CN1495200A - 作为载体的新的融合蛋白质 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种融合蛋白质，其包含一用于将所需分子输送进入细胞或细胞核的融合蛋白质，所述蛋白质包含i)一冷休克结构域及其同源物或功能等价衍生物，及ii)一膜转位序列或其功能等价肽及/或其衍生物。该融合蛋白质可用作体外输送核酸的载体，特别是可用作体内输送核酸的载体以用于基因疗法及制造转基因动物。

Description

作为载体的新的融合蛋白质

技术领域

本发明涉及一种称为新的载体的融合蛋白质，其用于将分子输送进入细胞。

背景技术

输送遗传物质进入哺乳动物细胞在治疗及商业等方面的重要性与日俱增。例如，基因疗法已用于修正先天或遗传的基因缺陷、癌症、及病毒感染。在人类中表达人工基因的能力促进了许多人类主要疾病的预防及/或治疗，包括许多藉由其它疗法的治疗无法矫正的疾病。然而，生物膜系生物系统中区隔的重要天然屏障。因此，一般认为多肽及寡核苷酸在治疗上的价值有限。为克服输送此类多肽及寡核苷酸的问题已进行了诸多研究。

初期的工作大多着眼于使用逆转录病毒载体转化此类细胞。然而，据报逆转录病毒有诸多缺点。例如不易感染某些细胞类型。典型地，逆转录病毒系经由受体进入细胞，因此若此类受体不存在于细胞上，或存在数量不大，则感染便不可行或效率不佳。

许多研究人员发展出用于输送多肽及寡核苷酸进入细胞的脂质粒(liposome)系统。脂质粒是由膜包围形成的小球，其内含有适当的DNA。然而，此系统亦有先天的问题。脂质粒的大小很难控制，因此输送至个别细胞的均一性亦难以控制。此外，难以防止脂质粒内容物的渗漏，因此如同其它技术一样，难以对细胞类型具专一性。

最近发展出数种称为 蛋白质转导结构域(protein transductiondomain，PTD)的蛋白质小区域以运送分子进入细胞(Fisher等人，Bioconjugate Chem.，Vol.12，No.6,2001年)。此类PTD可自由地转位(translocate)通过细胞膜而不需依靠受体、转运蛋白(transporter)，不会饱和，且不消耗任何能量。PTD可在一小时内穿越细胞膜屏障。制造、分离及利用TAT-融合蛋白质以影响哺乳动物细胞的基本需求见Becker-Hapak等人所述(Methods 24，247-256，2001年)。Steven等人合成了一系列合成PTD，其α-螺旋成分经加强且精氨酸残基配置经最佳化。数个PTD 相对于TAT具有显著增进的蛋白质转导能力(Steven等人，Cancer Research 61，474-477，2001年1月15日)。另外，USP 6,090,619描述了一种新的非病毒载体的制备，其可结合所需DNA以形成可用于转染人类或动物细胞的病态线粒体的组合物。USP 6,339,139提供了一种结合至生长因子受体的基因输送系统，包含一由配体寡肽/聚阳离子多肽/内体释出寡肽/外源DNA组成的4-元复合物基因输送系统，或由配体寡肽/聚阳离子多肽/外源DNA组成的3-元复合物。

本领域的输送载体系统面临了下述之一或多个障碍。第一，将病毒载体及阳离子脂质粒注射入活动物体内时会诱发免疫反应。第二，细胞的胞外液体如同血流般，会稀释或最终消化所载基因，导致所输送的基因丧失。第三，双层磷脂质的细胞膜形成天然屏障，阻止核苷酸分子进入。因此，大分子如DNA基因无法以自由(主动或被动)输送的方式穿越细胞膜，以输送外来DNA所载基因进入细胞内。第四，胶状的细胞质环境中富含蛋白酶及/或核酸酶，在其中藉内体陷阱(trapping)机制降解DNA所载基因。第五，细胞质中的载体-DNA载货遭遇第二重屏障——核膜。DNA所载基因须通过核膜并于基因可作用的细胞核中释出该DNA所载基因。第六，即使DNA所载基因能够进入细胞膜，输送效率仍低。

鉴于上述障碍，需开发一种可有效输送所需分子进入细胞或细胞核的输送系统。

发明内容

本发明涉及一种用于将所需分子输送进入细胞或细胞核的融合蛋白质，包括i)一冷休克结构域及其同源物或功能等价衍生物，及ii)一膜转位序列或其功能等价肽及/或其衍生物。

附图说明

图1所示为构建编码本发明融合蛋白质的基因rTAT-CspA的简化流程图。通过PCR以引物1及2由大肠杆菌扩增CspA基因，并藉由插入编码逆向形式(reversed form)TAT-PTD肽序列的经退火合成寡核苷酸1及2而获得双链DNA/RNA结合能力，将该序列导入CspA基因后将所得的本发明经修饰基因(rTAT-CspA)亚克隆进入pET28a表达载体中。

图2所示为构建编码本发明融合蛋白质的基因(SPKR)4-iTAT-CspA的简化流程图。通过PCR以引物1及2由大肠杆菌扩增CspA基因，并藉由插入编码DNA浓缩序列(SPKR)4的经退火合成寡核苷酸3及4而获得双链DNA/RNA结合能力，进一步通过PCR扩增以引物3及4于经修饰的CspA基因中导入PTD序列，然后将所得的本发明经修饰基因亚克隆进入pET28a表达载体中。

