CN116869979B - 补骨脂乙素在制备治疗流行性乙型脑炎病毒感染药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了补骨脂乙素在制备治疗流行性乙型脑炎病毒感染药物中的应用，通过CCK‑8法从脂类化合物库中筛选抑制流行性乙型脑炎病毒增殖的化合物，发现补骨脂乙素以浓度依赖的方式抑制流行性乙型脑炎病毒的复制，并通过药物添加试验证明补骨脂乙素主要作用于乙型脑炎病毒复制阶段来发挥抑制作用，在体内实验上补骨脂乙素也展示出良好的效果，其通过降低感染小鼠脑组织中的病毒载量，消除与乙脑病毒感染相关的组织病理学变化，从而保护小鼠免受乙型脑炎病毒带来的致死性攻击。总之补骨脂乙素有望成为乙型脑炎病毒抑制剂，本研究为乙型脑炎病毒引发的感染提供了治疗可能性。

Description

补骨脂乙素在制备治疗流行性乙型脑炎病毒感染药物中的 应用

技术领域

本发明属于抗病毒技术领域，具体涉及补骨脂乙素在制备治疗流行性乙型脑炎病毒感染药物中的应用。

背景技术

流行性乙型脑炎病毒又称为日本脑炎病毒，简称为乙脑病毒(JEV)，属于黄病毒科黄病毒属成员，以三带喙库蚊为感染媒介，以猪和涉水禽鸟为扩增宿主，库蚊通过叮咬感染人、马等终末宿主。流行性乙型脑炎病毒属于《中华人民共和国传染病防治法》中规定的乙类传染病，可以引发严重的人兽共患病。

乙型脑炎主要流行于夏季，7至9月正值高温季风雨气候，在水系发达、人口密集的城乡地区，易滋生蚊虫，并且水禽种类和数量多，同时人口密集的地区对猪肉需求量大，养殖业发达，三带喙库蚊通过叮咬猪后感染乙脑病毒，三带喙库蚊再叮咬人加剧了人类感染乙脑病毒的风险。1871年首次在日本发现乙脑病例，在1935年乙脑毒株Nakayama首次于患者大脑中分离出来。随后的时间里，在中国、韩国、菲律宾等地都有乙脑病毒感染的报道，并且逐渐蔓延，从北部的中俄边境地区到南部的澳大利亚北部，从东部的西太平洋群岛到西部的印巴边境地区都有乙脑的传播，并且有向更远处传播的可能。我国的大部分地区尤其是华东、华南地区，人口规模大，经济发展迅速，外加夏季炎热潮湿气候，人们受乙脑威胁较大。据报道，在上世纪，在我国山东省暴发流行乙脑，并且在20世纪6、70年代多地暴发，在2013年乙脑发病率仍居全国前列。其他省包括江苏省、福建省、广东省等在近些年都有感染病例的报道。这些数据表明乙脑发生具有季节性、区域性。

乙脑病毒感染人或者猪，都会引起明显的临床症状。当人感染乙脑病毒时，发病急，伴随有高热、头痛、呕吐等症状，严重的患者有吞咽困难、呼吸衰竭等症状，体征有浅反射消失、深反射亢进、强直性瘫痪等症状，根据发病率统计，10岁以下儿童的发病率最高。根据尹遵栋等报道，单因素分析表明″职业为农民″等7个因素是乙脑发病的危险因素，而多因素分析表明，″家里或邻居养猪″是乙脑发病危险因素中最高的。临床上乙脑病毒感染猪时，主要引发繁殖障碍，在妊娠母猪上主要体现为流产、产弱胎，死胎或木乃伊胎等，公猪会导致睾丸肿大、精液品质下降等问题，给养殖场造成持续性的经济损失。

乙脑作为人兽共患病，预防方式包括控制蚊子和疫苗免疫，目前在养殖行业，给猪免疫乙脑减毒活疫苗可以有效控制发病。但是目前乙脑的优势基因型正在发生转变，由GIII型转变为GI型，以前的减毒活疫苗能否持续发挥预防作用有待进一步研究；另外目前尚无特效药来治疗乙脑，而防控形势严峻，急需抗乙脑药物的快速研发。

