CN1529760A

CN1529760A - 提高泛酸盐生产的方法

Info

Publication number: CN1529760A
Application number: CNA028062558A
Authority: CN
Inventors: C; C·贝克; H-P·哈尔茨
Original assignee: BASF SE
Current assignee: BASF SE
Priority date: 2001-03-09
Filing date: 2002-03-11
Publication date: 2004-09-15
Also published as: EE200300438A; IN2003CH01584A; SK10972003A3; HUP0303472A3; EP1370671A1; PL365096A1; NO20033970L; NO20033970D0; HUP0303472A2; US20040072307A1; IL157329A0; JP2004529632A; WO2002072857A1; AU2002304320A1; MXPA03007452A; BR0207757A; RU2003130064A; CA2439895A1; CZ20032410A3; KR20040007458A

Abstract

本发明描述了生产泛酸盐组合物的改进方法。特别是本发明描述了通过微生物的培养来生产可喷雾干燥的泛酸盐组合物的方法。也描述了通过上述方法生产的泛酸盐组合物。

Description

提高泛酸盐生产的方法

相关申请

本申请要求先前提交的序号为60/274,455、提交日期为2001年3月9日的临时专利申请(未决)的利益。本发明涉及提交日期为2000年9月21日，序号为09/667,569的美国专利申请(未决)，其是1999年9月21日提交的，序号为09/400,494的美国专利申请(已放弃)的部分继续申请。序号为09/667,569的美国专利申请还要求先前提交的序号为60/210,072，提交日期为2000年6月7日的临时专利申请(期满)，序号为60/221,836、提交日期为2000年7月28日的临时专利申请(期满)，以及序号为60/227,860、提交日期为2000年8月24日的临时专利申请(期满)的利益。每个上面所提及的申请的完整内容都在此处引入。

背景技术

D-泛酸在世界范围内被大规模生产。大量合成的D-泛酸被用作如家禽和猪的饲料添加剂。对D-泛酸的需求正不断增加。

泛酸盐也称作泛酸或维生素B5，它是维生素B复合物的一员，并且是哺乳动物包括家畜和人的营养必需物(比如，食物来源的，作为水溶性维生素补充剂或作为饲料添加剂)。细胞中，泛酸盐主要用于辅酶A(CoA)和酰基载体蛋白(ACP)的生物合成。这些辅酶在酰基部分的代谢中起作用，酰基部分与这些分子的4’-磷酸泛酰巯基乙胺部分的巯基形成硫酯。这些辅酶在所有细胞中都是必需的，在细胞的代谢中参与100多种不同的中间反应。

传统的合成泛酸盐(特别是具生物活性的D型异构体)的方法是通过用大量的化学药品进行化学合成，该方法由于底物成本过高以及需要外消旋中间物的旋光拆分而受到阻碍。因此，研究人员最近注意到可产生在泛酸盐生物合成过程中有用的酶的细菌或微生物系统(因为细菌自身能合成泛酸)。特别是生物转化法已被评定为有利于优选的泛酸异构体产生的方法。而且，直接的微生物合成方法作为促进D-泛酸盐生产的方法最近也受到检验。

然而，仍然需要改进泛酸盐生产方法，特别需要的是优化的高产且产物更易纯化的微生物方法。

发明概要

本发明涉及生产泛酸盐的改进方法，特别是生产含D-泛酸钙的组合物的方法。本发明也描述了生产可喷雾干燥的泛酸盐组合物，优选地含有D-泛酸钙的可喷雾干燥组合物的方法。本发明的含D-泛酸钙的组合物和/或可喷雾干燥泛酸盐组合物可以利用泛酸盐生产微生物通过在发酵过程中，优选在pH-受控的发酵过程中补给钙盐用葡萄糖生产。在优选的实施方案中，含D-泛酸钙的组合物和/或可喷雾干燥泛酸盐组合物通过在发酵过程中补给Ca(OH)₂生产。本发明的含D-泛酸钙的组合物和/或可喷雾干燥泛酸盐组合物可以通过发酵泛酸盐生产微生物，优选工程化的、以前体独立性方式产生泛酸盐的微生物来生产。例如，含D-泛酸钙的组合物和/或可喷雾干燥泛酸盐组合物可以通过发酵工程化微生物以不需要前体如β-丙氨酸或泛解酸(或泛解酸盐)的方式生产。本发明还描述了生产D-泛酸镁组合物和/或可喷雾干燥的含D-泛酸镁的组合物的方法，例如，涉及优选地在pH-受控的发酵中补给镁盐，最优选地补给Mg(OH)₂的方法。含D-泛酸钙的组合物、D-泛酸镁组合物和/或可喷雾干燥组合物可以从发酵培养液中制得。用本发明方法制得的泛酸盐组合物是粉末(或者能够加工成粉末的组合物)，其含有泛酸盐，优选二价泛酸盐，更优选D-泛酸钙或D-泛酸镁。这些生产方法比传统的方法更经济、更有效。所得产物有许多商业用途，特别是用作维生素来源或饲料添加剂。

本发明还至少部分涉及生产可喷雾干燥的泛酸盐组合物的方法，该方法包括在Ca(OH)₂控制的pH条件下，培养泛酸盐生产微生物以得到可喷雾干燥的泛酸盐组合物。该方法还可以包括对此可喷雾干燥组合物的喷雾干燥。优选的，可喷雾干燥的泛酸盐组合物含有D-泛酸钙。本发明还涉及用本发明方法生产的泛酸盐组合物。

本发明的其他特点和优点将在下面的详细说明和权利要求书中彰显。

发明详述

本发明至少部分涉及生产D-泛酸钙的方法，优选生产可喷雾干燥的D-泛酸钙组合物的方法。该方法包括在钙盐存在时，优选存在钙盐且控制pH的条件下，更优选为在Ca(OH)₂控制的pH条件下，培养泛酸盐生产微生物，以生产D-泛酸钙或可喷雾干燥的D-泛酸钙组合物。本发明也至少部分涉及生产D-泛酸镁的方法，优选生产可喷雾干燥的D-泛酸镁组合物的方法。该方法包括在镁盐存在时，优选存在镁盐且控制pH的条件下，更优选为在Mg(OH)₂控制的pH条件下，培养泛酸盐生产微生物，以生产D-泛酸镁或可喷雾干燥的D-泛酸镁组合物。该方法还可以包括对此可喷雾干燥组合物的喷雾干燥。泛酸盐生产微生物可在比如具有此处所定义的组成的发酵培养基或培养液中培养。优选的，这些方法的特点是培养重组泛酸盐生产微生物，该微生物经工程化以独立于前体补料的方式生产泛酸盐(比如，生产高滴度的泛酸盐)。