图3表示融合蛋白质的诱导及纯化，其依据制造商指示进行，纯化的蛋白质于5％至15％SDS-PAGE上分析并以考马斯蓝(coomasieblue)染色凝胶；道1为pET28a/融合蛋白质的全细胞裂解物；道2为pET28a/融合蛋白质经超声波处理(sonicate)上清液1；道3为pET28a/融合蛋白质经超声波处理上清液2；道4为pET28a/融合蛋白质经超声波处理沉淀物；道5为镍-珠亲和层析法所得流通级份；道6为于1x结合缓冲液中含有20mM咪唑的洗涤级份；道7为溶析1的级份，含有；道8为溶析2的级份，于溶析缓冲液中含有60mM咪唑；道9为购自Amersham-Pharmacia公司的分子量标记物；道10为纯化的iTat蛋白质(0.25μg)；及道11为纯化的rTat蛋白质(1.0μg)。

图4表示凝胶阻滞分析法(gel retardation assay)。将0.5μg报告质粒pEGFP-N1(购自Clontech公司)与不同量的蛋白质载体(rTAT-CspA或iTAT-CspA)共置于1x PBS缓冲液中。于室温下放置30分钟后，于1％琼脂糖凝胶(1x TBE)上分离DNA-蛋白质复合物并以EtBr染色凝胶。

图5表示分别以下列转染的Hela细胞的绿色萤光蛋白质表达：(1)没有DNA质粒(左图)，(2)rTAT-CspA-pEGFP-N1复合物(中)，及(3)(SPKR)4-iTAT-CspA-pEGFP-N1。将DNA-蛋白质复合物与细胞置放1小时后，添加0.45mL含血清的DMEM肉汤培养基并于37℃培养6小时，然后添加1mL含血清的DMEM肉汤培养基，细胞再于37℃培养24小时并于萤光显微镜下检查EGFP基因表达。

图6表示经本发明融合蛋白质载体iTAT-CspA-pEGFP-N1复合物转染的小鼠胚胎的绿色萤光蛋白质表达。分别以0.75μg DNA质粒pcDNA3.1(左图)或pEGFP-N1报告DNA质粒及本发明蛋白质载体iTAT-CspA(右图)转染整区移除的小鼠胚胎。置放一段时间后，于萤光显微镜下检查绿色萤光蛋白质表达。

图7表示肝脏的冷冻组织切片，其为得自以i.p.注射本发明蛋白质载体rTAT-或iTAT-CspA-pEGFP-N1 DNA复合物处理的小鼠。48小时后处死小鼠，然后以共聚焦激光扫描显微镜(confocal laserscanning microscope，Leica公司)检查肝脏中的绿色萤光蛋白质表达。

图8表示电泳迁移率分析法(EMSA)，其使用本发明蛋白质、rTAT及人类5S rRNA进行。

具体实施方式

现代生物科技完全建立于DNA基因输送平台的基础上，例如体细胞基因疗法(包括纤维囊肿、胰岛素缺乏性糖尿病及甲型及乙型血友病等)及转基因动物。为得到更为有效、经济及安全的基因输送载体，以达改进人类保健的目标，需要所有这些研究领域及具商业重要性的议题。

本发明提供一种用于作为载体的新的融合蛋白质。本发明的载体为非病毒性载体，其可与所需核酸结合并有效地将其输送至任何生物体中，如动物、细胞株及胚胎。其可以最少成本大量生产，并广泛地应用于各种领域，如转基因动物及基因疗法。

本发明的重组融合蛋白质

此处所用的“融合蛋白质”系指编码标的多肽的第一氨基酸序列与界定一并非且实质上不同源于标的蛋白质的任何结构域的结构域(如多肽部分)的第二或更多氨基酸序列的融合。

本发明提供一种用于输送所需分子进入细胞或细胞核的融合蛋白质，包括i)一冷休克结构域及其同源物或功能等价衍生物，及ii)一膜转位序列或其功能等价肽及/或其衍生物。

冷休克结构域

依据本发明，任何适用的冷休克结构域及其同源物或功能等价衍生物皆可用于本发明的融合蛋白质。选择冷休克结构域(CSD)的原因可完全由下列优点阐明：(1)CSD系一普遍保守性的核酸结合结构域，普遍存在于原核及真核生物界中，因此其有助于减少免疫反应或甚至将此风险降至零。因此，CSD系构建基因输送蛋白质载体的最佳选择，因为CSD不会在接受基因输送载体的宿主中引起巨大的免疫反应。(2)CSD固有的核酸结合性质可容忍细胞内外不同的Na⁺/K⁺离子分布，亦即CSD不太可能会在输送过程中丧失所载基因，而可达到高效的基因输送。及(3)近来Lescar等人提出α病毒、黄病毒的外鞘糖蛋白采β桶型结构以插入宿主细胞的细胞膜，因此融合发生多肽与CSD的框架内(in-frame)融合可避免落入内体或直接与细胞膜融合(Lescar，J.，Roussel，A.，Wein，M.W.，Navaza，J.，Fuller，S.D.，Wengler，G，及Rey，F. A.(200 1)The fusion glycoprotein shell of Semliki Forestvirus：an icosahedral assembly primed for fusogenic activation atendosomal pH.Cell 105，137-148。及Kuhn，R.J.等人，Cell 108，717-725，2002)。

CSD的结构已经充分定性，为一反向平行的5股β桶型结构(称为OB-折叠)。因此，具有类似于CSD结构的OB-折叠家族可用于本发明的融合蛋白质。许多研究结果指出CSD可与单股核酸结合。例如冷休克结构域周边表面上的RNP-1及RNP-2 RNA结合基序(motif)及苯丙氨酸、赖氨酸残基可与单股DNA、RNA结合(Bycroft等人，Cell Vol.88，235-242，1997年1月24日)。Izumi等人指出 Y-盒结合蛋 白质-1可与单股核酸结合(Nucleic Acids Research，2001，Vol.29，No.5，1200-1207)。优选地，该冷休克结构域系选自由CspA、CspB、CspC、CspD、rpl S1 RNA结合结构域、真核生物的Y-盒蛋白质、DNA结合蛋白质B(DBPB)、DBPA、EF-1、mRNP3、mRNP4、FRG Y1及核酸酶敏感组件结合蛋白质1(NSEP1)所组成的组。更优选地，该冷休克结构域系选自由CspA、rpl S1 RNA结合结构域、人类YB-1及DNA结合蛋白质B所组成的组。

