[go: up one dir, main page]

CN1369005A - 预防病原性细菌引起的腹泻的新双歧杆菌 - Google Patents

预防病原性细菌引起的腹泻的新双歧杆菌 Download PDF

Info

Publication number
CN1369005A
CN1369005A CN00811245A CN00811245A CN1369005A CN 1369005 A CN1369005 A CN 1369005A CN 00811245 A CN00811245 A CN 00811245A CN 00811245 A CN00811245 A CN 00811245A CN 1369005 A CN1369005 A CN 1369005A
Authority
CN
China
Prior art keywords
bifidobacteria
milk
bifidobacterium
cells
food
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN00811245A
Other languages
English (en)
Other versions
CN1186440C (zh
Inventor
J·－R·尼泽尔
R·雷尼罗
F·罗查特
A·赛文
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Societe des Produits Nestle SA
Original Assignee
Societe des Produits Nestle SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Societe des Produits Nestle SA filed Critical Societe des Produits Nestle SA
Publication of CN1369005A publication Critical patent/CN1369005A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN1186440C publication Critical patent/CN1186440C/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING OR TREATMENT THEREOF
    • A23C9/00—Milk preparations; Milk powder or milk powder preparations
    • A23C9/12—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes
    • A23C9/123—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes using only microorganisms of the genus lactobacteriaceae; Yoghurt
    • A23C9/1234—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes using only microorganisms of the genus lactobacteriaceae; Yoghurt characterised by using a Lactobacillus sp. other than Lactobacillus Bulgaricus, including Bificlobacterium sp.
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING OR TREATMENT THEREOF
    • A23C19/00—Cheese; Cheese preparations; Making thereof
    • A23C19/02—Making cheese curd
    • A23C19/032—Making cheese curd characterised by the use of specific microorganisms, or enzymes of microbial origin
    • A23C19/0323—Making cheese curd characterised by the use of specific microorganisms, or enzymes of microbial origin using only lactic acid bacteria, e.g. Pediococcus and Leuconostoc species; Bifidobacteria; Microbial starters in general
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
    • A23L29/00—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof
    • A23L29/065—Microorganisms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A61K35/741—Probiotics
    • A61K35/744—Lactic acid bacteria, e.g. enterococci, pediococci, lactococci, streptococci or leuconostocs
    • A61K35/745—Bifidobacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2400/00—Lactic or propionic acid bacteria
    • A23V2400/51—Bifidobacterium
    • A23V2400/533—Longum
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)

