CN121204166A - 用于基因编辑的组合物及其在基因编辑中的应用 - Google Patents

Abstract

本申请公开了用于基因编辑的组合物及其在基因编辑中的应用，属于遗传工程技术领域。本申请提供了一种针对毕赤酵母的高效无痕基因编辑方法。本申请提供的技术方案中仅需构建供体片段即可实现毕赤酵母基因的无痕敲入或敲除，并且可以重复利用Ura3作为筛选标记，实现多个基因的敲入或敲除，解决毕赤酵母中多轮基因编辑无筛选标记可用的痛点。

Description

用于基因编辑的组合物及其在基因编辑中的应用

技术领域

本申请属于遗传工程技术领域，具体涉及用于基因编辑的组合物及其在基因编辑中的应用。

背景技术

毕赤酵母（Pichia pastoris）在现代工业中应用非常广泛，其属于甲基营养型微生物，能以甲醇为唯一碳源进行生长。毕赤酵母因其生长较快、基因操作相对简单、拥有诸多可选的强启动子、蛋白表达效率较高、能执行翻译后修饰、分泌的杂蛋白少、易于实现高密度发酵等优点，已被广泛用于表达各种异源蛋白。然而，与蛋白质生产相比，化合物的工程化生物合成通常需要整合多个异源基因并优化多条代谢途径。

URA3基因是酵母菌V号染色体上的编码基因，其产物乳清苷5-磷酸脱羧酶参与尿嘧啶核苷酸的生物合成。该酶的缺失将导致酵母无法自主合成尿嘧啶，形成营养缺陷型表型。该基因在基因编辑技术中被广泛用作筛选标记，通过5-氟乳清酸（5-FOA）毒性筛选系统实现转化菌株的高效筛选。研究者利用其上下游序列构建同源重组臂，开发了多物种适用的遗传操作系统。通过PCR扩增URA3上下游序列与筛选标记（如G418抗性基因）连接形成的敲除盒，可实现基因定向敲除。

目前常用的基因编辑技术依赖于目标基因和选择标记的同时重组，每一轮编辑均需消耗一个筛选标记，而毕赤酵母可用的高效标记仅3-4个，导致多基因连续编辑时面临标记耗尽问题。为了能够进行多轮基因编辑，已经在巴斯德毕赤酵母中建立了几个无标记编辑系统。例如，开发了基于Flp/ FRT和Cre/ loxP重组酶的系统，然而该技术体系在基因组操作后仍会残留重组酶识别位点（FRT/loxP）等冗余序列，这些残留序列可能干扰宿主基因组稳定性，从而引发非预期基因重组的风险。近年来，CRISPR-Cas9系统在毕赤酵母基因组改造中也有一定的应用，但毕赤酵母主要的修复方式是非同源末端连接（Non-homologousend joining，NHEJ）NHEJ途径，Cas9介导的gRNA对基因组的切割一方面要依赖sgRNA的切割效率，一方面需要依赖同源重组（Homologous Recombination，HR），正确整合效率低于有筛选标记的双交换整合。进行多轮基因编辑需要重复消除编辑质粒，如果没有合适的筛选压力，编辑质粒难以消除。

因此，提高毕赤酵母的同源重组（HR）效率并开发可循环使用的筛选标记，以支持多轮高效菌株构建，显得尤为重要。

发明内容

本申请要解决的技术问题是：如何解决现有技术中筛选标记不够用（多次基因编辑受限）、容易在基因组残留筛选标记或其他冗余序列以及编辑效率低等问题。为解决该技术问题，本申请提供以下所述的技术方案：

本申请提供用于基因编辑的组合物，所述组合物包括供体DNA对A或供体DNA对B；

所述供体DNA对A可由名称为供体DNA片段A1和名称为供体DNA片段A2的两种双链DNA组成，供体DNA片段A1的一条DNA单链自上游至下游可含有用于与待编辑细胞进行同源重组的上游同源臂、下游同源臂和Ura3表达框的一部分，所述供体DNA片段A2的一条DNA单链自上游至下游可含有所述Ura3表达框的另一部分和所述下游同源臂；其中所述供体DNA片段A1的所述DNA单链的3’端与所述供体DNA片段2的所述DNA单链的5’端含有序列相同的重合部分，所述重合部分位于所述Ura3表达框；

所述供体DNA对B可由名称为供体DNA片段B1和名称为供体DNA片段B2的两种双链DNA组成，所述供体DNA片段B1的一条DNA单链自上游至下游可含有所述Ura3表达框的一部分、所述上游同源臂和所述下游同源臂；所述供体DNA片段B2的一条DNA单链自上游至下游可含有所述上游同源臂、所述Ura3表达框的另一部分；其中所述供体DNA片段B1的所述DNA单链的5’端与所述供体DNA片段B2的所述DNA单链的3’端含有序列相同的重合部分，所述重合部分位于所述Ura3表达框。

本申请中，所述基因编辑可为基因敲除或敲入。

本申请中，所述上游同源臂或/和下游同源臂的长度可为下述至少一项：100至2000bp、200至1900bp、300至1800bp、400至1700bp、500至1600bp、600至1500bp、700至1400bp、800至1300bp、900至1200bp、900至1100bp、910至1090bp、920至1080bp、930至1070bp、940至1060bp、950至1050bp、960至1040bp、970至1030bp、980至1020bp、990至1010bp和1000bp。

本申请中，A1）中所述的重合部分和/或A2）中所述的重合部分的大小可为下述至少一项：100至2000bp、200至1900bp、300至1800bp、400至1700bp、500至1600bp、600至1500bp、700至1400bp、700至1300bp、700至1200bp、700至1100bp、710至1090bp、720至1080bp、730至1070bp、740至1060bp、750至1050bp、760至1040bp、770至1030bp。