为了更易于理解本发明，首先定义一些术语。

术语“泛酸盐”包括泛酸盐的游离酸形式(也称作“泛酸”)和其任何盐(比如，通过将泛酸盐或泛酸的酸性氢用阳离子，比如钙、钠、钾、铵离子替代所得的盐，又称“泛酸盐”)。优选的泛酸盐为泛酸钙、泛酸钠、泛酸镁、泛酸钾和/或泛酸铵。本发明的泛酸盐包括用传统方法从在此描述的游离酸制得的盐。在另外一个实施方案中，泛酸盐通过本发明的微生物直接合成。本发明的泛酸盐同样的可用传统的方法转化为泛酸盐的游离酸形式或者泛酸。优选的泛酸盐为D-泛酸钙(即Ca(D-泛酸)₂)。另一个优选的泛酸盐为D-泛酸镁(即Mg(D-泛酸)₂)。本领域认可的生产D-泛酸钙的方法包括加入等摩尔量的Ca(OH)₂到D-泛酸中以生产D-泛酸钙。可用包括但不限于WO 96/33283，US6,013,492和DE 10016321中所描述的方法将D-泛酸盐从含有D-泛酸盐的发酵培养基或培养液中常规分离出来。

D-泛酸盐可通过在培养液中发酵微生物制得，该培养液含有碳源如糖(比如，葡萄糖、蔗糖、糖蜜)或其他糖类(比如淀粉水解产物)，前体如β-丙氨酸、泛解酸(或泛解酸盐)、酮泛解酸盐(或酮泛解酸)、α-酮异戊酸盐(或α-酮异戊酸)等等，氮源如(NH₄)₂SO₄、蛋白质源如大豆粉、玉米浆或酵母提取物，磷源如磷酸钾或磷酸钠以及微量矿物质和维生素。微生物在具有适宜pH、适当的搅动与空气流速的发酵培养液中生长。

术语“泛酸盐组合物”指包括泛酸盐和任选地其它成分的组合物，其中所述其它成分包括但不限于：缓冲液、盐和/或其他培养基成分，培养基残余物(即来自发酵培养液的残余复杂培养基成分)，生物量(即来自发酵培养液的微生物和/或微生物的部分或残余物)，和/或帮助产物形成的培养基成分(比如糖、来自谷类和豆类的产物、硅胶等)。

术语“可喷雾干燥的泛酸盐组合物”包括其中的液体成分可以通过蒸发或其他方法除去以得到固体组合物的泛酸盐组合物。有利的是，对可喷雾干燥的泛酸盐组合物进行喷雾干燥或喷雾制粒(比如，用液化床喷雾干燥器)，但也可以用别的方法除去液体成分(比如，蒸发，冻干等等)。对可喷雾干燥的泛酸盐组合物的干燥可以在与发酵培养液中的生物量相分离或未分离的情况下进行，所述分离可以比如，通过过滤、离心、超滤、微量过滤或它们的组合实现。在一个实施方案中，可喷雾干燥的泛酸盐组合物在干燥后能够发挥所需功能而不需要进一步的纯化步骤。比如，可以在干燥后将此可喷雾干燥的泛酸盐组合物直接加到动物饲料(比如，家禽或猪的饲料)或预混饲料中而不用进一步纯化过程。

商业化的喷雾干燥装置的例子包括Niro或APV Anhydro(均在丹麦的哥本哈根)的产品。流化床喷雾制粒机由Glatt(Bingen，德国)，Heinen(Varel，德国)，Niro-Aeromativ(Bubendorf，瑞典)和Allgaier(Uhingen，德国)生产。在一个优选的实施方案中，喷雾干燥器的入口温度设定为约100℃到约280℃，有利的是约120℃到约210℃。喷雾干燥器的出口温度设定为约30℃到约180℃，有利的是约50℃到约150℃，优选为约50℃到约100℃。液体的雾化利用2个液体喷嘴(气体喷嘴和压力喷嘴)或旋转盘实现。Niro(哥本哈根，丹麦)生产的FSD(流化喷雾干燥器)或APVAnhydro(哥本哈根，丹麦)生产的叫作SBD(喷雾床干燥器)的相当的干燥器也可用于干燥。这些干燥器为喷雾干燥器和流化床制粒机的组合。其也可以在干燥过程中具有某种团聚作用。为了在最终产品中选择确定颗粒大小的分布，可通过筛子将非常小的颗粒分开并使其返回到处理过程中。同样的，非常大的颗粒可以用磨机粉碎后返回处理过程中。

术语“泛酸盐生产微生物”包括产生泛酸盐的天然存在的微生物以及具有去调节的泛酸盐生物合成途径和/或去调节的异亮氨酸-缬氨酸生物合成途径的微生物，如重组微生物。这里所用的“具有去调节的泛酸盐生物合成途径”的微生物包括这样的微生物，其至少一个泛酸盐生物合成酶被去调节(比如，过表达)以至于泛酸的产量得到增强(比如，和所述微生物在所述生物合成酶去调节前的泛酸产量相比或和野生型微生物相比)。优选的“具有去调节的泛酸盐生物合成途径”的微生物包括这样的微生物，其至少一个泛酸盐生物合成酶被去调节(比如，过表达)以至于泛酸的产量为1g/L或更多。更优选的“具有去调节的泛酸盐生物合成途径”的微生物包括这样的微生物，其至少一个泛酸盐生物合成酶被去调节(比如，过表达)以至于泛酸的产量为2g/L或更多。

术语“泛酸生物合成酶”包括泛酸生物合成途径中生成某个化合物(比如中间物或产物)所用的任何酶。比如，从α-酮异戊酸(α-KIV)经中间物酮泛解酸盐合成泛解酸盐。酮泛解酸盐的形成被泛酸盐生物合成酶酮泛解酸羟甲基转移酶(panB基因的产物)所催化。泛解酸的形成被泛酸生物合成酶酮泛解酸还原酶(panE基因产物)所催化。从天冬氨酸合成β-丙氨酸被泛酸生物合成酶天冬氨酸-α-脱羧酶(panD基因产物)所催化。从泛解酸和β-丙氨酸形成泛酸(比如，缩合作用)被泛酸生物合成酶泛酸合成酶(panC基因产物)所催化。

术语“异亮氨酸-缬氨酸生物合成途径”包括这样的生物合成途径，其涉及用于将丙酮酸转化或合成为缬氨酸或异亮氨酸的异亮氨酸-缬氨酸生物合成酶(比如，由生物合成酶编码基因编码的多肽)、化合物(比如，前体、底物、中间物或产物)、辅因子等等。术语“异亮氨酸-缬氨酸生物合成途径”包括导致微生物中(比如，在体内)缬氨酸或异亮氨酸合成的生物合成途径以及导致体外合成缬氨酸或异亮氨酸的生物合成途径。

