CN1322115C - 载有外源配体分子的胞外体及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种载有外源配体分子的胞外体及其制备方法与应用。该载有外源配体分子的胞外体，由外源配体分子和胞外体组成；所述外源配体分子结合在胞外体的膜表面，或者包裹在胞外体的腔内，或者在两个位置都存在；所述外源配体分子是非靶细胞自身合成的蛋白或分子，可以直接作用于靶细胞或被靶细胞通过内吞作用吸收。本发明的载有外源配体分子的胞外体可在同源或异源细胞间特异性传递外源的、具有生物活性的配体分子(外源的蛋白、毒素或药物分子)，将活性分子导入靶细胞。本发明的载有外源配体分子的胞外体可用于调节同源或异源靶细胞活性和制备药物(如治疗肿瘤的药物)。

Description

载有外源配体分子的胞外体及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及载有外源配体分子的胞外体及其制备方法与应用。

背景技术

很多动物细胞，包括多种肿瘤细胞，可以分泌一种内吞起源的小膜囊泡，称为“胞外体”(exosome)。它由磷脂双分子膜及其包裹的物质共同组成，直径为30-100nm，浮力密度约为1.1-1.2g/ml，载有一些特征性分子，如transferrinreceptor，flotillin，tsg101，rab5等(全部或者其中一部分)。胞外体由细胞中的多囊体(multivesicular body，MVB)与细胞质膜融合而生成，具体形成过程如图1所示：1.细胞通过内吞作用吸收胞外的物质，形成内吞囊泡(endocyticvesicle，EV)。2.内吞囊泡进一步融合成为早期内吞体(early endosome，EE)。3.早期内吞体在成熟过程中，其限制膜向内凹陷并出芽，形成腔内的小膜囊泡；此时生成的具有多层膜结构的细胞器称为多囊体(MVB)。4.成熟的MVB与细胞质膜(plasma membrane，PM)融合，将腔内的膜囊泡释放到胞外环境中，形成胞外体(exosomes)。

胞外体载有特定的来自细胞质膜或内吞体的膜整合蛋白或膜结合蛋白，以及一些来自细胞质的可溶性蛋白。分泌到细胞基质中的胞外体可以在邻近的细胞间传递，并且选择性地结合到周围的同源或者异源细胞上，从而介导细胞间的膜组分和细胞质组分交换，或者激活特定的信号反应(Stoorvogel，W.，Kleijmeer，M.J.，Geuze，H.J.，and Raposo，G.(2002).The biogenesis and functions ofexosomes.Traffic 3，321-330；Thery，C.，Zitvogel，L.，and Amigorena，S.(2002).Exosomes：composition，biogenesis and function.Nat Rev Immunol2，569-579)。

天花粉蛋白(Trichosanthin，TCS)是从中药植物栝楼的块根中分离出的一种毒素蛋白，其具有RNA N-糖苷酶活性，属于I型核糖体失活蛋白(ribosome-inactivating proteins，RIPs)。与靶细胞结合后，TCS可以侵入细胞质中，失活核糖体大亚基，阻断蛋白质的生物合成，从而导致靶细胞的死亡。TCS主要作用于合体滋胚层细胞、一些肿瘤细胞-如人子宫绒毛癌上皮细胞(JAR细胞)、白血病细胞(K562细胞)、黑素瘤细胞等，以及病毒侵染的免疫相关细胞-如HIV侵染的巨噬细胞和淋巴细胞等。因此，TCS及其衍生的免疫毒素被广泛用于中期引产、抗肿瘤以及抗HIV的治疗中。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种载有外源配体分子的胞外体。

本发明所提供的载有外源配体分子的胞外体(cargo-loaded exosome，CLE)，由外源配体分子和胞外体组成；所述外源配体分子结合在胞外体的膜表面，或者包裹在胞外体的腔内，或者在两个位置都存在；所述外源配体分子是非靶细胞自身合成的蛋白或分子，可以直接作用于靶细胞或被靶细胞通过内吞作用吸收。

