CN108148809A - 一种从肿瘤细胞上清液中分离外泌体的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从肿瘤细胞上清液中分离外泌体的方法，包括如下步骤：当肿瘤细胞生长汇合率达85％‑95％时，收集培养基，获取细胞培养上清液，进行膜过滤后，收集滤液再将滤液超滤离心，收集离心超滤液，按超滤液体积1∶1比例加入10w/v％‑12w/v％聚乙‑醇溶液，并充分混匀后4℃离心，最后所得沉淀即为外泌体。本发明取材方便，易于富集扩增培养；分离过程中采用膜过滤、超滤离心和加入聚乙二醇溶液等手段有效增加外泌体富集，耗时短，成本低。

Description

一种从肿瘤细胞上清液中分离外泌体的方法

技术领域

本发明涉及一种用于从生物流体中分离外泌体的方法，具体涉及一种从肿瘤细胞上清液中分离外泌体的方法。

背景技术

外泌体(exosomes)是一种由多种细胞所分泌的、直径为30-140nm的亚细胞囊泡结构，电子显微镜下呈球状或杯状。其源于细胞内的早期胞内体(early endosome)，胞内体向内出芽形成多囊泡胞内体(multivesicular endosome，MVE)，后者与细胞膜融合从而将小囊泡释放到细胞外，形成外泌体。外泌体的组分分析表明，外泌体中包含大量的蛋白质、核酸和脂质等，其中一部分是所有外泌体所共有的普遍性组分，其余则是因外泌体来源组织不同而特有的组分。无论是哪种成分，在外泌体介导的细胞间物质、信息交流的过程中均起到关键作用。研究发现，外泌体内含有与细胞来源相关的蛋白质、RNA和microRNA，并且外泌体能够通过生物屏障，在细胞间传递功能性核酸分子，从而发挥各种生物学功能，如肿瘤细胞源外泌体可通过多种途径参与肿瘤微环境中肿瘤细胞与肿瘤微环境之间相互作用，进而促进肿瘤细胞的生长和转移。故外泌体有望成为一种新型给药途径及基因治疗载体。

肿瘤是目前仅次于心脑血管疾病而影响人类健康的一大杀手，局部的浸润和远距离的转移是恶性肿瘤最重要的特点，并且这也是肿瘤致人死亡的主要原因。大量研究发现，与正常细胞相比，肿瘤细胞释放更多的外泌体来调节肿瘤微环境，逃避免疫系统的杀伤，增强肿瘤细胞的耐药性。近年来，随着对外泌体功能研究的深入，在肿瘤来源的外泌体中发现了一系列在促进肿瘤的浸润和转移过程中起到了关键作用的蛋白质和miRNAs。同时，这一发现也为开发肿瘤诊断与治疗的新方法提供了重要的理论基础。

目前，外泌体的提取主要采用超高速梯度离心法、密度梯度超速离心法、超速离心-免疫磁珠亲和法、以及试剂盒离心柱方法等。超高速离心法采用超高速离心机，价格昂贵，通常采用不低于100,000×g离心5-8h，对耗材的要求高，而且耗时很长。免疫磁珠亲和法可以对提取的外泌体进行特异性标记的纯化，但是由于目前对于不同来源的外泌体的标记蛋白还不明确，所以获得的外泌体产量远低于超速离心的产量，并往往需要多种标记的免疫磁珠进行提取，提高了试剂成本。试剂盒离心柱通常只适用于较小量外泌体的获得，并且成本昂贵。因此，分离得到质量可靠和高富集度的外泌体仍是该研究领域目前的一项重大挑战。

发明内容

本发明的目的在于提供一种更高效、简易、价廉的外泌体提取方法，从而克服绝大多数研究者因实验条件限制而无法提取获得量质俱佳外泌体的状况，该发明能够从肿瘤细胞上清液中获得高纯度、高产量的外泌体，对外泌体在科学研究和临床检测中的推广发挥重要的作用。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种从肿瘤细胞上清液中分离外泌体的方法，包括以下步骤：

S1：用完全培养基培养肿瘤细胞，当细胞生长密度达到50％-90％时，换用无外泌体血清的培养基，培养24h-48h后，收集细胞上清液，0℃-4℃条件下，依次500-1000×g和1500-2500×g各离心15min以去除细胞或细胞碎片，收集上清液；