术语“异亮氨酸-缬氨酸生物合成酶”包括异亮氨酸-缬氨酸生物合成途径中用于形成某种化合物(比如，中间物或产物)的任何酶。从丙酮酸合成缬氨酸经过中间物乙酰乳酸、α，β-二羟基异戊酸(α，β-DHIV)和α-酮异戊酸(α-KIV)。从丙酮酸形成乙酰乳酸被异亮氨酸-缬氨酸生物合成酶乙酰羟酸合成酶(ilvBN基因产物或，alsS基因产物)所催化。从乙酰乳酸形成α，β-DHIV被异亮氨酸-缬氨酸生物合成酶乙酰羟酸异构还原酶(ilvC基因产物)所催化。从α，β-DHIV合成α-KIV被异亮氨酸-缬氨酸生物合成酶二羟酸脱水酶(ilvD基因产物)所催化。而且，缬氨酸和异亮氨酸可通过支链氨基酸转氨酶互相转化。

在一个实施方案中，本发明的重组微生物是革兰氏阳性生物(比如，由于存在围绕微生物的革兰氏阳性细胞壁而保留碱性染料，例如结晶紫的微生物)。在一个优选的实施方案中，重组微生物属于选自芽孢杆菌属(Bacillus)、棒杆菌属(Cornyebacterium)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococci)和链霉菌属(Streptomyces)的属。更优选的实施方案中，重组微生物为芽孢杆菌属的微生物。在另一个优选的实施方案中，重组微生物选自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，缓病芽孢杆菌(Bacilluslentimorbus)，迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)，坚强芽孢杆菌(Bacillusfirmus)，泛酸芽孢杆菌(Bacillus pantothenticus)，淀粉液化芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)，环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)，凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)，地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)，短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)，苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)，以及其他组1芽孢杆菌种，例如，特征为16S rRNA型的种(Priest(1993)《Bacillus subtilis and Other Gram-Positive Bacteria》编Sonenshein等人，ASM，Washington，D.C.，p.6)。在另外一个优选的实施方案中，重组微生物是短芽孢杆菌(Bacillus brevis)或嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)。在另外一个优选的实施方案中，重组微生物选自地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，淀粉液化芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，耐芽孢杆菌(Bacillus halodurans)，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)。

在另外一个实施方案中，重组微生物是革兰氏阴性(排斥碱性染料)微生物。在一个优选的实施方案中，重组微生物选自沙门氏菌属(Salmonella)，埃希氏菌属(Escherichia)，克雷伯氏菌属(Klebsiella)，沙雷氏菌属(Serratia)和变形杆菌属(Proteus)的微生物。在一个更优选的实施方案中，重组微生物为埃希氏菌属的微生物。在甚至更优选的实施方案中，重组微生物是大肠杆菌(Escherichia coli)。在另外一个实施方案中，重组微生物是酵母(Saccharomyces)(比如酿酒酵母(S.cerevisiae))。特别优选的“泛酸盐生产微生物”包括比如在序号为09/667,569的美国专利申请中所描述的那些。

术语“培养”包括使本发明的活微生物维持和/或生长(如，使培养物或菌株维持和/或生长)。在一个实施方案中，本发明的微生物在液体培养基比如发酵培养液中培养。在一个优选的实施方案中，本发明的微生物在包含对其生长和/或维持所必需或有利的营养物质(例如，碳源或碳底物，例如糖、烃、油、脂肪、脂肪酸、有机酸和醇；氮源，例如胨、酵母提取物、肉膏、麦芽汁、尿素、硫酸铵、氯化铵、硝酸铵和磷酸铵；磷源，例如磷酸及其钠和钾盐；微量元素，例如镁、铁、锰、钙、铜、锌、硼、钼和/或钴盐；以及生长因子如氨基酸、维生素、生长促进剂等等)的培养基(例如，无菌的液体培养基)中培养。

优选地，本发明的微生物培养于pH受调控的条件下。在一个实施方案中，微生物培养在pH6.0和11.0之间。在另一个实施方案中，微生物培养在pH6.0和8.5之间，例如pH约为7。优选的控制pH的试剂包括氢氧化铵、氢氧化钠和/或氢氧化钾。当将盐(例如二价阳离子如Ca²⁺(CaCl₂)或Mg²⁺(MgCl₂))加到发酵培养基中时，用这些试剂控制pH尤为重要。在一个优选的实施方案中，微生物培养于“Ca(OH)₂控制的pH条件”下。术语“Ca(OH)₂控制的pH条件”包括至少加入一些Ca(OH)₂以利于得到所需产物，例如可喷雾干燥的泛酸钙组合物的条件。优选地，通过必要时加入Ca(OH)₂以升高pH，且在必要时用本领域技术人员所知的任何方法降低pH来保持所需pH。在另一个优选的实施方案中，微生物培养于“Mg(OH)₂控制的pH条件”下。术语“Mg(OH)₂控制的pH条件”包括至少加入一些Mg(OH)₂以利于得到所需产物，例如可喷雾干燥的泛酸镁组合物的条件。优选地，通过必要时加入Mg(OH)₂以升高pH，且在必要时用本领域技术人员所知的任何方法降低pH来保持所需pH。

微生物的培养条件将使微生物在约36小时中至少产生20g/L泛酸盐，在约48小时中至少产生约20-30g/L泛酸盐或者在约72小时中至少产生约35到40g/L泛酸盐。通过培养基、方法或菌株优化或者三者的组合优化，最终培养液中泛酸盐浓度能够达到40g/L，45g/L，50g/L，55g/L，60g/L，65g/L，70g/L，80g/L，90g/L或甚至大于90g/L。

D-泛酸钙广泛用作饲料添加剂。也发现D-泛酸钙可用作“预混料(pre-mixes)”的成分。预混料”是本领域认可的组合物(例如饲料添加剂)，包括例如支持动物生长和/或健康的维生素、矿物质和/或氨基酸。因此，非常需要设计一种方法以使D-泛酸钙从可再生的来源如糖产生而不用加入任何泛酸前体，例如β-丙氨酸。

为了该目的，可按照专利申请DE10046490所描述的在发酵结束后的任何下游处理步骤中往含D-泛酸或其盐的发酵培养液中加入钙离子。在另外一个实施方案中，可以在发酵过程中将钙离子加入发酵培养液中。例如，可在发酵培养液中通过补给如下溶液而加入钙离子，该溶液含有CaO、Ca(OH)₂、CaCl₂、CaCO₃、CaSO₄、CaHPO₄或者有机钙盐如甲酸钙、乙酸钙、丙酸钙、甘氨酸钙或乳酸钙或者这些盐的组合。也可以使用其他钙盐；上面所列举的不应看作是限定性的。优选在发酵中使用CaO或Ca(OH)₂，因为这些化合物有助于pH的滴定。优选地，每产生2摩尔D-泛酸盐加入至少1摩尔钙盐。在另一个实施方案中，为产生2摩尔D-泛酸盐加入大于1摩尔的钙盐。在另一个实施方案中，发酵结束后，往在发酵过程中补给钙盐而产生的发酵培养液中加入上面所列举的其它钙盐。(见例如，实施例4&5)。