所述外源配体分子具体可为外源的蛋白、毒素或药物分子，如天花粉蛋白或天花粉蛋白衍生物；所述靶细胞可为合体滋胚层细胞、肿瘤细胞或病毒侵染的免疫相关细胞。

所述肿瘤细胞可为人子宫绒毛癌上皮细胞、白血病细胞或黑素瘤细胞等。

所述免疫相关细胞包括淋巴细胞，造血干细胞，单核细胞和吞噬细胞。

本发明的另一个目的是提供两种制备载有外源配体分子的胞外体的方法，其中，一种是制备天然的载有外源配体分子的胞外体，另一种是制备重组的载有外源配体分子的胞外体。

本发明所提供的制备天然的载有外源配体分子的胞外体的方法，是将靶细胞在含有外源配体分子的培养基中培养4-12小时，收取培养混合物，离心除去细胞和细胞碎片，将得到的上清液进行滤径为0.2μM的过滤，将得到的滤液在60000g-100000g离心1-2小时，得到的沉淀即为载有外源配体分子的胞外体。

该方法中，60000g-100000g离心1-2小时得到的沉淀可用PBS缓冲液漂洗，得到纯化的载有外源配体分子的胞外体。

所述外源配体分子可为TCS；所述靶细胞可为K562细胞、JAR细胞；所述TCS和靶细胞的比例可为0.5-1×10⁷个细胞加入0.2-1μM TCS/8ml培养基。

本发明所提供的制备重组的载有外源配体分子的胞外体的方法，是先提取靶细胞分泌的胞外体，将胞外体在pH4.5-5.5的培养基中孵育30-50分钟，再向培养基中加入外源配体分子，再孵育2-6小时，60000g-100000g离心1-2小时，得到的沉淀即为载有外源配体分子的胞外体。

所述胞外体在由以下成分组成的培养基中孵育30-50分钟：pH5.0 RPMI 1640培养基，含有10mM Hepes，50mM NaAc，10％(质量百分含量)牛血清。

该方法中，60000g-100000g离心1-2小时得到的沉淀可用PBS缓冲液漂洗，得到纯化的载有外源配体分子的胞外体。

所述外源配体分子可为TCS；所述靶细胞可为K562细胞；所加入的天花粉蛋白的浓度可为0.5-2.0μM。

对TCS在JAR细胞和K562细胞中的作用机制的研究结果表明：1、被JAR细胞或K562细胞内吞的TCS分子可以大量地富集于MVB，并以毒素结合的胞外体(TCS-loaded exosome，TLE)形式分泌到细胞外。2、分泌的TLE可以在邻近的细胞间传递，这一传递是选择性的，JAR细胞和K562细胞产生的TLE都可以在同源细胞间传递；而JAR细胞和K562细胞间也可以进行异源TLE的交换，此外，K562细胞产生的TLE还可以与Hela细胞结合，但是不与293T细胞和SP2/0细胞结合。3、TLE可以将携带的TCS分子运送到靶细胞中，而后者对靶细胞发挥毒性作用，将其杀死。4、K562细胞分泌的TLE可以从TCS处理的肿瘤细胞的培养上清中分离纯化。5、分离纯化的TLE保持了对同源的K562细胞或异源的JAR细胞的选择性结合能力。6、纯化的TLE可以有效地将携带的TCS分子导入靶细胞的细胞质中，导致细胞的死亡。TLE对靶细胞的直接毒性是相同数量的自由TCS分子对靶细胞毒性的3-4倍。7、模拟细胞内MVB中的环境，将TCS与纯化的正常K562细胞衍生的胞外体在非细胞体系孵育，可以得到重组的TLE。重组的TLE具有与细胞分泌的TLE相似的性质。

上述研究结果表明细胞分泌的胞外体可以作为一种“天然”的载体，在同源或异源细胞间特异性地传递具有生物学活性的可溶性配体分子，并有效地将其导入靶细胞中，以发挥相应的细胞调节功效。对比于配体分子在细胞间的自由扩散，或者以人造脂质体为载体的运送方法，利用胞外体在细胞间传递可溶的活性分子具有多种优越性：