发明内容

本部分的目的在于概述本发明实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。

作为本发明其中一个方面，本发明提供补骨脂乙素在用于治疗流行性乙型脑炎病毒感染中的应用。

其中，所述补骨脂乙素可以抑制乙型脑炎病毒核酸和蛋白的生物合成，并且具有浓度依赖性。

其中，所述补骨脂乙素可以减轻乙型脑炎病毒感染引发的脑部病理变化。

其中，所述补骨脂乙素的用量在体外为2.5μM-20μM，在体内为25mg/kg-50mg/kg。

其中，所述补骨脂乙素的分子式为C₂₀H₂₀O₄，结构式为

其中，所述补骨脂乙素还包括补骨脂乙素的盐。

其中，所述治疗流行性乙型脑炎药物的剂型包括片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、针剂或缓释剂。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

一、补骨脂乙素是从134种脂类化合物中筛选到的一种抑制乙型脑炎病毒复制的化合物，在10μM浓度下，它可以抑制乙型脑炎病毒90％的核酸合成，抑制作用最为明显。

二、补骨脂乙素在不同种属源性的细胞上，包括鼠源BHK-21细胞，猪源PK-15细胞，人源HEK-293T细胞上都可以抑制乙型脑炎病毒增殖，并且药物选择指数都大于10，表明补骨脂乙素具有良好的市场应用前景。

三、补骨脂乙素不仅在体外表现出显著的抑制乙型脑炎病毒增殖活性，在小鼠上也可以明显提高JEV攻击后小鼠的存活率，从10％提高到80％，表明补骨脂乙素在体内也可以发挥抗病毒作用。

四、补骨脂乙素对于黄病毒科的其他病毒，例如鸭坦布苏病毒DTMUV和经典猪瘟病毒CSFV没有抑制作用，表明补骨脂乙素可以特异性的抑制JEV的增殖，这为补骨脂乙素作为仅治疗JEV的候选药物奠定理论基础。

五、补骨脂乙素作为一种黄酮类化合物，来源于中草药提取成分，在体内不易残留，对机体无明显毒副作用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：

图1为通过CCK-8法从脂类化合物库中筛选抑制JEV增殖的化合物。

图2为验证筛选到的化合物对JEV增殖具有抑制作用。

图3为补骨脂乙素抑制JEV增殖具有浓度依赖性。

图4为补骨脂乙素通过作用于病毒复制阶段抑制JEV的复制。

图5为补骨脂乙素抑制JEV在不同种属源性细胞上增殖的选择指数。

图6为补骨脂乙素抑制JEV疫苗毒(SA-14-14-2)增殖并具有浓度依赖性。

图7为补骨脂乙素不影响DTMUV和CSFV的增殖活性。

图8为补骨脂乙素保护小鼠免受JEV的致死性攻击。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。

实施例：

试验材料：

流行性乙型脑炎病毒NJ-2008株，SA-14-14-2株，经典猪瘟病毒CSFV(石门)株，鸭坦布苏病毒DTMUV，BHK-21细胞，PK-15细胞，HEK-293T细胞保存在本实验室；

脂类化合物库，补骨脂乙素购自MedChemExpress(MCE)公司；

CCK-8检测试剂盒购自美国APEXBIO公司；

反转录试剂盒(HiScript II Q RT SurperMix)，qPCR试剂盒(AceQ UniversalSYBR qPCR Master Mix)购自南京诺唯赞公司；

定量引物由南京金斯瑞公司合成；

抗乙型脑炎病毒NS5抗体由华中农业大学曹胜波教授馈赠，抗β-Actin抗体购买自Santa Cruz生物科技有限公司；

C57BL/6小鼠购自扬州大学比较医学中心。

试验方法：

脂类化合物库化合物的细胞毒性检测

使用含10％血清的DMEM稀释生长状态良好的BHK-21细胞，并接种于96孔板中，每孔含有1×10⁴细胞和100μL培养基，将96孔板置于37℃，5％CO₂培养箱中培养。待细胞密度达到80％-90％时，弃去孔内培养基，并使用PBS洗涤细胞2-3次，添加脂类化合物库的药物(总计134种)，药物使用浓度设为10μM(使用含2％血清的DMEM稀释脂类化合物)，同时设置空白孔，和细胞对照孔，每个样品三次重复。将96孔板继续放入37℃，5％CO2培养箱中培养。48h后弃去孔内培养基，使用PBS洗涤细胞2-3次，每孔添加CCK-810μL，DMEM90μL，轻摇混匀，避光条件下在37℃培养箱孵育，每隔半小时使用酶标仪在450nm吸光度下读值，待细胞对照孔值处于1.0-1.8之间，可停止读值。根据以下公式计算细胞存活率，并剔除对细胞具有明显毒性的化合物(细胞存活率≤70％)。

