CN120904265A - 一种硫代磷酰胺修饰核苷酸结构的寡核酸及其合成工艺 - Google Patents
一种硫代磷酰胺修饰核苷酸结构的寡核酸及其合成工艺Info
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Abstract
本发明公开了一种硫代修饰核苷酸结构的寡核酸及其合成工艺，所述硫代修饰核苷酸结构的寡核酸中包括式I或式II所示的核苷酸结构单元；
Description
技术领域
本发明涉及寡核酸技术领域，具体涉及一种硫代修饰核苷酸结构的寡核酸及其合成工艺。
背景技术
寡核酸(Oligonucleotide)是由短链核酸(通常为2-20个)通过磷酸二酯键连接形成的生物分子，可分为DNA寡核酸和RNA寡核酸。它们广泛应用于分子生物学研究、疾病诊断和治疗，例如作为PCR引物、基因编辑工具或靶向药物。
目前，传统的核苷酸单体合成的寡核酸序列，存在稳定性较差的问题，容易在人血清和人肝微粒体中被降解。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种硫代修饰核苷酸结构的寡核酸及其合成工艺，本发明硫代修饰核苷酸结构的寡核酸通过采用硫代磷酰胺的核苷酸单体进行合成，使其具有特定的硫代修饰核苷酸结构，能够提高合成的寡核酸的稳定性和改善其生物活性。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
本发明第一方面提供了一种硫代修饰核苷酸结构的寡核酸，所述硫代修饰核苷酸结构的寡核酸中包括式I或式II所示的核苷酸结构单元；
式I中：
Base为核苷酸碱基或其衍生物，所述核苷酸碱基为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、次黄嘌呤或黄嘌呤；
R1和R2分别为烷基、烯基、炔基、环烷基或芳香基；
R3为氢、烷基(包括甲基、乙基、长链烷基)、环烷基、烯基、炔基、硅基(包括三甲基硅基、三乙基硅基、三异丙基硅基、叔丁基二甲基硅基和叔丁基二苯基硅基)、硅基氧亚甲基、烷氧烷基、苄基或酰基(包括乙酰、丙酰、丁酰、异丁酰、苯甲酰)；
式II中：
Base为核苷酸碱基或其衍生物，所述核苷酸碱基为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、次黄嘌呤或黄嘌呤；
R为氢、卤素、烷基、巯基、烷基巯基、胺基、叠氮基或氰基；
R1和R2分别为烷基、烯基、炔基、环烷基或芳香基。
优选地，所述硫代修饰核苷酸结构的寡核酸合成过程中采用包括式III或式IV所示的核苷酸单体：
式III中：
Base为含保护基的核苷酸碱基或其衍生物，所述核苷酸碱基为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、次黄嘌呤或黄嘌呤；
PG为三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、4,4'-二甲氧基三苯甲基、4,4',4”-三甲氧基三苯甲基、烯丙基、烯丙氧羰基、苄基、酰基、硅基(包括三甲基硅基、叔丁基二甲基硅基或叔丁基二苯基硅基)；
R为氢、卤素、烷基、巯基、烷基巯基、胺基、叠氮基或氰基；
R1和R2分别为烷基、烯基、炔基、环烷基或芳香基；
式IV中：
Base为含保护基的核苷酸碱基或其衍生物，所述核苷酸碱基为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、次黄嘌呤或黄嘌呤；
PG为三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、4,4'-二甲氧基三苯甲基、4,4',4”-三甲氧基三苯甲基、烯丙基、烯丙氧羰基、苄基、酰基、硅基(包括三甲基硅基、叔丁基二甲基硅基或叔丁基二苯基硅基)；
R1和R2分别为烷基、烯基、炔基、环烷基或芳香基；
R3为烷基(包括甲基、乙基、长链烷基)、环烷基、烯基、炔基、硅基(包括三甲基硅基、三乙基硅基、三异丙基硅基、叔丁基二甲基硅基、叔丁基二苯基硅基)、硅基氧亚甲基、烷氧烷基、苄基或酰基(包括乙酰、丙酰、丁酰、异丁酰、苯甲酰)。
优选地，所述保护基选自三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、4,4'-二甲氧基三苯甲基、4,4',4”-三甲氧基三苯甲基、烯丙基、烯丙氧羰基、苄基、酰基、三甲基硅基、叔丁基二甲基硅基和叔丁基二苯基硅基中的一种。