1.胞外体可以保护活性分子，防止其在传递过程中被环境中的酶类物质分解或破坏。

2.很多外源活性分子具有较强的免疫原性，可以引起过敏反应。以胞外体运载，活性分子不会直接游离在胞外环境中，可以避免与免疫系统的接触。

3.相对于人造脂质体，胞外体是由细胞自身分泌的“细胞器”，不会引起机体的排斥反应。

4.相对于脂质体，胞外体作为一种细胞器，具有更好的自身稳定性，以及在细胞间的流通性，不易受损。

5.胞外体对靶细胞的识别具有天然的特异性，可以定向地将活性分子运送到特定的细胞中，而对其他细胞没有伤害。

6.利用不同种类细胞产生的胞外体，可以制备不同“靶向”的转运载体。

7.胞外体作为一种膜包裹细胞器，可以高效地通过细胞膜屏障，将携带的活性分子运送到发挥生物学作用的靶位点。

8.载有活性分子的胞外体可以从细胞培养物中直接提取或者在体外重组得到，简单易行。

本发明的载有外源配体分子的胞外体可在同源或异源细胞间特异性传递外源的、具有生物活性的配体分子(外源的蛋白、毒素或药物分子)，将活性分子导入靶细胞。本发明的载有外源配体分子的胞外体可用于调节同源或异源靶细胞活性和制备药物(如治疗肿瘤的药物)。本发明的载有外源配体分子的胞外体在科学研究、药物制备以及疾病的治疗等领域中具有十分广泛的应用前景和开发价值。

附图说明

图1为胞外体的产生过程示意图

图2为TLE在JAR细胞中的动态产生过程

图3为TLE在K562细胞中的动态产生过程

图4A为JAR细胞中含有内吞的TCS分子的多囊体的免疫电镜照片

图4B为JAR细胞分泌TLE的免疫电镜照片

图5A为K562细胞中含有内吞的TCS分子的多囊体的免疫电镜照片

图5B为K562细胞分泌TLE的免疫电镜照片

图6为纯化的K562细胞分泌的TLE的荧光显微镜观察

图7为纯化的K562细胞分泌的TLE的免疫电镜观察

图8为K562细胞分泌的TLE的连续密度梯度离心分析

图9为K562细胞分泌的TLE的蛋白组成分析

图10为TCS分子在K562细胞分泌的TLE中的分布

图11为K562细胞分泌的TLE的胰酶消化分析

图12为重组TLE的Western blotting分析

图13为重组TLE的荧光显微镜照片

图14A和图14B为TCS在重组TLE中的分布

图15A为TLE介导TCS在JAR细胞的传递

图15B为TLE介导TCS在K562细胞的传递

图16为TTLE介导TCS在异源细胞间的传递

图17为TLE介导胞间分子传递的选择性

图18为重组的TLE与靶细胞的选择性结合

图19为TLE将携带的TCS分子导入靶细胞中

图20为TLE在靶细胞中的内吞和融合的电镜观察

图21为纯化的TLE对靶细胞的直接毒性

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。

实施例1、TCS处理的JAR细胞和K562细胞分泌天然的载有TCS的胞外体(TCS-loaded exosome，TLE)

1、FITC-TCS的制备

将TCS溶于100-500μl pH9.5，0.1M Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液，终浓度为2-10mg/ml；加入FITC(sigma公司)，使TCS与FITC的摩尔比1∶5-1∶10，混合均匀，在37℃孵育4-6小时或4℃孵育12-16小时；用2-4L PBS缓冲液透析除去游离的FITC，得到FITC-TCS。