上述的组合物中，所述基因编辑可为基因敲除，所述上游同源臂的序列与所述待编辑细胞中待敲除靶标基因的上游序列相同，所述下游同源臂的序列与所述待敲除靶标基因的下游序列相同。

上述的组合物中，所述基因编辑可为基因敲入，所述供体DNA片段A1和所述供体DNA片段B1中的所述上游同源臂和所述下游同源臂之间还含有待敲入基因表达框；

所述上游同源臂的序列与导入位点的上游序列相同，所述下游同源臂的序列与所述导入位点的下游序列相同，所述导入位点为待敲入基因表达框的导入位置。

本申请中，所述待敲入基因为待导入所述待编辑细胞的细胞。

上述的组合物中，所述供体DNA片段A1和所述供体DNA片段A2能在待编辑细胞发生同源重组整合为重组DNA供体片段A，所述供体DNA片段B1和所述供体DNA片段B2能在待编辑细胞发生同源重组整合为重组DNA供体片段B；

所述重组DNA供体片段A可为下述至少一项：

Ai）所述重组DNA供体片段A的其中一条链自上游至下游含有如下所述的元件：与待编辑细胞进行同源重组的上游同源臂和下游同源臂、所述Ura3表达框和所述下游同源臂；

Aii）所述重组DNA供体片段A的其中一条链自上游至下游含有如下所述的元件：与待编辑细胞进行同源重组的上游同源臂、待敲入基因表达框、与待编辑细胞进行同源重组的下游同源臂、所述Ura3表达框和所述下游同源臂；

所述重组DNA供体片段B可为下述至少一项：

Bi）所述重组DNA供体片段B的其中一条链自上游至下游含有如下所述的元件：与所述待编辑细胞进行同源重组的上游同源臂、所述Ura3表达框、所述上游同源臂和与待编辑细胞进行同源重组的下游同源臂；

Bii）所述重组DNA供体片段B的其中一条链自上游至下游含有如下所述的元件：与所述待编辑细胞进行同源重组的上游同源臂、所述Ura3表达框、所述上游同源臂、所述待敲入基因表达框和与待编辑细胞进行同源重组的下游同源臂。

本申请中，所述Ura3基因是酵母菌V号染色体上的编码基因，其产物乳清苷5-磷酸脱羧酶参与尿嘧啶核苷酸的生物合成。该基因在基因编辑技术中被广泛用作筛选标记，通过5-氟乳清酸（5-FOA）毒性筛选系统实现转化菌株的高效筛选。

本申请中，所述Ura3基因编码的乳清苷5-磷酸脱羧酶为含有263个氨基酸残基的蛋白质。本申请中，所述Ura3基因的编码序列如SEQ ID NO:1第367至1158位所示。

在本申请的一些实施方式中，所述Ura3表达框的核苷酸序列为SEQ ID NO:1。其中，SEQ ID NO:1第1至366位为启动子序列，第367至1158位为Ura3编码序列，第1159至1366位为终止子序列。

在本明的一些实施方式中，用于基因敲除的所述供体DNA片段A1和所述供体DNA片段A2在所述待编辑细胞中发生同源重组整合为Ai）所示的重组DNA供体片段A。

Ai）所示的重组DNA供体片段A的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。其中SEQ ID NO:3第1至988位为所述上游同源臂、第989至1967位为所述下游同源臂、第1968至3333位为所述Ura3表达框，第3334至4312位为所述下游同源臂。

Ai）对应的所述DNA供体片段A1的核苷酸序列为SEQ ID NO:3第1至3114位，所述DNA供体片段A2的核苷酸序列为SEQ ID NO:3第2343至4312位。其中SEQ ID NO:3第2343至3114位为所述供体DNA片段A1和所述供体DNA片段A2的重合序列。

在本申请的一些实施方式中，用于基因敲入的所述供体DNA片段A1和所述供体DNA片段A2在所述待编辑细胞中发生同源重组整合为Aii）所示的重组DNA供体片段A。

Aii）所示的重组DNA供体片段A的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。其中SEQ IDNO:4第1至1056位为敲入位点Int6的上游序列、第1057至4694位为hLF基因表达框、第4695至5729位为敲入位点Int6的下游序列、第5730至7095位为Ura3表达框的序列，第7096至8130位为敲入位点Int6的下游序列。

Aii）对应的供体DNA片段A1的核苷酸序列为SEQ ID NO:4第1至6876位,供体DNA片段A2的核苷酸序列为SEQ ID NO:4第6105至8130位，其中SEQ ID NO:4第6105至6876位为所述供体DNA片段A1和所述供体DNA片段A2的重合序列。