优选地，所述核苷酸单体包括：
其中：
R1和R2分别为烷基、烯基、炔基、环烷基或芳香基；
R3为烷基(包括甲基、乙基、长链烷基)、环烷基、烯基、炔基、硅基(包括三甲基硅基、三乙基硅基、三异丙基硅基、叔丁基二甲基硅基和叔丁基二苯基硅基)、硅基氧亚甲基、烷氧烷基、苄基或酰基(包括乙酰、丙酰、丁酰、异丁酰、苯甲酰)。
优选地，所述核苷酸单体包括：
其中：
R1和R2分别为烷基、烯基、炔基、环烷基或芳香基。
优选地，所述核苷酸单体包括：
其中：
R1和R2分别为烷基、烯基、炔基、环烷基或芳香基。
优选地，所述核苷酸单体中4,4'-二甲氧基三苯甲基(DMTr)替换成三苯甲基(Tr)、4-甲氧基三苯甲基(MMTr)或4,4',4”-三甲氧基三苯甲基(TMTr)。
优选地，所述核苷酸单体由O5'含有保护基的核苷酸分子和硫代磷酰胺二氯在液相中反应制得。
优选地，所述硫代修饰的寡核酸中的硫代修饰核苷酸结构能够提高寡核酸的生物稳定性和抗酶降解活性。
本发明第二方面提供了一种上述硫代修饰核苷酸结构的寡核酸的合成工艺，所述合成工艺包括如下步骤：
(a)将核苷酸单体负载于固相载体上，再脱除核苷酸单体上O5'的保护基并进行洗涤；
(b)向洗涤后体系中泵入核苷酸单体进行偶联，再经过盖帽处理、脱除核苷酸单体上O5'的保护基并进行洗涤，所述核苷酸单体为硫代磷酰胺的核苷酸单体或亚磷酰胺的核苷酸单体；若核苷酸单体为亚磷酰胺的核苷酸单体时，在偶联反应后，经过氧化或硫化将三价的亚磷酸二酯转化为五价的磷酸二酯，再进行盖帽、脱除核苷酸单体上O5'的保护基并进行洗涤；
(c)重复步骤(b)操作，得到硫代修饰核苷酸结构的寡核酸。
与现有技术相比，本发明的有益效果至少包括：
本发明通过硫代修饰的核苷酸单体结构的特定限定，实现合成制备的寡核酸中含有硫代磷酰胺结构单元；相比传统的寡核酸分子，本发明硫代修饰核苷酸结构的寡核酸序列分子在药物抗酶降解、稳定性、结合性等药学参数上具有更加优异的效果，为寡核酸药物的研发和应用提供了一种新型的化学修饰策略。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。
需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。
在本发明中字母简称对应的物质如下：
CPG：可控微孔玻璃(controlled pore glass)；DBU：1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯；PS：聚苯乙烯(polystyrene)；Alkyl：烷基；Allyl：烯丙基；Alloc：烯丙氧羰基；Bn：苄基；Bz：苯甲酰；DMTr：二甲氧基三苯甲基；Me：甲基；MMTr：甲氧基三苯甲基；Tr：三苯甲基；TMTr：三甲氧基三苯甲基；iBu：2-异丁酰基；NPE：4-硝基苯乙氧基；Ph：芳香基；TMS：三甲基硅基；TBDMS：叔丁基二甲基硅基；TBDPS：叔丁基二苯基硅基；DCM：二氯甲烷；DMF：N,N-二甲基甲酰胺；DMAP：4-二甲氨基吡啶；TBAF：四丁基氟化铵；THF：四氢呋喃；TFA：三氟乙酸；iPrOH：异丙醇；TLC：薄层色谱；A：Adenine腺嘌呤；G：Guanine鸟嘌呤；C：Cytosine胞嘧啶；T：Thymine胸腺嘧啶；U：Uracil尿嘧啶；I：hypoxanthine次黄嘌呤；Xan：黄嘌呤；m5C：5-methylcytosine5-甲基胞嘧啶。
实施例1
本实施例为一种硫代修饰核苷酸结构的寡核酸合成用核苷酸单体[腺嘌呤硫代磷酰胺，A-1：O-((2R,3R,4R,5R)-5-(6-benzamido-9H-purin-9-yl)-2-((bis(4-methoxyphenyl)(phenyl)methoxy)methyl)-4-methoxytetrahydrofuran-3-yl)dimethylphosphoramidochloridothioate]的合成方法，合成反应式为
合成方法包括：
氮气保护下，688毫克O2'-Me-O5'-DMTr-N6-Bz-A(A-0，1.0mmol,1.0eq.)加入干燥混合溶剂(5毫升二氯甲烷和5毫升乙腈)，控制温度0℃，加入174毫克溴化锂(2.0mmol，2.0eq.)，混合搅拌5分钟。依次加入0.30毫升DBU(2.0mmol，2.0eq.)和0.20毫升N,N-二甲基硫代磷氨基二氯化物(1.5mmol，1.5eq.)溶于1毫升干燥二氯甲烷的溶液。氮气保护下，混合溶液在0℃搅拌40分钟。减压去除溶剂，残余物中加入50毫升乙酸乙酯，30毫升冷水洗涤后，有机相经过硫酸钠干燥后减压浓缩，利用硅胶层析分离，流动相选择二氯甲烷/丙酮/甲醇混合溶剂，得到586毫克目标产品A-1(纯度99％以上，产率71％)。
