CN120919157A - 岩藻多糖在制备抗鹅细小病毒感染制剂中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及岩藻多糖(FUC)在制备抗鹅细小病毒(GPV)感染制剂中的应用，本发明以原代番鸭胚小肠上皮细胞(PMDIECs)和GPV PT分离株为研究对象，通过细胞活力检测、免疫印迹、绝对荧光定量qPCR、半数组织细胞感染剂量及免疫荧光分析等技术，系统开展FUC的细胞毒性测定、体外抗GPV感染评价以及作用机制探究。结果显示，6mg/mL FUC作用PMDIECs 72h无明显细胞毒性，FUC可剂量依赖性抑制GPV感染，显著降低细胞内GPVVP3蛋白表达、病毒基因组拷贝数及培养上清病毒滴度等，本发明首次证实FUC体外抗GPV活性，为其研发防控GPV感染的兽用制剂提供实验依据。

Description

岩藻多糖在制备抗鹅细小病毒感染制剂中的应用

技术领域

本发明属于兽医微生物与生物活性物质抗病毒技术领域，具体涉及岩藻多糖(Fucoidan，FUC)在制备抗鹅细小病毒(goose parvovirus，GPV)感染制剂中的应用，岩藻多糖体外抑制鹅细小病毒复制的效应评估相关技术。

背景技术

小鹅瘟(俗称Derzsy's disease，德兹西氏病)是一种传染性强危害性大的水禽病毒性疫病，主要危害鹅与番鸭，其病原为鹅细小病毒(goose parvovirus，GPV)，属于细小病毒科中雁形目依赖细小病毒属1型，其病毒颗粒呈无囊膜二十面体结构，由病毒结构蛋白组成，内部包裹着线性单链DNA基因组，两端带有U形发夹结构(inverted terminal repeats,ITRs)。依赖这些发夹结构的细小病毒特异性滚环复制机制，加速了病毒重组与进化进程。GPV基因组长约5100bp，编码非结构蛋白(NS1和NS2)及病毒衣壳蛋白(VP1、VP2、VP3)，这些蛋白通过差异剪接机制大量表达。NS蛋白特异性结合ITRs启动病毒DNA复制与衣壳基因表达。同时，结构蛋白VP1、VP2和VP3按1：1：8比例形成病毒衣壳，形成二十面体结构，VP3蛋白是主要的衣壳成分。GPV主要感染一个月龄以内的幼鹅和雏番鸭，其感染特征表现为体重下降、结膜炎和水样腹泻等典型临床症状。此外，这类感染常引发急性肠炎、重要器官(如心脏、肝脏、肾脏)的炎症反应、坏死性肠炎，以及由凝固纤维素渗出物形成的肠道栓塞，并伴随肠黏膜坏死脱落。GPV主要通过感染个体的分泌物和排泄物传播，具有快速扩散和高致死率的特点。值得注意的是，幼鹅和雏番鸭通常在感染后无明显症状，但可发生垂直传播给后代，使得GPV能够通过种蛋形成代际循环，导致胚胎死亡、孵化率降低，造成养殖群体中GPV的隐匿扩散，加剧继发感染风险，进一步增加临床小鹅瘟防控难度。