细胞存活率＝(OD_450实验孔-OD_450空白孔)/(OD_{450细胞对照孔}-OD_450空白孔)×100％

从脂类化合物库筛选抑制JEV增殖的化合物

去掉对BHK-21细胞具有明显毒性的化合物，从剩下的脂类化合物中筛选抑制JEV复制的化合物。使用含10％血清的DMEM稀释生长状态良好的BHK-21细胞，并接种于96孔板中，每孔含有1×10⁴细胞和100μL培养基，将96孔板置于37℃，5％CO2培养箱中培养。待细胞密度达到80％-90％时，弃去孔内培养基，并使用PBS洗涤细胞2-3次，添加脂类化合物，药物使用浓度设为10μM(使用含2％血清的DMEM稀释脂类化合物)，将96孔板置于37℃，5％CO2培养箱中培养1h，弃去孔内培养基，并使用PBS洗涤细胞2-3次，按照MOI＝0.05感染JEV(JEV中含有脂类化合物)，同时设置细胞对照孔和单独病毒感染孔作为对照。将96孔板置于37℃，5％CO2培养箱中培养1-2h，弃去孔内培养基，并使用PBS洗涤细胞2-3次，添加脂类化合物，药物使用浓度设为10μM(使用含2％血清的DMEM稀释脂类化合物)，将96孔板置于37℃，5％CO2培养箱中培养，48h后弃去孔内培养基，使用PBS洗涤细胞2-3次，每孔添加CCK-810μL，DMEM90μL，轻摇混匀，避光条件下在37℃培养箱孵育，每隔半小时使用酶标仪在450nm吸光度下读值，待细胞对照孔值处于1.0-1.8之间，可停止读值。根据以下公式计算病毒抑制率，并挑选病毒抑制率≥80％的化合物进行下一步实验。

病毒抑制率＝(OD_450实验孔-OD_{450病毒感染孔})/(OD_{450细胞对照孔}-OD_{450病毒感染孔})×100％

对筛选到的化合物进行抑制JEV增殖的定量验证

使用含10％血清的DMEM稀释生长状态良好的BHK-21细胞，并接种于24孔板中，每孔含有5×10⁴细胞和500μL培养基，随后将24孔板置于37℃，5％CO2培养箱中培养。待细胞密度达到80％-90％时，弃去孔内培养基，并使用PBS洗涤细胞2-3次，添加脂类化合物，药物使用浓度设为10μM(使用含2％血清的DMEM稀释脂类化合物)，将24孔板置于37℃，5％CO2培养箱中培养1h，弃去孔内培养基，并使用PBS洗涤细胞2-3次，按照MOI＝0.05感染JEV(JEV中含有脂类化合物)，同时设置单独病毒感染孔作为对照。将24孔板置于37℃，5％CO2培养箱中培养1-2h，弃去孔内培养基，并使用PBS洗涤细胞2-3次，添加脂类化合物，药物使用浓度设为10μM(使用含2％血清的DMEM稀释脂类化合物)，将24孔板置于37℃，5％CO2培养箱中培养，48h后收样，每孔添加700μL TriZOL裂解细胞，静置10-15min，吹打混匀并吸干净所有液体置于1.5mL EP管中，添加200μL氯仿，涡旋混匀后静置10min，4℃离心(12000xg，15min)，将上清转移至新的1.5mL EP管，并添加等量的异丙醇，上下颠倒混匀，置于-20℃静置30min以上，4℃离心(12000xg，15min)，弃掉上清，并添加400μL 75％乙醇，上下颠倒混匀，4℃离心(12000xg，15min)，弃掉上清，4℃离心(12000xg，15min)，使用移液枪吸干EP管内液体，每孔添加30μL无酶水重悬RNA。使用反转录试剂盒(HiScript II Q RT SurperMix)将提取到的RNA反转为cDNA，详细步骤如下：

