示意原理图；图15是示意原理图；图16是示意原理图；图17是示意原理图；图18是示意原理图；图19是示意原理图；图20是示意原理图；图21是示意原理图；图22是示意原理图；图23是示意原理图；图24是示意原理图；图25是示意原理图；图26是示意原理图；图27是示意原理图；图28是示意原理图；和图29是示意原理图。图1，2，3和18在上面已提到过。

实施例1在杆状病毒表达系统中MLV gag-pol和被膜基因的表达

此策略是首先将被膜序列插入pBAC4x-1(Novagen)中，随后插入MLV gag-pol序列，将在pBlusecript(Stratagene)中首先重建此序列。

a)Env表达(亲嗜性MLV或VSV G)

从pHIT 123(Soneoka et al Op.cit)分离出含有完整env序列的EcoRI片段，用于亲嗜性MLV被膜序列。同样从pHCMV-G(Yee etal，1994 PNAS 91，9564)分离出EcoRI片段，用于VSV-G序列。然后将这些片段分别插入pBAC4x-1(Novagen)的EcoRI位点(图4)，产生pBAC4-env-e和pBAC4-env-v。按类似的方法，应用重组DNA领域熟知的技术，可以将任何病毒被膜基因插入这种载体中。被膜基因可能包括来自任何反转录病毒的被膜基因，或者是来自任何其它病毒的基因，此病毒能够假型化或相反地被掺入进从反转录病毒gag-pol基因产生的颗粒中。

b)在pBluescript中重建MLV gag-pol(图5)

通过PCR从pgagpolgpt(Markowitz et al 1988，病毒学杂志62，1120)产生了5′和3′片段(见引物表)。5′片段扩增至XhoI位点，并在此编码序列的起点形成KpnI和NotI位点，产生了一个940bp的片段。将3′片段从gag-pol序列的SphI位点扩增至pol编码序列的末端，产生一个700bp的片段。在此片段的二端形成了EcoRI位点，而NotI位点只在3′末端，以致当重建完整的gag-pol序列时，可以通过用NotI消化将它切除，并在此NotI位点将它插入pBAC4x-1(Novagen)中。

5′片断被插入pBluescript中的KpnI/XhoI位点，而3′片断被插入EcoRI位点。

然后从上述质粒中切除XhoI-SphI片段(30 bp)，并用来自pgagpolgpt的XhoI-SphI片段(3580bp)替代，以便在pBluescript中重建完整的gag-pol序列，形成pBluescript-gagpol。

c)将MLV gag-pol序列插入pBAC4-env而形成pBAC4-gagpolenv(图6)

从pBluescript-gagpol中分离出含有gag-pol序列的NotI片段，并分别被插入pBAC4-env-e和-v的NotI位点，形成pBAC4mgagpol-env-v，用于MLV被膜型和VSV-G型。

可应用如O′Reilly et al(Op.cit)中所述的标准方法，将这些质粒用作杆状病毒转移载体。产生的病毒制剂被分别称为bBAC4mgagpol-env-e和bBAC4mgagpol-env-v。当将这种病毒用于感染昆虫细胞如sf8细胞时，可产生大量的VLPs。实施例2应用T7方案表达基于MLV的载体基因组(图3和7)

在此实施例中，是从将用于瞬时表达系统的质粒中表达该载体基因组。该基因组可以从象gag-pol和env基因一样的重组杆状病毒中被表达。

将来自pLZSN(Adams et al，1991，病毒学杂志65，4985)的MLV基因组，在EagI/SmeI位点插入pEc-Hd(Polkinghorn 1996 D.Phil.Thesis，牛津大学)。被放入此载体的基因组具有如下的结构：

通过PCR扩增此基因组的5′和3′末端，以致使T7启动子序列被放置在5′R区紧接的上游。将3′末端扩增至3′R序列的末端，产生一个平端产物，使它将精确地融合于肝炎δ-抗基因组核酶基元序列。将一个校正聚合酶用于PCR，以便产生平端产物。

通过PCR将此基因组的5′末端扩增至包装信号中的EagI位点。在正好5′末端处产生一个附加的EagI位点，用于插入pEc-Hd的EagI位点中。将此基因组的3′末端，在3′R序列中从SmaI位点扩增至此R序列的最末端。

首先将3′片段在SmaI位点插入pEc-Hd(SmaI位点将不会在3′最末端再产生)，然后将5′片段插入EagI位点。

将上述的SmaI片段切除，并用来自pLZSN的SmaI片段替代，产生pEc-Hd-LZSN。借助于标准的程序，可以将同样的表达盒安装进入带有gag-pol和env序列的杆状病毒转移载体中。