2、荧光显微镜观察TLE的产生过程

向生长在RPMI-1640培养基中的JAR细胞或K562细胞中加入0.2μMFITC-TCS，在37℃孵育10min或30min，使FITC-TCS分子被细胞内吞。然后除去含有TCS的培养基，加入新鲜的培养基，将细胞在37℃继续孵育0-120min。结果如图2和图3所示，与靶细胞结合后，TCS可以被迅速地吸收到细胞边缘的初级内吞囊泡(图2A和图3A)，并进而运送到早期内吞体中(图2B和图3B)。在内吞60至90min后，大量的TCS分子累积到石榴样的MVB中。在那里，TCS分子充分结合到MVB的腔内膜结构上(图2C和图3C)。随着孵育时间的延长，TCS分子进一步向MVB的腔内膜囊泡聚集；同时，成熟的MVB移向细胞表面(图2D和图3D)。在120-150min左右，部分MVB与细胞质膜融合，将结合了TCS分子的腔内囊泡释放到胞外环境中，形成TLE(TCS-loaded exosome，TLE，载有TCS的胞外体)(图2E和图3E)。图2和图3中，10′、30′分别表示细胞与FITC-TCS共同孵育10min或30min；30′+30′、30′+60′、30′+90′、30′+120′分别表示细胞与FITC-TCS共同孵育30min后，加入新鲜培养基再继续孵育0分钟、30分钟、60分钟、90分钟、120分钟；左侧图片为荧光照片，右侧图片为荧光照片与微分干涉差照片叠加后的照片。

3、免疫电镜观察TLE的产生

将JAR和K562细胞与0.2μMTCS短暂孵育30min同前，所用基本培养基是RpMI 1640。除去含有TCS的培养基，加入新鲜的培养基，将细胞在37℃继续孵育60(图4A和图5A)或120min(图4B和图5B)。收集细胞，用PBS漂洗后，进行常规的电镜样品包埋操作。简要步骤为，将细胞依次用4％多聚甲醛、2.5％戊二醛、1％四氧化饿进行固定；然后依次用30％、40％、50％、70％、80％、90％、100％丙酮进行脱水处理，最后用环氧树脂Epon812包埋。包埋细胞样品进行超薄切片，得厚约70nm的切片，并捞于镀有formvar膜(聚乙烯醇缩甲醛膜)的镍网上。切片经双氧水刻蚀后，用兔抗TCS多克隆抗体(按常规方法制备，即以纯化TCS为抗原免疫兔子，得抗血清，经protein-G亲和纯化分离得到TCS的多克隆抗体)在37℃孵育4-6小时进行标记；样品经充分漂洗后与金标羊抗兔二抗(5nm胶体金，购于Jackson ImmunoResearch公司)孵育。将标记好的样品经充分漂洗后，用醋酸铀和柠檬酸铅染色，晾干后观察。对于TCS和flotillin双标样品，则切片先用羊抗flotillin多克隆抗体(购于Santa Cruz Biotechnology公司)在37℃孵育4-6小时进行标记；漂洗后用金标protein A(10nm胶体金，购于sigma公司)标记；然后再进行TCS的标记同上。

在电镜下，可以观察到TLE产生的细节过程。在TCS内吞60-90min后，可见相当数量的TCS分子结合在MVB腔中的30-100nm的小膜囊泡上。在这些小囊泡上还含有flotillin-一种常见的胞外体蛋白。当MVB与细胞质膜融合后，TCS以及flotillin分子随着MVB的腔内囊泡被释放到胞外(图4A，图4B，图5A和图5B)。图4A和图5A显示含有内吞的TCS分子的多囊体，TCS分子(5nm金颗粒免疫标记)和flotillin分子(10nm金颗粒免疫标记)结合在MVB的腔内膜囊泡上；图4B和图5B显示TLE的分泌过程，含有TCS的MVB与细胞质膜融合，将结合了TCS分子的腔内膜囊泡释放到胞外。图4A，图4B，图5A和图5B中的标尺为100nm。

实施例2、K562细胞分泌的TLE的分离纯化和鉴定

一、TLE的分离纯化

1.将2×10⁸个K562细胞置于新鲜的100ml RPMI-1640培养基中，加入0.2μMFITC-TCS(用于荧光显微镜检测)或TCS(用于其他检测)，在37℃孵育1h。然后，除去含有TCS的培养基，加入新鲜的RPMI 1640培养基，将细胞在37℃继续孵育2h。

2.将孵育后的培养混合物300g离心10min，除去细胞，取上清100ml。

3.上清依次进行3次离心，前两次800g离心15min，第三次10000g离心30min，除去细胞残片。

4.离心后上清经0.2μM滤膜过滤，超滤浓缩至20ml。

5.浓缩后上清经超速60000g-100000g离心2小时，得膜沉淀。

6.膜沉淀用PBS漂洗一次，用适量PBS(0.5-1ml)重新悬浮，即为TLE。

二、TLE的鉴定

将从FITC-TCS处理的细胞样品中纯化的TLE直接置于荧光显微镜下观察，可以发现TLE为载有大量FITC-TCS分子的小囊泡(图6)。左侧图片为荧光照片，右侧图片为微分干涉差照片，标尺为1μM。