福建省不仅是番鸭产业的重要基地，也是GPV感染的高发区。目前，防治番鸭小鹅瘟主要依赖疫苗接种。然而，灭活疫苗难以产生足够的中和抗体，减毒疫苗也无法对多种病毒株产生完全免疫效果，同时缺乏有效的抗病毒药物进一步增加了综合防控难度。岩藻多糖(Fucoidan，FUC)是一种主要从褐藻中提取的硫酸化多糖，其复杂结构包含L-岩藻糖、硫酸酯基团以及单糖(如半乳糖、甘露糖、木糖)，这些成分赋予了它多样化的生物活性。现有技术中，尚未证实岩藻多糖具备广谱抗病毒活性，目前岩藻多糖抗病毒机制研究中均针对特定有囊膜病毒类群，未涉及无囊膜病毒领域。其中，有囊膜病毒类群包含疱疹病毒(有囊膜DNA病毒)这类双链DNA病毒，也涵盖冠状病毒(有囊膜RNA病毒)这类单链RNA病毒(如现有技术CN 115835870 A公开了抗病毒药物组合物，包括岩藻多糖，其作用的病毒为冠状病毒)。鹅细小病毒(GPV)属于典型的无囊膜单链DNA病毒，其病毒颗粒结构(无脂质囊膜)、基因组类型(单链线性DNA)与既往研究的有囊膜病毒存在本质差异。经检索国内外中英文文献(包括PubMed、CNKI、Web ofScience等数据库)，目前尚无任何研究报道岩藻多糖对无囊膜单链DNA病毒的抑制作用。因此，关于FUC是否具有抑制GPV感染的生物学功能，当前已检索的文献中尚未发现相关报道。在本发明的研究中，探讨了FUC对GPV感染的抗病毒作用，并进一步探索了其抗病毒机制。根据本发明的数据显示，FUC表现出该药物在GPV感染早期阶段展现出显著的抗病毒效果，通过干扰GPV生命周期的多个阶段(包括病毒附着、内化、复制和释放)有效抑制其活性。本发明的研究结果表明FUC在治疗GPV感染方面具有兽医临床应用潜力。本发明首次建立该类病毒与岩藻多糖的抗病毒关联，直接填补了岩藻多糖抗病毒研究在“无囊膜单链DNA病毒”领域的空白，

发明内容

本发明的目的在于解决现有技术中GPV感染防控手段有限的技术问题。为此，本发明提供一种FUC在制备抗GPV感染制剂中的应用，目的是为GPV感染的防控提供新的技术方案和物质选择。

本发明的目的通过如下技术方案实现：

岩藻多糖(FUC)在制备抗鹅细小病毒(GPV)感染制剂中的应用。

所述抗鹅细小病毒(GPV)感染制剂包括抑制鹅细小病毒(GPV)吸附宿主细胞和/或抑制鹅细小病毒(GPV)侵染宿主细胞的制剂。

所述抗鹅细小病毒(GPV)感染制剂包括预防和/或治疗鹅细小病毒(GPV)感染的制剂。

所述抗鹅细小病毒(GPV)感染制剂包括干扰鹅细小病毒(GPV)生命周期的制剂。

所述生命周期包括病毒吸附、入胞、复制及释放。

所述制剂为兽用药物制剂。

所述兽用药物制剂的剂型包括散剂、口服液、可溶性粉剂。

所述鹅细小病毒的毒株为GPV-PT。本发明在评估FUC抑制GPV感染活性、FUC干扰病毒生命周期、FUC影响病毒吸附、FUC抑制病毒入胞、FUC阻断病毒复制及释放的测试中，所采用的鹅细小病毒分离株为GPV-PT。

所述岩藻多糖(FUC)的应用浓度为0.75-6mg/mL。

较之现有技术而言，本发明的优点在于：

(1)FUC源于褐藻资源丰富，提取工艺成熟，易于规模化生产，成本可控。

(2)FUC抗GPV感染效果显著，能有效抑制GPV对原代番鸭胚小肠上皮细胞(primaryMuscovy duck embryonic intestinal epithelial cells，PMDIECs)的吸附与侵入过程，显著降低病毒增殖滴度。

(3)FUC为天然海洋生物活性物质，生物相容性好，毒理学安全性高，适用于雏番鸭等敏感群体的长期防控。

(4)FUC兼具抗病毒、免疫增强及肠道屏障保护等多重生物学功能，针对灭活疫苗(如免疫应答相对较慢、常需多次接种以维持有效免疫水平)及弱毒疫苗(如存在潜在毒力返强风险、对免疫抑制个体安全性欠佳)在应用中的不足，其在GPV感染的综合防控中具有协同增效优势。

附图说明

图1为本发明实施例3中FUC对PMDIECs的毒性作用结果；

图2为本发明实施例4中FUC在PMDIECs上抑制GPV感染活性的结果，其中，A、B、C和D分别为Westernblotting、qPCR、TCID₅₀和IFA(标尺＝100m)测定FUC在PMDIECs上对GPV感染的影响；