实施例2
本实施例为一种硫代修饰核苷酸结构的寡核酸合成用核苷酸单体[鸟嘌呤腺嘌呤硫代磷酰胺，G-1-1：O-((2R,3R,4R,5R)-2-((bis(4-methoxyphenyl)(phenyl)methoxy)methyl)-5-(2-isobutyramido-6-oxo-1,6-dihydro-9H-purin-9-yl)-4-methoxytetrahydrofuran-3-yl)dimethylphosphoramidochloridothioate]的合成方法，合成反应式为
合成方法包括：
氮气保护下，670毫克O2'-Me-O5'-DMTr-N2-iBu-G(G-1-0，1.0mmol,1.0eq.)加入干燥混合溶剂(5毫升二氯甲烷和5毫升乙腈)，控制温度0℃，加入174毫克溴化锂(2.0mmol，2.0eq.)，混合搅拌5分钟。依次加入0.30毫升DBU(2.0mmol，2.0eq.)和0.20毫升N,N-二甲基硫代磷氨基二氯化物(1.5mmol，1.5eq.)溶于1毫升干燥二氯甲烷的溶液。氮气保护下，混合溶液在0℃搅拌40分钟。减压去除溶剂，残余物中加入50毫升乙酸乙酯，30毫升冷水洗涤后，有机相经过硫酸钠干燥后减压浓缩，利用硅胶层析分离，流动相选择二氯甲烷/丙酮/甲醇混合溶剂，得到497毫克目标产品G-1-1(纯度99％以上，产率61％)。
实施例3
本实施例为一种硫代修饰核苷酸结构的寡核酸合成用核苷酸单体[鸟嘌呤腺嘌呤硫代磷酰胺，G-2-1：O-((2R,3R,4R,5R)-2-((bis(4-methoxyphenyl)(phenyl)methoxy)methyl)-5-(2-isobutyramido-6-(4-nitrophenethoxy)-9H-purin-9-yl)-4-methoxytetrahydrofuran-3-yl)dimethylphosphoramidochloridothioate]的合成方法，合成反应式为
合成方法包括：
氮气保护下，819毫克O2'-Me-O5'-DMTr-N2-iBu-O6-NPE-G(G-2-0，1.0mmol,1.0eq.)加入干燥混合溶剂(5毫升二氯甲烷和5毫升乙腈)，控制温度0℃，加入174毫克溴化锂(2.0mmol，2.0eq.)，混合搅拌5分钟。依次加入0.30毫升DBU(2.0mmol，2.0eq.)和0.20毫升N,N-二甲基硫代磷氨基二氯化物(1.5mmol，1.5eq.)溶于1毫升干燥二氯甲烷的溶液。氮气保护下，混合溶液在0℃搅拌40分钟。减压去除溶剂，残余物中加入50毫升乙酸乙酯，30毫升冷水洗涤后，有机相经过硫酸钠干燥后减压浓缩，利用硅胶层析分离，流动相选择二氯甲烷/丙酮/甲醇混合溶剂，得到644毫克目标产品G-2-1(纯度99％以上，产率67％)。
实施例4
本实施例为一种硫代修饰核苷酸结构的寡核酸合成用核苷酸单体[鸟嘌呤腺嘌呤硫代磷酰胺，G-3-1：O-((2R,3R,4R,5R)-2-((bis(4-methoxyphenyl)(phenyl)methoxy)methyl)-5-(2-(((E)-(dimethylamino)methylene)amino)-6-oxo-1,6-dihydro-9H-purin-9-yl)-4-methoxytetrahydrofuran-3-yl)dimethylphosphoramidochloridethioate]的合成方法，合成反应式为
合成方法包括：
氮气保护下，655毫克O2'-Me-O5'-DMTr-N2-DMF-G(G-3-0，1.0mmol,1.0eq.)加入干燥混合溶剂(5毫升二氯甲烷和5毫升乙腈)，控制温度0℃，加入174毫克溴化锂(2.0mmol，2.0eq.)，混合搅拌5分钟。依次加入0.30毫升DBU(2.0mmol，2.0eq.)和0.20毫升N,N-二甲基硫代磷氨基二氯化物(1.5mmol，1.5eq.)溶于1毫升干燥二氯甲烷的溶液。氮气保护下，混合溶液在0℃搅拌40分钟。减压去除溶剂，残余物中加入50毫升乙酸乙酯，30毫升冷水洗涤后，有机相经过硫酸钠干燥后减压浓缩，利用硅胶层析分离，流动相选择二氯甲烷/丙酮/甲醇混合溶剂，得到470毫克目标产品G-3-1(纯度99％以上，产率56％)。