含D-泛酸钙的发酵培养液可按照此处所描述的方法喷雾干燥或者喷雾粒化。在一个实施方案中，在喷雾干燥或喷雾制粒过程之前或之中，向发酵培养液中加入化合物如糖，例如乳糖或麦芽糖糊精，谷类或豆类产品，例如全麦粉、麦麸或大豆或小麦面粉，矿物盐，例如钙、镁、钠、钾盐，添加剂如硅胶以及D-泛酸和/或其盐(通过化学合成或发酵生成的)。

在一个优选的实施方案中，没有加入其它成分而直接将发酵培养液喷雾干燥。

在一个实施方案中，生物量从发酵培养液中被分离出来而仅将上清液喷雾干燥。生物量的分离通过如过滤、离心、超滤、微量过滤或它们的组合实现。所得生物量可以进行洗涤，然后将液体加入分离的发酵上清液中。在另一个实施方案中，将含生物量的发酵培养液喷雾干燥而没有将生物量分开。在另外一个实施方案中，将发酵培养液喷雾干燥而没有进行附加的浓缩步骤。

在另一个实施方案中，进行发酵培养液的浓缩。结果干物质含量增加。这可例如通过蒸发除去水分实现。蒸发可分多步在真空下进行。蒸发可在薄膜蒸发器(例如由GIG(4800 Attnang Puchheim，奥地利)，GEA Canzler(52303 D üren，德国)，Diessel(31103 Hildesheim，德国)和Pitton(35274Kirchhain，德国)公司生产的)上进行。也可以用膜技术(例如，毫微过滤(nanofiltration)，逆向渗透等)使发酵培养液中的干物质含量增加。浓缩后，干物质含量可为约20％到约80％。在一个实施方案中，将除去的水返回到发酵培养液中，从而减少所产生的废水量。

在一个实施方案中，在发酵结束后，直接在发酵罐中进行发酵培养液的灭菌。在另一个实施方案中，在发酵培养液离开发酵罐后进行灭菌。也可以在用上面所列出的分离方法从发酵培养液中除去生物量后，对培养物上清液进行灭菌。

发酵培养液的干燥或配制可用本领域传统的方法进行。例如，可喷雾干燥、流化床喷雾制粒或旋转盘干燥发酵培养液(Ullmann’s Encyclopediaof Industrial Chemistry，第6版，1999，electronic release，章节“固体材料的干燥”)。

本发明所得产物除了D-泛酸钙之外，可能还含有发酵培养液中的其他成分，例如磷酸盐、碳酸盐、残留的糖、生物量、复杂培养基成分等。特征性地产物具有白到褐色，水分含量少于5％，优选1-3％。为了防止产物结块，水分含量不能超过5％。D-泛酸钙的含量为10-90％，优选20-80％，更优选为50-80％。

同样地，含有D-泛酸钙的发酵培养液可从葡萄糖制得，而不需要补给β-丙氨酸或任何其他泛酸盐前体并能使泛酸盐滴度达到20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85以及90g/L以上。在一个优选的实施方案中，本发明的微生物培养于受控的通气条件下。术语“受控的通气”包括充分的通气(例如氧气)以得到所需的产物(例如，可喷雾干燥的泛酸盐)。在一个实施方案中，通过调节培养物中氧气水平而控制通气，例如，通过调节溶解于培养基中的氧气来控制。优选地，通过搅动培养物使其通气。可通过螺旋桨或类似机械搅拌装置，通过旋转或摇动培养容器(例如试管或烧瓶)或通过各种泵装置进行搅动。可进一步将灭菌空气或氧气通入培养基(例如，通入发酵混合物)而控制通气。也优选，在没有过量泡沫(如，通过添加消泡剂)的条件下培养本发明的微生物。

而且，本发明微生物可在受控的温度条件下培养。术语“受控的温度”包括能导致所需产物(例如，可喷雾干燥的泛酸盐)产生的任何温度。在一个实施方案中，受控的温度包括15℃到95℃之间的温度。在另一个实施方案中，受控的温度包括15℃到70℃之间的温度。优选的温度在20℃到55℃之间，更优选的在30℃到50℃之间。

微生物可以在液体培养基中培养(例如，维持和/或生长)，优选通过传统的培养方法如标准培养、试管培养、摇动培养(例如，旋转摇动培养、摇瓶培养等)、通气旋转培养或发酵进行连续或不连续培养。在一个优选的实施方案中，微生物在摇瓶中培养。在一个更优选的实施方案中，微生物在发酵罐(例如发酵工艺)中培养。本发明的发酵工艺包括但不限于分批、补料分批和连续发酵工艺或方法。短语“分批工艺”或“分批发酵”指一个系统，其中培养基、营养物、补充添加剂等等的组成在发酵开始时设定，且在发酵过程中不进行改变，然而，可以采取措施控制如pH和氧气浓度等因素以防止培养基过分酸化和/或微生物死亡。短语“补料分批工艺”或“补料分批”发酵指分批发酵但随着发酵的进行，加入一种或多种底物或补充物(例如，增量加入或连续加入)。短语“连续工艺”或“连续发酵”指一个系统，其中连续向发酵罐中加入规定的发酵培养基，同时除去等量的用过的培养基或“条件”培养基，优选用于回收所需的产物(例如，可喷雾干燥的泛酸盐组合物)。在本领域中已经开发并熟知许多这样的工艺。

在一个实施方案中，可喷雾干燥的泛酸盐组合物不从微生物中纯化出来，例如，当微生物是生物无害的(例如，安全的)时。例如，整个培养物或发酵培养液(或上清液)可用作产物的来源(例如，粗产品)。在一个实施方案中，使用未经修饰的培养物(或培养上清)。在另一个实施方案中，浓缩培养物(或培养上清)。在另一个实施方案中，干燥或冷冻干燥培养物(或培养上清)。

本发明的生产方法导致以相当高的产量产生所需的化合物。短语“相当高产量”包括生产或产量水平得以充分提高或高于可比较的生产方法的通常生产或产量水平，例如，提高到足够用于所需产品的商业化生产的水平(例如，以商业可行的成本生产产品)。在一个实施方案中，本发明描述了一个生产方法，其包括在一定的条件下培养重组微生物以使所需的产物(例如，泛酸盐)以大于2g/L的水平生产。在另一个实施方案中，本发明描述了一个生产方法，其包括在一定的条件下培养重组微生物以使所需的产物(例如，泛酸盐)以大于10g/L的水平生产。在另一个实施方案中，本发明描述了一个生产方法，其包括在一定的条件下培养重组微生物以使所需的产物(例如，泛酸盐)以大于20g/L的水平生产。在另一个实施方案中，本发明描述了一个生产方法，其包括在一定的条件下培养重组微生物以使所需的产物(例如，泛酸盐)以大于30g/L的水平生产。在另一个实施方案中，本发明描述了一个生产方法，其包括在一定的条件下培养重组微生物以使所需的产物(例如，泛酸盐)以大于40g/L的水平生产。在另一个实施方案中，本发明描述了一个生产方法，其包括在一定的条件下培养重组微生物以使所需的产物(例如，泛酸盐)以大于50g/L的水平生产。在另一个实施方案中，本发明描述了一个生产方法，其包括在一定的条件下培养重组微生物以使所需的产物(例如，泛酸盐)以大于60g/L的水平生产。本发明还描述了这样的生产所需化合物的方法，其包括将重组微生物在一定条件下培养以至于在商业上所需的时间内产生足够高水平的化合物。