图3为本发明实施例5中FUC在三种给药方式【预防给药(pre-treatment)、同时给药(co-treatment)、治疗给药(post-treatment)】条件下抑制GPV感染PMDIECs的结果，其中，A、B分别为qPCR、TCID₅₀测定FUC在PMDIECs上对GPV感染的影响；C、D和E分别为Westernblotting测定三种给药方式条件下FUC在PMDIECs上对GPVVP3蛋白表达的影响

图4为本发明实施例6中FUC对GPV吸附PMDIECs的影响，A、B分别为qPCR、Westernblotting结果；

图5为本发明实施例7中FUC对GPV进入PMDIECs的影响，A、B分别为qPCR、Westernblotting结果；

图6为本发明实施例8中FUC对GPV在PMDIECs中增殖的影响，其中，A为本发明实施例8中12hpi和24hpi时FUC对GPVVP3基因拷贝数的影响，B、C分别为本发明实施例8中12hpi和24hpi时FUC对GPVVP3蛋白表达水平的影响；

图7为本发明实施例9中FUC对GPV释放的影响，A、B分别为qPCR、TCID₅₀结果；

图8为发明实例10中FUC对GPV诱导PMDIECs促炎性因子与I型干扰素mRNA相对表达量的影响。将感染GPV的PMDIECs分为两组，分别在不添加或添加6mg/mLFUC的条件下于37℃进行孵育。在处理后的12、24、36、48、60及72h，分别从细胞裂解液中提取总RNA。采用RT-qPCR方法，检测白细胞介素-1β(IL-1β，图8A)、白细胞介素-6(IL-6，图8B)、白细胞介素-8(IL-8，图8C)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α，图8D)、干扰素-α(IFN-α，图8E)及干扰素-β(IFN-β，图8F)的mRNA相对表达水平。该实验在相同的条件下进行了三次独立的重复实验，试验结果均以平均值±标准差表示，统计学分析以GPV感染组为对照，显著性差异标注标准如下：*代表p<0.05，**代表p<0.01，***代表p<0.001。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明。

需要说明的是，除非另外定义，本发明实施例使用的技术术语或者科学术语应当为本公开所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。

实施例1

细胞与病毒的准备

原代番鸭胚小肠上皮细胞(primary Muscovy duck embryonic intestinalepithelial cells，PMDIECs)分离自健康27日龄番鸭胚的小肠组织，细胞的制备与培养操作均遵循常规实验流程，培养阶段以含10％胎牛血清的Dulbecco's Modified EagleMedium(DMEM)完全培养液，以保障细胞的正常生长与活性维持。本研究使用的GPV-PT病毒株由本实验室分离并保存。

实施例2

FUC制剂的制备

将岩藻多糖(Fucoidan，FUC，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)溶解于DMEM培养液中，制备成储存浓度为24mg/mL的岩藻多糖制剂，0.22μm滤膜过滤除菌，适当分装后保存于-20℃。

实施例3：FUC对PMDIECs毒性的测定

首先将PMDIECs以1×10⁵个细胞/mL的浓度接种至96孔板中。同时设置空白对照组，使用不含任何细胞的维持培养基(含2％胎牛血清的DMEM)。将FUC用维持培养基进行两倍梯度稀释后，与PMDIECs在96孔板中共培养72h。另设仅含维持培养基的阴性对照组。72h后，每孔加入10μL CCK-8试剂(上海碧云天生物技术有限公司)，在37℃避光孵育2h，用酶标仪测定450_nm吸光度值。结果显示，6mg/mL的FUC作用PMDIECs 72h没有明显的细胞毒性(图1)。

实施例4：FUC在PMDIECs上抑制GPV感染的活性

(1)Westernblotting测定FUC在PMDIECs上抑制GPV感染的活性

PMDIECs在24孔板中于37℃培养至80％汇合度后，弃去完全培养液，并用PBS洗涤细胞三次。随后，细胞首先在维持培养液中用FUC(0、0.75、1.5、3和6mg/mL)预处理2h，吸弃细胞培养上清，接着用PBS洗涤三次，再以感染复数(multiplicity ofinfection，MOI)为1的GPV PT病毒株于37℃继续感染2h。之后移除病毒液，并用PBS再次冲洗孔板三次，接着向细胞中添加含不同浓度FUC(终浓度同预处理阶段)的维持培养液，继续孵育70h。同时设立仅含维持培养液且不含FUC的空白细胞对照组。病毒感染细胞72小时后，分别收集细胞培养上清与细胞样品，用PBS洗涤细胞3次，通过Western blotting分析GPV感染细胞中病毒VP3蛋白水平，测定FUC的抗病毒活性。结果显示，FUC的外源添加处理可使PMDIECs感染细胞中GPVVP3蛋白的表达量得到显著降低，初步证实FUC具有干扰GPV在宿主细胞内感染进程、抑制其感染活性的潜在作用(图2A)。