本申请中，用于基因编辑的组合物可为在微生物细胞中进行基因编辑的组合物。

本申请还提供上述的组合物在基因编辑中的应用，所述基因编辑可为基因敲除。

本申请还提供上述的组合物在基因编辑中的应用，所述基因编辑可为基因敲入。

本申请中，所述基因编辑（基因敲除或基因敲入）可为在微生物细胞中进行基因编辑。

本申请还提供基因敲除的方法，所述敲除可包括下述步骤：

S1）将上述的供体DNA对A导入待编辑细胞，筛选含有上述Ai）所述重组DNA供体片段A的重组细胞，或

将上述的供体DNA对B导入待编辑细胞，筛选含有上述Bi）所述重组DNA供体片段B的重组细胞；

S2）筛选在含有尿嘧啶和5-FOA的培养基上存活的目的细胞；

所述待编辑细胞不含所述Ura3基因。

本申请还提供基因敲入的方法，所述敲入可包括下述步骤：

S1’）将上述的供体DNA对A导入待编辑细胞，筛选含有上述Aii）所述重组DNA供体片段A的重组细胞，或

将上述的供体DNA对B导入待编辑细胞，筛选含有上述Bii）所述重组DNA供体片段B的重组细胞；

S2’）筛选在含有尿嘧啶和5-FOA的培养基上存活的目的细胞；

所述待编辑细胞不含所述Ura3基因。

本申请中，S1）或S1’）中的筛选可通过尿嘧啶筛选：重组成功的目的微生物可在不含尿嘧啶的培养基上生长。

本申请中，S1）或S1’）中的筛选还可通过PCR测序筛选：PCR扩增可获得目的产物的为阳性克隆。

本申请中，S2）或S2’）中的筛选可通过尿嘧啶和5-FOA筛选：Ura3基因消除的目的细胞可在含有尿嘧啶和5-FOA的培养基上存活。

本申请中，S2）或S2’）中的筛选还可通过PCR测序筛选：PCR扩增可获得目的产物的为阳性克隆。

在本申请的一些实施方式中，不含尿嘧啶的培养基为MD培养基，其配方为YNB：13.4g/L；葡萄糖：10g/L；琼脂：20g/L，溶剂为水。

在本申请的一些实施方式中，含有尿嘧啶和5-FOA的培养基为MDU+5-FOA培养基，其配方为YNB：13.4g/L；葡萄糖：10g/L；尿嘧啶：100mg/L，5-FOA：1mg/mL；琼脂：20g/L，溶剂为水。

上述的方法中，S1）至S2）所述步骤或/和S1’）至S2’）所述步骤的操作次数为N次，N为≥1的整数，N次操作的区别在于靶标或/和导入位点不同。

本申请中，所述待编辑细胞可为微生物细胞。

本申请中，所述微生物可为细菌或真菌。

本申请中，所述真菌可为酵母。

本申请中，所述酵母包括但不限于：毕赤酵母（Pichia pastoris）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、假丝酵母属（Candida）例如产朊假丝酵母（Candida utilis）、克鲁维酵母属（Kluyveromyces）例如Kluyveromyces lactis或Kluyveromyces marxianus、汉逊酵母属（Hansenula）例如Hansenula polymorpha、裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）、球拟酵母属（Torulopsis）例如Torulopsis versatilis和红酵母属（Rhodotorula）。

上述方法还包括敲除所述待编辑细胞的Ura3基因的步骤。

在本申请的一些实施方式中，通过同源重组敲除所述待编辑细胞的Ura3基因。在本申请的一些具体实施方式中，所述Ura3敲除供体片段的核苷酸序列为SEQ ID NO:2。

本申请取得的有益技术效果如下：

本申请提供的组合物以及基因编辑的方法可以实现待编辑细胞中基因的无痕、多次敲除或敲入。

附图说明

图1为引物Ura3-LR-F和Ura3-LR-R及其扩增的上游同源臂、引物Ura3-RR-F和Ura3-RR-R及其扩增的下游同源臂和毕赤酵母Ura3缺陷菌株PCR鉴定用到的URA3-JD-F和URA3-JD-R与Ura3基因组的位置关系图。

图2为同源臂2与同源臂3相同，表达框2为Ura3表达框时，基因的无痕敲入示意图。

图3为同源臂1与同源臂2相同，表达框1为Ura3表达框时，基因的无痕敲入示意图。

图4为以实施例1中制备的X33ΔUra3缺陷菌株作为宿主菌，以hLF作为敲入基因，以INT6基因作为敲入位点，以“（1）重组供体DNA片段的一种结构”中记载的重组供体DNA结构为例提供的基因敲入示意图。

图5为hLF敲入Int6位点菌落PCR验证。其中图A为纯杂合鉴定，纯合子扩增不出野生型条带，杂合子或野生型能扩增2861bp条带，泳道1、2、5、6、7、9、11、12、13、15、16为纯合子。图B和图C为供体片段整合鉴定，图B阳性克隆扩增条带为7242bp，泳道1、2、3、4、5、6、8为阳性克隆；图C阳性克隆扩增条带为2805bp，泳道1、2、3、4、5、7、8为阳性克隆。Marker为博迈德1kb DNA Ladder，货号MD114。

图6为同源臂2与同源臂3相同时重组DNA片段以及基因的无痕敲除示意图。

图7为同源臂1与同源臂2相同时重组DNA片段以及基因的无痕敲除示意图。

图8为以实施例1中制备的X33ΔUra3缺陷菌株作为宿主菌，以Pep4作为敲除基因，以“（1）重组供体DNA片段的一种结构”中记载的重组供体DNA结构为例提供的基因敲除示意图。

图9为Pep4敲除菌落PCR验证。其中图A泳道1-8为纯杂合鉴定，纯合子扩增不出野生型条带，杂合子或野生型能扩增1233bp条带，泳道6为纯合子。图B为供体片段整合鉴定，泳道1-8所用引物为Pep4-JD-F和Ura3-5-R1，理论大小为3267bp,泳道1、2、5、6、7、8大小正确；泳道9-16所用引物为Ura3 promoter-F1和Pep4-JD-R，理论大小为2505bp，泳道9、11、12、13、14、15、16为阳性克隆。Marker为博迈德1kb DNA Ladder，货号MD114。