Abstract

本发明涉及双歧杆菌属的新的微生物,它能够防止病原性细菌引起的腹泻。特别是,本发明涉及所说的微生物在可吸收的载体的制备方面的应用以及含有这种微生物的组合物。

Description

预防病原性细菌引起的腹泻的新双歧杆菌
本发明涉及双歧杆菌属的新的微生物，它能够预防病原性细菌引起的腹泻。特别是，本发明涉及所说的微生物在可吸收的载体的制备方面的使用和含有这种微生物的组合物。
很久以来，产生乳酸作为主要代谢组合物的微生物就为人们所知。在牛奶或牛奶处理工厂中，活着或腐烂的植物中也可在人和动物的肠子中发现这些细菌。这些微生物概述为“乳酸细菌”，其代表了一组相当不同类的细菌包括乳球菌(Lactococcus)、乳菌(Lactobacillus)，链球菌(Streptococcus)、双歧杆菌(Bifidobacterium)、片球菌(Pediococcus)等。
乳酸细菌作为低pH值条件下保存食物的发酵剂使用，发酵产物的作用抑制有害细菌的生长。另外，乳酸细菌也用于制备不同的乳制品例如奶酪、酸奶酪和其他发酵的乳制品。
近期，乳酸细菌的一些菌株显示出对人和动物的吸收颇有价值的性质，引起了人们的密切关注。特别是，特殊的乳酸菌或双歧杆菌的菌株被发现能够在肠内膜繁殖。它们暂时性或长期的保持在肠胃中被认为对于人类的健康具有巨大的正面的作用。
在这方面，EP0768375公开了双歧杆菌的特异性菌株，这种菌株能够灌输进入肠内并且粘附在肠细胞上。报道说这些双歧杆细菌有助于免疫功能，能够竞争性排除病原性细菌对肠内细胞的粘附，有助于维持生物个体的健康。
在最近几年科研集中在乳酸细菌作为益生菌试剂的潜在应用。益生菌被认为是能通过保持肠内自然微生物区系促进生物个体健康的可生长的微生物制品。微生物制品通常被认为是益生菌也就是这种有效的微生物并且人们已经知道了它们作用的模式。益生菌贴附在肠粘膜上，在肠道内生长并且防止有害微生物在其上粘附。对于它们在肠内发挥作用的至关重要的先决条件是它们必须以一种适当的能存活的方式粘附到内脏的粘膜上而且在胃肠上部不被消灭，特别是不受胃内低pH区域的影响。
在这方面，作为这样的一种益生菌，WO97/00078公开了一种特异性菌株，称为乳酸菌GG(ATCC53103)。在防止或治疗食物诱发的过敏反应的方法中特定使用这种微生物，也就是将其和已经经过用胃蛋白酶和/或胰酶一起进行水解处理的食品材料一起给药于受体。所选择的乳酸菌菌株显示了粘附和建群性能及蛋白酶体系，以至于含在将被给药的食物中的蛋白质通过被这种特殊的乳酸菌分泌的蛋白酶进一步水解。这份文件所讨论的方法最终导致蛋白质被内脏消化，没有显示出存在任何引起过敏的物质。
更进一步，在EP 0 577 903参考资料中采用了这种乳酸菌，它具有取代幽门螺杆菌的能力，幽门螺杆菌公认是引起溃疡的原因，上述制备可以治疗和预防幽门螺杆菌引起的溃疡。
乳酸菌特定的菌株可以提供有价值的特性，技术人员期望发现另外的细菌菌株能够有益于人类和/或动物的健康。
因此，本发明的问题是提供另外的乳酸菌菌株，它能表现出对人和/或动物例如宠物有益的新性质。
通过提供新的属于双歧杆菌属的新的微生物得到了解决，这些新的微生物具有防止病原性细菌移植肠胃引起腹泻的能力且用它们制备可吸收的载体物质。
这种双歧杆菌是从由长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)CNCMI-2169和CNCMI-2170组成的组中选择。
本发明的微生物显示有如下特性：它们是革兰氏阳性，过氧化氢酶试验阴性和CO2生产阴性，它们生产L(+)乳酸和可以基本上防止引起腹泻的细菌诸如致病的大肠杆菌、例如致肠病的E大肠杆菌(EPEC)、或沙门氏例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)在肠胃细胞上建群。
新的微生物可以用于制备一种可吸收的载体物质，例如奶、酸奶酪、凝乳、奶基发酵产品、发酵谷类产品、奶粉(milk based powders)、婴儿食品或宠物食品，也可以大约105cfu/g到1011cfu/g的量包含在载体中。本发明采用的缩写cfu的意思是“菌落形成单位”，定义为琼脂板上的微生物计数器所表示的细菌细胞的数目。
本发明也提供一种食品或药物组合物，含有至少一种双歧杆菌菌株，和/或含有一种其中生长有微生物的上清液，或其活性部分。在此方面，细菌上清液也显示具有抗病的活性。
为了制备本发明的食物组合物，至少一种双裂菌菌株被加到在合适的载体中，其含量为大约105cfu/g到1012cfu/g，优选含量为大约106cfu/g到1010cfu/g，更优选含量为大约107cfu/g到109cfu/g。
药品可以以片剂、液体细菌悬浮液、干的口服补充剂、湿的口服补充剂(oralsupplements)、干的管饲或湿的管饲等等的形式制备，所用的双歧杆菌的含量高达1012cfu/g，优选大约107cfu/g到1011cfu/g，更优选107cfu/g到1010cfu/g。
微生物在生物体肠内的活性当然取决于剂量。也就是分别通过上述食品或药物组合物摄入的微生物越多，保护和/或治疗的作用越高。由于所用的微生物对于人类或动物无害，实际上是从自然环境中分离出来的，也就是从婴儿的粪中分离出来的，加入的量高，生物体肠内新微生物建群的比例也就高。