可用质粒pEc-Hd-LZSN转染sf 21细胞，此细胞已用bBAC4mgagpol-env-e或bBAC4mgagpol-env-v和表达T7聚合酶的Bac-T7共感染。在这些细胞中，反转录病毒载体的全部成分都可被表达，这样，可对功能性载体的产生进行测定。高滴度功能性载体的产生可将lacZ基因转移至靶细胞。用于MLV gag-pol，env和VSV-G构建的引物为了扩增MLV gag-pol序列：

5′片段

正向(35 MER NOTFOR)

5′-CGG  GGTACC  GCGGCCGC ATGGGCCAGACTGTTACC-3

                Kpn       NotI

反向(22 MER XHOREV)

5′-GGGCG  CTCGAG GGGAAAAGCGG-3′

               XhoI

3′片段

正向(27 MER SPHFOR)

5′-CCG  GAATTC  GCATGC CTCAGGTATTGG-3

             EcoRI SphI

反向(33 MER NOTREV)

5′-TTT  GAATTC  GCGGCCGC TTAGGGGGCCTCGCGG-3′

            EcoRI NotI为了扩增基因组(pLZSN)：

5′片段

正向(44 MER EAGFOR)5′-GCG  CGGCCG  TAATACGACTCACTATA GCGCCAGTCTTCCGATAG-3′

       EagI        T7 启动子

反向(18 MER EAGREV)

5′-TTG  CGGCCG GGTGTTCAG-3′

            EagI

3′片段

正向(20 MER SMAFOR)

5′-TCG  CCCGGG TACCCGTGTAT-3′

            SmaI

反向(22 MER SMAREV)

5′-TGCAACTGCAAGAGGGTTTATT-3′实施例3在杆状病毒表达系统中表达HIV gag-pol和VSV-G(图8)

HIV gag-pol序列的来源是质粒pRV 664。这是一个来自pWI 3的(Kim et al，1989，病毒学杂志63，3708)gagpol vif表达质粒。通过平末端化StyI/StyI片段(7720-8050)，将pWI3的RRE(Genbank保存号：U 26942)插入SmaI切开的pBluescript KS+(Stratagene)中，从而产生pBSRRE。将pW13的NarI/EcoRI片段(637-5743)插入用ClaI和EcoRI切开的pBSRRE中，构成pBSGPRRE1。将XhoI/NotI片段(含有gagpol和RRE)插入表达质粒pCI-Neo中，构成pGR-RRE1。

从pRV 664分离出含有HIV gag-pol序列的5.6kb XhoI-NotI片段，并用DNA聚合酶I的Klenow片段平末端化。然后将此片段插入pBAC4-env-v的SmaI位点，产生pBAC4hgagpol-env-v。可按照与在实施例1中所述质粒相同的方法使用此质粒。实施例4应用T7方案表达基于HIV的载体基因组(图3和9-12)

来自pH4nZ的基因组具有如图9中所示的结构。是按如下方法产生的。通过使ClaI位点(829)平末端化，从HIVgpt(Page et al，1990，病毒学杂志64，5270)制备HIVdge，产生移码突变。然后用BglII和PstI(473-1414)切取HIVdge，并插入pTIN 406(Cannon et alOp.cti)中。pTIN 406具有CMV，R(HIV)和U5(MLV)的LTR结构。这就产生了一个含有CMV，和R以及来自HIV的U5的杂合LTR，被称为pBS5′。为了给此质粒提供Rev和RRE，可从HIVdge1.2切取EcoRI/XhoI片段(5743-8897)，此HIVdge 1.2是含有从NdeI至BglII(6403-7621)缺失的HIVdge衍生物，并被插入pBS5′形成了pBS5′R。可通过将pBS3′的NotI/XhoI片段插入pBS5′R，形成pH2而提供3′LTR。可通过三种途径连接pWI 3的XhoI/HindIII片段，pTIN 408(Cannon et al.Op.cit)的HindIII/KpnI片段以及用XhoI/KpnI切开的pBluescript KS+，而形成pBS3′。将来自pSPCMV的CMV启动子片段(SalI/XhoI)插入pH2制备的pH2CMV的唯一XhoI位点。通过将来自pLNCX(Genbank保存号：M 28246)的PstI/HindIII片段插入pSP72(Promega)中产生了pSPCMV。将来自pTIN 414(Cannon et al Op.cit)的β-半乳糖苷酶基因插入pSP72(XhoI/SphI)而构成pSPlacZ。用XhoI/SalI消化pSPlacZ，获得β-半乳糖苷酶编码区，将它插入pH2-CMV而得到pH3Z。为了产生tat-缺失的载体，可构建pH4Z。可通过以应用下面的PCR引物扩增的EcoRI(5881)-SpeI PCR产物替代pH3中的EcoRI(5743)I-SpeI片段，除去tat-编码区的头50个bp，得到pH4。

