JP2000505081A - オリゴヌクレオチドｎ３’→ｐ５’ホスホルアミデートの固相合成 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ホスホルアミダイトのアミン交換反応を用いて、オリゴヌクレオチドN3'→P5'ホスホルアミデートを合成する方法を提供し、ここで、固相支持オリゴヌクレオチド鎖の脱保護3'-アミノ基は、保護3'-アミノ基を有する入来モノマーの5'-ホスホルアミダイトのアミノ部分と交換される。得られたインターヌクレオシドホスホルアミダイト結合は、次いで、酸化されて、安定な保護ホスホルアミデート結合を形成する。本発明の方法は、上記種類の化合物の現在利用できる合成方法よりも、生成物の収率を大きく改良し、そして試薬の使用量を低減する。

Description

【発明の詳細な説明】 オリゴヌクレオチドN3'→P5'ホスホルアミデートの固相合成 発明の分野 本発明は、一般に、核酸重合体化学に関し、さらに特定すると、オリゴヌクレ オチドN3'→P5'ホスホルアミデートを合成する方法に関する。 発明の背景 核酸重合体化学は、製薬分野、診断分野および分析分野、さらに特定すると、 アンチセンス診断および抗遺伝子治療、コンビナトリアルケミストリー、分枝DN Aシグナル増幅、および配列ベースのDNA診断および分析(例えば、 など)の副分野において、多くの開発中の技術にて、重要な役割を果たしている 。 この化学分野の多くは、天然核酸重合体(例えば、DNA)の結合強度、特異性お よびヌクレアーゼ耐性を改良する方向に向けられている。残念なことに、１特性 (例えば、ヌクレアーゼ耐性)の改良には、しばしば、他の特性(例えば、結合強 度)に対するトレードオフ（trade-off）が関与する。このようなトレードオフの 例は多い：ペプチド核酸(PNA)は、良好なヌクレアーゼ耐性および結合強度を示 すが、試験培養における細胞吸収が低い(例えば、Hanveyら、Science、258：148 1-1485(1992))；ホスホロチオエートは、良好なヌクレアーゼ耐性および溶解性 を示すが、典型的には、P-キラル混合物として合成され、いくつかの配列非特異 的な生物学的効果を示す(例えば、Steinら、Science、261：1004-1012(1993))； メチルホスホネートは、良好なヌクレアーゼ耐性および細胞吸収を示すが、典型 的には、P-キラル混合物としても合成され、二重鎖安定性が低い(例えば、Mesma ekerら(上記))など。 最近、新しい種類のオリゴヌクレオチドアナログが開発され、このアナログは 、いわゆる、N3'→P5'ホスホルアミデートインターヌクレオシド結合を有し、こ れは、非常に好ましい結合特性、ヌクレアーゼ耐性および溶解性を示す(Gryazno vおよびLetsinger、Nucleic Acids Research、20：3403-3409(1992)；Chenら、N ucleic Acids Research、23：2661-2668(1995)；Gryaznovら、Proc．Natl．Acad .Sci.、92：5798-5802(1995)；およびGryaznovら、J．Am．Chem．Soc.、116：31 43-3144(1994))。残念なことに、公開されたプロトコルによるこれらの化合物の 合成収率の低さは、それらの商業的な利用を妨げている。 この新規な種類のオリゴヌクレオチドアナログの有用性は、上で概説した他の 好ましい特性のいずれについても損失を伴うことなくその合成収率を改良する改 変および新規合成アプローチが見出されるのであれば、著しく高められる。 発明の要旨 上記のことを考慮して、本発明の重要な目的は、逐次的なカップリング収量が 著しく増すようなオリゴヌクレオチドN3'→P5'ホスホルアミデートの固相合成の 新規アプローチを提供することにある。 本発明の他の目的は、本発明の方法において使用する新規な3'-保護アミノ-5' -ホスホルアミダイトモノマーを提供することにある。 本発明のさらに他の目的は、オリゴヌクレオチドN3'→P5'ホスホルアミデート (特に、２'-デオキシオリゴヌクレオチドN3'→P5'ホスホルアミデート)を製造す る実用的な大規模合成方法を提供することにある。 本発明のこれらの目的および他の目的は、アミン交換反応を用いてオリゴヌク レオチドN3'→P5'ホスホルアミデートを合成する方法を提供することにより達成 され、この方法では、固相支持オリゴヌクレオチド鎖の脱保護3'-アミノ基は、 保護3'-アミノ基を有する入来モノマー（incoming monomer）の5'-ホスホルアミ ダイトのアミノ部分と交換される。得られたインターヌクレオシドホスホルアミ ダイト結合は、次いで、酸化されて、安定な保護ホスホルアミデート結合を形成 する。この反応の一般的なスキームを以下に描写する。 一般に、本発明の方法は、以下の工程を包含する：(a)固相支持体に結合した 第一ヌクレオシドを提供する工程であって、該第一ヌクレオシドは、保護3'-ア ミノ基を有する；(b)該保護3'-アミノ基を脱保護して、遊離3'-アミノ基を形成 する工程;(c)該遊離3'-アミノ基を3'-保護アミノヌクレオシド-5'-ホスホルアミ ダイトモノマーと反応させて、インターヌクレオシドN3'→P5'ホスホルアミダイ ト結合を形成する工程；(d)該結合を酸化する工程；および(e)所望のオリゴヌク レオチドN3'→P5'ホスホルアミデートが合成されるまで、工程(b)〜(d)を繰り返 す工程。好ましくは、この3'-保護アミノヌクレオシド-5'-ホスホルアミダイト モノマーの5'-ホスホルアミダイトの窒素部分は、少なくとも10のpK_aを有する立 体障害アミンである。 本発明は、さらに、次式の3'-保護アミノヌクレオシド-5'-ホスホルアミダイ トモノマーを包含し、このモノマーは、本発明の方法で特に有用である： ここで、Bは、ピリミジン、プリン、またはそれらのアナログである；R¹は、ホ スフェート保護基である；Wは、-NHR²または-OR⁷のいずれかであり、ここで、R² は、アミノ保護基であり、そしてR⁷は、ヒドロキシル保護基である；R³は、水素 、ヒドロキシル、フルオロまたは-OR'であり、ここで、R'は、１個〜３個の炭素 原子を有するアルキル、または2'-ヒドロキシル保護基(例えば、アルキルシリル 、例えば、t-ブチルジメチルシリルなど)である；そしてR⁴およびR⁵は、それら が結合した窒素と一緒になって、炭素原子および/または酸素、イオウおよび窒 素からなる群から選択されるヘテロ原子を40個まで有するアルキルアミノ脱離基 またはアリールアミノ脱離基を形成する。-OR⁷としてのWを有するモノマーは、N 3'→P5'ホスホルアミデート結合および他の結合(例えば、ホスホジエステル、ホ スホロチオエートなど)の両方を含有するキメラ状オリゴヌクレオチドを合成す るのに特に有用である。 本発明は、完全アミド化結合または部分アミド化結合のいずれかを有するオリ ゴヌクレオチドN3'→P5'ホスホルアミデートを合成する従来方法の重大な欠点を 克服し、そしてこのような化合物の商業規模の製造法に道を開く。特に、本発明 は、ずっと低いモル当量のモノマー反応物を用いて、非常に向上したカップリン グ収率を提供し、これにより、このオリゴヌクレオチドN3'→P5'ホスホルアミデ ートの商業的に実現可能な合成を可能にする。本発明は、広範囲の分野(科学研 究および工業研究、治療および診断を含めて)において、この化合物の広い適用 を可能にする。図面の簡単な説明 図1は、N6-ベンゾイル-3'-トリチルアミノ-2'-デオキシアデノシン-5'-(2-シ アノエチル-N,N-ジイソプロピル)-ホスホルアミダイトおよびテトラゾールの混 合物の³¹P-NMRスペクトルである。 図２は、3'-トリチルアミノチミジン-5'-(2-シアノエチル−(2,2,6,6-テトラ メチルピペリジニル))-ホスホルアミダイトおよびテトラゾールの混合物の³¹P-N MRスペクトルである。 図３aおよび３bは、本発明のアミン交換反応により合成した２種の粗オリゴヌ クレオチドN3'→P5'ホスホルアミデートのイオン交換クロマトグラムである。 図４は、実施例19のオリゴ-2'-フルオロヌクレオシドN3'→P5'ホスホルアミデ ートの合成からの粗反応混合物のイオン交換HPLCクロマトグラムである。 定義 オリゴヌクレオチドが一連の文字(例えば、「ATGUCCTG」)で表わされる場合は いつも、このヌクレオチドは、左から右への5'→3'の順序であり、他に指示がな ければ、「A」は、デオキシアデノシンを表わし、「C」は、デオキシシチジンを 表わし、「G」は、デオキシグアノシンを表わし、「T」は、チミジンを表わし、 そして「U」は、デオキシウリジンを表わすことが理解される。 本明細書中で使用する「N3'→P5'ホスホルアミデート」とは、以下の形状のイ ンターヌクレオシド結合（internucleosidic linkage）を意味する： ３'-ＮＨ-Ｐ(=Ｘ)(ＯＲ¹)-Ｏ-５' ここで、3'および5'は、この結合によって接続された連続ヌクレオシドの糖部分 の炭素原子を表わし、ここで、R¹は、水素またはホスフェート保護基であり、そ してXは、カルコゲン(好ましくは、酸素またはイオウ)である。さらに特定する と、R¹がホスフェート保護基のとき、それは、10個までの炭素原子を含有するア ルキル、アルケニル、アリール、アラルキルまたはシクロアルキルである。好ま しくは、R¹がホスフェート保護基のとき、それは、1個〜６個の炭素原子 を有するアルキル；電子求引性β-置換エチル(特に、β-トリハロメチル−、β- シアノ−、β-スルホ−またはβ-ニトロ−置換エチル)；電子求引性置換フェニ ル(特に、ハロ−、スルホ−、シアノ−またはニトロ−置換フェニル)；または電 子求引性置換フェニルエチルである。さらに好ましくは、R¹がホスフェート保護 基のとき、それは、メチル、β-シアノエチルまたは4-ニトロフェニルエチルで ある。最も好ましくは、R¹は、水素、メチルまたはβ-シアノエチルである。電 子求引性置換基は、代表的には、ハロ、シアノ、ニトロ、スルホ、またはモノ− 、ジ−またはトリハロメチルなどである。ハロゲン原子置換基は、通常、フルオ ロ、クロロ、ブロモまたはヨードであり、好ましくは、それらは、フルオロまた はクロロである。「電子求引性」とは、ある置換基が、分子の一部分の原子価電 子を引きつける傾向(すなわち、電子陰性である)を表わす(例えば、March，Adva nced Organic Chemistry，pgs．16-18(John Wiley、New York、1985))。ホスフ ェート保護基を選択するためのガイダンスは、BeaucageおよびIyer、Tetrahedro n 48：2223-2311(1992)に示されている。