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CN1314951A - 生产葡糖胺的方法和原料 - Google Patents

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CN1314951A CN99810087A CN99810087A CN1314951A CN 1314951 A CN1314951 A CN 1314951A CN 99810087 A CN99810087 A CN 99810087A CN 99810087 A CN99810087 A CN 99810087A CN 1314951 A CN1314951 A CN 1314951A
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Abstract

本发明涉及通过发酵遗传修饰的微生物生产葡糖胺的方法和材料。本发明包括用于本发明生产葡糖胺之方法的遗传修饰的微生物,以及重组核酸分子和由所述重组核酸分子产生的蛋白质。

Description

生产葡糖胺的方法和原料
发明领域
本发明涉及通过发酵生产葡糖胺的方法。本发明还涉及用遗传工程方法修饰的用于生产葡糖胺的微生物菌株。
发明背景
氨基糖通常是作为复合寡糖和多糖中的单体残基。葡糖胺是这种单糖，葡萄糖的氨基衍生物。葡糖胺和其他氨基糖是许多天然多糖的重要组成部分。例如，含氨基糖的多糖可形成细胞的结构物质，类似于结构蛋白。
葡糖胺被制成营养品用于治疗动物和人的骨关节炎。葡糖胺的市场日益增大。此外，葡糖胺的世界市场价格不会显著降低。
目前通过酸水解几丁质，一种衍生于N-乙酰-D-葡糖胺的复杂碳水化合物获得葡糖胺。或者，通过酸水解各种乙酰化的壳聚糖生产葡糖胺。运些方法产率低(底物到葡糖胺的转化率为50％)。此外，原料(即几丁质源，例如蟹壳)日益缺乏。因此，为了商业销售和使用的目的，工业上需要一种成本合算的用于高产率生产葡糖胺的方法。
发明简述
本发明的一个实施方案涉及通过微生物发酵生产葡糖胺的方法。该方法包括以下步骤：(a)在发酵培养基中培养氨基糖代谢途径中有遗传修饰的微生物；(b)回收从培养步骤产生的选自葡糖胺-6-磷酸和葡糖胺的产物。这类氨基糖代谢途径选自将葡糖胺-6-磷酸转变成另一种化合物的途径、用于合成葡糖胺-6-磷酸的途径、将葡糖胺或葡糖胺-6-磷酸转运出所述微生物的途径、将葡糖胺转运到所述微生物中的途径以及与葡糖胺-6-磷酸生产有关的底物竞争的途径。发酵培养基包括可吸收的碳、氮和磷源。在优选的实施方案中，所述微生物是细菌或酵母，更优选埃希菌属的细菌，最佳为大肠杆菌。
在一个实施方案中，通过从微生物中回收细胞内葡糖胺-6-磷酸和/或从发酵培养基中回收细胞外葡糖胺可回收产物。在另一实施方案中，回收步骤可包括从发酵培养基中纯化葡糖胺，从微生物中分离葡糖胺-6-磷酸和/或将葡糖胺-6-磷酸去磷酸化以产生葡糖胺。在一实施方案中，回收至少约1g/L产物。
在另一实施方案中，培养步骤包括将培养基中的碳源保持在约0.5％-约5％的浓度。在另一实施方案中，培养步骤在约28℃-约37℃完成。在另一实施方案中，培养步骤是在发酵罐中完成。
在本发明的一个实施方案中，所述微生物在其编码蛋白质的基因中有修饰，所述蛋白质包括但不限于N-乙酰-葡糖胺-6-磷酸脱乙酰酶、葡糖胺-6-磷酸脱氨基酶、N-乙酰-葡糖胺-特异性酶ⅡNag、葡糖胺-6-磷酸合酶、磷酸葡糖胺变位酶、葡糖胺-1-磷酸乙酰转移酶-N-乙酰葡糖胺-1-磷酸尿苷酰转移酶、磷酸果糖激酶、PEP：葡萄糖PTS的酶ⅡGlc、PEP：甘露糖PTS的EIIM,P/ⅢMan和/或磷酸酶。
在另一实施方案中，遗传修饰包括其中提高微生物中的葡糖胺-6-磷酸合酶的作用的遗传修饰。所述遗传修饰包括用编码葡糖胺-6-磷酸合酶的重组核酸分子转化所述微生物以提高所述微生物的葡糖胺-6-磷酸合酶的作用和/或使所述微生物过量表达葡糖胺-6-磷酸合酶。在一个实施方案中，将所述重组核酸分子与转录控制序列有效相连。在另一实施方案中，将所述重组核酸分子整合到所述微生物的基因组中。在另一实施方案中，编码葡糖胺-6-磷酸合酶的所述重组核酸分子含有可提高所述合酶之作用的遗传修饰。所述遗传修饰例如可降低葡糖胺-6-磷酸合酶的葡糖胺-6-磷酸产物抑制作用。
在一实施方案中，含有编码葡糖胺-6-磷酸合酶之核酸序列的本发明重组核酸分子编码氨基酸序列SEQ ID NO:16。在另一实施方案中，所述重组核酸分子含有选自SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15的核酸序列。优选的本发明重组核酸分子包括pKLN23-28、nglmS-282184和nglmS-281830。
本发明还包括编码葡糖胺-6-磷酸合酶并含有可提高葡糖胺-6-磷酸合酶作用之遗传修饰的重组核酸分子(即葡糖胺-6-磷酸合酶同系物)。所述遗传修饰可例如降低所述合酶的葡糖胺-6-磷酸产物抑制作用。在一个实施方案中，在编码葡糖胺-6-磷酸合酶的本发明重组核酸分子中的所述遗传修饰产生至少一个氨基酸修饰，其选自增加、取代、缺失和/或衍生葡糖胺-6-磷酸合酶的一个氨基酸残基。在一个实施方案中，所述氨基酸修饰是在修饰的蛋白质(即同系物)中的氨基酸序列位置上，对应于氨基酸序列SEQ ID NO:16的下列一个或多个位置：Ile(4)、Ile(272)、Ser(450)、Ala(39)、Arg(250)、Gly(472)、Leu(469)。在另一实施方案中，所述氨基酸修饰选自下列氨基酸的取代：(a)有一个脂肪族羟基侧基团的氨基酸残基取代Ile(4)；(b)有一个脂肪族羟基侧基团的氨基酸残基取代Ile(272)；(c)有一个脂肪族侧基团的氨基酸残基取代Ser(450)；(d)有一个脂肪族羟基侧基团的氨基酸残基取代Ala(39)；(e)带有含硫例基团的氨基酸残基取代Arg(250)；(f)有一个脂肪族羟基侧基团的氨基酸残基取代Gly(472)；(g)有一个脂肪族侧基团的氨基酸残基取代Leu(469)；以及(h)(a)-(g)的组合。
在本发明的另一实施方案中，上述氨基酸修饰优选是选自下列的取代：Ile(4)变为Thr、Ile(272)变为Thr、Ser(450)变为Pro、Ala(39)变为Thr、Arg(250)变为Cys、Gly(472)变为Ser、Leu(469)变为Pro以及其组合。
在另一实施方案中，本发明的遗传修饰的重组核酸分子含有编码葡糖胺-6-磷酸合酶的核酸序列，所述合酶含有选自SEQ ID NO:19、SEQ IDNO:22、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:31的氨基酸序列。在另一实施方案中，本发明的遗传修饰的重组核酸分子含有选自SEQ IDNO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30的核酸序列。本发明优选的遗传修饰的重组核酸分子包括pKLN23-49、pKLN23-54、pKLN23-124、pKLN23-149、pKLN23-151、nglmS-492184、nglmS-491830、nglmS-542184、nglmS-541830、nglmS-1242184、nglmS-1241830、nglmS-1492184、nglmS-1491830、nglmS-1512184和nglmS-1511830。
本发明的另一实施方案涉及具有葡糖胺-6-磷酸合酶作用的葡糖胺-6-磷酸合酶，所述合酶由具有遗传修饰的核酸序列编码，所述修饰导致葡糖胺-6-磷酸作用的提高。所述核酸序列是上述本发明的重组核酸分子。
本发明的另一实施方案涉及通过发酵生产葡糖胺的方法，所述方法包括：(a)在含可吸收的碳、氮和磷源的发酵培养基中培养具有提高的葡糖胺-6-磷酸合酶作用的遗传修饰的微生物，其中所述遗传修饰的微生物是通过含下列步骤的方法产生的：(1)在含编码葡糖胺-6-磷酸合酶的分离的核酸分子中产生修饰以产生多个修饰的核酸序列；(2)用所述修饰的核酸序列转化微生物以产生遗传修饰的微生物；(3)就葡糖胺-6-磷酸合酶作用筛选经遗传修饰的微生物；(4)筛选具有提高的葡糖胺-6-磷酸合酶作用的遗传修饰的微生物；(b)回收产物。培养步骤从所述微生物中产生选自葡糖胺-6-磷酸和葡糖胺的产物。
在另一实施方案中，本发明微生物在编码N-乙酰-葡糖胺-6-磷酸脱乙酰酶、葡糖胺-6-磷酸脱氨基酶、N-乙酰-葡糖胺-特异性酶ⅡNag、磷酸葡糖胺变位酶、葡糖胺-1-磷酸乙酰转移酶-N-乙酰葡糖胺-1-磷酸尿苷酰转移酶、磷酸果糖激酶、PEP：葡萄糖PTS的酶ⅡGlc、和/或PEP：甘露糖PTS的EIIM,P/ⅢMan的基因中还有遗传修饰，其中所述修饰减弱了所述蛋白质的作用。在另一实施方案中，本发明的微生物在编码磷酸酶的基因中还有遗传修饰，其中所述修饰提高了所述磷酸酶的作用。在优选的实施方案中，本发明的微生物在编码下列蛋白质的基因中还有遗传修饰：N-乙酰-葡糖胺-6-磷酸脱乙酰酶、葡糖胺-6-磷酸脱氨基酶和N-乙酰-葡糖胺-特异性酶ⅡNag，所述修饰包括但不限于缺失至少所述基因的一部分。
本发明的另一实施方案涉及通过发酵生产葡糖胺的方法，所述方法包括步骤(a)在含可吸收的碳、氮和磷源的发酵培养基中培养用编码葡糖胺-6-磷酸合酶的重组核酸分子转化的大肠杆菌以生产产物，(b)回收产物。所述产物包括从大肠杆菌中回收的细胞内葡糖胺-6-磷酸和/或从发酵培养基中回收的细胞外葡糖胺。在本实施方案中，所述重组核酸分子提高了大肠杆菌对葡糖胺-6-磷酸合酶的表达，而且所述重组核酸分子与转录控制序列有效相连。在一个实施方案中，所述重组核酸分子含有可降低葡糖胺-6-磷酸合酶的葡糖胺-6-磷酸产物抑制作用的遗传修饰。在另一实施方案中，所述大肠杆菌在选自下列的至少一个基因中还有遗传修饰：nagA、nagB、nagC、nagD、nagE、manXYZ、glmM、pfkB、pfkA、glmU、glmS、ptsG和/或磷酸酶基因。在另一实施方案中，其他修饰包括nagA、nagB、nagC、nagD、nagE的缺失和manXYZ中的突变，其中所述修饰导致N-乙酰-葡糖胺-6-磷酸脱乙酰酶、葡糖胺-6-磷酸脱氨基酶和N-乙酰-葡糖胺-特异性酶ⅡNag的酶活性降低。
本发明的另一实施方案涉及通过生物合成方法生产葡糖胺的微生物。用编码葡糖胺-6-磷酸合酶的重组核酸分子转化所述微生物，其中将所述重组核酸分子与转录控制序列有效相连。所述重组核酸分子还含有可提高葡糖胺-6-磷酸合酶之作用的遗传修饰。所述重组核酸分子的表达提高了微生物对葡糖胺的生产。在优选的实施方案中，将所述重组核酸分子整合到所述微生物的基因组中。在另一实施方案中，所述微生物在编码选自下列的蛋白质的基因中至少还有一个遗传修饰：N-乙酰-葡糖胺-6-磷酸脱乙酰酶、葡糖胺-6-磷酸脱氨基酶、N-乙酰-葡糖胺-特异性酶ⅡNag、磷酸葡糖胺变位酶、葡糖胺-1-磷酸乙酰转移酶-N-乙酰葡糖胺-1-磷酸尿苷酰转移酶、磷酸果糖激酶、PEP：葡萄糖PTS的酶ⅡGlc、和/或PEP：甘露糖PTS的EIIM,P/ⅢMan，其中所述修饰减弱了所述蛋白质的作用。在另一实施方案中，本发明的微生物在编码磷酸酶的基因中还有遗传修饰，其中所述修饰提高了所述磷酸酶的作用。在另一实施方案中，所述微生物在编码下列蛋白质的基因中还有遗传修饰：N-乙酰-葡糖胺-6-磷酸脱乙酰酶、葡糖胺-6-磷酸脱氨基酶和N-乙酰-葡糖胺-特异性酶ⅡNag，其中所述遗传修饰降低了所述蛋白质的酶活性。在优选的实施方案中，所述遗传修饰是缺失所述基因的至少一部分。
在另一实施方案中，所述微生物是大肠杆菌，其在选自nagA、nagB、nagC、nagD、nagE、manXYZ、glmM、pfkB、pfkA、glmU、ptsGg基因和/或磷酸酶基因的基因中有修饰。在一实施方案中，所述大肠杆菌缺失了nag调节子基因，在另一实施方案中，所述大肠杆菌缺失了nag调节子基因并在manXYZ基因中有遗传修饰以便由manXYZ基因编码的所述蛋白质具有降低的作用。
本发明的另一实施方案是上述微生物，当在含14g/L K2HPO4、16g/LKH2PO4、1g/L二水合柠檬酸钠、5g/L(NH4)2SO4、20g/L葡萄糖、10mM MgSO4、lmM CaCl2和约0.2-约1mM IPTG的pH7.0的发酵培养基中，在约28℃-约37℃培养约10-60小时达到细胞干重至少约8g/L的细胞密度时，所述微生物产生至少约1g/L葡糖胺。
本发明的另一实施方案是用于通过生物合成方法生产葡糖胺的微生物，所述微生物含有(a)与转录控制序列有效相连的编码葡糖胺-6-磷酸合酶的重组核酸分子；(b)在编码选自下列蛋白质的基因中至少一个遗传修饰：N-乙酰-葡糖胺-6-磷酸脱乙酰酶、葡糖胺-6-磷酸脱氨基酶、N-乙酰-葡糖胺-特异性酶ⅡNag、磷酸葡糖胺变位酶、葡糖胺-1-磷酸乙酰转移酶-N-乙酰葡糖胺-1-磷酸尿苷酰转移酶、磷酸果糖激酶、PEP：葡萄糖PTS的酶ⅡGlc、和/或PEP：甘露糖PTS的EIIM,P/ⅢMan，其中所述修饰减弱了所述蛋白质的作用。在另一实施方案中，所述微生物在编码磷酸酶的基因中还有至少一个遗传修饰，其中所述修饰提高了所述磷酸酶的作用。所述重组核酸分子的表达提高了所述微生物中葡糖胺-6-磷酸合酶的作用。在另一实施方案中，所述重组核酸分子被整合到所述微生物的基因组中。
附图简述
图1是大肠杆菌中葡糖胺和N-乙酰-葡糖胺及其磷酸化衍生物的生物合成和分解代谢途径的示意图。
图2是对大肠杆菌中与葡糖胺过量生产中氨基糖代谢途径有关的途径的修饰示意图。
图3是含manXYZ、ptsG和△nag突变组合的大肠杆菌菌株的生产示意图。
图4说明向培养基中加入额外的葡萄糖和硫酸铵对葡糖胺积累的作用的线性图。
图5说明通过葡糖胺-6-磷酸和葡糖胺抑制葡糖胺-6-磷酸合酶的线性图。
图6是说明在突变体glmS克隆中，葡糖胺-6-磷酸合酶的产物抑制活性的线性图。
图7是说明构建含突变glmS基因的大肠杆菌菌株的策略示意图。
图8说明在含整合的突变glmS基因的大肠杆菌菌株中，葡糖胺-6-磷酸合酶的产物抑制作用的线性图。
图9说明在含整合的突变glmS基因的突变大肠杆菌菌株中，葡糖胺生产的线性图。
图10说明在生产葡糖胺的菌株中，葡糖胺-6-磷酸合酶的抑制作用的线性图。
图11A说明在45℃，生产葡糖胺的菌株中葡糖胺-6-磷酸合酶热稳定性的线性图。
图11B说明在50℃，生产葡糖胺的菌株中葡糖胺-6-磷酸合酶热稳定性的线性图。
图12说明IPTG浓度对葡糖胺生产的影响的线性图。
图13说明IPTG浓度和温度对葡糖胺生产的影响的线性图。
图14A是说明30℃时葡糖胺生产菌株2123-54的生长和葡糖胺生产情况线性图。
图14B说明37℃时葡糖胺生产菌株2123-54的生长和葡糖胺生产情况线性图。
图15A是说明30℃时葡糖胺生产菌株2123-49的葡糖胺生产的线性图。
图15B是说明30℃时葡糖胺生产菌株2123-124的葡糖胺生产的线性图。
图16A是说明37℃时在葡萄糖限量的发酵罐中葡糖胺生产菌株的葡糖胺生产情况线性图。
图16B是说明30℃时在葡萄糖限量的发酵罐中葡糖胺生产菌株的葡糖胺生产情况线性图。
图16C是说明30℃时在葡萄糖过量的发酵罐中葡糖胺生产菌株的葡糖胺生产情况线性图。
发明详述
本发明涉及生产葡糖胺的生物合成方法。所述方法包括发酵遗传工程修饰的微生物以生产葡糖胺。本发明还涉及用于生产葡糖胺的遗传工程修饰的微生物，例如大肠杆菌菌株。文中所用术语葡糖胺和N-葡糖胺可以交换使用。同样，术语葡糖胺-6-磷酸和N-葡糖胺-6-磷酸也可以交换使用。还可将葡糖胺缩写为GlcN，将葡糖胺-6-磷酸缩写为GlcN-6-P。
本发明通过发酵生产葡糖胺的新方法不昂贵，而且葡糖胺的产率超过目前每成本通过水解方法生产葡糖胺的产率。另外，通过使用本文所述的遗传工程方法修饰的微生物，很容易对本发明方法进行改变以便根据葡糖胺的生产适用于特定的问题或者变化的要求。
N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)和葡糖胺(GlcN)等氨基糖是微生物中非常重要的分子，因为它们是主要大分子，具体地讲，是糖结合物(即含共价寡糖链的大分子)生物合成的前体。例如，在大肠杆菌中，N-乙酰葡糖胺和葡糖胺是两种细胞膜大分子，肽聚糖和脂多糖的前体。阻断肽聚糖或脂多糖之生物合成的突变是致死的，会导致丧失细胞膜的完整性并最终导致细胞溶解。
本发明的一个实施方案涉及通过微生物发酵生产葡糖胺的方法。该方法包括步骤(a)在发酵培养基中培养在氨基糖代谢途径具有遗传修饰的微生物，所述代谢途径包括：将葡糖胺-6-磷酸转变成另一种化合物的途径、合成葡糖胺-6-磷酸的途径、将葡糖胺或葡糖胺-6-磷酸运输到所述微生物外的途径、将葡糖胺运输到所述微生物内的途径以及与葡糖胺-6-磷酸生成竞争底物的途径，以由所述微生物生成包括细胞内葡糖胺-6-磷酸和/或细胞外葡糖胺的产物；及(b)通过从所述微生物中回收细胞内葡糖胺-6-磷酸和/或从发酵培养基中回收细胞外葡糖胺来回收产物。发酵培养基包含可吸收的碳、氮和磷源。
本发明的另一实施方案涉及通过发酵生产葡糖胺的方法。所述方法包括步骤(a)在含可吸收的碳、氮和磷源的发酵培养基中培养用重组核酸分子转化的大肠杆菌，所述核酸分子编码葡糖胺-6-磷酸并与转录控制序列有效相连；(b)回收选自葡糖胺-6-磷酸和葡糖胺的产物。所述重组核酸分子可提高大肠杆菌葡糖胺-6-磷酸合酶的表达。在另一实施方案中，所述重组核酸分子含有降低葡糖胺-6-磷酸合酶的葡糖胺-6-磷酸产物抑制作用的遗传修饰。在另一实施方案中，所述大肠杆菌还至少有一个选自nagA、nagB、nagC、nagD、nagE、manXYZ、glmM、pfkB、pfkA、glmU、glmS、ptsG基因和/或磷酸酶基因的遗传修饰。
为了通过本发明的发酵方法以显著高的产率生产葡糖胺，对微生物进行遗传修饰以提高葡糖胺的生产。如文中所述，遗传修饰的微生物例如大肠杆菌含有从其正常(即野生型或天然)形式修饰(即突变或改变的)的基因组。利用经典菌株开发和/或分子遗传学技术可以完成微生物的遗传修饰。所述技术通常公开于例如Sambrook等，1989，分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)冷泉港实验室出版社。Sambrook等的文献全文引入本文作为参考。另外，在实施例节详细描述了用于遗传修饰微生物的技术。遗传修饰的微生物可包括天然遗传变体以及其中以所述修饰可在所述微生物内提供所需作用的方式已对核酸分子进行插入、缺失或修饰(即突变；例如通过核苷酸的插入、缺失、取代和/或倒置)的微生物。根据本发明，遗传修饰的微生物包括已用重组技术修饰过的微生物。如文中所用，可将导致基因表达、基因功能或基因产物(即由该基因编码的蛋白质)之功能降低的遗传修饰称为基因的失活(完全的或部分的)、缺失、断裂、阻断或下调。例如，导致基因编码之蛋白质功能降低的基因中的遗传修饰可能是下列原因的结果：所述基因完全缺失(即该基因不存在，因此所述蛋白质不存在)、导致蛋白质不完整或不翻译(例如蛋白质不表达)的基因中的突变、或者降低或消除了所述蛋白质的天然功能(例如被表达的蛋白质的酶活性或作用降低或没有活性或作用)的基因突变。可将导致基因表达或功能增强的遗传修饰称为基因的扩增、过量生产、过量表达、激活、提高、增加或上调。
在本发明的一个实施方案中，微生物的遗传修饰提高或降低了与本发明氨基糖代谢途径有关的蛋白质的作用。所述遗传修饰包括任何类型的修饰，具体包括通过重组技术和经典诱变产生的修饰。例如，在一实施方案中，本发明的微生物含有提高葡糖胺-6-磷酸合酶作用的遗传修饰。应注意本文所讨论的葡糖胺-6-磷酸合酶及其他酶作用(或活性)的提高指导致下列结果的所述微生物中的任何遗传修饰：所述酶功能提高并包括所述酶的较高活性(例如比活性或体内酶活性)、所述酶的抑制作用降低或所述酶的降解以及所述酶的过量表达。例如可增加基因拷贝数、利用比天然启动子有更高表达水平的启动子可以提高表达水平或者通过遗传工程方法或经典诱变可改变基因以提高所述酶的作用。在实施例节中描述了已经经过遗传修饰提高了葡糖胺-6-磷酸合酶之作用的编码葡糖胺-6-磷酸合酶的核酸分子的实例。同样，本文所讨论的酶作用的降低指可导致下列结果的任何遗传修饰：酶功能降低并包括酶活性(例如比活性)降低、酶的抑制作用增强或者降解增加以及所述酶表达的减少或消除。例如通过阻断或减少所述酶的生产、降低酶活性或者抑制所述酶的活性可以降低本发明酶的作用。酶生产的阻断或减少包括将编码所述酶的基因放在启动子的控制下，所述启动子需要在生长培养基中含有诱导化合物。通过确定条件从所述培养基中除去所述诱导剂，可以关闭编码所述酶之基因的表达(并因此，关闭酶合成)。酶活性的阻断或降低还可包括利用与美国专利4,743,546所述相似的切割技术，该专利引入本文作为参考。为了利用该方法，将编码目的酶的基因克隆在可使得特异性地有控制地从基因组中切割所述基因的特异性遗传序列间。例如按美国专利4,743,546所述通过培养温度的改变或者通过一些其他物理或营养信号可以促进切割。
氨基糖是糖的一种氨基衍生物(例如氨基代替了羟基的糖)。根据本发明，氨基糖代谢途径是与氨基糖的生物合成、合成代谢或分解代谢有关或影响其生物合成、合成代谢或分解代谢的任何生物化学途径。本文所用氨基糖代谢途径包括与氨基糖和其前体运输入或出细胞有关的途径，还可包括竞争氨基糖生物合成或分解代谢有关的底物的生物化学途径。例如，最早形成的氨基糖之一的中间前体是果糖-6-磷酸(F-6-P)，其在与谷氨酰胺(Gln，氨基供体)的生物化学反应中形成葡糖胺-6-磷酸。果糖-6-磷酸还是糖酵解途径的中间产物。因此，通过底物果糖-6-磷酸的竞争，糖酵解途径与葡糖胺-6-磷酸生物合成途径竞争。另外，通过一系列的生物化学反应可将葡糖胺-6-磷酸转变成其它氨基糖并形成各种大分子的组分。因此，果糖-6-磷酸/葡糖胺-6-磷酸途径、果糖-6-磷酸糖酵解途径在其影响葡糖胺-6-磷酸之生物合成的程度上，以及葡糖胺-6-磷酸/大分子生物合成途径均被认为是本发明的氨基糖代谢途径。
总之，带有遗传修饰的氨基糖代谢途径的微生物含有至少一个上述遗传修饰，与同样条件下培养的野生型微生物相比，所述修饰导致上述一个或多个氨基糖代谢途径的改变。氨基糖代谢途径中的这类修饰改变了所述微生物生产氨基糖的能力。根据本发明，遗传修饰的微生物与同样条件培养的野生型微生物相比优选其具有提高的生产葡糖胺的能力。通常可将影响葡糖胺生产的氨基糖代谢途径划归至少下列途径之一：(a)将葡糖胺-6-磷酸转变成其它化合物的途径，(b)合成葡糖胺-6-磷酸的途径，(c)将葡糖胺运输到细胞中的途径，(d)将葡糖胺或葡糖胺-6-磷酸运输出细胞的途径以及(e)与生产葡糖胺-6-磷酸竞争底物的途径。
用于本发明方法的遗传修饰的微生物通常具有至少一种修饰的至少与一种氨基糖代谢途径有关的基因，所述修饰导致(a)将葡糖胺-6-磷酸转变成其他化合物的能力降低(即葡糖胺-6-磷酸分解代谢或合成代谢途径的抑制作用)，(b)生产(即合成)葡糖胺-6-磷酸的能力提高，(c)将葡糖胺运输进细胞的能力降低，(d)将葡糖胺-6-磷酸或葡糖胺运输出细胞的能力提高和/或(e)使用与葡糖胺-6-磷酸生产有关的底物进行竞争性生物化学反应的能力降低。
应理解，本发明公开了在发酵过程中利用具有生产商业有用量葡糖胺之能力的微生物的方法(即优选与在相同条件下培养的野生型微生物相比生产葡糖胺的能力提高)。通过遗传修饰编码与氨基糖代谢途径有关之蛋白质的一个或多个基因而完成所述方法，所述遗传修饰导致生成(表达)与相应的野生型蛋白质相比具有改变的(例如提高或降低的)功能的蛋白质。所述改变的功能提高了遗传修饰的微生物生成葡糖胺的能力。本领域技术人员应理解生产经如实施例所述特异性筛选技术所得含本文特定之功能改变的遗传修饰微生物可产生许多符合特定功能要求的生物，但需经各种遗传修饰。例如，在指定核酸序列中的不同的随机核苷酸缺失和/或取代均可产生相同的表型(例如由所述序列编码之蛋白质作用的减弱)。本发明设想了可产生具有本文所述特征之微生物的任何这类遗传修饰。
对于不同微生物来说，已阐明了许多氨基糖代谢途径。具体地讲，已阐明了大肠杆菌中葡糖胺和N乙酰葡糖胺及其磷酸化衍生物的生物合成和分解代谢途径。这些途径包括利用这些氨基糖为碳源的多运输系统。已克隆并测序了大肠杆菌中编码直接与氨基糖之运输、分解代谢和生物合成有关的酶和蛋白质的基因。另外，已分离了在氨基糖代谢几乎每一步阻断的大肠杆菌的各突变株。图1说明了大肠杆菌氨基糖代谢的已知途径。
如下文将详细讨论的，尽管已阐明了与氨基糖代谢途径有关的许多途径和基因，但直到本发明为止，并不知道在许多可能的遗传修饰中究竟哪一种对于产生可生产商业显著量葡糖胺之微生物是必需的。确实，本发明人首次设计并生产出具有远大于任何已知野生型或突变微生物之葡糖胺生成能力的葡糖胺-生成微生物。本发明人还首次认识到所述遗传修饰的微生物可用于生产商业用葡糖胺的方法。
用于本发明发酵方法的微生物优选是细菌或酵母。更优选所述微生物是埃希菌属的细菌。大肠杆菌是用于本发明发酵方法的最佳微生物。特别优选的大肠杆菌菌株包括K-12、B和W，最佳为K-12。尽管大肠杆菌是最佳的，但应理解生成葡糖胺的并可经遗传修饰以提高葡糖胺生成的任何微生物均可用于本发明方法。还可将用于本发明发酵方法的微生物称为生产微生物。
下文将描述作为本发明具体实施方案的大肠杆菌的氨基糖代谢途径。应理解，其他微生物，具体地讲，其他细菌具有类似的氨基糖代谢途径以及在所述途径内具有类似结构和功能的基因和蛋白质。因此，下丈有关大肠杆菌的原理也适用于其他微生物。