具体实施方式

一、本申请中的术语：

描述本文使用的许多与分子生物学相关的术语的资源的例子可见于如下文献中找到：Alberts等,Molecular Biology of The Cell,第5版,Garland SciencePublishing,Inc.:New York,2007; Rieger 等,Glossary of Genetics: Classical andMolecular, 第5版, Springer-Verlag: New York, 1991; King 等, A Dictionary ofGenetics, 第6版, Oxford University Press: New York, 2002; 以及Lewin,GenesIX,Oxford University Press: New York, 2007。

本文引用的任何参考文献，包括例如所有专利、公开的专利申请和非专利出版物，均通过引用整体并入。

为了便于理解本公开，本文中使用的若干术语和缩写定义如下：

本申请中，“一致性”是指氨基酸序列或核苷酸序列的一致性（identity）。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列（或核苷酸序列）的一致性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Perresidue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85（缺省值）并进行检索一对氨基酸序列的一致性进行计算，然后即可获得一致性的值（%）。

具体的，所述70%以上一致性可为75%以上一致性。具体的，所述75%以上一致性可为80%以上一致性。具体的，所述80%以上一致性可为85%以上一致性。具体的，所述85%以上一致性可为90%以上一致性。具体的，所述90%以上一致性可为91%以上一致性、92%以上一致性、93%以上一致性、94%以上一致性、95%以上一致性、96%以上一致性、97%以上一致性、98%以上一致性或99%以上一致性。更具体的，所述70％以上的一致性可为至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的一致性。

当在两个或更多个项目的列表中使用时，术语“和/或”表示所列出的项目中的任何一项可以单独使用或者与所列出的项目中的任何一个或多个组合使用。例如，表述“A和/或B”旨在表示A和B中的任一个或两者，即单独的A、单独的B、或A和B的组合。表述“A、B和/或C”意指单独的A、单独的B、单独的C、A和B的组合、A和C的组合、B和C的组合、或者A、B和C的组合。

如本领域通常理解的，术语“启动子”通常可以指含有RNA聚合酶结合位点、转录起始位点和/或TATA盒并辅助或促进可转录DNA转录的DNA。启动子可以由人工合成产生、改变或衍生自已知或天然存在的启动子。启动子还可以包括包含两个或更多个异源序列的组合的嵌合启动子。因此，本申请的启动子可以包括与本文提供的其他启动子序列在组成上相似但不相同的启动子序列的变体。

术语“可转录DNA”是指可以转录成RNA分子的DNA。

术语“可操作地连接”可指启动子与可转录DNA之间进行功能性连接，使得启动子发挥作用以启动可转录DNA的转录。术语“可操作地连接”也指其他调控元件与目的基因之间进行功能性连接，以调控目的基因的转录和/或表达。

如本文所用，“表达框”是指至少包含可转录DNA，所述可转录DNA可操作地连接至一个或多个调控元件，通常至少启动子和3'UTR（如终止子）。

如本文所用，术语“载体”意指可用于转化目的的任何构建体，即，将异源DNA引入宿主细胞中。如质粒、粘粒、病毒、噬菌体、或线性或环状DNA。

本申请中，“编辑”或“基因组编辑”是指使用靶向基因组编辑技术产生内源待编辑细胞基因组核酸序列的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少75、至少100、至少250、至少500、至少1000、至少2500、至少5000或至少10,000个核苷酸的靶向突变、缺失、倒位或取代。

本申请中，“编辑”或“基因组编辑”还涵盖使用靶向基因组编辑技术将至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少75、至少100、至少250、至少500、至少750、至少1000、至少1500、至少2000、至少2500、至少3000、至少4000、至少5000或至少10,000个核苷酸靶向插入或定点整合到待编辑细胞的内源基因组中。

二、实施例

下面结合具体实施方式对本申请进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本申请，而不是为了限制本申请的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本申请的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中，所述YNB（无氨基酵母氮源（含硫酸胺,不含氨基酸））为博奥拓达公司的产品，货号为Y6050G；实施例中简称为YNB。

下述实施例中的定量试验，如无特殊说明均设置三次重复，结果取平均值。

实施例1、获得Ura3缺陷的酵母菌株

1.1、Ura3缺陷的酵母菌株的制备方法

以受体酵母菌株基因组为模板，引物Ura3-LR-F和Ura3-LR-R扩增上游同源臂，引物Ura3-RR-F和Ura3-RR-R扩增下游同源臂，胶回收。以两段回收的同源臂作为模板，使用引物Ura3-LR-F和Ura3-RR-R扩增Ura3敲除供体片段，胶回收。引物Ura3-LR-F和Ura3-LR-R及其扩增的上游同源臂、引物Ura3-RR-F和Ura3-RR-R及其扩增的下游同源臂和毕赤酵母Ura3缺陷菌株PCR鉴定用到的URA3-JD-F和URA3-JD-R与Ura3基因组的位置关系如图1所示。

1.2、获得毕赤酵母Ura3缺陷菌株

以毕赤酵母X33为例，就1.1的方法进行具体说明如下：

以X33基因组为模板，引物Ura3-LR-F和Ura3-LR-R扩增上游同源臂，引物Ura3-RR-F和Ura3-RR-R扩增下游同源臂，胶回收。以两段回收的同源臂作为模板，使用引物Ura3-LR-F和Ura3-RR-R扩增Ura3敲除供体片段，胶回收。测序结果表明：Ura3敲除供体片段的核苷酸序列为SEQ ID NO:2。SEQ ID NO:2第1至1057位为上游同源臂，第1058至2086位为下游同源臂，将获得的供体片段电转到X33电转感受态中，涂布于MDU+5-FOA平板，待长出单克隆后用下述两种方式进行阳性克隆鉴定，两种鉴定方式鉴定均为阳性的克隆为毕赤酵母Ura3缺陷菌株，命名为X33ΔUra3缺陷菌株。