根据另一个实施方案，本发明的双歧杆菌培养基的上清液或活性部分，可以用于制备可吸收的载体。这些上清液可以这样使用或在不毁灭被这些微生物分泌的代谢化合物的条件下干燥例如冷冻干燥加入液体介质，也可以包容在载体中。为了最大程度的减少上清液中未知化合物的数量，双歧杆菌优选在指定的培养基中培养，培养基的组合物是已知的并且对于宿主没有负的影响。而且熟练的操作人员根据一般的常识将从上清液分离未知的产物，例如采用色谱方法。
在这些图中
图1表示细胞系CNCMI-2169(称为B128/Cal)和长双歧杆菌CNCMI-2170(称为BL29/F9)粘附在培养基中人类肠细胞的能力。
图2表示病原细菌对于长双歧杆菌CNCMI-2170(称为BL29/F9)的病原敏感性。
图3表示病原细菌对于长双歧杆菌CNCMI-2169(称为B128/Cal)的病原敏感性。
图4表示细胞系B128/cAL和BL29/F9对于鼠沙门氏菌SL1344感染Caco-2细胞的活性。
图5表示鼠沙门氏菌SL1344感染的小鼠和用双歧杆菌BL29/F9处理的小鼠的存活率。
在进行本发明的广泛研究中，发明人调查了婴儿粪便并分离了不同的细菌菌株。随后检验了这些菌株防止引起腹泻的细菌在上皮细胞的建群和/或侵入，引起腹泻的细菌诸如大肠杆菌(E.coli)、志贺氏菌(Sigella)，克雷伯氏杆菌(Klebsiella)，耶尔森氏菌(Yersinia)，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、赖文氏菌(Listeria)、链球菌(Streptococcus)，Staphilococcus，难辨梭状芽孢杆菌(Clostridium difficile)，幽门螺杆菌(H.pyori)以及白色假丝酵母(Candidaalbicans)。
依据对腹泻的抑制性，包含双歧杆菌属、乳球菌属和链球菌属在内的几种细菌被筛选。采用病原微生物例如大肠杆菌、克雷伯氏杆菌、耶尔森氏杆菌、铜绿假单胞菌、幽门螺杆菌和鼠沙门氏菌作为感染生物个体引起腹泻的病原微生物进行抑制性能试验。
各种细菌在适当的培养基中生长，例如在它们适宜的MRS、Hugo-Jago或M17培养基中，最佳的生长温度30到40℃生长。在这些细菌稳定生长后采用离心分离和在生理盐水溶液中重新悬浮收集这些细菌。在这些不同试验之间这些细菌细胞被冷冻储存(-20C)。
选择下列方法评估抗菌的性能。
按照一个方案检验了本发明培养的双歧杆菌减少不同病原性微生物存活能力的性能。为此，病原细菌培养物和浓缩双歧杆菌培养物的上清液相接触并检验病原细菌的生长势。
按照第二个方案检验了本发明双歧杆菌在肠的细胞模型培养物T84细胞上的粘附能力。为此，双歧杆菌和T84细胞一起培养并检验粘附率。
按照另一个方案检测了本发明的双歧杆菌防止肠细胞沙门氏菌感染的能力，采用了细胞系Caco-2作为肠的模型。在这方面，本发明的双歧杆菌细胞培养物上清液和病原微生物一起加入肠细胞并分别检验粘附或侵入率。
培养的双歧杆菌和上清液证明具有极大的防止粘附和侵入肠细胞的作用，表明新微生物分泌的代谢化合物具有抗腹泻能力。
本发明将举例说明。并不局限于这些例子。
培养基和溶液
MRS(Difco)
Hugo-Jago(胰蛋白胨30g/l(Difco)，酵母提取物10g/l(Difco)，乳糖5g/l(Difco)，KH2PO46g/l，
牛肉汁2g/l(Difco)，琼脂2g/l(Difco)
M17(Difco)
密集的西红柿琼脂(罐装西红柿汁400ml，密集的琼脂(Eugon agar)BBL45.5g，麦芽糖(Difco)10g，血晶素sigma 5mg，琼脂(Difco)5g，蒸馏水600ml)
DMEM(Dulbecco`s modified eagle medium)
CFA(根据Ghosh等等，Journal of Clinical Microbiology，1993 31 2163-6)
Muller Hinton琼脂(Oxoid)
LB(Luria Bertami，Maniatis，实验室手册，冷泉港，1992)
C14-醋酸盐(53，4Ci/mMol，Amersham International PLC)
PBS(NaCl8/l，KCl0.2g/l，nAhpo4 1.15g/l，kh2po4 0.2g/l)
胰蛋白酶-EDTA溶液(Seromed)
FCS胎牛血清(Gibco)
从西雅图华盛顿大学获得大肠杆菌DAEC C 1845，从美国马里兰大学疫苗发展中心获得E大肠杆菌JPN15。
从美国加利福尼亚斯坦福大学微生物系获得鼠沙门氏菌株SL1344。这种菌株作为病员细菌作用在小鼠上，这种细菌抗链球菌。它粘附在Cac)-2结肠细胞(Finlay和Falkow，1990)。
从法国Faculte de Pharmacie Paris XI Chatenay-Malabry，微生物实验室获得的库存临床分离物获得克雷伯氏杆菌.
从INSERM Unit411，Hpital Necker，Paris，France，获得耶尔森氏杆菌。