在另一个实施方案中，本发明描述了一个生产方法，其包括在使所需的产物(例如，泛酸盐)得以产生的条件下培养重组微生物、收集培养物、从发酵培养液中分离(或不分离)生物量、对培养物灭菌(在生物量除去之前或之后)、浓缩培养液(或不浓缩)以及用上面描述的任何方法使培养物干燥以使产物中所含D-泛酸钙的水平大于10％(20-30-40％等)。

我们将用下面的实施例进一步阐述本发明，但这些实施例不应被解释成对本发明的限定。该整个申请中所引用的所用参考文献、专利和已出版的专利申请都在此引入作为参考。

发明实例：

实施例1：用PA668-24株生产泛酸钙

在20L实验室规模的发酵罐(Infors AG，Switzerland)中，按照下表制备4升以水为基础的发酵分批培养基：

物质	终浓度
物质	终浓度	大豆粉	40g/L
酵母提取物	5g/L	大豆粉	40g/L
酵母提取物	5g/L	谷氨酸钠	5g/L
(NH₄)₂SO₄	8g/L	谷氨酸钠	5g/L
(NH₄)₂SO₄	8g/L	Tego KS 911(消泡剂)	1mL/L

加水至最终体积为4L。灭菌(121℃，30min)后加入1升无菌的溶液。培养液组合物的浓度如下：

物质	浓度
物质	浓度	KH₂PO₄	10g/L
K₂HPO₄	20g/L	KH₂PO₄	10g/L
K₂HPO₄	20g/L	葡萄糖	20g/L
CaCl₂	0.1g/L	葡萄糖	20g/L
CaCl₂	0.1g/L	MgCl₂	1g/L
柠檬酸钠	1g/L	MgCl₂	1g/L
柠檬酸钠	1g/L	FeSO₄×7H₂O	0.01g/L
SM-1000x	1mL/L	FeSO₄×7H₂O	0.01g/L

微量矿物质溶液SM-1000x具有如下组成：0.15g Na₂MoSO₄×2H₂O，2.5g H₃BO₃，0.7g CoCl₂×6H₂O，0.25g CuSO₄×5H₂O，1.6g MnCl₂×4H₂O，0.3g ZnSO₄×7H₂O溶于水并加水至1升。通过无菌注射器将SM-1000x加入到发酵分批培养基中。

起始体积为5升，往分批培养基中加入100mL含枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)株PA668-24的接种培养物(在SVY培养基中OD＝10)。

向100mL SVY培养基中接种PA668-24株的冰冻原种，补加15mg/L四环素和5mg/L氯霉素以制备接种物。SVY培养基由25g Difco小牛肉浸汁(Veal Infusion broth)、5g Difco酵母提取物、5g谷氨酸钠和2.7g(NH₄)₂SO₄于740mL水中的灭菌混合物制得。对于灭菌的培养基，向其中加入200mL无菌1M K₂HPO₄(pH7)和60mL无菌的50％葡萄糖溶液使终体积为1升。然后将培养基在旋转摇床上于37℃培养12-18小时。

用带挡板的250mL锥形瓶制备冰冻原种。向50mL SVY培养基中补加15mg/L四环素和5mg/L氯霉素并用来自琼脂板上的单个菌落的PA668-24株进行接种。在旋转摇床上孵育过夜后，向培养物中加入10mL无菌的80％甘油溶液。在冰冻管中制作1mL的等分试样并分别冰冻于-80℃。

接种后，开始进行发酵。设定温度43℃。最初搅拌速度设为400rpm，最初空气流速设为4L/min。所有发酵均为限葡萄糖的补料分批式工艺。在指数生长期消化掉最初一批的2％葡萄糖。之后，通过连续补给下表所列出的葡萄糖溶液使葡萄糖浓度保持在0到1g/L之间。

物质	终浓度
物质	终浓度	葡萄糖	600g/L
谷氨酸钠	5g/L	葡萄糖	600g/L
谷氨酸钠	5g/L	柠檬酸钠	2g/L
FeSO₄×7H₂O	0.02g/L	柠檬酸钠	2g/L
FeSO₄×7H₂O	0.02g/L	SM-1000x	2ml/L

在发酵的最初8小时内，通过加入25％的NH₃溶液以维持pH。之后，必要时通过向发酵培养液中加入25％的Ca(OH)₂的水性悬浮液以升高pH来控制pH。偶尔，当pH高于优选pH范围时，通过加入20％磷酸降低pH。搅拌速度和空气流速通过溶解氧值(pO₂)控制，此溶解氧值设为饱和值的20％。葡萄糖溶液的补给通过和pO₂值相关的算法控制。为了控制泡沫，偶尔加入消泡剂。在发酵48小时，停止补给葡萄糖溶液。

pO₂值达到95％后，收集发酵培养液。D-泛酸盐的浓度为21.4g/L。通过离心分离生物量。上清液中残留的细胞通过在121℃灭菌30分钟将其杀死，这可通过将培养液样品涂琼脂平板(Difco Tryptone Blood AgarBroth，33g/L，补加30mg/L四环素和30mg/L氯霉素)，在37℃孵育过夜后检查菌落的生长情况来证明。最终上清液中D-泛酸盐的浓度为15g/L。

将发酵培养液在薄膜蒸发器里浓缩，得到的最终干物质含量为21％。浓缩的发酵培养液含有55.4g/L D-泛酸钙。

实施例2：含D-泛酸钙的发酵培养液制品

将500克实施例1中产生的浓缩的发酵培养液用带有双液体喷嘴(喷嘴直径为1.2mm)的实验室规模的干燥器(Minor‘Hi-Tec’；Niro，Copenhagen，Denmark)干燥。通过不断搅动使发酵悬浮液保持均匀。入口温度为185-192℃，出口温度为88-91℃，气压为2巴。

得到74.8g黄褐色的粉末，产量为70％。粉末含25％D-泛酸钙。水分含量为1.7％。

实施例3：含D-泛酸钙的发酵培养液制品

将500克实施例1中产生的浓缩的发酵培养液用带有双液体喷嘴(喷嘴直径为1.2mm)的实验室规模的干燥器(Minor ‘Hi-Tec’；Niro，Copenhagen，Denmark)干燥。通过不断搅动使发酵悬浮液保持均匀。入口温度为153-159℃，出口温度为72-78℃，气压为2巴。

