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CN120958139A - 用于制备含有l-阿洛酮糖的水溶液的方法 - Google Patents

用于制备含有l-阿洛酮糖的水溶液的方法

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CN120958139A
CN120958139A CN202480018261.8A CN202480018261A CN120958139A CN 120958139 A CN120958139 A CN 120958139A CN 202480018261 A CN202480018261 A CN 202480018261A CN 120958139 A CN120958139 A CN 120958139A
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妮可·司道宁
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Annikki GmbH
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Abstract

本发明涉及一种用于制备含有L‑阿洛酮糖的水溶液的方法，其如下实现：通过用差向异构酶在体外处理由以溶解状态存在于水溶液中的D‑果糖形成第一D‑阿洛酮糖，然后，通过用相应的NAD(P)H依赖性氧化还原酶在体外处理将第一D‑阿洛酮糖还原以形成蒜糖醇，并且在使差向异构酶失活和/或超滤后，加入相应的NAD(P)+依赖性氧化还原酶以形成L‑阿洛酮糖。然后去除失活的差向异构酶和氧化还原酶。

Description

用于制备含有L-阿洛酮糖的水溶液的方法
技术领域
本发明涉及用于制备含有L-阿洛酮糖的水溶液的方法。
背景技术
D-阿洛酮糖
单糖D-阿洛酮糖(D-psicose)，也称为D-阿罗酮糖(D-allulose)，是一种在自然界中很少发现的酮己糖(Zhang等人,2016)。其主要在sweetspires(鼠刺属(Itea sp.))的叶子中检测到(Hough&Stacey,1966)，但也存在于加工食品如糖果和香料酱中，在这些食品中，其由D-果糖(其C3差向异构体)在加热作用下形成(Oshima等人,2006)。
D-阿洛酮糖因其甜味而受到食品工业的关注。与蔗糖相比，D-阿洛酮糖具有70％的相对增甜能力，但较低的能量含量(0.2kcal/g)，对应于热量减少约95％(与蔗糖相比)(Jiang等人,2020)。
在美国，D-阿洛酮糖已被美国食品药品监督管理局(FDA)认定为公认安全(GRAS)甜味剂，然而，在欧盟其尚未获得批准(Ahmed等人,2022)。
此外，D-阿洛酮糖对脂质代谢和碳水化合物代谢具有积极作用(例如，抗糖尿病)，并且具有抗炎和抗氧化作用(Zhang等人,2016；Jiang等人,2020；Chen等人,2022)。
由于自然界中D-阿洛酮糖的稀缺性，其主要使用生物技术合成生产。
1993年，Izumori等人描述了来自菊苣假单胞菌(Pseudomonas cichorii)ST-24的酮糖-3-差向异构酶，用于从D-果糖生产D-阿洛酮糖(Izumori等人,1993)，其也被授予了专利(EP 0592202B1)。根据其底物特异性，酮糖-3-差向异构酶可分为三组：1)D-塔格糖-3-差向异构酶(DTE)；2)D-阿洛酮糖-3-差向异构酶(DPE)或D-阿罗酮糖-3-差向异构酶(DAE)；和3)L-核酮糖-3-差向异构酶(LRE)(Zhang等人,2016；Jiang等人,2020)。
然而，通过酮糖-3-差向异构酶将D-果糖转化为D-阿洛酮糖并不能完全进行，而是在两种差向异构体之间会形成平衡关系。根据反应条件(温度40至70℃，pH 6至11)，其为80:20至62.5:37.5(D-果糖:D-阿洛酮糖)。许多差向异构酶还需要二价金属离子如Mn2+或Co2+(有毒)作为辅因子(Zhang等人,2016；Jiang等人,2020)。
然而，通过差向异构酶途径生产D-阿洛酮糖存在以下缺点：1)平衡位置偏向D-果糖侧；2)许多差向异构酶需要添加(部分毒性的)金属离子作为辅因子；3)差向异构酶的活性低且长期稳定性差；以及4)产物混合物的分离复杂。
D-果糖差向异构化为D-阿洛酮糖的平衡处于不利位置，其可例如通过下游氧化还原反应来被有利影响。通过将DTE与核糖醇脱氢酶(RDH；EC 1.1.1.56)和甲酸脱氢酶(FDH；作为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NADH辅因子的再生酶)结合，可以在体外将D-果糖转化为蒜糖醇(Takeshita等人，2000)。
由于其对称性，非手性蒜糖醇糖醇在用于稀有糖的生物生产的所谓的Izumoring策略中形成了D-己糖和L-己糖之间的链接枢纽(Izumori,2006；Hassanin等人,2017)。因此，它也可以作为生产其他稀有单糖的前体。
Hold等人(2009)和Siedentop等人(2021)的理论论文探讨了酶级联反应的优化。文中描述，必须考虑所有组分和多个参数，尤其是与级联反应设计、酶本身、反应条件和环境以及工艺设计相关的参数，并且无法预测哪些参数会成功。文中并未具体提及L-阿洛酮糖的合成。
Chen等人(2022)转向通过全细胞生物催化剂(“体内”)的发酵途径生产D-阿洛酮糖，并得出结论，这是未来唯一具有经济化和工业化规模生产D-阿洛酮糖潜力的途径(具有不同的优化方案)。全细胞生物催化剂的优势显而易见：
(1)内部含有酶的细胞比酶本身更容易获取，酶的纯化通常非常费力；
(2)细胞内部为酶提供了合适的微环境，并且还允许辅因子再生(NAD(P)+/NAD(P)H)；
(3)细胞壁和细胞膜保护酶免受反应介质环境的影响；