便宜上、ヌクレオチドホスホルアミデ ートは、本明細書中において時に、N3'→P5'ホスホルアミデートおよびP3'→N5' ホスホルアミデートについて、それぞれ「np」または「pn」の下付き文字で示さ れる。それゆえ、「U_npU」は、3'-アミノウリジンおよびウリジンがN3'→P5'ホ スホルアミデート結合により連結されたジヌクレオチドである。同様に、2'-フ ルオロ置換基は、上付き文字「f」で示される。それゆえ、「U^f _npU」は、5'-モ スト(5'-most)3'-アミノ-2'-フルオロウリジンがN3'→P5'ホスホルアミデート結 合によりウリジンに連結されたジヌクレオチドである。単独の先に付く（leadin g）下付き文字「p」は、5'-モノホスフェートを示し、そして単独の後に付く（t ailing）下付き文字「n」は、3'-アミノ基を示す。 本明細書中で使用する「N3'→P5'ホスホルアミダイト結合」（強調を加える） との用語は、N3'→P5'ホスホルアミデート結合のリン(III)中間体を意味する。 本発明に従って、N3'→P5'ホスホルアミデート結合は、N3'→P5'ホスホルアミダ イト結合の酸化により形成される。 本明細書中で使用する「ヌクレオシド」には、天然ヌクレオシドが挙げられ、 これには、2'-デオキシ形態および2'-ヒドロキシル形態(例えば、Kornbergおよ びBaker、DNA Replication、第２版(Freeman、San Francisco、1992)に記述のも の)が含まれる。ヌクレオシドに関係する「アナログ」には、修飾塩基部分およ び/または修飾糖部分を有する合成ヌクレオシドが挙げられ、これらは、例えば 、一般に、Scheit、Nucleotide Analogs(John Wiley、New York、1980)に記述さ れている。このようなアナログには、UhlmannおよびPeyman(上記)に開示されて いるような結合特性(例えば、安定性、特異性など)を高めるように設計された合 成ヌクレオシドが挙げられる。 本明細書中で使用する「ピリミジン」とは、天然ヌクレオシドに生じるピリミ ジン(シトシン、チミン、およびウラシル、およびそれらの一般的なアナログ（ 例えば、オキシ、メチル、プロピニル、メトキシ、ヒドロキシル、アミノ、チオ 、ハロなどの置換基を含有するもの）を含めて)を意味する。本明細書中で使用 する用語には、さらに、一般的な保護基が結合したピリミジン(例えば、N⁴-ベン ゾイルシトシン)が挙げられる。一般的なピリミジン保護基はさらに、Beaucage およびIyer(上記)に開示されている。 本明細書中で使用する「プリン」は、天然ヌクレオシドに生じるプリン(アデ ニン、グアニン、およびヒポキサンチン、およびそれらの一般的なアナログ（例 えば、オキシ、メチル、プロピニル、メトキシ、ヒドロキシル、アミノ、チオ、 ハロなどの置換基を含有するもの）を含めて)を意味する。本明細書中で使用す る用語は、さらに、一般的な保護基が結合したプリン(例えば、N²-ベンゾイルグ アニン、N²-イソブチリルグアニン、N⁶-ベンゾイルアデニンなど)をさらに含む 。さらに一般的なプリン保護基は、BeaucageおよびIyer(上記)に開示されている 。 本明細書中で使用する「オリゴヌクレオチドN3'→P5'ホスホルアミデート」と は、少なくとも１個のN3'→P5'ホスホルアミデート結合により連結されたヌクレ オシドサブユニットのオリゴマー(通常、線状)を意味する。このヌクレオシドサ ブユニットは、通常、ヌクレオシドまたはヌクレオシドアナログを含有するが、 適合可能な化学的性質を有するより一般的な部分(例えば、非塩基性糖類（abasi c sugars）および他の炭化水素部分、例えば、以下の参考文献に記述のもの)を 含有していてもよい：Newtonら，Nucleic Acids Research，21:1155-1162（199 3);Griffinら，J．Am．Chem．Soc.，114:7976-7982(1992);Jaschkeら，Tetrahed ron Letters，34:301-304(1992);Maら，国際出願PCT/CA92/00423;Zonら，国際出 願PCT/US90/06630;Durandら，Nucleic Acids Research，18:6353-6359(1990);Sa lunkheら，J．Am．Chem．Soc.，114:8768-8772(1992);など。さらに好ましくは 、この用語は、全てのインターヌクレオシド結合がN3'→P5'ホスホルアミデート 結合で置換されたオリゴヌクレオチドを意味し、すなわち、この用語は、部分お よび完全「アミド化」オリゴマーを包含する。さらにより好ましくは、それは、 全てのインターヌクレオシド結合がN3'→P5'ホスホルアミデート結合で置換され 、そのヌクレオシドサブユニットが天然ヌクレオシドまたはそれらのアナログで あるオリゴヌクレオチドを意味する。全ての結合がN3'→P5'ホスホルアミデート 結合である(「完全にアミド化された」)、本発明のオリゴヌクレオチドN3'→P5' ホスホルアミデートは、他のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドに包埋 されるかまたは結合されて、「部分アミド化」されたより大きなオリゴマーを形 成し得る。例えば、この完全アミド化オリゴヌクレオチドN3'→P5'ホスホルアミ デートA_npA_npG_npC_npC_nは、より大きなヌクレオチドであるGGCCAAAA_npA_npG_npC_npC_np ACTAT(配列番号１)に包埋されるか、またはより大きなオリゴヌクレオチド：A_np A_npG_npC_npC_npTTTATC(配列番号２)として「TTTATC」に結合される。PCRプライ マー、捕捉プローブなどとして使用され得るこのようなキメラ状オリゴヌクレオ チドは、本発明の範囲内に含まれる。 本明細書中で使用する「酸化する」、「酸化」などの用語は、リン含有インタ ーヌクレオシド結合に関係して、この結合のリン原子をリン(III)形態からリン( Ｖ)形態に転化する方法または処理を意味する。 本明細書中で使用する「ホスホルアミダイトアミノ基」との用語は、ホスホル アミダイト基のリン原子に結合したアミノ基、-NR₄R₅を意味し、そして「ホスホ ルアミダイト窒素」との用語は、このホスホルアミダイトアミノ基の窒素原子を 意味する。 本明細書中で使用する「立体障害」、「立体的に障害のある」などの用語は、 「かさ高い（bulky）」基の化学反応性に対する効果を意味する(例えば、Morris onおよびBoyd、Organic Chemistry、page 603(AllynおよびBacon、Boston、197 8))。 発明の詳細な説明 本発明は、オリゴヌクレオチドN3'→P5'ホスホルアミデートを合成する固相方 法に関し、ここで、成長鎖の遊離アミノ基へのホスホルアミダイトモノマーのカ ップリングは、モノマーのホスホルアミダイトアミノ基のこの成長鎖の遊離の3' アミノ基での交換を経て進行する。好ましくは、本発明の方法により生成したオ リゴヌクレオチドN3'→P5'ホスホルアミデートは、次式により記述される：ここで、Bは、プリンまたはピリミジンまたはそれらのアナログである；Xは、カ ルコゲン(好ましくは、酸素またはイオウ、最も好ましくは、酸素)である；R³は 、水素、フルオロまたはヒドロキシル、好ましくは、水素である；R⁶は、アミノ またはヒドロキシルである；そしてZは、水素またはカチオン性対イオン(例えば 、アルカリ金属)、アミンカチオン(例えば、アンモニウム、トリエチルアンモニ ウム)などである。好ましくは、ｎは、１〜数百の範囲である；より好ましくは 、ｎは、１〜約50の範囲である；最も好ましくは、ｎは、１〜30の範囲である。 好ましくは、本発明のオリゴ-2-フルオロヌクレオチドN3'→P5'ホスホルアミ デートは、長さが２個と30個の間のヌクレオチドである。より好ましくは、これ らは、長さが８個と25個の間のヌクレオチドであり、最も好ましくは、これらは 、長さが８個と20個の間のヌクレオチドである。 上で述べたように、この方法の一般的な工程は、(a)固相支持体に結合した第 一ヌクレオシドを提供する工程であって、該第一ヌクレオシドは、保護3'-アミ ノ基を有する；(b)該保護3'-アミノ基を脱保護して、遊離の3'-アミノ基を形成 する工程；(c)該遊離3'-アミノ基を3'-保護アミノヌクレオシド-5'-ホスホルア ミダイトモノマーと反応させて、インターヌクレオシドN3'-P5'ホスホルアミダ イト結合を形成する工程；(d)該結合を酸化する工程；および(e)所望のオリゴヌ クレオチドN3'→P5'ホスホルアミデートが合成されるまで、工程(b)〜(d)を繰り 返す工程を包含する。 本発明のアミン交換反応が、たとえ、反応物および生成物の間の可逆的な平衡 (以下の反応式（equetion）1aおよび1bに示す)に依存していても(これは、不可 逆的なカップリング工程が関与する固相オリゴヌクレオチド合成の殆どのアプロ ーチとは対照的である)、カップリング条件、保護基、固相支持体、結合基、脱 保護試薬、固相支持体からの生成物を切断する試薬、生成物の精製などに関する 選択を行う重要なガイダンスは、例えば、以下のような文献に見出される： などの文献。 本発明では、広範囲の固相支持体が使用でき、これには、制御細孔ガラス(CPG )、高架橋ポリスチレン、アクリル共重合体、セルロース、ナイロン、デキスト ラン、ラテックス、ポリアクロレインなどが含まれ、これらは、以下の文献に開 示されている： 支持体は、さらに、ポリスチレンビーズ；ポリエチレングリコールでグラフト化 したポリスチレン(例えば、TentaGel^TM、Rapp Polymere、Tubingen Germany)な どが挙げられる。この支持体の特性(例えば、材料、多孔度、サイズ、形状など) 、および使用される結合部分のタイプの選択は、種々の要因(例えば、使用する 保護基、最終生成物の長さ、最終生成物の量など)に依存する。代表的な結合部 分は、以下に開示されている： など。 本発明で使用する好ましい固体支持体には、CPG、およびポリエチレングリコ ールでグラフト化しかつ末端アミノ基を有するポリスチレン(例えば、TentaGel −NH₂ ^TM、Rapp Polymere、Tubingen Germany)がある。このアミノプロピル基は 、CPGとヌクレオシド結合との間の好ましいスペーサーである。この第一ヌクレ オシドの5'-ヒドロキシルへの好ましい結合は、スクシニル基であり、これは、 塩基不安定性エステル結合（これは、典型的には、アンモニア水を用いた合成後 に開裂される）を提供する。 