在本发明的一个实施方案中，遗传修饰的微生物包括合成葡糖胺-6-磷酸的能力提高的微生物。根据本发明，“合成产物的能力提高”指在涉及产物合成的氨基糖代谢途径中的任何提高或上调以致与相同条件下培养的野生型微生物相比，本发明微生物生成产物的数量增加。在本发明的一实施方案中，微生物合成葡糖胺-6-磷酸能力的提高是通过增加葡糖胺-6-磷酸合酶基因的表达而完成的，在大肠杆菌中，该基因是glmS基因，其产物是葡糖胺-6-磷酸合酶。葡糖胺-6-磷酸合酶催化其中果糖-6-磷酸和谷氨酰胺形成葡糖胺-6-磷酸和谷氨酸的反应。在大肠杆菌中，例如通过导入编码glmS基因的重组核酸分子可增加葡糖胺-6-磷酸合酶的表达。
glmS的过量表达对于葡糖胺-6-磷酸的细胞内积累并最终生成葡糖胺是很重要的，因为细胞内葡糖胺-6-磷酸合酶的水平将控制碳流出糖酵解途径和进入葡糖胺-6-磷酸合成途径。glmS基因位于大肠杆菌染色体上的84min,该染色体区的序列分析表明glmS与glmU基因位于同一操纵子内，glmS编码双功能酶，葡糖胺-1-磷酸乙酰转移酶-N-乙酰葡糖胺-1-磷酸尿苷酰转移酶。葡糖胺-1-磷酸乙酰转移酶-N-乙酰葡糖胺-1-磷酸尿苷酰转移酶在通过一系列生物化学反应将葡糖胺-6-磷酸掺入大分子的氨基糖代谢途径中发挥功能。在glmS上游未检测到明显的启动子；glmUS操纵子的转录是从glmU上游的两个启动子序列开始的。因此，优选将glmS基因克隆在人工启动子的控制下。所述启动子可以是任何可在生产生物体中提供保持足够水平的葡糖胺-6-磷酸合酶所需之glmS表达水平的启动子。优选的启动子是组成型(而不是诱导型)启动子，因此而不需要加入昂贵的诱导剂。所述启动子包括已通过遗传修饰，例如较弱的突变阻遏基因的应用而成为功能组分或“渗漏”的正常可诱导型启动子系统。可与glmS一起使用的特别优选的启动子是lac,λPL和T7。根据最大产物形成量的要求可以改变glmS基因的量(拷贝数)。在一实施方案中，将重组glmS基因整合到大肠杆菌染色体中。
因此，本发明的一个实施方案是提供用含有编码葡糖胺-6-磷酸合酶之核酸序列的重组核酸分子转化的微生物，例如大肠杆菌，此时葡糖胺-6-磷酸是由glmS基因编码的。含所述核酸序列的优选重组核酸分子包括含编码葡糖胺-6-磷酸合酶之核酸序列的重组核酸分子，所述葡糖胺-6-磷酸合酶含有氨基酸序列SEQ ID NO:16。本发明其他优选的重组核酸分子包括含有选自SEQID NO:13、SEQ ID NO:14和/或SEQ ID NO:15之核酸序列的核酸分子。本发明特别优选的重组核酸分子包括含有核酸分子nglmS-282184和/或nglmS-281830的核酸分子。称为pKLM23-28的一个本发明的重组分子包括SEQ ID NO:13、14和15，且对于在微生物中表达葡糖胺-6-磷酸合酶是特别有用的。上述鉴定的核酸分子代表了含编码葡糖胺-6-磷酸合酶蛋白质之野生型(即天然或内源)核酸序列的核酸分子。本发明还包括含编码葡糖胺-6-磷酸合酶同系物(即修饰的和/或突变的)之核酸序列的遗传修饰的核酸分子，下文将详细描述。
报道的大肠杆菌果糖-6-磷酸合酶对果糖-6-磷酸和谷氨酰胺的Km分别是2mM和0.4mM。这些值相对较高(即该酶对其底物的亲和性相当弱)。因此，本发明的另一实施方案是提供葡糖胺-6-磷酸合酶与其底物的亲和性提高的微生物。可通过任何适宜的遗传修饰或蛋白质工程方法生产与其底物亲和性提高的葡糖胺-6-磷酸合酶。例如，可以用以计算机为基础的蛋白质工程设计具有较高稳定性和较好底物亲和性的葡糖胺-6-磷酸合酶。参见例如Maulik等，1997，分子生物技术：治疗应用与策略(Molecular Biotechnology:Therapeutic Applications and Strategies)；Wiley-Liss,Inc.，已全文引入本文作为参考。
White(1968，生物化学杂志(Biochem.J.)106:847-858)首次表明葡糖胺-6-磷酸合酶是由葡糖胺-6-磷酸抑制的。本发明确定这种抑制作用是限制葡糖胺在本发明设计的商业用葡糖胺生产菌株中积累的关键因素。因此，本发明的另一实施方案提供了具有减弱的葡糖胺-6-磷酸产物反馈抑制作用之葡糖胺-6-磷酸合酶的微生物。具有减弱的产物抑制作用的葡糖胺-6-磷酸合酶可以是突变的(即遗传修饰的)葡糖胺-6-磷酸合酶基因，例如可以通过任何适宜的遗传修饰方法产生。例如通过插入、缺失和/或取代核苷酸的方法，例如通过易错PCR可修饰编码葡糖胺-6-磷酸合酶的重组核酸分子。用该方法，在导致高频率掺入错误的条件下通过用于扩增的DNA聚合酶扩增所述基因。结果，在PCR产物中得到高频突变。在实施例5中将详细描述该方法。然后通过检测突变基因使被测微生物与携带非突变的重组葡糖胺-6-磷酸合酶核酸分子的微生物进行比较具有提高的葡糖胺生产能力，可筛选具有减弱的产物抑制作用的葡糖胺-6-磷酸合酶基因突变株。应注意，葡糖胺-6-磷酸合酶的产物抑制作用降低通常会导致葡糖胺-6-磷酸合酶的作用提高，甚至当与天然葡糖胺-6-磷酸酶相比，该酶的比活性仍相同或实际上降低时也会如此。因此，本发明的一个实施方案是生产具有提高的作用和提高的体内酶活性的遗传修饰的葡糖胺-6-磷酸合酶，遗传修饰的所述酶与天然葡糖胺-6-磷酸合酶相比具有未改变的或者甚至降低的比活性。本发明还包括遗传修饰的具有提高的比活性的葡糖胺-6-磷酸合酶。
因此，本发明的一个实施方案用遗传修饰的重组核酸分子转化的微生物，例如大肠杆菌，所述核酸分子含有编码突变葡糖胺-6-磷酸合酶蛋白或葡糖胺-6-磷酸合酶同系物的核酸序列。本文将这类葡糖胺-6-磷酸合酶蛋白也称为葡糖胺-6-磷酸合酶同系物。下丈将详细描述蛋白质同系物。含这类核酸序列的优选重组核酸分子包括含有编码葡糖胺-6-磷酸合酶之核酸序列的重组核酸分子，所述酶含有选自下列的氨基酸序列：SEQ ID NO:19、SEQ IDNO:22、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:28和/或SEQ ID NO:31。其他优选的重组核酸分子含有选自下列的核酸序列：SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ IDNO:29和/或SEQ ID NO:30。可用于本发明的特别优选的遗传修饰的重组核酸分子包括含选自下列之核酸分子的核酸分子：nglmS-492184、nglmS-491830,nglmS-542184、nglmS-541830、nglmS-1242184、nglmS-1241830、nglmS-1492184、nglmS-1491830、nglmS-1512184和nglmS-1511830。质粒pKLN23-49、pKLN23-54、PKLN23-124、pKLN23-149和pKLN23-151是本发明的重组核酸分子，它们对于在微生物中表达本发明葡糖胺-6-磷酸合酶同系物是特别有用的。
在细胞内有足够的谷氨酰胺(Gln)对于葡糖胺-6-磷酸合酶反应是很重要的。检查葡糖胺-6-磷酸的合成和降解途径表明存在潜在的无效循环，借助该循环果糖-6-磷酸和葡糖胺-6-磷酸的连续互变会导致谷氨酰胺的不经济消耗。在本发明的一个实施方案中，通过对生产生物体进行遗传修饰以提高细胞内的谷氨酰胺生产，或者通过修饰发酵培养基(即向发酵培养基中加入谷氨酰胺)可以提高谷氨酰胺的供应以确保谷氨酰胺的供应不会限制葡糖胺-6-磷酸的生产。
在本发明的另一实施方案中，所述潜在的果糖-6-磷酸和葡糖胺-6-磷酸无效循环是通过抑制或阻断葡糖胺-6-磷酸转变成果糖-6-磷酸的逆向反应而实现的。在该实施方案中，遗传修饰微生物以便其催化该转变的基因，葡糖胺-6-磷酸脱氨酶失活或缺失，在大肠杆菌中该基因是nagB基因。nagB基因是数个nag基因中的-种，这些nag基因是nag调节子的一部分。与葡糖胺和N-乙酰-葡糖胺降解有关的nag基因作为调节子存在于大肠杆菌染色体上的15min。在另一实施方案中，使完整的nag调节子失活或缺失。下文将详细讨论缺失全部nag调节子的优点。
如上所讨论，葡糖胺-6-磷酸合酶的过量生产导致果糖-6-磷酸合成转成葡糖胺-6-磷酸合成。但是，许多其他酶可以争夺底物果糖-6-磷酸。因此，本发明的一个实施方案包括其中阻断这些竞争性副反应的微生物。在优选的实施方案中，提供了含有完全或部分失活的编码磷酸果糖激酶之基因的微生物。糖酵解途径的第二步通过磷酸果糖激酶将果糖-6-磷酸转变成果糖-1,6-二磷酸，在大肠杆菌中，磷酸果糖激酶作为由pfkA或pfkB编码的两种同工酶存在。pfkA或pfkB基因的完全或部分失活会降低果糖-6-磷酸进入糖酵解途径的速度，并促进果糖-6-磷酸转变成葡糖胺-6-磷酸。丈中所用基因的失活指对导致所述基因之活性(即表达或功能)降低的基因的任何修饰，包括活性的减弱或活性的完全缺失。
在本发明的另一实施方案中，遗传修饰的微生物将葡糖胺-6-磷酸转变成其他化合物的能力降低。如上所述，葡糖胺-6-磷酸脱氨酶的失活代表一种所述修饰，但是，葡糖胺-6-磷酸是其他生物化学反应的底物。导致大分子例如大肠杆菌脂多糖和肽聚糖产生之途径中的第一步是通过磷酸葡糖胺变位酶将葡糖胺-6-磷酸变为葡糖胺-1-磷酸，在大肠杆菌中，所述变位酶是glmM基因的产物。最近通过克隆glmM基因确定了脂多糖和肽聚糖的生物合成有该酶活性的参与。结果，尚未详细研究出glmM基因的调节，其天然产物，磷酸葡糖胺变位酶。但是已表明磷酸葡糖胺变位酶与所研究的所有其他磷酸己糖变位酶一样均是通过磷酸化调节的。这种酶水平的调节通常对该途径末端产物的水平极为敏感。因此，通过磷酸葡糖胺变位酶的碳流可能是自我调节的，并且不是葡糖胺-6-磷酸积累的问题。glmM基因序列是已知的，但是，本发明优选的实施方案是提供其中磷酸葡糖胺变位酶编码基因被中断或缺失的微生物。更优选，将编码磷酸葡糖胺变位酶的基因通过突变下调，但不是完全失活，以便不会完全阻断重要细胞膜组分的生物合成。
导致葡糖胺-6-磷酸转变成另一化合物的另一途径是由N-乙酰葡糖胺-6-磷酸脱乙酰酶催化的。N-乙酰葡糖胺-6-磷酸脱乙酰酶能够催化葡糖胺-6-磷酸(加乙酰CoA)转变成N-乙酰-葡糖胺-6-磷酸的逆反应。这可能导致葡糖胺-6-磷酸和N-乙酰-葡糖胺-6-磷酸的无效循环并导致产生由葡糖胺和N-乙酰-葡糖胺组成的混合物。因此，本发明的另一实施方案是提供其中编码N-乙酰-葡糖胺-6-磷酸脱乙酰酶的基因，在大肠杆菌中是nagA基因失活的遗传修饰的微生物。
本发明的另一实施方案是使微生物中葡糖胺的运输系统失活以便细胞一旦分泌出葡糖胺后，不会再摄入。这种修饰有助于避免对细胞有毒的高水平的细胞内葡糖胺，并促进产物的回收，因为产物仍在细胞外。在本发明优选的实施方案中，将葡糖胺的运输系统失活以便微生物一旦产生葡糖胺后，将葡糖胺保持在所述微生物外。在大肠杆菌在仅以葡糖胺为碳源生长的过程中，通过PEP：甘露糖磷酸转移酶(PTS)系统将葡糖胺运输到细胞内，该系统不仅能够将葡糖胺运输到细胞内，而且是由葡糖胺诱导的。因此，本发明的一个实施方案是提供没有将葡糖胺运输到细胞内之能力的微生物。例如，manXYZ突变株(即编码PEP：甘露糖PTS之EIIM,P/ⅢMan的基因缺乏或有突变的大肠杆菌)不能通过该机制将葡糖胺运输到细胞内。另一方面，大肠杆菌的PEP：葡萄糖PTS能够将葡萄糖和葡糖胺运输到细胞内，但是葡糖胺不能诱导该系统。因此，为了使manXYZ突变株在葡糖胺上生长，必须使细胞先在葡萄糖上生长以诱导(可替换的)葡萄糖运输系统的表达并允许葡萄糖(优选的碳源)运输到细胞内。然后这些被诱导的细胞能够经葡萄糖转运蛋白将葡糖胺运输到细胞内。类似的情况存在于经PEP：果糖PTS运输葡糖胺，尽管在这种情况下，通过酶ⅡFru运输的葡糖胺很少。下文讨论抑制这些二级葡糖胺运输途径的方法。本发明的另一实施方案是提供PEP：葡萄糖PTS(上述)功能降低的微生物。所述修饰对于避免来自培养基的葡糖胺再吸收可能是必需的。例如，ptsG突变株(即编码PEP：葡萄糖PTS之酶ⅡGlc的基因缺乏或有突变)。由于所述微生物利用葡萄糖作为碳源的生长能力降低，因此，可对所述生物体进行进一步地遗传修饰以便通过与PEP：葡萄糖PTS无关的机制摄入葡萄糖。例如已表明可筛选PEP：葡萄糖PTS缺陷型突变微生物，所述微生物仍有在葡萄糖上生长的能力(Flores等，1996，天然生物技术(NatureBiotechnology)14:620-623)。
大肠杆菌nag调节子的DNA测序表明nagE基因位于所述调节子的一个臂上并由所述调节子另一臂上的其它nag基因(nagBACD)转录，它编码PEP：糖磷酸转移酶(PTS)系统中的N-乙酰-葡糖胺-特异性酶ⅡNag蛋白，该酶与葡糖胺运输到细胞内有关。因此，导致大肠杆菌运输葡糖胺至细胞内之能力降低的另一遗传修饰是nagE基因的失活或缺失，或者编码用于本发明方法的任何微生物中类似酶之基因的失活或缺失。
如上所述，在本发明的一个实施方案中，用于本发明方法的遗传修饰大肠杆菌的整个nag调节子已缺失。完整染色体nag调节子的缺失是优选的，因为将同时使许多不利于葡糖胺-6-磷酸产生的基因失活。上文已详细讨论了nagA、nagB和nagE基因。nagC基因编码一调节蛋白，该蛋白是nag调节子的阻遏物并且既是glmUS操纵子的激活剂，也是glmUS操纵子的的阻遏物。上文详细讨论了glm基因。nagD基因的功能是未知的，但由于其位于nag调节子内，因此认为其也与氨基糖代谢有关。因此，在大肠杆菌中，nag调节子的全部缺失避免了在用于过量生产葡糖胺的大肠杆菌菌株中，初始细胞内产物(葡糖胺-6-磷酸)的分解代谢。优选的具有nag调节子缺失的大肠杆菌突变株是具有ΔnagEBACD∷tc缺失/插入的大肠杆菌。
就glmUS操纵子的失活(nagC的功能)而言，尽管编码葡糖胺-6-磷酸合酶的glmS基因的失活为所需，但是glmU基因产物，葡糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶-N-乙酰葡糖胺-1-磷酸尿苷酰转移酶水平的增加对于葡糖胺-6-磷酸的积累可能不利，因为它可能导致碳源流向细胞膜组分。因此，本发明的一个实施方案是使本发明方法所用微生物的葡糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶-N-乙酰葡糖胺-1-磷酸尿苷酰转移酶失活。在其中glmUS操纵子或其等同物已被失活或缺失的微生物中，本发明的另一实施方案是通过重组方法在所述微生物中产生位于人工启动子控制下的编码葡糖胺-6-磷酸合酶之基因，从而遗传修饰所述微生物。
在本文所述之遗传修饰微生物中的初始细胞内产物是葡糖胺-6-磷酸。在许多微生物，包括大肠杆菌中，葡糖胺-6-磷酸通常在运输出细胞前去磷酸化成为葡糖胺。然而，本发明的另一实施方案是提供经遗传修饰具有将葡糖胺-6-磷酸转变成葡糖胺的相应磷酸酶活性的微生物。这类磷酸酶包括但不限于，例如碱性磷酸酶。在优选的实施方案中，这类大肠杆菌具有增强的(即提高的)磷酸酶活性(即磷酸酶作用)。
如上所述，在本发明生产葡糖胺的方法中，在用于生产葡糖胺的发酵培养基中培养具有遗传修饰的氨基糖代谢途径的微生物。适宜的或有效的发酵培养基指当被培养时，本发明遗传修饰的微生物能够产生葡糖胺的任何培养基。所述培养基通常是含有可吸收的碳、氮和磷源的含水培养基。所述培养基还可包括适宜的盐、矿物质、金属和其他营养成份。本文所述的对微生物之遗传修饰的一项优点是尽管所述遗传修饰显著地改变了氨基糖的代谢，但是对于生产生物体并没有任何营养需求。因此，优选用以葡萄糖为唯一碳源的基本-盐培养基作为发酵培养基。用于葡糖胺发酵的基本-盐-葡萄糖培养基还有利于葡糖胺产物的回收和纯化。
还可在常规发酵生物反应器中培养本发明的微生物。可通过任何发酵方法培养所述微生物，所述方法包括但不限于分批培养、补料分批培养、细胞再循环以及连续发酵。优选，通过分批培养或补料分批培养发酵方法培养本发明微生物。
在本发明的一个实施方案中，接种前，使发酵培养基达到理想温度，通常约20-约40℃，优选约25℃-约40℃，约28℃-约37℃，在一些实施方案中，约30℃-约37℃是最佳的。本发明人发现受控于T7-lac启动子(参见实施例节)的核酸分子所转染的本发明微生物于30℃培养时停止生长但继续生产葡糖胺，于37℃时生长和葡糖胺生产并存。37℃生长比30℃稍微好些，但是30℃时的葡糖胺生产显著好于37℃。应注意本发明微生物的生长和葡糖胺生产的最佳温度可随各种因素而改变。例如，用于微生物中重组核酸分子表达的特定启动子的筛选可能会影响最佳培养温度。本领域技术人员很容易用标准技术，例如实施例节中所述的用于本发明微生物的技术确定本发明任何微生物的最佳生长和葡糖胺生产温度。
用经过合理的生长期足以产生高细胞密度量的遗传修饰的微生物的活跃生长培养物接种培养基。使细胞生长至至少约10g/l的细胞密度，优选约10g/l-约40g/l，更优选至少约40g/l。该过程通常需要约10-60小时。
在发酵过程中须将足够的氧加到培养基中以便在开始的细胞生长中保持细胞生长并保持代谢和葡糖胺生产。一般通过培养基的搅拌和通气提供氧。可用搅拌或振荡等常规方法给培养基通气。培养基中的氧浓度优选大于饱和值(即在大气压和约30-40℃，培养基中的氧溶解度)的约15％，更优选大与饱和值的约20％，尽管如果对发酵没有不利影响，可达到较低的氧浓度。通过常规方法例如用氧电极可监测培养基的氧浓度。可以使用其他氧源，例如未稀释的氧气和用除以外的其它惰性气体稀释的氧气。
由于葡糖胺的发酵生产优选以葡萄糖为唯一碳源，因此在优选的实施方案中，将在大肠杆菌中诱导PEP：葡萄糖PTS。因此，甚至在没有PEP：甘露糖PTS的功能性EIIM,P/ⅢMan的情况下(例如，在带有manXYZ突变的大肠杆菌中)，仍将由细胞经诱导的葡萄糖运输系统摄入产物葡糖胺。但在有过量葡萄糖时，葡糖胺的摄入受到严重抑制。因此，本发明的一个实施方案是通过在发酵生物反应器中保持过量葡萄糖来抑制葡糖胺产物的摄入。本文所用“过量”的葡萄糖指葡萄糖的量高于正常条件，例如上述培养条件下保持微生物生长所需的量。优选，将葡萄糖浓度保持在发酵培养基重量/体积约0.5％-约5％。在另一实施方案中，将葡萄糖浓度保持在约5g/L-约50g/L发酵培养基，最佳为约5g/L至约20g/L发酵培养基。在一实施方案中，通过任何适宜的方法(例如用葡萄糖检测条)监测发酵培养基的葡萄糖浓度，当葡萄糖浓度耗尽或接近耗尽时，再向培养基中加入葡萄糖。在另一实施方案中，通过向发酵培养基中半连续或连续补料来保持葡萄糖的浓度。本文公开的葡萄糖参数适用于本发明发酵培养基所用的任何碳源。还应理解，可使碳源在发酵过程的任何适宜时间段达到不可检测的水平，只要其可促进葡糖胺的生产。
本发明的另一实施方案是根据保持和/或促进生产生物体生产葡糖胺的需要，补充和/或控制发酵培养基的其他组分和参数。例如，在一个实施方案中，发酵培养基含有硫酸铵，而且通过加入过量硫酸铵补充培养基中硫酸铵的浓度。优选将发酵培养基中的硫酸铵量保持在约0.1％-约1％(重量/体积)，优选约0.5％。在另一实施方案中，监测发酵培养基pH的波动。在本发明的发酵方法中，优选将pH保持在约pH6.0-约pH8.0，更优选约pH7.0。在本发明方法中，如果发酵培养基的起始pH为7.0，则监测发酵培养基的pH是否显著偏离pH7.0，并通过例如加入氢氧化钠作相应调整。
本发明的另一实施方案是改变碳流，使其从乙酸盐生产流向较低毒性副产物的生产。用所述方法，可避免与发酵培养基中葡萄糖过量有关的毒性问题。从乙酸盐生产改变碳流向的方法是本领域已知的。
在本发明的分批发酵过程中，持续发酵直到通过细胞外葡糖胺的积累表明葡糖胺的形成基本上停止为止。总发酵时间通常为约40-约60小时，更优选约48小时。在连续发酵过程中，随葡糖胺在培养基中的积累将其从反应器中取出。本发明的方法可生产包括细胞内或细胞外葡糖胺-6-磷酸和细胞内或细胞外葡糖胺的产物。
本发明方法还包括回收产物，所述产物可以是细胞内糖胺-6-磷酸或细胞外葡糖胺。术语“回收葡糖胺”简单指从发酵生物反应器中收集产物，并不指其他分离或纯化步骤。例如，回收步骤指从生物反应器中取出全部培养物(即微生物和发酵培养基)，从生物反应器中取出含细胞外葡糖胺的发酵培养基，和/或从生物反应器中取出含细胞内葡糖胺-6-磷酸的微生物。这些步骤后可进行进一步纯化。优选回收基本上纯形式的葡糖胺。本文所用“基本上纯的”指葡糖胺作为用于商业销售的营养化合物可有效使用的纯度。在一实施方案中，优选从生产生物体和其他发酵培养基组分中分离葡糖胺产物。下文描述完成所述分离的方法。
通过本发明方法，优选从微生物和/或发酵培养基中回收至少约1g/L产物(即葡糖胺和/或葡糖胺-6-磷酸)。通过本发明方法，更优选回收至少约5 g/L产物，最佳至少约10g/L产物，更好至少约20g/L产物，更好至少约50g/L产物。在一实施方案中，回收约1g/L-约50g/L的葡糖胺产物。
通常，用本发明方法生产的大部分葡糖胺是细胞外的。通过常规方法，例如通过过滤或离心可从发酵培养基中回收所述微生物。在一实施方案中，回收产物的步骤包括从发酵培养基中纯化葡糖胺。通过常规方法，例如色谱、提取、结晶(例如蒸发结晶)、膜分离、反渗透和蒸馏可从无细胞发酵培养基中回收葡糖胺。在优选的实施方案中，通过结晶从无细胞发酵培养基中回收葡糖胺。在另一实施方案中，回收产物的步骤包括浓缩细胞外葡糖胺的步骤。
在一实施方案中，葡糖胺-6-磷酸在细胞内积累，回收产物的步骤包括从所述微生物中分离葡糖胺-6-磷酸。例如，通过不会降解葡糖胺产物的方法溶解微生物细胞，离心裂解物以除去不溶的细胞碎片，然后通过上述常规方法回收葡糖胺和/或葡糖胺-6-磷酸可回收产物。
在本文所述的遗传修饰的微生物中的初始细胞内产物是葡糖胺-6-磷酸。通常认为，在从微生物向外运输的过程中，磷酸化的中间产物被去磷酸化，最可能归因于微生物的壁膜间隙中存在碱性磷酸酶。在本发明的一实施方案中，在从细胞向外运输前或过程中，通过天然磷酸酶将葡糖胺-6-磷酸去磷酸化以便有利于生成所需产物葡糖胺。在该实施方案中，不需要提高细胞内重组磷酸酶的活性或者用磷酸酶处理发酵培养基。在另一实施方案中，通过包括但不限于遗传修饰内源磷酸酶基因的方法或者通过重组修饰微生物以表达磷酸酶基因可提高生成生物体中的磷酸酶水平。在另一实施方案中，在葡糖胺-6-磷酸被释放到培养基后，例如按上述溶解细胞后，用磷酸酶处理回收的培养基。
如上所述，本发明方法生成了显著量的细胞外葡糖胺。具体地讲，该方法生成细胞外葡糖胺，占总葡糖胺约50％以上的是细胞外的，更优选约75％以上的均是细胞外的，最佳约90％以上的均是细胞外的。通过本发明方法，细胞外葡糖胺的浓度可大于约1g/l，优选大于约5g/l，更优选大于约10g/l，最佳大于约20g/L，甚至优选大于约50g/l。
本发明的一个实施方案涉及通过发酵生成葡糖胺的方法，所述方法包括步骤(a)在含可吸收的碳、氮和磷源的发酵培养基中培养带有遗传修饰的氨基糖代谢途径的大肠杆菌以生成产物，(b)回收产物。所述产物包括从大肠杆菌中回收的细胞内葡糖胺-6-磷酸和/或从发酵培养基中回收的细胞外葡糖胺。
本发明的一个实施方案涉及用于通过生物合成方法生成葡糖胺的微生物。用与转录控制序列有效相连的编码葡糖胺-6-磷酸合酶的重组核酸分子转化所述微生物。所述重组核酸分子带有可降低葡糖胺-6-磷酸合酶的葡糖胺-6-磷酸产物抑制作用的遗传修饰。所述重组核酸分子的表达提高了所述微生物的葡糖胺-6-磷酸合酶的表达。在优选的实施方案中，所述重组核酸分子被整合到所述微生物的基因组中。在另一实施方案中，所述微生物在编码选自下列蛋白质的基因中带有至少一个另外的遗传修饰：N-乙酰-葡糖胺-6-磷酸脱乙酰酶、葡糖胺-6-磷酸脱氨基酶、N-乙酰-葡糖胺-特异性酶ⅡNag、磷酸葡糖胺变位酶、葡糖胺-1-磷酸乙酰转移酶-N-乙酰葡糖胺-1-磷酸尿苷酰转移酶、磷酸果糖激酶、PEP：葡萄糖PTS的酶ⅡGlc、PEP：甘露糖PTS的EIIM,P/ⅢMan和/或磷酸酶。所述遗传修饰降低了蛋白质的作用，例外是在磷酸酶的情况下，其中优选提高了所述磷酸酶的作用。在另一优选的实施方案中，所述微生物在编码N-乙酰-葡糖胺-6-磷酸脱乙酰酶、葡糖胺-6-磷酸脱氨基酶、N-乙酰-葡糖胺-特异性酶ⅡNag的基因中带有修饰，其中所述遗传修饰降低了所述蛋白质的作用。在一实施方案中，所述遗传修饰是缺失至少所述基因的一部分。
在优选的实施方案中，所述遗传修饰的微生物是细菌或酵母，更优选埃希菌属的细菌，最佳是大肠杆菌。遗传修饰的大肠杆菌优选在包括但不限于下列的基因中带有修饰：nagA、nagB、nagC、nagD、nagE、manXYZ、glmM、pfkB、pfkA、glmU、glmS、ptsG或磷酸酶基因。在另一实施方案中，所述遗传修饰的大肠杆菌带有nag调节子基因的缺失，在另一实施方案中，带有nag调节子基因的缺失并在manXYZ基因中带有遗传修饰以致由manXYZ基因编码的蛋白质具有降低的作用。
本发明的另一实施方案涉及通过生物合成方法生成葡糖胺的微生物，所述微生物含有与转录控制序列有效相连的编码葡糖胺-6-磷酸合酶的重组核酸分子；并在编码选自下列蛋白质的基因中含有至少一个遗传修饰：N-乙酰-葡糖胺-6-磷酸脱乙酰酶、葡糖胺-6-磷酸脱氨基酶、N-乙酰-葡糖胺-特异性酶ⅡNag、磷酸葡糖胺变位酶、葡糖胺-1-磷酸乙酰转移酶-N-乙酰葡糖胺-1-磷酸尿苷酰转移酶、磷酸果糖激酶、PEP：葡萄糖PTS的酶ⅡGlc、和/或PEP：甘露糖PTS的EIIM,P/ⅢMan。所述遗传修饰降低了所述蛋白质的作用，所述重组核酸分子的表达提高了微生物的葡糖胺-6-磷酸合酶表达。在另一实施方案中，所述微生物在磷酸酶基因中至少有一个遗传修饰，使该基因编码的磷酸酶的作用增强。在另一实施方案中，所述重组核酸分子被整合到所述微生物的基因组中。