(4)多种酶在细胞内的共定位有利于局部酶浓度，并减少级联反应中中间体的扩散。
因此，作者认为“微生物细胞工厂”是大规模生产D-阿洛酮糖的最佳途径，这样普通消费者在不久的将来也能享用这种稀有糖类。
由Wang等人(2022,2023)领导的团队也在研究糖的酶促生物转化，研究体外和体内的生物转化。他们的目标是开发可工业化规模实施的经济生产方法。
为了从D-果糖生产D-阿洛酮糖，Wang等人(2023)描述了由两种大肠杆菌全细胞生物催化剂组成的体内方法，其中在第一步(将D-果糖转化为蒜糖醇)中，使用大肠杆菌细胞，其包含来自梭菌目(Clostridiales)的DPE、来自产碱普罗威登斯菌(Providenciaalcalifaciens)的RDH、来自Starkeya的FDH以及来自稻草根瘤菌(Rhizobiumstraminoryzae)的另一种DPE。通过这种方式，在37℃和pH 6，使用1000mM甲酸钠(基于D-果糖为2当量)，在12小时内将D-果糖(500mM＝90g/l)转化为452mM蒜糖醇(转化率为90.4％)。约30mM的D-山梨糖醇作为副产物形成。通过离心分离细胞，并通过加热使含蒜糖醇的上清液中泄漏的蛋白质失活。然后，将含有来自红弧菌属(Rubrivivax sp.)的RDH和来自化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)的NADH氧化酶的大肠杆菌细胞添加到蒜糖醇溶液中。在pH 7，蒜糖醇(452mM)在24小时内被氧化为D-阿洛酮糖(450mM)。
L-阿洛酮糖
与其对映异构体D-阿洛酮糖不同，L-阿洛酮糖并非天然存在。L-阿洛酮糖可用作生产L-果糖(Itoh&Izumori，1996)、L-塔格糖(Rao等人，2008)或L-塔罗糖醇(Sasahara&Izumori，2005)的起始原料。在一项小鼠研究中，已证实L-阿洛酮糖对引发角膜炎(角膜炎症)的1型单纯疱疹病毒具有抗病毒活性(Muniruzzaman等人，2016)。
已知基本上有三种不同的生物技术途径用于生产L-阿洛酮糖。
在果糖-1,6-二磷酸醛缩酶或塔格糖-1,6-二磷酸醛缩酶的催化下，L-甘油醛与磷酸二羟丙酮(DHAP)发生醛缩反应，随后末端磷酸基团断裂，生成L-阿洛酮糖与L-山梨糖的混合物。该反应级联既可在体外进行，也可在经工程改造的谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)菌株中通过发酵实现(Yang等人，2015)。Yang等人(2016)进一步发展了该反应级联，使得甘油也可用作发酵生产L-阿洛酮糖的起始原料。该级联反应的核心组成部分仍为L-甘油醛与DHAP的醛缩反应。
Wen等人(2015)的途径同样以L-甘油醛和磷酸二羟丙酮(DHAP)为起始物，其首先在鼠李酮糖(rhamnulose)二磷酸醛缩酶的作用下转化为L-果糖-1-磷酸，经脱磷酸化得到L-果糖。L-果糖被DTE异构化为L-阿洛酮糖，其中通过使用果糖激酶的磷酸化反应(需三磷酸腺苷(ATP)作为辅因子)使平衡向产物侧移动。去除磷酸基团后，得到L-阿洛酮糖。
第二条途径基于使用转酮酶(transketolase)(EC 2.2.1.1)，该酶是一种硫胺素依赖性酶，其催化具有α-羟基羰基的供体与Cn-醛受体之间的反应生成Cn+2酮糖并释放CO2。利用来源于嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)的耐热性转酮酶突变体，通过使L-赤藓糖与羟基丙酮酸反应可生成L-阿洛酮糖，然而，该反应需二磷酸硫胺素作为辅因子(Lorillière等人，2019)。
第三条途径是蒜糖醇微生物氧化为L-阿洛酮糖——使用弗氏葡萄糖杆菌(Gluconobacter frateurii)IFO 3254，可将100g/L的蒜糖醇氧化为98％ L-阿洛酮糖(Takeshita等人，1996)。通过相同生物体的氧化也描述于JP4761424B2和JP3711296B2中。
本发明的目的就在于此，本发明旨在提供一种高效且环境友好的方法，用于以高转化率制备含有L-阿洛酮糖的水溶液，该方法尤其可以采用一锅法进行。
发明详述
根据本发明，该目的通过以下实现：通过用差向异构酶在体外处理由存在于水溶液中的D-果糖形成第一D-阿洛酮糖，然后，通过用相应的NAD(P)H依赖性氧化还原酶在体外处理将第一D-阿洛酮糖还原为蒜糖醇，并且在使差向异构酶失活和/或超滤后，加入相应的NAD(P)+依赖性氧化还原酶以形成L-阿洛酮糖，然后去除失活的差向异构酶和氧化还原酶。
本发明方法在附图中示意性示出。
令人惊讶的是，已经表明，如果反应并非以发酵方式进行，而是将酶本身包含在水溶液中，即反应在体外进行，则可实现本发明中设定的目标。
本发明方法的一个优选变体的特征在于，用于由蒜糖醇形成L-阿洛酮糖的氧化还原酶包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：
i)与SEQ ID NO:2具有至少80％同一性的氨基酸序列，
ii)由与SEQ ID NO:1具有至少80％同一性的核酸编码的氨基酸序列，和
iii)由在严格条件下与包含1核酸序列的核酸分子结合的核酸编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO:1：
SEQ ID NO:2：
本发明方法的一个优选变体在于，通过D-阿洛酮糖还原为蒜糖醇形成的氧化型辅因子NAD(P)+通过醇脱氢酶(ADH)和仲醇被还原，并形成酮，其中仲醇优选为D-葡萄糖或2-丙醇(异丙醇)。2-丙醇是用于NAD(P)H再生的非常廉价的氢供体，并且氧化产物丙酮由于其挥发性而易于分离(Xu等人,2021)。从废气流中回收的丙酮可以在气相中或在作为2-丙醇/丙酮/水混合物或丙酮/水混合物存在的溶液中被非均相催化再氢化为2-丙醇(Al-Rabiah等人,2022)，而来自可持续来源的氢(“绿色氢”)在未来的应用可能会越来越广泛。使用这样的系统允许循环利用2-丙醇，且不会排放对气候有害的CO2，此外，还能避免产生大量废物(例如FDH再生系统中未反应的甲酸钠)。