本発明のモノマーには、2'-フルオロ-3'-保護アミノヌクレオシド-5'-ホスホ ルアミダイト、2'-デオキシ-3'-保護アミノヌクレオシド-5-ホスホルアミダイ ト、2'-保護-3'-保護アミノリボヌクレオシド-5'-ホスホルアミダイト、および それらの3'-保護-3'-ヒドロキシル類似物（counterpart）が挙げられる。好まし くは、本発明のモノマーは、次式により定義される： ここで、B、W、R¹、R³、R⁴およびR⁵は、上で定義の通りである。 さらに好ましくは、-NR⁴R⁵は、立体障害アミノ基であり、これは、以下の好ま しい代替物から構成されてもよい：まず、R⁴およびR⁵は、独立して、アルキル、 アラルキル、シクロアルキルまたはシクロアルキルアルキルであり、ここで、R⁴ およびR⁵は、合計で６個〜20個の炭素原子を有する。さらにより好ましくは、R⁴ およびR⁵は、独立して、１個〜８個の炭素原子を有するアルキルである。さらに 好ましくは、R⁴およびR⁵は、独立して、イソプロピル、sec-ブチル、イソブチル 、t-ブチル、シクロヘキシルまたは2-エチルヘキシルである。最も好ましくは、 独立して、R⁴は、イソプロピルであり、一方R⁵は、t-ブチルである。 第二に、R⁴およびR⁵は、一緒になって、その主鎖に12個までの炭素原子を含有 し、かつ全体で４個〜20個の炭素原子を含有するアルキレン鎖を形成し得、該鎖 の両方の末端原子価結合は、R⁴およびR⁵が結合した窒素原子に結合している。さ らに好ましくは、R⁴およびR⁵は、一緒になって、その主鎖に６個までの炭素原子 を含有し、かつ全体で４個〜12個の炭素原子を含有するアルキレン鎖を形成し得 、該鎖の両方の末端原子価結合は、R⁴およびR⁵が結合した窒素原子に結合してい る。 第三に、R⁴およびR⁵は、一緒になって、それらが結合した窒素と共に、その主 鎖に10個までの炭素原子またはヘテロ原子を有し、かつ全体で４個〜20個の炭素 原子またはヘテロ原子を有する飽和窒素複素環を形成し、その結果、R⁴およびR⁵ は、一緒になって、それらが結合した窒素原子と共に、窒素、酸素およびイオウ からなる群から選択される３個までのヘテロ原子を含有する。さらに好ま しくは、R⁴およびR⁵は、一緒になって、それらが結合した窒素原子と共に、10個 までの炭素原子を有し、かつ窒素、酸素およびイオウからなる群から選択される ３個までの追加のヘテロ原子を有する飽和窒素複素環を形成する。さらにより好 ましくは、R⁴およびR⁵は、一緒になって、それらが結合した窒素原子と共に、ピ ロリジノ、モルホリノ、テトラメチルグアニジニルまたはピペリジノとなる。さ らにより好ましくは、R⁴およびR⁵は、一緒になって、それらが結合した窒素原子 と共に、ジメチルピペリジニル、ピロリジニル、ジメチルモルホリノ、テトラメ チルモルホリノ、ジメチルピロリジニル、テトラメチルピロリジニルまたはテト ラメチルピペリジニルとなる。さらにより好ましくは、R⁴およびR⁵は、一緒にな って、それらが結合した窒素原子と共に、2,2,6,6-テトラメチルピペリジニル、 2,6-ジメチルピペリジニルまたは2,5-ジメチルピロリジニルとなる。最も好まし くは、R⁴およびR⁵は、一緒になって、それらが結合した窒素原子と共に、2,2,6, 6-テトラメチルピペリジニルとなる。 好ましくは、この方法で使用されるモノマーは、2'−デオキシ-3'-保護アミノ ヌクレオシド-5'-ホスホルアミダイトである。さらに好ましくは、このホスホル アミダイトアミノ基は、少なくとも10.0のPKaを有する。さらにより好ましくは 、このホスホルアミダイトアミノ基は、以下で定義されるようなテトラゾール活 性化平衡定数K₁にれは、実施例９で測定される)が10M^-1より大きくなるように、 選択される。さらにより好ましくは、この平衡定数は、100M^-1より大きく、最も 好ましくは、この平衡定数は、1000M^-1より大きい。 テトラゾール活性化平衡定数K₁は、以下のように定義される： ここで、[テトラゾリジルアミダイト]は、テトラゾジルアミダイト中間体の平衡 濃度であり、[テトラゾール]は、テトラゾールの平衡濃度であり、[モノマーア ミダイト]は、ホスホルアミダイトモノマーの平衡濃度であり、そして[R₂NH₂ ⁺ テトラゾリド^-]は、このホスホルアミダイトモノマーのアミノ脱離基のテトラゾ リド塩の平衡濃度である。 好ましくは、このモノマーの3'-アミノ保護基であるR²は、酸不安定性基(例え ば、トリフェニルメチル(すなわち、トリチル)、p-アニシルジフェニルメチル( すなわち、モノメトキシトリチルまたはMMT)、ジ-p-アニシルフェニルメチル(す なわち、ジメトキシトリチルまたはDMT)または酸不安定性ウレタン)である。最 も好ましくは、この3'-アミノ保護基は、トリフェニルメチルである。これらの 保護基は、酸性溶液(最も好ましくは、ジクロロ酢酸の３％塩化メチレン溶液)で 処理することにより除去される。同様に、このモノマーの3'-ヒドロキシル保護 基であるR7は、酸不安定性基(例えば、トリチル、MMT、DMTまたはウレタン)であ る。最も好ましくは、この3'-ヒドロキシル保護基は、DMTである。 本明細書中で使用する「遊離アミノ基」との用語は、本発明のモノマーに関係 して、入来モノマーのホスホルアミダイト基と反応させるのに利用可能なアミノ 基を意味する。好ましくは、遊離アミノ基は第一級アミンである。脱トリチル化 工程の後、このアミノ基は、一般に、脱トリチル化に用いた酸の共役塩基と共に その塩の形態で存在する。この塩は、脱トリチル化工程の後、必要に応じて、塩 基性溶液(例えば、アセトニトリル中の２％トリエチルアミンまたはピリジン)で 中和され得る。 本発明のカップリング工程は、−20〜200℃の温度範囲で行われ得る。より好 ましくは、この反応は、室温(約15〜30℃)で行われる。この反応は、ホスホルア ミダイトモノマー溶液および活性化剤溶液(またはホスホルアミダイトモノマー および活性化剤を含有する溶液)を、固体支持体に共有結合した(オリゴ)ヌクレ オチドの遊離アミノ基を含む反応容器に添加することにより行われる。一般に、 本発明の活性化剤は、求核性触媒であり、これは、より安定なホスホルアミダイ トアミノ基を置き換えて、反応性が高い（そして、より安定性が低い）中間体を 形成し、この中間体は、次いで、固体支持されたオリゴヌクレオチドN3'→P5'ホ スホルアミデートの遊離3'アミノ基と反応する。次いで、この混合物は、機械的 なボルテックス、不活性ガスの散布などの方法により混合される。あるいは、モ ノマーおよび活性化剤の溶液は、遊離3'-アミノ基を有する固体支持された（オ リ ゴ)ヌクレオチドを含む反応容器（またはカラム）を通って流れるように製造さ れ得る。これらのモノマーおよび活性化剤は、予め混合されるか、適切な合成機 のバルブブロックにおいて混合されるか、前活性化容器で混合され、望ましいな ら、予め平衡化されるか、または別々に反応容器に添加され得る。 本発明で使用される活性化剤の例には、テトラゾール、5-（エチルチオ）テト ラゾール、5-(4-ニトロフェニル)テトラゾール、5-(2-チ才フェン)テトラゾール 、トリアゾール、ピリジニウムクロライドなどがある(例えば、BeaucageおよびI yer（上記）;Bernerら、Nucleic Acids Research、17:853-864(1989);Benson、C hem．Rev．41：l-61(1947))。本明細書中で使用する「テトラゾール活性化剤」 との用語は、テトラゾールまたはテトラゾール誘導体である活性化剤を意味する 。最も好ましい活性化剤は、テトラゾールである。適切な溶媒には、ア七トニト リル、テトラヒドロフラン、塩化メチレンなどがある。アセトニトリルが好まし い。非常に乾燥した（水を含まない）モノマー、活性化剤、およびこのカップリ ング工程用の溶媒、およびこのカップリングエ程の直前にこの固体支持体を洗浄 するのに使用する溶媒には、多大な注意を行なうべきである。 モノマーの選択（特に、このホスホルアミダイトアミノ基の選択）は、その適 用に依存する。一般に、市販のDNA台成機(例えば、ABI Model 394)を用いる実験 室規模(0.01−10μmol)のホスホルアミデートオリゴヌクレオチド合成には、比 較的に安定で比較的に反応性の低い(これは、平衡定数K₁により定義される;上記 参照)モノマーを使用するのが有用であり、それにより、この溶液は、数週間の 期間にわたって、多重合成(multiple synthese)用の器具に残される。この用途 に対して比較的に反応性の低いモノマーを使用するのが好ましい他の理由には、 このタイプの器具が、典型的には、使用する試薬の容量を最小にするようには設 計されていないという事実がある。実際には、実験室規模の合成機は、典型的に は、ある程度まで、この反応容器（カラム）にモノマ一溶液を流すことにより操 作されるので、可溶性の生成物の一部は、このカラムから（従って、平衡状態か ら）除去され、それゆえ、この平衡を完結の方向に駆動するのを助ける。また、 この規模で使用するモノマーの価格は、他の要因（例えば、人件費、利便性など ）程に比較的に重要ではないであろう。一般に、反応性が低いモノマー（例えば 、ジイ ソプロピルアミノホスホルアミダイト)を使用する場合には、遊離アミノ基と比 較して、比較的に大過剰のモノマー(10〜50倍)を使用する必要があり、合理的な 反応速度および転化率（収率）を達成するために、大過剰の活性化剤を使用する 必要がある。 所望のカップリング収率を得るのに必要なモノマーの量（当量数）を最小にす るために、特に、比較的に反応性の低いモノマーを用いて、上で概説した小規模 の合成を行う場合、このカップリングエ程および酸化工程を２回行うのが非常に 有用であり、この際、２回のカップリングエ程のそれぞれでは、より低い濃度（ および低い当量)のモノマーを使用する。これは、カップリング反応が可逆平衡 であるためである（これは、反応式ｌａおよびｌｂで例示する）。この方法を用 いると、このサイクルの第一のカップリングは、かなり少ない量のモノマーを用 いて行われ、これらの条件下で形成される所望のホスホルアミダイト結合の平衡 濃度は、次いで、このサイクルの第一の酸化工程を行うことにより、このホスホ ルアミデートとして「固定(lock-in)」される。次いで、比較的に少ない量のモ ノマーを再度用いて、第二のカップリングエ程が行われ、続いて、第二の酸化工 程が行われる。この方法を用いて所望の収率を達成するには、全てのモノマーが 単一のカップリングで使用された場合よりも、全体としてより少ないモノマーが 必要とされるにすぎない。 大規模生産の経済性には、使用するモノマーの量（当量数）を最小にする必要 がある。この適用では、人件費および他の一部の価格は、この合成規模に関して 線形的に上昇しないので、一般に、このモノマーの価格が、その全体的な価格の 大部分を占める。大規模なオリゴヌクレオチド合成機はまた、一般に、実験室規 模の合成機に一般的な流動様式よりもむしろバッチ様式で操作され、その結果、 この容器から可溶性生成物を除去することにより、この反応を完結へと駆動する 操作は実用的ではない。