将重悬的TLE滴于电镜用镍网上，进行免疫金标，方法同实施例1，即将样品用TCS，或flotillin，或tsg101的一抗标记，然后用金标的二抗或protein A标记。TCS的一抗按照实施例1的方法制备，flotillin和tsg101的抗体购于SantaCruz Biotechnology公司。标记后样品经醋酸铀负染，电镜观察。结果表明，离心得到的TLE为直径30-100nm的小膜囊泡，其上载有相当数量的TCS分子，并同时含有flotillin和tsg101-两种常见的胞外体蛋白(图7)。图7中，A为10nm金颗粒免疫标记flotillin(Flo)；B为10nm金颗粒免疫标记tsg101(Tsg)；C为5nm金颗粒和10nm金颗粒免疫双标记TCS和flotillin；D为5nm金颗粒和10nm金颗粒免疫双标记TCS和tsg101；标尺为100nm。

将分离得到的TLE进行连续蔗糖密度梯度离心，结果表明分泌的TLE主要分布于低浮力密度平衡区域，浮力密度在1.1-1.2g/ml的范围内，作为对照，游离的TCS分子具有较高的浮力密度，主要分布在梯度底部，对应的密度值约为1.3g/ml(图8)。

将分离得到的TLE和K562全细胞裂解液(Cell)进行12.5％SDS-PAGE和Western blotting。其中，Western blotting中所用的一抗分别为：TCS抗体，按照实施例1的方法制备；TfR，flotillin，tsg101，rab5，calnexin和rab6的抗体购于Santa Cruz Biotechnology公司。二抗为辣根过氧化物酶标记的抗体，购于北京中杉生物科技有限公司。结果如图9所示，表明分离的TLE与K562细胞裂解液(Cell)有不同的蛋白组成谱；TLE中除了载有大量的TCS分子，还含有多种胞外体特征性的分子，如上述的flotillin和tsg101以及transferrin receptor(TfR)和rab5，但是分离的TLE中不含有rab6和calnexin-分别存在于Golgi复合体和ER中的特异性marker分子，表明在纯化过程中较好地避免了细胞碎片及其他膜结构的污染(图9)。

将分离得到的TLE用0.1％Triton X-100室温孵育30min。60000-80000g离心1-2h分离通透后的上清(S)和膜组分(P)。将上清(S)和膜组分(P)进行12.5％SDS-PAGE和Western blotting，其中Western blotting中所用的一抗分别为：TCS的抗体，按照实施例1的方法制备；TfR，flotillin的抗体购于Santa Cruz Biotechnology公司，二抗均为辣根过氧化物酶标记的抗体，购于北京中杉生物科技有限公司。结果如图10所示，膜整合蛋白transferrin receptor(TfR)和flotillin都分布在通透后膜沉淀中，大部分TCS也结合在胞外体的膜上，而少量的TCS分子出现在通透后上清中，表明部分TCS位于胞外体的腔内。Non，未经通透的从TCS处理的K562细胞的培养上清中离心分离的膜沉淀。

将分离得到的TLE用1mg/ml胰酶在37℃进行消化，缓冲液为PBS缓冲液或者含有0.1％Triton X-100的PBS缓冲液，利用Western blotting检测消化不同时间后残余的TCS的数量，其中Western blotting中所用的一抗为TCS的抗体，按照实施例1的方法制备；二抗为辣根过氧化物酶标记的抗体，购于北京中杉生物科技有限公司。作为对照(Control)，将等量游离的TCS用1mg/ml胰酶在37℃进行同样消化处理，缓冲液为PBS缓冲液或者含有0.1％Triton X-100的PBS缓冲液。结果如图11所示，表明不管是否添加Triton X-100，游离的TCS都可以在15min内完全降解；而TLE携带的大部分TCS分子也可以在15min内降解，表明其暴露在TLE的表面。而少量TCS分子(大约占总量的1/10)，在消化60min后仍然残留，只有在0.1％Triton X-100将胞外体通透后，这部分TCS分子才能被消化降解，表明其位于TLE的腔内。Non，未经酶切处理的样品。