使用ADH进行的辅因子再生例如可从EP 2812439 B1中获知，或已在Xu等人(2021)中描述。
在本发明的另一个优选实施方案中，通过还原形成的氧化型辅因子NAD(P)+通过葡萄糖脱氢酶和D-葡萄糖被还原，并形成D-葡萄糖酸盐。使用葡萄糖脱氢酶使NAD(P)H再生特别有利，因为在NAD(P)+还原过程中，D-葡萄糖会形成D-葡萄糖酸盐，其可以从反应混合物中获得并用于多个领域(例如，用于金属酸洗剂、药物以及作为食品稳定剂等)。此外，使用葡萄糖脱氢酶允许使用包含D-果糖和D-葡萄糖的混合物作为底物来生产蒜糖醇，而无需向反应混合物中添加额外的D-葡萄糖，也无需预先将D-葡萄糖异构化为D-果糖。例如，可以通过蔗糖的水解来生产D-果糖和D-葡萄糖的混合物。特别优选的是使用源自巨大普里斯特氏菌(Priestia megaterium)的葡萄糖脱氢酶，其氨基酸序列可在NCBI登录号MDQ0804260.1下获取。
本发明方法的另一个优选变体的特征在于，其以一锅法反应进行，无需分离任何中间产物。
在本发明方法中，酶优选以产生它们的对应细胞的裂解物形式使用。与Wang等人(2023)描述的基于具有共表达的重组酶的大肠杆菌全细胞生物催化剂的方法不同，本发明的酶在合适的大肠杆菌生产菌株中单独表达。
这使得能够优化酶的比例，因此与Wang等人(2023)相比，该方法不依赖于整个构建体中的表达水平。
在执行最后一步(氧化)之前，第一步(D-果糖→蒜糖醇)中的酶(差向异构酶、还原酶和/或脱氢酶)被通过加热失活和/或通过超滤去除，以防止通过酶形成副产物。尤其是在D-阿洛酮糖的情况下，如果没有适当的处理，通过氧化产生的D-阿洛酮糖大部分会转化回D-果糖。
基于烟酰胺的辅因子(NAD或NADP)的再生，在D-阿洛酮糖还原为蒜糖醇的情况下通过NAD(P)依赖性醇脱氢酶或葡萄糖脱氢酶进行，并且在氧化反应(第二步)的情况下通过形成H2O的NAD(P)H氧化酶进行。
D-果糖的特别优选浓度为50-250g/l。
第一步(差向异构化和还原)的特别优选温度范围为25至45℃，第二步(氧化)的特别优选温度范围为20至30℃。
这两个步骤的特别优选pH范围均为7至8.5。
在本发明方法的另一个优选实施方案中，酶存在于形成它们的相应细胞的悬浮液和/或匀浆和/或裂解物中，其中特别优选裂解物。
在本文中，悬浮液是指静息细胞的悬浮液。这些细胞在培养后收获(从生长培养基中分离)，并以糊状使用或悬浮于合适的缓冲体系中。与同样使用全细胞的发酵方法不同，静息细胞由于缺乏碳源和营养物质而无法继续生长，只能用于转化底物(Lin&Tao,2017)。在本文中，匀浆是指经过物理和/或化学处理的悬浮液(例如，通过压力、溶菌酶或超声波)，从而使细胞成分从细胞中释放出来。当匀浆中的不溶性细胞成分被去除(例如，通过过滤或离心)时，可获得裂解物(详情请参阅酶的生产和裂解物的制备)。
在另一个变体中，酶也可以在N端用水溶性聚合物(例如聚乙二醇)修饰，固定在固体基质中或固体基质上，或成为融合蛋白的一部分。
在另一个变体中，酶可以以粉末形式、冻干或喷雾干燥形式存在。
酶分离后，L-阿洛酮糖优选存在于水溶液中，例如，可以通过喷雾干燥从该水溶液中获得固体L-阿洛酮糖(对于D-阿洛酮糖，参见：US2019/0315790 A1；Kawakami等人，2013；Kawakami等人，2014)。
由于所得溶液的纯度高，可以浓缩滤液并且获得晶体形式或糖浆形式的L-阿洛酮糖。
在另一个优选方案中，L-阿洛酮糖存在于糖浆中，其中糖浆是通过浓缩上述滤液或通过将晶体L-阿洛酮糖(可通过根据本发明的方法制备)溶解于水中而制备的。根据本发明的糖浆优选总固体含量为约50重量％至约90重量％。根据本发明的糖浆中L-阿洛酮糖的含量为约80重量％至约99重量％，以干物质计。
因此，本发明的另一方面涉及包含L-阿洛酮糖的糖浆，其可通过根据本发明的方法生产。
在该方法的一个特别优选的实施方案中，仅使用来自差向异构酶和氧化还原酶酶组中的酶来转化起始原料，其中从这些组中的每一组选择这些酶中的一种或多种。
该方法中使用的差向异构酶可以来自EC 5.1.3.30组(D-阿洛酮糖-3-差向异构酶)或EC 5.1.3.31组(D-塔格糖-3-差向异构酶/L-核酮糖-3-差向异构酶)之一，前者是特别优选的。
用于还原D-阿洛酮糖和氧化蒜糖醇的酶来自氧化还原酶组(详情参见表1)。
用于辅因子再生的醇脱氢酶(ADH)可以属于EC 1.1.1.1组(NAD依赖性ADH)或EC1.1.1.2组(NADP依赖性ADH)之一。
用于辅因子再生的NAD(P)依赖性醇脱氢酶优选包含选自由以下组成的组的氨基酸序列，或由其组成：
i)与SEQ ID NO:6具有至少80％同一性的氨基酸序列，
ii)由与SEQ ID NO:5具有至少80％同一性的核酸编码的氨基酸序列，和
iii)由在严格条件下与包含SEQ ID NO:5核酸序列的核酸分子结合的核酸编码的氨基酸序列。
一般而言，特别适合于辅因子再生的是这样的醇脱氢酶，其氨基酸序列与SEQ IDNO:6具有至少80％同一性，或由与SEQ ID NO:5具有至少80％同一性的核酸编码，或由在严格条件下与包含SEQ ID NO:5核酸序列的核酸分子结合的核酸编码。
SEQ ID NO:5：
SEQ ID NO:6：
本文所述的用于辅因子再生的醇脱氢酶优选包含与SEQ ID NO:6具有至少80％同一性，更优选85％、甚至更优选90％、甚至更优选95％、甚至更优选98％、甚至更优选99％、特别是100％同一性的氨基酸序列。特别优选地，根据本发明的用于辅因子再生的醇脱氢酶包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列或由其组成。