从Faculte de Pharmacie Paris XI，Chatenay-Malabry，France的微生物实验室的库存临床分离物获得铜绿假单胞菌。
从Institute of Microbiology，Lausanne University，Lausanne Switzerland获得幽门螺杆菌。
实施例1
双歧杆菌的分离
从15到27天大的健康婴儿的尿布收集新鲜的粪便。1克新鲜粪便在无氧的条件下送到实验室，并且在从取样开始的两小时内用Ringer溶液系列稀释，并涂在选择性培养基上进行微生物分析。密集的西红柿琼脂(罐装西红柿汁400ml，密集的琼脂BBL45.5g，麦芽糖(Difco)10g，血晶素sigma 5mg，琼脂(Difco)5g，蒸馏水600ml)37℃下培养48小时用于分离双歧杆菌。随机采集菌落并提纯。对于分离株进行生理学和遗传学表征。
实施例2
培养细胞系
Caco-2细胞：
细胞系Caco-2作为小肠的成熟的肠细胞模型，用于抑制作用的检验。这种细胞具有肠细胞特征例如极化、肠酶表达、特定结构多肽的制备等等。这些细胞在不同的载体上生长，也就是在塑料盘(25cm2 Corning)用于生长和繁殖，在脱脂和灭菌6well玻璃皿(22×22mm，cornning)用于粘附和抑制试验。在培养第二天后按照日常规则改变培养基(DMEM)。在使用之前，用100U/ml的青霉素/链霉素，1μm氨苄青霉素，56℃30分钟灭活的20％FC和含有非必需氨基酸溶液1％(10Mm)(Eurobio，Paris，France)补充培养基。在90％的空气和10％的CO2组成的大气中37℃下培养。这些细胞每六天分离一次。这些细胞在PBS中pH7.2条件下用0.015％胰酶和3mM EDTA进行处理。为了中和胰酶的作用，等体积的含有FCS的培养基加入获得的细胞悬浮液，将这些混合物离心分离(1000转10分钟)然后在培养基介质中溶解分离产物。计算活细胞数量(不用苔盼蓝染色)。大约3.5×105活细胞转移到新的培养瓶，每个孔大约1.4×105细胞并培养直到获得细胞融合单层。
T84细胞：
为了分析粘附性，细胞系T84作为肠的结肠细胞样品。这些细胞系具有肠细胞的特征例如极性、肠酶表达、特别结构多肽的生产等等。从University ofCalifornia，San Diego，CA.获得T84细胞。在90％的空气和10％的CO2组成的大气中37℃条件下细胞在DMEM(50％)和Ham`s F12(50％)中生长，用2mM谷氨酸盐，50mM HEPES，1％非必需氨基酸和10％的灭活(30分钟，56℃)胎牛血清(Boehringer，Mannheim，Germany)补充。细胞以106/cm2的浓度接种。细胞最迟在汇合后也就是在10天以后进行粘附性能检验。
除了双歧杆菌外所有的菌株-80℃维持在含有15％甘油的培养基中。因为转移到新培养基的数目对于粘附因子有影响，在24小时内只转移2次沙门氏菌株，第一次在菌株处于冰冻状态时转移。所有培养物进行有氧的培养。
双歧杆菌：
双歧杆菌菌株(长双歧杆菌CNCM I-2169(B128/Cal)和长双歧杆菌CNCMI-2170(BL29/F9)在-20℃贮存在含有15％甘油的MRS培养基中。在抑制性能检测之前这些菌株在无氧条件下在MRS中生长并以24小时的间隔转移到新培养基中两次。用于检测的浓度是2×109cfu/ml。通过以20,000rpm的转速离心分离1小时获得上清液，然后检测存在的细菌。双裂菌菌株在MRS37℃无氧培养18小时。然后离心分离(4℃，20分钟)这些培养基，收集上清液，冻干，转变成溶液然后离心分离10次(10×)。上清液的pH值最后调节到4.5。
E大肠杆菌C1845：
在解冻后第一次传代在CFA-Muller Hinton琼脂上进行，这种琼脂适合于完成细菌粘附因子表达。在每一次试验前，在每24个小时转移到新的培养基细菌细胞在37℃培养。
克雷伯氏杆菌：
在37℃条件下细菌在Luria肉汤中过夜培养18小时。
耶尔森氏杆菌：
在37℃条件下细菌在Luria肉汤中过夜培养18小时。
铜绿假单胞菌：
在37℃条件下细菌在Luria肉汤中过夜培养18小时。
幽门螺杆菌
细菌在含有0.25％的酵母提取物(Difco Laboratories，Detroit，MI)，10％的马血清和0.4％的Campylobacter选择性补充剂(Skirrow supplement，SR69；Oxoid Ltd，Basingstoke，England).的脑-心-浸液(BHI)-琼脂板中培养.
实施例4
B1288Cal和BL29/F9对T84和Caco-2细胞的粘附
在玻璃盖玻片上制备的Cac)-2和T84单层用磷酸盐缓冲剂(PBS)洗涤两次，所说的玻璃盖玻片放在6孔Corning组织培养皿中(Corning Glass Works，Corning，NY)。将双歧杆菌1ml，4×108细菌/ml spent培养基上清液，处理上清液或新鲜的MRS肉汤)加入1ml的这种细胞培养基中。这种上清液(2ml)加入每个组织培养基皿的孔中并将其在37℃ 10％CO2/90％的空气中培养。在培养1小时后，这种单层用灭菌PBS洗涤5次，用甲醇固化，用革兰氏染色剂染色，用显微镜进行检测。每一次粘附检测连续进行三次肠细胞的重复试验。对于每一个玻璃盖上的单层在20个任意的显微区域评估粘附细菌的数目。为了排除人为因素，由两个不同的技术人员评估粘附。