DELT5(5′-CGTGAATTCGCCTAAAACTGCTTGTACCA-3′)和

DELT3(5′-GAACTAATGACCCCGTAATTG-3′)

将来自pH4的NsiI/SpeI片段插入pH3Z而产生pH4Z。

为了扩增基因组的5′和3′末端用于杆状病毒表达，实施了二个PCR反应。随后通过插入遗漏的间插序列重建了完整的基因组。一个PCR反应是为了扩增基因组的3′序列。将3′U3序列中的ScaI位点改变成SmaI位点，并扩增至R序列的最末端。这种改变造成了三个碱基对突变，但是不会影响整合作用。用校正聚合酶产生了900bp的平端产物。然后将此产物插入pEc-Hd的SmaI位点(图10)。这样，在R序列和pEc-Hd的接点处破坏了SmaI位点。

首先从R序列的起点扩增5′序列，直至位于包装信号中的第一个EcoRI序列。这样产生了一个900bp的片段。EagI位点被放置在此产物的二端，XhoI位点在此片段的5′最末端。再将此产物插入pBluescript KS(Stratageme)的XhoI-EcoRI位点中(图11)。

自pH4nZ中分离出跨越EcoRI位点和SpeI位点(CMV启动子中)的序列并插入上述质粒的EcoRI-SpeI位点。

然后从pBluescript KS中分离出含有基因组序列的EagI-SpeI片段，并将它插入pEc-Hd的EagI-SpeI位点中(图12)。

最后，通过将从pH4nZ分离出的SpeI-ScaI片段插入pEc-Hd的SpeI-SmaI位点，产生pEc-Hd-H4nZ而重建成完整的基因组。可按类似的方法将此质粒用于pEc-Hd-LZSN，但是为了以非常高的滴度产生基于HIV的反转录病毒载体，杆状病毒载体是来自pBAC4hgagpol-env-v。实施例5在杆状病毒系统中表达EIAV gag-pol和VSV-G(图13)

起始分子是pSPEIAV19(AC：U01866)，它是ELAV的前病毒克隆。通过用HindIII(5835/6571)在被膜区切开pSPEIAV19，使被膜编码区切割，自身连接而产生pSPEIAV19dH。这样产生了一个被膜损失性前病毒克隆。然后用MluI(216/8124)切开pSPEIAV19dH，并将形成的片段插入用MluI(216)切开的pCI-Neo(Promega)而构成了pONY3。

从包含EIAV gag-pol，tat和rev编码序列的pONY3中分离出MluI片段，并用DNA聚合酶I的Klenow片段平末端化。然后将它在SmaI位点插入pBAC4-VSVenv(平端)，产生pBAC4gagpol-env-v。按类似于实施例1中所述的方法，用此质粒形成了将能产生高水平EIAVVLP的重组杆状病毒。实施例6应用T7方案表达基于EIAV的载体基因组(图3和14-17)

质粒pONY 2.1nlslacZ的基因组具有如图14中所示的结构。可按如下构建它。应用pfu聚合酶，以如下的引物，对EIAV克隆pSPEIAV19的5′LTR进行PCR扩增：

5′GCATGGACCTGTGGGGTTTTTATGAGG

3′GCATGAGCTCTGTAGGATCTCGAACAGAC

通过5′突出部分补平将此扩增的片段平末端化，并被插入pBluescript II KS+中，它已用Bss HII切开，并通过3′突出部分的除去而平末端化。此构建体被称为pONY1，取向是相对于pBluescript II KS+的β-半乳糖苷酶从5′到3′。pONY1的序列没有显示任何突变。用MluI(216/8124)切开pSPEIAV19dH，并将此片段插入被MluI切开的pONY1(216)，形成pONY2。用Bss HII对pBluescript II KS+进行消化(619/792)，得到多克隆位点。通过5′突出部分补平将此片段平末端化，并与用BglII和NcoI(1901/4949)切开的pONY2连接，再通过5′突出部分补平被平末端化。取向是相对于EIAV序列从3′至5′。此质粒称为pONY 2.1。通过将来自pLNCX(Genbank保存号：M28246)的Psti/HindIII片段插入pSP72(Promega)，产生质粒pSPCMV。将来自pTIN 414(Cannon et al所引用的文献中)的β-半乳糖苷酶基因插入用XhoI和SphI切开的pSP72，形成了pSPlacZ。用来自pAD.RSVBgal(Bloggs et al，1992临床研究杂志90，629)的SV40 T抗原核定位信号代替β-半乳糖苷酶基因的5′末端。用XhoI/ClaI切开pAD.RSVbgal，将此片段插入XhoI/ClaI切开的pSPlacZ，形成pSPnlslacZ。将来自pSPnlslacZ，包含驱动lacZ基因的CMV启动子的PstI片段，按照EIAV的5′至3′取向插入pONY 2.1的PstI位点。它被定名为pONY 2.1nlslacZ。