0.1％Triton X-100的通透实验和胰酶酶切实验表明大部分TCS分子结合在胞外体的膜表面，而少量TCS分子包裹在胞外体的腔中，处于这两种分布方式的TCS分子的数量比大约为9∶1。

实施例3、在非细胞体系重组TLE的制备和鉴定

模拟细胞内MVB中的环境，可以在非细胞体系中制备重组的TLE。具体操作如下：

1.正常K562细胞分泌的胞外体从12h细胞培养上清中提取，具体步骤如下：

(1)将2×10⁸K562细胞在RPMI-1640培养基中37℃培养12-24小时，培养混合物300g离心10min，除去细胞，取上清约100ml。

(2)上清依次进行3次离心，前两次800g离心15min，第三次10000g离心30min，除去细胞残片。

(3)离心后上清经0.2μM滤膜过滤，超滤浓缩至20ml，浓缩后上清经超速60000g-100000g离心2小时，得膜沉淀。膜沉淀用PBS漂洗一次，得到胞外体。

2.取纯化的K562胞外体，放置于pH5.0 RPMI-1640培养基(10mM Hepes，50mM NaAc，10％牛血清)，37℃孵育40min。

3.在上述胞外体中加入不同浓度(0.1、0.2、0.5或1μM)的TCS(或FITC-TCS，用于荧光显微镜检测)，37℃孵育4h。

4.100000g离心2h，得到胞外体沉淀(P)和上清液(S)。

5.将沉淀的胞外体用PBS漂洗一次。

将步骤4得到的上清液(S)和步骤5得到的胞外体沉淀(P)进行12.5％SDS-PAGE和Western blotting，其中Western blotting中所用的一抗为TCS的抗体，按照实施例1的方法制备；二抗为辣根过氧化物酶标记的抗体，购于北京中杉生物科技有限公司，结果如图12所示，在低浓度下，TCS与胞外体的结合非常微弱，当浓度提高到0.5μM或以上时，TCS分子可以充分地结合到胞外体上。

将FITC-TCS处理的胞外体置于荧光显微镜下观察，结果如图13所示，显示多数胞外体上结合了相当数量的FITC-TCS分子。图13中，标尺为1μM；左侧图片为微分干涉差(DIC)照片，中间图片为荧光照片，右侧图片为微分干涉差照片和荧光照片叠加后的照片。

Western blotting和荧光显微镜观察结果表明，当体相中TCS浓度高于0.5μM时，TCS分子可以充分地、自发地结合到正常的K562细胞胞外体上。

按照实施例2的方法对重组的TLE进行0.1％Triton X-100通透实验和胰酶消化实验和检测，表明在重组TLE中，TCS分子也分布在两个不同的位置：大部分分子结合在胞外体的膜表面，而少量分子包裹在胞外体的腔中，而且处于这两种分布的TCS的数量比也大约为9∶1，与细胞分泌的天然TLE非常类似(图14A和图14B)。图14A，重组TLE用0.1％Triton X-100进行通透处理同前，通透后离心分离上清(S1)和膜沉淀(P1)。Non为未经通透处理的重组TLE。图14B，重组TLE与1mg/ml胰酶在PBS(buffer)中，或含有0.1％Triton X-100的PBS中，37℃下消化60min，结果表明，大多数TCS分子分布于重组TLE的膜表面，而少量分子包裹在TLE的腔内；Non为未经酶切处理的重组TLE。

实施例4、TLE介导TCS在细胞间的传递

一、同源细胞间的传递

1.取A、B两组JAR细胞或K562细胞，A组中加入0.2μM FITC-TCS(制备方法同实施例1)，B组中加入0.2μM TRITC-TCS(制备方法同FITC-TCS，标记时将FITC换成TRITC)，在37℃孵育30min，所用的培养基是RPMI 1640。