试验结果如图1所示，很明显B128/Cal和BL29/F9都有粘附在肠细胞的能力并可以和已知的细胞系GG(WO97/00078)或Lal(EP0577903)相比。
实施例5
双歧杆菌的抗病活性
选用了病原性细菌大肠杆菌、克雷伯氏杆菌、耶尔森氏杆菌、铜绿假单胞菌和幽门螺杆菌。
细菌(B128/Cal或BL29/F9)的培养基在MRS培养基总保持18小时，产生指数增长的培养物(37℃3小时)。取出2ml溶液在4℃5500g离心分离5分钟。在收集上清液后，沉淀用灭菌PBS洗涤。在离心分离后，收集沉淀加入2ml无菌PBS。计数细菌并按照浓度在1到5×106之间细菌/ml制成悬浮液。
按照Lehrer等J.Imunol.Methods 137(1991)，167-173描述的Lehrer法对本发明的双歧杆菌的抗菌的作用进行了检验，这项方法的文件请见参考文献。检验结果如图2和图3所示。
从上述试验结果可以看出本发明的双歧杆菌可以有效的抑制各种病原细菌的生长。
实施例6
抑制沙门氏菌的检验
沙门氏菌是一种侵入表皮细胞并在那里大量繁殖的细菌。为了测定本发明双歧杆菌的抑制鼠沙门氏菌的能力，采用了菌株SL1344和如下的方法。
在LB-培养基中培养病原细胞。在第二次传代到新的培养基之后，采用10μCi/ml放射性同位素C14-醋酸盐在LB-培养基中标记细菌菌株。在该培养基中在37℃培养18小时。
随后离心分离(1041rpm，15分钟)细菌悬浮液，从上清液中去除残余的C14-醋酸盐。将沉淀在PBS中悬浮并洗涤，这些细胞以大约108细胞/ml的浓度在1％的灭菌甘露糖溶液中悬浮。甘露糖抑制非特异性粘附。然后将细菌溶液调整到2×108细胞/毫升。
在37℃将病原菌(1ml；2×108细胞)和一部分(1ml)双歧杆菌培养基的上清液预培养2小时。然后离心分离悬浮液，去除得到的上清液，将沉淀在0.5ml的PBS中再一次悬浮。随后将病原菌溶液(0.5ml)和人类肠细胞在培养物中接触。培养物用灭菌PBS洗涤两次并加入0.5ml粘附培养基(DMEM)。然后在37℃在10％CO2条件下培养这些细胞1小时。
在培养后，计算培养基中和在肠细胞上/内的细菌数目。为了测定粘附在细胞上的量或侵入肠细胞的量，采用了如下方法。
为了测量粘附细菌的数目，轻轻倒出培养基，用培养基介质洗涤一次，用灭菌PBS洗涤一次。随后，每个间隔加入1ml灭菌水，溶胞细胞并形成细胞溶液，在37℃培养1-2小时，然后连续稀释。为了计数粘附和侵入的细菌数目，离心分离细胞溶液去除细胞碎片然后测量放射性。
按照另一个方案，将10等分试样加在TSA培养基上。然后在37℃培养18-24小时。
为了测量侵入细菌的量，Caco-2细胞用PBS洗涤以去除所有的没有粘附的细胞。随后，加入含有庆大霉素(20μg/ml)的培养基并在37℃连续培养1小时。庆大霉素是一种抗生素但不进入肠细胞，于是所有的细胞外的微生物都被杀死，而已经侵入肠细胞的细菌将存活。这些细胞然后在37℃再培养一个小时并用PBS洗涤两次。在37℃通过加入灭菌蒸馏水和培养，来溶胞这些细胞。在去除了细胞碎片后，测量放射性。按照另一个方案采用TSA培养基连续稀释。在37℃培养18-24小时。
可以看出培养的细胞和培养物上清液对于防止沙门氏菌的粘附和侵入肠细胞具有极其有效的作用。
实施例7
鼠沙门氏菌C5菌株感染小鼠
成年、7-8周大的无菌雌性小鼠(C3H/He/oujco conventional，Iffa Credo，France)，在无菌条件下饲养，用固定浓度的鼠沙门氏菌(0.2ml，108cfu/每只小鼠)通过口服感染。一些小鼠植入双歧杆菌从而成为单主寄生物。将这些小鼠的肠子片段用PBS洗涤并切碎，计算双歧杆菌的数目。另一些小鼠保持在无菌环境中，和对照组的小鼠的存活天数进行比较。
结果如图5所示，正如所推测的，对照组几乎所有的小鼠在大约10天左右死掉。与此对比，用BL29/F9处理的所有的小鼠都活过10天，只有20％的小鼠在30天以后被沙门氏菌致死。这些试验结果表明本发明的双歧杆菌有极其有效的上述性能。
申请人或代理人挡案号 国际申请号
    关于微生物保藏的说明
        (细则13之二)
A.对说明书第          2页，第17          行所述的微生物的说明
B.保藏事项
保藏单位名称    国立巴斯德研究所微生物培养物保藏中心
保藏单位地址(包括邮政编码和国名)25，Rue du Docteur RouxF-75724 Paris Cedex 15
保藏日期    1999年3月15日    保藏编号    NCC 251-I-2169/2170
C.补充说明(必要时)
D.本说明是为下列指定国作的(如果说明不是为所有指定国而作的)
E.补充说明(必要时)
下列说明将随后向国际局提供(写出说明的类别，例如：“保藏的编号”)
PCT/RO/134表(1992年7月)