この適用では、比較的に反応性(これは、K₁で定義され る；上記参照)が高いモノマーを選択する必要がある。このようなモノマーは、 一般に、比較的に塩基性が高いかおよび/または立体障害性が高いホスホルアミ ダイトアミノ基を有する。このような反応性モノマーの使用は、より低い濃度の 活性化剤の使用で、合理的な反応速度を達成することを可能となる。これらのよ り低い濃度の活性化剤は、所望生成物と活性化剤との逆反応を防止して、活性化 中間体(反応式lb)を形成するのを助ける。これらの理由のために、著しく低い量 （１〜５当量）のモノマーを必要とする。一般に、最も高い純度のモノマーを使 用するのが非常に重要である。 このカップリングエ程の後、得られたホスホルアミダイト結合は、酸化されて （硫化されて）、安定な保護ホスホルアミデート（ホスホロチオアミデート）結 合を形成する。この酸化工程は、カップリング溶液を反応容器から排出した直後 に行われ得るか、またはその間に溶媒洗浄を伴って行われ得る。このホスホルア ミダイト結合は、テトラゾールの存在下にて加水分解できるので、洗浄溶液は、 好ましくは、非常に乾燥しているかおよび/または塩基性である。洗浄工程が使 用されないのであれば、酸化溶液は、塩基性および/または非常に乾燥している ことが好ましいか、あるいは加水分解でうまく完結する程に充分に反応性の酸化 剤が選択される。 本発明の方法で有用な酸化剤には、ヨウ素、塩素、臭素、過酸(例えば、m-ク ロロ安息香酸)、ヒドロペルオキシド(例えば、t-ブチルヒドロペルオキシド、工 チルヒドロペルオキシド、メチルヒドロペルオキシドなど)、オゾン、混合アシ ルスルフィン酸無水物(例えば、3H-2,l-ベンズオキサチオラン-3-オン-l-オキシ ド)、過硫酸の塩（例えば、過硫酸ナトリウム、過硫酸アンモニウムおよび過硫 酸テトラブチルアンモニウムなど)、モノペルオキシ硫酸塩(例えば、oxone^TM)、 ナトリウムおよび/または他の次亜塩素酸塩、過酸化物（例えば、過酸化ジエチ ルまたは過酸化ビス（トリメチルシリル）、または過酸化水素または非水性過酸 化水素等価物（例えば、尿素／過酸化水素錯体など）)が挙げられる。リン(111) をリン(V)に転化するのに使用され得る他の有用な酸化剤は、BeaucageおよびIye r（上記)に記述されている。本発明で使用する硫化剤には、元素イオウ、チウラ ムジスルフィド（例えば、テトラエチルチウラムジスルフィド）、アシルジスル フィド（例えば、フェナシルジスルフィド）、ホスフィノチオニルジスルフィド (例えば、S-Tetra^TM)、および1,l,-ジオキソ-3H-l,2-ベンゾジチオール-3-オン が挙げられる。過酸化水素は、本発明の使用に好ましい酸化剤である。好ましい 実施態様では、過酸化水素l.5％、水3.5％、ピリジン20％およびTHF(75％)の溶 液を使用 する。 本発明の1実施態様では、サイクルの（最後の）酸化工程の後に残留している 未反応3'-アミノ基は、次の脱トリチル化工程の前に、適切なキャップ化剤でキ ャップ化され得、それらは、引き続くカップリングエ程に対して不活性とされる 。このキャップ化工程は、HPLCプロフィールを改良して精製をより容易にするだ けでなく、おそらく、未反応3'アミノ基を平衡状態での競合から取り除くことに より、生成物の全体的な収率を著しく改良する。本発明の方法で有用なキャップ 化試薬には、求電子性試薬、例えば、無水酢酸および無水イソ酪酸、酸クロライ ド（例えば、アダマンチルカルボニルクロライド、ピバロイルクロライドなど） 、イソチオシアネート、クロロホルメートなどが挙げられる。酸化の前に活性化 剤と組み合わせたホスホルアミダイト、および酸クロライド（例えば、ピバロイ ルクロライドまたはアダマンチルカルボニルクロライド)と組み合わせて使用さ れるH-ホスホネート塩（例えば、トリエチルアンモニウムイソプロピル−Ｈ−ホ スホネート)もまた、有用である。 モノマ一中の3'-アミノ保護基（例えば、トリチル）は、このアミノ基の、こ のモノマーのホスホルアミダイト基およびキャップ化剤との反応性を低くする。 しかし、この保護は、通常のホスホジエステル合成の、同様に保護された5'-ヒ ドロキシル基の場合ほどは完全ではない。この理由のために、ホスホジエステル 合成で最もよく使用される無水酢酸よりも、僅かに反応性が低いキャップ化剤（ 例えば、無水イソ酪酸)が好ましい。無水イソ酪酸または無水酢酸のいずれかは 、１：１：８（容量）の無水物:ルチジン：テトラヒドロフラン溶液として使用 され得、PE Applied Biosystems(Foster City、CA)から供給されたl-メチルイミ ダゾールのテトラヒドロフラン溶液と等しい部で使用され得る。 オリゴヌクレオチドは、固体支持体から切断され、そしてこの鎖アセンブリの 完結後、アンモニア水または上で引用した参考文献に記述のような他の手段を用 いて脱保護される。オリゴヌクレオチドは、その末端アミノ保護基(または、あ る場合には、ヒドロキシル保護基)を無傷のままで、支持体から切断され得る。 これは、トリチル保護基または他の保護基が、例えば、逆相またはイオン交換HP LCによる精製するのを補助するのに使用されるような状況では望ましい。しかし 、 トリチル保護基を使用して、支持体からの切断、脱保護、および精製後の酸処理 で除去される場合、脱保護されたホスホルアミデート結合は、望ましくない断片 化を受ける強い傾向にあるので、この段階では多大な注意を必要とする。 あるいは、末端アミノ保護基（例えば、トリチル）は、支持体からの切断前に 、酸で除去され得る。この場合には、ホスホルアミデート結合は、依然として保 護されており、断片化は回避される。次いで、このオリゴヌクレオチドは、支持 体から切断されて、上記のように脱保護される。このホスホルアミデートオリゴ ヌクレオチドは、イオン交換HPLC、逆相HPLCまたは他の手段により精製され得る 。 実施例１ 2'- デオキシ-3'-トリチルアミノチミジン- 5'- ホスホルアミダイトモノマーの調製 3'-（トリチル）アミノ-3'-デオキシチミジン-5'-(2-シアノエチルN,N-ジイソ プロピル)ホスホルアミダイト(4t)の合成をスキームＩに概説する。3'-アジド-5 '-0-(4-メトキシベンゾイル)-3'-ジオキシチミジン(lt)を、CzemeckiおよびVale ry，Synthesis、1991：239の方法により合成した。 スキームＩ 3'-（トリチル）アミノ-5'-(4-メトキシベンゾイル)-3'-デオキシチミジン（2 t）。3'-アジド-5'-0-(4-メトキシベンゾイル)-3'-ジオキシチミジン(lt)（10.0 g、24.9mmol)をエタノール(500mL)に溶解し、そして10％Pd/C(1.0g)の存在下に て、16時間にわたり、水素化(4.2・10⁵ Pa、60 psi H₂)によって還元した。引き 続いて、濾過によって触媒を除去し、そして真空下での溶媒蒸発し、92％収率(8 .6ｇ、22.9mmol)の対応する3'-アミンを得、これを、次の反応に直接使用した。 この5'-(4-メトキシベンゾイル)-3'-アミノ-3'-デオキシチミジン(8.6ｇ、22.9m mol)をピリジン(2×50mL)から共沸し、そして無水ピリジン(50mL)に溶解した。 この溶液に、トリエチルアミン(6.7lmL．48.lmmol)およびトリチルク 口ライド(7.0ｇ、25.2mmol)を添加した。この混合物を室温で２時間撹拌し、追 加のトリチルクロライド(1.9ｇ、6.9mmol)を添加し、反応物をさらに２時間撹拌 した。真空下で溶媒を除去し、粗生成物をシリカ(２〜５％Me0H/CH₂Cl₂)上で精 製して、90％収率(12.7ｇ、20.6mmol)の3'-（トリチル）アミノ-5'-(4-メトキシ ベンゾイル)-3'-デオキシチミジン(2t)を得た。 3'-（トリチル）アミノ-3'-デオキシチミジン(3t)。2t(30.lｇ、48.7mmol)を5 7:43のl,4-ジオキサン/Me0H(150mL)に溶解し、引き続いて、２MのNa0H水溶液(73 .lmL、146.2mmol)を添加することにより、その5'-0-アニソイル保護基を除去し た。室温で1.5時間撹拌した後、この反応混合物を、Dowex 50W-X8カチオン交換 樹脂(約150ｇの乾燥ピリジニウムH⁺-形状、1.6meq/ｇ)で中和した。一旦、そのp Hが中性となると(約10分間)、この樹脂を濾過し、CH₂Cl₂およびMe0Hで充分に洗 浄し、粗生成物を真空下で濃縮した。その残留物をEt0Ac(500mL)に再溶解し、そ して飽和NaHC0₃水溶液(2×250mL)、H₂0(250mL)および飽和NaCl水溶液(250mL)で 抽出した。Na₂SO₄で乾燥し、濾過した後、溶媒を真空下で除去し、得られた泡状 物を95：5のCH₂Cl₂/Me0H(300mL)に再溶解した。この溶液を、急速撹拌される１ ：１Et₂0/ヘキサン混合物(l250mL)にゆっくりと添加して、純粋な3'-（トリチル ）アミノ-3'-デオキシチミジン(3t)を90％収率(21.2ｇ、43.8mmol)で沈殿させた 。ホスホルアミダイトモノマーおよび/またはスクシニル化ヌクレオシドへの転 化は、以下の実施例５〜７で記述する。 実施例2 2'- デオキシ-3'-トリチルアミノシチジン-5'- ホスホルアミダイトモノマーの調製 N⁴-ベンゾイル-3'-（トリチル）アミノ-2',3'-ジデオキシシチジン-5'-(2-シ アノエチルN,N-ジイソプロピル)ホスホルアミダイト(4c)の合成を、スキームII で概説する。 スキームII 3'-アジド-5'-0-(tert-ブチルジメチルシリル)-2',3'-ジデオキシウリジン、 １du。2'-デオキシウリジン(11.４ｇ、50mmol)を、真空下で無水DMF(2×100mL) と共にエバポレートさせることにより、完全に乾燥させた。次いで、DMF(100mL) を添加し、続いて、トリエチルアミン(8.36mL，60mmol)、4-ジメチルアミノ ピリジン(0.31ｇ、2.5mmol)およびtert-ブチルジメチルシリルクロライド(8.29 ｇ、55.0mmol)を添加した。反応混合物を室温で１時間撹拌し、ジクロロメタン( 600mL)で希釈し、そしてH₂O(３×200mL)および飽和NaCl水溶液(200mL)で抽出し た。その有機層をNa₂SO₄で乾燥し、濾過し、そして真空下で濃縮した。得られた 残留物をシリカ上で精製(2〜10％MeOH/CH₂Cl₂)して、80％収率(13.7ｇ、40.0mmo l)の5'-0-(tert-ブチルジメチルシリル)-2'-デオキシウリジンを得た。