鉴定方式1：用引物URA3-JD-F和URA3-JD-R进行菌落PCR鉴定，Ura3成功敲除的阳性克隆PCR扩增条带为2411bp，未敲除则PCR扩增条带为3203bp。

鉴定方式2:将单克隆分别在MD和MDU+5-FOA平板上培养，Ura3成功敲除的阳性克隆能在MDU+5-FOA上正常生长，而在MD不长。

MDU+5-FOA平板的配方为YNB：13.4g/L；葡萄糖：10g/L；尿嘧啶：100mg/L，5-FOA：1mg/mL；琼脂：20g/L，溶剂为水。

MD平板的配方为YNB：13.4g/L；葡萄糖：10g/L；琼脂：20g/L，溶剂为水。

实施例2、基因敲入ΔUra3缺陷菌株的无痕编辑方法

2.1、基因敲入ΔUra3缺陷菌株的无痕编辑方法

构建供体DNA片段1和供体DNA片段2，供体DNA片段1和供体DNA片段2含有重合序列，将供体DNA片段1和供体DNA片段2转化至宿主菌株（ΔUra3缺陷菌株）中，在宿主中产生一条DNA单链为如下结构的重组供体DNA片段：同源臂1-表达框1-同源臂2-表达框2-同源臂3。其中，表达框1和表达框2分别为敲入基因表达框或Ura3表达框；同源臂1、同源臂2和同源臂3满足以下条件：同源臂1与同源臂2相同或同源臂2与同源臂3相同；两个相同的同源臂之间的表达框为Ura3表达框，另一个表达框为敲入基因表达框。

（1）重组供体DNA片段的一种结构

同源臂2与同源臂3相同，表达框2为Ura3表达框时，基因的无痕敲入示意图如图2所示。其中，供体DNA片段1的一条DNA单链自上游至下游分别为：敲入位点的上游序列（图中标记为UP-In）、敲入基因表达框、敲入位点的下游序列（图中标记为DN-In）、Ura3表达框的一部分。供体DNA片段2的一条DNA单链自上游至下游分别为：Ura3表达框的一部分和所述敲入位点的下游序列（图中标记为DN-In）。供体DNA片段1和供体DNA片段2中的Ura3表达框存在700bp左右的重合序列。在供体DNA片段1和供体DNA片段2电转化至宿主细胞时利用宿主自身的DNA修复使供体DNA片段1和供体DNA片段2组成一条完整的供体产生整合至宿主基因组的重组供体片段。所述重组供体片段的一条DNA单链的结构为：敲入位点的上游序列（图中标记为UP-In）、敲入基因表达框、敲入位点的下游序列（图中标记为DN-In）、Ura3表达框和所述敲入位点的下游序列（图中标记为DN-In）。

含有重组供体片段的阳性纯合子筛选：重组供体片段与宿主细胞发生同源重组将供体DNA片段整合至敲入位点。通过PCR鉴定阳性纯合子。

5-FOA加压筛选：筛选的阳性纯合子进一步通过MDU+5-FOA平板进行加压筛选，最终获得Ura3消除的重组菌，实现了基因无痕敲入。

（2）重组供体DNA片段的另一种结构

同源臂1与同源臂2相同，表达框1为Ura3表达框时，基因的无痕敲入示意图如图3所示。其中，供体DNA片段1的一条DNA单链自上游至下游分别为：Ura3表达框的一部分、敲入位点的上游序列（图中标记为UP-In）、敲入基因表达框、敲入位点的下游序列（图中标记为DN-In）。供体DNA片段2的一条DNA单链自上游至下游分别为：敲入位点的上游序列（图中标记为UP-In）和Ura3表达框的一部分。供体DNA片段1和供体DNA片段2中的Ura3表达框存在700bp左右的重合序列。在供体DNA片段1和供体DNA片段2电转化至宿主细胞时利用宿主自身的DNA修复使供体DNA片段1和供体DNA片段2组成一条完整的供体产生整合至宿主基因组的重组供体片段。所述重组供体片段的一条DNA单链的结构为：敲入位点的上游序列（图中标记为UP-In）、Ura3表达框、敲入位点的上游序列（图中标记为UP-In）、敲入基因表达框和所述敲入位点的下游序列（图中标记为DN-In）。

供体DNA片段1和供体DNA片段2电转化宿主后含有重组供体片段的阳性纯合子筛选以及5-FOA加压筛选参照“（1）重组供体DNA片段的一种结构”中的方法，其区别仅在于引物序列不同。

2.2、将hLF敲入X33ΔUra3缺陷菌株INT6位点

以实施例1中制备的X33ΔUra3缺陷菌株作为宿主菌，以hLF作为敲入基因，以INT6基因作为敲入位点，以“（1）重组供体DNA片段的一种结构”中记载的重组供体DNA结构为例，就2.1的方法进行具体说明如下，其中示意图如图4所示。

（1）构建hLF敲入供体

由于供体中有两段完全相同的序列，用普通的overlap PCR难以获得完整的供体片段，所以将供体片段分为两部分分别构建，两个供体在Ura3处重叠约700bp，转入酵母细胞后利用酵母自身的DNA修复重组成一条完整的供体。具体构建如下：