然后用pONY 2.1nlslacZ作模板，进行二次PCR反应，以便扩增此基因组的5′和3′末端，用于杆状病毒表达盒。随后，通过插入遗漏的间插序列，重建成完整的基因组。

用校正聚合酶扩增此3′PCR产物，从env序列中的SmaI位点扩增至R序列的最末端，产生平末端化的产物。然后将此产物插入pEc-Hd的SmaI位点。正好在3′末端失去了SmaI位点(图15)。

从pONY 2.1nlslacZ分离出包含CMVnlslacZ的SmaI片段，并将它插入SmaI位点(图16)。

扩增此5′PCR产物，直至MCS中的EagI位点，并在5′末端加入EagI位点。然后将此产物插入EagI位点，以便重建pEc-Hd中的pONY基因组(图17)，从而产生了pEc-Hd-ONY 2.1nlslacZ。按照类似于实施例2和4中所述的方法，将此质粒同pBAC4egagpol-env-v一起使用，产生高滴度的基于EIAV的载体。实施例7应用R-区置换的方案表达基于MLV的载体基因组(图1，18和19)。

把包含有从pplyhedrin启动子(O′Reill et al所引用的文献中)表达的LZSN反转录病毒载体基因组的质粒定名为pBHLZSN(图19)。按如下程序构建此质粒：用于一系列PCR反应的起始模板是pHIT111(Soneoka et al，1996所引用的文献中)。为了产生显示为PCR：A(图19)的PCR产物，在反应A中用PCR引物产生了含有多角体蛋白启动子的5′LTR。第二个反应(B)产生了与PCR：A重叠的片段。此外，反应C产生一个以SalI和HindIII切割的组合片段。然后将所产生的片段插入pBluescript KS+中，产生质粒pBHR(图18)。为了在新构建的R区内构建带有适当的多角体蛋白启动子成分的3′LTR，进行了PCR反应D和E(图19)。然后用这些反应的产物产生了组合PCR产物(PCR：F)，用XbeI和NotI切开此产物，将形成的片段插入pBHR中，构成pBHU3HR(图19)。最后的一步是通过用SpeI和XbaI切开pHIT111，插入来自pHIT111的LZSN内部区，并将生成的片段插入用相同的酶切开的pBHU3HR中(图19)。

为构建pBHLZSN用于PCR反应的引物：A.5′引物(polyhA5)-TACT  GTCGAC ATA ACC ATC TCG CAAATA AAT(加底线的＝SalI)；3′引物(PolyhA3)-CAG TCT ATCGGA AGA CTG GCG CT ATT TAT AGG TTT TTT TATB.5′引物(polyhB5)-ATA AAA AAA CCT ATA AAT AGC GCCAG TCT TCC GAT AGA CTG；3′引物(polyhB3)-GCTAAAGCTT TCC GCC AGA TAC AGA FCT(加底线的＝Hind III)C.用引物polyhA5和polyhB3，连同PCR产物A和B，得到5′LTR杂合体(polyderin.R)D.5′引物(polyhD5)-AGTT  TCTAGA GAA CCA TCA GAT GTTTCC AGG(加底线的＝Xba I)；3′引物(polyhD3)-TAC AAA ACTGTT ACG AAA ACA GTA AAA TAC TT C CCG AGT GAG GGG TTGTGGE.5′引物(polyhE5)-TTC GTA ACA GTT TTG TAA TAA AAAAAC CTA TAA ATA GCG CCA GTC CTC CGA TTG；3′引物(polyhE3)-GATC  GCGGCCGC AAT GAA AGA CCC CCG CTG(加底线的＝Not I)F.用引物polyhD5和polyhE3，连同PCR产物D和E，得到3′LTR杂合体(U3.polyherin.R)实施例8应用R-区置换方案表达基于EIAV的载体基因组