トリフエ ニルホスフィン(16.8ｇ、64.0mmol)およびDMF(100mL)を添加し、この撹拌混合物 に、ジイソプロピルアゾジカルボキシレート(12.6mL、64.0mmol)のDMF(20mL)溶 液を添加した。室温で２時間撹拌した後、反応混合物を真空下で約30mLまで濃縮 し、そしてEt₂O(1200mL)中に注いだ。10分間の急速な撹拌後、所望の2,3'-アン ヒドロ-5'-0-(tert-ブチルジメチルシリル)-2'-デオキシウリジンが沈殿し始め た。得られた混合物を一晩冷蔵庫に入れて、沈殿物を濾過により集め、追加の冷 Et₂O(２×300mL)で洗浄し、そして真空下で乾燥して、白色の固形物として、90 ％収率(11.7ｇ、36.0mmol)の2,3'-アンヒドロ-5'-0-(tert-ブチルジメチルシリ ル)-2'-デオキシウリジンを得、これは、さらに精製しなかった。次いで、この2 ,3'-アンヒドロ-5'-0-(tert-ブチルジメチルシリル)-2'-デオキシウリジン(33.8 ｇ、104.2mmol)を、95〜100℃で48時間にわたって、DMF(300mL)中のLiN₃(7.65ｇ 、156.3mmol)と反応させた。次いで、得られた褐色で均一な混合物を室温まで冷 却し、真空下でオイルまで濃縮し、EtOAc(800mL)に溶解し、そしてH₂O(200mL)で 抽出した。水層をEtOAc(75mL)でもう２回抽出し、そして合わせた有機物をH₂O( ３×250mL)で洗浄し、そして飽和NaCl水溶液(250mL)で１回洗浄した。このEtOAc 溶液をNa₂SO₄で乾燥し、濾過し、そして真空下で濃縮して、褐色がかった泡状物 として、87％収率(33.2ｇ、90.3mmol)の3'-アジド-5'-0-(tert-ブチルジメチル シリル)-2',3'-ジデオキシウリジン（1du）を得、これを直接水素化に用いた。 3'-(トリチル)アミノ-5'-0-(tert-ブチルジメチルシリル)-2',3'-ジデオキシ ウリジン（2du）。粗製1du(33.2ｇ、90.3mmol)を２：１ EtOH/CH₂Cl₂(300mL)に 溶解し、そして10％Pd/C(3.0g)の存在下にて、18時間にわたり、水素化(4.2・10⁵ Pa、60 psi H₂)によって還元した。濾過および真空下での溶媒のエバポ レートにより、触媒を引き続いて除去して、定量収率(30.4ｇ、89.8mmol)の対応 する3'-アミンを得、これを、次の反応に直接使用した。この5'-0-(tert-ブチル ジメチルシリル)-3'-アミノ-2',3'-ジデオキシウリジン(30.4ｇ、89.8mmol)をピ リジン(２×300mL)から共沸し、そしてCH₂Cl₂(600mL)および無水ピリジン(70mL) の混合物に溶解した。この溶液に、トリエチルアミン(25.0mL、179.6mmol)およ びトリチルクロライド(35.0ｇ、125.7mmol)を添加し、反応混合物を室温で２時 間撹拌した。真空下で溶媒を除去し、そして粗製生成物をシリカ上で精製(１〜 ５％MeOH/CH₂Cl₂)して、85％収率(44.3ｇ、75.9mmol)の3'-（トリチル)アミノ-5 '-0-(tert-ブチルジメチルシリル)-2',3'-ジデオキシウリジン（2du）を得た。 N⁴-ベンゾイル-3'-(トリチル)アミノ-5'-0-(tert-ブチルジメチルシリル)-2', 3'-ジデオキシシチジン（2c）。0℃での無水アセトニトリル(125mL)中の1,2,4- トリアゾール(11.1ｇ，161.1 mmol)およびオキシ塩化リン(3.5mL、37.1mmol)の 撹拌混合物に、10分間にわたって、トリエチルアミン(22.5mL、161.1mmol)を滴 下した。この冷撹拌混合物に、アセトニトリル(50mL)溶液として、2du(9.4g、16 .1mmol)を添加した。この混合物を室温で２時間撹拌し、トリエチルアミン(30mL )およびH₂O(10mL)を添加して、反応をクエンチし、溶解を促進し、そして溶媒を 真空下で除去した。得られた褐色の固形物をCH₂Cl₂(250mL)に再溶解し、飽和NaH CO₃(3×150mL)水溶液、飽和NaCl水溶液で抽出し、Na₂SO₄で乾燥し、濾過し、そ して真空下で濃縮して、橙色がかった固形物として、定量収率(10.2ｇ、16.1mmo l)の3'-(トリチル)アミノ-5'-0-(tert-ブチルジメチルシリル)-2',3'-ジデオキ シ-4-(1,2,4-トリアゾール-1-イル)ウリジンを得た。この粗製物質を1,4-ジオキ サン(200mL)に溶解し、そして冷濃縮NH₄OH(50mL)を添加した。反応混合物を室温 で４時間撹拌し、そして真空下で濃縮して、ベージュ色の固形物として、定量収 率(9.4ｇ、16.1mmol)の3'-(トリチル)アミノ-5'-0-(tert-ブチルジメチルシリル )-2',3'-ジデオキシシチジンを得た。次いで、この粗製物質を無水ピリジン(2× 200mL)から共沸し、ピリジン(200mL)に再溶解し、この撹拌溶液に、0℃で、塩化 ベンゾイル(2.2mL、19.3mmol)を添加した。次いで、反応系を室温で16時間撹拌 し、外部から0℃まで冷却し、H₂O(40mL)で クエンチし、そして５分間撹拌した後、濃アンモニア水(40mL)を添加し、反応混 合物を0℃でさらに15分間撹拌した。溶媒を真空下で除去し、残留物をCH₂Cl₂(12 5mL)に再溶解し、そして飽和NaHCO₃水溶液(３×75mL)で抽出し、Na₂SO₄で乾燥し 、濾過し、そして真空下で濃縮した。この粗製物質をシリカ(１〜５％MeOH/CH₂C l₂)上で精製して、92％収率(10.2ｇ、14.8mmol)のN⁴-ベンゾイル-3'-(トリチル) アミノ-5'-0-(tert-ブチルジメチルシリル)-2',3'-ジデオキシシチジン（2c）を 得た。 N⁴-ベンゾイル-3'-(トリチル)アミノ-2',3'-ジデオキシシチジン（3c）。2c(5 .8ｇ、8.5mmol)を１：１CH₂Cl₂/ピリジン(25mL)に溶解し、そして16時間にわた って、Et₃N・3HF(6.9mL、42.6mmol)と反応させることにより、5'-TBDMS保護基を 除去した。反応混合物をCH₂Cl₂(200mL)で希釈し、そしてH₂O(２×50mL)および飽 和NaCl水溶液(50mL)で抽出した。有機層をNa₂SO₄で乾燥し、濾過し、そした溶媒 を真空下で除去した。粗製生成物をシリカ上で精製(３％MeOH/CH₂Cl₂)して、75 ％収率(3.7ｇ、6.4mmol)のN⁴-ベンゾイル-3'-(トリチル)アミノ-2',3'-ジデオキ シシチジン（3c）を得た。ホスホルアミダイトモノマーおよび/またはスクシニ ル化ヌクレオシドへの転化は、以下の実施例５〜７で記述する。 実施例３ 2'- デオキシ-3'-リチルアミノグアノシン- 5'- ホスホルアミダイトモノマーの調製 N²-イソブチリル-3'-(トリチル)アミノ-2',3-ジデオキシグアノシン-5'-(2-シ アノエチルN,N-ジイソプロピル)ホスホルアミダイト（4g）の合成を、スキームI IIで概説する。5'-0-ベンゾイル-N²-イソブチリル-2'-デオキシグアノシンおよ び3'-0-ベンゾイル-N²-イソブチリル-2'-デオキシキシログアノシンは、Reeseら 、J．Chem．Soc．Perkin Trans.I、1984：1263で先に記述のように、調製された 。 スキームIII 5'-O-(tert-ブチルジメチルシリル)-N²-イソブチリル-3'-アジド-2',3'-ジデ オキシグアノシン（1g）。3'-O-ベンゾイル-N²-イソブチリル-2'-デオキシグア ノシン(4.86ｇ、11.0mmol)のDMF(20mL)撹拌溶液に、トリエチルアミン(3.4mL、2 4.2mmol)、4-ジメチルアミノピリジン(54mg、0.44mmol)およびtert-ブチルジメ チルシリルクロライド(3.31ｇ、22.0mmol)を添加した。反応系を室温で２時間撹 拌し、メタノール(10mL)を添加し、そしてさらに５分間撹拌した後、反応混合物 を真空下で濃縮した。残留物をCH₂Cl₂(150mL)に再溶解し、H₂O(３×40mL)および 飽和NaCl水溶液(60mL)で洗浄した。有機層をNa₂SO₄で乾燥し、濾過し、そして真 空下で濃縮して、赤色がかった色の泡状物6.40ｇを得た。この粗製物質に、２M NaOHのあらかじめ冷却した(約５℃)ピリジン：MeOH：H₂O(65：30：５、44.0mL、 87.9mmol)溶液を添加した。反応混合物を氷浴で20分間撹拌し、そして１MHCl(97 mL)でpH７まで中和した。反応混合物を真空下で約50mLまで濃縮し、そしてCH₂Cl₂ (３×75mL)で抽出した。合わせた有機物を飽和NaCl水溶液(50mL)で洗浄し、Na₂ SO₄で乾燥し、濾過し、そして真空下で濃縮して、砂色の泡状物として、82％収 率(4.1ｇ、9.1 mmol)の5'-O-(tert-ブチルジメチルシリル)-N²-イソブチリル-2' -デオキシキシログアノシンを得、これを、さらに精製することなく、次の反応 で使用した。粗製5'-O-(tert-ブチルジメチルシリル)-N²-イソブチリル-2'-デオ キシキシログアノシン(47.3ｇ、104.7mmol)に、LiN₃(15.4ｇ、314.1mmol)、トリ フェニルホスフィン(41.2ｇ、157.1mmol)および無水DMF(1000mL)を添加した。ジ エチルアゾジカルボキシレート(24.7mL、157.1mmol)を添加し、そして反応混合 物を、アルゴン下にて、室温で５時間撹拌した。H₂O(20mL)を添加し、そして反 応混合物を真空下で濃縮した。残留物をEtOAc(1500mL)に溶解し、H₂O(3×1000mL )、飽和NaCl水溶液(1000mL)で洗浄し、Na₂SO₄で乾燥し、濾過し、そして真空下 で濃縮した。残留物をシリカ上で精製(１〜５％MeOH/CH₂Cl₂)したが、これによ り、100％を越える収率(112.7g)の不純5'-O-(tert-ブチルジメチルシリル)-N²- イソブチリル-3'-アジド-2',3'-ジデオキシグアノシン、1gを得た。この不純物 含有生成物はさらに精製せず、そして水素化に直接使用して、3'-アミンとして 精製した。 5'-O-(tert-ブチルジメチルシリル)-N²-イソブチリル-3'-(トリチル)アミノ- 2',3'-ジデオキシグアノシン（2g）。粗製化合物1g(49.9ｇ、104.7mmol)を(温) エタノール(1600mL)に溶解し、そして10％Pd/C(2.5ｇ)の存在下にて、室温で16 時間にわたり水素化した(4.2・10⁵Pa、60psi H₂)。触媒を濾過により除去し、溶 媒を真空下でエバポレートさせて、粗製5'-O-(tert-ブチルジメチルシリル)-N²- イソブチリル-3'-アミノ-2',3'-ジデオキシグアノシンを得、これを、シリカ上 で精製(２〜６％MeOH/CH₂Cl₂に次いで、１％Et₃N/６％MeOH/CH₂Cl₂)して、オフ ホワイト色の泡状物として、60％収率(28.5ｇ、63.2mmol)の純5'-O-(tert-ブチ ルジメチルシリル)-N²-イソブチリル-3'-アミノ-2',3'-ジデオキシグアノシンを 得た。