以X33基因组为模板，用引物Int6-UP-F和Int6-UP-R扩增上游同源臂，Int6-DN-F和Int6-DN-R扩增下游同源臂，Ura3 promoter-F和Ura3-5-R1扩增部分Ura3表达框计为5-Ura3，Ura3 promoter-F和Ura3tt-R扩增部分Ura3表达框计为3-Ura3，分别胶回收。以pPICZαA-hLF质粒为模板，用引物pAOX1-F和AOX1tt-R扩增hLF表达框，胶回收。以回收的上游同源臂、hLF表达框、下游同源臂和5-Ura3为模板，用引物Int6-UP-F和Ura3-5-R1进行Overlap，获得供体DNA片段1。以回收的下游同源臂和3-Ura3为模板，用引物Ura3-3-F和Int6-DN-R进行Overlap PCR，获得供体DNA片段2。

供体DNA片段1的核苷酸序列为SEQ ID NO:4第1至6876位。其中SEQ ID NO:4第1至1056位为敲入位点Int6的上游序列（图中标记为UP-Int6）、第1057至4694位为hLF基因表达框（第1057至1995位为启动子序列，第2269至4344位为hLF基因的编码序列，第4448至4694位为终止子序列）、第4695至5729位为敲入位点Int6的下游序列（图中标记为DN-Int6）、第5730至6876位为Ura3表达框的部分序列（其中第6105至6876位为重合序列）。

供体DNA片段2的核苷酸序列为SEQ ID NO:4第6105至8130位，第6105至7095位为Ura3表达框的部分序列（其中第6105至6876位为重合序列），第7096至8130位为敲入位点Int6的下游序列（图中标记为DN-Int6）。

（2）筛选阳性克隆

将获得的供体DNA片段1和供体DNA片段2电转到X33ΔUra3缺陷菌株电转感受态中，涂布于MD平板，待长出单克隆进行菌落PCR鉴定。由于毕赤酵母是二倍体，首先用引物Int6-JD-F和Int6-JD-R鉴定纯杂合，由于成功整合的供体片段中有两段完全一致的序列，用PCR扩增不出来，因此PCR扩增无野生型条带的为纯合子。选择8个纯合子进行进一步验证，用Int6-JD-F和Ura3-5-R1与Ura3 promoter-F和Int6-JD-R分别进行扩增，分别能正确扩增出7242bp和2805bp条带则表明供体DNA片段1和供体DNA片段2在基因组上进行了正确整合，两对引物均有正确扩增的为阳性克隆。

图5为hLF敲入Int6位点菌落PCR验证。其中图A为纯杂合鉴定，纯合子扩增不出野生型条带，杂合子或野生型能扩增2861bp条带，泳道1、2、5、6、7、9、11、12、13、15、16为纯合子。图B和图C为供体片段整合鉴定，图B阳性克隆扩增条带为7242bp，泳道1、2、3、4、5、6、8为阳性克隆；图C阳性克隆扩增条带为2805bp，泳道1、2、3、4、5、7、8为阳性克隆。Marker为博迈德1kb DNA Ladder，货号MD114。

正确整合的重组片段命名为重组供体DNA片段，重组供体DNA片段的的核苷酸序列为SEQ ID NO:4。其中，其中SEQ ID NO:4第1至1056位为敲入位点Int6的上游序列（UP-Int6）、第1057至4694位为hLF基因表达框（第1057至1995位为启动子序列，第2269至4344位为hLF基因编码序列，第4448至4694位为终止子序列）、第4695至5729位为敲入位点Int6的下游序列（DN-Int6）、第5730至7095位为Ura3表达框的序列（其中第6105至6876位为供体DNA片段1和供体DNA片段2的重合序列），第7096至8130位为敲入位点Int6的下游序列（DN-Int6）。

（3）消除Ura3

将步骤2获得的阳性克隆用YPD过夜摇菌，将菌液稀释10倍，涂100微升于MDU+5-FOA平板。待长出单克隆后，分别点到MD和MDU+5-FOA平板上进行验证，在MDU+5-FOA平板上生长，在MD上不长的克隆成功消除Ura3。同时用引物Int6-JD-F和Int6-JD-R进行二次验证，若引物能扩增出大小为6499bp的目的条带，则Ura3消除成功。

Ura3消除成功的重组菌实现了基因无痕敲入。并且，由于Ura3消除成功，获得的重组菌可以按照本申请中图3、图4、图6和图7中至少一项所述的方法进行多轮的基因敲入或敲除。

实施例3、基因敲除

3.1、靶标基因敲除的无痕编辑方法

构建供体DNA片段1和供体DNA片段2，供体DNA片段1和供体DNA片段2含有重合序列，将供体DNA片段1和供体DNA片段2转化至宿主菌株（ΔUra3缺陷菌株）中，在宿主中产生具有如下DNA原件的重组供体DNA片段：自上游至下游的同源臂1、同源臂2和同源臂3以及位于两个序列相同的同源臂之间的Ura3表达框。同源臂1、同源臂2和同源臂3满足以下条件：同源臂2与同源臂1序列相同或同源臂2与同源臂3序列相同；两个序列相同的同源臂之间为Ura3表达框。

（1）重组供体DNA片段的一种结构

同源臂2与同源臂3相同时重组DNA片段以及基因的无痕敲除示意图如图6所示。其中，供体DNA片段1其中的一条DNA单链自上游至下游分别为：靶标基因的上游序列（图中标记为UP-T）、靶标基因的下游序列（图中标记为DN-T）和Ura3表达框的一部分。供体DNA片段2其中的一条DNA单链自上游至下游分别为：Ura3表达框的一部分和所述靶标基因的下游序列（图中标记为DN-T）。供体DNA片段1和供体DNA片段2中的Ura3表达框存在700bp左右的重合序列。在供体DNA片段1和供体DNA片段2电转化至宿主细胞时利用宿主自身的DNA修复使供体DNA片段1和供体DNA片段2组成一条完整的供体产生整合至宿主基因组的重组供体片段。所述重组供体片段其中的一条DNA单链的结构为：靶标基因的上游序列（图中标记为UP）、靶标基因的下游序列（图中标记为DN-T）、Ura3表达框和所述靶标基因的下游序列（图中标记为DN-T）。