实施例5
本实施例为一种硫代修饰核苷酸结构的寡核酸合成用核苷酸单体[鸟嘌呤腺嘌呤硫代磷酰胺，G-4-1：O-((2R,3R,4R,5R)-2-((bis(4-methoxyphenyl)(phenyl)methoxy)methyl)-5-(2-(((E)-(dimethylamino)methylene)amino)-6-(4-nitrophenethox y)-9H-purin-9-yl)-4-methoxytetrahydrofuran-3-yl)dimethylphosphoramidochloridothioate]的合成方法，合成反应式为
合成方法包括：
氮气保护下，804毫克O2'-Me-O5'-DMTr-N2-DMF-O6-NPE-G(G-4-0，1.0mmol,1.0eq.)加入干燥混合溶剂(5毫升二氯甲烷和5毫升乙腈)，控制温度0℃，加入174毫克溴化锂(2.0mmol，2.0eq.)，混合搅拌5分钟。依次加入0.30毫升DBU(2.0mmol，2.0eq.)和0.20毫升N,N-二甲基硫代磷氨基二氯化物(1.5mmol，1.5eq.)溶于1毫升干燥二氯甲烷的溶液。氮气保护下，混合溶液在0℃搅拌40分钟。减压去除溶剂，残余物中加入50毫升乙酸乙酯，30毫升冷水洗涤后，有机相经过硫酸钠干燥后减压浓缩，利用硅胶层析分离，流动相选择二氯甲烷/丙酮/甲醇混合溶剂，得到623毫克目标产品G-4-1(纯度99％以上，产率66％)。
实施例6
本实施例为一种硫代修饰核苷酸结构的寡核酸合成用核苷酸单体[胞嘧啶硫代磷酰胺，C-1：O-((2R,3R,4R,5R)-5-(4-benzamido-2-oxopyrimidin-1(2H)-yl)-2-((bis(4-methoxyphenyl)(phenyl)methoxy)methyl)-4-methoxytetrahydrofuran-3-yl)dimethylphosphoramidochloridothioate]的合成方法，合成反应式为
合成方法包括：
氮气保护下，664毫克O2'-Me-O5'-DMTr-N4-Bz-C(C-0，1.0mmol,1.0eq.)加入干燥混合溶剂(5毫升二氯甲烷和5毫升乙腈)，控制温度0℃，加入174毫克溴化锂(2.0mmol，2.0eq.)，混合搅拌5分钟。依次加入0.30毫升DBU(2.0mmol，2.0eq.)和0.20毫升N,N-二甲基硫代磷氨基二氯化物(1.5mmol，1.5eq.)溶于1毫升干燥二氯甲烷的溶液。氮气保护下，混合溶液在0℃搅拌40分钟。减压去除溶剂，残余物中加入50毫升乙酸乙酯，30毫升冷水洗涤后，有机相经过硫酸钠干燥后减压浓缩，利用硅胶层析分离，流动相选择二氯甲烷/丙酮/甲醇混合溶剂，得到565毫克目标产品C-1(纯度99％以上，产率70％)。
实施例7
本实施例为一种硫代修饰核苷酸结构的寡核酸合成用核苷酸单体[5-甲基腺嘌呤硫代磷酰胺，m5C-1：O-((2R,3R,4R,5R)-5-(4-benzamido-5-methyl-2-oxo pyrimidin-1(2H)-yl)-2-((bis(4-methoxyphenyl)(phenyl)methoxy)methyl)-4-methoxytetrahydrofuran-3-yl)dimethylphosphoramidochloridothioate]的合成方法，合成反应式为
合成方法包括：
氮气保护下，678毫克O2'-Me-O5'-DMTr-N4-Bz-m5C(m5C-0，1.0mmol,1.0eq.)加入干燥混合溶剂(5毫升二氯甲烷和5毫升乙腈)，控制温度0℃，加入174毫克溴化锂(2.0mmol，2.0eq.)，混合搅拌5分钟。依次加入0.30毫升DBU(2.0mmol，2.0eq.)和0.20毫升N,N-二甲基硫代磷氨基二氯化物(1.5mmol，1.5eq.)溶于1毫升干燥二氯甲烷的溶液。氮气保护下，混合溶液在0℃搅拌40分钟。减压去除溶剂，残余物中加入50毫升乙酸乙酯，30毫升冷水洗涤后，有机相经过硫酸钠干燥后减压浓缩，利用硅胶层析分离，流动相选择二氯甲烷/丙酮/甲醇混合溶剂，得到586毫克目标产品m5C-1(纯度99％以上，产率72％)。
实施例8