或者，用于辅因子再生的醇脱氢酶优选包含由与SEQ ID NO:5具有至少80％同一性，更优选85％、甚至更优选90％、甚至更优选95％、甚至更优选98％、甚至更优选99％、特别是100％同一性的核酸编码的氨基酸序列。特别优选地，编码根据本发明的用于辅因子再生的醇脱氢酶的核酸包含SEQ ID NO:5的核酸序列或由其组成。
本发明的另一方面涉及醇脱氢酶用于辅因子再生的用途，其中所述醇脱氢酶包含选自由以下组成的组的氨基酸序列，或由其组成：
i)与SEQ ID NO:6具有至少80％同一性的氨基酸序列，
ii)由与SEQ ID NO:5具有至少80％同一性的核酸编码的氨基酸序列，和
iii)由在严格条件下与包含SEQ ID NO:5核酸序列的核酸分子结合的核酸编码的氨基酸序列。
本文公开的醇脱氢酶可在多种酶促反应中用于NAD(P)+或NAD(P)H的再生，即用于NAD(P)+的还原或NAD(P)H的氧化。特别优选的是将本发明的醇脱氢酶用于NAD(P)+的辅因子再生，所述NAD(P)+是在NAD(P)H依赖性氧化还原酶将D-阿洛酮糖还原为蒜糖醇的过程中产生的。
用于辅因子再生的葡萄糖脱氢酶(GDH)可以来自组EC 1.1.1.47(葡萄糖-1-脱氢酶)、EC 1.1.1.118(葡萄糖-1-脱氢酶(NAD+))、EC 1.1.1.119(葡萄糖-1-脱氢酶(NADP+))或EC 1.1.1.360(葡萄糖/半乳糖-1-脱氢酶)之一。
用于辅因子再生的NAD(P)依赖性葡萄糖脱氢酶优选包含选自由以下组成的组的氨基酸序列，或由其组成：
i)与SEQ ID NO:10具有至少80％同一性的氨基酸序列，
ii)由与SEQ ID NO:9具有至少80％同一性的核酸编码的氨基酸序列，和
iii)由在严格条件下与包含SEQ ID NO:9核酸序列的核酸分子结合的核酸编码的氨基酸序列。
一般而言，特别适合于辅因子再生的葡萄糖脱氢酶是这样的葡萄糖脱氢酶，其氨基酸序列与SEQ ID NO:10具有至少80％同一性，或由与SEQ ID NO:9具有至少80％同一性的核酸编码，或由在严格条件下与具有SEQ ID NO:9核酸序列的核酸分子结合的核酸编码。
SEQ ID NO:9：
SEQ ID NO:10：
本文所述的用于辅因子再生的葡萄糖脱氢酶优选包含与SEQ ID NO:10具有至少80％同一性，更优选85％、甚至更优选90％、甚至更优选95％、甚至更优选98％、甚至更优选99％、特别是100％同一性的氨基酸序列。特别优选地，本发明用于辅因子再生的葡萄糖脱氢酶包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列或由其组成。
或者，用于辅因子再生的葡萄糖脱氢酶优选包含由与SEQ ID NO:9具有至少80％同一性，更优选85％、甚至更优选90％、甚至更优选95％、甚至更优选98％、甚至更优选99％、特别是100％同一性的核酸编码的氨基酸序列。特别优选地，编码本发明用于辅因子再生的葡萄糖脱氢酶的核酸包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列或由其组成。
本发明的另一方面涉及葡萄糖脱氢酶用于辅因子再生的用途，其中所述葡萄糖脱氢酶包含选自由以下组成的组的氨基酸序列，或由其组成：
i)与SEQ ID NO:10具有至少80％同一性的氨基酸序列，
ii)由与SEQ ID NO:9具有至少80％同一性的核酸编码的氨基酸序列，和
iii)由在严格条件下与包含SEQ ID NO:9核酸序列的核酸分子结合的核酸编码的氨基酸序列。
用于辅因子再生的NAD(P)H氧化酶(参见图1)可以来自组EC 1.6.3.1(NAD(P)H氧化酶(形成H2O2))、EC 1.6.3.2(NAD(P)H氧化酶(形成H2O))、EC 1.6.3.3(NADH氧化酶(形成H2O2))和EC 1.6.3.4(NADH氧化酶(形成H2O))之一，其中形成H2O的类别是特别优选的。
特别优选的形成H2O的NAD(P)H氧化酶优选包含选自由以下组成的组的氨基酸序列，或由其组成：
i)与SEQ ID NO:8具有至少80％同一性的氨基酸序列，
ii)由与SEQ ID NO:7具有至少80％同一性的核酸编码的氨基酸序列，和
iii)由在严格条件下与包含SEQ ID NO:7核酸序列的核酸分子结合的核酸编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO:7：
SEQ ID NO:8：
优选使用的形成H2O的NAD(P)H氧化酶优选包含与SEQ ID NO:8具有至少80％同一性，更优选85％、甚至更优选90％、甚至更优选95％、甚至更优选98％、甚至更优选99％、特别是100％同一性的氨基酸序列，或由其组成。特别优选地，形成H2O的NAD(P)H氧化酶包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列，或由其组成。
或者，形成H2O的NAD(P)H氧化酶优选具有由与SEQ ID NO:7具有至少80％同一性，更优选85％、甚至更优选90％、甚至更优选95％、甚至更优选98％、甚至更优选99％、特别是100％同一性的核酸编码的氨基酸序列。特别优选地，编码形成H2O的NAD(P)H氧化酶的核酸包含SEQ ID NO:7的核酸序列，或由其组成。
本发明的另一方面涉及形成H2O的NAD(P)H氧化酶用于辅因子再生(NAD(P)H至NAD(P)+)的用途，所述形成H2O的NAD(P)H氧化酶包含选自由以下组成的组的氨基酸序列，或由其组成：
i)与SEQ ID NO:8具有至少80％同一性的氨基酸序列，
ii)由与SEQ ID NO:7具有至少80％同一性的核酸编码的氨基酸序列，和
iii)由在严格条件下与包含SEQ ID NO:7核酸序列的核酸分子结合的核酸编码的氨基酸序列。