本发明的另一实施方案涉及任何上述微生物，其在pH7.0的含14g/LK2HPO4、16g/L KH2PO4、1g/L二水合柠檬酸钠、5g/L(NH4)2SO4、20g/L葡萄糖、10mM MgSO4、1mM CaCl2和1mM IPTG的发酵培养基中37℃培养约24小时达到至少约8g/L细胞干重的细胞密度时，所述微生物产生至少约1g/L葡糖胺。
本发明更优选的实施方案涉及上述任何微生物，当在pH7.0的含14g/LK2HPO4、16g/L KH2PO4、1g/L二水合柠檬酸钠、5g/L(NH4)2SO4、20g/L葡萄糖、10mM MgSO4、1mM CaCl2和0.2mM-约1mM IPTG的发酵培养基中在约28℃-约37℃培养约10-约60小时达到至少约8g/L细胞干重的细胞密度时，所述微生物产生至少约1g/L葡糖胺。在优选的实施方案中，IPTG的量是约0.2mM。
本发明的另一实施方案涉及任何上述遗传修饰的微生物，其在本文所述培养条件下培养时，产生至少约1g/L，优选至少约5g/L，更优选至少约10g/L，甚至更优选至少约20g/L，甚至更优选至少约50g/L葡糖胺和/或葡糖胺-6-磷酸。本发明的另一实施方案涉及任何上述遗传修饰的微生物，其比相同条件下培养的野生型(即未修饰的天然)微生物生产至少多约2倍的葡糖胺和/或葡糖胺-6-磷酸，优选至少多约5倍，更优选至少多约10倍，更优选多至少约25倍，更优选多至少约50倍，甚至更优选多至少约100倍，甚至更优选多至少约200倍葡糖胺和/或葡糖胺-6-磷酸。在实施例节中鉴定了许多具体的微生物。本发明的其他实施方案包括这些微生物和具有实施例中具体鉴定之微生物的特定特征的微生物。所述微生物优选是酵母或细菌，更优选是细菌，最佳是大肠杆菌。所述鉴定特征可包括实施例中微生物的任何或所有基因型和/或表型特征，包括其生产葡糖胺的能力。
本发明优选的微生物包括已用编码葡糖胺-6-磷酸合酶的重组核酸分子转化的大肠杆菌菌株。优选所述核酸分子被整合到所述微生物的基因组中。特别优选的微生物是大肠杆菌菌株2123-12。菌株2123-12含有整合到其基因组中的含核酸序列SEQ ID NO:15的重组核酸分子，所述核酸序列代表含有氨基酸序列SEQ ID NO:16之野生型(即正常、未修饰的或天然)葡糖胺-6-磷酸合酶的编码区。本发明特别优选的微生物已用含有编码葡糖胺-6-磷酸合酶之核酸序列的核酸分子转化，已对所述核酸序列进行了遗传修饰以致所述合酶具有提高的作用(上述)。最佳，与未用所述核酸分子转化的微生物相比，所述遗传修饰提高了所述微生物生产葡糖胺的能力。在实施例节中描述了本发明特别优选的遗传修饰的微生物，包括大肠杆菌菌株2123-49、2123-54、2123-124、2123-149和2123-151。
用经典菌株培育和分子遗传技术均可开发经遗传修饰，生产葡糖胺之能力提高的微生物。总之，产生具有提高的葡糖胺生产之微生物的策略是(1)失活或缺失至少一个，优选一个以上其中对葡糖胺-6-磷酸生产有不利影响(即抑制)的氨基糖代谢途径；(2)扩增至少一个，优选一个以上其中提高葡糖胺-6-磷酸生产的氨基糖代谢途径。因此，本发明遗传修饰的微生物具有(a)将葡糖胺-6-磷酸转变成其他化合物的能力降低(即葡糖胺-6-磷酸分解代谢或合成代谢途径的抑制作用)；(b)生产(即合成)葡糖胺-6-磷酸的能力提高；(c)将葡糖胺运输到细胞内的能力降低；(d)将葡糖胺-6-磷酸或葡糖胺运输出细胞的能力提高和/或(e)利用与葡糖胺-6-P生产有关之底物竞争进行生物化学反应的能力减弱。
如前文所讨论的，在一实施方案中，遗传修饰的微生物可以是以下微生物，其中核酸分子已缺失、插入或修饰(如通过核苷酸插入、缺失、取代和/或倒置)而在所述微生物内提供所需的影响。在某些实施方案中，所述遗传修饰可以在核酸分子之编码蛋白的编码区内，其使为所述微生物提供所需影响的蛋白质产生氨基酸序列内的氨基酸修饰如插入、缺失、取代。遗传修饰的微生物可通过重组技术例如将分离的核酸分子导入微生物中来修饰。例如，可用编码目的蛋白，如需提高表达之蛋白的重组核酸分子转染遗传修饰的微生物。转染的核酸分子以其表达能力得到保持的方式成为染色体外组分或者整合到转染(重组)的宿主细胞染色体上一个或多个位点。优选，用核酸分子转染本发明的宿主细胞后，将所述核酸分子整合到宿主细胞基因组中。整合的显著优点是可以将核酸分子稳定地保持在细胞内。在优选的实施方案中，整合的核酸分子与可被诱导以控制所述核酸分子表达的转录控制序列(下文)有效相连。
通过随机或定靶整合可将核酸分子整合到宿主细胞的基因组中。所述整合方法是本领域已知的。例如，按实施例2中的详细描述，大肠杆菌菌株ATCC47002(表1)含有使其不能保持含ColE1复制起点之质粒的突变。当这类质粒转移到该菌株中时，对该质粒上所含遗传标记的选择会使该质粒整合到染色体中。例如用含目的基因和大肠杆菌lacZ基因之5’和3’末端侧翼的可选择标记的质粒转化该菌株。lacZ序列可将接纳的DNA靶向染色体中的lacZ基因。lacZ位点的整合取代了编码β-半乳糖苷酶的完整lacZ基因，其中部分lacZ基因被目的基因隔断。根据β-半乳糖苷酶阴性可筛选成功的整合体。也可通过转导噬菌体的利用等方法将核酸分子导入受体细胞基因组中，以产生遗传修饰的微生物。利用重组技术和转导噬菌体技术以产生本发明的不同遗传修饰的微生物是本领域已知的并在实施例节中详细描述。根据本发明，一种基因，例如pstG基因包括与天然pstG基因有关的所有核酸序列，例如控制该基因编码的pstG蛋白质(PEP：葡萄糖PTS的酶ⅡGlc)生产的调节区(例如但不限于转录、翻译或翻译后控制区)以及其编码区本身。在另一实施方案中，一种基因，例如pstG基因可以是与编码给定的pstG基因的核酸序列相似但不相同的等位基因变体(即天然等位基因变体)。具有给定的核酸序列之pstG基因的等位基因变体是在与给定核酸序列基本相同的基因组座位上出现，但由于例如突变或重组引起的天然变异而具有相似但不相同序列的基因。等位基因变体通常编码与其对照基因编码的蛋白质具有类似活性的蛋白质。等位基因变体还可在所述基因的5’或3’非翻译区(例如在调节控制区)含有改变。等位基因变体是本领域技术人员熟知的并被认为会在给定的微生物例如大肠杆菌和/或两种或多种微生物中发现。
尽管术语“核酸分子”主要指物理核酸分子，而术语“核酸序列”主要指所述核酸分子上的核苷酸序列，但这两个术语可以互换使用，尤其关于核酸分子或核酸序列能够编码与氨基糖代谢途径有关的基因时。另外，术语“重组分子”主要指与转录控制序列有效相连的核酸分子，但可与在宿主细胞中分离并表达的术语“核酸分子”互换使用。
知道本发明特定核酸分子，特别是大肠杆菌核酸分子的核酸序列，本领域技术人员可以例如(a)制备这些核酸分子的拷贝和/或(b)得到含至少所述核酸分子一部分(例如含全长基因，全长编码区，调控序列，截短的编码区的核酸分子)的核酸分子。所述核酸分子可以用各种方法得到，包括利用寡核苷酸探针筛选适宜的文库或DNA，然后用寡核苷酸引物PCR扩增适宜的文库或DNA的传统克隆技术。用于筛选或从中扩增核酸分子的优选文库包括细菌和酵母基因组DNA文库，特别是大肠杆菌基因组DNA文库。在例如Sambrook等，同上文中公开了克隆和扩增基因的技术。
根据本发明，分离的核酸分子是已脱离其天然环境(即经过人为操作)的核酸分子。因此，“分离的”并不反映所述核酸分子已被纯化的程度。分离的核酸分子可包括DNA、RNA或者DNA或RNA的衍生物。对核酸分子的最大长度没有限制，不同于实践限制，因为核酸分子可包括基因的一部分，完整的基因或者多个基因，或者其部分。
本发明分离的核酸分子可从其天然来源以完整(即全部)基因或其能与该基因形成稳定杂化物的部分的形式而获得。还可用重组DNA技术(例如聚合酶链反应(PCR)扩增、克隆)或者化学合成方法生产分离的核酸分子。分离的核酸分子包括天然核酸分子和其同系物，所述同系物包括但不限于天然等位基因变体和修饰的核酸分子，所述修饰指核苷酸已插入、缺失、取代和/或倒置，从而为所述微生物提供所需效应。
利用本领域技术人员熟知的许多方法(参见例如Sambrook等，见上丈)均可生产核酸分子同系物。例如可用各种技术修饰核酸分子，所述技术包括但不限于经典诱变技术和重组DNA技术，例如定点诱变，对核酸分子进行化学处理以诱导突变，核酸片段的限制酶裂解，核酸片段的连接，核酸序列所选区域的PCR扩增和/或诱变，寡核苷酸混合物的合成以及混合物组的连接以“建立”核酸分子混合物及所述方法结合使用。通过筛选由所述核酸编码之蛋白质的功能和/或与野生型基因杂交可从修饰核酸的混合物中筛选核酸分子同系物。在实施例节中详细描述了所述技术的实例。
在本发明的一个实施方案中，本发明核酸分子的核酸同系物优选含有导致由所述核酸同系物编码之蛋白质的作用改变的遗传修饰。例如，在本发明的一个实施方案中，提供了一种遗传修饰的重组核酸分子，该核酸分子含有编码葡糖胺-6-磷酸合酶蛋白质同系物的核酸序列，其中优选与编码没有所述遗传修饰的天然葡糖胺-6-磷酸合酶的重组核酸分子相比，所述遗传修饰提高了葡糖胺-6-磷酸合酶同系物的作用。所述遗传修饰通过例如编码具有减弱的葡糖胺-6-磷酸产物抑制作用和/或提高的比活性的葡糖胺-6-磷酸合酶来提高葡糖胺-6-磷酸合酶的作用。带有遗传修饰的所述重组核酸分子在本文称为编码葡糖胺-6-磷酸合酶的野生型核酸分子的核酸同系物。根据本发明，具有因其核酸分子之遗传修饰所致修饰的蛋白质在本文称为蛋白质同系物或给定蛋白质的同系物。
因此，例如具有葡糖胺-6-磷酸合酶活性并可用于本发明的葡糖胺-6-磷酸合酶蛋白质可以是全长葡糖胺-6-磷酸合酶蛋白质，全长葡糖胺-6-磷酸合酶蛋白质的酶活性部分，或者所述蛋白质的任何同系物，例如含有至少一个或数个氨基酸修饰的葡糖胺-6-磷酸合酶蛋白，其中氨基酸残基已被缺失(例如所述蛋白质的截短物，例如肽)、插入、倒置、取代和/或衍生(例如通过糖基化，磷酸化，乙酰化，豆蔻酰化，异戊二烯化，棕榈酸化，酰胺化和/或糖基磷脂酰肌醇的加成)的。
本发明所述的氨基糖代谢途径内之任何蛋白质的同系物是具有与天然蛋白质氨基酸序列(即天然、未修饰的或野生型)足够相似之氨基酸序列的蛋白质，其核酸序列在严紧条件下能够与编码天然蛋白质的核酸分子杂交(即与编码天然蛋白质氨基酸序列的核酸链互补)。本发明任何核酸序列的互补核酸序列指与所引述之序列链互补(即能与整个分子形成双螺旋)的核酸链的核酸序列。应注意，已确定是由SEQ ID NO表示其一条链的本发明的双链核酸分子还包括含有该SEQ ID NO之互补链序列的互补链。因此，本发明的核酸分子可以是双链的或单链的，包括在严紧杂交条件下与本文的某一SEQ ID NO和/或该SEQ ID NO之互补物(在本文中可标明或不标明)形成稳定杂交物的那些核酸分子。推导互补序列的方法是本领域技术人员已知的。
本发明蛋白质同系物的最小长度是足以由能够与编码相应天然蛋白质之核酸分子的互补序列形成稳定杂交物的核酸分子编码的长度。另外，本发明蛋白质同系物的最小长度是足以具有葡糖胺-6-磷酸合酶作用(例如催化或酶活性部分)的长度，优选可提高葡糖胺-6-磷酸合酶作用的长度。因此，编码所述蛋白质同系物之核酸分子的长度取决于核酸组成以及核酸分子与互补序列间的同源百分比和杂交条件本身(例如温度，盐浓度以及甲酰胺浓度)对核酸分子的最大长度没有限制，不同于实践限制，因为核酸分子可包括基因的一部分，完整的基因或者多个基因，或者其部分。同样，本发明蛋白质同系物的最小长度为约4-约6个氨基酸，优选长度取决于是否需要所述蛋白质的全长，多价(即具有一个以上功能结构域的融合蛋白)或者功能部分。
文中所用严紧杂交条件指用于鉴定相似核酸分子之核酸分子的标准杂交条件。所述标准条件公开于例如Sambrook等，分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A LAboratory Manual)，冷泉港实验室出版社，1989。Sambrook等，出处同上，全文引入本文作为参考(具体参见9.31-9.62页，11.7和11.45-11.61)。另外，在例如Meinkoth等，1984,分析生物化学(Anal.Biochem.)138,267-284中公开了计算适宜杂交和洗涤条件以完成允许不同程度核苷酸错配之杂交的公式；Meinkoth等，出处同上，全文引入本文作为参考。
更具体地讲，本文所称严紧杂交条件指在杂交反应中可以分离与用作探针的核酸分子具有至少约70％，优选至少约75％，最佳至少约80％核酸序列同一性之核酸分子的条件。所述条件根据是否形成DNA:RNA或DNA:DNA杂交物而改变。计算的DNA:DNA杂交物的解链温度比DNA:RNA杂交物的低10℃。在具体的实施方案中，DNA:DNA杂交物的严紧杂交条件包括0.1X SSC(0.157M Na+)的离子强度，温度为约20℃-约35℃，更优选约28℃-约40℃，最佳约35℃-约45℃。在具体的实施方案中，DNA:RNA杂交物的严紧杂交条件包括0.1×SSC(0.157M Na+)的离子强度，温度为约30℃-约45℃，更优选约38℃-约50℃，最佳约45℃-约55℃。这些值根据大于约100个核苷酸，0％甲酰胺和G+C含量约50％的分子的解链温度计算。或按Sambrook等，同上文11.55-11.57页所述凭经验计算Tm。
与本发明氨基糖代谢途径有关的蛋白质的同系物可以是天然等位基因变异或天然突变的结果。本发明的蛋白质同系物也可用本领域已知的技术生产，所述技术包括但不限于直接修饰蛋白质或修饰编码该蛋白质的基因，如用经典或重组DNA技术以引起随机或定靶诱变，如上文所讨论。
在本发明的一个实施方案中，在编码葡糖胺-6-磷酸合酶的本发明重组核酸分子中的遗传修饰产生至少一个选自下列的氨基酸修饰(即所编码蛋白的氨基酸序列改变)：葡糖胺-6-磷酸合酶的氨基酸残基的增加、取代、缺失和/或衍生。通过与野生型或天然葡糖胺-6-磷酸合酶例如含有氨基酸序列SEQID NO:16的葡糖胺-6-磷酸合酶进行比较可确定所编码蛋白的氨基酸序列中的修饰。与具有氨基酸序列SEQ ID NO:16的天然葡糖胺-6-磷酸合酶相比，一个或多个所述氨基酸修饰导致葡糖胺-6-磷酸合酶的作用提高。在一个实施方案中，所述氨基酸修饰位于所修饰蛋白质(即同系物)中对应于氨基酸序列SEQ ID NO:l 6的Ile(4),Ile(272),Ser(450),Ala(39),Arg(250),Gly(472),Leu(469)的一个或多个位置上。
在另一实施方案中，所述氨基酸修饰选自下列取代：(a)有一个脂肪族羟基侧基团的氨基酸残基取代Ile(4)；(b)有一个脂肪族羟基侧基团的氨基酸残基取代Ile(272)；(c)有一个脂肪族侧基团的氨基酸残基取代Ser(450)；(d)有一个脂肪族羟基侧基团的氨基酸残基取代Ala(39)；(e)带有含硫侧基团的氨基酸残基取代Arg(250)；(f)有一个脂肪族羟基侧基团的氨基酸残基取代Gly(472)；(g)有一个脂肪族侧基团的氨基酸残基取代Leu(469)；以及(h)(a)-(g)的组合。根据本发明，带有脂肪族羟基的氨基酸残基包括丝氨酸和苏氨酸，带有脂肪族侧基团的氨基酸包括甘氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸和脯氨酸。
在本发明的另一实施方案中，上述氨基酸修饰优选是选自下列的取代：Ile(4)到Thr、Ile(272)到Thr、Ser(450)到Pro、Ala(39)到Thr、Arg(250)到Cys、Gly(472)到Ser、Leu(469)到Pro以及其组合。在实施例节中详细描述了具有导致所述氨基酸修饰的遗传修饰的重组核酸分子的实例。
含有编码葡糖胺-6-磷酸合酶(其作用提高)的核酸序列的优选遗传修饰之重组核酸分子包括含有编码下述葡糖胺-6-磷酸合酶的核酸分子的重组核酸分子，所述合酶含选自下列之氨基酸序列：SEQ ID NO:19、SEQ IDNO:22、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:31。其它优选的遗传修饰的重组核酸分子含有选自SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ IDNO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29和/或SEQ ID NO:30的核酸序列。用于本发明的特别优选的遗传修饰的重组核酸分子包括含选自下列之核酸分子的核酸分子：pKLN23-49、pKLN23-54、pKLN23-124、pKLN23-149、pKLN23-151、nglmS-492184、nglmS-491830、nglmS-542184、nglmS-541830、nglmS-1242184、nglmS-1241830、nglmS-1492184、nglmS-1491830、nglmS-1512184和nglmS-1511830。
本发明包括重组载体，所述载体包括至少一个本发明的分离的核酸分子，其已插入到能够将核酸分子传递到细菌细胞中的任何载体中。所述载体可含有天然情况下不与待插入到载体中的核酸分子相邻的细菌核酸分子。所述载体可以是RNA或DNA，通常是质粒。可将重组载体用于克隆、测序和/或核酸分子的其它操作。可将本文称为重组核酸分子并在下文详细描述的一种重组载体用于表达核酸分子。优选的重组载体能够在转化的细菌或酵母细胞，特别是大肠杆菌细胞中复制。
通过可将核酸分子插入到细胞中的任何方法完成核酸分子向细胞内的转化。转化技术包括但不限于转染，电穿孔和显微注射。
本发明的重组分子可以是DNA或RNA，还可含有其他调节序列，例如翻译调节序列，复制起点和与重组细胞相容的其他调节序列。可用本发明的一个或多个重组分子生产编码产物(即葡糖胺-6-磷酸合酶)。在一实施方案中，通过在有效生成编码蛋白的条件下表达本发明的核酸分子来生成该蛋白质。这类条件(即培养条件)已在上丈描述并将在实施例节进一步讨论。生产编码蛋白的优选方法是用本发明的一个或多个重组分子转染宿主细胞以形成重组细胞。
如上所讨论，本发明的优选重组分子包括nglmS-282184、nglmS-281830、nglmS-492184、nglmS-491830、nglmS-542184、nglmS-541830、nglmS-1242184、nglmS-1241830、nglmS-1492184、nglmS-1491830、nglmS-15l2184、nglmS-1511830、pKLN23-28、pKLN23-49、pKLN23-54、pKLN23-124、pKLN23-149和/或pKLN23-151。
优选用一个或多个重组分子转化细菌细胞(即宿主细胞)来生产重组细胞，所述重组分子各含有一个或多个有效相连至表达载体(其含一个或多个转录控制序列)的核酸分子。术语，有效相连指核酸分子以其转化到宿主细胞中能够被表达的方式向表达载体的插入。本文所用表达载体是能够转化宿主细胞并能够影响具体核酸分子表达的DNA或RNA载体。优选所述表达载体还能够在所述宿主细胞内复制。在本发明中，表达载体通常是质粒。本发明的表达载体包括在酵母宿主细胞或细菌宿主细胞，优选大肠杆菌宿主细胞中可发挥功能(即指导基因表达)的任何载体。在实施例节中列出了本发明优选的重组细胞。
可将本发明的核酸分子与表达载体有效相连，所述表达载体含有调节序列例如转录控制序列、翻译控制序列、复制起点和与重组细胞相容和控制本发明核酸分子表达的其他调节序列。具体地讲，本发明的重组分子包括转录控制序列。转录控制序列是控制转录的开始、延伸和终止的序列。特别重要的转录控制序列是控制转录开始的序列，例如启动子、增强子、操纵子和阻遏子序列。适宜的转录控制序列包括在酵母或细菌细胞，优选大肠杆菌中发挥作用的任何转录控制序列。各种此类转录控制序列为本领域技术人员已知。
本领域技术人员应理解重组DNA技术的应用可通过操作如宿主细胞内的核酸分子拷贝数，所述核酸分子的转录效率，所得转录子的翻译效率以及翻译后的修饰效率而提高转化的核酸分子的表达。用于提高本发明核酸分子表达的重组技术包括，但不限于将核酸分子与高拷贝数的质粒有效相连，将核酸分子整合到宿主细胞染色体中，将载体稳定性序列加到质粒中，取代或修饰转录控制信号(例如启动子、操纵子、增强子)，取代或修饰翻译控制序列，对本发明的核酸分子进行修饰以对应于宿主细胞的惯用密码子，缺失使转录子不稳定的序列，以及利用控制信号使发酵过程中的重组细胞生长与重组酶生产在不同时间发生。通过将编码所述蛋白质的核酸分子片段化、修饰或衍生可提高本发明表达之重组蛋白质的活性。在实施例节详细描述了所述修饰。
提供下列实施例是为了说明而不是限制本发明的范围。
实施例
实施例1
下列实施例描述了大肠杆菌突变株的产生，所述菌株中与葡糖胺降解有关的氨基糖代谢途径被阻断。
构建本文所述所有葡糖胺过量生产菌株的起始菌株是大肠杆菌W3110(可从美国典型培养物保藏中心以编号ATCC 25947获得)，该菌株是原养型，大肠杆菌K-12的F-λ-衍生物(Bachmann,1987，大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌，细胞和分子生物学1190-1219页；该文献全文引入本文作为参考)。在表1中列出了下列实施例中所用和所生产的所有菌株。
                           表1．细菌菌株
   菌株      别名                    基因型         来源/参考文献
W3110  F-mcrA mcrB IN(rrnD-rrnE)1 λ- ATCC
IBPC 522  thi-1 argG6 argE3 his-4 mtl-1 xyl-5rpsL tsx-29？ΔlacX74 manXYZ8nagE47 ptsG22 zcf-229∷Tn10 J.Plumbridge
IBPC 566  thi-1 argG6 argE3 his-4 mtl-1 xyl-5rpsL tsx-29？ΔlacX74 manXYZ8 zdj-225∷Tn10 J.Plumbridge
IBPC 590  thi-1 argG6 argE3 his-4 mtl-1 xyl-5rpsL tsx-29？ΔlacX74Δnag∷TcR J.Plumbridge
7101-6 W3110 ptsM  F-mcrA mcrB IN(rrnD-rrnE)1 λ-manXYZ8 zdj-225∷Tn10 W3110×Plvir(IBPC566)
7101-7 W3110 ptsM  F-mcrA mcrB IN(rrnD-rrnE)1 λ-manXYZ8 zdj-225∷Tn10 W3110×Plvir(IBPC566)
7101-9 W3110Δnag  F-mcrA mcrB IN(rrnD-rrnE)1 λ-Δnag∷TcR W3110×Plvir(IBPC590)
7101-13 W3110 ptsMTcS  F-mcrA mcrB IN(rrnD-rrnE)1 λ-manXYZ8 zaj-225∷Tn10？TcS 在TCS培养基上筛选的7101-6
7101-14 W3110 ptsMTcS  F-mcrA mcrB IN(rrnD-rrnE)1 λ-manXYZ8 zdj-225∷Tn10？TcS 在TCS培养基上筛选的7101-7
7101-15 W3110 ptsMptsG  F-mcrA mcrB IN(rrnD-rrnE)l λ-manXYZ8 zdj-225∷Tn10？ptsG22 zcf-229∷Tn10 7101-14×Plvir(IBPC522)
7101-17 W3110 ptsMΔnag  F-mcrA mcrB IN(rrnD-rrnE)1 λ-manXYZ8 zdj-225∷Tn10？TcSΔnag∷TcR 7101-13×Plvir(IBPC590)
7101-22 W3110 ptsMptsG TcS  F-mcrA mcrB IN(rrnD-rrnE)1 λ-manXYZ8 zdj-225∷Tn10？ptsG22 zcf-229∷Tn10？TcS 在TCS培养基上筛选的7101-15
2123-4 W3110 ptsMptsGΔnag F-mcrA mcrB IN(rrnD-rrnE)1 λ-manXYZ8 zdj-225∷Tn10？ ptsG22 zcf-229∷Tn10？TcSΔnag∷TcR 7101-22×Plvir(IBPC590)
W3110(DE3) F-mcrA mcrB IN(rrnD-rrnE)1λDE3 用λDE3溶原化的W3110
7101-9(DE3) F-mcrA mcrB IN(rrnD-rrnE)1λDE3Δnag∷TcR 用λDE3溶原化的7101-9
7101-17(DE3) F-mcrA mcrB IN(rrnD-rrnE)1λDE3manYXZ8 zdj-225∷Tn10？TcSΔrnag∷TcR 用λDE3溶原化的7101-17
2123-4(DE3) F-mcrA mcrB IN(rrnD-rrnE)1λDE3manYXZ8 zdj-225∷Tn10？ptsG22 zcf-229∷Tn10 TcSΔnag∷TcR 用λDE3溶原化的2123-4
BL21(DE3) F-ompT hsdSB gal dcmλDE3 Novagen,Inc.