本实施例为一种硫代修饰核苷酸结构的寡核酸合成用核苷酸单体[尿嘧啶硫代磷酰胺，U-1-1：O-((2R,3R,4R,5R)-2-((bis(4-methoxyphenyl)(phenyl)methoxy)methyl)-5-(2,4-dioxo-3,4-dihydropyrimidin-1(2H)-yl)-4-methoxytetrahydrofuran-3-yl)dimethylphosphoramidochloridothioate]的合成方法，合成反应式为
合成方法包括：
氮气保护下，561毫克O2'-Me-O5'-DMTr-U(U-1-0，1.0mmol,1.0eq.)加入干燥混合溶剂(5毫升二氯甲烷和5毫升乙腈)，控制温度0℃，加入174毫克溴化锂(2.0mmol，2.0eq.)，混合搅拌5分钟。依次加入0.30毫升DBU(2.0mmol，2.0eq.)和0.20毫升N,N-二甲基硫代磷氨基二氯化物(1.5mmol，1.5eq.)溶于1毫升干燥二氯甲烷的溶液。氮气保护下，混合溶液在0℃搅拌40分钟。减压去除溶剂，残余物中加入50毫升乙酸乙酯，30毫升冷水洗涤后，有机相经过硫酸钠干燥后减压浓缩，利用硅胶层析分离，流动相选择二氯甲烷/丙酮/甲醇混合溶剂，得到423毫克目标产品U-1-1(纯度99％以上，产率60％)。
实施例9
本实施例为一种硫代修饰核苷酸结构的寡核酸合成用核苷酸单体[胸腺嘧啶硫代磷酰胺，T-1-1：O-((2R,3R,4R,5R)-2-((bis(4-methoxyphenyl)(phenyl)metho xy)methyl)-4-methoxy-5-(5-methyl-2,4-dioxo-3,4-dihydropyrimidin-1(2H)-yl)tetrahydrofuran-3-yl)dimethylphosphoramidochloridothioate]的合成方法，合成反应式为
合成方法包括：
氮气保护下，575毫克O2'-Me-O5'-DMTr-T(T-1-0，1.0mmol,1.0eq.)加入干燥混合溶剂(5毫升二氯甲烷和5毫升乙腈)，控制温度0℃，加入174毫克溴化锂(2.0mmol，2.0eq.)，混合搅拌5分钟。依次加入0.30毫升DBU(2.0mmol，2.0eq.)和0.20毫升N,N-二甲基硫代磷氨基二氯化物(1.5mmol，1.5eq.)溶于1毫升干燥二氯甲烷的溶液。氮气保护下，混合溶液在0℃搅拌40分钟。减压去除溶剂，残余物中加入50毫升乙酸乙酯，30毫升冷水洗涤后，有机相经过硫酸钠干燥后减压浓缩，利用硅胶层析分离，流动相选择二氯甲烷/丙酮/甲醇混合溶剂，得到417毫克目标产品T-1-1(纯度99％以上，产率58％)。
实施例10
本实施例为一种硫代修饰核苷酸结构的寡核酸合成用核苷酸单体[次黄嘌呤硫代磷酰胺，I-1-1：O-((2R,3R,4R,5R)-2-((bis(4-methoxyphenyl)(phenyl)methoxy)methyl)-4-methoxy-5-(6-oxo-1,6-dihydro-9H-purin-9-yl)tetrahydrofuran-3-yl)dimet hylphosphoramidochloridothioate]的合成方法，合成反应式为
合成方法包括：
氮气保护下，585毫克O2'-Me-O5'-DMTr-I(I-1-0，1.0mmol,1.0eq.)加入干燥混合溶剂(5毫升二氯甲烷和5毫升乙腈)，控制温度0℃，加入174毫克溴化锂(2.0mmol，2.0eq.)，混合搅拌5分钟。依次加入0.30毫升DBU(2.0mmol，2.0eq.)和0.20毫升N,N-二甲基硫代磷氨基二氯化物(1.5mmol，1.5eq.)溶于1毫升干燥二氯甲烷的溶液。氮气保护下，混合溶液在0℃搅拌40分钟。减压去除溶剂，残余物中加入50毫升乙酸乙酯，30毫升冷水洗涤后，有机相经过硫酸钠干燥后减压浓缩，利用硅胶层析分离，流动相选择二氯甲烷/丙酮/甲醇混合溶剂，得到387毫克目标产品I-1-1(纯度99％以上，产率53％)。
实施例11
本实施例为一种硫代修饰核苷酸结构的寡核酸合成用核苷酸单体[次黄嘌呤硫代磷酰胺，I-2-1：O-((2R,3R,4R,5R)-2-((bis(4-methoxyphenyl)(phenyl)methoxy)methyl)-4-methoxy-5-(6-(4-nitrophenethoxy)-9H-purin-9-yl)tetrahydrofuran-3-yl)dimethylphosphoramidochloridothioate]的合成方法，合成反应式为
合成方法包括：