结合辅因子再生，本文提出的酶促策略允许用于生产L-阿洛酮糖的生物催化、环境友好且高效的生产方法。
根据本发明用于从蒜糖醇生成L-阿洛酮糖的氧化还原酶优选为甘露醇脱氢酶型短链脱氢酶/还原酶。令人惊讶的是，已经表明，在NAD(P)+辅因子存在的情况下，甘露醇脱氢酶型短链脱氢酶/还原酶能够将蒜糖醇转化为L-阿洛酮糖。因此，本发明的另一个方面涉及用于生产L-阿洛酮糖的方法，其包括在NAD(P)+辅因子存在的条件下，用氧化还原酶(优选甘露醇脱氢酶型短链脱氢酶/还原酶)处理蒜糖醇的步骤。
用于由蒜糖醇形成L-阿洛酮糖的氧化还原酶优选包含选自由以下组成的组的氨基酸序列，或由其组成：
i)与SEQ ID NO:2具有至少80％同一性的氨基酸序列，
ii)由与SEQ ID NO:1具有至少80％同一性的核酸编码的氨基酸序列，和
iii)由在严格条件下与包含SEQ ID NO:1核酸序列的核酸分子结合的核酸编码的氨基酸序列。
用于将第一D-阿洛酮糖还原为蒜糖醇的NAD(P)H依赖性氧化还原酶优选包含选自由以下组成的组的氨基酸序列，或由其组成：
i)与SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:14具有至少80％同一性的氨基酸序列，
ii)由与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:13具有至少80％同一性的核酸编码的氨基酸序列，和
iii)由在严格条件下与包含SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:13核酸序列的核酸分子结合的核酸编码的氨基酸序列。
特别适合于将第一D-阿洛酮糖还原为蒜糖醇或通常将D-阿洛酮糖还原为蒜糖醇的是这样的氧化还原酶，其氨基酸序列与SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:14具有至少80％同一性，或由与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:13具有至少80％同一性的核酸编码，或由在严格条件下与包含SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:13核酸序列的核酸分子结合核酸编码。此外，该氧化还原酶令人惊讶地可用于将蒜糖醇氧化为D-阿洛酮糖。
SEQ ID NO:3：
SEQ ID NO:4：
SEQ ID NO:11：
SEQ ID NO:12：
SEQ ID NO:13：
SEQ ID NO:14：
本文所述的用于将D-阿洛酮糖还原为蒜糖醇和/或用于由蒜糖醇形成L-阿洛酮糖的氧化还原酶优选包含与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:14具有至少80％同一性，更优选85％、甚至更优选90％、甚至更优选95％、甚至更优选98％、甚至更优选99％、特别是100％同一性的氨基酸序列。特别优选地，本发明用于将D-阿洛酮糖还原为蒜糖醇的氧化还原酶包含SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:14的氨基酸序列或由其组成，并且用于由蒜糖醇形成L-阿洛酮糖的氧化还原酶包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或由其组成。
或者，用于将D-阿洛酮糖还原为蒜糖醇和/或用于由蒜糖醇形成L-阿洛酮糖的氧化还原酶优选地包含由与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:13具有至少80％同一性，更优选85％、甚至更优选90％、甚至更优选95％、甚至更优选98％、甚至更优选99％、特别是100％同一性的核酸编码的氨基酸序列。特别优选地，编码本发明用于将D-阿洛酮糖还原为蒜糖醇的氧化还原酶的核酸包含SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:11或SEQ IDNO:13的核酸序列或由其组成，并且编码用于由蒜糖醇形成L-阿洛酮糖的氧化还原酶的核酸包含SEQ ID NO:1的核酸序列或由其组成。
本文中使用的术语“同一性”是指使用标准化算法(“比对”)进行比对的至少两个核苷酸或氨基酸序列之间相同核苷酸或氨基酸的百分比。此类算法可以以标准化且可重复的方式在被比较的序列中插入空位，以优化两个序列之间的比对，从而实现两个序列更有意义的比较。
序列之间的百分比同一性可以使用现有技术中已知或本文描述的一种或多种计算机算法或程序来确定。根据本发明，使用美国国家生物技术信息中心(National Centerfor Biotechnology Information，NCBI)提供的基本局部比对搜索工具(Basic LocalAlignment Search Tool，BLAST)(Altschul等人，1990)来确定同一性。BLAST软件套件包含多个程序，其中包括名为“BLAST 2Sequences”的工具，该工具用于两个核苷酸或氨基酸序列之间的直接成对比较。“BLAST 2Sequences”也可以通过NCBI万维网页面在互联网上交互式检索并使用。blastn程序(用于核苷酸序列)默认使用字长(W)11、期望值(E)10、M＝5、N＝-4以及双链比较。对于氨基酸序列，blastp程序默认使用字长3、期望值(E)10和BLOSUM62评分矩阵(Henikoff&Henikoff,1989)、比对(B)50、期望值(E)10、M＝5、N＝-4。
或者，用于将D-阿洛酮糖还原为蒜糖醇和/或由蒜糖醇形成L-阿洛酮糖的氧化还原酶优选包含由在严格条件下与包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:11或SEQ IDNO:13核酸序列的核酸分子结合的核酸编码的氨基酸序列。本文所用的严格条件是指形成所谓的特异性杂交体，但不形成非特异性杂交体的条件。例如，严格条件包括在45℃下在6xSSC(氯化钠/柠檬酸钠)中杂交，然后在50至65℃下用0.2至1xSSC、0.1％ SDS洗涤；或者，这样的条件可以包括在65至70℃下在1xSSC中杂交，然后在65至70℃下用0.3xSSC洗涤。杂交可以通过常规已知方法进行，例如J.Sambrook等人在Molecular Cloning,ALaboratoryManual,2nd Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory(1989)中描述的方法。
本发明的一个方面涉及氧化还原酶用于由蒜糖醇形成L-阿洛酮糖的用途，其中所述氧化还原酶包含选自由以下组成的组的氨基酸序列，或由其组成：
i)与SEQ ID NO:2具有至少80％同一性的氨基酸序列，
ii)由与SEQ ID NO:1具有至少80％同一性的核酸编码的氨基酸序列，和
iii)由在严格条件下与包含SEQ ID NO:1核酸序列的核酸分子结合的核酸编码的氨基酸序列。
公开了氧化还原酶用于将D-阿洛酮糖还原为蒜糖醇的用途，其中所述氧化还原酶包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：
i)与SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:14具有至少80％同一性的氨基酸序列，
ii)由与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:13具有至少80％同一性的核酸编码的氨基酸序列，和
iii)由在严格条件下与包含SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:13核酸序列的核酸分子结合的核酸编码的氨基酸序列。
根据反应(还原或氧化)，本发明的氧化还原酶需要对应的辅因子，如上文所述。
材料
D-阿洛酮糖购自TCI和湖南花园天然有限公司(Hunan Garden Naturals Inc.)(中国)；蒜糖醇和L-阿洛酮糖购自TCI；D-果糖、NADPH四钠盐和甲醇购自PanReacAppliChem(ITW Reagents)；D-葡萄糖、葡萄糖酸钠、IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)购自Sigma-Aldrich；磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、NAD+、NADH二钠盐、NADP+二钠盐和十二烷基硫酸钠(SDS)购自Carl Roth；三乙醇胺(TEA)购自Chem-Lab NV。
酶的生产和裂解物的制备
大肠杆菌中重组酶表达的一般信息
对于大肠杆菌菌株中的重组酶生产，首先使用基因组DNA或其合成的适应大肠杆菌密码子使用的等同物为模板，结合额外携带限制性内切酶识别序列的特异性寡核苷酸，对待表达基因进行PCR扩增，并从反应混合物中分离。用限制性酶Sphl和HindIII进行核酸消化后，将编码目标酶的基因片段连接到表达载体pQE70-Kan的Sphl和HindIII切割骨架上。将连接产物转化至化学感受态Top10F大肠杆菌细胞中，并将所得菌落用于质粒分离和限制性分析。
通过限制性酶消化和DNA测序验证了克隆步骤的结果。所得构建体携带位于IPTG诱导型T5启动子下的目标基因。
为了在大肠杆菌中过表达该酶，将所得表达质粒转化到感受态表达细胞RB791中。在37℃下孵育24小时后，将所得菌落接种到LB培养基中进行表达测定。
第二天，接种光密度OD550为0.02的表达培养物，并在37℃下振荡培养至OD550达到0.3。随后，将温度降至25℃，并且当OD550达到0.5时，用0.1mM IPTG诱导培养物。22小时后，收获培养物(通过离心以细胞沉淀的形式从培养基中分离)，并使用SDS凝胶电泳和活性测定(用途测试或光学酶促测定)分析重组酶的表达。
使用超声破碎仪破碎制备细胞裂解物
为了制备细胞悬浮液，将按照上述方法制备的细胞沉淀称重到合适的容器中，并与缓冲液和溶菌酶(终浓度为0.5mg/ml)(例如三乙醇胺(TEA)-HCl)混合，搅拌溶解。生物质的质量分数通常为20％，其余为缓冲液。
使用Branson Sonifier 450进行细胞破碎。将悬浮液处理三次，每次15个超声波脉冲(设备设置：定时器＝15；占空比＝50；输出控制＝3–5)。
将所得匀浆在4℃下以16,000rpm离心10分钟(Eppendorf Centrifuge 5417R)，以分离不溶性细胞碎片并获得裂解物。
表1.实施例中所用酶的酶类和供体生物体(SDR＝来自短链脱氢酶/还原酶家族的氧化还原酶)。
分析方法
高效液相色谱法
使用Agilent HPLC 1260Infinity II Series系统，通过HPLC(高效液相色谱法)定量测定D-阿洛酮糖/L-阿洛酮糖、D-果糖、D-葡萄糖和蒜糖醇。使用折射率检测器(RI检测)进行检测。对于测量，使用具有合适的预柱的Phenomenex Rezex RPM-单糖Pb+2(8％)柱，用超纯水等度洗脱。
高效阴离子交换色谱法
使用具有AS-AP自动进样器的Dionex ICS6000系统，采用HPAEC(高效阴离子交换色谱法)定量测定D-葡萄糖酸/D-葡萄糖酸盐。使用与处于外水模式下的Dionex AERS 500电解再生抑制器偶联的电导检测(CD)进行测量。使用具有合适预柱和NaOH梯度的DionexlonPac AS11-HC-4μm柱分离分析物。流动相额外经Dionex ATC阴离子捕获柱预处理。
酶活性测定(光学酶促测定)
使用Shimadzu UV-1900分光光度计测定裂解物中的酶活性。为此，通过吸收变化在340nm波长处监测NAD(P)H的生成或消耗。测量利用0.2mM辅因子(NAD(P)+或NAD(P)H)进行。为此，将20μl 10mM辅因子储备溶液置于比色皿(聚苯乙烯制成的Greiner Bio-One半微量比色皿)中，并用100mM TEAHCl缓冲液(870μl)调节至期望pH。将10μl裂解物(稀释或未稀释)和100μl底物溶液加入比色皿中，立即开始测量。测量默认在25℃下进行。裂解物的酶活性可以使用NADH/NADPH在340nm处的消光系数(ε＝6220L mol-1cm-1)以U/ml(基于裂解物的体积)或U/g(基于用于生产的生物质)为单位测定。这里，1U代表每分钟1μmol底物转化率(1U＝1μmol/分钟＝1.67·10-8kat)。
以下实施例将更详细地描述本发明方法的优选方案。这些实施例中使用的裂解物均按照上述步骤制备。
实施例1
果糖转化为L-阿洛酮糖(还原步骤中利用ADH进行辅因子再生)
在玻璃样品瓶中混合以下组分：70.6μL去离子水、250μL 200mM TEA HCl缓冲液(pH8)、50μL D-果糖溶液(500g/l)和25μL D-阿洛酮糖-3-差向异构酶裂解物。然后，加入35μL SDR I裂解物、8U醇脱氢酶裂解物、5μL 10mM NAD+溶液和50μL 2-丙醇。将混合物在持续振荡(Eppendorf Thermomixer；35℃，800rpm)下孵育总共20小时。
将混合物加热至70℃并保持60分钟。冷却后，加入25μL氧化还原酶裂解物(SEQ IDNO:2)、10U NAD(P)H氧化酶裂解物和5μL 5mM NADP+溶液。将混合物继续在持续振荡(Eppendorf Thermomixer；24℃，800rpm)下再孵育20小时。
分析时，向100μL混合物中加入200μL甲醇，并在Eppendorf Thermomixer中在60℃和1200rpm下孵育15分钟。将样品在离心机中短暂离心，加入700μl去离子水，涡旋，然后以最大离心力离心5分钟。将200μl上清液转移至带插入件的HPLC样品瓶中，并通过HPLC(RI检测)进行测量。
通过该方法，97.7％的D-果糖(50g/l)转化为L-阿洛酮糖(实测浓度：45.8g/l)。
所采用的色谱方法无法区分D-阿洛酮糖与L-阿洛酮糖(二者洗脱时保留时间相同)，因此向样品瓶中加入25μL D-阿洛酮糖-3-差向异构酶裂解物。将混合物在35℃下孵育2小时后，再次进行HPLC分析。
在加入差向异构酶后，未观察到阿洛酮糖的量发生变化，这证实产物为L-阿洛酮糖。
实施例2
D-果糖转化为L-阿洛酮糖(还原步骤中利用GDH进行辅因子再生)
在玻璃样品瓶中混合以下组分：134μL去离子水、50μL 500mM TEA HCl缓冲液(pH7.5)、250μL含D-果糖和D-葡萄糖的溶液(各300g/l)和25μL D-阿洛酮糖-3-差向异构酶裂解物。然后，加入35μL SDR I裂解物、2U葡萄糖脱氢酶裂解物和5μL 10mM NAD+溶液。将混合物在持续振荡(Eppendorf Thermomixer；35℃，800rpm)下孵育总共30小时。
将混合物冷却至24℃后，加入25μL氧化还原酶裂解物(SEQ ID NO:2)、10U NAD(P)H氧化酶裂解物和5μL 5mM NADP+溶液。将混合物继续在持续振荡(EppendorfThermomixer；24℃，800rpm)下再孵育20小时。
分析时，向100μL混合物中加入200μL甲醇，并在Eppendorf Thermomixer中在60℃和1200rpm下孵育15分钟。将样品在离心机中短暂离心，加入700μl去离子水，涡旋，然后以最大离心力离心5分钟。将200μl上清液转移至HPLC样品瓶中，并通过HPLC(RI检测)进行测量。对于HPAEC测量(电导检测)，将澄清上清液按1:250稀释。
通过该方法，25.6％的D-果糖(150g/l)转化为L-阿洛酮糖(实测浓度：29.9g/l)，且D-葡萄糖完全转化为D-葡萄糖酸盐(实测浓度：158g/l)。
实施例3
蒜糖醇氧化为L-阿洛酮糖
在玻璃样品瓶中混合以下组分：30μL去离子水、250μL 200mM TEA HCl缓冲液(pH8)、125μL蒜糖醇溶液(200g/l)、50μL氧化还原酶裂解物(SEQ ID NO:2)、40μL NAD(P)H氧化酶裂解物和5μL 10mM NADP+溶液。将混合物在持续振荡(Eppendorf Thermomixer；35℃，800rpm)下孵育总共20小时。
分析时，向100μL混合物中加入200μL甲醇，并在Eppendorf Thermomixer中在60℃和1200rpm下孵育15分钟。将样品在离心机中短暂离心，加入700μl去离子水，涡旋，然后以最大离心力离心5分钟。将200μl上清液转移至HPLC样品瓶中，并通过HPLC(RI检测)进行测量。
通过该方法，98.2％的蒜糖醇(50g/l)氧化为L-阿洛酮糖(实测浓度：50.1g/l)。
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Claims (16)

1.一种用于制备含有L-阿洛酮糖的水溶液的方法，其如下实现：通过用差向异构酶在体外处理由存在于水溶液中的D-果糖形成第一D-阿洛酮糖，然后，通过用相应的NAD(P)H依赖性氧化还原酶在体外处理将所述第一D-阿洛酮糖还原为蒜糖醇，并且在使所述差向异构酶失活和/或超滤后，加入相应的NAD(P)+依赖性氧化还原酶以形成L-阿洛酮糖，然后去除失活的差向异构酶和氧化还原酶。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，用于由蒜糖醇形成L-阿洛酮糖的所述氧化还原酶包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：