ATCC 47002 JC7623 F-recB21 recC22 sbcB15 leu-6 ara-14his-4λ- ATCC
T-71 F-recB21 recC22 sbcB15 leu-6 ara-14his-4λ-lacZ∷pT7-glmS-Cm8H7 通过pKLN23-28转化使pT7-glmS-Cm整合到ATCC 47002的lacZ
T-81 F-recB21 recC22 sbcB15 leu-6 ara-14his-4λ-lacZ∷pT7-glmS-Cm8H8 通过pKLN23-28转化使pT7-glmS-Cm整合到ATCC 47002的lacZ
2123-5 W3110(DE3)lacZ∷pT7-glmS-Cm8H7 W3110(DE3)×Plvir(T-71)
2123-6 W3110(DE3)lacZ∷pT7-glmS-Cm8H8 W3110(DE3)×P1vir(T-81)
2123-7 W3110(DE3)lacZ∷pT7-glmS-Cm8H7 W3110(DE3)×Plvir(T-71)
2123-8 W3110(DE3)lacZ∷pT7-g1mS-Cm8H8 W3110(DE3)×Plvir(T-81)
2123-9 7101-9(DE3)lacZ∷pT7-glmS-Cm8H7 7101-9(DE3)×Plvir(T-71)
2123-10 7101-9(DE3)lacZ∷pT7-glmS-Cm8H8 7101-9(DE3)×Plvir(T-81)
2123-11 7101-17(DE3)1acZ∷pT7-g1mS-Cm8H7 7101-17(DE3)×Plvir(T-71)
2123-12 7101-17(DE3)lacZ∷pT7-glmS-Cm8H8 7101-17(DE3)×Plvir(T-81)
2123-13 2123-4(DE3)lacZ∷pT7-glmS-Cm8H7 2123-4(DE3)×Plvir(T-71)
2123-14 2123-4(DE3)lacZ∷pT7-glmS-Cm8H8 2123-4(DE3)×Plvir(T-81)
NovaBlue endA1 hsdR17 supE44 thi-1 recA1 Novagen
gyrA96 relA1 lac[F’proA+B+lacIqZΔM15∷Tn10]
LE392 F-e14-(McrA-)hsdR514(r-m+)supE44supF58 lacY1或Δ1ac(IZY)6 galK2galT22 metB1 trpR55 Lab collection
2123-16 LE392 glmS13 LE392的NG诱变
2123-49 7101-17(DE3) lacZ∷pT7-glmS11C-Cm8H8 用pKLN23-28进行易错PCR；将突变glms整合至ATCC 47002；经P1转导转移至7101-17(DE3)中
2123-51 7101-17(DE3) lacZ∷pT7-glmS52B-Cm8H8 用pKLN23-28进行易错PCR；将突变glms整合至ATCC 47002中；经P1转导转移到7101-17(DE3)中
2123-54 7101-17(DE3) lacZ∷pT7-glmS8A-Cm8H8 用pKLN23-28进行易错PCR；将突变glms整合到ATCC 47002中；经P1转导转移到7101-17(DE3)中
2123-124 7101-17(DE3) lacZ∷pT7-glmS94A S-Cm8H8 用pKLN23-28进行易错PCR；将突变glms整合到ATCC 47002中；经P1转导转移到7101-17(DE3)中
2123-149 7101-17(DE3) lacZ∷pT7-glmS149-Cm8H8 pKLN23-54 EcoRI-HindIII(1.0 kb)×pKLN23-28 EcoRI-HindIII(6.4 kb)；将突变glms整合进ATCC 47002,经P1转导转移进7101-17(DE3)
2123-151 7101-17(DE3) lacZ∷pT7-glmS151-Cm8H8 pKLN23-54 EcoRⅠ-HindⅢ(1.0 kb)×pKLN23-28 EcoRⅠ-HindⅢ(6.4 kb)；将突变glms整合进ATCC 47002,经P1转导转移进7101-17(DE3)
阻断了葡糖胺摄入和降解的宿主菌株是通过在nagE、manXYZ和ptsG基因中导入突变以阻断葡糖胺的转运、在与葡糖胺-6-磷酸代谢有关的nagA、-B、-C和-D基因中导入突变而构建。已在前文详细描述了这些基因。用转导噬菌体Plvir(如Miller,1972，分子遗传学实验(Experiments inMolecular Genetics)所述，冷泉港实验室出版社，该文献全文引入本文作为参考)将这些基因中的突变导入菌株。
在该技术中，用转导噬菌体Plvir将来自一个菌株(供体菌)的基因或突变转移到受体菌中。当噬菌体Plvir在供体菌中生长时，所产生的少部分噬菌体颗粒含有供体菌染色体DNA，而不含噬菌体DNA的正常互补物。用在供体菌上生长的噬菌体转染受体菌后，含供体菌染色体DNA的噬菌体颗粒可将该DNA转移到受体菌中。如果对供体菌的DNA存在强选择，可选出含供体菌相应基因或突变的受体菌。
为使Plvir在供体菌中生长，用现有的噬菌体原液感染该菌株的培养物。使受体菌在37℃的LBMC培养基(10g/L细菌用胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L NaCl,1mM MgCl2,5mMCaCl2)中生长直到在600nm的吸收值为约1.0，相当于约6×108细胞/mL培养物。然后以约1个噬菌体/10个细胞的比例使稀释的噬菌体原液感染1毫升培养物。在37℃，将混合物非振荡培养20分钟，然后转移到125毫升带挡板之锥形瓶中的10毫升预热LBMC肉汤中。将所得培养物在37℃剧烈振荡2-3小时。在该过程中，通常观察到培养物变浑浊，这标明细菌生长。在该培养期结束时，培养物将变澄清，这表明由于噬菌体的生长使细胞溶解。溶解发生后，将培养物在冰上冷却，加入数滴氯仿，短时振荡。然后将烧瓶的内含物离心以除去细胞碎片和氯仿，所得的上清液通常含108-109噬菌体/mL。
通过用上述适宜供体菌中生长的Plvir进行转导将突变转移到受体菌。为了进行Plvir转导，使受体菌培养物在37℃的LBMC肉汤中过夜生长。将0.1mL培养物与在无菌试管中的0.1mL噬菌体裂解物或者裂解物的系列稀释物混合，然后在37℃保温20分钟。将0.2mL柠檬酸钠加到试管中，将混合物铺板于选择性培养基上。为每次转导如上述设置含未感染细胞和无细胞噬菌体裂解物的对照。为了生产葡糖胺降解阻断的菌株，按下文所述筛选四环素抗性。通过铺在含12.5μg/mL四环素和10mM柠檬酸钠的LB培养基(10g/L细菌用胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L NaCl)中筛选四环素抗性突变株。
将nag基因中的突变作为缺失突变(Δnag∷TcR)同时导入。在含该突变的菌株IBPC590(Plumbridge，表1)中，已用四环素-抗性(TcR)决定簇代替nag基因。结果，将除去了nag功能之突变通过四环素抗性筛选转移到适宜的受体宿主中。在这种情况下，由于在所需突变中含有TcR决定簇，所以Δnag与TcR突变100％连锁。即所有接受了IBPC590之TcR决定簇的受体菌也接受了Δnag突变。这可以通过因在IBPC590上生长的Plvir转染而产生的四环素抗性菌株的生长表型来确定。所有这类菌株均不能在以葡糖胺或N-乙酰葡糖胺为碳源的培养基上生长，这表明存在Δnag突变。
通过用菌株IBPC566和IBPC522(Plumbridge，表1)中的Plvir噬菌体进行转导也可分别在manXYZ和ptsG基因中导入突变。这些菌株也含有与所需突变连锁的四环素抗性决定簇(分别称为zdj-225∷Tn10和zcf-229∷Tn10)。在这些菌株中，TcR决定簇不在该基因内，但与该基因连锁。因此，并不是所有接受TcR决定簇的受体菌均含所需突变。连锁程度可说明TcR决定簇与所需突变在染色体上的距离。结果，必需筛选manXYZ和ptsG的四环素抗性菌株。manXYZ菌株在甘露糖上生长缓慢，不能以葡糖胺为唯一碳源生长。ptsG菌株以葡萄糖为唯一碳源生长缓慢。
由于上述突变的所有筛选均是针对四环素抗性，因此，如果要导入多个突变，则需要在各步骤间使菌株具有四环素敏感性。为了达到该目的，将四环素抗性菌株铺在用于筛选四环素敏感性突变株的TCS培养基(15g/L琼脂，5g/L细菌用胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，50mg/L盐酸金霉素，10g/LNaCl,10g/L NaH2PO4H2O,12mg/L镰孢菌酸和0.1mM ZnCl2)中(描述于Maloy和Nunn,1981，细菌杂志(J.Bacteriol.),145:1110-1112，该文献引入本文作为参考)。将该培养基上长出的菌落通过在相同培养基上再划线来纯化，然后铺板于含有和不含12.5μg/mL四环素的LB培养基上以逐个检查每个菌落的四环素敏感性。
图3图示了用于产生含manXYZ、ptsG和Δnag突变组合的菌株的上述方案。
                   实施例2
下列实施例描述了glmS基因的克隆和过量表达以及T7-glmS基因盒向大肠杆菌染色体中的整合。
glmS基因的克隆和过量表达
用从glmS基因的公开序列(Walker等，1984，生物化学杂志(Biochem.J.),224:799-815，该文献全文引入本文作为参考)获得的信息，合成引物以便用聚合酶链反应(PCR)从W3110菌株(表1)分离的基因组DNA中扩增该基因。用于PCR扩增的引物被称为Up1和Lo8，并具有下列序列：
Up1:5＇-CGGTCTCCCATGTGTGGAATTGTTGGCGC-3＇(SEQ ID NO:1)
Lo8:5＇-CTCTAGAGCGTTGATATTCAGTCAATTACAAACA-3＇(SEQ IDNO:2)
Up1引物含有位于BsaI限制性核酸内切酶位点(GGTCTC,SEQ ID NO:1中的核苷酸2-7)后glmS基因的前20个核苷酸的序列。Lo8引物含位于XbaⅠ限制性核酸内切酶位点(TCTAGA,SEQ ID NO:2的核苷酸2-7)下游的glmS基因的下游145-171碱基(SEQ ID NO:2的核苷酸8-34)的序列。用标准方法完成PCR扩增，以产生以BsaⅠ和XbaⅠ位点为侧翼的、包含glmS基因及其下游DNA的171个碱基对的片段。用制造商提供的材料和说明将该DNA片段克隆到载体pCR-ScriptTMSK(+)(Stratagene Cloning Systems,La Jolla,California)中。所得质粒称为pKLN23-20。
该克隆的结果之一是将唯一的SacⅠ限制性核酸内切酶位点放在该基因的下游。这使得可用限制性核酸内切酶BsaⅠ和SacⅠ从pKLN23-20中切割含glmS基因的DNA片段。然后将该片段克隆在表达载体pET-24d(+)(Novagen,Inc.,Madison,Wisconsin)的NcoⅠ和SacⅠ位点之间以产生质粒pKLN23-23。pET-24d(+)表达载体是基于T7启动子系统(Studier和Moffatt,1986，分子生物学杂志(J.MoL Biol.),189:113-130)。用这种方法克隆使glmS基因被置于pET-24d(+)中T7-lac启动子之后。T7-lac启动子由T7RNA聚合酶特异性识别并仅在含克隆的T7基因1(编码T7 RNA聚合酶)的菌株中表达。在称为λDE3的缺陷型λ噬菌体中含有克隆的T7聚合酶基因。其中λDE3元件被整合到染色体中的菌株含有由lacUV5启动子驱动的T7 RNA聚合酶基因。在那些菌株中，用乳糖类似物异丙基硫代-β-D-吡喃半乳糖苷(IPTG)可诱导T7RNA聚合酶基因的表达。因此，将IPTG加到所述培养基中会诱导T7 RNA聚合酶基因并表达T7或T7-lac启动子控制的任何基因。
为了证实pKLN23-23含有由T7-lac启动子驱动的glmS基因，将所述质粒转移到菌株BL21(DE3)(Novagen,Inc.)(表1)中。使菌株BL21(DE3)/pKLN23-23在含50mg/L卡那霉素(该质粒编码卡那霉素抗性)的LB培养基中生长，一式两份。其中一份用1mMIPTG诱导；而另一份不用。当用十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳监测这两份培养物的总蛋白质时，在来自诱导的培养物的细胞中，显著观察到分子量为约70000的蛋白质，这对应于glmS基因产物的预测大小，但在来自未诱导的培养物的细胞中则观察不到。来自诱导培养物的初步酶检测表明在诱导的培养物中，葡糖胺-6-磷酸合酶活性比用野生型菌株观察到高数百倍。
T7-glmS基因盒整合到大肠杆菌染色体中
通过多步骤的方法，将由T7-lac(T7-glmS基因盒)启动子驱动的glmS基因转移到大肠杆菌菌株的染色体中。首先，将该盒克隆到质粒pBRINT-Cm(Balbas等，1996,基因(Gene)96:65-69，该文献全文引入本文作为参考)。然后通过Balbas等，1996，同上文，描述的技术，将该基因盒整合到ATCC47002(表1)的染色体中以产生菌株T-71和T-81(表1)。最后，通过下文所述的Plvir转导将该基因盒转移到所需的菌株中。
通过用限制性核酸内切酶BglⅡ部分消化和用限制性核酸内切酶HinDⅢ完全消化，从pKLN23-23中切割T7-glmS盒。质粒pKLN23-23在T7启动子上游约20个碱基对的位置含有BglⅡ位点。glmS基因也含有两个BglⅡ位点。运用该酶进行的部分消化是在质粒上游T7启动子处切割，而避开两个内含位点所必需的。质粒pKLN23-23还在glmS基因下游含有唯一的HinDⅢ位点。将切割出的T7-glmS盒克隆到pBRINT-Cm的唯一BamHI和HinDⅢ位点之间。这样产生称为pKLN23-27和pKLN23-28的质粒。质粒pKLN23-27和pKLN23-28含有T7-glmS盒，还含有氯霉素抗性决定簇，其两侧为大肠杆菌lacZ基因的5’和3’末端。
ATCC 47002(表1)含有使其不能保持带ColE1复制起点的质粒例如pBRINT-Cm的突变。当将所述质粒转移到该菌株中时，对该质粒上所含遗传标记的筛选使得该质粒整合到染色体中(Balbas等，1996，同上文)。如上所述，质粒pKLN23-27和-28含有T7-glmS盒和两侧带有大肠杆菌lacZ基因的5’和3’末端的氯霉素抗性决定簇。lacZ序列将导入的DNA靶向染色体中所含的lacZ基因。lacZ位点的整合使编码β-半乳糖苷酶的完整lacZ基因为T7-glmS-Cm盒所隔断的部分lacZ基因所取代。结果，在lacZ的整合导致该菌株变成β-半乳糖苷酶阴性。该质粒还含有远离5’-lacZ-T7-glmS-cm-lacZ-3’盒的氨苄青霉素抗性决定簇。在lacZ的整合和质粒的丢失导致对氨苄青霉素的敏感。
将质粒pKLN23-27和-28转移到ATCC 47002中，然后将细胞铺在含10μg/mL氯霉素，1mM IPTG和40μg/mL5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃半乳糖苷(X-gal)的LB培养基中。培养基中所含的X-gal是β-半乳糖苷酶的产色底物。β-半乳糖苷酶水解X-gal产生蓝色衍生物。X-gal以及诱导天然lacZ基因的IPTG的存在导致出现蓝色lacZ阳性菌落和白色lacZ阴性菌落。然后筛选并纯化白色(lacZ-阴性)氯霉素抗性菌落。然后通过铺在含有和不含有100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中确定所述菌株对氨苄青霉素的敏感性。按Balbas等1996(同上文)所述的PCR方案进一步证实DNA整合。整合子T-71和T-81(表1)分别是因质粒pLN23-27和pKLN23-28的目的片段整合到ATCC47002的染色体中而产生的。
然后按实施例1所述，用菌株T-71和T-81的裂解物通过Plvir转导，将T7-glmS-Cm盒转移到W3110(DE3),7101-9(DE3),7101-17(DE3)和2123-4(DE3)菌株中。这些菌株除含有从T7-lac启动子表达所必需的λDE3元件外，还含有Δnag、manXYZ和ptsG突变的不同组合。用Novagen,Inc.(Madison,Wisconsin)生产的λDE3溶原化试剂盒将λDE3元件导入这些菌株。在含30μg/mL氯霉素和10mM柠檬酸钠的LB琼脂平板上筛选转导子。在含X-gal和IPTG的平板上确定β-半乳糖苷酶活性的丧失，按Balbas等，1996(同上文)所述的PCR方案进一步确定DNA整合。
在含有和不含有IPTG的LB培养基中生长后，测定含整合的T7-glmS盒之生产菌中的葡糖胺-6-磷酸合酶活性(表2)。用下文所述的比色或分光光度检测(Badet等，1987，生物化学(Biochemistry)26:1940-1948)检测细胞粗提物中的葡糖胺-6-磷酸合酶。通过将洗涤过的细胞沉淀以每克细胞湿重5mL的比例悬浮在0.1M KH2PO4/K2HPO4、pH7.5中，让悬浮液以16,000psi通过French压力机，将破碎的细胞悬浮液以35,000-40,000xg离心15-20分钟来制备用于那些检测的提取物。用上清液作为所述检测的酶的来源。
为了进行比色检测，制备含45mM KH2PO4/K2HPO4,20mM果糖-6-磷酸，15mML-葡糖胺，2.5mM EDTA,pH7.5和细胞提取物的1mL反应液。将反应液在37℃保温20分钟，然后通过煮沸4分钟终止反应。通过离心除去所得沉淀，然后按基本如Zalkin(1985，酶学方法113:278-281)所述但已改进的Elson和Morgan方法(1933，生物化学杂志27:1824-1828)检测上清液的葡糖胺-6-磷酸，所述两篇文献均全文引入本文作为参考。向100微升上述上清液中加入12.5微升饱和的NaHCO3和12.5微升冷的新鲜制备的5％含水醋酸酐。在室温保温3分钟后，将混合物煮沸3分钟以蒸掉过量醋酸酐。冷却到室温后，加入150微升0.8M硼酸钾，pH9.2(用KOH将pH调到9.2的0.8MH3BO3)，然后将混合物煮沸3分钟。冷却到室温后，将1.25mL Ehrlich＇s试剂(在含0.125N HCl的冰醋酸中的1％对二甲氨基苯甲醛)加到各试管中。在37℃保温30分钟后，测量在585nm的吸收值，用标准曲线确定形成的葡糖胺-6-磷酸量。不存在底物果糖-6-磷酸时，或者当检测中使用煮沸的提取物时，在585nm没有观察到显著的吸收值。
在室温下用含50mM KH2PO4/K2HPO4,10mM果糖-6-磷酸，6mM L-葡糖胺，10mM KCl,0.6mM乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(APAD)和50-60单位的L-谷氨酸脱氢酶(来自牛肝的Sigma TypeⅡ)的1毫升反应液进行分光光度检测。加入提取物后，监测在365nm的吸收值跟踪活性，并用不存在提取物时的观察值来校正吸收值的少量增加。用APAD的摩尔消光系数9100计算活性。
                         表2
在含整合的T7-glmS盒的生产菌株中葡糖胺-6-磷酸合酶的活性
    菌株     宿主基因型 活性，(μmol/分/ml提取物)
    -IPTG     +IPTG
2123-52123-62123-72123-82123-92123-102123-112123-122123-132123-14  DE3DE3DE3DE3DE3ΔnagDE3ΔnagDE3Δnag manXYZDE3Δnag manXYZDE3Δnag manXYZ ptsGDE3Δnag manXYZ ptsG     2342325263332172120     6449689586759676888
表2表明，平均来说，含整合的T7-glmS盒的生产菌株中葡糖胺-6-磷酸合酶的活性在用IPTG诱导时比不诱导时高约3-至4倍。该活性明显高于用其天然启动子驱动的野生型glmS菌株的(其通常为0.05-0.1μmol/分钟/mL提取物)。菌株2123-6明显带有异常整合，因为其活性比其它菌株的低，而且不受培养基中IPTG存在的影响。
                        实施例3
下列实施例说明菌株基因型对葡糖胺积累的影响。
使按实施例2所述生产的带有T7-glmS整合子的菌株以及不带整合DNA的相应亲本菌株在含M9A培养基(14g/L K2HPO4,16g/L KH2PO4,1g/L二水合柠檬酸钠，5g/L(NH4)2SO4,pH7.0)的振荡烧瓶中生长，所述培养基添加有20g/L葡萄糖，10mM MgSO4，1mM CaCl2和1mM IPTG。每两天取一次样，用实施例2中所述的改进的Elson-Morgan试验测量培养上清液中的葡糖胺浓度。样品用醋酸酐处理和不处理，用标准曲线从净吸收值确定存在的葡糖胺量。
表3列出了培养24小时后，浓度达峰值时葡糖胺的浓度。表3的结果表明，既然有显著的葡糖胺生产，则一定存在T7-glmS基因盒。数据还表明宿主中Δnag突变的存在导致与其不存在相比，葡糖胺积累有显著的增加。在该试验中，几乎观察不到manXYZ突变的影响。但在进一步的振荡烧瓶试验中，菌株2123-12积累的葡糖胺浓度稍高于一贯的基础。
                         表3
            生产菌株培养上清液中的葡糖胺
    菌株            基因型 葡糖胺浓度，mg/L(24小时)
2123-52123-72123-92123-102123-112123-12W3110(DE3)7101-9(DE3)7101-17(DE3) DE3,T-71整合体DE3,T-71整合体DE3,Δnag,T-71整合体DE3,Δnag,T-81整合体DE3,Δnag,manXYZ,T-71整合体DE3,Δnag,manXYZ,T-81整合体DE3，无整合体DE3,Δnag，无整合体DE3,Δnag,manXYZ，无整合体         212367806563400
                           实施例4
下列实施例说明向培养基中补充营养对葡糖胺的积累的影响。
在早期试验中，观察到当培养基中的葡萄糖耗尽时，葡糖胺积累停止。在表4和图4总结的试验中，发现当葡萄糖和硫酸铵快耗尽时补充它们可以提高葡糖胺积累。为了进行该试验，使2123-12菌株在添加了10mM MgSO4,1mM CaCl2和1mM IPTG的M9A培养基中生长。按表4所示改变起始葡萄糖浓度和补料方案。在一个烧瓶中，起始硫酸铵的浓度为10g/L，而不是M9A培养基中所用的正常浓度5g/L。在培养过程中，用Diastix葡萄糖检测条(Bayer Corporation Diagnostics Division,Elkhart,Indiana)监测烧瓶中葡萄糖浓度。当葡萄糖浓度耗尽或接近耗尽(剩余＜5g/L)时，按表4的说明补充葡萄糖和/或硫酸铵。培养过程中还要监测pH。当pH相对于起始pH7.0显著改变时，用氢氧化钠将其调整到7.0。
                           表4
            检测葡萄糖补料之影响的振荡烧瓶试验
烧瓶号 启始葡萄糖，g/L 启始硫酸铵，g/L            补料
    12345         2050502020         551055 无无无20g/L葡萄糖20g/L葡萄糖+5g/L AmSO4
如图4所表明的，增加葡萄糖的供应对葡糖胺积累有积极作用。通过定期补充葡萄糖和硫酸铵(分别加入20g/L和5g/L)，观察到最大葡糖胺积累0.4g/L，比没有补充时高约4倍。
                       实施例5
下列实施例描述突变的glmS基因的分离，所述基因编码葡糖胺-6-磷酸产物抑制作用减弱的葡糖胺-6-磷酸合酶基因。
White(1968，生物化学杂志(Biochem.J.)106:847-858)首先证实葡糖胺-6-磷酸合酶受葡糖胺-6-磷酸抑制。用实施例2所述的用于葡糖胺-6-磷酸合酶的分光光度检测，测定葡糖胺-6-磷酸和葡糖胺对葡糖胺-6-磷酸合酶的影响。为了确定产物抑制作用，在存在不同浓度加入的葡糖胺-6-磷酸的条件下进行检测。
如图5所示，葡糖胺-6-磷酸明显抑制该酶，而葡糖胺稍微抑制该酶。这些结果与White,1968(同上文)得到的相似。该抑制作用是葡糖胺生产菌株中限制葡糖胺积累的关键因素。
为了进一步提高生产菌株中的葡糖胺合成，作出了很大努力以分离编码具有降低的产物抑制作用的葡糖胺-6-磷酸合酶变体的glmS基因。为了达到该目的，用易错PCR技术扩增克隆的基因。用该方法，通过用于扩增的DNA聚合酶，在导致高频错配的条件下扩增所述基因。结果，在PCR产物中得到高频突变。
质粒pKLN23-28在T7启动子上游25个碱基对处和glmS基起点上游111个碱基对处含有一个唯一的SpeⅠ限制性核酸内切酶位点。该质粒还在glmS基因下游177个碱基对处含有一唯一的HinDⅢ位点。合成下列序列的PCR引物，所述引物分别对应SpeⅠ紧邻上游区和HinDⅢ紧邻下游区：
5＇-ATGGATGAGCAGACGATGGT-3＇(SEQ ID NO:3)
5＇-CCTCGAGGTCGACGGTATC-3＇(SEQ ID NO:4)
用这些引物(SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4)扩增可以诱变含完整glmS基因的2247个碱基对区。PCR条件述于Moore和Amold,1996，天然生物技术(Nature Biotechnology)14:458-467，该文献全文引入本文作为参考。简而言之，制备100微升溶液，所述溶液含有四种脱氧核苷三磷酸各1mM,16.6mM硫酸铵，67mM Tris-HCl,pH8.8,6.1mM MgCl2,6.7μM EDTA,10mM β-巯基乙醇，10μLDMSO，引物(SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4)各30ng,7或35ng用KpnⅠ线性化的质粒pKLN23-28和2.5单位的Taq DNA聚合酶(PerkinElmer-Cetus,Emeryville,California)。用70μL矿物油覆盖反应混合物，然后放在热循环仪中，将下列步骤重复25个循环：
94℃1分钟
42℃1分钟
72℃2分钟
据报道在这些条件下，错误频率为每1000个碱基对约1个突变(Moore和Arno1d,1996，同上文)。回收反应产物，纯化，然后用SpeⅠ和HinDⅢ消化，克隆到pKLN23-28的SpeⅠ-HinDⅢ骨架片段中，所述反应产物有效取代了pKLN23-28的SpeⅠ-HinDⅢ片段上的野生型glmS基因。用克隆的DNA转化菌株NovaBlue(Novagen,Inc.,Madison,Wisconsin)，然后将转化的细胞铺在含氨苄青霉素的LB琼脂上。从氨苄青霉素平板上收集9000个含质粒的菌落，然后从收集的细胞中制备质粒DNA以得到pKLN23-28衍生的质粒文库，其在克隆的glmS基因中含有突变。
在Δnag manXYZ DE3宿主背景中筛选通过易错PCR产生的突变质粒提高葡糖胺生产的能力。该筛选是一种生物检测，其中评估含质粒的菌株互养需葡糖胺之大肠杆菌的能力。
葡糖胺-6-磷酸合酶缺陷型的大肠杆菌(Sarvas,1971，细菌学杂志(J.Bacteriol.)105:467-471；Wu和Wu,1971，细菌学杂志(J.Bacteriol.)105:455-466)和枯草芽孢杆菌(Freese等，1970，细菌学杂志(J.Bacteriol.)101:1046-1062)生长时需要葡糖胺或N-乙酰葡糖胺。需要葡糖胺的大肠杆菌菌株用N-甲基-N＇-硝基-N-亚硝基胍(NG)诱变后进行分离。菌株LE392(表1)在LB培养基中生长至6×108个细胞/mL的密度。将溶解于甲醇的2.5mg/mL的NG50微升加到2mL该培养物中，然后将混合物在37℃培养20分钟。该处理导致约10％的菌株存活。离心收集诱变的细胞，通过在0.9％NaCl中悬浮将细胞洗涤两次，然后再离心。将洗涤过的细胞稀释，然后以每平板50-200菌落形成单位的密度铺到含0.2g/L N-乙酰葡糖胺的营养琼脂培养基(NA；5g/L细菌用蛋白胨，3g/L牛肉提取物，15g/L琼脂)。约铺13000个菌落。将这些菌落复制铺板到含和不含0.2g/LN-乙酰葡糖胺的NA琼脂上。在含0.2g/LN-乙酰葡糖胺的NA琼脂上生长了24个菌落，但在不含0.2g/L N-乙酰葡糖胺的NA琼脂上没有。这些菌落通过划线到含0.2g/LN-乙酰葡糖胺的NA琼脂上纯化，然后再检查其生长表型。在选出的最初22个菌落中，5个有预期的LE392之glmS突变株表型。它们不能在NA上生长，但可以在添加了0.2g/L葡糖胺或0.2g/LN-乙酰葡糖胺的NA上生长。它们也不能在葡萄糖基本琼脂上生长，但能在添加了0.2g/LN-乙酰葡糖胺的葡萄糖基本琼脂上生长。将这些突变株之一命名为2123-16(表1)。
在互养实验中，用2123-16菌株的培养细胞覆盖含甘油或果糖作为主要生长碳源的琼脂平板，按上述分离需要葡糖胺的菌株。将生成葡糖胺的菌株穿刺接种到琼脂中，根据穿刺点周围指示菌株所形成晕的大小评估生成葡糖胺的能力。围有较大晕的穿刺点被认为产生较大量的葡糖胺。
用于互养实验的培养基由添加40mg/LL-甲硫氨酸(菌株LE392或菌株2123-16生长所必需)和2g/L甘油或果糖的M9基本培养基(6g/LNa2HPO4,3g/L KH2PO4,0.5g/LNaCl,1g/L NH4Cl,1mM MgSO4,0.1mM CaCl2)组成。按下述用菌株2123-16覆盖这些平板。在含1g/L N-乙酰葡糖胺的LB培养基中，在37℃使2123-16的培养物过夜生长。离心收集培养物，通过在0.9％NaCl中悬浮将细胞洗涤两次，然后再离心。将洗涤过的细胞悬浮在原体积的0.9％NaCl中。对于待覆盖的各平板，将0.1mL洗涤的细胞悬浮液与3mL溶化后的(50℃)F-顶层琼脂(8g/L NaCl,8g/L琼脂)混合，然后注到平板中。
将pKLN23-28突变质粒的文库转移到菌株7101-17(DE3)中，然后将转化的细胞铺到含100μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂上。在这些平板上生长的每个菌落都含有一种突变质粒文库。将菌落从LB+氨苄青霉素平板中捡出，然后依次穿刺接种到：
(1)LB琼脂+氨苄青霉素
(2)用2123-16菌株覆盖的甘油基本琼脂；和
(3)用2123-16覆盖的果糖基本琼脂
中筛选菌落。
将所有平板在37℃保温约24小时。保温后，可在双层平板中穿刺点周围观察到2123-16指示菌株的生长晕。从相应的LB+氨苄青霉素平板中捡出产生较大晕的那些菌落，然后划线纯化。在最初筛选中，筛选了4368个候选突变株，鉴定出96个最初候选菌株。再筛选后，30似乎优于其它的，即产生大于指示菌株的晕。
对6株如上分离的含质粒菌株进行酶试验表明，其中3株对葡糖胺-6-磷酸之抑制作用的敏感性低于对照菌株7101-17(DE3)/pKLN23-28的酶。使菌株在含100μg/mL氨苄青霉素和1mM IPTG的LB肉汤中生长过夜。从那些培养物收集的细胞制备提取物，在添加和添加葡糖胺-6-磷酸的条件下，用分光光度检测法(实施例2所述)检测这些提取物的葡糖胺-6-磷酸合酶。突变克隆子11C、65A和8A对葡糖胺-6-磷酸的敏感性显著低于对照菌株(图6)。在该检测法中其它突变株与对照无法区别。
                          实施例6
下列实施例描述了构建并鉴定在glmS基因中带有导致产物抑制作用降低之突变的葡糖胺生产菌株。
将从上述克隆11C,52B和8A分离的质粒DNA转移到ATCC 47002中，其曾用于将克隆的T7-glmS构建体整合到大肠杆菌染色体中。用实施例2所述的方法很容易完成整合，将整合的DNA按实施例1所述通过P1转导转移到7101-17(DE3)中。这些方法产生与菌株2123-12有相同基因型，但在通过PCR产生的glmS基因中存在突变的菌株。将这些新突变的生产菌株分别称为2123-49、2323-51和2123-54。图7简述了菌株构建的策略。
使菌株2123-12,2123-49,2123-51和2123-54在含1mM IPTG的LB肉汤中生长过夜。从那些培养物收集细胞制备提取物，在添加和不添加葡糖胺-6-磷酸的条件下，用分光光度检测法(实施例2所述)检测所述提取物的葡糖胺-6-磷酸合酶。这些检测的结果列于图8。
这些突变株中的葡糖胺生产比菌株2123-12中的显著提高。用前文实施例4所述葡萄糖和硫酸铵补料的方法在振荡烧瓶获得的培养物进行葡糖胺生产的分析时，当培养物的细胞密度(测O.D.600)达到约14(约8.4g/L细胞干重)时，菌株2123-49,2123-51和2123-54分别产生1.5,2.4和5.8g/L葡糖胺(图9)，而菌株2123-12产生0.3g/L葡糖胺。
                        实施例7
下列实施例描述了在glmS中带有导致产物抑制作用降低之突变的另一菌株的产生。
同样实施例5所述，用互养试验筛选含有通过实施例5所述易错PCR产生的突变质粒的另外6344个菌落。54个菌落产生比其余菌落大的晕。分离所有54个菌落的DNA，按实施例6所述构建与菌株2123-12有相同基因型但glmS中的突变不同的菌株。
这些突变株中大部分的葡糖胺生产显著高于2123-12菌株。在新分离的突变株中，产生最多葡糖胺的菌株是被称为2123-124的菌株。当用实施例4所述的葡萄糖和硫酸铵补料方法在振荡烧瓶中检测生产情况时，该菌株产生3.6g/L葡糖胺，而在平行试验中，2123-54菌株产生4.3g/L葡糖胺。
                        实施例8
下列实施例描述了对质粒pKLN23-28中的克隆的野生型glmS基因的测序。另外，还测序并描述了在质粒pKLN2349,pKLN23-54和pKLN23-124中的序列，这些质粒含有分别用于构建菌株2123-49,2123-54和2123-124的突变glmS基因。
用AmpliTaq DNA聚合酶和Applied Biosystems(ABI)Prism DyeTerminator Cycle测序方法完成DNA测序反应。在ABIDNA测序仪373A或377上通过凝胶电泳分离所得产物。用来自ABI的ABI Sequencing Analysis3.0软件和来自Gene Codes的Sequencher 3.1分析序列。
用于测序的引物如下：
PK-1:5＇-TGGATGAGCAGACGATGG-3＇(SEQ ID NO:5)
PK-2:5＇-TCCGTCACAGGTATTTATTC-3＇(SEQID NO:6)
PK-3:5＇-AGCTGCGTGGTGCGTAC-3＇(SEQ ID NO:7)
PK-4:5＇-GGACCGTGTTTCAGTTCG-3＇(SEQID NO:8)
PK-5A:5＇-GCCGTGGCGATCAGTAC-3＇(SEQ ID NO:9)
PK-6A:5＇-GCCAATCACCAGCGGAC-3＇(SEQ ID NO:10)
PK-7:5＇-ATGGTTTCCCGCTACTGG-3＇(SEQ ID NO:11)
PK-8:5＇-GAACCAAGGTAACCCAGC-3＇(SEQ ID NO:12)
确定含野生型glmS基因的质粒pKLN23-28的核苷酸序列是本文SEQID NO:13表示的7408bp核酸序列。用上述引物确定SEQ ID NO:13之位置1130与3313之间的2184个碱基对。本文将代表SEQ ID NO:13之位置1130-3313的核酸分子称为nglmS-282184，并进一步鉴定为SEQ ID NO:14。nglmS-282184表明包含用于按实施例5所述构建突变体质粒的SpeⅠ和HinDⅢ位点。SEQ ID NO:13的剩余DNA序列是基于用于构建pKLN23-28之载体的已知序列。测定质粒pKLN23-49,pKLN23-54和pKLN23-124中相同的2184个碱基对区。应注意，为了讨论这些质粒的突变glmS基因(表5)，用SEQ ID NO:13作为参考描述含突变glmS的质粒的核苷酸序列中突变的具体核苷酸位置。
SEQ ID NOs:13和14含有编码glmS基因产物(即Glc6P合酶)的开放阅读框架，其是本文称为nglmS-281830的核酸分子，其核酸序列由SEQ ID NO:15表示。SEQ ID NO:15跨SEQ ID NO:13的核苷酸1253-3082，并包括跨苷酸1253-1255的起始密码子和跨核苷酸3080-3082的终止密码子。SEQ IDNO:15编码本文称为GlcN6P-S-28的609个氨基酸的蛋白质，其推导的氨基酸序列由SEQ ID NO:16表示。应注意为了讨论本文所述突变菌株产生的突变glmS基因产物，用SEQ ID NO:16作为参考描述在突变glmS基因产物之氨基酸序列中的具体突变。
上述引物对应于SEQ ID NO:13的下列核苷酸位置：
PK-1(SEQ ID NO:5):SEQ ID NO:13的位置1087-1104；
PK-2(SEQ ID NO:6):SEQ ID NO:13之互补核酸序列的位置3378-3359；
PK-3(SEQ ID NO:7):SEQ ID NO:13的位置1707-1723；
PK-4(SEQ ID NO:8):SEQ ID NO:13之互补核酸序列的位置2772-2755；
PK-5A(SEQ ID NO:9):SEQ ID NO:13的位置2667-2683；
PK-6A(SEQ ID NO:10):SEQ ID NO:13之互补核酸序列的位置1798-1782；
PK-7(SEQ ID NO:11):SEQ ID NO:13的位置2177-2194；
PK-8(SEQ ID NO:12):SEQ ID NO:13之互补核酸序列的位置2364-2347。
来自pKLN23-28的核酸分子nglmS-281830(SEQ ID NO:15，或者SEQ IDNO:13的位置1253-3082)的核酸序列在位置2509和2510(参照SEQ IDNO:13)不同于公开的序列(Walker,J.E.，等，1984，大肠杆菌unc操纵子邻近的DNA序列，生物化学杂志(Biochem.J.)224:799-815)。在本实施例中pKLN23-28在这些位置上的核苷酸分别是G和C，而在公开的序列中报道是C和G。除此之外，glmS基因的公开序列和测定序列是相同的。经测定glmS基因上游和下游序列是根据用于构建pKLN23-28的载体的已知序列和用于构建该质粒的方法预测的那些。
按照上述用于pKLN23-28的所述方法，确定质粒pKLN23-49,pKLN23-54和pKLN23-124的突变glmS基因的核苷酸序列。在每个质粒中均发现了突变。在表5中总结了与在pKLN23-28上测定的野生型序列(SEQID NO:13)相比，在相应突变glmS基因产物中的突变和预测的氨基酸改变。
                       表5
        在葡糖胺过量生产菌株的glmS基因中的突变
    质粒    位置*     碱基改变  氨基酸改变(位置**)
pKLN23-49     126320672600     T变为CT变为CT变为C Ile变为Thr(4)Ile变为Thr(272)Ser变为Pro(450)
pKLN23-54     13672000223926663264     G变为AC变为TT变为CG变为AA变为G A1a变为Thr(39)Arg变为Cys(250)沉默(329)Gly变为Ser(472)基因外
pKLN23-124     152526583280     T变为CT变为CG变为A 沉默(91)Leu变为Pro(469)基因外
*参照在pKLN23-28序列(SEQ ID NO:13)中表示的核酸位置
**glmS基因(nglmS-281830；SEQ ID NO:15)编码长度为609个氨基酸的蛋白质(SEQ ID NO:16)；由水解酶除去在位置1的甲硫氨酸残基。
pKLN23-49含有本文称为nglmS-492184的2184bp核酸分子，该核酸分子含有一个突变的glmS基因。nglmS-492184的核酸序列由本文SEQ IDNO:17表示。本文称为nglmS-491830的跨SEQ ID NO:17中核苷酸124-1953的核酸分子代表编码本发明突变的葡糖胺-6-磷酸合酶的开放阅读框架，起始密码子是SEQ ID NO:17的核苷酸124-126，终止密码子是SEQ ID NO:17的核苷酸1951-1953。在本文nglmS-491830的核酸序列是SEQ ID NO:18。SEQID NO:18编码本文称为GlcN6P-S-49的609个氨基酸的突变葡糖胺-6-磷酸合酶蛋白质，在本文其推导的氨基酸序列是SEQ ID NO:19。SEQ ID NO:17含有与SEQ ID NO:13中1130-3313位(即SEQ ID NO:14)基本相同的核酸序列，不同之处在于如表5对质粒pKLN23-49所标明的突变。SEQ ID NO:18含有与SEQ ID NO:13中1253-3082位(即SEQ ID NO:15)基本相同的核酸序列，不同之处在于如表5所标明的有关质粒pKLN23-49的突变。
质粒pKLN23-54含有本文称为nglmS-542184的2184bp核酸分子，该核酸分子含有一个突变的glmS基因。nglmS-542184的核酸序列由本文SEQ IDNO:20表示。本文称为nglmS-541830的跨SEQ ID NO:20中核苷酸124-1953的核酸分子代表编码本发明突变的葡糖胺-6-磷酸合酶的开放阅读框架，起始密码子是SEQ ID NO:20的核苷酸124-126，终止密码子是SEQ IDNO:20的核苷酸1951-1953。在本文nglmS-541830的核酸序列是SEQ IDNO:21。SEQID NO:21编码本文称为GlcN6P-S-54的609个氨基酸的突变葡糖胺-6-磷酸合酶蛋白质，在本文其推导的氨基酸序列是SEQ ID NO:22。SEQ ID NO:20含有与SEQ ID NO:13的位置1130-3313(即SEQ ID NO:14)基本相同的核酸序列，不同之处在于如表5所标明的有关质粒pKLN23-54的突变。SEQ ID NO:21含有与SEQ ID NO:13的位置1253-3082(即SEQ ID NO:15)基本相同的核酸序列，不同之处在于如表5所标明的有关质粒pKLN23-54的突变。
质粒pKLN23-124含有本文称为nglmS-1242184的2184bp核酸分子，该核酸分子含有一个突变的glmS基因。nglmS-1242184的核酸序列由本文SEQID NO:23表示。本丈称为nglmS-1241830的跨SEQ ID NO:23中核苷酸124-1953的核酸分子代表编码本发明突变的葡糖胺-6-磷酸合酶的开放阅读框架，起始密码子是SEQ ID NO:23的核苷酸124-126，终止密码子是SEQ IDNO:23的核苷酸1951-1953。在本文nglmS-1241830的核酸序列是SEQ IDNO:24。SEQ ID NO:24编码本文称为G1cN6P-S-124的609个氨基酸的突变葡糖胺-6-磷酸合酶蛋白质，在本文其推导的氨基酸序列是SEQ ID NO:25。SEQ ID NO:23含有与SEQ ID NO:13的位置1130-3313(即SEQ ID NO:14)基本相同的核酸序列，不同之处在于如表5所标明的有关质粒pKLN23-124的突变。SEQ ID NO:24含有与SEQ ID NO:13的位置1253-3082(即SEQ IDNO:15)基本相同的核酸序列，不同之处在于如表5所标明的有关质粒pKLN23-124的突变。
为了证实在染色体中已整合了突变的glmS基因的菌株中存在相同的突变，从菌株2123-49、2123-54和2123-124分离的基因组DNA产生PCR产物。为了进行PCR扩增，使用实施例3中所列的用于诱变基因的引物(SEQID NO:3和SEQ ID NO:4)。在含20mM TrisHCl(pH8.8),10mMKCl,10mM(NH4)2SO4,20mMgSO4,0.1％Triton X-100,0.1mg/mL无核酸酶牛血清白蛋白，脱氧核苷三磷酸各0.05mM，每种引物各2μM，克隆的Pfu DNA聚合酶(Stratagene)1.25U和160ng基因组DNA的反应液50微升中完成PCR反应。将整个反应体系放在RoboCycler Gradient 96 Temperature Cycler(Stratagene)上。在94℃3分钟后，将下列三个步骤重复30个循环：(1)94℃,30秒；(2)47℃,30秒和(3)72℃,2分钟。此后在72℃保温7分钟。
所得的DNA除无关产物外还含有预期的扩增产物。用QIAquickPCR纯化试剂盒纯化含glmS基因的产物，然后在琼脂糖凝胶上对纯化的产物实施电泳，用QIAquick凝胶提取试剂盒分离正确的带，用该分离的DNA作为模板再进行扩增。按照与上述初步扩增相同的方案扩增含该分离DNA的反应液，不同的是用40ng DNA作为模板，并且仅实施20个循环的扩增。按上述回收这第二次扩增的产物。
用引物检验基因组DNA中突变的存在，所述引物特异于含有质粒中所鉴定的突变的DNA区。对于2123-49，这些包括引物PK-1(SEQ ID NO:5),PK-3(SEQ ID NO:7),PK4(SEQ ID NO:8)和PK-5A(SEQ ID NO:9)。对于2123-124，使用引物PK-1(SEQ ID NO:5)；PK4(SEQ ID NO:8)和PK-5(SEQ IDNO:9)。对于2123-54，用前述所有8个引物(SEQ ID NOs:5-12)测定完整PCR产物的序列。对PCR产物的测序证实从质粒中鉴定并列于表5的突变的存在。
                         实施例9
本实施例描述从菌株2123-54构建含突变glmS基因的菌株，所述突变glmS基因编码的产物仅在位置472(SEQ ID NO:22)含有甘氨酸取代丝氨酸的改变。
如表5中所列，在菌株2123-124的GlcN6P合酶(GlcN6P-S-124)中，唯一的氨基酸改变是在位置469(SEQ ID NO:25)的脯氨酸变成亮氨酸，清楚地限定该突变引起菌株2123-124过量生产葡糖胺。这提示在菌株2123-54中GlcN6P-S-54的位置472上，丝氨酸变为甘氨酸(gly取代Ser472；SEQ IDNO:22)的可能性同样是导致该菌株过量生产葡糖胺的原因。在尝试说明这一点的过程中，用EcoRⅠ和HinDⅢ消化质粒pKLN23-54，将所述改变与2123-54菌株中GlcN6P-S-54氨基酸序列(SEQ ID NO:22)中的其它两个氨基酸改变(即Ala取代Thr39和Arg取代Cys250)分开。这些酶在质粒上各有其唯一的裂解位点，分别在位置2241和3305(相对于pKLN23-28之SEQ ID NO:13的等价位置)切割，产生1064个碱基对和6344个碱基对的片段。该较小片段所含突变中唯一的氨基酸改变是pKLN23-54中472位ser变为gly。将该较小的片段与pKLN23-28中含野生型glmS基因的相应较大片段相连。
从该连接产生的两个质粒称为pKLN23-149和pKLN23-151。用引物PK-1(SEQ ID NO:5),PK-3(SEQ ID NO:7)和PK-4(SEQ ID NO:8)测定来自这些质粒的DNA序列证实，这些质粒在质粒pKLN23-54的位置2666含有突变，但在位置1367和2000没有突变(表5，参照SEQ ID NO:13)。
本文将质粒pKLN23-149之位置1130-3313间的2184个碱基对的核酸序列(这些位置经测定对应于SEQ ID NO:13的等价位置)称为nglmS-1492184，其核酸序列由SEQ ID NO:26代表。SEQ ID NO:26含有本文称为nglmS-1491830的跨核苷酸124-1953的核酸序列，该核酸序列代表编码本发明突变葡糖胺-6-磷酸合酶的开放阅读框架，起始密码子是SEQ ID NO:26的核苷酸124-126，终止密码子是SEQ ID NO:26的核苷酸1951-1953。在本文nglmS-1491830的核酸序列是SEQ ID NO:27。SEQ ID NO:27编码本文称为GlcN6P-S-149的609个氨基酸的突变葡糖胺-6-磷酸合酶蛋白质，在本文其推导的氨基酸序列是SEQ ID NO:28。
本文将质粒pKLN23-151之位置1130-3313间的2184个碱基对的核酸序列(这些位置经测定对应于SEQ ID NO:13的等价位置)称为nglmS-1512184，其核酸序列由SEQ ID NO:29代表。SEQ ID NO:29含有本文称为nglmS-1511830的跨核苷酸124-1953的核酸序列，该核酸序列代表编码本发明突变葡糖胺-6-磷酸合酶的开放阅读框架，起始密码子是SEQ ID NO:29的核苷酸124-126，终止密码子是SEQ ID NO:29的核苷酸1951-1953。在本文ng1mS-1511830的核酸序列是SEQ ID NO:30。SEQ ID NO:30编码本文称为GlcN6P-S-151的609个氨基酸的突变葡糖胺-6-磷酸合酶蛋白质，在本文其推导的氨基酸序列是SEQ ID NO:31。