供体DNA片段1和供体DNA片段2电转化宿主后含有重组供体片段的阳性纯合子筛选以及5-FOA加压筛选参照实施例2中“（1）重组供体DNA片段的一种结构”中的方法，其区别仅在于引物序列不同。

（2）重组供体DNA片段的另一种结构

同源臂1与同源臂2相同时重组DNA片段以及基因的无痕敲除示意图如图7所示。其中，供体DNA片段1其中的一条DNA单链自上游至下游分别为：Ura3表达框的一部分、靶标基因的上游序列（图中标记为UP-T）和靶标基因的下游序列（图中标记为DN-T）。供体DNA片段2其中的一条DNA单链自上游至下游分别为：所述靶标基因的上游序列（图中标记为UP-T）和Ura3表达框的一部分。供体DNA片段1和供体DNA片段2中的Ura3表达框存在700bp左右的重合序列。在供体DNA片段1和供体DNA片段2电转化至宿主细胞时利用宿主自身的DNA修复使供体DNA片段1和供体DNA片段2组成一条完整的供体产生整合至宿主基因组的重组供体片段。所述重组供体片段其中的一条DNA单链的结构为：靶标基因的上游序列（图中标记为UP-T）、Ura3表达框、所述靶标基因的上游序列（图中标记为UP-T）和靶标基因的下游序列（图中标记为DN-T）。

供体DNA片段1和供体DNA片段2电转化宿主后含有重组供体片段的阳性纯合子筛选以及5-FOA加压筛选参照实施例2中“（1）重组供体DNA片段的一种结构”中的方法，其区别仅在于引物序列不同。

3.2、敲除示例

以实施例1中制备的X33ΔUra3缺陷菌株作为宿主菌，以Pep4作为敲除基因，以“（1）重组供体DNA片段的一种结构”中记载的重组供体DNA结构为例，就3.1的方法进行具体说明如下，其中示意图如图8所示。

（1）构建敲除供体

以X33基因组为模板，用引物Pep4-LR-F和Pep4-LR-R扩增上游同源臂，Pep4-RR-F和Pep4-RR-Ura3-R扩增下游同源臂，Ura3 promoter-F1和Ura3-5-R1扩增部分Ura3表达框记为5-Ura3，分别胶回收后共同作为模板，以引物Pep4-LR-F和Ura3-5-R1进行Overlap得到敲除供体片段1。以X33基因组为模板，用引物Ura3-3-F和Ura3tt-R1扩增部分Ura3表达框计为3-Ura3，Pep4-RR-Ura3-F和Pep4-RR-R扩增下游同源臂，分别胶回收后共同作为模板，用引物Ura3-3-F和Pep4-RR-R进行Overlap得到敲除供体片段2。

供体片段1的核苷酸序列为SEQ ID NO:3第1至3114位，其中第1至988位为所述pep4基因的上游同源臂、第989至1967位为所述pep4基因的下游同源臂、第1968至3114位为所述Ura3表达框的一部分。对应的所述DNA供体片段2的核苷酸序列为SEQ ID NO:3第2343至4312位，第2343至3333位为所述Ura3表达框的一部分，第3334至4312位为所述pep4基因的下游同源臂。其中SEQ ID NO:3第2343至3114位为供体片段1和供体片段2的重合部分。

（2）筛选阳性克隆

将获得的供体DNA片段1和供体DNA片段2电转到X33ΔUra3缺陷菌株电转感受态中，涂布于MD平板，待长出单克隆进行菌落PCR鉴定。首先用引物Pep4-JP-F和Pep4-JP-R鉴定纯杂合，PCR扩增无野生型条带的为纯合子。用Pep4-JD-F和Ura3-5-R1与Ura3 promoter-F1和Pep4-JD-R分别进行扩增，分别能正确扩增出3267bp和2505bp条带则表明供体DNA片段1和供体DNA片段2在基因组上进行了正确整合。三对引物扩增均有正确条带的克隆为阳性克隆。

图9为Pep4敲除菌落PCR验证。其中图A泳道1-8为纯杂合鉴定，纯合子扩增不出野生型条带，杂合子或野生型能扩增1233bp条带，泳道6为纯合子。图B为供体片段整合鉴定，泳道1-8所用引物为Pep4-JD-F和Ura3-5-R1，理论大小为3267bp,泳道1、2、5、6、7、8大小正确；泳道9-16所用引物为Ura3 promoter-F1和Pep4-JD-R，理论大小为2505bp，泳道9、11、12、13、14、15、16为阳性克隆。Marker为博迈德1kb DNA Ladder，货号MD114。

正确整合的重组片段命名为重组供体DNA片段，重组供体DNA片段的的核苷酸序列为SEQ ID NO:3。其中SEQ ID NO:3第1至988位为所述pep4基因的上游同源臂、第989至1967位为所述pep4基因的下游同源臂、第1968至4312位为所述Ura3表达框（第2343至3114位为重合部分），第3334至4312位为所述pep4基因的下游同源臂。