(2)绝对荧光定量多聚酶链式反应(quantitative real-time polymerase chainreaction，qPCR)测定PMDIECs中GPVVP3基因拷贝数

细胞样品总DNA提取参照FastPure Cell/Tissue DNA Isolation Mini Kit(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)说明书操作完成。GPVVP3基因的荧光定量PCR引物，参照本实验室前期已建立的GPV SYBR Green I qPCR检测方法设计，委托福州尚亚生物技术有限公司合成，序列为GPV G5P1F(5’-GAGGTAGACAGCAACAGAAA-3’)和GPV G5P2R(5’-GCTCGTCCGTGACCATA-3’)。qPCR分析采用ChamQ Blue Universal SYBR qPCR MasterMix(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)，反应程序设置为：95℃变性30秒，随后进行40个循环的95℃变性10秒、60℃退火30秒。以预先构建的pMD19-T-GPV质粒(pGDA)作为标准质粒绘制标准曲线，通过该曲线计算GPV拷贝数，从而检测感染样品中的GPV病毒载量。结果表明，FUC可显著抑制GPV在侵染PMDIECs内的复制增殖，且该抑制效应具有浓度依赖性(图2B)。

(3)TCID₅₀测定FUC在PMDIECs上抑制GPV感染的活性

收集本实施例4(1)中GPV感染对照组以及各浓度(0、0.75、1.5、3和6mg/mL)FUC抗GPV处理组的细胞培养上清。将本实施例4(1)中收集的细胞培养上清样品，均按10倍系列梯度进行倍比稀释；随后分别接种至铺有单层PMDIECs且细胞融合度达80％的96孔细胞板中，每个稀释度接种8孔，每孔100μL。吸附2h后，用PBS缓冲液清洗细胞2-3次，再加入与接种体积等量的细胞维持液，于37℃条件下连续培养7天，同时设置正常细胞对照组。每日观察并记录细胞病变情况，以≥50％细胞出现细胞病变的孔判定为阳性孔，记录各稀释度的阳性孔数，按Reed-Muench方法计算TCID₅₀。结果表明：FUC能够以剂量依赖性方式降低细胞培养上清液中的病毒滴度(图2C)，证明FUC对GPV的感染过程具有显著抑制作用。

(4)免疫荧光(immunofluorescence assay，IFA)测定FUC在PMDIECs上抑制GPV感染的活性

PMDIECs按本实施例4(1)中的方法进行处理，感染72h后，细胞用PBS洗涤3遍，加入4℃预冷4％多聚甲醛覆盖细胞表面，在37℃固定15min后，弃去固定液，用PBS洗涤细胞3次，每次5min。加入0.1％Triton X-100透化剂，室温孵育5-10min，弃去透化剂，用PBS洗涤细胞3次，每次5min，向培养孔中加入5％BSA封闭液，覆盖细胞表面，4℃封闭过夜。封闭后加入抗GPV单克隆抗体(1：200)在37℃孵育1-2h，孵育结束后，弃去一抗溶液，用PBS洗涤细胞3-4次，每次5-10min，向培养孔中加入FITC标记山羊抗小鼠IgG抗体(1：200)，室温避光孵育30min-1h。孵育结束后，弃去二抗溶液，用PBS洗涤细胞3-4次，每次5-10min，避光洗涤。向培养孔中加入DAPI染液，室温避光孵育5-10min后观察。结果表明，FUC能够以剂量依赖性方式降低细胞培养上清液中的病毒滴度(图2D)，证明FUC可以抑制GPV在PMDIECs中的感染增殖。