用图7所示的方案构建与菌株2123-12基因型相同，但含有使gly取代ser472之突变的菌株。分别从质粒pKLN23-149和pKLN23-151产生菌株2123-149和2123-151。用实施例8所述的方法，对这些菌株之基因组DNA的PCR产物测序证实，在位置2666(SEQ ID NO:13)存在突变，而在位置1367和2000没有突变。
                            实施例10
本实施例比较来自2123-12,2123-49,2123-54,2123-124,2123-149和2123-151菌株的GlcN6P合酶的特性。
使在上述实施例中所述的菌株2123-12,2123-49,2123-54,2123-124,2123-149和2123-151在37℃LB肉汤中生长过夜，然后转移到新鲜LB肉汤中。培养物生长到在600nm的吸收值为0.8-0.9，然后通过加入1mMIPTG诱导GlcN6P合酶生产。在37℃，使培养物再生长3小时，然后收集。按实施例2所述，从那些培养物中收集的细胞制备提取物，然后按实施例2所述，用分光光度检测法检测葡糖胺-6-磷酸合酶，不同的是果糖-6-磷酸浓度为20mM。存在和不存在加入的葡糖胺-6-磷酸的条件下检测该酶。不存在葡糖胺-6-磷酸的条件下，这些酶的比活性相似，只有菌株2123-124不同。表6的数据提示后者编码该酶的较低活性的变体。
                           表6
             来自葡糖胺生产菌株的GlcN6P合酶的比活性
    菌株    比活性，μmol min-1mg-1
    2123-122123-492123-542123-1242123-1492123-151            0.3850.3750.4160.00760.4940.515
图10表明菌株2123-49,2123-54和2123-124的GlcN6P合酶与菌株2123-12的酶相比明显不太受GlcN6P的抑制。相比，菌株2123-149和2123-151的酶受GlcN6P抑制的程度比菌株2123-12的酶稍微。
这些酶的热稳定性也用这些提取物进行了检测。将提取物在45℃(图11A)或50℃(图11B)保温不同的时间，然后用分光光度检测法检测。图11A和11B显示菌株2123-49和菌株2123-54的酶的稳定性远不及菌株2123-12的酶的。菌株2123-124的酶的稳定性与野生型酶的相当，而菌株2123-149和菌株2123-151的酶在所述保温条件下稳定性略逊。
                         实施例11
下列实施例说明异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)浓度和温度对葡糖胺生产的影响。
在37℃，在添加了20g/L葡萄糖，1mM MgSO4,0.1mM CaCl2和各种量的IPTG的M9A培养基(14g/L K2HPO4,16g/L KH2PO4,1g/L二水合柠檬酸钠，5g/L(NH4)2SO4,pH7.0)上使菌株2123-54和2123-124的培养物生长20小时。在生长期结束时，取样品，用实施例2所述的Elson-Morgan检测法检测培养上清液中的葡糖胺浓度。图12所示的结果表明用于生产的最佳IPTG浓度为约0.2mM。
随后，在含0.2或1mM IPTG的振荡烧瓶中，在30或37℃，在与上述相同的培养基中使菌株2123-54生长。按实施例4所述向这些烧瓶培养物中添加葡萄糖和硫酸铵。间隔不同时间取样，用实施例2所述的Elson-Morgan检测法检测培养上清液中的葡糖胺浓度。图13表明在该试验条件下，不同浓度的IPTG下葡糖胺的生产几乎没有差别。但是，在30℃生长时比在37℃生长有更高的葡糖胺生产。图14A和14B的结果进一步说明，在30℃(图14A)，生长停止后葡糖胺生产继续，而在37℃(图14B)，生长和葡糖胺生产同时停止。
在30℃含0.2mM IPTG的条件下使菌株2123-49和2123-124生长时，生长停止后，葡糖胺生产还在继续，如图15A(2123-49)和15B(2123-124)所示。如在37℃观察的，用菌株2123-54得到最高浓度的葡糖胺，其次是2123-124再次是2123-49。还检测了菌株2123-149和2123-151，它们并不比2123-12产生更高浓度的葡糖胺(表7)。
                          表7
                 30℃时的葡糖胺生产
    菌株     最大葡糖胺生产，g/L
    2123-122123-492123-542123-1242123-1492123-151             0.34.67.25.30.60.6
                          实施例12
下列实施例说明菌株2123-54的发酵罐培养比振荡烧瓶培养产生更高浓度的葡糖胺。本实施例还说明在发酵罐中，菌株2123-54在30℃比在37℃产生更多葡糖胺。
菌株2123-54的发酵培养物在表8所示的培养基中培养。发酵时用NaOH将pH控制在pH6.7，用33％葡萄糖，8％硫酸铵的混合物补料。调整通气和搅拌以使溶解氧的浓度大于20％空气饱和度。
                          表8
                      发酵培养基
组分     量，g/L
K2HPO4KH2PO4二水合柠檬酸钠(NH4)2SO4MgSO4CaCl2Mazu 204 AntifoamIPTG葡萄糖痕量金属        1416150.120.0110.5mL/L0.04820*
*痕量金属组分是0.7mg/L CoCl2,1.7mg/L H3BO3,0.6mg/LCuCl2·2H2O,10.5mg/L FeCl3·6H2O,12mg/L MnCl2·4H2O,1.5mg/LNa2MO4·2H2O,1.5mg/L ZnCl2。
在下列试验中，在含一升容器中以600mL培养基开始进行三个发酵。变量检测如下。
发酵罐#1：补充33％葡萄糖和8％硫酸铵的混合物，其速度将保证发酵罐中没有葡萄糖的积累。培养温度为37℃。
发酵罐#2：基本同发酵#1，但培养温度为30℃。
发酵罐#3：基本同发酵#2，但提高了补料速率以使发酵罐中的葡萄糖浓度稳定在5-10g/L。
在图16A,16B和16C中列出了这些发酵的结果。比较发酵罐1(图16A)和2(图16B)的结果发现正如在振荡烧瓶中所观察到的，在30℃的葡糖胺滴度明显高于在37℃的。观察到的最大葡糖胺浓度是在30℃葡萄糖过量的发酵罐3中(图16C)，为10.9g/L。在30℃，生长与葡糖胺浓度变化平行，似乎在葡萄糖过量条件下生长稍微有利。在随后的发酵试验中，在与发酵罐#3相似的条件下发酵，得到超过12g/L的葡糖胺浓度(数据未列出)。
总之，本发明人在本文描述了利用代谢工程产生第一个大肠杆菌的葡糖胺过量生产菌株。本文所证明的概念总体上适用于具有氨基糖生产途径的任何微生物或者已导入氨基糖生产途径的任何重组微生物。除本发明用于产生葡糖胺-生产菌的方法外(即减少葡糖胺降解和摄入并提高glmS基因的表达)，本发明还确立了减弱葡糖胺-6-磷酸合酶的葡糖胺-6-产物抑制作用可提高葡糖胺生产。
尽管已详细描述了本发明的各种实施方案，但是显然本领域技术人员可以对那些实施方案进行修饰和改变。但是，应清楚地理解所述修饰和改变在本发明下列权利要求的范围内。
                      序列表<110>Berry.AlanBurlingame.Richard P.Millis,James R.<120>生产葡糖胺的方法和材料<130>3161-18-C1-PCT<140>PCT/US99/15976<141>1999-07-15<150>PCT/US98/0080<151>1998-01-14<150>60/035,494<151>1997-01-14<160>31<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>1cggtctccca tgtgtggaat tgtt  ggcgc                                              29<210>2<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>2ctctagagcg ttgatattca gtcaattaca aaca                                          34<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>3atggatgagc agacgatggt                                                          20<210>4<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>4cctcgaggtc gacggtatc                                                           19<210>5<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>5tggatgagca gacgatgg                                                            18<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>6tccgtcacag gtatttattc                                                          20<210>7<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>7agctgcgtgg tgcgtac                                                             17<210>8<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>8ggaccgtgtt tcagttcg                                                            18<210>9<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>9gccgtggcga tcagtac                                                             17<210>10<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>10gccaatcacc agcggac                                                             17<210>11<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>11atggtttccc gctactgg                                                            18<210>12<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>12gaaccaaggt aacccagc                                                            18<210>13<211>7408<212>DNA<213>大肠杆菌<220><221>RBS<222>(1240)..(1245)<220><221>启动子<222>(1165)..(1181)<220><221>冲突<222>(2509)..(2510)<400>13gaattgatcc cgtcgtttta caacgtcgtg actgggaaaa ccctggcgtt acccaactta 60atcgccttgc agcacatccc cctttcgcca gctggcgtaa tagcgaagag gcccgcaccg 120atcgcccttc ccaacagttg cgcagcctga atggcgaatg gcgctttgcc tggtttccgg 180caccagaagc ggtgccggaa agctggctgg agtgcgatct tcctgaggcc gatactgtcg 240tcgtcccctc aaactggcag atgcacggtt acgatgcgcc catctacacc aacgtaacct 300atcccattac ggtcaatccg ccgtttgttc ccacggagaa tccgacgggt tgttactcgc 360tcacatttaa tgttgatgaa agctggctac aggaaggcca gacgcgaatt atttttgatg 420gcgttaactc ggcgtttcat ctgtggtgca acgggcgctg ggtcggttac ggccaggaca 480gtcgtttgcc gtctgaattt gacctgagcg catttttacg cgccggagaa aaccgcctcg 540cggtgatggt gctgcgttgg agtgacggca gttatctgga agatcaggat atgtggcgga 600tgagcggcat tttccgtgac gtctcgttgc tgcataaacc gactacacaa atcagcgatt 660tccatgttgc cactcgcttt aatgatgatt tcagccgcgc tgtactggag gctgaagttc 720agatgtgcgg cgagttgcgt gactacctac gggtaacagt ttctttatgg cagggtgaaa 780cgcaggtcgc cagcggcacc gcgcctttcg gcggtgaaat tatcgatgag cgtggtggtt 840atgccgatcg cgtcacacta cgtctgaacg tcgaaaaccc gaaactgtgg agcgccgaaa 900tcccgaatct ctatcgtgcg gtggttgaac tgcacaccgc cgacggcacg ctgattgaag 960cagaagcctg cgatgtcggt ttccgcgagg tgcggattga aaatggtctg ctgctgctga 1020acggcaagcc gttgctgatt cgaggcgtta accgtcacga gcatcatcct ctgcatggtc 1080aggtcatgga tgagcagacg atggtgcagg atctccaccg cggtggcggc cgctctagaa 1140ctagtggatc tcgatcccgc gaaattaata cgactcacta taggggaatt gtgagcggat 1200aacaattccc ctctagaaat aattttgttt aactttaaga aggagatata ccatgtgtgg 1260aattgttggc gcgatcgcgc aacgtgatgt agcagaaatc cttcttgaag gtttacgtcg 1320tctggaatac cgcggatatg actctgccgg tctggccgtt gttgatgcag aaggtcatat 1380gacccgcctg cgtcgcctcg gtaaagtcca gatgctggca caggcagcgg aagaacatcc 1440tctgcatggc ggcactggta ttgctcacac tcgctgggcg acccacggtg aaccttcaga 1500agtgaatgcg catccgcatg tttctgaaca cattgtggtg gtgcataacg gcatcatcga 1560aaaccatgaa ccgctgcgtg aagagctaaa agcgcgtggc tataccttcg tttctgaaac 1620cgacaccgaa gtgattgccc atctggtgaa ctgggagctg aaacaaggcg ggactctgcg 1680tgaggccgtt ctgcgtgcta tcccgcagct gcgtggtgcg tacggtacag tgatcatgga 1740ctcccgtcac ccggataccc tgctggcggc acgttctggt agtccgctgg tgattggcct 1800ggggatgggc gaaaacttta tcgcttctga ccagctggcg ctgttgccgg tgacccgtcg 1860ctttatcttc cttgaagagg gcgatattgc ggaaatcact cgccgttcgg taaacatctt 1920cgataaaact ggcgcggaag taaaacgtca ggatatcgaa tccaatctgc aatatgacgc 1980gggcgataaa ggcatttacc gtcactacat gcagaaagag atctacgaac agccgaacgc 2040gatcaaaaac acccttaccg gacgcatcag ccacggtcag gttgatttaa gcgagctggg 2100accgaacgcc gacgaactgc tgtcgaaggt tgagcatatt cagatcctcg cctgtggtac 2160ttcttataac tccggtatgg tttcccgcta ctggtttgaa tcgctagcag gtattccgtg 2220cgacgtcgaa atcgcctctg aattccgcta tcgcaaatct gccgtgcgtc gtaacagcct 2280gatgatcacc ttgtcacagt ctggcgaaac cgcggatacc ctggctggcc tgcgtctgtc 2340gaaagagctg ggttaccttg gttcactggc aatctgtaac gttccgggtt cttctctggt 2400gcgcgaatcc gatctggcgc taatgaccaa cgcgggtaca gaaatcggcg tggcatccac 2460taaagcattc accactcagt taactgtgct gttgatgctg gtggcgaagc tgtctcgcct 2520gaaaggtctg gatgcctcca ttgaacatga catcgtgcat ggtctgcagg c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         20                  25                  30ggt ctg gcc gtt gtt gat gca gaa ggt cat atg acc cgc ctg cgt cgc   144Gly Leu Ala Val Val Asp Ala Glu Gly His Met Thr Arg Leu Arg Arg
         35              40                  45ctc ggt aaa gtc cag atg ctg gca cag gca gcg gaa gaa cat cct ctg   192Leu Gly Lys Val Gln Met Leu Ala Gln Ala Ala Glu Glu His Pro Leu
 50                  55                  60cat ggc ggc act ggt att gct cac act cgc tgg gcg acc cac ggt gaa   240His Gly Gly Thr Gly Ile Ala His Thr Arg Trp Ala Thr His Gly Glu65                  70                  75                  80cct tca gaa gtg aat gcg cat ccg cat gtt tct gaa cac att gtg gtg   288Pro Ser Glu Val Asn Ala His Pro His Val Ser Glu His Ile Val Val
             85                  90                  95gtg cat aac ggc atc atc gaa aac cat gaa ccg ctg cgt gaa gag cta   336Val His Asn Gly Ile Ile Glu Asn His Glu Pro Leu Arg Glu Glu Leu
        100                 105                 110aaa gcg cgt ggc tat acc ttc gtt tct gaa acc gac acc gaa gtg att   384Lys Ala Arg Gly Tyr Thr Phe Val Ser Glu Thr Asp Thr Glu Val Ile
    115                 120                 125gcc cat ctg gtg aac tgg gag ctg aaa caa ggc ggg act ctg cgt gag   432Ala His Leu Val Asn Trp Glu Leu Lys Gln Gly Gly Thr Leu Arg Glu
130                 135                 140gcc gtt ctg cgt gct atc ccg cag ctg cgt ggt gcg tac ggt aca gtg   480Ala Val Leu Arg Ala Ile Pro Gln Leu Arg Gly Ala Tyr Gly Thr Val145                 150                 155                 160atc atg gac tcc cgt cac ccg gat acc ctg ctg gcg gca cgt tct ggt   528Ile Met Asp Ser Arg His Pro Asp Thr Leu Leu Ala Ala Arg Ser Gly
            165                 170                 175agt ccg ctg gtg att ggc ctg ggg atg ggc gaa aac ttt atc gct tct   576Ser Pro Leu Val Ile Gly Leu Gly Met Gly Glu Asn Phe Ile Ala Ser
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    195                 200                 205gag ggc gat att gcg gaa atc act cgc cgt tcg gta aac atc ttc gat   672Glu Gly Asp Ile Ala Glu Ile Thr Arg Arg Ser Val Asn Ile Phe Asp
210                 215                 220aaa act ggc gcg gaa gta aaa cgt cag gat atc gaa tcc aat ctg caa   720Lys Thr Gly Ala Glu Val Lys Arg Gln Asp Ile Glu Ser Asn Leu Gln225                 230                 235                 240tat gac gcg ggc gat aaa ggc att tac cgt cac tac atg cag aaa gag   768Tyr Asp Ala Gly Asp Lys Gly Ile Tyr Arg His Tyr Met Gln Lys Glu
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    275                 280                 285ctg ctg tcg aag gtt gag cat att cag arc ctc gcc tgt ggt act tct   912Leu Leu Ser Lys Val Glu His Ile Gln Ile Leu Ala Cys Gly Thr Ser
290                 295                 300tat aac tcc ggt atg gtt tcc cgc tac tgg ttt gaa tcg cta gca ggt   960Tyr Asn Ser Gly Met Val Ser Arg Tyr Trp Phe Glu Ser Leu Ala Gly305                 310                 315                 320att ccg tgc gac gtc gaa atc gcc tct gaa ttc cgc tat cgc aaa tct   1008Ile Pro Cys Asp Val Glu Ile Ala Ser Glu Phe Arg Tyr Arg Lys Ser
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610<210>16<21l>609<212>PRT<213>大肠杆菌<400>16Met Cys Gly Ile Val Gly Ala Ile Ala Gln Arg Asp Val Ala Glu Ile1              5                   10                  15Leu Leu Glu Gly Leu Arg Arg Leu Glu Tyr Arg Gly Tyr Asp Ser Ala
         20                  25                  30Gly Leu Ala Val Val Asp Ala Glu Gly His Met Thr Arg Leu Arg Arg
     35                  40                  45Leu Gly Lys Val Gln Met Leu Ala Gln Ala Ala Glu Glu His Pro Leu
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    115                 120                 125Ala His Leu Val Asn Trp Glu Leu Lys Gln Gly Gly Thr Leu Arg Glu
130                 135             140Ala Val Leu Arg Ala Ile Pro Gln Leu Arg Gly Ala Tyr Gly Thr Val145                 150                 155                 160Ile Met Asp Ser Arg His Pro Asp Thr Leu Leu Ala Ala Arg Ser Gly
            165                 170                 175Ser Pro Leu Val Ile Gly Leu Gly Met Gly Glu Asn Phe Ile Ala Ser
        180                 185                 190Asp Gln Leu Ala Leu Leu Pro Val Thr Arg Arg Phe Ile Phe Leu Glu
    195                 200                 205Glu Gly Asp Ile Ala Glu Ile Thr Arg Arg Ser Val Asn Ile Phe Asp
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    275                 280                 285Leu Leu Ser Lys Val Glu His Ile Gln Ile Leu Ala Cys Gly Thr Ser
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        340                 345                 350Thr Ala Asp Thr Leu Ala Gly Leu Arg Leu Ser Lys Glu Leu Gly Tyr
    355                 360                 365Leu Gly Ser Leu Ala Ile Cys Asn Val Pro Gly Ser Ser Leu Val Arg
370                 375                 380Glu Ser Asp Leu Ala Leu Met Thr Asn Ala Gly Thr Glu Ile Gly Val385                 390                 395                 400Ala Ser Thr Lys Ala Phe Thr Thr Gln Leu Thr Val Leu Leu Met Leu
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        420                 425                 430Asp Ile Val His Gly Leu Gln Ala Leu Pro Ser Arg Ile Glu Gln Met
    435                 440                 445Leu Ser Gln Asp Lys Arg Ile Glu Ala Leu Ala Glu Asp Phe Ser Asp
450                 455                 460Lys His His Ala Leu Phe Leu Gly Arg Gly Asp Gln Tyr Pro Ile Ala465                 470                 475                 480Leu Glu Gly Ala Leu Lys Leu Lys Glu Ile Ser Tyr Ile His Ala Glu
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        580                 585                 590Gly Thr Asp Val Asp Gln Pro Arg Asn Leu Ala Lys Ser Val Thr Val
    595                 600                 605Glu<210>17<211>2184<212>DNA<213>大肠杆菌<400>17ccgctctaga actagtggat ctcgatcccg cgaaattaat acgactcact ataggggaat 60tgtgagcgga taacaattcc cctctagaaa taattttgtt taactttaag aaggagatat 120accatgtgtg gaactgttgg cgcgatcgcg caacgtgatg tagcagaaat ccttcttgaa 180ggtttacgtc gtctggaata ccgcggatat gactctgccg gtctggccgt tgttgatgca 240gaaggtcata tgacccgcct gcgtcgcctc ggtaaagtcc agatgctggc acaggcagcg 300gaagaacatc ctctgcatgg cggcactggt attgctcaca ctcgctgggc gacccacggt 360gaaccttcag aagtgaatgc gcatccgcat gtttctgaac acattgtggt ggtgcataac 420ggcatcatcg aaaaccatga accgctgcgt gaagagctaa aagcgcgtgg ctataccttc 480gtttctgaaa ccgacaccga agtgattgcc catctggtga actgggagct gaaacaaggc 540gggactctgc gtgaggccgt tctgcgtgct atcccgcagc tgcgtggtgc gtacggtaca 600gtgatcatgg actcccgtca cccggatacc ctgctggcgg cacgttctgg tagtccgctg 660gtgattggcc tggggatggg cgaaaacttt atcgcttctg accagctggc gctgttgccg 720gtgacccgtc gctttatctt ccttgaagag ggcgatattg cggaaatcac tcgccgttcg 780gtaaacatct tcgataaaac tggcgcggaa gtaaaacgtc aggatatcga atccaatctg 840caatatgacg cgggcgataa aggcatttac cgtcactaca tgcagaaaga gatctacgaa 900cagccgaacg cgatcaaaaa cacccttacc ggacgcacca gccacggtca ggttgattta 960agcgagctgg gaccgaacgc cgacgaactg ctgtcgaagg ttgagcatat tcagatcctc 1020gcctgtggta cttcttataa ctccggtatg gtttcccgct actggtttga atcgctagca 1080ggtattccgt gcgacgtcga aatcgcctct gaattccgct atcgcaaatc tgccgtgcgt 1140cgtaacagcc tgatgatcac cttgtcacag tctggcgaaa ccgcggatac cctggctggc 1200ctgcgtctgt cgaaagagct gggttacctt ggttcactgg caatctgtaa cgttccgggt 1260tcttctctgg tgcgcgaatc cgatctggcg ctaatgacca acgcgggtac agaaatcggc 1320gtggcatcca ctaaagcatt caccactcag ttaactgtgc tgttgatgct ggtggcgaag 1380ctgtctcgcc tgaaaggtct ggatgcctcc attgaacatg acatcgtgca tggtctgcag 1440gcgctgccga gccgtattga gcagatgctg cctcaggaca aacgcattga agcgctggca 1500gaagatttct ctgacaaaca tcacgcgctg ttcctgggcc gtggcgatca gtacccaatc 1560gcgctggaag gcgcattgaa gttgaaagag atctcttaca ttcacgctga agcctacgct 1620gctggcgaac tgaaacacgg tccgctggcg ctaattgatg ccgatatgcc ggttattgtt 1680gttgcaccga acaacgaatt gctggaaaaa ctgaaatcca acattgaaga agttcgcgcg 1740cgtggcggtc agttgtatgt cttcgccgat caggatgcgg gttttgtaag tagcgataac 1800atgcacatca tcgagatgcc gcatgtggaa gaggtgattg caccgatctt ctacaccgtt 1860ccgctgcagc tgctggctta ccatgtcgcg ctgatcaaag gcaccgacgt tgaccagccg 1920cgtaacctgg caaaatcggt tacggttgag taataaatgg atgccctgcg taagcggggc 1980atttttcttc ctgttatgtt tttaatcaaa catcctgcca actccatgtg acaaaccgtc 2040atcttcggct actttttctc tgtcacagaa tgaaaatttt tctgtcatct cttcgttatt 2100aatgtttgta attgactgaa tatcaacgct ctagaggggc tagagcggcc gccaccgcgg 2160tggagctccg tcgacaagct tatc                                        2184<210>18<211>1830<212>DNA<213>大肠杆菌<220><221>CDS<222>(1)..(1830)<400>18atg tgt gga act gtt ggc gcg atc gcg caa cgt gat gta gca gaa atc   48Met Cys Gly Thr Val Gly Ala Ile Ala Gln Arg Asp Val Ala Glu Ile1               5                  10                  15ctt ctt gaa ggt tta cgt cgt ctg gaa tac cgc gga tat gac tct gcc   96Leu Leu Glu Gly Leu Arg Arg Leu Glu Tyr Arg Gly Tyr Asp Ser Ala
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        180                 185                 190gac cag ctg gcg ctg ttg ccg gtg acc cgt cgc ttt atc ttc ctt gaa   624Asp Gln Leu Ala Leu Leu Pro Val Thr Arg Arg Phe Ile Phe Leu Glu
    195                 200                 205gag ggc gat att gcg gaa atc act cgc cgt tcg gta aac atc ttc gat   672Glu Gly Asp Ile Ala Glu Ile Thr Arg Arg Ser Val Asn Ile Phe Asp
210                 215                 220aaa act ggc gcg gaa gta aaa cgt cag gat atc gaa tcc aat ctg caa   720Lys Thr G1y Ala Glu Val Lys Arg Gln Asp Ile Glu Ser Ash Leu Gln225                 230                 235                 240tat gac gcg ggc gat aaa ggc att tac cgt cac tac atg cag aaa gag   768Tyr Asp Ala Gly Asp Lys Gly Ile Tyr Arg His Tyr Met Gln Lys Glu
            245                 250                 255atc tac gaa cag ccg aac gcg atc aaa aac acc ctt acc gga cgc acc   816Ile Tyr Glu Gln Pro Asn Ala Ile Lys Asn Thr Leu Thr Gly Arg Thr
        260                 265                 270agc cac ggt cag gtt gat tta agc gag ctg gga ccg aac gcc gac gaa   864Ser His Gly Gln Val Asp Leu Ser Glu Leu Gly Pro Asn Ala Asp Glu
    275                 280                 285ctg ctg tcg aag gtt gag cat att cag atc ctc gcc tgt ggt act tct   912Leu Leu Ser Lys Val Glu His Ile Gln Ile Leu Ala Cys Gly Thr Ser
290                 295                 300tat aac tcc ggt atg gtt tcc cgc tac tgg ttt gaa tcg cta gca ggt   960Tyr Asn Ser Gly Met Val Ser Arg Tyr Trp Phe Glu Ser Leu Ala Gly305                 310                 315                 320att ccg tgc gac gtc gaa atc gcc tct gaa ttc cgc tat cgc aaa tct   1008Ile Pro Cys Asp Val Glu Ile Ala Ser Glu Phe Arg Tyr Arg Lys Ser
            325                 330                 335gcc gtg cgt cgt aac agc ctg atg atc acc ttg tca cag tct ggc gaa   1056Ala Val Arg Arg Asn Ser Leu Met Ile Thr Leu Ser Gln Ser Gly Glu
        340                 345                 350acc gcg gat acc ctg gct ggc ctg cgt ctg tcg aaa gag ctg ggt tac   1104Thr Ala Asp Thr Leu Ala Gly Leu Arg Leu Ser Lys Glu Leu Gly Tyr
    355                 360                 365ctt ggt tca ctg gca atc tgt aac gtt ccg ggt tct tct ctg gtg cgc   1152Leu Gly Ser Leu Ala Ile Cys Asn Val Pro Gly Ser Ser Leu Val Arg
370                 375                 380gaa tcc gat ctg gcg cta atg acc aac gcg ggt aca gaa atc ggc gtg   1200Glu Ser Asp Leu Ala Leu Met Thr Asn Ala Gly Thr Glu Ile Gly Val385                 390                 395                 400gca tcc act aaa gca ttc acc act cag tta act gtg ctg ttg atg ctg   1248Ala Ser Thr Lys Ala Phe Thr Thr Gln Leu Thr Val Leu Leu Met Leu
            405                 410                 415gtg gcg aag ctg tct cgc ctg aaa ggt ctg gat gcc tcc att gaa cat   1296Val Ala Lys Leu Ser Arg Leu Lys Gly Leu Asp Ala Ser Ile Glu His
        420                 425                 430gac atc gtg cat ggt ctg cag gcg ctg ccg agc cgt att gag cag atg   1344Asp Ile Val His Gly Leu Gln Ala Leu Pro Ser Arg Ile Glu Gln Met
    435                 440                 445ctg cct cag gac aaa cgc att gaa gcg ctg gca gaa gat ttc tct gac   1392Leu Pro Gln Asp Lys Arg Ile Glu Ala Leu Ala Glu Asp Phe Ser Asp
450                 455                 460aaa cat cac gcg ctg ttc ctg ggc cgt ggc gat cag tac cca atc gcg   1440Lys His His Ala Leu Phe Leu Gly Arg Gly Asp Gln Tyr Pro Ile Ala465                 470                 475                 480ctg gaa ggc gca ttg aag ttg aaa gag atc tct tac att cac gct gaa   1488Leu Glu Gly Ala Leu Lys Leu Lys Glu lle Ser Tyr Ile His Ala Glu
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            565                 570                 575tac acc gtt ccg ctg cag ctg ctg gct tac cat gtc gcg ctg atc aaa   1776Tyr Thr Val Pro Leu Gln Leu Leu Ala Tyr His Val Ala Leu Ile Lys
        580                 585                 590ggc acc gac gtt gac cag ccg cgt aac ctg gca aaa tcg gtt acg gtt   1824Gly Thr Asp Val Asp Gln Pro Arg Asn Leu Ala Lys Ser Val Thr Val
    595                 600                  605gag taa                                                          1830Glu
610<210>19<211>609<212>PRT<213>大肠杆菌<400>19Met Cys Gly Thr Val Gly Ala Ile Ala Gln Arg Asp Val Ala Glu Ile1              5                   10                  15Leu Leu Glu Gly Leu Arg Arg Leu Glu Tyr Arg Gly Tyr Asp Ser Ala