（3）消除Ura3

将步骤2获得的阳性克隆用YPD过夜摇菌，将菌液稀释10倍，涂100微升于MDU+5-FOA平板。待长出单克隆后，分别点到MD和MDU+5-FOA平板上进行验证，在MDU+5-FOA平板上生长，在MD上不长的克隆成功消除Ura3。同时用引物Pep4-JD-F和Pep4-JD-R进行二次验证，若引物能扩增出大小为2280bp的目的条带，则Ura3消除成功。

Ura3消除成功的重组菌实现了基因无痕敲除。并且，由于Ura3消除成功，获得的重组菌可以按照本申请中图3、图4、图6和图7中至少一项所述的方法进行多轮的基因敲入或敲除。

以上对本申请进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本申请的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本申请。虽然本申请给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本申请作进一步的改进。总之，按本申请的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本申请的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。

Claims (10)

1.用于基因编辑的组合物，其特征在于：所述组合物包括供体DNA对A或供体DNA对B；

所述供体DNA对A由名称为供体DNA片段A1和名称为供体DNA片段A2的两种双链DNA组成，供体DNA片段A1的一条DNA单链自上游至下游含有用于与待编辑细胞进行同源重组的上游同源臂、下游同源臂和Ura3表达框的一部分，所述供体DNA片段A2的一条DNA单链自上游至下游含有所述Ura3表达框的另一部分和所述下游同源臂；其中所述供体DNA片段A1的所述DNA单链的3’端与所述供体DNA片段2的所述DNA单链的5’端含有序列相同的重合部分，所述重合部分位于所述Ura3表达框；

所述供体DNA对B由名称为供体DNA片段B1和名称为供体DNA片段B2的两种双链DNA组成，所述供体DNA片段B1的一条DNA单链自上游至下游含有所述Ura3表达框的一部分、所述上游同源臂和所述下游同源臂；所述供体DNA片段B2的一条DNA单链自上游至下游含有所述上游同源臂、所述Ura3表达框的另一部分；其中所述供体DNA片段B1的所述DNA单链的5’端与所述供体DNA片段B2的所述DNA单链的3’端含有序列相同的重合部分，所述重合部分位于所述Ura3表达框。

2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于：所述基因编辑为基因敲除，所述上游同源臂的序列与所述待编辑细胞中待敲除靶标基因的上游序列相同，所述下游同源臂的序列与所述待敲除靶标基因的下游序列相同。

3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于：所述基因编辑为基因敲入，所述供体DNA片段A1和所述供体DNA片段B1中的所述上游同源臂和所述下游同源臂之间还含有待敲入基因表达框；

所述上游同源臂的序列与导入位点的上游序列相同，所述下游同源臂的序列与所述导入位点的下游序列相同，所述导入位点为待敲入基因表达框的导入位置。

4.根据权利要求1至3任一项所述的组合物，其特征在于：所述供体DNA片段A1和所述供体DNA片段A2能在待编辑细胞发生同源重组整合为重组DNA供体片段A，所述供体DNA片段B1和所述供体DNA片段B2能在待编辑细胞发生同源重组整合为重组DNA供体片段B；

所述重组DNA供体片段A为下述至少一项：

Ai）所述重组DNA供体片段A的其中一条链自上游至下游含有如下所述的元件：与待编辑细胞进行同源重组的上游同源臂和下游同源臂、所述Ura3表达框和所述下游同源臂；

Aii）所述重组DNA供体片段A的其中一条链自上游至下游含有如下所述的元件：与待编辑细胞进行同源重组的上游同源臂、待敲入基因表达框、与待编辑细胞进行同源重组的下游同源臂、所述Ura3表达框和所述下游同源臂；

所述重组DNA供体片段B为下述至少一项：

Bi）所述重组DNA供体片段B的其中一条链自上游至下游含有如下所述的元件：与待编辑细胞进行同源重组的上游同源臂、所述Ura3表达框、所述上游同源臂和与待编辑细胞进行同源重组的下游同源臂；

Bii）所述重组DNA供体片段B的其中一条链自上游至下游含有如下所述的元件：与待编辑细胞进行同源重组的上游同源臂、所述Ura3表达框、所述上游同源臂、所述待敲入基因表达框和与待编辑细胞进行同源重组的下游同源臂。

5.一种应用，其特征在于：所述应用为下述至少一项：

C1）权利要求2所述的组合物在基因敲除中的应用；

C2）权利要求3所述的组合物在基因敲入中的应用。

6.基因敲除的方法，其特征在于：所述敲除包括下述步骤：

S1）将权利要求1或2所述的供体DNA对A导入待编辑细胞，筛选含有权利要求4中Ai）所述重组DNA供体片段A的重组细胞，或

将权利要求1或2所述的供体DNA对B导入待编辑细胞，筛选含有权利要求4中Bi）所述重组DNA供体片段B的重组细胞；

S2）筛选在含有尿嘧啶和5-FOA的培养基上存活的目的细胞；

所述待编辑细胞不含所述Ura3基因。

7.基因敲入的方法，其特征在于：所述敲入包括下述步骤：

S1’）将权利要求3所述的供体DNA对A导入待编辑细胞，筛选含有权利要求4中Aii）所述重组DNA供体片段A的重组细胞，或

将权利要求3所述的供体DNA对B导入待编辑细胞，筛选含有权利要求4中Bii）所述重组DNA供体片段B的重组细胞；

S2’）筛选在含有尿嘧啶和5-FOA的培养基上存活的目的细胞；

所述待编辑细胞不含所述Ura3基因。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：S1）至S2）所述步骤或/和S1’）至S2’）所述步骤的操作次数为N次，N为≥1的整数。

9.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：还包括敲除所述待编辑细胞的Ura3基因的步骤。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述待编辑细胞为微生物细胞。