3'-アミン(28.5ｇ、63.2mmol)を、ピリジン(500mL)中にて、室温で16時間 にわたり、トリエチルアミン(17.6mL、126.4mmol)およびトリチルクロライド(28 .2ｇ、101.1mmol)と反応させることにより、保護した。溶媒を真空下で除去し、 そして残留物をシリカ上で精製(１〜５％MeOH/CH₂Cl₂)して、定量収率(43.8ｇ、 63.2mmol)の5'-O-(tert-ブチルジメチルシリル)-N²-イソブチリル-3'-(トリチル )アミノ-2',3'-ジデオキシグアノシン（2g）を得た。 N²-イソブチリル-3'-(トリチル)アミノ-2',3'-ジデオキシグアノシン（3g）。 2g(5.9ｇ、8.5mmol)をCH₂Cl₂/ピリジン(25mL)に溶解し、そして16時間にわたっ て、Et₃N・3HF(6.9mL、42.6mmol)と反応させることにより、5'-TBDMS保護基を除 去した。反応混合物をCH₂Cl₂(200mL)で希釈し、そしてH₂O(２×50mL)および飽和 NaCl水溶液(50mL)で抽出した。有機層をNa₂SO₄で乾燥し、濾過し、そして溶媒を 真空下で除去した。粗製生成物をシリカ上で精製(２〜５％MeOH/CH₂Cl₂)して、7 3％収率(3.6ｇ、6.2mmol)のN²-イソブチリル-3'-(トリチル)アミノ-2',3'-ジデ オキシグアノシン、3gを得た。ホスホルアミダイトモノマーおよび/またはスク シニル化ヌクレオシドへの転化は、以下の実施例５〜７で記述する。 実施例４ 2'- デオキシ-3'-トリチルアミノアデノシン- 5'- ホスホルアミダイトモノマーの調製 N⁶-ベンゾイル-3'-(トリチル)アミノ-2',3'-ジデオキシアデノシン-5'-(2-シ アノエチルN,N-ジイソプロピル)ホスホルアミダイト（4a）の合成を、スキームI Vで概説する。N⁶-ベンゾイル-9-(5-O-ベンゾイル-2-デオキシ−β-D-スレオ-ペ ンタフラノシル)アデノシンは、Herdewijn、J．Org．Chem.、53：5050(1988)の 方法により、合成した。 スキームIV 5'-O-(ベンゾイル)-N⁶-ベンゾイル-3'-アジド-2',3'-ジデオキシアデノシン、 1a。N⁶-ベンゾイル-9-(5-O-ベンゾイル-2-デオキシ-β-D-スレオ-ペントフラノ シル)アデノシン(7.0ｇ、15.3mmol)、トリフェニルホスフィン(6.0ｇ、22.9mmol )およびLiN₃(2.8ｇ、56.4mmol)を、DMF(100mL)に溶解した。この撹拌混合物に、 ジエチルアゾジカルボキシレート(3.6mL，22.9mmol)を一度に添加し、 反応系を室温で2.5時間撹拌し、そして反応をH₂O(10mL)でクエンチした。溶媒を 真空下で除去し、残油をEtOAc(300mL)に再溶解し、そしてH₂O(２×200mL)および 飽和NaCl水溶液(200mL)で抽出した。有機層をNa₂SO₄で乾燥し、濾過し、そして 真空下で濃縮した。得られた残油をSiO₂上で精製(２〜５％MeOH/CH₂Cl₂)精製し て、琥珀色の泡状物として、5'-O-ベンゾイル-N⁶-ベンゾイル-3'-アジド-2',3'- ジデオキシアデノシン(1a)を得、これを、水素化に直接使用した。 N⁶-ベンゾイル-3'-(トリチル)アミノ-2',3'-ジデオキシアデノシン(3a)。粗製 1aを３：１ EtOH/CH₂Cl₂(200mL)に溶解し、そして10％Pd/C(0.7ｇ)の存在下にて 、18時間にわたり、水素化(4.2・10⁵ Pa、60psi H₂)によって還元した。濾過およ び真空下での溶媒のエバポレートにより、触媒を引き続いて除去して、57％(4.0 ｇ、8.7mmol)の対応する3'-アミンを得、これを、次の反応に直接使用した。5'- O-ベンゾイル-N⁶-ベンゾイル-3'-アミノ-2',3'-ジデオキシアデノシン(3.9ｇ、8 .5mmol)をCH₂Cl₂(50mL)に溶解し、トリエチルアミン(2.9mL、20.8mmol)を添加し 、続いて、トリチルクロライド(2.9ｇ、10.2mmol)を添加した。室温で1.5時間撹 拌した後、反応混合物をCH₂Cl₂(50mL)で希釈し、そしてH₂O(２×50mL)および飽 和NaCl水溶液(50mL)で抽出した。有機層をNa₂SO₄で乾燥し、濾過し、そして真空 下で濃縮して、粗製5'-O-ベンゾイル-N⁶-ベンゾイル-3'-(トリチル)アミノ-2',3 '-ジデオキシアデノシンを得、これを、5'-ベンゾイル保護基の加水分解に直接 使用した。粗製5'-O-ベンゾイル-N⁶-ベンゾイル-3'-(トリチル)アミノ-2',3'-ジ デオキシアデノシン(約6.0ｇ、8.5mmol)をTHF/MeOH(１：１、100mL)に溶解し、 そして０℃まで冷却した。この混合物に、あらかじめ冷却した２M NaOH水溶液(1 3.7ml、27.4mmol)を添加し、反応混合物を０℃で20分間撹拌した。この時点で、 反応は、約50％完結しただけと思われたので、追加の２M NaOH水溶液(10.0mL、2 0mmol)を添加した。０℃でさらに15分間撹拌した後、反応物を、Dowex 50W-X8カ チオン交換樹脂(約40ｇの乾燥ピリジニウムH⁺-形態、1.6meq/g)でpH６まで中和 した。樹脂を濾過し、そしてMeOHおよびTHFで充分に洗浄し、そして溶媒を真空 下で除去した。残留物をCH₂Cl₂(300mL)に再溶解し、そしてH₂O(150mL)、飽和NaH CO₃水溶液(２×150mL)、H₂O(150mL)および飽和NaCl水溶液(150mL)で抽出した。N a₂SO₄で乾燥した後、溶液を濾過 し、そして真空下で濃縮した。残留物をSiO₂上で精製(２〜３％MeOH/CH₂Cl₂)し て、白色の泡状物として、71％収率(3.6ｇ、6.0mmol)のN⁶-ベンゾイル-3'-(トリ チル)アミノ-2',3'-ジデオキシアデノシン（3a）を得た。ホスホルアミダイトモ ノマーおよび/またはスクシニル化ヌクレオシドへの転化は、以下の実施例５〜 ７で記述する。 実施例５ 3'- （トリチル）アミノ-2',3'-ジデオキシヌクレオシド- 5'-(2- シアノエチルN,N-ジイソプロピル)ホスホルアミダイト、 4a 、4c、4gおよび4tの調製 CH₂Cl₂(25mL)中の3'-(トリチル)アミノ-2',3'-ジデオキシヌクレオシド(3a、3 c、3gおよび3t)(CH₃CNからあらかじめ２回共沸させた)8.4mmolに、アルゴン下に て、N,N-ジイソプロピルエチルアミン2.0mL(11.8mmol)および2-シアノエチルN,N -ジイソプロピルクロロホスホルアミダイト2.1mL(9.4mmol)を添加した。15分間 撹拌した後、反応系をCH₂Cl₂で希釈し、そして飽和NaHCO₃水溶液および飽和NaCl 水溶液で抽出した。有機層を乾燥し(Na₂SO₄)、濾過し、そして真空下で濃縮した 。N⁶-ベンゾイル-3'-(トリチル)アミノ-2',3'-ジデオキシアデノシン-5'-(2-シ アノエチルN,N-ジイソプロピル)ホスホルアミダイト（4a）を、SiO₂上で精製(５ ％Et₃N/２％メタノール/トルエン)すると、純粋ホスホルアミダイト5.82ｇ(87.1 ％)が得られた。³¹P NMR(CD₃CN)δ148.6、149.2。N⁴-ベンゾイル-3'-(トリチル) アミノ-2',3'-ジデオキシシチジン-5'-(2-シアノエチルN,N-ジイソプロピル)ホ スホルアミダイト（4c）を、SiO₂上で精製(３％MeOH/５％Et₃N/トルエン)し、そ して純粋生成物5.58ｇ(86.0％)が得られた。³¹P NMR(CD₃CN)δ149.3、149.6。N² -イソブチリル-3'-(トリチル)アミノ-2',3'-ジデオキシグアノシン-5'-(2-シア ノエチルN,N-ジイソプロピル)ホスホルアミダイト（4g）を、アルゴン下にて、C H₂Cl₂(10mL)から、４℃にて、急速撹拌しているエチルエーテル(200mL)およびヘ キサン(200mL)に沈殿させて、水素ホスホンアミデート（phosphonamidate）不純 物（これは、この場合、カラムクロマトグラフィーでは除去できない)を除去し た。固形物を濾過し、ヘキサンで洗浄し、そ して真空下で乾燥した。この沈殿工程を繰り返し、そして得られた固形物をSiO₂ 上でさらに精製(10％Et₃N/CH₂Cl₂)すると、純粋なホスホルアミダイト生成物4.5 1ｇ(69％)が得られた。³¹P NMR(CD₃CN)δ148.7、149.4。3'-(トリチル)アミノ-3 '-デオキシチミジン-5'-(2-シアノエチルN,N-ジイソプロピル)ホスホルアミダイ ト（4t）をSiO₂上でさらに精製(２％Et₃N/CH₂Cl₂)すると、純粋なホスホルアミ ダイト4.06ｇ(70.7％)およびある種の混合画分が得られた。³¹P NMR(CD₃CN)δ14 9.4、149.5。 実施例６ 3'-( トリチル)アミノ-2',3'-ジデオキシヌクレオシド-5'- (2- シアノエチル-2,2,6,6,-テトラメチルピペリジン) ホスホルアミダイト、5a、5c、5gおよび5tの調製： ４℃まで冷却したCH₂Cl₂(25 mL)中の3'−(トリチル)アミノ-2',3'-ジデオキシ ヌクレオシド(3a、3c、3gおよび3t)(これは、CH₃CNからあらかじめ２回共沸させ た)8.4mmolに、アルゴン下にて、DBU(1.9mL，12.6mmol)、および2-シアノエチル 2,2,6,6,-テトラメチルピペリジンクロロホスホルアミダイトのCH₂Cl₂溶液5.2 m L(8.4mmol)(濃度＝1.626mmol/mL)を添加した。氷浴を取り除き、溶液を30〜60分 間撹拌した。分解を回避するために、粗製溶液を、精製用に、SiO₂カラム(5a、5 cおよび5tに対して３％MeOH/５％Et₃N/トルエン、および5gに対して10％Et₃N/CH₂ Cl₂)に直接付加した。いずれの場合にも、各生成物に対して示したように、さ らなる精製が必要であった。N⁶-ベンゾイル-3'-(トリチル)アミノ-2',3'-ジデオ キシアデノシン-5'-(2-シアノエチル2,2,6,6,-テトラメチルピペリジン)ホスホ ルアミダイト（5a）を、SiO₂(３％MeOH/５％Et₃N/トルエン)上で精製すると、純 粋ホスホルアミダイト5.21ｇ(74.3％)が得られた。³¹P NMR(CD₃CN)δ164.8、165 .4。N⁴-ベンゾイル-3'-(トリチル)アミノ-2',3'-ジデオキシシチジン-5'-(2-シ アノエチル2,2,6,6,-テトラメチルピペリジン)ホスホルアミダイト、5cを、SiO₂ 上で精製(３％MeOH/５％Et₃N/トルエン)すると、純粋生成物5.07ｇ(74.2％)およ びある種の混合画分が得られた。