应了解本发明的CSD并不限于以上所例举的种类，而亦包括由任何其它来源所得的同源序列。依据上述揭示，本领域技术人员应可理解任何可与核酸结合的CSD同源物均可用于本发明的融合蛋白质。

依据本发明，CSD及其同源物的功能等价衍生物亦可用于本发明的融合蛋白质。CSD或其同源物可经修饰以与双链核酸结合。CSD及其同源物的“功能等价衍生物”包括重组产生或化学合成的多肽分子，其以类似于参考分子的方式作用以达所需结果。因此，CSD及其同源物的功能等价衍生物包含衍生物其包括任何发生于内部或胺基或羧基端的单或多个氨基酸添加、取代及/或删除，及包括任何修饰如插入DNA结合结构域或DNA浓缩结构域。亦以证明CSD可经修饰以与双链DNA或RNA结合。例如Wang等人发现将CspA的冷休克结构域以其真核生物的对应物YB-1蛋白质的正电荷氨基酸予以结构域置换而修饰，可导致双链DNA结合能力(Wang等人，Mol.Microbiology，38(3)：526-534，2000)。

依据本发明，CSD经修饰以得到具有双链RNA/DNA结合能力的衍生物，其可藉由将 DNA浓缩结构域或DNA结合结构域插入CSD中而达成。DNA浓缩结构域可结合更多DNA，及/或使DNA分子浓缩形成核小体(nucleosome)结构，其对Dnase消化具抗性而可使用较少量融合蛋白质。依据本发明，任何可修饰冷休克结构域/核糖体蛋白质S1，使的可与双链DNA结合的适合DNA浓缩或结合结构域均可用于本发明。例如，适合的DNA浓缩或结合结构域为得自组蛋白(histone)的DNA浓缩结构域(SPKR)3-4、高移动性族组(HMG)蛋白质、或富含正电荷氨基酸如精氨酸、赖氨酸的细胞核定位序列(NLS)，例如SV40大T抗原、Myc、YB1蛋白质及其它推算的NLS。

膜转位序列

依据本发明，融合蛋白质的膜转位序列为能够在称为蛋白质转导的过程中有效穿越生物膜者，如蛋白质转导结构域(PTD)及膜融合序列及其功能等价肽或衍生物。已知蛋白质转导并非以传统的受体-、转运蛋白-或内体-介导的方式发生。膜转位序列可迅速而有效地转导分子进入细胞。膜转位序列的实施例示于下表：序列                                                名称(序列来源)蛋白质转导结构域RQIKIWFQNRRMKWKK(SEQ ID NO：1)                       Pantp(43-58)(Penetratin)Kkwkmrrnqfwvkvqr(SEQ ID NO：2)                       Retro-inverso pAntp(43-58)RRWRRWWRRWWRRWRR(SEQ ID NO：3)                       W/R PenetratinRRMKWKK(SEQ ID NO：4)                                Pantp(52-58)GRKKRRQRRRPPQ(SEQ ID NO：5)                          HIV TATYGRKKRRQRRR(SEQ ID NO：6)                            HIV TATrrrrrrr(SEQ ID NO：7)                                R7Asp-Ala-AlaOThr-Arg-Ser-Ala-Ala-Ser-Arg-Pro-Thr-Glu  VP22(267～300)-Arg-Pro-Arg-Ala-Pro-Ala-Arg-Ser-A1a-Ser-Arg-Pro-Arg-Arg-Pro-Val-Glu(SEQ ID NO：8)Membrane Fusion SequenceGALFLGWLGAAGSTMGA(SEQ ID NO：9)                      Gp41融合序列GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKSKRKV                          MPG(gp41融合序列-SV40NLS)(SEQ ID NO：10)MGLGLHLLVLAAALQGAWSQPKKKRKV                          宽吻鳄Ig(v)轻链-SV40NLS(SEQ ID NO：11)PLSSIFSRIGDP(SEQ ID NO：12)                          PreS2-TLMFWRGDLVFDFQV(SEQ ID NO：13)                          VP3核心蛋白质KFTIVFPHNQKGNWKNVPSNYHYCP(SEQ ID NO：VSV-G肽14)AKRARLSTSFNPVYPYEDES(SEQ ID NO：15)                  Ad纤维GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL                          Transportan(SEQ ID NO：16)RGGRLSYSRRRFSTSTGR(SEQ ID NO：17)                    SynB1AAVALLPAVLLALLAP(SEQ ID NO：18)                      MPS(Kaposi FGF讯号序列)AAVLLPVLLAAP(SEQ ID NO：19)         MPS(Kaposi FGF讯号序列)VTVLALGALAGVGVG(SEQ ID NO：20)      MPS(人类整合素β3讯号序列)VAYISRGGVSTYYSDTVKGRFIRQKYNKRA(SEQ  P3ID NO：21)KLALKLALKALKAALKLA(SEQ ID NO：22)   模型两性肽WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKACEA      KALA(SEQ ID NO：23)

本发明的一优选实施方案为提供一用于输送所需分子进入细胞或细胞核的融合蛋白质，包括i)一冷休克结构域及其同源物或功能等价衍生物，及ii)一膜转位序列或其功能等价肽及/或衍生物。本领域已知PTD可输送核酸穿越细胞膜及核膜。藉由结合CSD及PTD，本发明的融合蛋白质可成功地输送所需核酸至细胞质或细胞核。研究已发现数种PTD及其特性、特征及功效(Fischer等人，BioconjugateChem.，2001，Vol.12，No.6，825-841；Lindgren等人，Tips，2000年3月，Vol.21；Becker-Hapak等人，Methods 24，247-256，2001；及Ho等人，Cancer Research 61，474-477，2001年1月15日)。例如，Tat系一种86至102个氨基酸长度(取决于病毒品系)的转录活化因子，并涉及HIV的复制。最小的Tat转导结构域为基本残基49至57。VP22，一种来自单纯泡疹病毒-1的38-kDa结构性蛋白质，具有细胞间传输的优异特性。最小的VP22转导结构域为基本残基267至300。Antp为一 果蝇类似(homeotic) 转录因子，由三个α-螺旋及位于螺旋2及3的间的β-转折所组成。Antp的第三个α-螺旋(残基43至58)系转导所需者。

优选地，PTD系选自由SEQ ID NO：1至8所组成的组。更优选地，PTD系选自由SEQ ID NO：1、2、4、5、6及7所组成的组。

本发明另一实施方案系提供一用于输送所需分子进入细胞或细胞核的融合蛋白质，包括i)一冷休克结构域及其同源或功能等价衍生物。本领域亦已知膜融合序列可将分子转位至细胞膜。藉由结合CSD及膜融合序列，本发明的融合蛋白质可输送所需核酸至细胞质。为输送所需核酸至细胞核，该融合蛋白质须进一步包含一膜定位序列。例如，一代表性膜融合序列为PreS2-TLM。PreS2系一穿透性肽，其转位基序称为PreS2-TLM。PreS2-TLM对应于一介于PreS2蛋白质的残基41及52间的两性(amphipathic)α-螺旋。该肽似乎可穿透各种细胞，包括植物细胞。优选地，该膜融合序列系选自由SEQ ID NO：9至23所组成的组。更优选地，该膜融合序列系选自由SEQ ID NO：9、10、11、12、13、17、19、20及21所组成的组。

蛋白质纯化标识序列

依据本发明，该融合蛋白质可进一步包含蛋白质纯化标识序列。依据本发明，该纯化标识序列只是该融合蛋白质的选择性组件，仅用于蛋白质纯化。本发明的融合蛋白质可通过化学纯化技术予以纯化。例如，含Tat-PTD的蛋白质可通过肝素管柱纯化(Hakansson等人，Protein Science(2001)，10：2138-2139)。再者，DNA柱亦可用于纯化本发明的融合蛋白质。

依据本发明，该蛋白质纯化标识序列可融合于基因输送蛋白质载体的N-或C-端。优选地，该蛋白质纯化标识序列系选自由HA、GST、His6标记所组成的组。更优选地，该蛋白质纯化标识序列为His6标记。

本发明融合蛋白质的制备

本发明融合蛋白质可通过在适于表达该蛋白质的条件下培养经重组载体转化的宿主细胞，及纯化藉此产生的蛋白质而制造的。

本发明可使用适于表达依据本发明的融合蛋白质的DNA构建体，亦即重组DNA分子。为表达本发明蛋白质，将该DNA构建体转殖入一表达本发明融合蛋白质的表达载体中。该表达载体当然系依据选定用于表达该蛋白质的宿主细胞的本质而选择的。适合的此类表达载体可在市面购得。当适合的表达载体系原核生物表达载体，如由Novagen公司所提供的pET系统细菌质粒时，表达较佳系于原核生物宿主中进行，更佳系于微生物宿主中，特别是大肠杆菌。

本发明融合蛋白质的应用

本发明提供一种作为输送载体的融合蛋白质。本发明的融合蛋白质在体外，及特别是体内，具有高转染效率而可输送基因进入细胞、胚胎及活体动物中。由该融合蛋白质所进行的基因输送可以物种特异性，甚至个体特异性的方式进行。因此，本发明的融合蛋白质在基因疗法及转基因动物的制造上系有效的工具。

下列实施例仅供例示而非设限。

实施例

实施例1

本发明融合蛋白质的克隆及构建

挑选单一菌落的DH5α品系大肠杆菌，然后添加100μl灭菌水。将所得溶液煮沸5分钟。短暂离心后，取10μl的份量用作以聚合酶链反应(PCR)扩增CspA基因的模板。使用引物1及引物2由大肠杆菌扩增CspA基因。引物1及引物2的序列如下：引物1：5’-gctagcATGTCCGGTAAAATGACTGGTATCGTAAA-3’引物2：5’- ctcgagATTACAGGCTGGTTACGTTA-3’(小写字母表示NheI切割处。下标线小写字母表示XhoI切割处。)

进行25个PCR循环后(退火温度设定于55℃，1分钟)后，以1.2％琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，然后以QIAquick PCR产物纯化试剂盒(QIAGEN公司)纯化。纯化的PCR产物克隆入pGEM-T载体中(Promega公司)并依制造商的技术手册指示筛选重组质粒，获得pGEM(T)/CspA质粒，然后以DNA测序加以确认。因此，通过在本发明冷休克结构域中插入DNA浓缩或结合结构域，将该冷休克蛋白质A(CspA；冷休克结构域)进一步修饰以用于结合双链核酸。融合蛋白质I：最简单形式的融合蛋白质，包含由TAT及CSD而来的NLS+/PTD组合，称为rTAT(见图1)。该DNA结合/NLS+/PTD，Tat肽序列的反向形式(rTAT)，系由下列合成寡核苷酸所编码：

寡核苷酸(1)：5’-taTGGGTCGCCGTCGTCAACGTCGTAAAAAGCGCCGTT-3’

寡核苷酸(2)：5’-ctagAACCGCGCTTTTTACGACGTTGACGACGGCGACCCA-3’融合蛋白质II：第二种形式的融合蛋白质包含由TAT及(SPKR)4及CSD的DNA浓缩序列而来的NLS+/PTD组合，称为(SPKR)4-iTAT-CspA(见图2)。该DNA浓缩序列，(SPKR)4，系由下列合成寡核苷酸所编码：

寡核苷酸(3)：5’-taTGGGCTCTCCTAAACGCTCTCCTAAACGCTCTCCTAAACGCTCTCCTAAACGTGGTT-3’

寡核苷酸(4)：5’-ctagAACCACGTTTAGGAGAGCGTTTAGGAGAGCGTTTAGGAGAGCGTTTAGGAGAGCCCA-3’

分别混合100pmol寡核苷酸(1)及寡核苷酸(2)或寡核苷酸(3)及寡核苷酸(4)，并于95℃加热5分钟。退火的双链寡核苷酸缓慢冷却至4℃并于-20℃下贮存过夜。依制造商的建议指示以T4多核苷酸激酶(购自Amersham公司)及ATP标定退火的双链寡核苷酸的5’-端。于37℃下静置1小时后，以热灭活化停止反应，然后以苯酚：氯仿：异戊醇(isoamyloalcohol)(v/v/v＝25∶24∶1；Applichem公司)萃取。以糖原(glycogen；Roche公司)及冷无水乙醇(Merck公司)沉淀退火的双链寡核苷酸。

以T4 DNA连接酶(New England Biolab.公司)分别将编码Tat肽序列的反向形式(rTAT)或DNA浓缩序列(SPKR)4的合成寡核苷酸克隆入经NdeI、NheI处理的pGEM(T)/CspA中，并转化入DH5α品系大肠杆菌以分别得到pGEM(T)/rTAT-CspA及pGEM(T)/(SPKR)4-CspA DNA质粒。为进一步构建具膜转位活性的经修饰(SPKR)4-CspA，我们使用引物3及4(其系互补于CspA部份编码序列)，将来自TAT的PTD编码序列并入引物4中，并使用pGEM(T)/(SPKR)4-CspA DNA质粒作为PCR模板。经25个PCR循环后，以引物3及4用Taq酶(购自Takara公司)将PTD序列导入pGEM(T)/(SPKR)4-CspA。PTD的引物3及4的序列如下：引物3：5′-NNNNN GGATCCAGAGAAGTGTACGAACACATC-3′引物4：5′-NNNNN GGATCCCGCAAGAAACGCCGTCAACGCCGCAGAGGATCTCTGGACGAAGGTCAGAAA(下标线字母表示Bam HI切割处。)

退火温度设定于54℃，1分钟。经25个PCR循环后，所得PCR产物以QIAquick PCR纯化试剂盒纯化，并以DpnI及Bam HI消化之。经限制酶消化后，以1％琼脂糖凝胶(1×TAE)分离并以QIAquick凝胶纯化试剂盒(QIAGEN公司)纯化DNA。纯化的DNA经自我连接，然后转化入DH5α品系大肠杆菌，以得到pGEM(T)/(SPKR)4-iTat-CspA质粒。

表达载体的构建

以NdeI及XhoI消化由pGEM(T)/rTAT-CspA或(SPKR)4-iTat-CspA质粒所编码的融合蛋白质序列，然后以1％琼脂糖凝胶分离，分别以切下的含有rTAT-CspA或(SPKR)4-iTat-CspA融合蛋白质的编码序列的DNA片段作为DNA插入物。以相同的限制酶NdeI及XhoI处理表达载体pET28a(Novagen公司)，然后分别与DNA插入物(rTAT-CspA或(SPKR)4-iTat-CspA融合蛋白质的编码序列)连接；接着转化入DH5α品系大肠杆菌，以得到pET28a/rTAT-CspA或pET28a/(SPKR)4-iTat-CspA质粒；然后对pET表达载体做DNA测序。经测序辨识的pET28a/rTAT-CspA或pET28a/(SPKR)4-iTat-CspA质粒分别转化入大肠杆菌菌株BL21(DE3)codon-plus细胞(购自Stratagene公司)，以表达本发明融合蛋白质。

本发明融合蛋白质的表达与纯化

内含pET28a/rTAT-CspA或pET28a/(SPKR)4-iTat-CspA质粒的大肠杆菌菌株BL21(DE3)codon-plus细胞生长于LB(Kan+、Cm+)培养皿上。挑选单一菌落接种于2mlLB肉汤培养基(Kan+、Cm+)中，然后于37℃下培养4小时。取1ml份量的细菌培养物接种于400ml极端(terrific)肉汤培养基(Kan+、Cm+)中，进一步培养至光学密度OD600达于0.6-0.8。加入最终浓度1mM的IPTG，再于37℃下培养5到7小时。以离心收取经IPTG诱导的大肠杆菌细胞。所得沉淀物(pellet)贮存于-70℃的冷冻柜中，待进一步的蛋白质纯化。