         20                  25                   30Gly Leu Ala Val Val Asp Ala Glu Gly His Met Thr Arg Leu Arg Arg
     35                  40                   45Leu Gly Lys Val Gln Met Leu Ala Gln Ala Ala Glu Glu His Pro Leu
 50                  55                  60His Gly Gly Thr Gly Ile Ala His Thr Arg Trp Ala Thr His Gly Glu65                  70                  75                  80Pro Ser Glu Val Asn Ala His Pro His Val Ser Glu His Ile Val Val
             85                  90                  95Val His Asn Gly Ile Ile G1u Asn His Glu Pro Leu Arg Glu Glu Leu
        100                 105                 110Lys Ala Arg Gly Tyr Thr Phe Val Ser Glu Thr Asp Thr Glu Val Ile
    115                 120                 125Ala His Leu Val Asn Trp Glu Leu Lys Gln Gly Gly Thr Leu Arg Glu
130                 135                 140Ala Val Leu Arg Ala Ile Pro Gln Leu Arg Gly Ala Tyr Gly Thr Val145                 150                 155                 160Ile Met Asp Ser Arg His Pro Asp Thr Leu Leu Ala Ala Arg Ser Gly
            165                 170                 175Ser Pro Leu Val Ile Gly Leu Gly Met Gly Glu Asn Phe Ile Ala Ser
        180                 185                 190Asp Gln Leu Ala Leu Leu Pro Val Thr Arg Arg Phe Ile Phe Leu Glu
    195                 200                 205Glu Gly Asp Ile Ala Glu Ile Thr Arg Arg Ser Val Asn Ile Phe Asp
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            245                 250                 255Ile Tyr Glu Gln Pro Asn Ala Ile Lys Asn Thr Leu Thr Gly Arg Thr
        260                 265                 270Ser His Gly Gln Val Asp Leu Ser Glu Leu Gly Pro Asn Ala Asp Glu
    275                 280                 285Leu Leu Ser Lys Val Glu His Ile Gln Ile Leu Ala Cys Gly Thr Ser
290                 295                 300Tyr Asn Ser Gly Met Val Ser Arg Tyr Trp Phe Glu Ser Leu Ala Gly305                 310                 315                 320Ile Pro Cys Asp Val Glu Ile Ala Ser Glu Phe Arg Tyr Arg Lys Ser
            325                 330                 335Ala Val Arg Arg Asn Ser Leu Met Ile Thr Leu Ser Gln Ser Gly Glu
        340                 345                 350Thr Ala Asp Thr Leu Ala Gly Leu Arg Leu Ser Lys Glu Leu Gly Tyr
    355                 360                 365Leu Gly Ser Leu Ala Ile Cys Asn Val Pro Gly Ser Ser Leu Val Arg
370                 375                 380Glu Ser Asp Leu Ala Leu Met Thr Asn Ala Gly Thr Glu Ile Gly Val385                 390                 395                 400Ala Ser Thr Lys Ala Phe Thr Thr Gln Leu Thr Val Leu Leu Met Leu
            405                 410                 415Val Ala Lys Leu Ser Arg Leu Lys Gly Leu Asp Ala Ser Ile Glu His
        420                 425                 430Asp Ile Val His Gly Leu Gln Ala Leu Pro Ser Arg Ile Glu Gln Met
    435                 440                 445Leu Pro Gln Asp Lys Arg Ile Glu Ala Leu Ala Glu Asp Phe Ser Asp
450                 455                 460Lys His His Ala Leu Phe Leu Gly Arg Gly Asp Gln Tyr Pro Ile Ala465                 470                 475                 480Leu Glu Gly Ala Leu Lys Leu Lys Glu Ile Ser Tyr Ile His Ala Glu
            485                 490                 495Ala Tyr Ala Ala Gly Glu Leu Lys His Gly Pro Leu Ala Leu Ile Asp
        500                 505                 510Ala Asp Met Pro Val Ile Val Val Ala Pro Asn Asn Glu Leu Leu Glu
    515                 520                 525Lys Leu Lys Ser Asn lle Glu Glu Val Arg Ala Arg Gly Gly Gln Leu
530                 535                 540Tyr Val Phe Ala Asp Gln Asp Ala Gly Phe Val Ser Ser Asp Asn Met545                 550                 555                 560His Ile Ile Glu Met Pro His Val Glu Glu Val Ile Ala Pro Ile Phe
            565                 570                 575Tyr Thr Val Pro Leu Gln Leu Leu Ala Tyr His Val Ala Leu Ile Lys
        580                 585                 590Gly Thr Asp Val Asp Gln Pro Arg Asn Leu Ala Lys Ser Val Thr Val
    595                 600                 605Glu<210>20<211>2184<212>DNA<213>大肠杆菌<400>20ccgctctaga actagtggat ctcgatcccg cgaaattaat acgactcact ataggggaat 60tgtgagcgga taacaattcc cctctagaaa taattttgtt taactttaag aaggagatat 120accatgtgtg gaattgttgg cgcgatcgcg caacgtgatg tagcagaaat ccttcttgaa 180ggtttacgtc gtctggaata ccgcggatat gactctgccg gtctggccgt tgttgataca 240gaaggtcata tgacccgcct gcgtcgcctc ggtaaagtcc agatgctggc acaggcagcg 300gaagaacatc ctctgcatgg cggcactggt attgctcaca ctcgctgggc gacccacggt 360gaaccttcag aagtgaatgc gcatccgcat gtttctgaac acattgtggt ggtgcataac 420ggcatcatcg aaaaccatga accgctgcgt gaagagctaa aagcgcgtgg ctataccttc 480gtttctgaaa ccgacaccga agtgattgcc catctggtga actgggagct gaaacaaggc 540gggactctgc gtgaggccgt tctgcgtgct atcccgcagc tgcgtggtgc gtacggtaca 600gtgatcatgg actcccgtca cccggatacc ctgctggcgg cacgttctgg tagtccgctg 660gtgattggcc tggggatggg cgaaaacttt atcgcttctg accagctggc gctgttgccg 720gtgacccgtc gctttatctt ccttgaagag ggcgatattg cggaaatcac tcgccgttcg 780gtaaacatct tcgataaaac tggcgcggaa gtaaaacgtc aggatatcga atccaatctg 840caatatgacg cgggcgataa aggcatttac tgtcactaca tgcagaaaga gatctacgaa 900cagccgaacg cgatcaaaaa cacccttacc ggacgcatca gccacggtca ggttgattta 960agcgagctgg gaccgaacgc cgacgaactg ctgtcgaagg ttgagcatat tcagatcctc 1020gcctgtggta cttcttataa ctccggtatg gtttcccgct actggtttga atcgctagca 1080ggtattccgt gcgacgtcga aatcgcctcc gaattccgct atcgcaaatc tgccgtgcgt 1140cgtaacagcc tgatgatcac cttgtcacag tctggcgaaa ccgcggatac cctggctggc 1200ctgcgtctgt cgaaagagct gggttacctt ggttcactgg caatctgtaa cgttccgggt 1260tcttctctgg tgcgcgaatc cgatctggcg ctaatgacca acgcgggtac agaaatcggc 1320gtggcatcca ctaaagcatt caccactcag ttaactgtgc tgttgatgct ggtggcgaag 1380ctgtctcgcc tgaaaggtct ggatgcctcc attgaacatg acatcgtgca tggtctgcag 1440gcgctgccga gccgtattga gcagatgctg tctcaggaca aacgcattga agcgctggca 1500gaagatttct ctgacaaaca tcacgcgctg ttcctgagcc gtggcgatca gtacccaatc 1560gcgctggaag gcgcattgaa gttgaaagag atctcttaca ttcacgctga agcctacgct 1620gctggcgaac tgaaacacgg tccgctggcg ctaattgatg ccgatatgcc ggttattgtt 1680gttgcaccga acaacgaatt gctggaaaaa ctgaaatcca acattgaaga agttcgcgcg 1740cgtggcggtc agttgtatgt cttcgccgat caggatgcgg gttttgtaag tagcgataac 1800atgcacatca tcgagatgcc gcatgtggaa gaggtgattg caccgatctt ctacaccgtt 1860ccgctgcagc tgctggctta ccatgtcgcg ctgatcaaag gcaccgacgt tgaccagccg 1920cgtaacctgg caaaatcggt tacggttgag taataaatgg atgccctgcg taagcggggc 1980atttttcttc ctgttatgtt tttaatcaaa catcctgcca actccatgtg acaaaccgtc 2040atcttcggct actttttctc tgtcacagaa tgaaaatttt tctgtcatct cttcgttatt 2100aatgtttgta attgactgaa tatcaacgct ctaggggggc tagagcggcc gccaccgcgg 2160tggagctccg tcgacaagct tatc                                        2184<210>21<211>1830<212>DNA<213>大肠杆菌<220><221>CDS<222>(1)..(1830)<400>21atg tgt gga att gtt ggc gcg atc gcg caa cgt gat gta gca gaa atc   48Met Cys Gly Ile Va1 Gly Ala Ile Ala Gln Arg Asp Va1 Ala Glu Ile1               5                  10                  15ctt ctt gaa ggt tta cgt cgt ctg gaa tac cgc gga tat gac tct gcc   96Leu Leu Glu Gly Leu Arg Arg Leu Glu Tyr Arg Gly Tyr Asp Ser Ala
         20                  25                  30ggt ctg gcc gtt gtt gat aca gaa ggt cat atg acc cgc ctg cgt cgc   144Gly Leu Ala Val Val Asp Thr Glu Gly His Met Thr Arg Leu Arg Arg
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130                 135                 140gcc gtt ctg cgt gct atc ccg cag ctg cgt ggt gcg tac ggt aca gtg   480Ala Val Leu Arg Ala Ile Pro Gln Leu Arg Gly Ala Tyr Gly Thr Val145                 150                 155                 160atc atg gac tcc cgt cac ccg gat acc ctg ctg gcg gca cgt tct ggt   528Ile Met Asp Ser Arg His Pro Asp Thr Leu Leu Ala Ala Arg Ser Gly
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    195                 200                 205gag ggc gat att gcg gaa atc act cgc cgt tcg gta aac atc ttc gat   672Glu Gly Asp Ile Ala Glu Ile Thr Arg Arg Ser Val Asn Ile Phe Asp
210                 215                 220aaa act ggc gcg gaa gta aaa cgt cag gat atc gaa tcc aat ctg caa   720Lys Thr Gly Ala Glu Val Lys Arg Gln Asp Ile Glu Ser Asn Leu Gln225                 230                 235                 240tat gac gcg ggc gat aaa ggc att tac tgt cac tac atg cag aaa gag   768Tyr Asp Ala Gly Asp Lys Gly Ile Tyr Cys His Tyr Met Gln Lys Glu
            245                 250                 255atc tac gaa cag ccg aac gcg atc aaa aac acc ctt acc gga cgc atc   816Ile Tyr Glu Gln Pro Asn Ala Ile Lys Asn Thr Leu Thr Gly Arg Ile
        260                 265                 270agc cac ggt cag gtt gat tta agc gag ctg gga ccg aac gcc gac gaa   864Ser His Gly Gln Val Asp Leu Ser Glu Leu Gly Pro Asn Ala Asp Glu
    275                 280                  285ctg ctg tcg aag gtt gag cat att cag atc ctc gcc tgt ggt act tct   912Leu Leu Ser Lys Val Glu His Ile Gln Ile Leu Ala Cys Gly Thr Ser
290                 295                 300tat aac tcc ggt atg gtt tcc cgc tac tgg ttt gaa tcg cta gca ggt   960Tyr Asn Ser Gly Met Val Ser Arg Tyr Trp Phe Glu Ser Leu Ala Gly305                 310                 315                 320att ccg tgc gac gtc gaa atc gcc tcc gaa ttc cgc tat cgc aaa tct   1008Ile Pro Cys Asp Val Glu Ile Ala Ser Glu Phe Arg Tyr Arg Lys Ser
            325                 330                 335gcc gtg cgt cgt aac agc ctg atg atc acc ttg tca cag tct ggc gaa   1056Ala Val Arg Arg Asn Ser Leu Met Ile Thr Leu Ser Gln Ser Gly Glu
        340                 345                 350acc gcg gat acc ctg gct ggc ctg cgt ctg tcg aaa gag ctg ggt tac   1104Thr Ala Asp Thr Leu Ala Gly Leu Arg Leu Ser Lys Glu Leu Gly Tyr
    355                 360                 365ctt ggt tca ctg gca atc tgt aac gtt ccg ggt tct tct ctg gtg cgc   1152Leu Gly Ser Leu Ala Ile Cys Ash Val Pro Gly Ser Ser Leu ValArg
370                 375                 380gaa tcc gat ctg gcg cta atg acc aac gcg ggt aca gaa atc ggc gtg   1200Glu Ser Asp Leu Ala Leu Met Thr Asn Ala Gly Thr Glu Ile Gly Val385                 390                 395                 400gca tcc act aaa gca ttc acc act cag tta act gtg ctg ttg atg ctg   1248Ala Ser Thr Lys Ala Phe Thr Thr Gln Leu Thr Val Leu Leu Met Leu
            405                 410                 415gtg gcg aag ctg tct cgc ctg aaa ggt ctg gat gcc tcc att gaa cat   1296Val Ala Lys Leu Ser Arg Leu Lys Gly Leu Asp Ala Ser Ile Glu His
        420                 425                 430gac atc gtg cat ggt ctg cag gcg ctg ccg agc cgt att gag cag atg   1344Asp Ile Val His Gly Leu Gln Ala Leu Pro Ser Arg Ile Glu Gln Met
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450                 455                 460aaa cat cac gcg ctg ttc ctg agc cgt ggc gat cag tac cca atc gcg   1440Lys His His Ala Leu Phe Leu Ser Arg Gly Asp Gln Tyr Pro Ile Ala465                 470                 475                 480ctg gaa ggc gca ttg aag ttg aaa gag atc tct tac att cac gct gaa   1488Leu Glu Gly Ala Leu Lys Leu Lys Glu Ile Ser Tyr Ile His Ala Glu
            485                 490                 495gcc tac gct gct ggc gaa ctg aaa cac ggt ccg ctg gcg cta att gat   1536Ala Tyr Ala Ala Gly Glu Leu Lys His Gly Pro Leu Ala Leu Ile Asp
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530                 535                 540tat gtc ttc gcc gat cag gat gcg ggt ttt gta agt agc gat aac atg   1680Tyr Val Phe Ala Asp Gln Asp Ala Gly Phe Val Ser Ser Asp Asn Met545                 550                 555                 560cac atc atc gag atg ccg cat gtg gaa gag gtg att gca ccg atc ttc   1728His Ile Ile Glu Met Pro His Val Glu Glu Val Ile Ala Pro Ile Phe
            565                 570                 575tac acc gtt ccg ctg cag ctg ctg gct tac cat gtc gcg ctg atc aaa   1776Tyr Thr Val Pro Leu Gln Leu Leu Ala Tyr His Val Ala Leu Ile Lys
            580             585                 590ggc acc gac gtt gac cag ccg cgt aac ctg gca aaa tcg gtt acg gtt   1824Gly Thr Asp Val Asp Gln Pro Arg Asn Leu Ala Lys Ser Val Thr Val
    595                 600                 605gag taa                                                          1830Glu
610<210>22<211>609<212>PRT<213>大肠杆菌<400>22Met Cys Gly Ile Val Gly Ala Ile Ala Gln Arg Asp Val Ala Glu Ile1              5                   10                  15Leu Leu Glu Gly Leu Arg Arg Leu Glu Tyr Arg Gly Tyr Asp Ser Ala
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     35                  40                  45Leu Gly Lys Val Gln Met Leu Ala Gln Ala Ala Glu Glu His Pro Leu
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130                 135                 140Ala Val Leu Arg Ala Ile Pro Gln Leu Arg Gly Ala Tyr Gly Thr Val145                 150                 155                 160Ile Met Asp Ser Arg His Pro Asp Thr Leu Leu Ala Ala Arg Ser Gly
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        180                 185                 190Asp Gln Leu Ala Leu Leu Pro Val Thr Arg Arg Phe Ile Phe Leu Glu
    195                 200                 205G1u Gly Asp Ile Ala Glu Ile Thr Arg Arg Ser Val Asn Ile Phe Asp
210                 215                 220Lys Thr Gly Ala Glu Val Lys Arg Gln Asp Ile Glu Ser Asn Leu Gln225                 230                 235                 240Tyr Asp Ala Gly Asp Lys Gly Ile Tyr Cys His Tyr Met Gln Lys Glu
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        260                 265                 270Ser His Gly Gln Val Asp Leu Ser Glu Leu 6ly Pro Asn Ala Asp Glu
    275                 280                 285Leu Leu Ser Lys Val Glu His Ile Gln Ile Leu Ala Cys Gly Thr Ser
290                 295                 300Tyr Asn Ser Gly Met Val Ser Arg Tyr Trp Phe Glu Ser Leu Ala Gly305                 310                 315                 320Ile Pro Cys Asp Val Glu Ile Ala Ser Glu Phe Arg Tyr Arg Lys Ser
            325                 330                 335Ala Val Arg Arg Asn Ser Leu Met Ile Thr Leu Ser Gln Ser Gly Glu
        340                 345                 350Thr Ala Asp Thr Leu Ala Gly Leu Arg Leu Ser Lys Glu Leu Gly Tyr
    355                 360                 365Leu Gly Ser Leu Ala Ile Cys Asn Val Pro Gly Ser Ser Leu Val Arg
370                 375                 380Glu Ser Asp Leu Ala Leu Met Thr Asn Ala Gly Thr Glu Ile Gly Val385                 390                 395                 400Ala Ser Thr Lys Ala Phe Thr Thr Gln Leu Thr Val Leu Leu Met Leu
            405                 410                 415Val Ala Lys Leu Ser Arg Leu Lys Gly Leu Asp Ala Ser Ile Glu His
        420                 425                 430Asp Ile Val His Gly Leu Gln Ala Leu Pro Ser Arg Ile Glu Gln Met
    435                 440                 445Leu Ser Gln Asp Lys Arg Ile Glu Ala Leu Ala Glu Asp Phe Ser Asp
450                 455                 460Lys His His Ala Leu Phe Leu Ser Arg Gly Asp Gln Tyr Pro Ile Ala465                 470                 475                 480Leu Glu Gly Ala Leu Lys Leu Lys Glu Ile Ser Tyr Ile His Ala Glu
            485                 490                 495Ala Tyr Ala Ala Gly Glu Leu Lys His Gly Pro Leu Ala Leu Ile Asp
        500                 505                 510Ala Asp Met Pro Val Ile Val Val Ala Pro Asn Asn Glu Leu Leu Glu
    515                 520                 525Lys Leu Lys Ser Asn Ile Glu Glu Val Arg Ala Arg Gly Gly Gln Leu
530                 535                 540Tyr Val Phe Ala Asp Gln Asp Ala Gly Phe Val Ser Ser Asp Asn Met545                 550                 555                 560His Ile Ile Glu Met Pro His Val Glu Glu Val Ile Ala Pro Ile Phe
            565                 570                 575Tyr Thr Val Pro Leu Gln Leu Leu Ala Tyr His Val Ala Leu Ile Lys
        580                 585                 590Gly Thr Asp Val Asp Gln Pro Arg Asn Leu Ala Lys Ser Val Thr Val
    595                 600                 605Glu<210>23<211>2184<212>DNA<213>大肠杆菌<400>23ccgctctaga actagtggat ctcgatcccg cgaaattaat acgactcact ataggggaat 60tgtgagcgga taacaattcc cctctagaaa taattttgtt taactttaag aaggagatat 120accatgtgtg gaattgttgg cgcgatcgcg caacgtgatg tagcagaaat ccttcttgaa 180ggtttacgtc gtctggaata ccgcggatat gactctgccg gtctggccgt tgttgatgca 240gaaggtcata tgacccgcct gcgtcgcctc ggtaaagtcc agatgctggc acaggcagcg 300gaagaacatc ctctgcatgg cggcactggt attgctcaca ctcgctgggc gacccacggt 360gaaccttcag aagtgaatgc gcatccgcat gtttccgaac acattgtggt ggtgcataac 420ggcatcatcg aaaaccatga accgctgcgt gaagagctaa aagcgcgtgg ctataccttc 480gtttctgaaa ccgacaccga agtgattgcc catctggtga actgggagct gaaacaaggc 540gggactctgc gtgaggccgt tctgcgtgct atcccgcagc tgcgtggtgc gtacggtaca 600gtgatcatgg actcccgtca cccggatacc ctgctggcgg cacgttctgg tagtccgctg 660gtgattggcc tggggatggg cgaaaacttt atcgcttctg accagctggc gctgttgccg 720gtgacccgtc gctttatctt ccttgaagag ggcgatattg cggaaatcac tcgccgttcg 780gtaaacatct tcgataaaac tggcgcggaa gtaaaacgtc aggatatcga atccaatctg 840caatatgacg cgggcgataa aggcatttac cgtcactaca tgcagaaaga gatctacgaa 900cagccgaacg cgatcaaaaa cacccttacc ggacgcatca gccacggtca ggttgattta 960agcgagctgg gaccgaacgc cgacgaactg ctgtcgaagg ttgagcatat tcagatcctc 1020gcctgtggta cttcttataa ctccggtatg gtttcccgct actggtttga atcgctagca 1080ggtattccgt gcgacgtcga aatcgcctct gaattccgct atcgcaaatc tgccgtgcgt 1140cgtaacagcc tgatgatcac cttgtcacag tctggcgaaa ccgcggatac cctggctggc 1200ctgcgtctgt cgaaagagct gggttacctt ggttcactgg caatctgtaa cgttccgggt 1260tcttctctgg tgcgcgaatc cgatctggcg ctaatgacca acgcgggtac agaaatcggc 1320gtggcatcca ctaaagcatt caccactcag ttaactgtgc tgttgatgct ggtggcgaag 1380ctgtctcgcc tgaaaggtct ggatgcctcc attgaacatg acatcgtgca tggtctgcag 1440gcgctgccga gccgtattga gcagatgctg tctcaggaca aacgcattga agcgctggca 1500gaagatttct ctgacaaaca tcacgcgccg ttcctgggcc gtggcgatca gtacccaatc 1560gcgctggaag gcgcattgaa gttgaaagag atctcttaca ttcacgctga agcctacgct 1620gctggcgaac tgaaacacgg tccgctggcg ctaattgatg ccgatatgcc ggttattgtt 1680gttgcaccga acaacgaatt gctggaaaaa ctgaaatcca acattgaaga agttcgcgcg 1740cgtggcggtc agttgtatgt cttcgccgat caggatgcgg gttttgtaag tagcgataac 1800atgcacatca tcgagatgcc gcatgtggaa gaggtgattg caccgatctt ctacaccgtt 1860ccgctgcagc tgctggctta ccatgtcgcg ctgatcaaag gcaccgacgt tgaccagccg 1920cgtaacctgg caaaatcggt tacggttgag taataaatgg atgccctgcg taagcggggc 1980atttttcttc ctgttatgtt tttaatcaaa catcctgcca actccatgtg acaaaccgtc 2040atcttcggct actttttctc tgtcacagaa tgaaaatttt tctgtcatct cttcgttatt 2100aatgtttgta attgactgaa tatcaacgct ctagaggggc tagagcggcc accaccgcgg 2160tggagctccg tcgacaagct tatc                                         2184<210>24<211>1830<212>DNA<213>大肠杆菌<220><221>CDS<222>(1)..(1830)<400>24atg tgt gga att gtt ggc gcg atc gcg caa cgt gat gta gca gaa atc   48Met Cys Gly Ile Val Gly Ala Ile Ala Gln Arg Asp Val Ala Glu Ile1              5                   10                  15ctt ctt gaa ggt tta cgt cgt ctg gaa tac cgc gga tat gac tct gcc   96Leu Leu Glu Gly Leu Arg Arg Leu Glu Tyr Arg Gly Tyr Asp Ser Ala
         20                  25                  30ggt ctg gcc gtt gtt gat gca gaa ggt cat atg acc cgc ctg cgt cgc   144Gly Leu Ala Val Val Asp Ala Glu Gly His Met Thr Arg Leu Arg Arg
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 50                  55                  60cat ggc ggc act ggt att gct cac act cgc tgg gcg acc cac ggt gaa   240His Gly Gly Thr Gly Ile Ala His Thr Arg Trp Ala Thr His Gly Glu65                  70                  75                  80cct tca gaa gtg aat gcg cat ccg cat gtt tcc gaa cac att gtg gtg   288Pro Ser Glu Val Asn Ala His Pro His Val Set Glu His Ile Val Val
             85                  90                  95gtg cat aac ggc atc atc gaa aac cat gaa ccg ctg cgt gaa gag cta   336Val His Asn Gly Ile Ile Glu Asn His Glu Pro Leu Arg Glu Glu Leu
        100                 105                 110aaa gcg cgt ggc tat acc ttc gtt tct gaa acc gac acc gaa gtg att   384Lys Ala Arg Gly Tyr Thr Phe Val Ser Glu Thr Asp Thr Glu Val Ile
    115                 120                 125gcc cat ctg gtg aac tgg gag ctg aaa caa ggc ggg act ctg cgt gag   432Ala His Leu Val Asn Trp Glu Leu Lys Gln Gly Gly Thr Leu Arg Glu
130                 135                 140gcc gtt ctg cgt gct atc ccg cag ctg cgt ggt gcg tac ggt aca gtg   480Ala Val Leu Arg Ala Ile Pro Gln Leu Arg Gly Ala Tyr Gly Thr Val145                 150                 155                 160atc atg gac tcc cgt cac ccg gat acc ctg ctg gcg gca cgt tct ggt   528Ile Met Asp Ser Arg His Pro Asp Thr Leu Leu Ala Ala Arg Ser Gly
            165                 170             175agt ccg ctg gtg att ggc ctg ggg atg ggc gaa aac ttt atc gct tct   576Ser Pro Leu Val Ile GIy Leu Gly Met Gly Glu Asn Phe Ile Ala Ser
        180                 185                 190gac cag ctg gcg ctg ttg ccg gtg acc cgt cgc ttt atc ttc ctt gaa   624Asp Gln Leu Ala Leu Leu Pro Val Thr Arg Arg Phe Ile Phe Leu Glu
    195                 200                 205gag ggc gat att gcg gaa atc act cgc cgt tcg gta aac atc ttc gat   672Glu Gly Asp Ile Ala Glu Ile Thr Arg Arg Ser Val Asn Ile Phe Asp
210                 215                 220aaa act ggc gcg gaa gta aaa cgt cag gat atc gaa tcc aat ctg caa   720Lys Thr Gly Ala Glu Val Lys Arg Gln Asp Ile Glu Ser Asn Leu Gln225                 230                 235                 240tat gac gcg ggc gat aaa ggc att tac cgt cac tac atg cag aaa gag   768Tyr Asp Ala Gly Asp Lys Gly Ile Tyr Arg His Tyr Met Gln Lys Glu
            245                 250                 255atc tac gaa cag ccg aac gcg atc aaa aac acc ctt acc gga cgc atc   816Ile Tyr Glu Gln Pro Asn Ala Ile Lys Asn Thr Leu Thr Gly Arg Ile