得到79.2g黄褐色的粉末。粉末含24.1％D-泛酸钙。水分含量为1.9％。

实施例4：含D-泛酸钙的发酵培养液制品

向500克实施例1中产生的浓缩的发酵培养液中，加入2.2g固体Ca(OH)₂以增加溶液的碱性至pH10。然后将溶液用带有双喷嘴(喷嘴直径为1.2mm)的实验室规模的干燥器(Minor‘Hi-Tec’；Niro，Copenhagen，Denmark)干燥。通过不断搅动使发酵悬浮液保持均匀。入口温度为135-143℃，出口温度为73-77℃，气压为2巴。

得到82.4g黄褐色的粉末。粉末含23.7％D-泛酸钙。水分含量为1.6％。实施例5：含D-泛酸钙的发酵培养液制品

向500克实施例1中产生的浓缩的发酵培养液中，加入5.0g固体CaCl₂。然后将所得溶液用带有双液体喷嘴(喷嘴直径为1.2mm)的实验室规模的干燥器(Minor‘Hi-Tec’；Niro，Copenhagen，Denmark)干燥。通过不断搅动使发酵悬浮液保持均匀。入口温度为129-130℃，出口温度为75-78℃，气压为2巴。

得到65.1g黄褐色的粉末。粉末含23.4％D-泛酸钙。水分含量为1.7％。实施例6：用PA668-2A进行泛酸钙的生产

物质	终浓度
物质	终浓度	大豆粉	40g/L
酵母提取物	5g/L	大豆粉	40g/L
酵母提取物	5g/L	谷氨酸钠	5g/L
(NH₄)₂SO₄	8g/L	谷氨酸钠	5g/L
(NH₄)₂SO₄	8g/L	Tego KS(消泡剂)	1mL/L

加水至最终体积为4L。121℃灭菌30min后，加入1升灭菌的溶液使达到如下表的终浓度：

物质	终浓度
物质	终浓度	KH₂PO₄	10g/L
K₂HPO₄	20g/L	KH₂PO₄	10g/L
K₂HPO₄	20g/L	葡萄糖	20g/L
CaCl₂	0.1g/L	葡萄糖	20g/L
CaCl₂	0.1g/L	MgCl₂	1g/L
柠檬酸钠	1g/L	MgCl₂	1g/L
柠檬酸钠	1g/L	FeSO₄×7H₂O	0.01g/L
SM-1000x	1mL/L	FeSO₄×7H₂O	0.01g/L

微量矿物质溶液SM-1000x由如下组成：0.15g Na₂MoSO₄×2H₂O，2.5g H₃BO₃，0.7g CoCl₂×6H₂O，0.25g CuSO₄×5H₂O，1.6g MnCl₂×4H₂O和0.3g ZnSO₄×7H₂O溶于1升水。通过无菌注射器将微量矿物质溶液SM-1000x加入到发酵分批培养基中。

发酵分批培养基起始体积为5升，往分批培养基中加入100mL含枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)株(PA668-2A)的接种培养物(在SVY培养基中OD＝10)。

向100mL SVY培养基(补加15mg/L四环素和5mg/L氯霉素)中接种PA668-2A株的冰冻原种以制备接种物。SVY培养基：25g Difco VealInfusion broth、5g Difco酵母提取物、5g谷氨酸钠和2.7g(NH₄)₂SO₄溶于740mL水，灭菌，加入200mL无菌1M K₂HPO₄(pH7)和60mL无菌的50％葡萄糖溶液(终体积1升)。将培养物在旋转摇床上于37℃培养12-18小时。

用带挡板的250mL锥形瓶制备冰冻原种。对100mL SVY培养基(补加15mg/L四环素和5mg/L氯霉素)用来自琼脂板上的单个菌落的PA668-2A株进行接种。在旋转摇床上孵育过夜后，向培养物中加入10mL无菌的80％甘油溶液。在冰冻管中制作1mL的培养物等分试样并分别冰冻于-80℃。

接种后，开始进行发酵。设定温度43℃。最初搅拌速度设为400rpm，最初空气流速设为4L/min。

所有发酵均为限葡萄糖的补料分批式工艺。在指数生长期消化掉最初一批的2％葡萄糖。之后，通过连续补给800g/L下表所列出的葡萄糖溶液使葡萄糖浓度保持在0到1g/L之间。

物质	终浓度
物质	终浓度	葡萄糖	800g/L
CaCl₂	0.6g/L	葡萄糖	800g/L
CaCl₂	0.6g/L	谷氨酸钠	5g/L
柠檬酸钠	2g/L	谷氨酸钠	5g/L
柠檬酸钠	2g/L	FeSO₄×7H₂O	0.02g/L
SM-1000x	2ml/L	FeSO₄×7H₂O	0.02g/L

在发酵的最初24小时内，通过加入25％的NH₃溶液以控制pH。之后，通过加入25％的Ca(OH)₂的水性悬浮液到发酵培养液中以控制pH。为了滴定偶尔出现的碱性pH，加入20％磷酸。搅拌速度和空气流速通过溶解氧值(pO₂)控制，此溶解氧值设为饱和值的20％。葡萄糖溶液的补给通过和pO₂相关的算法控制。通过偶尔加入消泡剂来控制泡沫。在发酵48小时，停止补给葡萄糖溶液。D-泛酸盐的浓度约为44.8g/L。pO₂值达到95％后，将发酵培养液在121℃灭菌30min。成功的灭菌可通过将灭菌后的发酵培养液样品涂琼脂平板(Difco Tryptone Blood Agar Broth，33g/L，补加30mg/L四环素和30mg/L氯霉素)，在37℃孵育过夜后检查菌落的生长情况来证明。不将发酵培养液中的生物量除去，其中发酵培养液含有38g/L D-泛酸盐。

将发酵培养液在薄膜蒸发器里浓缩，得到最终干物质含量为30％。

实施例7：含有D-泛酸钙和生物量的发酵培养液制品

500克实施例6中产生的浓缩的发酵培养液用带有双液体喷嘴(喷嘴直径为1.2mm)的实验室规模的干燥器(Minor‘Hi-Tec’；Niro，Copenhagen，Denmark)干燥。通过不断搅动使发酵悬浮液保持均匀。入口温度为185-192℃，出口温度为88-91℃，气压为2巴。

得到105g 含D-泛酸钙的黄褐色粉末。产率为70％。

上面实施例所用的菌株构建如下：

构建泛酸盐生产菌株的起始点为枯草芽孢杆菌168(Marburg StammATCC 6051)，其基因型为trpC2(Trp^-)。通过将Trp⁺标记(来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)野生型W23)转导到枯草芽孢杆菌168株中后得到PY79株。通过经典的基因工程方法(例如Harwood，C.R和Cutting，S.M(编辑)，Molecular Biological Methods for Bacillus(1990)JohnWiley&Sons，Ltd.，Chichester，England)将ΔpanB和ΔpanE1突变导入PY79株中。

将所得菌株用枯草芽孢杆菌株PA221(基因型P₂₆panBCD，trpC2(Trp^-))基因组DNA和枯草芽孢杆菌株PA303(基因型P₂₆panE1)基因组DNA转化。所得菌株PA327具有基因型P₂₆panBCD，P₂₆panE1且是色氨酸营养缺陷型(Trp^-)。

将枯草芽孢杆菌株PA327在补充5g/L β-丙氨酸和5g/Lα-酮异戊酸的10mL SVY培养基(25g/L Difco Veal Infusion broth、5g/L Difco酵母提取物、5g/L谷氨酸钠和2.7g/L(NH₄)₂SO₄溶于水，用水补充至740mL，灭菌，加入200mL 1M磷酸钾(pH7.0)和60mL 50％无菌葡萄糖溶液)中培养，得到的泛酸滴度高达3g/L(24h)。

枯草芽孢杆菌株PA221(基因型P₂₆panBCD，trpC2(Trp^-))的产生见下文：

用经典的基因工程方法，从枯草芽孢杆菌GP275质粒文库，利用大肠杆菌的panBCD操纵子序列信息(见Merkel等，FEMS Microbiol.Lett.，143，1996：247-252)，克隆芽孢杆菌panBCD操纵子。

为了克隆，利用了大肠杆菌BM4062(bir^ts)株和芽孢杆菌操纵子位于birA基因座附近的信息。将panBCD操纵子克隆到大肠杆菌可复制质粒中。为了增强panBCD操纵子的表达，使用了枯草芽孢杆菌噬菌体SP01的强组成性启动子(例如P₂₆)。此外，panB基因上游的核糖体结合位点(“RBS”)用序列为CCCTCT-AG-AAGGAGGAGAAAACATG的人工RBS代替。质粒上紧挨P₂₆panBCD盒的上游区插入一个DNA片断，天然地该片断位于芽孢杆菌天然panB基因的紧上游区。将该质粒转化到枯草芽孢杆菌株RL-1中(通过经典诱变得到的枯草芽孢杆菌168衍生株(Marburg株ATCC 6051)，基因型trpC2(Trp^-))并通过同源重组将天然panBCD操纵子替换成P₂₆panBCD操纵子。所得菌株称为PA221，其基因型为P₂₆panBCD，trpC2(Trp^-)。

将枯草芽孢杆菌株PA221在补充有5g/Lβ-丙氨酸和5g/Lα-酮异戊酸的10mL SVY培养基中培养，得到的泛酸盐滴度高达0.92g/L(24h)。

制备枯草芽孢杆菌株PA303(基因型P₂₆panE1)的步骤如下：

通过已知的大肠杆菌panE基因的序列，对芽孢杆菌panE基因进行克隆。有趣的是，在枯草芽孢杆菌中，有两个与大肠杆菌panE基因同源的基因，分别称作panE1和panE2。通过基因敲除分析知道，panE1基因负责90％的泛酸盐合成，而删除panE2基因对泛酸盐的合成没有显著影响。同时，这里的启动子被强组成性P₂₆启动子代替，panE1上游的核糖体结合部位被人工RBS代替。将P₂₆panE1片断克隆到质粒载体中，该载体的设计使得P₂₆panE1片断能够整合到枯草芽孢杆菌基因组原来的天然panE1座位中。经过转化和同源重组后产生的菌株称为PA303，其特征是其基因型为P₂₆panE1。

将枯草芽孢杆菌株PA303在补充有5g/Lβ-丙氨酸和5g/Lα-酮异戊酸的10mL SVY培养基中培养，得到的泛酸盐滴度高达1.66g/L(24h)。

对菌株的进一步改造通过用质粒进一步转化PA327进行，该质粒含有P₂₆ilvBNC操纵子和放线壮观素标记基因。P₂₆ilvBNC操纵子整合于amyE座位，这可通过PCR分析证实。其中一个转化体称为PA340株(基因型P₂₆panBCD，P₂₆panE1，P₂₆ilvBNC，specR，trpC2(Trp^-))。

将枯草芽孢杆菌株PA340在补充有5g/Lβ-丙氨酸的10mL SVY培养基中培养，得到的泛酸盐滴度高达3.6g/L(24h)。在补充有5g/Lβ-丙氨酸和5g/Lα-酮异戊酸的10mL SVY培养基中培养得到高达4.1g/L(24h)的泛酸盐滴度。

进一步，将一个去调节的ilvD盒导入PA340株。为此，将含有受P26启动子和人工RBS控制的ilvD基因的质粒转化到PA340中。通过同源重组使P₂₆ilvD基因整合到天然ilvD座位。所得PA374株具有基因型P₂₆panBCD，P₂₆panE1，P₂₆ilvBNC，P₂₆ilvD，specR和trpC2(Trp^-)。

将枯草芽孢杆菌株PA374在补充有5g/Lβ-丙氨酸的10mL SVY培养基中培养得到高达2.99g/L(24h)的泛酸盐滴度。

为了不用补给β-丙氨酸前体也能产生泛酸盐，将额外拷贝的编码天冬氨酸-α-脱羧酶的基因panD导入PA374株中。将PA401株的染色体DNA转化到PA374中。通过四环素筛选得到PA377株。

所得PA377株具有基因型P₂₆panBCD，P₂₆panE1，P₂₆ilvBNC，P₂₆ilvD，specR，tetR和trpC2(Trp^-)。

将枯草芽孢杆菌株PA377在不补给任何前体如β-丙氨酸和α-酮异戊酸的10mL SVY培养基中培养得到高达1.31g/L(24h)和3.6g/L(48h)的泛酸盐滴度。

枯草芽孢杆菌株PA401(基因型P₂₆panD)的产生在下面段落中描述：

将枯草芽孢杆菌panD基因从panBCD操纵子克隆到含有四环素标记基因的质粒载体中。在panD基因的上游插入启动子P₂₆和上述人工RBS。通过限制性内切酶消化，从载体中得到含有四环素标记基因和P₂₆panD基因的片断。将该片断重新连接并转化上述PA221株。如此该片断整合到PA221的基因组中。所得菌株PA401的特征是其基因型为P₂₆panBCD，P₂₆panD，tetR和trpC2(Trp^-)。

将枯草芽孢杆菌株PA401在补充有5g/Lα-酮异戊酸的10mL SVY培养基中培养得到高达0.3g/L(24h)的泛酸盐滴度。在补充有5g/L D-泛解酸和10g/L L-天冬氨酸的10mL SVY培养基中培养得到高达2.2g/L(24h)的泛酸盐滴度。

将PA377株用菌株PY79染色体DNA转化得到色氨酸原养型菌株。所得菌株PA824具有基因型P₂₆panBCD，P₂₆panE1，P₂₆ilvBNC，P₂₆ilvD，specR，tetR和Trp⁺。将枯草芽孢杆菌株PA824在不添加例如前体的10mLSVY培养基中培养得到泛酸盐的滴度高达4.9g/L(48h)。