Claims (8)

1.能够预防引起腹泻的细菌在肠内建群的双歧杆菌的培养物上清液在可吸收的载体物质中的应用。
2.双歧杆菌的应用，其中用于制备可吸收的载体物质的双歧杆菌是长双歧杆菌CNCM1-2169(B128/Cal)或长双歧杆菌CNCM1-2170(BL29/F9)。
3.权利要求2中的应用，其中的双歧杆菌在载体物质中的含量为大约105cfu/g到大约1012fu/g载体物质。
4.权利要求1到3中的应用，其中所使用的载体物质是一种食物组合物选自奶、酸奶酪、凝乳、干酪、发酵奶、奶基发酵产品、冰激凌、谷类发酵产品、奶粉、婴儿食品、宠物食品或片剂、液体细菌悬浮液、干口服补充剂、湿口服补充剂、干的管饲、湿的管饲或宠物食品。
5.权利要求1到4任一权利要求的应用，其中的载体物质用于治疗和/或预防腹泻相关的失调。
6.能够防止引起腹泻的细菌建群的双歧杆菌，它是长双歧杆菌CNCM1-2169(B128/Cal)或长双歧杆菌CNCM1-2170(BL29/F9)。
7.含有至少一种权利要求6双歧杆菌或能够防止腹泻的双歧杆菌培养物上清液的食物或药物组合物。
8.权利要求7的组合物，选自奶、酸奶酪、凝乳、干酪、发酵奶、奶基发酵产品、冰激凌、谷类发酵产品、奶粉、婴儿食品、宠物食品，片剂、液体细菌悬浮液、干口服补充剂、湿口服补充剂、干的管饲、湿的管饲或宠物食品。
CNB008112452A 1999-08-05 2000-07-26 预防病原性细菌引起的腹泻的新双歧杆菌 Expired - Fee Related CN1186440C (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP99115502.9 1999-08-05
EP99115502 1999-08-05

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1369005A true CN1369005A (zh) 2002-09-11
CN1186440C CN1186440C (zh) 2005-01-26

Family

ID=8238733

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNB008112452A Expired - Fee Related CN1186440C (zh) 1999-08-05 2000-07-26 预防病原性细菌引起的腹泻的新双歧杆菌

Country Status (12)