        260                 265                 270agc cac ggt cag gtt gat tta agc gag ctg gga ccg aac gcc gac gaa   864Ser His Gly Gln Val Asp Leu Ser Glu Leu Gly Pro Asn Ala Asp Glu
    275                 280                 285ctg ctg tcg aag gtt gag cat att cag atc ctc gcc tgt ggt act tct   912Leu Leu Ser Lys Val Glu His Ile Gln Ile Leu Ala Cys Gly Thr Ser
290                 295                 300tat aac tcc ggt atg gtt tcc cgc tac tgg ttt gaa tcg cta gca ggt   960Tyr Asn Ser Gly Met Val Ser Arg Tyr Trp Phe Glu Ser Leu Ala Gly305                 310                 315                 320att ccg tgc gac gtc gaa atc gcc tct gaa ttc cgc tat cgc aaa tct   1008Ile Pro Cys Asp Val Glu Ile Ala Ser Glu Phe Arg Tyr Arg Lys Ser
            325                 330                 335gcc gtg cgt cgt aac agc ctg atg atc acc ttg tca cag tct ggc gaa   1056Ala Val Arg Arg Asn Ser Leu Met Ile Thr Leu Ser Gln Ser Gly Glu
        340                 345                 350acc gcg gat acc ctg gct ggc ctg cgt ctg tcg aaa gag ctg ggt tac   1104Thr Ala Asp Thr Leu Ala Gly Leu Arg Leu Ser Lys Glu Leu Gly Tyr
    355                 360                 365ctt ggt tca ctg gca atc tgt aac gtt ccg ggt tct tct ctg gtg cgc   1152Leu Gly Ser Leu Ala Ile Cys Asn Val Pro Gly Ser Ser Leu Val Arg
370                 375                 380gaa tcc gat ctg gcg cta atg acc aac gcg ggt aca gaa atc ggc gtg   1200Glu Ser Asp Leu Ala Leu Met Thr Asn Ala Gly Thr Glu Ile Gly Val385                 390                 395                 400gca tcc act aaa gca ttc acc act cag tta act gtg ctg ttg atg ctg   1248Ala Ser Thr Lys Ala Phe Thr Thr Gln Leu Thr Val Leu Leu Met Leu
            405                 410                 415gtg gcg aag ctg tct cgc ctg aaa ggt ctg gat gcc tcc att gaa cat   1296Val Ala Lys Leu Ser Arg Leu Lys Gly Leu Asp Ala Ser Ile Glu His
        420                 425                 430gac atc gtg cat ggt ctg cag gcg ctg ccg agc cgt att gag cag atg   1344Asp Ile Val His Gly Leu Gln Ala Leu Pro Ser Arg Ile Glu Gln Met
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450                 455                 460aaa cat cac gcg ccg ttc ctg ggc cgt ggc gat cag tac cca atc gcg   1440Lys His His Ala Pro Phe Leu Gly Arg Gly Asp Gln Tyr Pro Ile Ala465                 470                 475                 480ctg gaa ggc gca ttg aag ttg aaa gag atc tct tac att cac gct gaa   1488Leu Glu Gly Ala Leu Lys Leu Lys Glu Ile Ser Tyr Ile His Ala Glu
            485                 490                 495gcc tac gct gct ggc gaa ctg aaa cac ggt ccg ctg gcg cta att gat   1536Ala Tyr Ala Ala Gly Glu Leu Lys His Gly Pro Leu Ala Leu Ile Asp
        500                 505                 510gcc gat atg ccg gtt att gtt gtt gca ccg aac aac gaa ttg ctg gaa   1584Ala Asp Met Pro Val Ile Val Val Ala Pro Asn Asn Glu Leu Leu Glu
    515                 520                 525aaa ctg aaa tcc aac att gaa gaa gtt cgc gcg cgt ggc ggt cag ttg   1632Lys Leu Lys Ser Asn Ile Glu Glu Val Arg Ala Arg Gly Gly Gln Leu
530                 535                 540tat gtc ttc gcc gat cag gat gcg ggt ttt gta agt agc gat aac atg   1680Tyr Val Phe Ala Asp Gln Asp Ala Gly Phe Val Ser Ser Asp Asn Met545                 550                 555                 560cac atc atc gag atg ccg cat gtg gaa gag gtg att gca ccg atc ttc   1728His Ile Ile Glu Met Pro His Val Glu Glu Val Ile Ala Pro Ile Phe
            565                 570                 575tac acc gtt ccg ctg cag ctg ctg gct tac cat gtc gcg ctg atc aaa   1776Tyr Thr Val Pro Leu Gln Leu Leu Ala Tyr His Val Ala Leu Ile Lys
        580                 585                 590ggc acc gac gtt gac cag ccg cgt aac ctg gca aaa tcg gtt acg gtt   1824Gly Thr Asp Val Asp Gln Pro Arg Asn Leu Ala Lys Ser Val Thr Val
    595                 600                 605gag taa                                                             1830Glu
610<210>25<211>609<212>PRT<213>大肠杆菌<400>25Met Cys Gly lle Val Gly Ala Ile Ala Gln Arg Asp Val Ala Glu Ile1              5                   l0                  15Leu Leu Glu Gly Leu Arg Arg Leu Glu Tyr Arg Gly Tyr Asp Ser Ala
        20                  25                   30Gly Leu Ala Val Val Asp Ala Glu Gly His Met Thr Arg Leu Arg Arg
     35                  40                  45Leu Gly Lys Val Gln Met Leu Ala Gln Ala Ala Glu Glu His Pro Leu
 50                  55                  60His Gly Gly Thr Gly Ile Ala His Thr Arg Trp Ala Thr His Gly Glu65                  70                  75                  80Pro Ser Glu Val Asn Ala His Pro His Val Ser Glu His Ile Val Val
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    115                 120                 125Ala His Leu Val Asn Trp Glu Leu Lys Gln Gly Gly Thr Leu Arg Glu
130                 135                 140Ala Val Leu Arg Ala Ile Pro Gln Leu Arg Gly Ala Tyr Gly Thr Val145                 150                 155                 160Ile Met Asp Ser Arg His Pro Asp Thr Leu Leu Ala Ala Arg Ser Gly
            165                 170                 175Ser Pro Leu Val Ile Gly Leu Gly Met Gly Glu Asn Phe Ile Ala Ser
        180                 185                 190Asp Gln Leu Ala Leu Leu Pro Val Thr Arg Arg Phe Ile Phe Leu Glu
    195                 200                 205Glu Gly Asp Ile Ala Glu Ile Thr Arg Arg Ser Val Asn Ile Phe Asp
210                 215                 220Lys Thr Gly Ala Glu Val Lys Arg Gln Asp Ile Glu Ser Asn Leu Gln225                 230                 235                 240Tyr Asp Ala Gly Asp Lys Gly Ile Tyr Arg His Tyr Met Gln Lys Glu
            245                 250                 255Ile Tyr Glu Gln Pro Asn Ala Ile Lys Asn Thr Leu Thr Gly Arg Ile
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    275                 280                 285Leu Leu Ser Lys Val Glu His Ile Gln Ile Leu Ala Cys Gly Thr Ser
290                 295                 300Tyr Asn Ser Gly Met Val Ser Arg Tyr Trp Phe Glu Ser Leu Ala Gly305                 310                 315                 320Ile Pro Cys Asp Val Glu Ile Ala Ser Glu Phe Arg Tyr Arg Lys Ser
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        340                 345                 350Thr Ala Asp Thr Leu Ala Gly Leu Arg Leu Ser Lys Glu Leu Gly Tyr
    355                 360                 365Leu Gly Ser Leu Ala Ile Cys Asn Val Pro Gly Ser Ser Leu Val Arg
370                 375                 380Glu Ser Asp Leu Ala Leu Met Thr Asn Ala Gly Thr Glu Ile GGly Val385                 390                 395                  400Ala Ser Thr Lys Ala Phe Thr Thr Gln Leu Thr Val Leu Leu Met Leu
            405                 410                 415Val Ala Lys Leu Ser Arg Leu Lys Gly Leu Asp Ala Ser Ile Glu His
        420                 425                 430Asp Ile Val His Gly Leu Gln Ala Leu Pro Ser Arg Ile Glu Gln Met
    435                  440                 445Leu Ser Gln Asp Lys Arg Ile Glu Ala Leu Ala Glu Asp Phe Ser Asp
450                 455                 460Lys His His Ala Pro Phe Leu Gly Arg Gly Asp Gln Tyr Pro Ile Ala465                 470                 475                 480Leu Glu Gly Ala Leu Lys Leu Lys Glu Ile Ser Tyr Ile His Ala Glu
            485                 490                 495Ala Tyr Ala Ala Gly Glu Leu Lys His Gly Pro Leu Ala Leu Ile Asp
        500                 505                 510Ala Asp Met Pro Val Ile Val Val Ala Pro Asn Asn Glu Leu Leu Glu
    515                 520                 525Lys Leu Lys Ser Asn Ile Glu Glu Val Arg Ala Arg Gly Gly Gln Leu
530                 535                 540Tyr Val Phe Ala Asp Gln Asp Ala Gly Phe Val Ser Ser Asp Asn Met545                 550                 555                 560His Ile Ile Glu Met Pro His Val Glu Glu Val lle Ala Pro Ile Phe
            565                 570                 575Tyr Thr Val Pro Leu Gln Leu Leu Ala Tyr His Val Ala Leu Ile Lys
        580                 585                 590Gly Thr Asp Val Asp Gln Pro Arg Asn Leu Ala Lys Ser Val Thr Val
    595                 600                 605Glu<210>26<211>2184<212>DNA<213>大肠杆菌<400>26ccgctctaga actagtggat ctcgatcccg cgaaattaat acgactcact ataggggaat 60tgtgagcgga taacaattcc cctctagaaa taattttgtt taactttaag aaggagatat 120accatgtgtg gaattgttgg cgcgatcgcg caacgtgatg tagcagaaat ccttcttgaa 180ggtttacgtc gtctggaata ccgcggatat gactctgccg gtctggccgt tgttgatgca 240gaaggtcata tgacccgcct gcgtcgcctc ggtaaagtcc agatgctggc acaggcagcg 300gaagaacatc ctctgcatgg cggcactggt attgctcaca ctcgctgggc gacccacggt 360gaaccttcag aagtgaatgc gcatccgcat gtttctgaac acattgtggt ggtgcataac 420ggcatcatcg aaaaccatga accgctgcgt gaagagctaa aagcgcgtgg ctataccttc 480gtttctgaaa ccgacaccga agtgattgcc catctggtga actgggagct gaaacaaggc 540gggactctgc gtgaggccgt tctgcgtgct atcccgcagc tgcgtggtgc gtacggtaca 600gtgatcatgg actcccgtca cccggatacc ctgctggcgg cacgttctgg tagtccgctg 660gtgattggcc tggggatggg cgaaaacttt atcgcttctg accagctggc gctgttgccg 720gtgacccgtc gctttatctt ccttgaagag ggcgatattg cggaaatcac tcgccgttcg 780gtaaacatct tcgataaaac tggcgcggaa gtaaaacgtc aggatatcga atccaatctg 840caatatgacg cgggcgataa aggcatttac cgtcactaca tgcagaaaga gatctacgaa 900cagccgaacg cgatcaaaaa cacccttacc ggacgcatca gccacggtca ggttgattta 960agcgagctgg gaccgaacgc cgacgaactg ctgtcgaagg ttgagcatat tcagatcctc 1020gcctgtggta cttcttataa ctccggtatg gtttcccgct actggtttga atcgctagca 1080ggtattccgt gcgacgtcga aatcgcctct gaattccgct atcgcaaatc tgccgtgcgt 1140cgtaacagcc tgatgatcac cttgtcacag tctggcgaaa ccgcggatac cctggctggc 1200ctgcgtctgt cgaaagagct gggttacctt ggttcactgg caatctgtaa cgttccgggt 1260tcttctctgg tgcgcgaatc cgatctggcg ctaatgacca acgcgggtac agaaatcggc 1320gtggcatcca ctaaagcatt caccactcag ttaactgtgc tgttgatgct ggtggcgaag 1380ctgtctcgcc tgaaaggtct ggatgcctcc attgaacatg acatcgtgca tggtctgcag 1440gcgctgccga gccgtattga gcagatgctg tctcaggaca aacgcattga agcgctggca 1500gaagatttct ctgacaaaca tcacgcgctg ttcctgagcc gtggcgatca gtacccaatc 1560gcgctggaag gcgcattgaa gttgaaagag atctcttaca ttcacgctga agcctacgct 1620gctggcgaac tgaaacacgg tccgctggcg ctaattgatg ccgatatgcc ggttattgtt 1680gttgcaccga acaacgaatt gctggaaaaa ctgaaatcca acattgaaga agttcgcgcg 1740cgtggcggtc agttgtatgt cttcgccgat caggatgcgg gttttgtaag tagcgataac 1800atgcacatca tcgagatgcc gcatgtggaa gaggtgattg caccgatctt ctacaccgtt 1860ccgctgcagc tgctggctta ccatgtcgcg ctgatcaaag gcaccgacgt tgaccagccg 1920cgtaacctgg caaaatcggt tacggttgag taataaatgg atgccctgcg taagcggggc 1980atttttcttc ctgttatgtt tttaatcaaa catcctgcca actccatgtg acaaaccgtc 2040atcttcggct actttttctc tgtcacagaa tgaaaatttt tctgtcatct cttcgttatt 2100aatgtttgta attgactgaa tatcaacgct ctaggggggc tagagcggcc gccaccgcgg 2160tggagctccg tcgacaagct tatc                                        2184<210>27<211>1830<212>DNA<213>大肠杆菌<220><221>CDS<222>(1)..(1830)<400>27atg tgt gga att gtt ggc gcg atc gcg caa cgt gat gta gca gaa atc   48Met Cys Gly Ile Val Gly Ala Ile Ala Gln Arg Asp Val Ala Glu Ile1              5                   10                  15ctt ctt gaa ggt tta cgt cgt ctg gaa tac cgc gga tat gac tct gcc   96Leu Leu Glu Gly Leu Arg Arg Leu Glu Tyr Arg Gly Tyr Asp Ser Ala
         20                  25                  30ggt ctg gcc gtt gtt gat gca gaa ggt cat atg acc cgc ctg cgt cgc   144Gly Leu Ala Val Val Asp Ala Glu Gly His Met Thr Arg Leu Arg Arg
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 50                  55                  60cat ggc ggc act ggt att gct cac act cgc tgg gcg acc cac ggt gaa   240His Gly Gly Thr Gly Ile Ala His Thr Arg Trp Ala Thr His Gly Glu65                  70                  75                   80cct tca gaa gtg aat gcg cat ccg cat gtt tct gaa cac att gtg gtg   288Pro Ser Glu Val Asn Ala His Pro His Val Ser Glu His Ile Val Val
             85                  90                  95gtg cat aac ggc atc atc gaa aac cat gaa ccg ctg cgt gaa gag cta   336Val His Asn Gly Ile Ile Glu Asn His Glu Pro Leu Arg Glu Glu Leu
        100                 105                 110aaa gcg cgt ggc tat acc ttc gtt tct gaa acc gac acc gaa gtg att   384Lys Ala Arg Gly Tyr Thr Phe Val Ser Glu Thr Asp Thr Glu Val Ile
    115                 120                 125gcc cat ctg gtg aac tgg gag ctg aaa caa ggc ggg act ctg cgt gag   432Ala His Leu Val Asn Trp Glu Leu Lys Gln Gly Gly Thr Leu Arg Glu
130                 135                 140gcc gtt ctg cgt gct atc ccg cag ctg cgt ggt gcg tac ggt aca gtg   480Ala Val Leu Arg Ala Ile Pro Gln Leu Arg Gly Ala Tyr Gly Thr Val145                 150                 155                 160atc atg gac tcc cgt cac ccg gat acc ctg ctg gcg gca cgt tct ggt   528Ile Met Asp Ser Arg His Pro Asp Thr Leu Leu Ala Ala Arg Ser Gly
            165                 170                 175agt ccg ctg gtg att ggc ctg ggg atg ggc gaa aac ttt atc gct tct   576Ser Pro Leu Val Ile Gly Leu Gly Met Gly Glu Asn Phe Ile Ala Ser
        180                 185                 190gac cag ctg gcg ctg ttg ccg gtg acc cgt cgc ttt atc ttc ctt gaa   624Asp Gln Leu Ala Leu Leu Pro Val Thr Arg Arg Phe Ile Phe Leu Glu
    195                 200                 205gag ggc gat att gcg gaa atc act cgc cgt tcg gta aac atc ttc gat   672Glu Gly Asp Ile Ala Glu Ile Thr Arg Arg Ser Val Asn Ile Phe Asp
210                 215                 220aaa act ggc gcg gaa gta aaa cgt cag gat atc gaa tcc aat ctg caa   720Lys Thr Gly Ala Glu Val Lys Arg Gln Asp Ile Glu Ser Asn Leu Gln225                 230                 235                 240tat gac gcg ggc gat aaa ggc att tac cgt cac tac atg cag aaa gag   768Tyr Asp Ala Gly Asp Lys Gly Ile Tyr Arg His Tyr Met Gln Lys Glu
            245                 250                 255atc tac gaa cag ccg aac gcg atc aaa aac acc ctt acc gga cgc atc   816Ile Tyr Glu Gln Pro Asn Ala Ile Lys Asn Thr Leu Thr Gly Arg Ile
        260                 265                 270agc cac ggt cag gtt gat tta agc gag ctg gga ccg aac gcc gac gaa   864Ser His Gly Gln Val Asp Leu Ser Glu Leu Gly Pro Asn Ala Asp Glu
    275                 280                 285ctg ctg tcg aag gtt gag cat att cag atc ctc gcc tgt ggt act tct   912Leu Leu Ser Lys Val Glu His Ile Gln Ile Leu Ala Cys Gly Thr Ser
290                 295                 300tat aac tcc ggt atg gtt tcc cgc tac tgg ttt gaa tcg cta gca ggt   960Tyr Asn Ser Gly Met Val Ser Arg Tyr Trp Phe Glu Ser Leu Ala Gly305                 310                 315                 320att ccg tgc gac gtc gaa atc gcc tct gaa ttc cgc tat cgc aaa tct   1008Ile Pro Cys Asp Val Glu Ile Ala Ser Glu Phe Arg Tyr Arg Lys Ser
            325                 330                 335gcc gtg cgt cgt aac agc ctg atg atc acc ttg tca cag tct ggc gaa   1056Ala Val Arg Arg Asn Ser Leu Met Ile Thr Leu Ser Gln Ser Gly Glu
        340                 345                 350acc gcg gat acc ctg gct ggc ctg cgt ctg tcg aaa gag ctg ggt tac   1104Thr Ala Asp Thr Leu Ala Gly Leu Arg Leu Ser Lys Glu Leu Gly Tyr
    355                 360                 365ctt ggt tca ctg gca atc tgt aac gtt ccg ggt tct tct ctg gtg cgc   1152Leu Gly Ser Leu Ala Ile Cys Asn Val Pro Gly Ser Ser Leu Val Arg
370                 375                 380gaa tcc gat ctg gcg cta atg acc aac gcg ggt aca gaa atc ggc gtg   1200Glu Ser Asp Leu Ala Leu Met Thr Asn Ala Gly Thr Glu Ile Gly Val385                 390                 395                 400gca tcc act aaa gca ttc acc act cag tta act gtg ctg ttg atg ctg   1248Ala Ser Thr Lys Ala Phe Thr Thr Gln Leu Thr Val Leu Leu Met Leu
            405                 410                 415gtg gcg aag ctg tct cgc ctg aaa ggt ctg gat gcc tcc att gaa cat   1296Val Ala Lys Leu Ser Arg Leu Lys Gly Leu Asp Ala Ser Ile Glu His
        420                 425                 430gac atc gtg cat ggt ctg cag gcg ctg ccg agc cgt att gag cag atg   1344Asp Ile Val His Gly Leu Gln Ala Leu Pro Ser Arg Ile Glu Gln Met
    435                 440                 445ctg tct cag gac aaa cgc att gaa gcg ctg gca gaa gat ttc tct gac   1392Leu Ser Gln Asp Lys Arg Ile Glu Ala Leu Ala Glu Asp Phe Ser Asp
450                 455                 460aaa cat cac gcg ctg ttc ctg agc cgt ggc gat cag tac cca atc gcg   1440Lys His His Ala Leu Phe Leu Ser Arg Gly Asp Gln Tyr Pro Ile Ala465                 470                 475                 480ctg gaa ggc gca ttg aag ttg aaa gag atc tct tac att cac gct gaa   1488Leu Glu GIy Ala Leu Lys Leu Lys Glu Ile Ser Tyr Ile His Ala Glu
            485                 490                 495gcc tac gct gct ggc gaa ctg aaa cac ggt ccg ctg gcg cta att gat   1536Ala Tyr Ala Ala Gly Glu Leu Lys His Gly Pro Leu Ala Leu Ile Asp
        500                 505                 510gcc gat atg ccg gtt att gtt gtt gca ccg aac aac gaa ttg ctg gaa   1584Ala Asp Met Pro Val Ile Val Val Ala Pro Asn Asn Glu Leu Leu Glu
    515                 520                 525aaa ctg aaa tcc aac att gaa gaa gtt cgc gcg cgt ggc ggt cag ttg   1632Lys Leu Lys Ser Asn Ile Glu Glu Val Arg Ala Arg Gly Gly Gln Leu
530                 535                 540tat gtc ttc gcc gat cag gat gcg ggt ttt gta agt agc gat aac atg   1680Tyr Val Phe Ala Asp Gln Asp Ala Gly Phe Val Ser Ser Asp Asn Met545                 550                 555                 560cac atc atc gag atg ccg cat gtg gaa gag gtg att gca ccg atc ttc   1728His Ile Ile Glu Met Pro His Val Glu Glu Val Ile Ala Pro Ile Phe
            565                 570                 575tac acc gtt ccg ctg cag ctg ctg gct tac cat gtc gcg ctg atc aaa   1776Tyr Thr Val Pro Leu Gln Leu Leu Ala Tyr His Val Ala Leu Ile Lys
        580                 585                 590ggc acc gac gtt gac cag ccg cgt aac ctg gca aaa tcg gtt acg gtt   1824Gly Thr Asp Val Asp Gln Pro Arg Asn Leu Ala Lys Ser Val Thr Val
    595                 600                 605gag taa                                                             1830Glu
610<210>28<211>609<212>PRT<213>大肠杆菌<400>28Met Cys Gly Ile Val Gly Ala Ile Ala Gln Arg Asp Val Ala Glu Ile1              5                   10                  15Leu Leu Glu Gly Leu Arg Arg Leu Glu Tyr Arg Gly Tyr Asp Ser Ala
         20                  25                  30Gly Leu Ala Val Val Asp Ala Glu Gly His Met Thr Arg Leu Arg Arg
     35                  40                  45Leu Gly Lys Val Gln Met Leu Ala Gln Ala Ala Glu Glu His Pro Leu
 50                  55                     60His Gly Gly Thr Gly Ile Ala His Thr Arg Trp Ala Thr His Gly Glu65                 70                   75                  80Pro Ser Glu Val Asn Ala His Pro His Val Ser Glu His Ile Val Val
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        100                 105                 110Lys Ala Arg Gly Tyr Thr Phe Val Ser Glu Thr Asp Thr Glu ValIle
    115                 120                 125Ala His Leu Va1 ASn Trp Glu Leu Lys Gln Gly Gly Thr Leu Arg Glu
130                 135                 140Ala Val Leu Arg Ala Ile Pro Gln Leu Arg Gly Ala Tyr Gly Thr Val145                 150                 155                 160Ile Met Asp Ser Arg His Pro Asp Thr Leu Leu Ala Ala Arg Ser Gly
            165                 170                 175Ser Pro Leu Val Ile Gly Leu Gly Met Gly Glu Asn Phe Ile Ala Ser
        180                 185                 190Asp Gln Leu Ala Leu Leu Pro Val Thr Arg Arg Phe Ile Phe Leu Glu
    195                 200                 205Glu Gly Asp Ile Ala Glu Ile Thr Arg Arg Ser Val Asn Ile Phe Asp
210                 215                 220Lys Thr Gly Ala Glu Val Lys Arg Gln Asp Ile Glu Ser Asn Leu Gln225                 230                 235                 240Tyr Asp Ala Gly Asp Lys Gly Ile Tyr Arg His Tyr Met Gln Lys Glu
            245                 250                 255Ile Tyr Glu Gln Pro Asn Ala Ile Lys Asn Thr Leu Thr Gly Arg Ile
        260                 265                 270Ser His Gly Gln Val Asp Leu Ser Glu Leu Gly Pro Asn Ala Asp Glu
    275                 280                 285Leu Leu Ser Lys Val Glu His Ile Gln Ile Leu Ala Cys Gly Thr Ser
290                 295                 300Tyr Asn Ser Gly Met Val Ser Arg Tyr Trp Phe Glu Ser Leu Ala Gly305                 310                 315                 320Ile Pro Cys Asp Val Glu Ile Ala Ser Glu Phe Arg Tyr Arg Lys Ser
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    355                 360                 365Leu Gly Ser Leu Ala Ile Cys Asn Val Pro Gly Ser Ser Leu Val Arg
370                 375                 380Glu Ser Asp Leu Ala Leu Met Thr Asn Ala Gly Thr Glu Ile Gly Val385                 390                 395                 400Ala Ser Thr Lys Ala Phe Thr Thr Gln Leu Thr Val Leu Leu Met Leu
            405                 410                 415Val Ala Lys Leu Ser Arg Leu Lys Gly Leu Asp Ala Ser lle Glu His
        420                 425                 430Asp Ile Val His Gly Leu Gln Ala Leu Pro Ser Arg Ile Glu Gln Met
    435                 440                 445Leu Ser Gln Asp Lys Arg Ile Glu Ala Leu Ala Glu Asp Phe Ser Asp
450                 455                 460Lys His His Ala Leu Phe Leu Ser Arg Gly Asp Gln Tyr Pro Ile Ala465                 470                 475                 480Leu Glu Gly Ala Leu Lys Leu Lys Glu Ile Ser Tyr Ile His Ala Glu
            485                 490                 495Ala Tyr Ala Ala Gly Glu Leu Lys His Gly Pro Leu Ala Leu Ile Asp
        500                 505                 510Ala Asp Met Pro Val Ile Val Val Ala Pro Asn Asn Glu Leu Leu Glu
    515                 520                 525Lys Leu Lys Ser Asn Ile Glu Glu Val Arg Ala Arg Gly Gly Gln Leu