实施例5：FUC在不同给药方式干预下对GPV感染的抑制作用

PMDIECs在24孔板中于37℃条件下培养5％CO₂，直至达到汇合状态，随后在GPV感染期间分别接受FUC(0、0.75、1.5、3和6mg/mL)的预防给药(pre-treatment)、同时给药(co-treatment)、治疗给药(post-treatment)三种作用方式。具体操作步骤简述如下：

预防给药组中，PMDIECs首先与FUC在37℃下孵育2小时，浓度分别为0、0.75、1.5、3和6mg/mL，随后弃掉含FUC细胞维持培养液；经三次PBS洗涤后，用GPV PT毒株(MOI＝1)感染细胞2小时，随后弃掉病毒液，对细胞单层进行三次PBS洗涤，并补充不含FUC新鲜细胞维持培养液。同时设立仅含维持培养液且不含FUC的空白细胞对照组。

同时给药组中，将含FUC(0、1.5、3、6和12mg/mL)的维持培养基与GPV PT毒株(MOI＝2)等体积混合，在37℃下共孵育2小时后接种至PMDIECs继续培养2小时，弃掉GPV与FUC混合液，经三次PBS洗涤后，添加不含FUC新鲜维持培养液中培养，在37℃下继续孵育。同时设立仅含维持培养液且不含FUC的空白细胞对照组。

治疗给药组中，PMDIECs首先与GPV(MOI＝1)在37℃下孵育2小时，随后弃掉病毒液，经三次PBS洗涤后，分别加入含FUC(浓度为0、0.75、1.5、3和6mg/mL)的新鲜细胞维持培养液，在37℃下继续孵育。同时设立仅含维持培养液且不含FUC的空白细胞对照组。

本实施例5的整个实验过程中，所有上述处理的细胞均培养至感染后72h，此时收集感染细胞及其培养上清液。通过绝对定量qPCR测定GPV基因组拷贝数，采用TCID₅₀法检测病毒滴度，并通过蛋Westernblotting分析GPV VP3蛋白的表达水平。结果表明，FUC在三种不同给药方式情况下，均可以抑制GPV对PMDIECs的感染活性，特别是在同时给药模式下FUC对GPV的直接灭活作用尤其显著，可以显著抑制GPVVP3蛋白表达、减少病毒拷贝数，降低感染细胞上清中的病毒滴度(图3A-E)。

实施例6：FUC对GPV吸附(attachment)的影响

将24孔细胞培养板中已生长形成单层的PMDIECs于4℃条件下预冷30min，随后接种GPV-PT(感染复数MOI＝1)及含有不同浓度FUC(0、0.75、1.5、3、6mg/mL)的细胞维持培养液，在4℃条件下共同孵育2h。同时设置细胞空白对照组，该组仅用不含FUC的细胞维持培养液孵育PMDIECs。孵育结束后，吸弃上清液，再用预冷的PBS洗涤细胞三次。随后收集细胞样本，通过绝对定量qPCR测定GPV基因组拷贝数，采用Western Blotting检测GPV-VP3蛋白的表达水平。qPCR和Westernblotting实验结果显示，用FUC处理后，吸附在PMDIECs表面的GPV显著减少，能够抑制VP3蛋白的表达，证明FUC能够抑制GPV对PMDIECs的吸附(图4A、B)。

实施例7：FUC对GPV入胞的影响

将PMDIECs接种到24孔细胞培养板，待细胞长到90％汇片状态，在4℃预冷30min后，于相同温度条件下用GPV-PT(MOI＝1)感染2小时，随后用冷PBS洗涤三次以去除未结合的病毒颗粒。随后，将感染细胞分别用含有0、0.75、1.5、3和6mg/mL FUC的维持培养液处理2h，温度维持在37℃以促进病毒入胞，同时细胞空白对照组仅在相同维持培养液中保持无病毒感染状态。孵育结束后，用高碱性高盐溶液[1M氯化钠和50mM三羟甲基氨基甲烷(pH9.5)]洗涤细胞三次以去除未内化的胞外病毒，随后收集细胞进行绝对荧光定量qPCR分析病毒DNA拷贝数，并通过Western blotting分析GPV-VP3蛋白的表达水平。qPCR和Westernblotting实验结果显示，FUC可以抑制GPV进入PMDIECs(图5A、B)，而且FUC对GPV入胞过程的抑制作用较其对GPV吸附PMDIECs过程的影响更为显著。