1.配制第一链cDNA合成反应液

5X HiScript II Q RT SurperMix	4μL
		模板RNA	2μL
RNase-free dd H2O	14μL

2.进行逆转录反应

50℃，15min；85℃，5s。

反转完成后，使用试剂盒(AceQ Universal SYBR qPCR Master Mix)进行相对定量qPCR，引物序列为

JEV-F(5′-3′)：AGAGCGGGGAAAAAGGTCAT，

JEV-R(5′-3′)：TTTCACGCTCTTTCTACAGT；

β-Actin-F(5′-3′)：CTCCATCATGAAGTGCGACGT，

β-Actin-R(5′-3′)：GTGATCTCCTTCTGCATCCTGTC；

具体实验流程如下：

1.在qPCR管中配制如下混合液：

2.按下列条件进行qPCR反应

补骨脂乙素在体外抑制JEV增殖具有浓度依赖性的检测

使用含10％血清的DMEM稀释生长状态良好的BHK-21细胞，并接种于24孔板中，每孔含有5×10⁴细胞和500μL培养基，随后将24孔板置于37℃，5％CO2培养箱中培养。待细胞密度达到80％-90％时，弃去孔内培养基，并使用PBS洗涤细胞2-3次，添加不同浓度的补骨脂乙素，药物使用浓度设为2.5μM，5μM，7.5μM，10μM，20μM(使用含2％血清的DMEM稀释)，将24孔板置于37℃，5％CO2培养箱中培养1h，弃去孔内培养基，并使用PBS洗涤细胞2-3次，按照MOI＝0.05感染JEV(JEV中含有不同浓度的补骨脂乙素)，同时设置单独病毒感染孔作为对照，每个样品三次重复。将24孔板置于37℃，5％CO2培养箱中培养1-2h，弃去孔内培养基，并使用PBS洗涤细胞2-3次，添加不同浓度的补骨脂乙素，将24孔板置于37℃，5％CO2培养箱中培养，48h后收样。

RT-qPCR样品处理方法按照上述定量验证中的方法操作，不再详细赘述。

WB样品处理方法如下：弃掉上清，使用预冷的PBS洗涤细胞2-3次，每孔添加RIPA裂解液80μL，置于4℃摇床孵育20-30min，将24孔板置于冰盒上，使用移液枪吹吸液体，使细胞完全裂解脱落，吸取液体至1.5mLEP管中，4℃离心(5000xg，10min)，转移上清至新1.5mLEP管中，添加5xSDS Loading buffer 20μL，涡旋混匀，顺离，沸水浴15min，可直接进行SDS-PAGE电泳或放于-20℃保存，需要时进行电泳。

电泳完成后，使用转印槽将SDS-PAGE胶上的蛋白转移至NC膜上，转印完成后使用10％的脱脂乳对NC膜进行封闭，室温封闭1-2h后，使用PBST洗涤3次，每次5-10min，最后一次洗涤完成后，弃掉液体，添加靶标一抗，4℃摇床孵育过夜，使用PBST洗涤3次，每次5-10min，添加同一抗种属源性相同的二抗，室温孵育1-2h，使用PBST洗涤3次，每次5-10min，使用ECL显色液进行曝光。

间接免疫荧光样品处理方法如下：弃掉上清，使用预冷的PBS洗涤细胞2-3次，吸净孔内液体，添加300μL4％的多聚甲醛，室温孵育20min，使用预冷的PBS洗涤细胞2-3次，添加靶标一抗，4℃摇床过夜孵育，使用PBS洗涤3次，每次3-5min，避光添加同一抗种属源性相同的荧光二抗，室温避光孵育1-2h，使用PBS洗涤3次，每次3-5min，使用DAPI染色液对细胞核进行染色，室温避光孵育5-10min，使用PBS洗涤3次，每次3-5min，每孔添加200μLPBS，使用倒置荧光显微镜观察荧光。

补骨脂乙素通过作用于病毒复制阶段来抑制JEV的复制

通过药物添加时间试验来检测补骨脂乙素抑制JEV感染的时期。试验分为四组，分别为接毒前给药组，接毒中给药组，和接毒后给药组。接毒后给药组又分为两组，一组为接毒后在4℃孵育1h，弃上清，然后给药，在37℃孵育1h，再换液；一组为接毒后在37℃孵育1h，弃上清，然后给药，药物作用时间维持24h。首先使用含10％血清的DMEM稀释生长状态良好的BHK-21细胞，并接种于12孔板中，每孔含有1×10⁵细胞和1mL培养基，随后将12孔板置于37℃，5％CO2培养箱中培养。待细胞密度达到80％-90％时，弃去孔内培养基，并使用PBS洗涤细胞2-3次，按照药物不同添加时间依次给药接毒或接毒给药，接毒后24h收样，WB检测各组JEV NS5含量，并使用β-Actin做对照。WB步骤按上文所述。