Country Link
US (2) US6926891B1 (zh)
EP (1) EP1206523B1 (zh)
CN (1) CN1186440C (zh)
AT (1) ATE425244T1 (zh)
AU (1) AU6160200A (zh)
BR (1) BR0012992A (zh)
CA (1) CA2380849C (zh)
DE (1) DE60041770D1 (zh)
ES (1) ES2321797T3 (zh)
HK (1) HK1046929A1 (zh)
TR (1) TR200200301T2 (zh)
WO (1) WO2001011015A1 (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN100558883C (zh) * 2003-01-31 2009-11-11 普罗比公司 具有产生谷氨酰胺的能力的双歧杆菌属的新菌株
CN103997903A (zh) * 2011-12-29 2014-08-20 希尔氏宠物营养品公司 用于改善胃肠菌群的组合物和方法
CN114747534A (zh) * 2021-12-02 2022-07-15 中国农业大学 腹泻性大肠杆菌感染动物模型的构建方法及其应用

Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1384483A1 (en) * 2002-07-23 2004-01-28 Nestec S.A. Probiotics for treatment of irritable bowel disease (IBS) through improvement of gut neuromuscular function
CN101273736B (zh) * 2007-03-28 2012-08-08 北京弗蒙特生物技术有限公司 一种在常温下保持高活菌数的发酵乳的制备方法
EP1997880A1 (en) * 2007-05-31 2008-12-03 Puleva Biotech, S.A. Breast milk bifidobacteria, compositions thereof, their use and a novel culture media to obtain them
EP2455094A1 (en) 2010-11-11 2012-05-23 Nestec S.A. Non-replicating probiotic micro-organisms protect children against gastrointestinal infections
US10492372B2 (en) 2011-05-05 2019-12-03 Steven J Terrell Apparatus for aerial tool configurations
US11382279B2 (en) 2011-05-05 2022-07-12 Steven J Terrell Apparatus for aerial tool configurations
US11690324B2 (en) 2011-05-05 2023-07-04 Steven J Terrell Apparatus for aerial tool configurations
US10492373B2 (en) 2011-05-05 2019-12-03 Steven J Terrell Apparatus for aerial tool configurations
US11330766B2 (en) 2011-05-05 2022-05-17 Steven J Terrell Apparatus for aerial tool configurations
US10798877B2 (en) 2011-05-05 2020-10-13 Steven J Terrell Apparatus for aerial tool configurations
BR112014021388A2 (pt) 2012-02-29 2017-07-18 Ethicon Endo Surgery Inc composições de microbiota e métodos rela-cionados às mesmas
EP3212001A4 (en) 2014-10-31 2018-04-25 Whole Biome Inc. Methods and compositions relating to microbial treatment and diagnosis of disorders
WO2016129863A1 (en) 2015-02-12 2016-08-18 Samsung Electronics Co., Ltd. Payment processing method and electronic device supporting the same
KR102460459B1 (ko) 2015-02-27 2022-10-28 삼성전자주식회사 전자 장치를 이용한 카드 서비스 방법 및 장치
WO2016137277A1 (en) 2015-02-27 2016-09-01 Samsung Electronics Co., Ltd. Electronic device providing electronic payment function and operating method thereof
US10193700B2 (en) 2015-02-27 2019-01-29 Samsung Electronics Co., Ltd. Trust-zone-based end-to-end security
US10699274B2 (en) 2015-08-24 2020-06-30 Samsung Electronics Co., Ltd. Apparatus and method for secure electronic payment
US10846696B2 (en) 2015-08-24 2020-11-24 Samsung Electronics Co., Ltd. Apparatus and method for trusted execution environment based secure payment transactions
CA3073838A1 (en) 2017-08-30 2019-03-07 Pendulum Therapeutics, Inc. Methods and compositions for treatment of microbiome-associated disorders
AU2019306649A1 (en) 2018-07-19 2021-02-04 Pendulum Therapeutics, Inc. Methods and compositions for microbial engraftment
AU2021272294A1 (en) * 2020-05-14 2022-10-20 Société des Produits Nestlé S.A. Methods and compositions using serpin producing bacteria
CN116121119B (zh) * 2022-11-30 2024-01-26 天津小薇生物科技有限公司 一种治疗腹泻的长双歧杆菌bc012及其应用

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK0577904T3 (da) * 1992-07-06 1997-10-27 Nestle Sa Mælkesyrebakterie.
EP0577903B1 (fr) 1992-07-06 1997-12-17 Societe Des Produits Nestle S.A. Agent antigastrite
FI104465B (fi) 1995-06-14 2000-02-15 Valio Oy Proteiinihydrolysaatteja allergioiden hoitamiseksi tai estämiseksi, niiden valmistus ja käyttö
IT1288119B1 (it) * 1996-06-28 1998-09-10 Renata Maria Anna Ve Cavaliere Composizioni dietetiche da utilizzare nell'alimentazione per via enterica