实施例8：FUC对GPV复制的影响

将PMDIECs接种至24孔细胞培养板，待细胞生长至90％汇片后，于37℃条件下接种GPV-PT(感染复数MOI＝1)，感染4h。感染结束后，向各组分别加入含0、0.75、1.5、3和6mg/mLFUC的维持培养液，同时设置细胞空白对照组(仅加入不含FUC的细胞维持培养液)，各组均继续置于37℃条件下孵育。随后分别于感染GPV后12小时(12hours post-infection，hpi)和24hpi收集细胞样品，采用绝对荧光定量qPCR和Westernblotting检测细胞内GPVVP3基因拷贝数与蛋白表达水平。qPCR和Westernblotting实验结果显示，FUC能够有效抑制GPV在PMDIECs中的复制与增殖过程(图6A-C)。

实施例9：FUC对GPV释放的影响

将PMDIECs接种至24孔细胞培养板，待细胞生长至90％汇片后，于37℃条件下接种GPV-PT(MOI＝1)，感染24h。随后用PBS将细胞洗涤3次，分别向细胞中加入含0、0.75、1.5、3和6mg/mLFUC的维持培养液，继续于37℃孵育8h，同时设置细胞空白对照组(仅加入不含FUC的细胞维持培养液)。孵育完成后，分别收集各组细胞样品与培养上清液，采用绝对荧光定量qPCR测定细胞中GPV DNA拷贝数，利用TCID50检测细胞培养上清中的病毒滴度。qPCR和Westernblotting实验结果显示，FUC可以有效抑制GPV子代病毒的释放(图7A，B)。

实施例10：FUC对GPV感染PMDIECs中炎症因子及I型干扰素mRNA表达的影响

PMDIECs按实本实施例4(1)中的方法进行处理，感染72h后使用FastPure Cell/Tissue Total RNAIsolation KitV2(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)提取PMDIECs总RNA，并参照说明书通过HiScript IIQ Select RT SuperMix for qPCR(+gDNAwiper)(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)合成cDNA。应用ChamQ Blue Universal SYBR qPCRMasterMix(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)检测白细胞介素-1β(IL-1β)、IL-6、IL-8、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、干扰素-α(IFN-α)及IFN-β的mRNA在PMDIECs中的相对表达水平。引物序列见表1，由福州尚亚生物技术有限公司合成。反应体系:ChamQ Universal SYBRqPCR Master Mix 5.0μL，无菌除酶水3.6μL，模板cDNA 1.0μL，上下游引物(10pmol/μL)各0.2μL。反应程序：95℃预变性30s；95℃变性10s，60℃退火延伸30s，共40个循环。以β-微管蛋白(β-Tubulin)为内参，采用2^-ΔΔCt法计算IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、IFN-α与IFN-β基因的mRNA相对表达量。结果显示，FUC显著降低了GPV感染细胞中促炎因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α的含量，其中高剂量组的效果更好。同时，FUC处理组I型干扰素(IFN-α、IFN-β)的表达水平显著升高(图8A-F)。

表1荧光定量RT-qPCR引物序列信息

由以上实施例可知：

本发明首次在体外实验证实，FUC对GPV感染具有显著抑制作用。GPV的生命周期可分为四个阶段：1)病毒颗粒附着于细胞表面；2)病毒颗粒被宿主细胞内化；3)病毒颗粒进行基因组复制；4)病毒颗粒释放。每个阶段都可能成为抗病毒药物研发的潜在靶点。本发明通过加药时间实验发现，随着药物浓度增加，病毒滴度呈剂量依赖性逐渐下降，GPVVP3基因的相对表达水平也相应逐步降低。与病毒对照组相比，这些差异具有极显著性。在相同药物浓度下，不同给药方式的对比显示：FUC对GPV的直接灭活作用效果显著。