补骨脂乙素抑制JEV增殖的选择指数(SI)

使用CCK-8法测定补骨脂乙素在乳仓鼠肾细胞BHK-21，猪肾细胞PK-15，人肾上皮细胞293T上的CC₅₀。使用含10％血清的DMEM稀释生长状态良好的细胞，并接种于96孔板中，每孔含有1×10⁴细胞和100μL培养基，将96孔板置于37℃，5％CO2培养箱中培养。待细胞密度达到80％-90％时，弃去孔内培养基，并使用PBS洗涤细胞2-3次，添加不同浓度的补骨脂乙素(5μM，10μM，20μM，40μM，80μM)，同时设置空白孔，和细胞对照孔，每个样品三次重复。将96孔板继续放入37℃，5％CO2培养箱中培养。48h后弃去孔内培养基，使用PBS洗涤细胞2-3次，每孔添加CCK-810μL，DMEM90μL，轻摇混匀，避光条件下在37℃培养箱孵育，每隔半小时使用酶标仪在450nm吸光度下读值，待细胞对照孔值处于1.0-1.8之间，可停止读值。根据公式计算细胞存活率，并使用Graph Prism拟合CC₅₀。

使用CCK-8法测定补骨脂乙素在乳仓鼠肾细胞BHK-21，猪肾细胞PK-15，人肾上皮细胞293T上抑制JEV增殖的IC₅₀。使用含10％血清的DMEM稀释生长状态良好的细胞，并接种于96孔板中，每孔含有1×10⁴细胞和100μL培养基，将96孔板置于37℃，5％CO2培养箱中培养。待细胞密度达到80％-90％时，弃去孔内培养基，并使用PBS洗涤细胞2-3次，按照MOl＝0.05进行接毒，接毒后将96孔板置于37℃，5％CO2培养箱中培养1-2h，然后弃上清，添加不同浓度的补骨脂乙素(使用含2％血清的DMEM将补骨脂乙素稀释成5μM，10μM，20μM，40μM，80μM)，同时设置单独病毒感染孔，和细胞对照孔，每个样品三次重复。将96孔板继续放入37℃，5％CO2培养箱中培养。48h后弃去孔内培养基，使用PBS洗涤细胞2-3次，每孔添加CCK-810μL，DMEM90μL，轻摇混匀，避光条件下在37℃培养箱孵育，每隔半小时使用酶标仪在450nm吸光度下读值，待细胞对照孔值处于1.0-1.8之间，可停止读值。根据公式计算病毒抑制率，并使用Graph Prism拟合IC50。

按照SI＝CC50/IC50计算选择指数，判定标准为SI＜1，受试样品无效；1＜Sl＜2，药物低效有毒；2＜SI＜10，药物低毒有效；SI＞10，药物低毒高效。一般认为SI＞10的情况下药物才具有良好的应用前景。

补骨脂乙素抑制JEV疫苗毒(SA-14-14-2)增殖活性检测

使用含10％血清的DMEM稀释生长状态良好的BHK-21细胞，并接种于24孔板中，每孔含有5×10⁴细胞和500μL培养基，随后将24孔板置于37℃，5％CO2培养箱中培养。待细胞密度达到80％-90％时，弃去孔内培养基，并使用PBS洗涤细胞2-3次，添加不同浓度的补骨脂乙素，药物使用浓度设为2.5μM，5μM，7.5μM，10μM，20μM(使用含2％血清的DMEM稀释)，将24孔板置于37℃，5％CO2培养箱中培养1h，弃去孔内培养基，并使用PBS洗涤细胞2-3次，按照MOI＝0.05感染JEV疫苗毒SA-14-14-2(JEV中含有不同浓度的补骨脂乙素)，同时设置单独病毒感染孔作为对照，每个样品三次重复。将24孔板置于37℃，5％CO2培养箱中培养1-2h，弃去孔内培养基，并使用PBS洗涤细胞2-3次，添加不同浓度的补骨脂乙素，将24孔板置于37℃，5％CO2培养箱中培养，48h后收样。