本发明融合蛋白质的纯化

本发明融合蛋白质的纯化系依据pET系统的制造商指导手册进行。将经IPTG诱导表达的大肠杆菌宿主沉淀物再悬浮于含有8M尿素的1×His键合缓冲液(500mM NaCl、20mM咪唑及20mM Tris-Cl，pH7.9)中，然后以超声波处理打破细胞。高速离心后，超声波处理上清液部分以镍离子亲和力柱处理，之后以10倍体积的含有8M尿素的1×结合缓冲液(500mM NaCl、25mM咪唑及20mM Tris-Cl，pH7.9)及含有8M尿素的1×洗涤缓冲液(500mM NaCl、40mM咪唑及20mM Tris-Cl，pH7.9)洗涤柱。以含有8M尿素的1×溶析缓冲液(500mMNaCl、60mM咪唑及20mM Tris-Cl，pH7.9)将His6标记的融合蛋白质自柱析出。依次以4 M尿素及灭菌水透析该His6标记的融合蛋白质。冻干经透析的蛋白质，将蛋白质粉末溶解于1×PBS溶液，并以BCA(PIERCE公司)方法测定蛋白质浓度。纯化的融合蛋白质以5％至15％SDS-PAGE分析，并以亚甲基蓝染色凝胶(见图3)。所得蛋白质溶液可直接用于核酸结合试验(凝胶阻滞或EtBr排阻分析(EtBrexclusion assay))并测试其基因输送活性。

实施例2

本发明融合蛋白质的DNA结合容量

简言的，取0.5ug报告质粒pEGFP-N1(购自Clontech公司)与不同量的融合蛋白质载体(rTAT-CspA或(SPKR)4-iTat-CspA)共置于1×PBS缓冲液中。于室温下放置30分钟后，于1％琼脂糖凝胶(1×TBE)上分离DNA-蛋白质复合物并以EtBr染色及照相。一旦大的DNA-蛋白质复合物形成时，报告质粒DNA即因与融合蛋白质结合而被留置于凝胶顶端的孔中，故无法跑入凝胶中且无法被EtBr充分染色(见图4)。

实施例3

以融合蛋白质载体及pEGFP-N1报告质粒于体外转染Hela细胞培养物

置于以血清涂覆的盖玻片上生长过夜的次汇合(subconfluent)单层Hela细胞，温和地以无血清DMEM培养液洗涤2次、以1×PBS缓冲液洗涤5次，然后分别以5μg报告质粒pEGFP-N1或融合蛋白质(rTAT或(SPKR)4-iTat-CspA)-报告DNA质粒复合物(5μg)处理细胞。将Hela细胞于37℃下培养1小时，然后添加0.45ml的新鲜有血清DMEM培养液并于37℃下培养6小时，再添加1ml有血清DMEM培养液，继续培养。培养24小时后，直接以荧光显微镜(Leica公司)检视有表达EGFP蛋白质的经转染Hela细胞。如图5所示，经融合蛋白质-pEGFP-N1复合体转染的Hela细胞在细胞中展现出显著的绿色荧光讯号。该结果显示本发明融合蛋白质可有效输送DNA进入细胞中。

实施例4

以本发明融合蛋白质及pEGFP-N1报告质粒于体外转染区域(zona)移除的小鼠胚胎

用于转染的小鼠胚胎基本上系依据Gordon等人(Gordon，J.W.及Ruddle，F.H.(1983)Gene transfer into mouse embryos.Production oftransgenic mice by pronuclear injection.Methods in Enzymol.，Recombinant DNA，Part C.，101，411-433)及Hogan，B.、Costantini，F.及Lacy，E.(1986；Manipulating the mouse embryo：A LaboratoryManual)所述者制备的。简言之，ICR外系繁殖品系系购自台大实验动物中心(台北)，然后注射2.5IU的怀孕母马血清促性腺激素(购自Sigma，G4527)使其过度排卵，48小时后注射5IU的人类绒毛膜促性腺激素(hCG；Sigma公司，C8554)，并个别与ICR雄性同笼过夜。于注射hCG后24小时时，冲洗输卵管以收集单细胞小鼠胚胎。小鼠胚胎以内含0.5％链霉蛋白(pronase；Sigma公司，P5147)的M2培养液于37℃下处理5分钟以去除透明(pellucida)区，并以M2培养液及1×PBS缓冲液温和地清洗数次，然后以对照组质粒pcDNA3.1(购自Invitrogen公司)或融合蛋白质载体(SPKR)4-iTat-CspA及报告pEGFP-N1质粒，在与转染Hela细胞相同的条件下(除了使用0.75μg对照组质粒pcDNA3.1或pEGFP-N1报告质粒)转染。于37℃下静置15分钟后，添加1ml M16培养液(Sigma公司，M7292)，然后将胚胎置于矿物油中(Sigma公司，M8410)。在静置期间，每隔24小时以荧光显微镜(Leica公司)检查EGFP蛋白质表达。如图6所示，融合蛋白质(SPKR)4-iTat-CspA-pEGFP-N1报告质粒(左)在荧光显微镜相片中展现出显著的绿色荧光讯号，表示该融合蛋白质可成功输送DNApEGFP-N1报告质粒进入胚胎中。

实施例5

以本发明融合蛋白质输送报告DNA质粒pEGFP-N1进入小鼠中

取20μg DNA质粒pEGFP-N1与本发明融合蛋白质rTAT-CspA或(SPKR)4-iTat-CspA于1×PBS缓冲液中混合，于室温下静置15分钟，然后分别以腹腔内注射入小鼠中。48小时后，处死小鼠并将其肝脏做成冷冻组织切片，然后以共聚焦激光扫描显微镜(Leica公司)检查EGFP蛋白质表达。图7显示本发明融合蛋白质rTAT-CspA或(SPKR)4-iTat-CspA可成功于体内输送DNA质粒pEGFP-N1至肝细胞。