把含有pONY 2.1nlslacZ反转录病毒载体基因组的质粒称为pBONY2.1nlslacZ，并且此基因组是从具有适当的R-区置换的多角体蛋白启动子表达的。按如下程序构建此质粒：用于一系列PCR反应的起始模板是pONY 2.1nlslacZ(见实施例6和GB专利申请号9727135.7和GB专利申请号9711578.6)。为了产生显示为PCR：AE的PCR产物，用PCR引物在反应AE中制造了含有多角体蛋白启动子的5′LTR。第二个反应(BE)制造了与PCR：AE重叠的片段。此外反应CE产生了一个以SalI和HindIII切割的组合片段。然后将产生的片段插入pBluescript KS+中，形成质粒pBEHR。为了在新构建的R区内构建具有适当的多角体蛋白启动子成分的3′LTR，进行了PCR反应DE和EE。然后用这些反应产物产生组合PCR产物(PCR：FE)，用XbaI和NotI切开此产物，将形成的片段插入pBEHR中，产生了pBEHU3HR。最后一步是通过用NarI和NspV切开而插入pONY 2.1nlslacZ的内部区，并将形成的片段插入用相同的酶切开的pBEHU3HR中(见下面的注解和图20)。可将质粒pBONY 2.1nlslacZ与pBAC4gagpol-env-v一起使用，产生高滴度的基于EIAV的载体(也可参考图21)。构建pONY 2.1nlslacZA.5′引物(polyhAE3)TACT  GTCGAC ATA ACC ATC TCG CAA ATA AAT(加底线的＝SalI)3′引物(polyhAE3)AGA CCG CAG AAT CTG AGT GCCC T ATT TAT AGG TTT TTTTAT

此PCR产物将提供带有部分R的多角体蛋白启动子。B.5′引物(polyhBE5)ATA AAA AAA CCT ATA AAT AGG GCA CTC AGA TTC TGC GGTCTG3′引物(polyhBE3)ACTG AAGCTT CAG GTC CCT GTT CG  GGCGCC A ACT G(斜体＝Hind III，加底线的＝Nar I)

此PCR将提供带有R的多角体蛋白部分。C.

用引物polyAE5和polyhBE3，连同PCR产物AE和BE，得到5′LTR杂合体(polydrin.R)

通过以SalI和HindIII切开后将它插入pBluescript KS+II中，称为pBEHR。

3′LTR(U3.多角体蛋白.R.U5)。D.在U3至R内，但是包括多角体蛋白启动子。5′引物(polyhDE5)CTG  TCTAGA A GA TTCGAA GCG AAG GAGGAAA C...(加底线的＝Xba I.斜体＝NspV)3′引物(PolyhDE3)TAC AAA ACT GTT ACG AAA ACA GAT AAA TAC TTATTGTCAGAATACAAGCACT

此PCR将提供带有部分多角体蛋白启动子的U3。E.R至U5，带有多角体蛋白启动子5′引物(polyhEE5)TTCGTA ACA GTT TTG TAA TAA AAA AAC CTA TAA ATAGGCACTCAGATTCTGCGGTC3′引物(polyhEE3)GATC  GCGGCCGC CTGTAGGATCTCGAACAGACAAAC(加底线的＝Not I)

此PCR将提供带有R的部分多角体蛋白启动子。F.

用引物polyhDE5和polyhEE3，连同PCR产物DE和EE，得到3′LTR杂合体(U3.多角体蛋白.R)。

通过以XbaI和NotI切开后将它插入pBEHR中，称为pBEHRU3HR。G.

以NarI和NspV切开pONY 2.1nlslacZ，得到7.8kb的片段，借助NarI和NspV，将它插入pBEHRU3HR中，形成pBEHONYnlslacZ。实施例9应用R-区置换方案表达基于HIV的载体基因组

将包含从多角体蛋白启动子表达的pH4Z反转录病毒载体基因组的质粒称为pBH4Z。按如下程序构建此质粒：用于一系列PCR反应的起始模板是pH4Z(见PCT/GB 97/02857和GB专利申请号：9711578.6)。用PCR引物在反应AH中形成含有多角体蛋白启动子的5′LTR，以便产生显示为PCR：AH的PCR产物。第二个反应(BH)产生了一个与PCR：AH重叠的片段。此外反应C产生了用SalI和HindIII切割的组合片段。然后将此产生的片段插入pBluescript KS+，产生质粒pBHHR。为了在新构建的R区内构建带有适当的多角体蛋白启动子成分的3′LTR，进行了PCR反应DH和EH。然后用这些反应的产物产生了组合PCR产物(PCR：FH)，用XbaI和NotI切开此产物，将产生的片段插入pBHHR中，构成pBHHU3HR。最后的一步是通过用NarI和SphI切开而插入pH4Z的内部区，并将形成的片段插入以相同酶切开的pBHHU3HR中(见下面的注释和图22)。可将质粒pBH4Z同pBAC4hagapol-env-v一起使用，产生高滴度的基于HIV的载体(还可以参考图23)。构建pBH4ZA.5′引物(polyhAH5)TACT  GTCGAC ATA ACC ATC TCG CAA ATA AAT(加底线的＝SalI)3′引物(PolyhAH3)AGA CCG CAG AAT CTG AGT GCCC T ATT TAT AGG TTT TTTTAT

此PCR产物将提供带有R部分的多角体蛋白启动子。B.5′引物(polyhBH5)ATA AAA AAA CCT ATA AAT AGG GCA CTC AGA TTC TGC GGTCTG3′引物(polyhBH3)ACTG AAGCTT GGT CCC TGT TCG  GGCGCC AC(斜体＝HindIII，加底线的＝NarI)

此PCR将提供带有R的部分多角体蛋白。C.