使用RT-qPCR检测JEV核酸含量，使用WB检测JEV蛋白水平，详细操作方法如上所述。

补骨脂乙素对其它黄病毒(CSFV和DTMUV)的增殖活性影响

使用含10％血清的DMEM稀释生长状态良好的PK-15细胞或者BHK-21细胞，并接种于24孔板中，每孔含有5×10⁴细胞和500μL培养基，随后将24孔板置于37℃，5％CO2培养箱中培养。待细胞密度达到80％-90％时，弃去孔内培养基，并使用PBS洗涤细胞2-3次，添加不同浓度的补骨脂乙素，药物使用浓度设为2.5μM，5μM，10μM，20μM(使用含2％血清的DMEM稀释)，将24孔板置于37℃，5％CO2培养箱中培养1h，弃去孔内培养基，并使用PBS洗涤细胞2-3次，按照MOI＝0.05感染JEV疫苗毒SA-14-14-2(JEV中含有不同浓度的补骨脂乙素)，同时设置单独病毒感染孔作为对照，每个样品三次重复。将24孔板置于37℃，5％CO2培养箱中培养1-2h，弃去孔内培养基，并使用PBS洗涤细胞2-3次，添加不同浓度的补骨脂乙素，将24孔板置于37℃，5％CO2培养箱中培养，48h后收样。

使用RT-qPCR检测病毒核酸含量，使用WB检测病毒蛋白水平，详细操作方法如上所述。

定量引物序列为

CSFV-F(5′-3′)：CCTGAGGACCAAACACATGTTG，

CSFV-R(5′-3′)：TGGTGGAAGTTGGTTGTGTCTG；

DTMUV-F(5′-3′)：TGTCTTATGCAGGTACCGATG，

DTMUV-R(5′-3′)：CGTATGGGTTGACTGTTATCA；

补骨脂乙素体内抗JEV活性检测

使用C57BL/6小鼠进行动物攻毒治疗试验。动物试验分为4组，每组10只三周龄雌性小鼠，分别为不做处理组(Blank)，单独接毒组(JEV)，接毒后低剂量治疗组(JEV+IBC-L)，和接毒后高剂量治疗组(JEV+IBC-H)。除了Blank组外，其它组每只小鼠腹腔注射10LD₅₀JEV(NJ2008)，攻毒24h后开始进行治疗，低剂量治疗组每天给予25mg/kg补骨脂乙素，高剂量治疗组每天给与50mg/kg补骨脂乙素，保证小鼠自由采食饮水。每天记录各组小鼠体重，记录各组小鼠的死亡情况，并采集小鼠脑组织，一部分用于RT-qPCR检测病毒核酸，另一部分制作HE切片，观察脑部病理变化。HE切片委托武汉塞维尔生物科技公司完成。

试验结果：

1.从脂类化合物库(134种)筛到6种抑制JEV在BHK-21细胞上增殖的药物

筛选流程如图1A所示，首先利用CCK-8法检测134种脂类化合物的细胞毒性，发现有7种化合物在10μM浓度下有严重的细胞毒性。剔除这7种药物后，通过CCK-8法对剩下的127种化合物进行病毒抑制率的检测，结果发现有6种化合物在10μM的浓度下对JEV的抑制率超过80％(图1B)。这6种化合物分别为：香胶甾酮(Guggulsterone)，羽扇豆醇(Lupeol)，孕烯醇酮(Pregnenolone)，20S-原人参三醇((20S)-Protopanaxatriol)，呋喃硫胺(Fursultiamine)和补骨脂乙素(Isobavachalcone，IBC)。

2.6种脂类化合物中补骨脂乙素(IBC)的抑制作用最明显

由于CCK-8的计算结果是用细胞病变程度间接反应病毒的多少，并没有直接对病毒进行定量。因此我们对筛到的6种化合物再一次进行了第三次筛选，通过RT-qPCR检测各种化合物处理后病毒mRNA的变化。结果如图2所示，和对照组相比，这6种脂类化合物处理都可以有效降低JEV的mRNA水平，但是降低幅度有所差别。其中羽扇豆醇和20S-原人参三醇的抑制效果最差，这两组的mRNA含量占对照组的0.55-0.65倍左右；香胶甾酮和呋喃硫胺的效果略好于羽扇豆醇和20S-原人参三醇，这两组的mRNA含量和对照组相比降低了一半；孕烯醇酮可以抑制75％的病毒mRNA产生；补骨脂乙素的效果最为显著，在10μM的浓度下可以有效降低JEV mRNA的含量，只有对照组的10％。这些结果说明在这6种脂类化合物中，补骨脂乙素对JEV的抑制率最为显著，有望成为JEV抑制剂的候选药物。