实施例6

本发明融合蛋白质的RNA结合负载量

将人类5S rDNA的PCR产物克隆入pGEM(T)载体(Promega公司，Elong Lin博士所赠)中。以Spe I消化pGEM(T)/h5S rDNA质粒，然后以1％琼脂糖凝胶(1×TAE)分离的。将线形pGEM(T)/h5SrDNA片段由琼脂糖凝胶切离，并以QIAquick凝胶纯化试剂盒(QIAGEN公司)纯化之。使用RiboMAX/T7大量RNA生产系统(Promega公司)合成人类5S rRNA，并依据制造商指导手册以UTP[α-32P](800ci/mmol，10mci/ml；NEN公司)均匀标记人类5S rRNA。体外合成的人类5SrRNA以12％UREA-PAGE分离，然后以UV遮蔽方法由凝胶纯化。经醋酸铵及乙醇沉淀后，人类5S rRNA于沸水浴中加热5分钟使其变性，然后缓慢冷却至室温并于-20℃下贮存过夜。取125ng人类5SrRNA与不同量的本发明蛋白质rTAT蛋白质混合，于室温下静置30分钟，然后再于37℃下静置10分钟同时以或不以RNase T1(10U；Ambion公司)处理。以8％天然PAGE(0.5×TBE)分离结合复合物，然后以10％醋酸固定该凝胶，接着干燥凝胶并进行放射自显影。如图8所示，RNase-抗性的结合复合物以符号“*”标识。

                         序列表<110>基因梭生技医药股份有限公司<120>作为载体的新的融合蛋白质<130>FF-02-004<140>JP 2002-140441<141>2002-05-15<160>29<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>16<212>PRT<213>Pantp；Penetratin<400>1Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys1               5                   10                  15<210>2<211>16<212>PRT<213>Retro-inVerso pAntp<400>2Lys Lys Trp Lys Met Arg Arg Asn Gln Phe Trp Val Lys Val Gln Arg1               5                   10                  15<210>3<211>16<212>PRT<213>W/R Penetrain<400>3Arg Arg Trp Arg Arg Trp Trp Arg Arg Trp Trp Arg Arg Trp Arg Arg1               5                   10                  15<210>4<211>7<212>PRT<213>Pantp<400>4Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys1               5<210>5<211>13<212>PRT<213>HIV TAT<400>5Gly Arg Lys  Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln1                5                   10<210>6<211>11<212>PRT<213>HIV TAT<400>6Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg1               5                   10<210>7<211>7<212>PRT<213>R7<400>7Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg1               5<210>8<211>30<212>PRT<213>VP22<400>8Asp Ala Ala Thr Arg Ser Ala Ala Ser Arg Pro Thr Glu Arg Pro Arg1               5                   10                  15Ala Pro Ala Arg Ser Ala Ser Arg Pro Arg Arg Pro Val Glu

        20                  25                  30<210>9<211>17<212>PRT<213>Gp41融合序列<400>9Gly Ala Leu Phe Leu Gly Trp Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly1              5               10                15Ala<210>10<211>27<212>PRT<213>MPG(Gp41融合序列-SV40NLS)<400>10Gly Ala Leu Phe Leu Gly Phe Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly1               5                   10                  15Ala Trp Ser Gln Pro Lys Ser Lys Arg Lys Val

        20                  25<210>11<211>27<212>PRT<213>宽吻鳄Ig(v)轻链-SV40NLS<400>11Met Gly Leu Gly Leu His Leu Leu Val Leu Ala Ala Ala Leu Gln Gly1               5                   10                  15Ala Trp Ser Gln Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val

        20                  25<210>12<211>12<212>PRT<213>PreS2-TLM<400>12Pro Leu Ser Ser Ile Phe Ser Arg Ile Gly Asp Pro1               5                   10<210>13<211>20<212>PRT<213>Ad纤维<400>13Ala Lys Arg Ala Arg Leu Ser Thr Ser Phe Asn Pro Val Tyr Pro Tyr1               5                   10                  15Glu Asp Glu Ser

        20<210>14<211>27<212>PRT<213>转移<400>14Gly Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys Ile Asn Leu1               5                   10                  15Lys Ala Leu Ala Ala Leu Ala Lys Lys Ile Leu

        20                  25<210>15<211>18<212>PRT<213>SynBl<400>15Arg Gly Gly Arg Leu Ser Tyr Ser Arg Arg Arg Phe Ser Thr Ser Thr1               5                   10                  15Gly Arg<210>16<211>16<212>PRT<213>MPS(Kaposi FGF信号序列)<400>16Ala Ala Val Ala Leu Leu Pro Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Ala Pro1               5                   10                  15<210>17<211>12<212>PRT<213>MPS(Kaposi FGF信号序列)<400>17Ala Ala Val Leu Leu Pro Val Leu Leu Ala Ala Pro1               5                   10<210>18<211>15<212>PRT<213>人整合素3信号序列<400>18Val Thr Val Leu Ala Leu Gly Ala Leu Ala Gly Val Gly Val Gly1               5                   10                  15<210>19<211>30<212>PRT<213>P3<400>19Val Ala Tyr Ile Ser Arg Gly Gly Val Ser Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr1               5                   10                  15Val Lys Gly Arg Phe Thr Arg Gln Lys Tyr Asn Lys Arg Ala

        20                  25                  30<210>20<211>18<212>PRT<213>两性肽模型<400>20Lys Leu Ala Leu Lys Leu Ala Leu Lys Ala Leu Lys Ala Ala Leu Lys1               5                   10                  15Leu Ala<210>21<211>30<212>PRT<213>KALA<400>21Trp Glu Ala Lys Leu Ala Lys Ala Leu Ala Lys Ala Leu Ala Lys His1               5                   10                  15Leu Ala Lys Ala Leu Ala Lys Ala Leu Lys Ala Cys Glu Ala