氮气保护下，734毫克O2'-Me-O5'-DMTr-O6-NPE-I(I-2-0，1.0mmol,1.0eq.)加入干燥混合溶剂(5毫升二氯甲烷和5毫升乙腈)，控制温度0℃，加入174毫克溴化锂(2.0mmol，2.0eq.)，混合搅拌5分钟。依次加入0.30毫升DBU(2.0mmol，2.0eq.)和0.20毫升N,N-二甲基硫代磷氨基二氯化物(1.5mmol，1.5eq.)溶于1毫升干燥二氯甲烷的溶液。氮气保护下，混合溶液在0℃搅拌40分钟。减压去除溶剂，残余物中加入50毫升乙酸乙酯，30毫升冷水洗涤后，有机相经过硫酸钠干燥后减压浓缩，利用硅胶层析分离，流动相选择二氯甲烷/丙酮/甲醇混合溶剂，得到543毫克目标产品I-2-1(纯度99％以上，产率62％)。
实施例12
本实施例为一种硫代修饰核苷酸结构的寡核酸合成用核苷酸单体[尿嘧啶硫代磷酰胺，U-2-1：O-((2R,3R,4R,5R)-2-((bis(4-methoxyphenyl)(phenyl)methoxy)methyl)-5-(2,4-dioxo-3,4-dihydropyrimidin-1(2H)-yl)-4-fluorotetrahydrofuran-3-yl)dimethylphosphoramidochloridothioate]的合成方法，合成反应式为
合成方法包括：
氮气保护下，549毫克2'-F-O5'-DMTr-U(U-2-0，1.0mmol,1.0eq.)加入干燥混合溶剂(5毫升二氯甲烷和5毫升乙腈)，控制温度0℃，加入174毫克溴化锂(2.0mmol，2.0eq.)，混合搅拌5分钟。依次加入0.30毫升DBU(2.0mmol，2.0eq.)和0.20毫升N,N-二甲基硫代磷氨基二氯化物(1.5mmol，1.5eq.)溶于1毫升干燥二氯甲烷的溶液。氮气保护下，混合溶液在0℃搅拌40分钟。减压去除溶剂，残余物中加入50毫升乙酸乙酯，30毫升冷水洗涤后，有机相经过硫酸钠干燥后减压浓缩，利用硅胶层析分离，流动相选择二氯甲烷/丙酮/甲醇混合溶剂，得到386毫克目标产品U-2-1(纯度99％以上，产率55％)。
采用上述类似的合成方法合成如下核苷酸单体：
实施例13
本实施例为一种硫代修饰核苷酸结构的寡核酸合成用核苷酸单体[胸腺嘧啶硫代磷酰胺，T-2-1：O-((2R,3S,5R)-2-((bis(4-methoxyphenyl)(phenyl)methoxy)methyl)-5-(5-methyl-2,4-dioxo-3,4-dihydropyrimidin-1(2H)-yl)tetrahydrofuran-3-yl)dimethylphosphoramidochloridothioate]的合成方法，合成反应式为
合成方法包括：
氮气保护下，545毫克O5'-DMTr-T(T-2-0，1.0mmol,1.0eq.)加入干燥混合溶剂(5毫升二氯甲烷和5毫升乙腈)，控制温度0℃，加入174毫克溴化锂(2.0mmol，2.0eq.)，混合搅拌5分钟。依次加入0.30毫升DBU(2.0mmol，2.0eq.)和0.20毫升N,N-二甲基硫代磷氨基二氯化物(1.5mmol，1.5eq.)溶于1毫升干燥二氯甲烷的溶液。氮气保护下，混合溶液在0℃搅拌40分钟。减压去除溶剂，残余物中加入50毫升乙酸乙酯，30毫升冷水洗涤后，有机相经过硫酸钠干燥后减压浓缩，利用硅胶层析分离，流动相选择二氯甲烷/丙酮/甲醇混合溶剂，得到433毫克目标产品T-2-1(纯度99％以上，产率63％)。
采用上述类似的合成方法合成如下核苷酸单体：
实施例14
本实施例为一种硫代修饰核苷酸结构的寡核酸合成用核苷酸单体，该核苷酸单体的合成方法采用上述实施例1～3中的类似的方法，该核苷酸单体的结构式包括：
上述O5'位置的保护基4,4'-二甲氧基三苯甲基(DMTr)，硫代磷酰胺核苷酸单体的制备合成同样适用于核苷酸单体的O5'位置保护基替换为三苯甲基(Tr)、4-甲氧基三苯甲基(MMTr)和4,4',4”-三甲氧基三苯甲基(TMTr)。
实施例15
本实施例为一种硫代修饰核苷酸结构的寡核酸负载于固相载体的核苷酸单体为硫代修饰的核苷酸单体为
合成反应式为
硫代修饰核苷酸结构的寡核酸的合成方法包括：
单体O5'-DMTr-O2'-Me-T负载于交联聚苯乙烯PS，利用3％二氯乙酸甲苯溶液脱除O5'-DMTr，乙腈洗涤后，泵入单体U-1-1进行偶联。体系经过盖帽处理，3％二氯乙酸甲苯溶液脱除O5'-DMTr，在线检测该转换率98.2％。乙腈洗涤后，泵入单体U-1-1进行偶联。3％二氯乙酸甲苯溶液脱除O5'-DMTr，在线检测该转换率98.0％。
负载的寡核酸分子经过氨解、脱保护处理后，减压浓缩的粗品利用HPLC分离提纯，收集主馏分，浓缩后冻干得到的产品，经检测确认为目标序列的核酸分子。
实施例16
本实施例为一种硫代修饰核苷酸结构的寡核酸负载于固相载体的核苷酸单体为硫代修饰的核苷酸单体为
合成反应式为
硫代修饰核苷酸结构的寡核酸的合成方法包括：
单体O5'-DMTr-O2'-Me-T负载于交联聚苯乙烯PS，利用3％二氯乙酸甲苯溶液脱除O5'-DMTr，乙腈洗涤后，泵入单体U-2-1进行偶联。体系经过盖帽处理，3％二氯乙酸甲苯溶液脱除O5'-DMTr，在线检测该转换率98.3％。乙腈洗涤后，泵入单体U-2-1进行偶联。3％二氯乙酸甲苯溶液脱除O5'-DMTr，在线检测该转换率98.2％。
负载的寡核酸分子经过氨解、脱保护处理后，减压浓缩的粗品利用HPLC分离提纯，收集主馏分，浓缩后冻干得到的产品，经检测确认为目标序列的核酸分子。
实施例17
本实施例为一种硫代修饰核苷酸结构的寡核酸负载于固相载体的核苷酸单体为硫代修饰的核苷酸单体为核苷酸亚磷酸酰胺2'-F-O5'-DMTr-A-P(OCE)(NiPr2)为
合成反应式为
硫代修饰核苷酸结构的寡核酸的合成方法包括：
单体O5'-DMTr-O2'-Me-T负载于交联聚苯乙烯PS，利用3％二氯乙酸甲苯溶液脱除O5'-DMTr，乙腈洗涤后，泵入单体U-2-1进行偶联。体系经过盖帽处理，3％二氯乙酸甲苯溶液脱除O5'-DMTr，在线检测该转换率98.2％。乙腈洗涤后，泵入单体2'-F-O5'-DMTr-A-P(OCE)(NiPr2)进行偶联、碘/吡啶氧化。3％二氯乙酸甲苯溶液脱除O5'-DMTr，在线检测该转换率99.3％。
负载的寡核酸分子经过氨解、脱保护处理后，减压浓缩的粗品利用HPLC分离提纯，收集主馏分，浓缩后冻干得到的产品，经检测确认为目标序列的核酸分子。
实施例18
本实施例为一种硫代修饰核苷酸结构的寡核酸负载于固相载体的核苷酸单体为硫代修饰的核苷酸单体为
合成反应式为
硫代修饰核苷酸结构的寡核酸的合成方法包括：
单体O5'-DMTr-O2'-Me-T负载于交联聚苯乙烯PS，利用3％二氯乙酸甲苯溶液脱除O5'-DMTr，乙腈洗涤后，泵入单体T-2-1进行偶联。体系经过盖帽处理，3％二氯乙酸甲苯溶液脱除O5'-DMTr，在线检测该转换率98.4％。乙腈洗涤后，泵入单体T-2-1进行偶联。体系经过盖帽处理，3％二氯乙酸甲苯溶液脱除O5'-DMTr，在线检测该转换率98.5％。
负载的寡核酸分子经过氨解、脱保护处理后，减压浓缩的粗品利用HPLC分离提纯，收集主馏分，浓缩后冻干得到的产品，经检测确认为目标序列的核酸分子。
实施例19
本实施例为一种硫代修饰核苷酸结构的寡核酸，制备过程中，负载于固相载体的核苷酸单体为硫代修饰的核苷酸单体为(U-1-1)；
寡核酸的结构式为
硫代修饰核苷酸结构的寡核酸的合成方法包括：
单体O5'-DMTr-O2'-Me-T负载于交联聚苯乙烯PS，利用3％二氯乙酸甲苯溶液脱除O5'-DMTr，乙腈洗涤后，泵入单体U-1-1进行偶联。体系经过盖帽处理后，3％二氯乙酸甲苯溶液脱除O5'-DMTr。乙腈洗涤后，泵入单体U-1-1，按照以上循环操作重复六次，得到序列结构的硫代磷酰胺修饰寡核酸分子，记为ON7-SN。
对比例1
本对比例为一种与ON7-SN碱基序列一样的寡核酸，制备过程中，负载于固相载体的核苷酸单体为采用的核苷酸单体为核苷酸亚磷酸酰胺寡核酸的结构式为记为ON7；该寡核酸采用常规的固相合成方法合成得到。
实验例
将实施例19制备得到的ON7-SN以及对比例1制备得到的ON7在人血清和人肝微粒体中的稳定性分别进行测试。
测试结果表明：
未采用硫代磷酰胺修饰的寡核酸分子ON7出现明显的降解，4小时后未降解的核酸序列比例低于5％；与之对照，无论在人血清还是人肝微粒体孵育48小时后，含硫代磷酰胺修饰核苷酸的寡核酸链ON7-SN的未降解比例大于96％，显示该修饰的寡核酸分子具有更强的抵抗生物酶降解能力。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。
Claims (10)
1.一种硫代修饰核苷酸结构的寡核酸，其特征在于，所述硫代修饰核苷酸结构的寡核酸中包括式I或式II所示的核苷酸结构单元；
式I中：
Base为核苷酸碱基或其衍生物，所述核苷酸碱基为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、次黄嘌呤或黄嘌呤；