³¹P NMR(CD₃CN)δ164.8、165.7。N²-イソブチ リル-3'-(トリチル)アミノ-2',3'-ジデオキシ グアノシン-5'-(2-シアノエチル2,2,6,6,-テトラメチルピペリジン)ホスホルア ミダイト（5g）を、アルゴン下にて、CH₂Cl₂(２mL)から、４℃にて、急速撹拌し ているエチルエーテル(40mL)およびヘキサン(40mL)中に沈殿させて、水素ホスホ ンアミデート不純物(これは、この場合、カラムクロマトグラフィーでは除去で きない)を除去した。固形物を濾過し、ヘキサンで洗浄し、そして真空下で乾燥 した。この沈殿工程を２回繰り返し、そして得られた固形物をSiO₂上でさらに精 製(10％Et₃N/CH₂Cl₂)すると、純粋なホスホルアミダイト生成物0.89ｇ(12.8％) が得られた。³¹P NMR(CD₃CN)δ165.2、165.5。3'-(トリチル)アミノ-3'-デオキ シチミジン-5'-(2-シアノエチル2,2,6,6,-テトラメチルピペリジン)ホスホルア ミダイト（5t）をSiO₂上で精製(５％MeOH/５％Et₃N/トルエン)すると、純粋なホ スホルアミダイト3.33ｇ(54.8％)が得られた。³¹P NMR(CD₃CN)δ165.3、166.1。 実施例７ 3'-( トリチル)アミノ-2',3'-ジデオキシヌクレオシド-5'- スクシニレート、6a、6cおよび6tの調製： CH₂Cl₂(５ml)中の3'-(トリチル)アミノ-2',3'-ジデオキシヌクレオシド(3t、3 cおよび3a)1.5mmolに、N,N-ジメチルアミノピリジン0.22ｇ(1.8mmol)を添加し、 次いで、無水コハク酸0.18g(1.8mmol)を添加した。室温で１時間撹拌した後、反 応系を、メタノール0.6mLの添加によりクエンチし、CH₂Cl₂で希釈し、そして冷1 0％クエン酸、水および飽和NaCl水溶液で抽出した。有機層を希釈し(Na₂SO₄)、 濾過し、そして濃縮して泡状物とした。N⁶-ベンゾイル-3'-(トリチル)アミノ-2' ,3'-ジデオキシアデノシン-5'-スクシニレート（6a）。収量1.15ｇ(100％)。N⁴- ベンゾイル-3'-(トリチル)アミノ-2',3'-ジデオキシシチジン-5'-スクシニレー ト、6c。収量0.77ｇ(76.3％)。3'-(トリチル)アミノ-3'-デオキシチミジン-5'- スクシニレート（6t）。収量0.82ｇ(94.0％)。 実施例８ 3'-( トリチル)アミノ-2',3'-ジデオキシヌクレオシド-5'- スクシニル付加(loaded)CPGの調製 N-メチルピロリジン５mLおよびDMSO５mL中の3'-(トリチル)アミノ-2',3'-ジデ オキシヌクレオシド-5'-スクシニレート(6a、6cまたは6t)１mmolおよび1-ヒドロ キシベンゾトリアゾール0.13ｇ(0.95mmol)に、N,N-ジイソプロピルエチルアミン 0.35mL(2.0mmol)を添加し、次いで、2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3, 3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート0.36ｇ(0.95mmol)を添加 した。溶液を５分間撹拌し、アミノプロピル-CPG(10.0ｇ)に添加し、そして振と う器に６時間置いた。CPGを濾過し、そしてDMF、メタノールおよびエチルエーテ ルで洗浄した。CPG上の未反応アミノ基を、30分間にわたって、標準的なABIキャ ップ化溶液を用いてアセチル化した。ヌクレオシド付加は、40.7umol^-1cm^-1のモ ル吸光係数を用いて、20％TFA/CHCl₃中にて、432nmにおけるトリチルアッセイで 測定した。Aについて38.6umol/ｇ、Cについて33.6umol/ｇそしてTについて29.0u mol/ｇであった。 実施例９ テトラゾール活性化平衡定数K ₁ の測定 反応式１で表わす平衡を、N⁶-ベンゾイル-3'-トリチルアミノ-デオキシアデノ シン-5'-(2-シアノエチルN,N-ジイソプロピル)ホスホルアミダイト、(4a、56.1m g、65.2μmol)を無水ジュウテリオ(deutero)アセトニトリル0.300mLに溶解させ 、そして0.5Mテトラゾールのアセトニトリル溶液0.300mLを添加することにより 、全て、アルゴン雰囲気下で研究した。溶液を、アルゴン下にて、NMR用試験管 に移した。２分後、図１で示す³¹P-NMRスペクトルを記録した。 スペクトルは、ホスホルアミダイトモノマー(143.07、143.72ppm)、テトラゾ リジル-アミダイト中間体(127.58ppm)、(テトラゾリジルアミダイト中間体を介 して)モノマーの一部の加水分解から得た水素ホスホネート(10.24、9.61ppm)、 および僅かな副反応物に対応する共鳴からなっている。これらの種の全積算は、 0.0993Mの初期ホスホルアミダイト濃度に等しいと推測され、平衡における濃度 は、個々の共鳴の相対的な積算から算出した。リンを含有せず、従って、スペク トルに現れない種の濃度は、以下のようにして計算した。ジイソプロピルアンモ ニウムテトラゾリドの平衡における濃度(0.0824M)は、ホスホルアミダイトモノ マーの初期濃度(0.0993M)−平衡濃度(0.0169M)に等しいと推測された。テトラゾ ールの平衡における濃度(0.0875M)は、初期テトラゾール濃度(0.2286M)−テトラ ゾリジルアミダイト中間体濃度(0.0587M)およびジイソプロピルアンモニウムテ トラゾリド濃度(0.0824M)の合計に等しいと推測された。活性化平衡定数K₁を、 以下のように算出した： 上記実験を、3'-トリチルアミノチミジン-5'-ジイソプロピルアミノホスホル アミダイトモノマー(4t)を用いて繰り返し、そしてK₁は、56.2M^-1であることが 分かった。実験を、3'-トリチルアミノチミジン-5-テトラメチルピペリジニルホ スホルアミダイトモノマー(5t)を用いて再び繰り返した。その31P-NMRスペクト ルを図２に表わす。 この実験の条件下では、平衡状態で残留しているテトラメチルピペリジニルホ スホルアミダイトモノマー(165.3、166.1ppmと予想される)は、検出されなかっ た。モノマーは、その濃度が少なくとも0.19mMなら、そのスペクトルのノイズレ ベル以上で検出可能のはずである。この情報から、この平衡のK₁は、少なくとも 5260 M^-1でなければならず、すなわち、ジイソプロピルアミノホスホルアミダイ トモノマーの値の93倍大きくなければならないことが計算できる。実験を、3'- トリチルアミノチミジン-5'-(N-イソプロピル-N-t-ブチル)ホスホルアミダイ トモノマーを用いて、もう１回繰り返した。テトラメチルピペリジニルホスホル アミダイトモノマーの場合と同様に、このモノマーは、平衡状態では、³¹P-NMR スペクトルでは検出できなかった。 実施例10 ジイソプロピルアミノホスホルアミダイトモノマーを用いた オリゴ-2'-デオキシヌクレオチドN3'→P5'ホスホルアミデートの １μmolスケールの合成 ABI 392 DNA合成機にて、1umolスケールで、オリゴヌクレオチドN3'→P5'ホス ホルアミデートを調製し、そして分取イオン交換クロマトグラフィーにより精製 した。合成は、カラム中にて、3'-(トリチル)アミノ-2',3'-ジデオキシヌクレオ シド-5'-スクシニル付加CPGを用いて、(市販の合成機でプログラムされている3' →5'方向ではなく)5'→3'方向で行う。3'-トリチルアミノ-5'-ジイソプロピルホ スホルアミダイトモノマーを、アセトニトリル中の0.1M溶液として調製した。活 性化溶液は、アセトニトリル中の0.5Mテトラゾールであった(PE Applied Biosys tems、Foster City、CA)。脱トリチル化溶液は、ジクロロメタン(DCM)中の３％ ジクロロ酢酸(DCA)であり、そして酸化溶液は、テトラヒドロフラン/ピリジン/ 水(75/20/２、v/v/v)溶液中の0.1Mヨウ素であった(PE Applied Biosystems、Fos ter City、CA)。 脱トリチル化に続いて、カップリング、酸化、カップリング、酸化の方策から なる反復合成サイクルを使用して、オリゴヌクレオチドN3'→P5'ホスホルアミデ ートを合成した。支持体結合ヌクレオシドの3'-アミンの脱トリチル化は、３％D CA/DCMを、GおよびAヌクレオシドについて40秒間、そしてTおよびCヌクレオシド について50秒間流すことにより、達成された。次いで、支持体結合3'-アミノヌ クレオシドを、10秒間アセトニトリル送達(delivery)送達/５秒間アルゴンフラ ッシュの組合せで６回洗浄した。アミンと5'-ホスホルアミダイト-3'-トリチル アミノヌクレオシドとのカップリングは、モノマー＋トラゾールおよびテトラゾ ール単独のカラムへの交互送達を、約10秒間、続いて５分間待機で用いることに より、達成された。モノマーは、カラムからアルゴンでフラッシュし、そし てヨウ素溶液を直ちに添加し、続いて、２分間待機させた。酸化が完結すると、 成長しつつある支持体結合オリゴマーを、20秒間アセトニトリル送達/５秒間ア ルゴンフラッシュの組合せで１回洗浄し、そして10秒間アセトニトリル送達/5秒 間アルゴンフラッシュの組合せで５回洗浄した。カップリングおよび酸化をもう １回繰り返し、続いて、脱トリチル化の前に、洗浄した。この手順を用いると、 各カップリング工程には、約15当量の(支持体結合ヌクレオシドの初期付加と比 較して)モノマーが使用され、従って、各合成サイクルには、約30当量のモノマ ーが使用される。 合成が完了すると、支持体結合3'-脱トリチル化オリゴヌクレオチドN3'→P5' ホスホルアミデートを送達し、そして濃アンモニア水中にて、55°で12時間にわ たって、塩基脱保護した。切断しそして脱保護したオリゴヌクレオチドN3'→P5' ホスホルアミデート溶液を、CPGから除去し、CPGを、アンモニア200μlで２回洗 浄した。全てのアンモニア洗浄液を合わせ、溶液を0.01M NaOHに緩衝化し、そし てアンモニアを真空下にて除去した。濾過に続いて、粗製オリゴヌクレオチドを 、分取アニオン交換カラム(Pharmacia MonoQ 10/10)で精製し、Sephadex G-25(P harmacia NAP-5)上で脱塩し、そして凍結乾燥した。 以下で挙げた配列を、本発明のホスホルアミダイトアミン交換方法か、または Atherton-Todd酸化性カップリングアプローチ(例えば、Letsingerらの米国特許 第5,476,925号に記述のもの)のいずれかを用いて、ABI 392合成機上で合成した 。