用引物polyhAH5和polyBH3，连同PCR产物AH和BH，得到5′LTR杂合体(polyderin.R)通过用SalI和HhidIII切开将它插入pBluescript KS+II中，称为pBHHR。

3′LTR(U3.多角体蛋白.R.U5)。D.在U3至R内，但是包括多角体蛋白启动子5′引物(polyhDH5)GATC  TCTAGA A AAGCATGCCTGCAGGTCGAGGTCGAT...(加底线的＝XbaI，斜体＝SphI)3′引物(PolyhDH3)TAC AAA ACT GTT ACG AAA ACA GTA AAA TAC TT AGT ACAGGC AAA AAG CAG CTG C

此PCR将提供带有多角体蛋白启动子部分的U3。E.R至U5，带有多角体蛋白启动子5′引物(polyEH5)TTCGTA ACA GTT TTG TAA TAA AAA AAC CTA TAA ATAGGGTCTCTCTGGTTAGAC3′引物(polyhEH3)GATC  GCGGCCGC TGC TAG AGA TTT TCC ACA CTG(加底线的＝NotI)

此PCR将提供带有R的部分多角体蛋白启动子。F.

用引物polyDH5和polyhEH3，连同PCR产物DH和EH，得到3′LTR杂合体(U3.多角体蛋白.R)

通过用XbaI和NotI切开将它插入pBHHR中，称为pBHHRU3HR。G.

用NarI和SphI切开pH4Z，得到6.7kb的片段，借助于NarI和NspV将它插入pBHHRU3HR中，构成pBH4Z。实施例10从多角体蛋白启动子表达功能性MLV，EIAV和HIV载体基因组：双核酶切割法

是借助于在多角体蛋白启动子序列下游设计包含锤头形核酶来实现此方案，以致它们可从与之连接的转录物删除其本身的5′多角体蛋白序列。图24，25和26中的示意图图解说明如何使之达到分别用于MLV，ELAV和HIV载体的目的。

此方案在全部三个实例中是相同的，只是为了匹配MLV，EIAV和HIV各自的互补R序列，核酶的螺旋1序列不同。当在所指示的位置用核酶切割时，形成的RNA转录物在其第5初始末端现在已包含正确的R序列。

下面将依次简述用于构建这些基于自身-切割性多角体蛋白启动子的反转录病毒基因组表达载体中每一种的克隆方案。每种载体都可以同其同源的gagpol和env表达系统一起用于产生高滴度的反转录病毒载体制备物。此外，可借助于标准的程序将它们的基因组表达盒插入杆状病毒载体中。(i)构建基于MLV的载体：

将引物polyhAM5和polyhAM3(见图27-和下面的注评)用于PCR扩增pEc-Hd-LZSN的5′LTR，以便将需要的改变(多角体蛋白启动子/核酶序列加对5′R序列的平接)掺入PCR片段中，然后将此片段借助于EcoRI-SpeI消化而克隆进入pEc-Hd-LZSN中，产生最终的载体-pBHz-Hd-aR。构建pBHz-Hδ-αR5′引物(polyhAM5)actg  gaattcATAACCATCTCGCAAATAAATAAGTATTTTACTGTTTTCGTAACAGTTTTGTAATAAAAAAACCTATAAATA GGACTGGCGC CTGATGAGCGGCCGAAAGCCCGCGAAACCTGCGTCGACACGCAGGTC GCGCCAGTCCTCCGATTGACTGAGTC(加底线的＝EcoRI位点)3′引物(polyhAM3)GTTAGCTA  ACTAGT ACAGACGCAG(加底线的＝SpeI)