530                 535                 540Tyr Val Phe Ala Asp Gln Asp Ala Gly Phe Val Ser Ser Asp Asn Met545                 550                 555                 560His Ile Ile Glu Met Pro His Val Glu Glu Val Ile Ala Pro Ile Phe
            565                 570                 575Tyr Thr Val Pro Leu Gln Leu Leu Ala Tyr His Val Ala Leu Ile Lys
        580                 585                 590Gly Thr Asp Val Asp Gln Pro Arg Asn Leu Ala Lys Ser Val Thr Val
    595                 600                 605Glu<210>29<211>2184<212>DNA<213>大肠杆菌<400>29ccgctctaga actagtggat ctcgatcccg cgaaattaat acgactcact ataggggaat 60tgtgagcgga taacaattcc cctctagaaa taattttgtt taactttaag aaggagatat 120accatgtgtg gaattgttgg cgcgatcgcg caacgtgatg tagcagaaat ccttcttgaa 180ggtttacgtc gtctggaata ccgcggatat gactctgccg gtctggccgt tgttgatgca 240gaaggtcata tgacccgcct gcgtcgcctc ggtaaagtcc agatgctggc acaggcagcg 300gaagaacatc ctctgcatgg cggcactggt attgctcaca ctcgctgggc gacccacggt 360gaaccttcag aagtgaatgc gcatccgcat gtttctgaac acattgtggt ggtgcataac 420ggcatcatcg aaaaccatga accgctgcgt gaagagctaa aagcgcgtgg ctataccttc 480gtttctgaaa ccgacaccga agtgattgcc catctggtga actgggagct gaaacaaggc 540gggactctgc gtgaggccgt tctgcgtgct atcccgcagc tgcgtggtgc gtacggtaca 600gtgatcatgg actcccgtca cccggatacc ctgctggcgg cacgttctgg tagtccgctg 660gtgattggcc tggggatggg cgaaaacttt atcgcttctg accagctggc gctgttgccg 720gtgacccgtc gctttatctt ccttgaagag ggcgatattg cggaaatcac tcgccgttcg 780gtaaacatct tcgataaaac tggcgcggaa gtaaaacgtc aggatatcga atccaatctg 840caatatgacg cgggcgataa aggcatttac cgtcactaca tgcagaaaga gatctacgaa 900cagccgaacg cgatcaaaaa cacccttacc ggacgcatca gccacggtca ggttgattta 960agcgagctgg gaccgaacgc cgacgaactg ctgtcgaagg ttgagcatat tcagatcctc 1020gcctgtggta cttcttataa ctccggtatg gtttcccgct actggtttga atcgctagca 1080ggtattccgt gcgacgtcga aatcgcctct gaattccgct atcgcaaatc tgccgtgcgt 1140cgtaacagcc tgatgatcac cttgtcacag tctggcgaaa ccgcggatac cctggctggc 1200ctgcgtctgt cgaaagagct gggttacctt ggttcactgg caatctgtaa cgttccgggt 1260tcttctctgg tgcgcgaatc cgatctggcg ctaatgacca acgcgggtac agaaatcggc 1320gtggcatcca ctaaagcatt caccactcag ttaactgtgc tgttgatgct ggtggcgaag 1380ctgtctcgcc tgaaaggtct ggatgcctcc attgaacatg acatcgtgca tggtctgcag 1440gcgctgccga gccgtattga gcagatgctg tctcaggaca aacgcattga agcgctggca 1500gaagatttct ctgacaaaca tcacgcgctg ttcctgagcc gtggcgatca gtacccaatc 1560gcgctggaag gcgcattgaa gttgaaagag atctcttaca ttcacgctga agcctacgct 1620gctggcgaac tgaaacacgg tccgctggcg ctaattgatg ccgatatgcc ggttattgtt 1680gttgcaccga acaacgaatt gctggaaaaa ctgaaatcca acattgaaga agttcgcgcg 1740cgtggcggtc agttgtatgt cttcgccgat caggatgcgg gttttgtaag tagcgataac 1800atgcacatca tcgagatgcc gcatgtggaa gaggtgattg caccgatctt ctacaccgtt 1860ccgctgcagc tgctggctta ccatgtcgcg ctgatcaaag gcaccgacgt tgaccagccg 1920cgtaacctgg caaaatcggt tacggttgag taataaatgg atgccctgcg taagcggggc 1980atttttcttc ctgttatgtt tttaatcaaa catcctgcca actccatgtg acaaaccgtc 2040atcttcggct actttttctc tgtcacagaa tgaaaatttt tctgtcatct cttcgttatt 2100aatgtttgta attgactgaa tatcaacgct ctaggggggc tagagcggcc gccaccgcgg 2160tggagctccg tcgacaagct tatc                                        2184<210>30<211>1830<212>DNA<213>大肠杆菌<220><221>CDS<222>(1)..(1830)<400> 30atg tgt gga att gtt ggc gcg atc gcg caa cgt gat gta gca gaa atc   48Met Cys Gly Ile Val Gly Ala Ile Ala Gln Arg Asp Val Ala Glu Ile1              5                   10                  15ctt ctt gaa ggt tta cgt cgt ctg gaa tac cgc gga tat gac tct gcc   96Leu Leu Glu Gly Leu Arg Arg Leu Glu Tyr Arg Gly Tyr Asp Ser Ala
         20                  25                  30ggt ctg gcc gtt gtt gat gca gaa ggt cat atg acc cgc ctg cgt cgc   144Gly Leu Ala Val Val Asp Ala Glu Gly His Met Thr Arg Leu Arg Arg
         35              40                  45ctc ggt aaa gtc cag atg ctg gca cag gca gcg gaa gaa cat cct ctg   192Leu Gly Lys Val Gln Met Leu Ala Gln Ala Ala Glu Glu His Pro Leu
 50                  55                  60cat ggc ggc act ggt att gct cac act cgc tgg gcg acc cac ggt gaa   240His Gly Gly Thr Gly Ile Ala His Thr Arg Trp Ala Thr His Gly Glu65                  70                  75                  80cct tca gaa gtg aat gcg cat ccg cat gtt tct gaa cac att gtg gtg   288Pro Ser Glu Val Asn Ala His Pro His Val Ser Glu His Ile Val Val
             85                  90                  95gtg cat aac ggc atc atc gaa aac cat gaa ccg ctg cgt gaa gag cra   336Val His Asn Gly Ile Ile Glu Asn His Glu Pro Leu Arg Glu Glu Leu
        100                 105                 110aaa gcg cgt ggc tat acc ttc gtt tct gaa acc gac acc gaa gtg att   384Lys Ala Arg Gly Tyr Thr Phe Val Ser Glu Thr Asp Thr Glu Val Ile
    115                 120                 125gcc cat ctg gtg aac tgg gag ctg aaa caa ggc ggg act ctg cgt gag   432Ala His Leu Val Asn Trp Glu Leu Lys Gln Gly Gly Thr Leu Arg Glu
130                 135                 140gcc gtt ctg cgt gct atc ccg cag ctg cgt ggt gcg tac ggt aca gtg   480Ala Val Leu Arg Ala Ile Pro Gln Leu Arg Gly Ala Tyr Gly Thr Val145                 150                 155                 160atc atg gac tcc cgt cac ccg gat acc ctg ctg gcg gca cgt tct ggt   528Ile Met Asp Ser Arg His Pro Asp Thr Leu Leu Ala Ala Arg Ser Gly
            165                 170                 175agt ccg ctg gtg att ggc ctg ggg atg ggc gaa aac ttt atc gct tct   576Ser Pro Leu Val Ile Gly Leu Gly Met Gly Glu Asn Phe Ile Ala Ser
        180                 185                 190gac cag ctg gcg ctg ttg ccg gtg acc cgt cgc ttt atc ttc ctt gaa   624Asp Gln Leu Ala Leu Leu Pro Val Thr Arg Arg Phe Ile Phe Leu Glu
    195                 200                 205gag ggc gat att gcg gaa atc act cgc cgt tcg gta aac atc ttc gat   672Glu Gly Asp Ile Ala Glu Ile Thr Arg Arg Ser Val Asn Ile Phe Asp
210                 215                 220aaa act ggc gcg gaa gta aaa cgt cag gat atc gaa tcc aat ctg caa   720Lys Thr Gly Ala Glu Val Lys Arg Gln Asp Ile Glu Ser Asn Leu Gln225                 230                 235                 240tat gac gcg ggc gat aaa ggc att tac cgt cac tac atg cag aaa gag   768Tyr Asp Ala Gly Asp Lys Gly Ile Tyr Arg His Tyr Met Gln Lys Glu
            245                 250                 255atc tac gaa cag ccg aac gcg atc aaa aac acc ctt acc gga cgc atc   816Ile Tyr Glu Gln Pro Asn Ala Ile Lys Asn Thr Leu Thr Gly Arg Ile
        260                 265                 270agc cac ggt cag gtt gat tta agc gag ctg gga ccg aac gcc gac gaa   864Ser His Gly Gln Val Asp Leu Ser Glu Leu Gly Pro Asn Ala Asp Glu
    275                 280                 285ctg ctg tcg aag gtt gag cat att cag atc ctc gcc tgt ggt act tct   912Leu Leu Ser Lys Val Glu His Ile Gln Ile Leu Ala Cys Gly Thr Ser
290                 295                 300tat aac tcc ggt atg gtt tcc cgc tac tgg ttt gaa tcg cta gca ggt   960Tyr Asn Set Gly Met Val Ser Arg Tyr Trp Phe Glu Ser Leu Ala Gly305                 310                 315                 320att ccg tgc gac gtc gaa atc gcc tct gaa ttc cgc tat cgc aaa tct   1008Ile Pro Cys Asp Val Glu Ile Ala Ser Glu Phe Arg Tyr Arg Lys Ser
            325                 330                 335gcc gtg cgt cgt aac agc ctg atg atc acc ttg tca cag tct ggc gaa   1056Ala Val Arg Arg Asn Set Leu Met Ile Thr Leu Ser Gln Ser Gly Glu
        340                 345                 350acc gcg gat acc ctg gct ggc ctg cgt ctg tcg aaa gag ctg ggt tac   1104Thr Ala Asp Thr Leu Ala Gly Leu Arg Leu Ser Lys Glu Leu Gly Tyr
    355                 360                 365ctt ggt tca ctg gca atc tgt aac gtt ccg ggt tct tct ctg gtg cgc   1152Leu Gly Ser Leu Ala Ile Cys Asn Val Pro Gly Ser Ser Leu Val Arg
370                 375                 380gaa tcc gat ctg gcg cta atg acc aac gcg ggt aca gaa atc ggc gtg   1200Glu Ser Asp Leu Ala Leu Met Thr Asn Ala Gly Thr Glu Ile Gly Val385                 390                 395                 400gca tcc act aaa gca ttc acc act cag tta act gtg ctg ttg atg ctg   1248Ala Ser Thr Lys Ala Phe Thr Thr Gln Leu Thr Val Leu Leu Met Leu
            405                 410                 415gtg gcg aag ctg tct cgc ctg aaa ggt ctg gat gcc tcc att gaa cat   1296Val Ala Lys Leu Ser Arg Leu Lys Gly Leu Asp Ala Ser Ile Glu His
        420                 425                 430gac atc gtg cat ggt ctg cag gcg ctg ccg agc cgt att gag cag atg   1344Asp Ile Val His Gly Leu Gln Ala Leu Pro Ser Arg Ile Glu Gln Met
    435                 440                 445ctg tct cag gac aaa cgc att gaa gcg ctg gca gaa gat ttc tct gac   1392Leu Ser Gln Asp Lys Arg Ile Glu Ala Leu Ala Glu Asp Phe Ser Asp
450                 455                 460aaa cat cac gcg ctg ttc ctg agc cgt ggc gat cag tac cca atc gcg   1440Lys His His Ala Leu Phe Leu Ser Arg Gly Asp Gln Tyr Pro Ile Ala465                 470                 475                 480ctg gaa ggc gca ttg aag ttg aaa gag ate tct tac att cac gct gaa   1488Leu Glu Gly Ala Leu Lys Leu Lys Glu Ile Ser Tyr Ile His Ala Glu
            485                 490                 495gcc tac gct gct ggc gaa ctg aaa cac ggt ccg ctg gcg cta att gat   1536Ala Tyr Ala Ala Gly Glu Leu Lys His Gly Pro Leu Ala Leu Ile Asp
        500                 505                 510gcc gat atg ccg gtt att gtt gtt gca ccg aac aac gaa ttg ctg gaa   1584Ala Asp Met Pro Val Ile Val Val Ala Pro Asn Asn Glu Leu Leu Glu
    515                 520                 525aaa ctg aaa tcc aac att gaa gaa gtt cgc gcg cgt ggc ggt cag ttg   1632Lys Leu Lys Ser Asn Ile Glu Glu Val Arg Ala Arg Gly Gly Gln Leu
530                 535                 540tat gtc ttc gcc gat cag gat gcg ggt ttt gta agt agc gat aac atg   1680Tyr Val Phe Ala Asp Gln Asp Ala Gly Phe Val Ser Ser Asp Asn Met545                 550                 555                 560cac atc atc gag atg ccg cat gtg gaa gag gtg att gca ccg atc ttc   1728His Ile Ile Glu Met Pro His Val Glu Glu Val Ile Ala Pro Ile Phe
            565                 570                 575tac acc gtt ccg ctg cag ctg ctg gct tac cat gtc gcg ctg atc aaa   1776Tyr Thr Val Pro Leu Gln Leu Leu Ala Tyr His Val Ala Leu Ile Lys
        580                 585                 590ggc acc gac gtt gac cag ccg cgt aac ctg gca aaa tcg gtt acg gtt   1824Gly Thr Asp Val Asp Gln Pro Arg Asn Leu Ala Lys Ser Val Thr Val
    595                 600                 605gag taa                                                           1830Glu
610<210>31<211>609<212>PRT<213>大肠杆菌<400>31Met Cys Gly Ile Val Gly Ala Ile Ala Gln Arg Asp Val Ala Glu Ile1              5                   10                  15Leu Leu Glu Gly Leu Arg Arg Leu Glu Tyr Arg Gly Tyr Asp Ser Ala
         20                  25                  30Gly Leu Ala Val Val Asp Ala Glu Gly His Met Thr Arg Leu Arg Arg
     35                  40                  45Leu Gly Lys Val Gln Met Leu Ala Gln Ala Ala Glu Glu His Pro Leu
 50                  55                  60His Gly Gly Thr Gly Ile Ala His Thr Arg Trp Ala Thr His Gly Glu65                  70                  75                  80Pro Ser Glu Val Asn Ala His Pro His Val Ser Glu His Ile Val Val
             85                  90                  95Val His Asn Gly Ile Ile Glu Asn His Glu Pro Leu Arg Glu Glu Leu
        100                 105                 110Lys Ala Arg Gly Tyr Thr Phe Val Ser Glu Thr Asp Thr Glu Val Ile
    115                 120                 125Ala His Leu Val Asn Trp Glu Leu Lys Gln Gly Gly Thr Leu Arg Glu
130                 135                 140Ala Val Leu Arg Ala Ile Pro Gln Leu Arg Gly Ala Tyr Gly Thr Val145                 150                 155                 160Ile Met Asp Ser Arg His Pro Asp Thr Leu Leu Ala Ala Arg Ser Gly
            165                 170                 175Ser Pro Leu Val Ile Gly Leu Gly Met Gly Glu Asn Phe Ile Ala Ser
        180                 185                 190Asp Gln Leu Ala Leu Leu Pro Val Thr Arg Arg Phe Ile Phe Leu Glu
    195                 200                 205Glu Gly Asp Ile Ala Glu Ile Thr Arg Arg Ser Val Asn Ile Phe Asp
210                 215                 220Lys Thr Gly Ala Glu Val Lys Arg Gln Asp Ile Glu Ser Asn Leu Gln225                 230                 235                 240Tyr Asp Ala Gly Asp Lys Gly Ile Tyr Arg His Tyr Met Gln Lys Glu
            245                 250                 255Ile Tyr Glu Gln Pro Asn Ala Ile Lys Asn Thr Leu Thr Gly Arg Ile
        260                 265                 270Ser His Gly Gln Val Asp Leu Ser Glu Leu Gly Pro Asn Ala Asp Glu
    275                 280                 285Leu Leu Ser Lys Val Glu His Ile Gln Ile Leu Ala Cys Gly Thr Ser
290                 295                 300Tyr Asn Ser Gly Met Val Ser Arg Tyr Trp Phe Glu Ser Leu Ala Gly305                 310                 315                 320Ile Pro Cys Asp Val Glu Ile Ala Ser Glu Phe Arg Tyr Arg Lys Ser
            325                 330                 335Ala Val Arg Arg Asn Ser Leu Met Ile Thr Leu Ser Gln Ser Gly Glu
        340                 345                 350Thr Ala Asp Thr Leu Ala Gly Leu Arg Leu Ser Lys Glu Leu Gly Tyr
    355                 360                 365Leu Gly Ser Leu Ala Ile Cys Asn Val Pro Gly Ser Ser Leu Val Arg
370                 375                 380Glu Ser Asp Leu Ala Leu Met Thr Asn Ala Gly Thr Glu Ile Gly Val385                 390                 395                 400Ala Ser Thr Lys Ala Phe Thr Thr Gln Leu Thr Val Leu Leu Met Leu
            405                 410                 415Val Ala Lys Leu Ser Arg Leu Lys Gly Leu Asp Ala Ser Ile Glu His
        420                 425                 430Asp Ile Val His Gly Leu Gln Ala Leu Pro Ser Arg Ile Glu Gln Met
    435                 440                 445Leu Ser Gln Asp Lys Arg Ile Glu Ala Leu Ala Glu Asp Phe Ser Asp
450                 455                 460Lys His His Ala Leu Phe Leu Ser Arg Gly Asp Gln Tyr Pro Ile Ala465                 470                 475                 480Leu Glu Gly Ala Leu Lys Leu Lys Glu Ile Ser Tyr Ile His Ala Glu
            485                 490                 495Ala Tyr Ala Ala Gly Glu Leu Lys His Gly Pro Leu Ala Leu Ile Asp
        500                 505                 510Ala Asp Met Pro Val lle Val Val Ala Pro Asn Asn Glu Leu Leu Glu
    515                 520                 525Lys Leu Lys Ser Asn Ile Glu Glu Val Arg Ala Arg Gly Gly Gln Leu
530                 535                 540Tyr Val Phe Ala Asp Gln Asp Ala Gly Phe Val Ser Ser Asp Asn Met545                 550                 555                 560His Ile Ile Glu Met Pro His Val Glu Glu Val Ile Ala Pro Ile Phe
            565                 570                 575Tyr Thr Val Pro Leu Gln Leu Leu Ala Tyr His Val Ala Leu Ile Lys
        580                 585                 590Gly Thr Asp Val Asp Gln Pro Arg Asn Leu Ala Lys Ser Val Thr Val
    595                 600                 605Glu

Claims (60)

1．通过发酵生产葡糖胺的方法，该方法包括
(a)在含可吸收的碳、氮和磷源的培养基中培养在氨基糖代谢途径中有遗传修饰的微生物，所述氨基糖代谢途径选自将葡糖胺-6-磷酸转变成另一种化合物的途径、用于合成葡糖胺-6-磷酸的途径、将葡糖胺或葡糖胺-6-磷酸转运出所述微生物的途径、将葡糖胺转运到所述微生物中的途径以及竞争葡糖胺-6-磷酸生产的有关底物的途径；
其中所述培养步骤从所述微生物中产生选自葡糖胺-6-磷酸和葡糖胺的产物；
(b)回收所述产物。
2．权利要求1的方法，其中所述葡糖胺-6-磷酸是细胞内的，所述葡糖胺细胞外的，其中所述回收步骤包括选自从所述微生物中回收所述葡糖胺-6-磷酸、从所述发酵培养基中回收所述葡糖胺以及其组合的回收步骤。
3．权利要求1的方法，其中所述产物是通过所述微生物分泌到所述发酵培养基中的葡糖胺，且所述回收步骤包括从所述发酵培养基中纯化所述葡糖胺。
4．权利要求1的方法，其中所述产物是细胞内葡糖胺-6-磷酸，且所述回收步骤包括从所述微生物中分离所述葡糖胺-6-磷酸。
5．权利要求1的方法，其中所述产物是细胞内葡糖胺-6-磷酸，且所述回收步骤还包括将所述葡糖胺-6-磷酸去磷酸化以产生葡糖胺。
6．权利要求1的方法，其中所述培养步骤包括将所述发酵培养基中的碳源浓度保持在约0.5％至约5％。
7．权利要求1的方法，其中所述培养步骤是在约28℃至约37℃完成的。
8．权利要求1的方法，其中所述培养步骤是在发酵罐中完成的。
9．权利要求1的方法，其中回收至少约1g/L的所述产物。
10．权利要求1的方法，其中所述遗传修饰是在编码选自下列蛋白质的核酸分子中的修饰：N-乙酰-葡糖胺-6-磷酸脱乙酰酶、葡糖胺-6-磷酸脱氨基酶、N-乙酰-葡糖胺-特异性酶ⅡNag、葡糖胺-6-磷酸合酶、磷酸葡糖胺变位酶、葡糖胺-1-磷酸乙酰转移酶-N-乙酰葡糖胺-1-磷酸尿苷酰转移酶、磷酸果糖激酶、PEP：葡萄糖PTS的酶ⅡGlc、PEP：甘露糖PTS的EIIM,P/ⅢMan和磷酸酶。
11．权利要求1的方法，其中所述微生物含有提高葡糖胺-6-磷酸合酶作用的遗传修饰。
12．权利要求11的方法，其中所述遗传修饰导致所述微生物过量表达葡糖胺-6-磷酸合酶。
13．权利要求11的方法，其中所述遗传修饰包括用编码具有葡糖胺-6-磷酸合酶活性之葡糖胺-6-磷酸合酶的重组核酸分子转化所述微生物，其中所述重组核酸分子与转录控制序列有效相连。
14．权利要求13的方法，其中所述重组核酸分子含有编码葡糖胺-6-磷酸合酶同系物的核酸序列。
15．权利要求13的方法，其中所述重组核酸分子含有编码氨基酸序列SEQ ID NO:16的核酸序列。
16．权利要求13的方法，其中所述重组核酸分子含有选自SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15的核酸序列。
17．权利要求13的方法，其中所述重组核酸分子含有选自pKLN23-28,nglmS-282184和nglmS-281830的核酸分子。
18．权利要求13的方法，其中所述重组核酸分子被整合到所述微生物的基因组中。
19．权利要求13的方法，其中所述编码葡糖胺-6-磷酸合酶的重组核酸分子含有提高所述葡糖胺-6-磷酸合酶作用的遗传修饰。
20．权利要求19的方法，其中所述编码葡糖胺-6-磷酸合酶的重组核酸分子含有含有减弱所述葡糖胺-6-磷酸合酶之葡糖胺-6-磷酸产物抑制作用的遗传修饰。
21．权利要求19的方法，其中所述遗传修饰导致至少一个选自下列的氨基酸修饰：所述葡糖胺-6-磷酸合酶的至少一个氨基酸残基的缺失、插入、倒置、取代和衍生，所述至少一个氨基酸修饰导致葡糖胺-6-磷酸合酶作用提高。
22．权利要求21的方法，其中所述至少一个氨基酸修饰是在一个氨基酸序列位置，其对应于氨基酸序列SEQ ID NO:16，选自Ile(4),Ile(272),Ser(450),Ala(39),Arg(250),GIy(472),Leu(469)和其组合。
23．权利要求22的方法，其中所述氨基酸修饰是选自下列的取代：
(a)带有一个脂肪族羟基侧基团的氨基酸残基取代Ile(4)；
(b)带有一个脂肪族羟基侧基团的氨基酸残基取代Ile(272)；
(c)带有一个脂肪族侧基团的氨基酸残基取代Ser(450)；
(d)带有一个脂肪族羟基侧基团的氨基酸残基取代Ala(39)；
(e)带有含硫侧基团的氨基酸残基取代Arg(250)；
(f)带有一个脂肪族羟基侧基团的氨基酸残基取代Gly(472)；
(g)带有一个脂肪族侧基团的氨基酸残基取代Leu(469)；
(h)(a)-(g)的组合。
24．权利要求22的方法，其中所述氨基酸修饰是选自下列的取代：Ile(4)被Thr取代、Ile(272)被Thr取代、Ser(450)被Pro取代、Ala(39)被Thr取代、Arg(250)被Cys取代、Gly(472)被Ser取代、Leu(469)被Pro取代以及其组合。
25．权利要求22的方法，其中所述氨基酸修饰是在氨基酸序列位置Leu(469)由脯氨酸残基取代亮氨酸残基。
26．权利要求22的方法，其中所述氨基酸修饰是选自下列的氨基酸残基的取代：
(a)苏氨酸残基取代Ala(39)位的丙氨酸残基；
(b)半胱氨酸残基取代Arg(250)位的精氨酸残基；
(c)丝氨酸残基取代Gly(472)位的甘氨酸残基；以及
(d)(a)、(b)或(c)的任意组合。
27．权利要求22的方法，其中所述氨基酸修饰是选自下列的取代：
(a)苏氨酸残基取代Ile(4)位的异亮氨酸残基；
(b)苏氨酸残基取代Ile(272)位的异亮氨酸残基；
(c)脯氨酸残基取代Ser(450)位的丝氨酸残基；以及
(d)(a)、(b)或(c)的任意组合。
28．权利要求19的方法，其中所述重组核酸分子含有编码葡糖胺-6-磷酸合酶的核酸序列，所述合酶含有选自SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:22、SEQID NO:25、SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:31的氨基酸序列。
29．权利要求19的方法，其中所述重组核酸分子含有选自SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:21,SEQ ID NO:23,SEQ IDNO:24,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30的核酸序列。
30．权利要求19的方法，其中所述重组核酸分子含有选自pKLN23-49、pKLN23-54、pKLN23-124、pKLN23-149、pKLN23-151、nglmS-492184、nglmS-491830、nglmS-542184、nglmS-541830、nglmS-1242184、nglmS-1241830、nglmS-1492184、nglmS-1491830、nglmS-1512184和nglmS-1511830的核酸分子。
31．权利要求19的方法，其中所述重组核酸分子被整合到所述微生物的基因组中。
32．权利要求11的方法，其中所述微生物在编码选自下列蛋白质的基因中还含有至少一个遗传修饰：N-乙酰-葡糖胺-6-磷酸脱乙酰酶、葡糖胺-6-磷酸脱氨基酶、N-乙酰-葡糖胺-特异性酶ⅡNag、磷酸葡糖胺变位酶、葡糖胺-1-磷酸乙酰转移酶-N-乙酰葡糖胺-1-磷酸尿苷酰转移酶、磷酸果糖激酶、PEP：葡萄糖PTS的酶ⅡGlc、PEP：甘露糖PTS的EIIM,P/ⅢMan，其中所述遗传修饰降低了所述蛋白质的作用。
33．权利要求11的方法，其中所述微生物在编码磷酸酶的基因中还含有至少一个遗传修饰，其中所述遗传修饰提高所述磷酸酶的作用。
34．权利要求11的方法，其中所述微生物在编码下列蛋白质的基因中还含有修饰：N-乙酰-葡糖胺-6-磷酸脱乙酰酶、葡糖胺-6-磷酸脱氨基酶、N-乙酰-葡糖胺-特异性酶ⅡNag，
其中所述遗传修饰降低了所述蛋白质的作用。
35．权利要求34的方法，其中所述遗传修饰是缺失所述基因的至少一部分。
36．权利要求1的方法，其中所述微生物选自细菌和酵母。
37．权利要求1的方法，其中所述微生物是埃希菌属的细菌。
38．权利要求1的方法，其中所述微生物是大肠杆菌。
39．权利要求38的方法，其中所述遗传修饰是在选自下列的大肠杆菌基因中的突变：nagA、nagB、nagC、nagD、nagE、manXYZ、glmM、pfkB、pfkA、glmU、glmS、ptsG基因和磷酸酶基因。
40．通过发酵生产葡糖胺的方法，该方法包括
(a)在含可吸收的碳、氮和磷源的培养基中培养用编码葡糖胺-6-磷酸合酶的重组核酸分子转化的大肠杆菌，其中所述重组核酸分子提高了所述大肠杆菌中的葡糖胺-6-磷酸合酶的作用，其中所述重组核酸分子与转录控制序列有效相连；
其中所述培养步骤从所述大肠杆菌中产生选自葡糖胺-6-磷酸和葡糖胺的产物；以及
(b)回收所述产物。
41．权利要求40的方法，其中所述大肠杆菌在选自下列的至少一个基因中还含有至少一个遗传修饰：nagA、nagB、nagC、nagD、nagE、manXYZ、glmM、pfkB、pfkA、glmU、glmS、ptsG基因和磷酸酶基因。
42．权利要求40的方法，其中所述至少一个另外的遗传修饰包括nagA、nagB、nagC、nagD和nagE的一个缺失，manXYZ中的突变，所述修饰导致N-乙酰-葡糖胺-6-磷酸脱乙酰酶、葡糖胺-6-磷酸脱氨基酶、N-乙酰-葡糖胺-特异性酶ⅡNag的作用降低。
43．用于通过生物合成方法生产葡糖胺的微生物，所述微生物用编码葡糖胺-6-磷酸合酶的重组核酸分子转化，所述重组核酸分子与转录控制序列有效相连并含有提高所述葡糖胺-6-磷酸合酶作用的遗传修饰；
其中所述重组核酸分子的表达提高了所述微生物的葡糖胺生产。
44．权利要求43的微生物，其中其中所述微生物在编码选自下列蛋白质的基因中还含有至少一个遗传修饰：N-乙酰-葡糖胺-6-磷酸脱乙酰酶、葡糖胺-6-磷酸脱氨基酶、N-乙酰-葡糖胺-特异性酶ⅡNag、磷酸葡糖胺变位酶、葡糖胺-1-磷酸乙酰转移酶-N-乙酰葡糖胺-1-磷酸尿苷酰转移酶、磷酸果糖激酶、PEP：葡萄糖PTS的酶ⅡGlc、PEP：甘露糖PTS的EIIM,P/ⅢMan，其中所述遗传修饰降低了所述蛋白质的作用。
45．权利要求43的微生物，其中所述微生物在编码磷酸酶的基因中还含有至少一个遗传修饰，其中所述遗传修饰提高了所述磷酸酶的作用。
46．权利要求43的微生物，其中所述微生物是在选自下列的基因中还含有至少一个遗传修饰的大肠杆菌：nagA、nagB、nagC、nagD、nagE、manXYZ、glmM、pfkB、pfkA、glmU和ptsG基因，其中所述遗传修饰降低了由所述基因编码之蛋白质的作用。
47．权利要求43的微生物，其中所述微生物是含有nag调节子基因之缺失的大肠杆菌。
48．权利要求43的微生物，其中所述微生物是含有nag调节子基因之缺失以及在manXYZ基因中含有遗传修饰以使所述manXYZ基因编码之蛋白质作用降低的大肠杆菌。
49．权利要求43的微生物，其中在含14g/L K2HPO4,16g/L KH2PO4,1g/L二水合柠檬酸钠，5g/L(NH4)2SO4,20g/L葡萄糖，10mM MgSO4,1mMCaCl2和约0.2-约1mM IPTG的pH7.0培养基上，当在约28-约37℃培养约10-约60小时，使细胞密度按细胞干重计算为至少约8g/L时，所述微生物产生至少约lg/L葡糖胺。
50．用于通过生物合成方法生产葡糖胺的微生物，所述微生物含有：
(a)编码葡糖胺-6-磷酸合酶的重组核酸分子，所述重组核酸分子与转录控制序列有效相连，其中所述重组核酸分子的表达提高了所述微生物的葡糖胺-6-合酶的作用；和
(b)在选自编码下列蛋白质的基因中至少一个遗传修饰：N-乙酰-葡糖胺-6-磷酸脱乙酰酶、葡糖胺-6-磷酸脱氨基酶、N-乙酰-葡糖胺-特异性酶ⅡNag、磷酸葡糖胺变位酶、葡糖胺-1-磷酸乙酰转移酶-N-乙酰葡糖胺-1-磷酸尿苷酰转移酶、磷酸果糖激酶、PEP：葡萄糖PTS的酶ⅡGlc、PEP：甘露糖PTS的EIIM,P/ⅢMan，其中所述遗传修饰降低了所述蛋白质的作用。
51．权利要求50的微生物，其中所述微生物在编码磷酸酶的基因中还含有至少一个遗传修饰，其中所述遗传修饰提高了所述磷酸酶的作用。
52．含有编码葡糖胺-6-磷酸合酶之核酸序列的重组核酸分子，其含有导致葡糖胺-6-磷酸合酶作用提高的遗传修饰。
53．权利要求52的重组核酸分子，其中所述遗传修饰导致至少一个选自下列的氨基酸修饰：所述葡糖胺-6-磷酸合酶的至少一个氨基酸残基的缺失、插入、倒置、取代和衍生，所述至少一个氨基酸修饰导致葡糖胺-6-磷酸合酶作用提高。
54．权利要求52的重组核酸分子，其中所述重组核酸分子含有编码葡糖胺-6-磷酸合酶的核酸序列，所述葡糖胺-6-磷酸合酶含有选自SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:22,SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:31的氨基酸序列。
55．权利要求52的重组核酸分子，其中所述重组核酸分子含有选自SEQID NO:17,SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:21,SEQ ID NO:23,SEQ ID NO:24,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:29和SEQ IDNO:30的核酸序列。
56．具有葡糖胺-6-磷酸合酶作用的葡糖胺-6-磷酸合酶，所述合酶由含有导致葡糖胺-6-磷酸合酶作用提高之遗传修饰的核酸序列编码。
57．权利要求56的葡糖胺-6-磷酸合酶，其中所述合酶含有选自至少一个氨基酸残基之缺失、插入、倒置、取代和衍生的至少一个氨基酸修饰。
58．权利要求56的葡糖胺-6-磷酸合酶，其中所述合酶由选自SEQ IDNO:17,SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:21,SEQ ID NO:23,SEQID NO:24,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30的核酸序列编码。
59．权利要求56的葡糖胺-6-磷酸合酶，其中所述合酶含有选自SEQ IDNO:19,SEQ ID NO:22,SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:31的氨基酸序列。
60．通过发酵生产葡糖胺的方法，该方法包括：
(a)在含可吸收的碳、氮和磷源的发酵培养基中培养具有使葡糖胺-6-磷酸合酶作用提高之遗传修饰的微生物，其中所述遗传修饰的微生物由包含下列步骤的方法产生：
(1)从含编码葡糖胺-6-磷酸合酶的核酸序列的分离的核酸分子中产生修饰以产生多个修饰的核酸序列；
(2)用所述修饰的核酸序列转化微生物以产生遗传修饰的微生物；
(3)根据葡糖胺-6-磷酸合酶作用筛选所述遗传修饰的微生物；和
(4)筛选具有提高的葡糖胺-6-磷酸合酶作用的所述遗传修饰微生物；
其中所述培养步骤从所述微生物中产生选自葡糖胺-6-磷酸和葡糖胺的产物；
(b)回收所述产物。
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