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN100558883C (zh) * 2003-01-31 2009-11-11 普罗比公司 具有产生谷氨酰胺的能力的双歧杆菌属的新菌株
CN103997903A (zh) * 2011-12-29 2014-08-20 希尔氏宠物营养品公司 用于改善胃肠菌群的组合物和方法
CN114747534A (zh) * 2021-12-02 2022-07-15 中国农业大学 腹泻性大肠杆菌感染动物模型的构建方法及其应用
CN114747534B (zh) * 2021-12-02 2023-04-18 中国农业大学 腹泻性大肠杆菌感染动物模型的构建方法及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CA2380849A1 (en) 2001-02-15
CN1186440C (zh) 2005-01-26
EP1206523B1 (en) 2009-03-11
ES2321797T3 (es) 2009-06-12
US20050260170A1 (en) 2005-11-24
ATE425244T1 (de) 2009-03-15
CA2380849C (en) 2010-06-29
HK1046929A1 (zh) 2003-01-30
US7767430B2 (en) 2010-08-03
TR200200301T2 (tr) 2004-12-21
EP1206523A1 (en) 2002-05-22
AU6160200A (en) 2001-03-05
WO2001011015A1 (en) 2001-02-15
BR0012992A (pt) 2002-05-07
US6926891B1 (en) 2005-08-09
DE60041770D1 (de) 2009-04-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1369005A (zh) 预防病原性细菌引起的腹泻的新双歧杆菌
CN1153575C (zh) 包含鼠李糖乳杆菌的药物制剂
ES2524589T3 (es) Nueva Lactobacillus sakei Probio-65 ácido tolerante con capacidad para suprimir el crecimiento de microorganismos patógenos y con efecto antialérgico
FI59925C (fi) Foerfarande foer framstaellning av ett bakteriepreparat anvaendbart foer foerhindrande av salmonellainfektion hos fjaederfae
KR101618391B1 (ko) 높은 옥살산 분해능을 갖는 유산균
JP2004523241A (ja) プロバイオティクスとして有用な新規ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｒｅｕｔｅｒｉ）
TW201204374A (en) Lactobacillus plantarum and uses thereof
CN112877233B (zh) 一种瑞士乳杆菌菌株及其应用
WO1994003195A1 (en) Probiotic for control of salmonella
JP4589618B2 (ja) 免疫調節性機能を誘導する乳酸菌類とその成分
WO2020063531A1 (zh) 副干酪乳杆菌et-22及其用途
Ostad et al. Live and heat-inactivated lactobacilli from feces inhibit Salmonella typhi and Escherichia coli adherence to Caco-2 cells
Todorov et al. Bacteriocin production and resistance to drugs are advantageous features for Lactobacillus acidophilus La-14, a potential probiotic strain
WO2017071346A1 (zh) 脆弱拟杆菌在抗水产病原菌中的应用
WO2024260441A1 (zh) 一种复合菌粉制剂及其制备方法和用途
US20070134220A1 (en) Lactobacillus fermentum strain and uses thereof
CN116790402B (zh) 一株具有抗炎特性的单形拟杆菌菌株、培养方法及应用
CN1198631C (zh) 双歧杆菌在制备预防腹泻药物中的用途
JP2004135669A6 (ja) ヘリコバクターピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉ）及びリステリアモノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）の生育を抑制する抗菌活性物質を生産するペディオコッカスペントサセウス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）ＣＢＴ−８と命名される乳酸菌株、これを利用した抗菌特性を持つ抗菌物質製造方法、並びに生菌剤抗菌物質を機能性食品及び医薬品に利用する方法
Nasir et al. Analysis and characterization of potential probiotic properties of Lactobacillus and Bacillus salmalaya 139SI
CN117721032A (zh) 一种复合菌粉制剂及其制备方法和用途
KR100646938B1 (ko) 헬리코박터 필로리의 정착과 생육 활성을 저해하는락토바실루스 람노서스 아이디씨씨 3201
KR100490284B1 (ko) 돼지 생식기 호흡기 증후군을 유발하는 바이러스의 생육을억제하는 신규한 내산성 프로바이오틱 엔테로코커스훼칼리스 프로바이오-64
EP1243181A1 (en) A probiotic, a food product containing a probiotic, a method for preparation of said food product, a pharmaceutical composition and a use of the probiotic strain
Ghaderian et al. Probiotic therapy, what is the most effective method for host protection against enteric pathogen

Legal Events

Date Code Title Description
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20050126

Termination date: 20170726

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee