CN103397006A - 来源于产酸克雷伯氏菌的核糖醇脱氢酶（rdh）及其编码基因与应用 - Google Patents
来源于产酸克雷伯氏菌的核糖醇脱氢酶（rdh）及其编码基因与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一个来源于来源于产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）G4A4CGMCC No.7662的核糖醇脱氢酶（RDH），并实现了其在大肠杆菌中的表达。实验证明，该酶可以实现蒜糖醇的生物转化法生产，可以将D-阿洛酮糖转化为功能性稀少糖醇—蒜糖醇，转化率高（最高96％以上），污染小。转化过程中加入NADH再生系统，NAD用量小，大大降低了成本。且蒜糖醇可以应用于制备医药品（如糖尿病治疗药物等）、保健品、其它稀少糖的原料等诸多领域中，应用前景广泛。
Description
技术领域
本发明涉及酶及其编码基因与应用，特别是涉及一个来源于产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）的核糖醇脱氢酶（RDH）及其在生产蒜糖醇中的应用。
背景技术
稀少糖（Rare Sugar）是自然界中存在但含量极少的一类单糖及其衍生物（2002年国际稀少糖学会ISRS定义），其味道类似于蔗糖，但具有热量低、稳定性高、甜味协调、无吸湿性、无致龋齿性、耐受性高等优点，对改善特殊人群的饮食起到重要作用。另外，大量研究结果还表明稀少糖在抗癌、清除自由基、神经保护等诸多方面发挥着重要的生理活性作用，还可和蛋白及多肽等活性物质发生美拉德反应从而优化其功能活性（Zeng Y,Zhang X,Guan Y,Sun Y.Characteristics and antioxidantactivity of Maillard reaction products from psicose-lysine andfructose-lysine model systems.J Food Sci.2011,76(3):C398-403；Sun Y,Hayakawa S,Ogawa M,Fukada K,Izumori K.Influence of a rare sugar,d-Psicose,on the physicochemical and functional properties of an aerated food systemcontaining egg albumen.J Agric Food Chem.2008,56(12):4789-4796.）。功能性稀少糖具有独特的生物学活性，市场开发潜力较大。
蒜糖醇（allitol）是一种六碳稀少糖醇，具有一定的降血糖功能，而且降糖过程缓慢平稳，即使大量服用也不会发生低血糖危险，服用安全，可用于制备治疗糖尿病药物；另外，蒜糖醇具有对称性，可以作为D-型和L-型六碳稀少糖相互转化的连接中心。因此，蒜糖醇不仅可用于甜味剂、保健品、降糖药物，还可以用来生产其它稀少己糖。
目前，蒜糖醇的生产方式主要是提取法和化学转化法，生产效率低，成本高。日本的研究学者何森健（Izumori Ken）教授建立的Izumoring策略为稀少糖的生物转化提供了一条新的途径（Izumori K.Izumoring:a strategy for bioproduction ofall hexoses.J Biotechnol.2006,124(4):717-722）。研究发现，某些微生物可以实现D-阿洛酮糖和蒜糖醇之间的相互转化，如集聚肠杆菌Enterobacteragglomerans221e（Muniruzzaman S,Tokunaga H,Izumori K.Conversion ofD-psicose to allitol by Enterobacter agglomerans strain221e.J FermentBioengVolume.1995,79(4):323-327），该文献报道了以D-阿洛酮糖为底物转化生产蒜糖醇，但该菌底物特异性较差，如以D-果糖和D-阿洛酮糖混合物进行转化可能生成其他副产物；又如产气肠杆菌Enterobacter aerogenes IK7（Gullapalli P,Takata G,Poonperm W,Rao D,Morimoto K,Akimitsu K,Tajima S,Izumori K.Bioproduction of D-psicose from allitol with Enterobacter aerogenes IK7:anew frontier in rare ketose production.Biosci Biotechnol Biochem.2007,71(12):3048-3054），该文献只报道了以蒜糖醇为底物转化生产D-阿洛酮糖，国内尚未有相关报道。国外的主要专利文献有：[1]Ikumori Takeshi,Tsuzaki keiji.Ribitol dehydrogenase and its production and use.Japan,JP19940218155,1994-08-20.该专利文献公开了利用产气肠杆菌Enterobacter aerogenes IK7生产1-脱氧-L-阿洛酮糖和1-脱氧-L-果糖等脱氧稀少糖的方法，但是没有涉及生产蒜糖醇的方法。[2]Izumori Ken,Morimoto Kenji,Takata Goro,Tokuda Masaaki,TsujisakaYoshio,Takeshita Kei,Tsusaki Keiji,Okuma Kazuhiro.Microorganism withability to produce deoxy polyol dehydrogenase and use thereof.Japan,JP20060313672,2006-11-20.该专利文献公开了利用集聚肠杆菌Enterobacteragglomerans221e的氧化和还原作用分别生产多种稀少糖和糖醇的方法，但该菌底物特异性较差，如以D-果糖和D-阿洛酮糖混合物进行转化可能生成其它副产物。
发明内容
本发明的目的是提供一个来源于产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）的核糖醇脱氢酶（RDH）。
本发明所提供的核糖醇脱氢酶（RDH），来源于产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）G4A4，其保藏编号CGMCC No.7662，是下述氨基酸残基序列之一：
1）序列表中的SEQ ID NO：1；
2）将序列表中SEQ ID NO：1的氨基酸残基序列经过氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有核糖醇脱氢酶作用的蛋白质，新蛋白质与SEQ ID NO：1同源性达到80％或更高。
序列表中的SEQ ID NO：1由242个氨基酸残基组成。
产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）G4A4菌株已于2013年05月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏编号为CGMCC No.7662。
编码上述核糖醇脱氢酶的基因（RDH），是下述核苷酸序列之一：
1）序列表中SEQ ID NO：2的DNA序列；
2）编码序列表中SEQ ID NO：1的DNA序列；
3）所编码的序列80％或以上同源于序列表中SEQ ID NO：1且具有核糖醇脱氢酶作用的核苷酸序列；
4）在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID NO：2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
所述高严谨条件为杂交后用含0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液在65℃下洗膜。
序列表中的SEQ ID NO：2由729个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-729位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO：1所示氨基酸残基序列的蛋白质。
含有本发明基因的表达载体、转基因细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。
扩增核糖醇脱氢酶的基因（RDH）中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。
本发明的另一个目的是提供一种表达上述核糖醇脱氢酶（RDH）的方法。
本发明所提供的表达核糖醇脱氢酶（RDH）的方法，可包括以下步骤：
1）获得核糖醇脱氢酶基因（RDH）：以产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）G4A4CGMCC No.7662的基因组DNA为模板，在引物1：
5'-CGGGATCCATGAATACTTCCCTTAGC-3'（序列表中序列3，带下划线碱基为BamHⅠ酶切位点）和引物2：5'-CCCAAGCTTGAGATCCACGCTGTTCG-3'（序列表中序列4，带下划线碱基为HindⅢ酶切位点）的引导下PCR扩增核糖醇脱氢酶基因（RDH）；
2）构建重组表达载体：将核糖醇脱氢酶基因（RDH）连接入表达载体中；
3）表达核糖醇脱氢酶（RDH）：将核糖醇脱氢酶基因（RDH）或含有核糖醇脱氢酶基因（RDH）的重组表达载体转化或转导宿主细胞及其后代细胞，发酵重组宿主细胞，使核糖醇脱氢酶基因（RDH）获得表达，得到核糖醇脱氢酶（RDH）。
在上述核糖醇脱氢酶（RDH）的表达方法中，所述步骤2）中用于构建含有核糖醇脱氢酶基因（RDH）的重组表达载体的出发载体可为pET系列载体，如pET-21a、pET-28a、pET-32a、pET-43a或pETDuet-1等，优选为pET-21a；所述含有核糖醇脱氢酶基因（RDH）的重组表达载体的构建方法可为：将核糖醇脱氢酶基因（RDH）用限制性内切酶BamH I和Hind Ⅲ进行双酶切后与经同样酶双酶切的出发载体在T4DNA连接酶作用下进行连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，提取质粒，经测序鉴定出转化有含有核糖醇脱氢酶基因（RDH）的重组表达载体的阳性转化子，提取质粒，得到含有核糖醇脱氢酶基因（RDH）的重组表达载体；以pET-21a为出发载体构建的含有核糖醇脱氢酶基因（RDH）的重组表达载体为pETKRDH。
所述步骤3）中的宿主为任一可表达外源基因的原核细胞；所述原核细胞可为大肠肝菌，如E.coli BL21、E.coli Rosetta、E.coli Origami、E.coli M15、E.coli JM109、或E.coli LG90等，优选为E.coli BL21。
培养含有本发明核糖醇脱氢酶基因（RDH）的重组宿主细胞的培养基为低糖高氮适于大肠杆菌生长的培养基，如LB培养基、SOC培养基或肉汤培养基等，优选为LB培养基。
含有本发明核糖醇脱氢酶基因（RDH）的重组宿主细胞的培养条件为培养出发宿主的培养条件。
当所述宿主为大肠肝菌时，需加入乳糖、IPTG或两者混合物进行诱导表达，其中，所加入IPTG的浓度为0.1mM-0.5mM，优选为0.5mM。
具体来讲，含有核糖醇脱氢酶基因（RDH）的重组宿主细胞的发酵培养方法为：将含有核糖醇脱氢酶基因（RDH）的重组宿主细胞接种于50mL LB培养基（含100μg/mL氨苄青霉素）中进行活化，然后按1％的接种量接种于1L LB培养基（含100μg/mL氨苄青霉素）中，37℃、200rpm条件下进行培养，培养至OD600=0.6-1.0时，加入0.1mM-0.5mM（优选为0.5mM）IPTG诱导物，在20℃、100rpm条件下诱导培养16-24h。
上述核糖醇脱氢酶（RDH）、核糖醇脱氢酶基因（RDH）、含有核糖醇脱氢酶基因（RDH）的重组表达载体和含有核糖醇脱氢酶基因（RDH）的重组宿主细胞在蒜糖醇生产中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明还提供了一种蒜糖醇的生产方法，是将核糖醇脱氢酶（RDH）粗酶液或纯化后的核糖醇脱氢酶（RDH）加入Tris-HCl缓冲液（配方：50mM Tris水溶液，用盐酸调pH值为8.0）或磷酸盐缓冲液（配方：50mM磷酸氢二钠与磷酸二氢钠的水溶液，pH8.0）或HEPES缓冲液（配方：50mM HEPES水溶液，用氢氧化钠调pH值为8.0）中，加酶量0.1-0.5mg/mL（以核糖醇脱氢酶含量计），底物为D-阿洛酮糖纯品或D-果糖异构化后纯化得到的D-阿洛酮糖或D-果糖异构化后不经纯化得到的D-果糖与D-阿洛酮糖的混合物，底物浓度为0.5-10％（以D-阿洛酮糖含量计，质量／体积百分浓度，g/100ml），在30-45℃（优选为37℃）、pH为7.0-9.0（优选为7.0）条件下进行转化，转化过程加入NADH再生系统（甲酸脱氢酶0.1-0.5mg/mL，甲酸钠50-500mM，NAD+2-5mM），核糖醇脱氢酶（RDH）可将底物转化为蒜糖醇。
在上述蒜糖醇的生产方法中，核糖醇脱氢酶（RDH）可将底物转化为蒜糖醇的原理是核糖醇脱氢酶（RDH）使D-阿洛酮糖的2位羰基加氢，发生了还原化学反应，化学反应式如下：
本发明提供了一个来源于产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）G4A4，保藏号CGMCC No.7662的核糖醇脱氢酶（RDH），并实现了其在大肠杆菌中的表达。实验证明，该酶可以实现蒜糖醇的生物转化法生产，可以将D-阿洛酮糖转化为功能性稀少糖醇—蒜糖醇，转化率高（最高96％以上），污染小。转化过程中加入NADH再生系统，NAD用量小，大大降低了成本。且蒜糖醇可以应用于制备医药品（如糖尿病治疗药物等）、保健品、其它稀少糖的原料等诸多领域中，应用前景广泛。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
附图说明
图1为含有核糖醇脱氢酶基因（RDH）的重组大肠杆菌表达载体pETKRDH的物理图谱
图2为表达核糖醇脱氢酶基因（RDH）的大肠杆菌菌体、破碎上清、纯化产物的SDS-PAGE电泳图
图3为实施例2检测物的高效液相色谱图：A为D-阿洛酮糖标准物的高效液相色谱图；B为蒜糖醇标准物的高效液相色谱图；C为核糖醇脱氢酶纯化蛋白与D-阿洛酮糖37℃反应4h后的高效液相色谱图
图4为核糖醇脱氢酶纯化蛋白与不同浓度（1、3、5％）底物D-阿洛酮糖及不同浓度甲酸钠（100mM、200mM、300mM）的反应进程曲线
具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》（Sambrook，J.，Russell，David W.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold SpringHarbor）。
所述百分比浓度如无特别说明均为质量/体积(W/V)百分比浓度（单位:g/100ml）或体积/体积(V/V)百分比浓度。
本发明中用到的产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）G4A4菌株已于2013年05月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏编号为CGMCC No.7662。
实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验或生产可行的获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的同样性质的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。
所用引物由大连宝生物公司合成。
实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1、核糖醇脱氢酶（RDH）的表达
本发明核糖醇脱氢酶（RDH）的表达方法，可包括以下步骤：
1）获得核糖醇脱氢酶基因（RDH）：以保藏编号为CGMCC No.7662的产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）G4A4的基因组DNA为模板，在引物1：
5'-CGGGATCCATGAATACTTCCCTTAGC-3'（序列表中序列3，带下划线碱基为BamH I酶切位点）和引物2：5'-CCCAAGCTTGAGATCCACGCTGTTCG-3'（序列表中序列4，带下划线碱基为Hind Ⅲ酶切位点）的引导下PCR扩增核糖醇脱氢酶基因（RDH），PCR反应体系为：产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）G4A4CGMCC No.7662基因组DNA1μl，10×PCR缓冲液5μl，2mM dNTP5μl，10mM引物11μl，10mM引物21μl，高保真DNA聚合酶0.5μl，加水补足至总体积为50μl。PCR反应条件：先94℃5min；然后94℃30s，56℃30s，72℃90s，共30个循环；最后72℃5min。反应结束后，对PCR扩增产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，经扩增获得了729bp的DNA片段，与预期结果相符，用DNA回收试剂盒（购自天根生化科技有限公司）回收该目的基因。对该目的基因进行测序，测序结果表明该基因具有序列表中SEQ ID NO：2的核苷酸序列，由729个碱基组成，自5’端第1-729位碱基编码序列表中SEQ ID NO：1所示氨基酸残基序列的蛋白质。与已有文献报道的其它来源的核糖醇脱氢酶（RDH）在氨基酸水平上进行了序列比较，结果来源于产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）G4A4的RDH与运动发酵单胞菌（Zymomonas mobilis）ZM4（Moon HJ,Tiwari M,Jeya M,Lee JK.Cloning and characterization of a ribitol dehydrogenase from Zymomonasmobilis.Appl Microbiol Biotechnol.2010,87(1):205-214）的RDH相似性仅为24.0％，表明是一个新的核糖醇脱氢酶（RDH）。
2）构建重组表达载体：将核糖醇脱氢酶基因（RDH）用限制性内切酶BamH I和Hind Ⅲ进行双酶切后与经同样酶双酶切的出发载体pET-21a在T4DNA连接酶作用下进行连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，提取质粒，经测序鉴定出转化有含有核糖醇脱氢酶基因（RDH）的重组表达载体的阳性转化子，提取质粒，得到含有核糖醇脱氢酶基因（RDH）的重组表达载体，命名为pETKRDH，其物理图谱如图1所示。
3）表达核糖醇脱氢酶（RDH）：将取1μg含有核糖醇脱氢酶基因（RDH）的重组表达质粒pETKRDH，用CaCl2法将其转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，在含100μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基上培养过夜（12-20小时），待转化子长出后，用菌落PCR（引物1和引物2）的方法筛选出阳性重组宿主细胞，阳性重组宿主细胞可扩增出729bp的DNA片段，发酵重组宿主细胞，发酵方法为：将含有核糖醇脱氢酶基因（RDH）的重组宿主细胞接种于50mL LB培养基（含100μg/mL氨苄青霉素）中进行活化，然后按1％的接种量接种于1L LB培养基（含100μg/mL氨苄青霉素）中，37℃、200rpm条件下进行培养，培养至OD600=0.8（0.6-1.0均可）时，加入0.5mM（0.1mM-0.5mM均可）IPTG诱导物，在20℃、100rpm条件下诱导培养16-24h。培养结束后，对菌体、破碎上清、纯化产物进行12.5％SDS-PAGE检测，结果如图2所示，可见重组蛋白以可溶性形式存在，几乎没有包涵体的生成，表明用本发明的方法可使核糖醇脱氢酶基因（RDH）在大肠杆菌中获得表达，纯化后得到纯度较高的核糖醇脱氢酶（RDH），纯度可达95％以上。
用本发明的核糖醇脱氢酶（RDH）转化生产蒜糖醇（实施例2-4）：
实施例2、用核糖醇脱氢酶（RDH）转化生产蒜糖醇
1）离心收集实施例1中的菌体，用50mL pH8.0、50mM的Tris-HCl缓冲液（配方：50mM Tris水溶液，用盐酸调制pH为8.0）【磷酸盐缓冲液（配方：50mM磷酸氢二钠与磷酸二氢钠的水溶液，pH为8.0）或HEPES缓冲液（配方：50mM HEPES水溶液，用氢氧化钠调制pH为8.0）也可以】重悬菌体，超声破碎，15000rpm离心30min收集上清液，即为粗酶液。粗酶液经亲和层析、离子交换色谱纯化后获得纯酶（纯度达95％以上）。
2）将核糖醇脱氢酶（RDH）粗酶液或纯化后的核糖醇脱氢酶（RDH）加入pH8.0、50mM的Tris-HCl缓冲液（磷酸盐缓冲液或HEPES缓冲液也可以）中，加酶量0.1mg/mL（0.1-0.5mg/mL均可，以核糖醇脱氢酶含量计），底物为D-阿洛酮糖纯品或D-果糖异构化后纯化得到的D-阿洛酮糖或D-果糖异构化后不经纯化得到的D-果糖与D-阿洛酮糖的混合物，底物浓度为1％（0.5-10％均可，以D-阿洛酮糖含量计，质量／体积百分浓度g/100ml），在37℃（30-45℃均可）、pH7.0（7.0-9.0均可）条件下进行转化，转化过程加入NADH再生系统【甲酸脱氢酶0.5mg/mL（0.1-0.5mg/mL均可），甲酸钠100mM（50-500mM均可），NAD+2mM（2-5mM均可）】。
3）反应结束后，100℃处理5min使酶灭活。用0.22μm的微孔滤膜过滤，滤液进行高效液相色谱分析，按如下条件进行：仪器为安捷伦高效液相色谱仪1200，分析柱：Waters Sugar Pak1（购自沃特世科技有限公司），流动相：去离子水，流速：0.4mL/min，柱温：80℃，检测器：示差折光检测器。以Sigma公司生产的D-阿洛酮糖和蒜糖醇纯品为标准品。对样品进行分析，上样量为20μl。
D-阿洛酮糖标准物的高效液相色谱图如图3A所示，蒜糖醇标准物的高效液相色谱图如图3B所示，核糖醇脱氢酶纯化蛋白与D-阿洛酮糖37℃反应4h后的高效液相色谱图如图3C所示，可以看出，本发明的核糖醇脱氢酶（RDH）可将底物D-阿洛酮糖转化为蒜糖醇。
核糖醇脱氢酶纯化蛋白与浓度为1％的底物D-阿洛酮糖及100mM甲酸钠的反应进程曲线如图4所示，经过24小时反应，蒜糖醇转化率为93.1％，48小时后，蒜糖醇转化率为96.8％，接近全部转化。
实施例3、用核糖醇脱氢酶（RDH）转化生产蒜糖醇
方法与实施例2相同，不同之处是蒜糖醇转化反应体系中D-阿洛酮糖的浓度为3％（质量／体积百分浓度,g/100ml），NADH再生系统中甲酸钠的浓度为200mM。
核糖醇脱氢酶纯化蛋白与浓度为3％的底物D-阿洛酮糖及200mM甲酸钠的反应进程曲线如图4所示，经过48小时反应，蒜糖醇转化率达到90.1％，继续延长反应时间，转化率不再变化，说明反应已经达到平衡。
实施例4、用核糖醇脱氢酶（RDH）转化生产蒜糖醇
方法与实施例2相同，不同之处是蒜糖醇转化反应体系中D-阿洛酮糖的浓度为5％（质量／体积百分浓度,g/100ml），NADH再生系统中甲酸钠的浓度为300mM。
核糖醇脱氢酶纯化蛋白与浓度为5％的底物D-阿洛酮糖及300mM甲酸钠的反应进程曲线如图4所示，经过48小时反应，转化率达到80.6％，继续延长反应时间，转化率不再变化，说明反应已经达到平衡。
图4显示本发明的核糖醇脱氢酶（RDH）纯化蛋白与不同浓度（1、3、5％）底物D-阿洛酮糖的反应进程曲线。可见当核糖醇脱氢酶的加酶量为0.1mg/mL时，1％浓度的D-阿洛酮糖几乎可以被完全转化为蒜糖醇。由于酶随反应进程的失活，3％和5％的D-阿洛酮糖最终转化率分别为90％和80％左右，若使其完全转化，可以通过增加加酶量或者反应进程中补加核糖醇脱氢酶来实现。
实施例2-4说明使用本发明来源于产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）G4A4CGMCC No.7662的核糖醇脱氢酶（RDH）可以实现蒜糖醇的生物转化法生产，可以将D-阿洛酮糖转化为功能性稀少糖醇—蒜糖醇，转化率高（最高96％以上），污染小。转化过程中加入NADH再生系统，NAD用量小，大大降低了成本。且蒜糖醇可以应用于制备医药品（如糖尿病治疗药物等）、保健品、其它稀少糖的原料等诸多领域中，应用前景广泛。
Claims (10)
1.来源于保藏编号CGMCC No.7662的产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）G4A4的核糖醇脱氢酶（RDH），是下述氨基酸残基序列之一：
1）序列表中的SEQ ID NO：1；
2）将序列表中SEQ ID NO：1的氨基酸残基序列经过氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有核糖醇脱氢酶作用的蛋白质，新蛋白质与SEQ ID NO：1同源性达到80％或更高。
2.编码权利要求1所述核糖醇脱氢酶的基因（RDH），是下述核苷酸序列之一：
1）序列表中SEQ ID NO：2的DNA序列；
2）编码序列表中SEQ ID NO：1的DNA序列；
3）所编码的序列80％或以上同源于序列表中SEQ ID NO：1且具有核糖醇脱氢酶作用的核苷酸序列；
4）在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID NO：2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