        20                  25                  30<210>22<211>35<212>DNA<213>引物1<400>22gctagcatgt ccggtaaaat gactggtatc gtaaa                               35<210>23<211>26<212>DNA<213>引物2<400>23ctcgagatta caggctggtt acgtta                                         26<210>24<211>38<212>DNA<213>Oligo(1)<400>24tatgggtcgc cgtcgtcaac gtcgtaaaaa gcgccgtt                            38<210>25<211>40<212>DNA<213>Oligo(2)<400>25ctagaaccgc gctttttacg acgttgacga cggcgaccca                          40<210>26<211>59<212>DNA<213>Oligo(3)<400>26tatgggctct cctaaacgct ctcctaaacg ctctcctaaa cgctctccta aacgtggtt     59<210>27<211>61<212>DNA<213>Oligo  (4)<400>27ctagaaccac gtttaggaga gcgtttagga gagcgtttag gagagcgttt aggagagccc    60a                                                                    61<210>28<211>27<212>DNA<213>引物3<400>28ggatccagag aagtgtacga acacatc                                    27<210>29<211>57<212>DNA<213>引物4<400>29ggatcccgca agaaacgccg tcaacgccgc agaggatctc tggacgaaggtcagaaa    57

Claims (33)

1.一种用于输送所需分子进入细胞或细胞核的融合蛋白质，包含i)一冷休克结构域及其同源或功能等价衍生物，及ii)一膜转位序列或其功能等价肽及/或衍生物。

2.如权利要求1的融合蛋白质，其中该冷休克结构域选自由下列所组成的一组：CspA、CspB、CspC、CspD、rpl S1 RNA结合结构域、真核生物的Y-盒蛋白质、DNA结合蛋白质B(DBPB)、DBPA、EFE-1、mRNP3、mRNP4、FRG Y1及核酸酶敏感组件结合蛋白质1(NSEP1)。

3.如权利要求1的融合蛋白质，其中该冷休克结构域选自由下列所组成的一组：CspA、rpl S1 RNA结合结构域、人类YB-1及DNA结合蛋白质A及B、及FRG Y1。

4.如权利要求1的融合蛋白质，其中该冷休克结构域的功能等价衍生物是藉由在该冷休克结构域内插入一DNA浓缩结构域或DNA结合结构域而修饰。

5.如权利要求4的融合蛋白质其中该DNA浓缩或结合结构域选自由DNA浓缩结构域(SPKR)3-4及正电荷细胞核定位序列(NLS+)所组成的组。

6.如权利要求1的融合蛋白质，其中该膜转位序列为蛋白质转导结构域(PTD)或膜融合序列。

7.如权利要求1的融合蛋白质，其中该膜转位序列为选自由SEQ ID NO：1、2、4、5、6、7及8所组成的组的蛋白质转导结构域(PTD)。

8.如权利要求1的融合蛋白质，其中该膜转位序列为选自由SEQ ID NO：1、2、4、5、6及7所组成的组的蛋白质转导结构域(PTD)。

9.如权利要求1的融合蛋白质，其中该膜融合序列选自由SEQID NO：9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22及23所组成的组。

10.如权利要求1的融合蛋白质，其中该膜融合序列选自由SEQID NO：9、10、11、12、13、17、19、20及21所组成的组。

11.如权利要求1的融合蛋白质，其进一步包含一蛋白质纯化标识序列。

12.如权利要求11的融合蛋白质，其中该蛋白质纯化标识序列选自由HA、GST、His6标记所组成的组。

13.如权利要求1的融合蛋白质其用于输送选自由DNA及RNA所组成的组的核酸进入基因输送用细胞。

14.如权利要求1的融合蛋白质，其用于输送核酸至体内的基因输送用细胞。

15.如权利要求1的融合蛋白质，其用于输送核酸至胚胎或活体动物以制造转基因动物。

16.一种融合蛋白质，包含i)一冷休克结构域及其同源或功能等价衍生物，及ii)一蛋白质转导结构域或其功能等价肽及衍生物。

17.如权利要求16的融合蛋白质，其进一步包含一蛋白质纯化标识序列。

18.如权利要求17的融合蛋白质，其中该蛋白质纯化标识序列系选自由HA、GST、His6标记所组成的组。

19.如权利要求16的融合蛋白质，其用于输送核酸至基因输送用细胞。

20.如权利要求16的融合蛋白质，其用于输送核酸至体内的基因输送用细胞。

21.如权利要求16的融合蛋白质，其用于输送核酸至胚胎或活体动物以制造转基因动物。

22.一种融合蛋白质，包含i)一冷休克结构域及其同源或功能等价衍生物，及ii)一膜融合序列或其功能等价肽及衍生物。

23.如权利要求22的融合蛋白质，其进一步包含一蛋白质纯化标识序列。

24.如权利要求23的融合蛋白质，其中该蛋白质纯化标识序列系选自由HA、GST、His6标记所组成的组。

25.如权利要求22的融合蛋白质，其用于输送核酸至基因输送用细胞。

26.如权利要求16的融合蛋白质，其用于输送核酸至体内的基因输送用细胞。

27.如权利要求22的融合蛋白质，其用于输送核酸至胚胎或活体动物以制造转基因动物。

28.如权利要求22的融合蛋白质，其进一步包含一细胞核定位序列。

29.如权利要求28的融合蛋白质，其进一步包含一蛋白质纯化标识序列。

30.如权利要求29的融合蛋白质，其中该蛋白质纯化标识序列系选自由HA、GST、His6标记所组成的组。

31.如权利要求28的融合蛋白质，其用于输送核酸至基因输送用细胞。

32.如权利要求28的融合蛋白质，其用于输送核酸至体内的基因输送用细胞。

33.如权利要求28的融合蛋白质，其用于输送核酸至胚胎或活体动物以制造转基因动物。

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