2.除去含有TCS的培养基，加入新鲜的培养基，继续培养120min。

3.将细胞用预冷的PBS充分漂洗后，取等量的A、B两组细胞混合，在新鲜的RPMI 1640培养基中共同培养30-60min。

结果如图15A和图15B所示，表明分泌后的TLE可以在邻近的细胞间传递，导致分别来自A组和B组细胞的含有FITC-TCS的TLE和含有TRITC-TCS分子的TLE运送到同一细胞上(插图放大显示)。图15A和图15B中，长箭头示含有FITC-TCS的TLE，短箭头示含有TRITC-TCS的TLE，标尺为3μM，左侧图片为荧光照片，右侧图片为微分干涉差照片。

二、异源细胞间的传递

按照步骤一的操作，将FITC-TCS处理的JAR细胞和TRITC-TCS处理的K562细胞混合培养。结果如图16所示，表明JAR细胞分泌的携带FITC-TCS分子的TLE可以传递到K562细胞(下排)上；同时，K562细胞分泌的携带TRITC-TCS分子的TLE可以传递到JAR细胞(上排)上。图16中，长箭头示含有FITC-TCS的TLE(由JAR分泌)，短箭头示含有TRITC-TCS的TLE(由K562细胞分泌)，标尺为3μm，插图放大显示，左侧图片为荧光照片，右侧图片为微分干涉差照片。

三、TLE在细胞间传递的选择性

按照步骤一的操作，将同样数量的FITC-TCS处理的K562细胞分别与JAR细胞、Hela细胞、293T细胞和sp2/0细胞共同孵育。结果如图17所示，表明K562细胞分泌的TLE可以有效地传递到JAR细胞上，也能部分地传递到Hela细胞上，但是与293T细胞和sp2/0细胞则没有明显的相互作用。图17中，标尺为3μm，上排图片为荧光照片，下排图片为微分干涉差照片。

实施例5、分离纯化的天然TLE以及体外重组的TLE保持与靶细胞的选择性结合能力

按照实施例2中的操作，从FITC-TCS处理的K562细胞的培养上清中分离纯化得到天然的含有FITC-TCS的TLE。将等量纯化的TLE分别加到K562细胞、JAR细胞、293T细胞或sp2/0细胞中，在RPMI-1640培养基中，37℃孵育10-30min。结果如图19所示，表明TLE可以选择性地结合到同源的K562细胞或者异源的JAR细胞表面(图19A和D)，但是与293T和sp2/0细胞没有明显的相互作用。

同样地，按照实施例3中的操作，在体外制备重组的含有FITC-TCS的TLE，并将其与上述细胞共同孵育，得到类似的结果。重组的TLE选择性地结合到K562细胞和JAR细胞表面，而不与293T和sp2/0细胞结合(图18)。图18中，第一排图片为荧光照片，第二排图片为微分干涉差照片，标尺为3μm。

实施例6、TLE有效地将携带的TCS分子导入靶细胞中

按照实施例2中的操作，从FITC-TCS处理的K562细胞的培养上清中分离纯化得到天然的含有FITC-TCS的TLE。将分离纯化TLE加入到K562细胞或JAR细胞中，在37℃孵育10min，使TLE与靶细胞结合，所用的培养基是RPMI-1640。将未与细胞结合的TLE除去，加入新鲜的培养基，将细胞在37℃继续培养60-120min。细胞样品用荧光显微镜观察(图19)或制备超薄切片及进行免疫金标(如实施例1中方法)用电镜观察(图20)

结果表明TLE可以迅速结合到细胞表面，并被捕捉到内吞凹陷中(图19A和D，图20A和D)。经过60min的孵育，大量结合的TLE被靶细胞吸收到胞内，出现在靠近细胞核的内吞细胞器中(图19B和E，图20B和E)。内吞的TLE可以与细胞器的限制膜发生融合，将携带的TCS分子释放到靶细胞的细胞质中(图20C和E，箭头)。在孵育大概120min后，几乎全部内吞的TLE都与靶细胞发生融合，此时在细胞中仅能观察到微量残余的TLE(图19C和F)。从TLE中释放出的TCS分子可以扩散到细胞质的各个部位，尤其是靠近细胞核的位置，那里分布着粗面内质网，上面结合着大量的核糖体-TCS攻击的靶位点。