此PCR将提供多角体蛋白，锤头型核酶，MSV R区，U5和前导序列。

可在EcoRI和SpeI位点将此片段克隆进入pEc-Hd-LISN中，得到pBHz-Hδ-αRLZSN。(ii)构建基于EIAV的载体：

将引物polyhAEM5和polyhAEM3(见图28-和下面的注评)用于PCR扩增pEc-Hd-ONY 2.1nlslacZ的5′LTR，以便将需要的改变(多角体蛋白启动子/核酶序列加对5′R序列的平接)掺入PCR片段中，然后将此片段借助于Eag1消化而克隆进入pEc-Hd-ONY 2.1nlslacZ中，产生最终的载体-pBEHz-Hδ-αR。构建pBEHz-Hδ-αR5′引物(polyhAEM5)actg  cggccgATAACCATCTCGCAAATAAATAAGTATTTTACTGTTTTCGTAACAGTTTTGTAATAAAAAAACCTATAAATA CTGAGTGCCC CTGATGAGCGGCCGAAAGCCCGCGAAACCTGCGTCGACACGCAGGTCGGGCACTCAGATTCTGCGGTCTG(加底线的＝Eag I位点)3′引物(polyhAEM3)CTAGTTCTAGAG CGGCCGCCAC(加底线的＝Eag I)

此PCR将提供多角体蛋白，锤头型核酶，EIAV R区，U5和前导序列。

可在Eag I和Eag I位点将此片段插入pEc-Hd-ONY 2.1nlslacZ中，得到pBEHz-Hδ-αR。(iii)构建基于HIV的载体

将引物polyhAHM5和polyhAHM3(见图29-和下面的注评)用于PCR扩增pEc-Hd-H4nZ的5′LTR，以便将所需要的改变(多角体蛋白启动子/核酶序列加对5′R序列的平接)掺入PCR片段中，然后将此片段借助于Eag I-Nar I消化克隆进入pEc-Hd-H4nZ中，产生最终的载体-pBHHz-Hδ-αR。构建pBHHz-Hδ-αR5′引物(polyhAHM5)ACTGTTTTCGTAACAGTTTTGTAATAAAAAAACCTAT

        锤头型核酶AAATA AGAGAGACCC CTGATGAGCGGCCGAAAGCCCGCGAAACCTGCGTCGACACGCAGGTCGGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATC...(加底线的＝Eag I位点)3′引物(polyhAHM3)CCCTGTTCG GGCGCCACTGC(加底线的＝Nar I)

此PCR将提供多角体蛋白，锤头型核酶，HIV R区，U5和前导序列。

可将此片段在Eag I和Nar I位点插入pEc-Hd-H4nZ中，构成pBHHz-Hδ-αRLZSN。简述

因此，本发明提供了一个用于产生反转录病毒载体颗粒的新型系统。在高度优选的实施方案中，此新型系统是使用编码反转录病毒载体基因组的杆状病毒表达载体。在另一优选的实施方案中，本发明提供了一种编码反转录载体基因组的杆状病毒表达载体，并把它提供给由本发明新型系统产生的反转录病毒载体颗粒。

在上面详述中引用的所有文献在此均被引入作为参考。根据本发明的内容和精髓，对于本领域的技术人员，形成对本发明所述方法和系统的各种修改和变化形式将是显而易见的。虽然已结合特定的优选实施方案对本发明进行了论述，但是应该理解的是，本发明的保护范围将不局限于这些特定的实施方案。的确，为了实现本发明的各种修改形式被视为下面的权利要求范围之内，对于分子生物学或有关领域的技术人员，这些修改形式也是显而易见的。

Claims (40)

1.一种组合物，包含至少一种杆状病毒成分和至少一种反转录病毒成分，其中的反转录病毒成为能够被包装进入反转录病毒颗粒中。

2.一种组合物，其中该组合物是含有至少一种反转录病毒成分的杆状病毒表达系统，其中的反转录病毒成分能够被包装进入反转录病毒颗粒中。

3.权利要求1或2的组合物，其中的反转录病毒成分相当于一个反转录病毒基因组。

4.上面权利要求中任何之一的组合物，其中该组合物含有反转录病毒载体基因组的RNA转录起始位点，并且其中编码反转录病毒成分的核苷酸序列有效地连接于一个启动子，此启动子包含位于RNA转录起始位点上游的上游启动子成分，以及位于RNA转录起始位点下游的下游启动子成分。