3.补骨脂乙素抑制JEV增殖具有浓度依赖性

药物对病毒的抑制需要呈现剂量依赖性，也就是在一定范围内可以通过调整剂量控制药效，这对药物来说是必须的。为了检测补骨脂乙素抑制JEV增殖是否具有浓度依赖性，不同浓度的补骨脂乙素被使用，JEV的mRNA通过RT-qPCR检测，蛋白表达水平通过WB检测，胞内的病毒滴度通过IFA检测。结果如图3所示，随着补骨脂乙素浓度的升高，检测到的mRNA越来越少，在10μM浓度下，mRNA含量仅为对照组的10％左右，在20μM浓度下，基本检测不到mRNA；蛋白含量也和期望的一致，在20μM浓度下，JEV的NS5蛋白不能被观察到；并且随着药物浓度的升高，细胞内的荧光斑块数量也越来越少，在10μM和20μM浓度下，仅可观察到个位数的荧光斑。这些结果表明补骨脂乙素抑制JEV在BHK-21的增殖具有浓度依赖性。

4.补骨脂乙素主要通过作用于病毒的复制阶段来抑制JEV的增殖

大部分病毒入侵宿主细胞都需经过一系列特殊过程，其生命周期一般有：吸附、入侵、复制、装配、释放。为了检测补骨脂乙素发挥作用的时期，我们进行了药物添加时间实验，药物和接毒时间如图4A所示，接毒24h后JEV蛋白和mRNA被检测，结果如图4B所示，在接毒前给予补骨脂乙素不能抑制病毒核酸和蛋白的产生；JEV和补骨脂乙素一起在4℃孵育细胞，也不能降低病毒核酸和蛋白水平；接毒后给药可以降低JEV的mRNA和蛋白水平，然而JEV在4℃优先和细胞孵育1h，再添加补骨脂乙素，在37℃维持1h组虽然降低了JEV mRNA水平，但降低幅度很小，不具有统计学差异，只有病毒在完成了吸附入侵之后，再给予补骨脂乙素处理，并维持24h，才在mRNA水平和蛋白水平上表现出了显著降低。这些结果说明补骨脂乙素不能直接杀死病毒，也不通过干扰病毒的吸附和入侵抑制JEV增殖，而是通过作用于病毒的复制阶段来抑制JEV在BHK-21细胞上的增殖。

5.补骨脂乙素抑制JEV复制的药物选择指数测定

药物选择指数(SI)是评价药物效果的安全范围，选择指数SI＝CC₅₀/IC₅₀，药物选择指数越大越好。一般认为选择指数＞10的情况下药物具有良好的应用前景。通过CCK-8法评估了补骨脂乙素在不同种属源性细胞上的CC₅₀和IC₅₀，结果如图5所示，补骨脂乙素在鼠源BHK-21细胞上的选择指数为10.13，在猪源PK-15细胞上的选择指数为11.47，在人源HEK-293T细胞上的选择指数为16.25。这些数据表明补骨脂乙素在选定的三种细胞上的选择指数都大于10，证明补骨脂乙素具有优良的应用前景。

6.补骨脂乙素抑制JEV疫苗毒SA-14-14-2的增殖，并具有浓度依赖性

上述测试的是补骨脂乙素对JEV强毒(NJ2008)的抑制作用，那么补骨脂乙素是否对JEV弱毒具有抑制作用呢？在这里我们选择了JEV疫苗毒SA-14-14-2作为试验对象，通过WB和RT-qPCR检测疫苗毒的核酸和蛋白水平，结果如图6所示，补骨脂乙素可以抑制JEVmRNA和蛋白的产生，并且随着补骨脂乙素浓度的提高，抑制作用逐渐增强，在10μM浓度下，可以抑制80％mRNA的生成，从而有效降低JEV蛋白的生物合成。