枯草芽孢杆菌株PA668的产生在下面段落中描述：

将克隆自panBCD操纵子的芽孢杆菌panB基因插入到含有氯霉素标记基因和枯草芽孢杆菌vpr基因座序列的质粒载体中。将强组成性启动子P26插入到panB基因的上游。含有P₂₆panB基因、氯霉素标记基因和vpr序列的片断通过限制性内切酶处理得到。将分离的片断重新连接并用于转化PA824菌株。所得菌株名为PA668。PA668的基因型为P₂₆panBCD，P₂₆panE1，P₂₆ilvBNC，P₂₆ilvD，P₂₆panB，specR，tetR和Trp⁺。分离到PA668的两个菌落，一个名为PA668-2A，另一个名为PA668-24。

将枯草芽孢杆菌株PA668-2A在无添加(例如前体)的10mL SVY培养基中培养，得到泛酸盐的滴度高达1.5g/L(48h)。在补加10g/L L-天冬氨酸的10mL SVY培养基中培养，得到泛酸盐的滴度高达5.0g/L(48h)。在补加5g/L D-泛解酸和10g/L L-天冬氨酸的10mL SVY培养基中培养，得到泛酸盐的滴度高达4.9g/L(48h)。

将枯草芽孢杆菌株PA668-24在无添加(例如前体)的10mL SVY培养基中培养，得到泛酸盐的滴度高达1.8g/L(48h)。在补加10g/L L-天冬氨酸的10mL SVY培养基中培养，得到泛酸盐的滴度高达4.9g/L(48h)。在补加5g/L D-泛解酸和10g/L L-天冬氨酸的10mL SVY培养基中培养，得到泛酸盐的滴度高达6.1g/L(48h)。

此处P26启动子的序列如下：

gcctacctag cttccaagaa agatatccta acagcacaag agcggaaaga tgttttgttc

tacatccaga acaacctctg ctaaaattcc tgaaaaattt tgcaaaaagt tgttgacttt

atctacaagg tgtggtataa taatcttaac aacagcagga cgc

上述PA377菌株用SVY-培养基(25g/L Difco Veal Infusion Broth，5g/L Difco酵母提取物，5g/L色氨酸，5g/L谷氨酸钠，2g/L(NH₄)₂SO₄，10g/L KH₂PO₄，20g/L K₂HPO₄，0.1g/L CaCl₂，1g/L MgSO₄，1g/L柠檬酸钠，0.01g/L FeSO₄×7H₂O和1ml/L微量矿物质溶液(组合物：0.15gNa₂MoO₄×2H₂O，2.5g H₃BO₃，0.7g CoCl₂×6H₂O，0.25g CuSO₄×5H₂O，1.6g MnCl₂×4H₂O，0.3g ZnSO₄×7H₂O，溶于水，终体积1L))进行限葡萄糖发酵检验。进行10L规模的连续补给葡萄糖溶液的发酵，得到泛酸盐的滴度为18-19g/L(36h)和22-25g/L(48h)。

也对PA377的色氨酸原养型衍生株PA824在YE-培养基(10g/L Difco酵母提取物，5g/L谷氨酸钠，8g/L(NH₄)₂SO₄，10g/L KH₂PO₄，20g/LK₂HPO₄，0.1g/L CaCl₂，1g/L MgSO₄，1g/L柠檬酸钠，0.01g/L FeSO₄×7H₂O和1ml/L上述微量矿物质溶液)中进行了限葡萄糖发酵检验。进行10L规模的连续补给葡萄糖溶液的发酵，得到泛酸盐的滴度为20g/L(36h)，28g/L(48h)和36g/L(72h)。

对PA824进一步在分批培养基中进行限葡萄糖发酵检验。所述分批培养基的组成为：10g/L Difco酵母提取物，10g/L NZ Amine A(QuestInternational GmbH，Erftstadt，德国)，10g/L谷氨酸钠，4g/L(NH₄)₂SO₄，10g/L KH₂PO₄，20g/L K₂HPO₄，0.1g/L CaCl₂，1g/L MgSO₄，1g/L柠檬酸钠，0.01g/L FeSO₄×7H₂O和1ml/L上述微量矿物质溶液。进行10L规模的连续补给葡萄糖溶液的发酵，得到泛酸盐的滴度为37g/L(36h)和48g/L(48h)。

这些发酵检验举例说明了过量产生泛酸盐以及以在此定义的前体独立型方式生产泛酸盐的工程菌。

可以通过优化或者改造培养基、增加发酵时间、改进工艺和菌株以及联合使用上述方法进一步提高发酵培养液中泛酸的滴度。例如，可通过发酵上述PA824或PA668菌株的衍生株而得到上述的泛酸盐滴度。可通过经典的菌株改造手段如经典诱变和基因技术方法得到衍生株。通过培养基、菌株或工艺的改造，发酵培养液中泛酸盐滴度能够增加到超过40，45，50，55，60，65，70，75，80，85和＞90g/L。

等效方案只使用常规实验，本领域的技术人员即可意识到或能够确定在此描述的本发明的特定实施方案的许多等效方案。这些等效方案将被包括在下面的权利要求书中。

Claims

1.生产可喷雾干燥的泛酸盐组合物的方法，包括在Ca(OH)₂控制的pH条件下培养泛酸盐生产微生物，以产生可喷雾干燥的泛酸盐组合物。

2.权利要求1的方法，其中所述可喷雾干燥的泛酸盐组合物含有D-泛酸钙。

3.权利要求1的方法，其中浓缩的可喷雾干燥的泛酸盐组合物的干物质含量为约10％到约80％。

4.权利要求1的方法，其中浓缩的可喷雾干燥的泛酸盐组合物的干物质含量为约20％到约60％。

5.权利要求1的方法，其中浓缩的可喷雾干燥的泛酸盐组合物的干物质含量大于50％。

6.权利要求5的方法，其中所述泛酸盐组合物通过喷雾干燥进一步处理。

7.权利要求6的方法，其中对所述可喷雾干燥的泛酸盐组合物喷雾干燥时入口温度为约100℃到约200℃。

8.权利要求7的方法，其中对所述可喷雾干燥的泛酸盐组合物喷雾干燥时出口温度为约60℃到约100℃。

9.权利要求5的方法，其中在干燥之前生物量从所述可喷雾干燥的泛酸盐组合物中被分离出来。

10.权利要求9的方法，其中通过过滤、离心、超滤、微量过滤或其联合将生物量从所述可喷雾干燥的泛酸盐组合物中分离出来。

11.权利要求1的方法，其中所述可喷雾干燥的泛酸盐组合物被浓缩。

12.权利要求1的方法，其中所述Ca(OH)₂控制的pH条件为约pH 6.0至pH 11.0。

13.权利要求12的方法，其中所述Ca(OH)₂控制的pH条件为约pH 7.0。

14.权利要求12的方法，其中所述Ca(OH)₂控制的pH条件为约pH 10。

15.用权利要求1-14任何之一的方法生产的可喷雾干燥的泛酸盐组合物。