图19中，10′、10′+60′、10′+120′分别表示细胞与TLE共同孵育10min后，加入新鲜培养基后继续孵育0分钟、60分钟、120分钟的照片；第一排和第三排图片为荧光照片，第二排和第四排图片为荧光照片与微分干涉差照片叠加后的照片，图片A-C为JAR细胞，图片D-F为K562细胞，标尺为3μm，Nu为细胞核。

图20中，A-C为JAR细胞，D-E为K562细胞，标尺，200nm，Nu为细胞核，PM为细胞质膜。TLE与靶细胞结合后，被吸收到内吞凹陷中(A和D)，随后，TLE被内吞到邻近细胞核的细胞器中(B和E)，内吞的TLE可以与细胞器的限制膜融合，将携带的TCS分子释放到靶细胞的细胞质中(C和E，箭头)。

TLE将携带的TCS分子导入靶细胞的细胞质的效率可以通过其对靶细胞的直接杀伤性来衡量，因为当TCS分子进入细胞质后，可以攻击核糖体而导致靶细胞的死亡。按照实施例2中方法，从TCS处理的K562细胞的培养上清中分离纯化TLE。将载有85ng TCS的纯化TLE与JAR细胞和K562细胞共同孵育48h，可以导致约19％的JAR细胞死亡，以及约16％的K562细胞死亡。其细胞毒性与675ng的游离TCS分子相当(作用48h可以导致大约22％JAR细胞死亡，18％K562细胞死亡)。相比之下，85ng的游离TCS的细胞毒性仅为TLE的1/3-1/4左右(图21)。这一结果也充分证明了TLE可以有效地把携带的TCS分子运送到靶细胞的细胞质中。

Claims (10)

1、载有外源配体分子的胞外体，由外源配体分子和胞外体组成；所述外源配体分子结合在胞外体的膜表面，或者包裹在胞外体的腔内，或者在两个位置都存在；

所述外源配体分子是非靶细胞自身合成的蛋白或分子，可以直接作用于靶细胞或被靶细胞通过内吞作用吸收。

2、根据权利要求1所述的载有外源配体分子的胞外体，其特征在于：所述外源配体分子为外源的蛋白、毒素或药物分子；所述靶细胞为合体滋胚层细胞、肿瘤细胞或病毒侵染的免疫相关细胞。

3、根据权利要求1或2所述的载有外源配体分子的胞外体，其特征在于：所述外源配体分子为天花粉蛋白。

4、根据权利要求2所述的载有外源配体分子的胞外体，其特征在于：所述肿瘤细胞为人子宫绒毛癌上皮细胞、白血病细胞或黑素瘤细胞。

5、根据权利要求2所述的载有外源配体分子的胞外体，其特征在于：所述免疫相关细胞为淋巴细胞，造血干细胞，单核细胞或吞噬细胞。

6、一种制备权利要求1所述的载有外源配体分子的胞外体的方法，是将靶细胞在含有外源配体分子的培养基中培养4-12小时，收取培养混合物，离心除去细胞和细胞碎片，将得到的上清液进行滤径为0.2μM的过滤，将得到的滤液在60000g-100000g离心1-2小时，得到的沉淀即为载有外源配体分子的胞外体。

7、根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述外源配体分子为天花粉蛋白；所述靶细胞为K562细胞或JAR细胞；所述天花粉蛋白和靶细胞的比例为0.5-1×10⁷个细胞0.2-1μM天花粉蛋白/8ml培养基。

8、一种制备权利要求1所述的载有外源配体分子的胞外体的方法，是先提取靶细胞分泌的胞外体，将胞外体在pH4.5-5.5的培养基中孵育30-50分钟，再向培养基中加入外源配体分子，再孵育2-6小时，60000g-100000g离心1-2小时，得到的沉淀即为载有外源配体分子的胞外体。

9、根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述外源配体分子为天花粉蛋白；所述靶细胞为K562细胞或JAR细胞；所加入的天花粉蛋白的浓度为0.5-2.0μM。

10、权利要求1所述的载有外源配体分子的胞外体在调节同源或异源靶细胞活性和在制备药物中的应用。

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