5.权利要求4的组合物，其中的下游启动子成分是在编码反转录载体基因组的多核苷酸序列的上游。

6.权利要求4或5的组合物，其中的启动子是杆状病毒启动子。

7.权利要求6的组合物，其中的启动子是多角体蛋白启动子和/或p10启动子和/或polh启动子。

8.权利要求1-5中任何之一的组合物，其中的启动子是非-杆状病毒启动子。

9.权利要求8的组合物，其中的启动子是T7启动子或sp6沙门氏菌噬菌体启动子。

10.上面权利要求中任何之一的组合物，其中该组合物含有至少一个RNA切割成分。

11.权利要求10的组合物，其中至少一个RNA切割成分将产生没有任何杆状病毒成分的反转录病毒基因组。

12.权利要求11的组合物，当从属于权利要求4-9中任何之一时，其中至少一个RNA切割成分是位于启动子和编码反转录病毒成分的序列之间。

13.权利要求12的组合物，其中为了随后能在载体成分的5′末端切割，至少一个RNA切割成分紧邻编码反转录病毒载体成分的序列。

14.权利要求4-13中任何之一的组合物，其中至少一个RNA切割成分是位于编码反转录病毒成分序列的下游。

15.权利要求14的组合物，其中为了随后能在载体成分的3′末端切割，该RNA切割成分具有一个紧邻编码反转录病毒载体成分的序列的切割位点。

16.权利要求4-15中任何之一的组合物，其中为了其随后的切割，至少一个RNA切割成分是可被核酶识别的序列。

17.权利要求4-15中任何之一的组合物，其中为了其随后的切割，每个RNA切割成分都是可被核酶识别的序列。

18.权利要求4-17中任何之一的组合物，其中的下游启动子成分是位于编码反转录病毒成分的序列之内。

19.权利要求18的组合物，其中的下游启动子成分是位于编码反转录病毒载体的序列之内。

20.权利要求19的组合物，其中的反转录病毒成分，在编码反转录病毒载体基因组的序列一端，含有一个R区，其中的下游启动子成分是位于5′R区内，并在3′R区内具有一个相对应的序列。

21.上面权利要求中任何之一的组合物，其中该组合物按下行方向含有：一个上游杆状病毒启动子成分，一个下游杆状病毒启动子成分，一个核酶序列，一个反转录病毒5′R区，一个反转录病毒U5区，一个反转录病毒载体区，用于插入一个或几个将被此载体传递的基因，一个反转录病毒U3区，一个反转录病毒3′R区，以及任选地一个第二核酶序。

22.上面权利要求中任何之一的组合物，其中该组合物按下行方向含有：一个上游杆状病毒启动子成分，一个含有下游启动子成分的反转录病毒5′R区，一个反转录病毒U5区，一个反转录病毒载体区，用于插入一个或几个将被此反转录病毒载体传递的基因，一个反转录病毒U3区，一个反转录病毒3′R区，以及任选地一个核酶序列。

23.上面权利要求中任何之一的组合物，其中该组合物包含一个或几个编码一个或几个包装成分、用于产生反转录病毒载体颗粒的核苷酸序列，该颗粒含有反转录病毒成分。

24.上面权利要求中任何之一的组合物，其中该组合物另外还含有至少一个待研究的核苷酸序列(NOI)。

25.权利要求24的组合物，其中的NOI是对医疗有用的。

26.权利要求24或25的组合物，其中的NOI是反转录病毒成分的一部分。

27.一种反转录病毒颗粒，可通过表达上面权利要求中任何之一的组合物而获得。

28.一种制备反转录病毒颗粒的方法，包括表达上面权利要求中任何之一的组合物。

29.一种昆虫细胞，包含上面权利要求任何之一的组合物。

30.一种反转录病毒载体颗粒产生系统，包括在一种昆虫细胞中含有上面权利要求中任何之一的组合物。

31.一种反转录病毒载体颗粒，是由权利要求30的反转录病毒载体颗粒产生系统产生的。

32.一种含有一个多核苷酸序列的表达载体，此多核苷酸序列编码具有5′和3′末端的反转录病毒载体基因组，此反转录病毒基因组在杆状病毒表达系统中能够被表达，并被包装在反转录病毒载体颗粒内。

33.一种组合物，至少包含可从第一种病毒获得的第一病毒成分，以及可从第二种病毒获得的第二病毒成分；其中第一种病毒不同于第二种病毒；第二病毒成分侧翼至少有二个切割位点(它们可以是相同或不相同的位点)；第二病毒成分的至少一部分能够被包装在一种病毒颗粒中；该病毒颗粒基本上不存在任何第一病毒成分。

34.权利要求33的组合物，其中至少一个切割位点是核酶切割位点。

35.权利要求34的组合物，其中每个切割位点都是核酶切割位点。

36.权利要求33-35中任何之一的组合物，其中的第一病毒是杆状病毒。

37.权利要求33-36中任何之一的组合物，其中的第二病毒是反转录病毒。

38.一种杆状病毒组合物在表达含有至少一个内含子的NOI中的用途。

39.一种用于生产大量NOI或其表达产物的生产装置，其中该生产装置包括一种培养基，此培养基含有一种包含NOI的杆状病毒组合物。

40.一种基本上如本文所述并参照附图的组合物。

Images