S2：将所得的上清液用无菌过滤器过滤，收集滤液，在0℃-4℃条件下，将所得滤液2000-4000×g离心15min，收集上清液；

S3：将步骤S2得到的上清液转移至超滤离心管，在0℃-4℃条件下，3000-5000×g离心30min，收集超滤液；

S4：向步骤S3得到的超滤液内按与超滤液体积1∶1的比例加入5w/v％-20w/v％聚乙二醇溶液，上下颠倒离心管，混匀，4℃孵育过夜；

S5：将孵育后的液体在室温或4℃，1500×g离心30min，离心管底部可见米白色沉淀；去除上清，1500×g继续离心5min，去除上层的液体，得到的沉淀即为外泌体。

优选地，所述无菌过滤器的规格为0.22μm或0.45μm。

优选地，所述步骤S3中的超滤离心管的规格为10KD、30KD或100KD。

优选地，所述步骤S4中孵育的时间不少于12h。

本发明具有以下有益效果：

本发明通过综合运用膜过滤法、超滤离心管等方法，简化整个制备工艺，缩短了制取时间，大幅度提高外泌体的获取量，进而有效降低制取成本，便于推广应用。

附图说明

图1为本发明实施例中胶质瘤U251细胞源外泌体的粒径检测示意图；

图中：分布系数(PDI)，根据累积距法得到的分布系数是一个无量纲的值，代表粒子尺寸的分布)：0.08～0.7代表适中分散度体系，是运算法则最佳适用范围。

图2为本发明实施例中胶质瘤U251细胞源外泌体流式细胞仪表面抗原CD63和CD81表达。

图3为本发明实施例中胶质瘤U251细胞源外泌体中蛋白浓度检测。

图4为本发明实施例中胶质瘤U251细胞源外泌体中蛋白的考马斯亮蓝染色结果。

图5为本发明实施例中胶质瘤U251细胞源外泌体中蛋白免疫印迹图。

具体实施方式

为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

人胶质瘤U251细胞上清液外泌体的分离和提取

步骤1、将人胶质瘤细胞U251(购自中国Cyagen公司)培养于75cm²的4个培养瓶中，并加入含10％胎牛血清、100U/ml青霉素及0.1mg/ml链霉素的DMEM/F12培养基，在37℃、5％CO₂培养箱内培养，待细胞生长密度达到60％～70％时，吸去原有的细胞上清液，加入含10％无外泌体的胎牛血清培养基，每瓶15mL培养基，培养48h后获取细胞上清液50mL，然后在4℃条件下依次800×g和2000×g离心15min后，得到上清液a；

步骤2、将上清液a用0.22μm(Millex-GP，Millipore)无菌过滤器过滤，收集滤液，然后4℃，3000×g离心15min以去除细胞或细胞碎片，得到上清液b；

步骤3、将上清液b转移至超滤离心管(30KD，Millipore Amicon Ultra 15))中，在4℃，4000×g，离心使浓缩液体积至800-1000μL，吸取超滤液c，按照体积1∶1比例，向超滤液c中加入10w/v％-12w/v％聚乙二醇的溶液(溶解于PBS中)，上下颠倒离心管，混匀，4℃孵育过夜(至少12h)。孵育过夜时保持离心管直立。

步骤4、将孵育后滤液c在室温或4℃，1500×g离心30min，离心管底部可见米白色沉淀；吸去上清，1500×g继续离心5min，小心去除上层的液体组分，得到的沉淀即为外泌体。将提取的外泌体沉淀直接冻存于-80℃的冰箱中，在短时间内以备后续的外泌体鉴定和其它实验。

实施例2

人胶质瘤U251细胞源外泌体的粒径分析和标志物鉴定

1)外泌体粒径检测：经上述方法分离得到外泌体沉淀使用1mL经过滤PBS复溶外泌体，密封冰上保存；选择一次性干净的样品池，对光使用无尘纸擦拭确保光路上无颗粒附着外管壁；缓慢注入外泌体溶液避免气泡，可适度倾斜样品池，使用盖子将样品池封住；将样品池放入仪器，按照标准操作规程操作仪器检测；按照仪器操作规程上机检测：ZETASIZERNano series-Nano-ZS，检测外泌体的粒径。

检测结果如图1和表1所示，使用ZETASIZER Nano series-Nano-ZS仪器分析样品1，得到的平均粒径以及粒径主峰均在Exosome的粒径范围内，检测得到的粒子分布系数(PDI)在0.08-0.7之间，证明体系分散度适中，检测结果置信度高。样品的粒径分布其中20nm-200nm范围占60％左右，与Exosome的粒径分布吻合。