i)与SEQ ID NO:2具有至少80％同一性的氨基酸序列，
ii)由与SEQ ID NO:1具有至少80％同一性的核酸编码的氨基酸序列，和
iii)由在严格条件下与包含SEQ ID NO:1核酸序列的核酸分子结合的核酸编码的氨基酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，通过所述还原形成的氧化型辅因子NAD(P)+通过醇脱氢酶和仲醇被还原，并形成酮。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述仲醇为D-葡萄糖或2-丙醇。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法以一锅法反应进行，无需分离任何中间产物。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其特征在于，所述酶以产生它们的对应细胞的裂解物形式存在。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其特征在于，用于将所述第一D-阿洛酮糖还原为蒜糖醇的所述NAD(P)H依赖性氧化还原酶包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：
i)与SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:14具有至少80％同一性的氨基酸序列，
ii)由与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:13具有至少80％同一性的核酸编码的氨基酸序列，和
iii)由在严格条件下与包含SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:13核酸序列的核酸分子结合的核酸编码的氨基酸序列。
8.根据权利要求3至7中任一项所述的方法，其特征在于，所述醇脱氢酶包含选自由以下组成的组的氨基酸序列，或由其组成：
i)与SEQ ID NO:6具有至少80％同一性的氨基酸序列，
ii)由与SEQ ID NO:5具有至少80％同一性的核酸编码的氨基酸序列，和
iii)由在严格条件下与包含SEQ ID NO:5核酸序列的核酸分子结合的核酸编码的氨基酸序列。
9.根据权利要求1至8中任一项的方法，其特征在于，通过所述还原形成的氧化型辅因子NAD(P)+通过葡萄糖脱氢酶和D-葡萄糖被还原，并形成D-葡萄糖酸盐。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述葡萄糖脱氢酶包含选自由以下组成的组的氨基酸序列，或由其组成：
i)与SEQ ID NO:10具有至少80％同一性的氨基酸序列，
ii)由与SEQ ID NO:9具有至少80％同一性的核酸编码的氨基酸序列，和
iii)由在严格条件下与包含SEQ ID NO:9核酸序列的核酸分子结合的核酸编码的氨基酸序列。
11.通过根据权利要求1至10中任一项所述的方法可制备的水溶液在制备含有L-阿洛酮糖的糖浆中的用途。
12.氧化还原酶用于由蒜糖醇形成L-阿洛酮糖的用途，其特征在于，所述氧化还原酶包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：
i)与SEQ ID NO:2具有至少80％同一性的氨基酸序列，
ii)由与SEQ ID NO:1具有至少80％同一性的核酸编码的氨基酸序列，和
iii)由在严格条件下与包含SEQ ID NO:1核酸序列的核酸分子结合的核酸编码的氨基酸序列。
13.氧化还原酶用于由将D-阿洛酮糖还原为蒜糖醇的用途，其中所述氧化还原酶包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：
i)与SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:14具有至少80％同一性的氨基酸序列，
ii)由与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:13具有至少80％同一性的核酸编码的氨基酸序列，和
iii)由在严格条件下与包含SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:13核酸序列的核酸分子结合的核酸编码的氨基酸序列。
14.醇脱氢酶用于辅因子再生的用途，其中所述醇脱氢酶包含选自由以下组成的组的氨基酸序列，或由其组成：
i)与SEQ ID NO:6具有至少80％同一性的氨基酸序列，
ii)由与SEQ ID NO:5具有至少80％同一性的核酸编码的氨基酸序列，和
iii)由在严格条件下与包含SEQ ID NO:5核酸序列的核酸分子结合的核酸编码的氨基酸序列。
15.葡萄糖脱氢酶用于辅因子再生的用途，其中所述葡萄糖脱氢酶包含选自由以下组成的组的氨基酸序列，或由其组成：
i)与SEQ ID NO:10具有至少80％同一性的氨基酸序列，
ii)由与SEQ ID NO:9具有至少80％同一性的核酸编码的氨基酸序列，和
iii)由在严格条件下与包含SEQ ID NO:9核酸序列的核酸分子结合的核酸编码的氨基酸序列。
16.形成H2O的NAD(P)H氧化酶用于辅因子再生的用途，所述形成H2O的NAD(P)H氧化酶包含选自由以下组成的组的氨基酸序列，或由其组成：
i)与SEQ ID NO:8具有至少80％同一性的氨基酸序列，
ii)由与SEQ ID NO:7具有至少80％同一性的核酸编码的氨基酸序列，和
iii)由在严格条件下与包含SEQ ID NO:7核酸序列的核酸分子结合的核酸编码的氨基酸序列。
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