3.含有权利要求2所述基因的表达载体、转基因细胞系或宿主菌。
4.一种表达权利要求1所述核糖醇脱氢酶（RDH）的方法，包括以下步骤：
1）获得核糖醇脱氢酶基因（RDH）：以所述产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）G4A4的基因组DNA为模板，在序列表中序列3表示的引物1和序列表中序列4表示的引物2的引导下PCR扩增核糖醇脱氢酶基因（RDH）；
2）构建重组表达载体：将核糖醇脱氢酶基因（RDH）连接入表达载体中；
3）表达核糖醇脱氢酶（RDH）：将核糖醇脱氢酶基因（RDH）或含有核糖醇脱氢酶基因（RDH）的重组表达载体转化或转导宿主细胞及其后代细胞，发酵重组宿主细胞，使核糖醇脱氢酶基因（RDH）获得表达，得到核糖醇脱氢酶（RDH）。
5.根据权利要求4所述的表达方法，其特征在于：所述步骤2）中用于构建含有核糖醇脱氢酶基因（RDH）的重组表达载体的出发载体可为pET系列载体，如pET-21a、pET-28a、pET-32a、pET-43a或pETDuet-1等等，优选为pET-21a；所述含有核糖醇脱氢酶基因（RDH）的重组表达载体的构建方法可为：将核糖醇脱氢酶基因（RDH）用限制性内切酶BamH I和Hind Ⅲ进行双酶切后与经同样酶双酶切的出发载体在T4DNA连接酶作用下进行连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，提取质粒，经测序鉴定出转化有含有核糖醇脱氢酶基因（RDH）的重组表达载体的阳性转化子，提取质粒，得到含有核糖醇脱氢酶基因（RDH）的重组表达载体。
6.根据权利要求5所述的表达方法，其特征在于：以pET-21a为出发载体构建的含有核糖醇脱氢酶基因（RDH）的重组表达载体命名为pETKRDH。
7.根据权利要求4或5或6所述的表达方法，其特征在于：所述步骤3）中的宿主为任一可表达外源基因的原核细胞；所述原核细胞可为大肠肝菌，如E.coli BL21、E.coli Rosetta、E.coli Origami、E.coli M15、E.coli JM109或E.coli LG90等，优选为E.coli BL21；培养含有本发明核糖醇脱氢酶基因（RDH）的重组宿主细胞的培养基为低糖高氮适于大肠杆菌生长的培养基，如LB培养基、SOC培养基或肉汤培养基等，优选为LB培养基；当宿主为大肠肝菌时，需加入乳糖、IPTG或两者混合物进行诱导表达，其中，所加入IPTG的浓度为0.1mM-0.5mM，优选为0.5mM。
8.根据权利要求4-7任一项所述的表达方法，其特征在于：所述步骤3）中含有核糖醇脱氢酶基因（RDH）的重组宿主细胞的发酵培养方法为：将含有核糖醇脱氢酶基因（RDH）的重组宿主细胞接种于50mL LB培养基（含100μg/mL氨苄青霉素）中进行活化，然后按1％的接种量接种于1L LB培养基（含100μg/mL氨苄青霉素）中，37℃、200rpm条件下进行培养，培养至OD600=0.6-1.0时，加入0.1mM-0.5mM（优选为0.5mM）IPTG诱导物，在20℃、100rpm条件下诱导培养16-24h。
9.权利要求1所述核糖醇脱氢酶（RDH）、权利要求2所述核糖醇脱氢酶基因（RDH）、权利要求3所述含有核糖醇脱氢酶基因（RDH）的重组表达载体或权利要求3所述含有核糖醇脱氢酶基因（RDH）的重组宿主细胞在蒜糖醇生产中的应用。
10.一种蒜糖醇的生产方法，是将权利要求1所述核糖醇脱氢酶（RDH）粗酶液或纯化后的核糖醇脱氢酶（RDH）加入Tris-HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液或HEPES缓冲液中，加酶量0.1-0.5mg/mL（以核糖醇脱氢酶含量计），底物为D-阿洛酮糖纯品或D-果糖异构化后纯化得到的D-阿洛酮糖或D-果糖异构化后不经纯化得到的D-果糖与D-阿洛酮糖的混合物，底物浓度为0.5-10％（以D-阿洛酮糖含量计，质量／体积百分浓度，g/100ml），在30-45℃（优选37℃）、pH为7.0-9.0（优选7.0）条件下进行转化，转化过程加入NADH再生系统（甲酸脱氢酶0.1-0.5mg/mL，甲酸钠50-500mM，NAD+2-5mM），核糖醇脱氢酶（RDH）可将底物转化为蒜糖醇。
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20131120 |