R1和R2分别为烷基、烯基、炔基、环烷基或芳香基；
R3为氢、烷基、环烷基、烯基、炔基、硅基、硅基氧亚甲基、烷氧烷基、苄基或酰基；
式II中：
Base为核苷酸碱基或其衍生物，所述核苷酸碱基为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、次黄嘌呤或黄嘌呤；
R为氢、卤素、烷基、巯基、烷基巯基、胺基、叠氮基或氰基；
R1和R2分别为烷基、烯基、炔基、环烷基或芳香基。
2.根据权利要求1所述的硫代修饰核苷酸结构的寡核酸，其特征在于，所述硫代修饰核苷酸结构的寡核酸合成过程中采用包括式III或式IV所示的核苷酸单体：
式III中：
Base为含保护基的核苷酸碱基或其衍生物，所述核苷酸碱基为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、次黄嘌呤或黄嘌呤；
PG为三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、4,4'-二甲氧基三苯甲基、4,4',4”-三甲氧基三苯甲基、烯丙基、烯丙氧羰基、苄基、酰基、三甲基硅基、叔丁基二甲基硅基或叔丁基二苯基硅基；
R为氢、卤素、烷基、巯基、烷基巯基、胺基、叠氮基或氰基；
R1和R2分别为烷基、烯基、炔基、环烷基或芳香基；
式IV中：
Base为含保护基的核苷酸碱基或其衍生物，所述核苷酸碱基为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、次黄嘌呤或黄嘌呤；
PG为三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、4,4'-二甲氧基三苯甲基、4,4',4”-三甲氧基三苯甲基、烯丙基、烯丙氧羰基、苄基、酰基、三甲基硅基、叔丁基二甲基硅基或叔丁基二苯基硅基；
R1和R2分别为烷基、烯基、炔基、环烷基或芳香基；
R3为烷基、环烷基、烯基、炔基、硅基、硅基氧亚甲基、烷氧烷基、苄基或酰基。
3.根据权利要求2所述的硫代修饰核苷酸结构的寡核酸，其特征在于，所述保护基选自三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、4,4'-二甲氧基三苯甲基、4,4',4”-三甲氧基三苯甲基、烯丙基、烯丙氧羰基、苄基、酰基、三甲基硅基、叔丁基二甲基硅基和叔丁基二苯基硅基中的一种。
4.根据权利要求2所述的硫代修饰核苷酸结构的寡核酸，其特征在于，所述核苷酸单体包括：
其中：
R1和R2分别为烷基、烯基、炔基、环烷基或芳香基；
R3为烷基、环烷基、烯基、炔基、硅基、硅基氧亚甲基、烷氧烷基、苄基或酰基。
5.根据权利要求2所述的硫代修饰核苷酸结构的寡核酸，其特征在于，所述核苷酸单体包括：
其中：
R1和R2分别为烷基、烯基、炔基、环烷基或芳香基。
6.根据权利要求1所述的硫代修饰核苷酸结构的寡核酸，其特征在于，所述核苷酸单体包括：
其中：
R1和R2分别为烷基、烯基、炔基、环烷基或芳香基。
7.根据权利要求4～6中任一所述的硫代修饰核苷酸结构的寡核酸，其特征在于，所述核苷酸单体中4,4'-二甲氧基三苯甲基(DMTr)替换成三苯甲基(Tr)、4-甲氧基三苯甲基(MMTr)或4,4',4”-三甲氧基三苯甲基(TMTr)。
8.根据权利要求2所述的硫代修饰核苷酸结构的寡核酸，其特征在于，所述核苷酸单体由O5'含有保护基的核苷酸分子和硫代磷酰胺二氯在液相中反应制得。
9.根据权利要求1所述的硫代修饰核苷酸结构的寡核酸，其特征在于，所述硫代修饰核苷酸结构的寡核酸中的硫代修饰核苷酸结构能够提高寡核酸的生物稳定性和抗酶降解活性。
10.权利要求1～9中任一所述的硫代修饰核苷酸结构的寡核酸的合成工艺，其特征在于，所述合成工艺包括如下步骤：
(a)将核苷酸单体负载于固相载体上，再脱除核苷酸单体上O5'的保护基并进行洗涤；
(b)向洗涤后体系中泵入核苷酸单体进行偶联，再经过盖帽处理、脱除核苷酸单体上O5'的保护基并进行洗涤，所述核苷酸单体为硫代磷酰胺的核苷酸单体或亚磷酰胺的核苷酸单体；若核苷酸单体为亚磷酰胺的核苷酸单体时，在偶联反应后，经过氧化或硫化将三价的亚磷酸二酯转化为五价的磷酸二酯，再进行盖帽、脱除核苷酸单体上O5'的保护基并进行洗涤；
(c)重复步骤(b)操作，得到硫代修饰核苷酸结构的寡核酸。
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