病毒感染的初始阶段涉及病毒与细胞表面受体的结合，随后通过稳定且不可逆的吸附作用启动后续的细胞入侵过程。相较于感染后使用抗病毒药物，抑制病毒吸附至细胞表面是预防感染更有效的策略。在4℃条件下，病毒仅能吸附于细胞膜表面，而无法穿透至细胞质内部；这一特性使4℃成为评估病毒吸附特异性效应的理想实验条件。基于该条件的优势，本发明进一步通过FUC处理番鸭胚小肠上皮细胞，系统评估FUC对GPV吸附过程的调控作用。结果显示，与未经FUC处理的对照组相比，经FUC处理的细胞对GPV的吸附量显著降低。此外，即使病毒最初已吸附到细胞表面，FUC仍能阻断GPV的内化过程。我们推测FUC结构中硫酸基团所带负电荷，可能会与病毒衣壳蛋白上的正电基团相互作用，从而阻止病毒与细胞结合、阻断吸附并干扰复制；另一方面，由于FUC具有凝胶特性，它可能与病毒竞争结合细胞表面受体，进而抑制病毒附着。在抗病毒实验中，FUC处理有效抑制了GPV的复制。值得注意的是，当靶向GPV复制时，这种抑制作用比靶向病毒结合、内化或释放时更为显著。这些发现表明，干扰病毒蛋白合成是FUC发挥抗病毒活性的关键途径。

GPV感染幼鹅与雏番鸭会引发肠道炎症，此时主要产生促炎性细胞因子。这些细胞因子通过协调并激活适应性免疫反应，在水禽病毒性肠病的发展中起着关键作用，从而帮助宿主清除病原体。已有研究表明，GPV可通过下调I型干扰素(IFN-I)依赖的免疫应答，从而逃逸宿主免疫细胞的免疫监视。值得注意的是，本发明的发明人发现GPV感染易感宿主细胞后，显著增加了IL-1β、IL-6和TNF-α的表达水平，这与先前研究结果一致。此外，FUC处理能显著降低病毒感染诱导的细胞因子表达，并促进IFN-α和IFN-β基因的表达转录，从而抑制GPV在番鸭胚小肠上皮细胞中的感染复制。这些数据表明，FUC不仅作为病毒生命周期的抑制剂发挥作用，还能调控宿主的炎症和免疫反应。

综上所述，本发明首次证实FUC对GPV具有显著抗病毒活性。FUC在感染早期阶段即发挥作用，通过靶向GPV生命周期的关键环节，包括病毒吸附、内化、复制及释放等关键步骤，并能直接与GPV发生相互作用。本发明不仅确立了FUC作为GPV感染潜在治疗药物的潜力，还为其在预防和治疗GPV感染中的应用提供了理论依据，并为未来抗GPV药物的研发指明方向。

最后需要说明书的是，本领域普通技术人员应理解：对前述任一实施例的探讨仅具示例性，其目的并非暗示本公开的保护范围(含权利要求所界定范围)仅限于此类示例；在本发明所秉持的技术构思框架内，前述各实施例或不同实施例所含的技术特征可进一步相互组合，相关步骤的执行顺序亦具备任意性，且本发明在不同技术维度上还存在诸多如前所述的其他变形，为保证表述简洁，未对这些变形展开详细阐述。

本发明的各实施例旨在覆盖所有符合所附权利要求书界定的宽泛保护范围的替换方案、修改方式及变型形式。据此，凡在本发明的技术精神与核心原则框架内，所实施的任何省略、修改、等同替换及改进等行为，均应纳入本发明的保护范围。

Claims (9)

1.岩藻多糖在制备抗鹅细小病毒感染制剂中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述抗鹅细小病毒感染制剂包括抑制鹅细小病毒吸附宿主细胞和/或抑制鹅细小病毒侵染宿主细胞的制剂。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述抗鹅细小病毒感染制剂包括预防和/或治疗鹅细小病毒感染的制剂。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述抗鹅细小病毒感染制剂包括干扰鹅细小病毒生命周期的制剂。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述生命周期包括病毒吸附、入胞、复制及释放。

6.根据权利要求1-4任意一项所述的应用，其特征在于：所述制剂为兽用药物制剂。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述兽用药物制剂的剂型包括散剂、口服液、可溶性粉剂。

8.根据权利要求1-4任意一项所述的应用，其特征在于：所述鹅细小病毒的毒株为GPV-PT。

9.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述岩藻多糖的应用浓度为0.75-6mg/mL。