表1

检测指标	结果
		平均粒径(nm)	20.3
分布系数(PDI)	0.356
		粒径主峰(nm)	30.24
粒径20nm-200nm百分比(％)	59

2)外泌体流式细胞仪表面标记物检测：经上述方法分离得到外泌体沉淀，使用100ul经过滤PBS复匀外泌体，密封冰上保存；加入20μL BD荧光直标抗体(CD63或CD81)孵育；样品2分别使用不染色Exosome的作为阴性对照，标记为NC；样品2分别进行CD63和CD81两组抗体染色，标记为CD63和CD81；按照仪器操作规程上机检测：BD accuri C6 flowcytomenter。

检测结果如图2和表2所示，使用BD accuri C6 flow cytomenter仪器分析样品2中CD63和CD81两个特异性抗体的表达情况，得到的经染色后Exosome均呈阳性，阳性率在60-80％之间。同一样品两个抗体检测阳性率略有不同，可能与抗体的特异性结合能力或者两个抗原的分布有关。

表2

分组	阴性比例(％)	阳性比例(％)
			阴性对照	97.7	2.3
CD63	39.8	60.2
			CD81	14.7	85.3

实施例3

人胶质瘤U251细胞源外泌体蛋白含量和外泌体特异性蛋白CD9、HSP70和Tsg101的表达情况检测

将实施例1得到的外泌体沉淀用1mL的高效RIPA裂解液充分冻融裂解，提取总蛋白。

根据Bradfod蛋白浓度测定的方法，制作BSA标准曲线，加入待测蛋白样品，加入285μL的考马斯亮蓝溶液，在酶标仪上检测吸光度(OD值)，并计算蛋白含量。

在电压80-100V进行60-90min的电泳。电泳至溴酚蓝刚跑出即可终止电泳，后进行考马斯亮蓝蛋白染色和转膜。

转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的TBST洗涤液中，漂洗5min，以洗去膜上的电转液。后加入封闭液，在摇床上缓慢摇动，室温封闭60min。

封闭结束后，立即加入稀释好的一抗(CD9，HSP70，Tsg101)。4℃缓慢摇动孵育过夜后，回收一抗，TBST洗涤液洗涤3次，每次15min。

按照适当比例用二抗稀释液稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗，室温或4℃在摇床上缓慢摇动孵育60min，TBST洗涤液洗涤3次，每次15min。

膜上蛋白面加入ECL发光液进行显影。

检测结果如图3和表3所示，按上述方法50mL细胞上清液分离得到外泌体中蛋白浓度可达到1.8μg/μL，考马斯亮蓝染色显示蛋白条带在不同的分子量分布均匀，随着浓度的增加，条带的颜色逐渐加深，Western Blot检测显示，所分离的外泌体可表达标志性蛋白分子CD9、HSP70和Tsg101，且随着浓度的增加，蛋白的表达量逐渐上调。

表3

外泌体蛋白	结果
		OD值	0.12
浓度(μg/μL)	1.8

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种从肿瘤细胞上清液中分离外泌体的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：用完全培养基培养肿瘤细胞，当细胞生长密度达到50％-90％时，换用无外泌体血清的培养基，培养24h-48h后，收集细胞上清液，0℃-4℃条件下，依次500-1000×g和1500-2500×g各离心15min以去除细胞或细胞碎片，收集上清液；

S2：将所得的上清液用无菌过滤器过滤，收集滤液，在0℃-4℃条件下，将所得滤液2000-4000×g离心15min，收集上清液；

S3：将步骤S2得到的上清液转移至超滤离心管，在0℃-4℃条件下，3000-5000×g离心30min，收集超滤液；

S4：向步骤S3得到的超滤液内按与超滤液体积1∶1的比例加入5w/v％-20w/v％聚乙二醇溶液，上下颠倒离心管，混匀，4℃孵育过夜；

S5：将孵育后的液体在室温或4℃，1500×g离心30min，离心管底部可见米白色沉淀；去除上清，1500×g继续离心5min，去除上层的液体，得到的沉淀即为外泌体。

2.如权利要求1所述的一种从肿瘤细胞上清液中分离外泌体的方法，其特征在于，所述无菌过滤器的规格为0.22μm或0.45μm。

3.如权利要求1所述的一种从肿瘤细胞上清液中分离外泌体的方法，其特征在于，所述步骤S3中的超滤离心管的规格为10KD、30KD或100KD。

4.如权利要求1所述的一种从肿瘤细胞上清液中分离外泌体的方法，其特征在于，所述步骤S4中孵育的时间不少于12h。