7.补骨脂乙素对于DTMUV和CSFV的增殖活性的影响

通过WB和RT-qPCR检测DTMUV和CSFV的核酸和蛋白水平，检测补骨脂乙素对其它黄病毒增殖活性的影响，结果如图7所示，不论是在核酸水平，还是蛋白水平，补骨脂乙素都没有表现出明显的抗DTMUV和CSFV增殖活性；即使补骨脂乙素浓度提高，也没有明显抑制活性。这些结果表明补骨脂乙素不能抑制DTMUV和CSFV的复制，其对JEV的抑制可能具有特异性，这也为补骨脂乙素作为治疗JEV感染的候选药物奠定理论基础。

8.补骨脂乙素保护小鼠免受JEV的致死性攻击

很多药物在体外具有抗病毒作用，然而在体内却不能展现出相应抗病毒活性，因此不能应用于临床。为了探究补骨脂乙素能否在体内具有抑制JEV增殖的活性，使用致死剂量攻击小鼠，而后给予补骨脂乙素治疗，每日检测小鼠体重，记录死亡率，并采集小鼠脑组织检测病毒载量，制作脑部HE切片观察病理变化。日常体重检测结果如图8A所示，小鼠在攻毒后第三天开始出现体重下降，单独感染组小鼠体重持续下降，到攻毒后第8天仅为初始体重的80％，而药物治疗组的体重在持续下降1-2天后，开始出现回升，到第8天时，低剂量治疗组的平均体重约为初始体重的1.1倍，高剂量治疗组的小鼠体重为初始体重的1.2倍，这些数据表明补骨脂乙素可以有效减轻JEV感染引发的体重降低，甚至出现体重增加的现象。

各组小鼠存活情况如图8B所示，单独JEV感染组小鼠在第4天开始出现死亡，第6天达到死亡高峰，试验结束时，存活率仅为10％；补骨脂乙素低剂量治疗组在攻毒后第5天开始出现死亡，第6天达到死亡高峰，试验结束时，存活率为40％；补骨脂乙素高剂量治疗组在攻毒后第6天开始出现死亡，并且之后不再死亡，试验结束时，该组存活率为80％。这些数据表明补骨脂乙素可以有效提高小鼠在JEV致死性攻击下的存活率。

各组小鼠脑部病毒载量如图8C所示，单独JEV感染组小鼠脑部的病毒载量可以达到7.5lg，补骨脂乙素低剂量治疗组的病毒载量约为4.5lg，降低了3lg，而补骨脂乙素高剂量治疗组的病毒载量仅为2lg，极显著地低于单独感染组，表明补骨脂乙素可以有效降低JEV感染小鼠脑部的病毒滴度。

为了探究当病毒滴度降低时，病毒感染带来的脑部病理变化是否有所改变的问题，使用小鼠的脑组织制作病理切片，结果如图8D所示，JEV感染组血管炎症细胞增加，形成典型的血管鞘现象。神经细胞周围间隙加大，细胞质变得松散和空泡化，细胞核变得浓缩，导致神经细胞坏死。相比之下，低剂量药物治疗组仍然表现出空泡化，但严重程度低于JEV组。高剂量药物治疗组与空白组相似，基本没有显著病变，表明补骨脂乙素不仅可以降低JEV攻击引发的脑部病毒滴度，而且可以显著改善JEV感染导致的脑部病变。

总之在本研究中，我们评估了134种脂质化合物对JEV增殖的抑制作用，发现补骨脂乙素在细胞上强力抑制了JEV的增殖，具有浓度依赖性，并主要通过作用于病毒复制时期发挥作用。另外体内试验也证明补骨脂乙素通过降低大脑中的病毒载量并消除与JEV感染相关的组织病理学变化，保护小鼠免受JEV感染带来的致死性攻击。

应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (6)

1.补骨脂乙素或其盐在制备治疗流行性乙型脑炎病毒感染药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述补骨脂乙素能够抑制乙型脑炎病毒核酸和蛋白的生物合成，并且具有浓度依赖性。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述补骨脂乙素能够减轻乙型脑炎病毒感染引发的脑部病理变化。

4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述补骨脂乙素的用量为25mg/kg一50mg/kg。

5.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述补骨脂乙素的分子式为C₂₀H₂₀0₄，结构式为

6.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述治疗流行性乙型脑炎病毒感染药物的剂型包括片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、针剂或缓释剂。