結果を以下に表とし、そして図3aおよび3bに示すが、これらは、表で挙げた２ 種の混合塩基配列のイオン交換HPLC分離のクロマトグラムを示している。 １ Atherton-Todd酸化性カップリング方法により合成した配列は、3'-末端水 酸基を有しているのに対して、アミン交換方法により合成した配列は、3'-末端 アミノ基を有している。 実施例11 ジイソプロピルアミノホスホルアミダイトを用いた オリゴ-2'-デオキシヌクレオシドN3'→P5'ホスホルアミデートの １μmolスケールの合成 モノマー：カップリング/酸化と、カップリング/酸化/カップリング/酸化との比 較： 単一のカップリング/酸化工程の生成物収率に対する効果を、以下のようにし て、二重のカップリング/酸化工程（カップリング/酸化/カップリング/酸化）の それと比較した： 5'-AAC-ATG-GAG-AGC-GTC-3'(配列番号：７)の配列を、上記手順を使用し、ジイ ソプロピルアミノホスホルアミダイトモノマーを用いて合成し、そして、以下の 例 外以外は上記と同様の第二の合成と比較した：1)1サイクルあたり、(２回ではな く)単一のカップリング/酸化を使用した、そして2)モノマー溶液の濃度は、(0. １Mではなく)0.2Mであった。従って、単一のカップリング/酸化実験では、各合 成サイクルにて、約30当量のモノマーを使用したのに対して、カップリング/酸 化/カップリング/酸化実験では、２回のカップリング工程のそれぞれで、約15当 量のモノマーを使用し、１合成サイクルあたり、全体で同じ約30当量のモノマー を使用した。以下に示す結果は、２×（カップリング/酸化）方法を用いた効率 が改良されることを実証している。 実施例12 オリゴ-2'-デオキシヌクレオシドN3'→P5'ホスホルアミデートの １μmolスケールの合成：キャップなし、無水酢酸キャップ化および 無水イソ酪酸キャップ化の比較 5'-AAC-ATG-GAG-AGC-GTC-3'(配列番号：７)の配列を、上記手順を用いて、１ μmolスケールで３回合成したが、この合成のうちの２回では、各サイクルにお いて、最後の酸化工程の後であって脱トリチル化工程の前に、60秒間のキャップ 化工程を挿入した。これらの実験の１つでは、キャップ化試薬として、無水酢酸 /NMI(PE Applied Biosystems、Foster City、CA)を使用し、そして他方では、無 水イソ酪酸(１/１/８の無水イソ酪酸/2,6-ルチジン/THF)/NMI(PE Applied Biosy stems、Foster City，CA)を使用した。以下に示す結果は、キャップ化により、 収率および純度が改良されることを実証している。 実施例13オリゴ-2'-デオキシヌクレオシドN3'→P5'ホスホルアミデートの １μmolスケールの合成：I₂酸化およびH₂O₂酸化の比較 以下の配列を、上記手順を用いて、１μmolスケールで合成した。しかし、１ 組の実験では、ヨウ素酸化剤を、1.5％H₂O₂/3.5％H₂O/20％ピリジン/75％THFか らなる酸化剤で置き換えた。これらの実験では、キャップ化剤は使用しなかった 。 実施例14 オリゴ-2'-デオキシヌクレオシドN3'→P5'ホスホルアミデートの 10 μmolスケールの合成：ジイソプロピルおよび テトラメチルピペリジニルホスホルアミダイトモノマーの比較 10μmolスケールの合成について、以下の一般手順に従った：改良390Z ABI DN A合成機にて、10-umolスケールで、オリゴヌクレオチドN3'→P5'ホスホルアミデ ートを調製し、そして分取イオン交換クロマトグラフィーにより精製した。3'- トリチルアミノ5'-ホスホルアミダイトモノマーを、アセトニトリル中の0.1M溶 液として調製した。活性化剤は、アセトニトリル中の0.15Mテトラゾールであっ た。脱トリチル化溶液は、ジクロロメタン(DCM)中の３％ジクロロ酢酸(DCA)であ り、そして酸化溶液は、テトラヒドロフラン/ピリジン/水(75/20/２、v/v/v)中 の0.1Mヨウ素であった(PE Applied Biosystems、Foster City、CA)。 脱トリチル化に続いてカップリングおよび酸化からなるバッチ型反復合成サイ クルを使用して、オリゴヌクレオチドを合成した。個々のモジュールを記載し、 そして組み合わせて、完全な合成サイクルを形成した。さらに特定すると、この 合成は、10μmolの3'-(トリチル)アミノ-2',3'-ジデオキシヌクレオシド-5'-ス クシニル付加CPGを用いて、5'→3'方向で行われる。3'-アミンの脱トリチル化は 、反応容器の頂部への３％DCA/DCMの反復性の流れに続いて、３秒間の攪拌およ び排出を用いて達成された。酸暴露の全時間は、およそ２分間であった。次いで 、支持体結合3'-アミノヌクレオシドを、この反応容器の底部からおよび頂部か ら、攪拌および排水での一連の交互洗浄で10回洗浄した。得られた遊離のアミン （おそらく、そのジクロロ酢酸塩)と3'-(トリチル)アミノヌクレオシド-5'-ホス ホルアミダイトモノマーとのカップリングは、反応器へのモノマーの初期送達に 続いてテトラゾールの送達を用いて、行った。次いで、カップリング混合物を、 ５分間にわたり、攪拌した。反応容器を排出した後、ヨウ素溶液を直ちに添加し 、そして２分間にわたり、攪拌した。酸化溶液を排出し、そして支持体を、反応 容器の底部から、および頂部からの、攪拌および排出による一連の交互アセトニ トリル洗浄で10回洗浄した。 合成が完了すると、3'-脱保護オリゴヌクレオチドを支持体から切断し、そし て濃アンモニア水中にて、55°で12時間にわたって、脱保護した。溶液を0.01M NaOHに緩衝化し、そしてアンモニアを真空下にて除去した。濾過に続いて、粗製 溶液を、分取アニオン交換カラム(Pharmacia MonoQ 10/10)で精製し、脱塩し、 そして凍結乾燥した。 上記方法を使用して、種々の濃度(従って、種々の当量数)のテトラゾールと、 ジイソプロピルアミノホスホルアミダイトモノマーまたはテトラメチルピペリジ ンホスホルアミダイトモノマーのいずれかとを用いて、10μmolスケールで、5'- TT-3'ダイマーを合成した。結果は、効能の低いジイソプロピルアミノホスホル アミダイトモノマーよりも効能の高いテトラメチルピペリジニルホスホルアミダ イトモノマーを著しく少ない当量で用いて、ホスホルアミダイト合成を行い得る ことを、明らかに示している。 実施例15 オリゴ-2'-デオキシヌクレオシドN3'→P5'ホスホルアミデートの 10 μmolスケールの合成 上記手順を用い、そして以下の量のテトラメチルピペリジニルホスホルアミダ イトモノマーを用いて、10μmolスケールで、以下の配列を合成した。 １ このオリゴは、ダイマー上に残っている末端トリチル基を有する支持体か ら切断された。 ２ このHPLC収率は、塩基上のベンゾイル保護基の脱保護から形成したベンズ アミドに対して補正している。 実施例16 N⁴- ベンゾイル-2'-フルオロ-3'-(4-メトキシトリチル)アミノ- 2',3'- ジデオキシウリジン-5'- (2- シアノエチルN,N-ジイソプロピル)ホスホルアミダイト) 本発明の2'-フルオロヌクレオシドホスホルアミダイトモノマーは、スキーム ＶおよびVIで例示したように調製される。要約すると、リボヌクレオシドを5'- ヒドロキシル-保護-2',3'-アンヒドロキシルヌクレオシドに変換し、その後、2' ,3'-エポキシ環を、アジ化ナトリウムなどの試薬で処理することにより開環して 、5'ヒドロキシル-保護-3'-アジド-3'-デオキシアラビノヌクレオシドを形成す る。精製後、5'-ヒドロキシル-保護-3'-アジド-3'-デオキシアラビノヌクレオシ ドを、ジエチルアミノスルファトリフルオライド(DAST)などの試薬で処理するこ とにより、2'位置にてフッ素化し、その後、アジド基を還元して、3'-アミノを 得る。3'-アミノを適切に保護し、5'-ヒドロキシル保護基を遊離した後、ヌクレ オシドを、5'-酸素にてホスフィチル化して、粗製ホスホルアミダイトモノマー を得る。 スキームＶ スキームＶを参照すると、ウリジン３はメシル化され、次いで、文献に記載の 操作(例えば、Codington、J.F.；Fecher、R.；Fox、J.J．J．Am．Chem．Soc．19 60、82、2794-2803)に従って、安息香酸ナトリウムで処理することにより、2,2' -アンヒドロ環の形成を伴って、選択的にベンゾイル化された。これらの反応の 結果、69〜77％の全収率で、化合物７が得られた。他の文献方法(Codington、J. F.；Fecher,R.；Fox，J.J．J.Organic Chem．1962、27、163-167)により、2,3'- アンヒドロアラビノヌクレオシド７を、２段階で、2',3'-アンヒドロリキ ソウリジン８に変換した。これには、７を塩酸で処理して3'-メシル-5'-ベンゾ イルアラビノウリジンを形成することが関与しており、これは、水酸化アンモニ ウムで処理すると、閉環して、63〜77％の全収率で、リキソ-2',3'-エポキシド ８を形成する。次いで、また、刊行物の手順(Reichman、U.；Hollenberg,D.H.； Chu、C.K.；Watanabe、K.A.；Fox、J.J．J．Organic Chem．1976、41、2042-204 3)に従って、2',3'-アンヒドロリキソヌクレオシド８を、アジ化アンモニウムと 共に加熱する。文献での示唆とは反対に、この反応は、完全には立体選択的では なく、およそ2.5：１の比で、所望の5'-ベンゾイル-3'-アジドアラビノヌクレオ シド９およびその2'-アジド-2'-デオキシ位置異性体(regioisomer)9iのクロマト グラフィーで分割できない混合物を生成した。粗製アラビノヌクレオシド９をDA STでフッ素化して、2'-フルオロ-3'-アジドヌクレオシド10を得、次いで、触媒 により水素化して、2'-フルオロ-3'-アジドヌクレオシド11を得、これは、シリ カゲルクロマトグラフィーにより、その位置異性体から分離可能であった。3'- アミンのモノメトキシトリチル(MMT)基での保護に続いて、5'一脱ベンゾイル化 により、中間体13が生成し、5'-ホスフィチル化により、アンヒドロヌクレオシ ド８からの全収率22％で、所望のホスホルアミダイトの構築ブロック2uが生成し た。さらに特定すると、これらの工程は、以下のようにして行われた： 3'-O-メタンスルホニル-5'-O-ベンゾイル-2,2'-アンヒドロアラビノウリジン ７は、Codingtonら(上で引用した、J．Organic Chem．Soc.)の手順に従って、全 収率69〜77％で、３から２段階で調製された。 5'-O-ベンゾイル-2',3'-アンヒドロキシウリジン８は、Codingtonら(上で引用 した、J．Am．Chem.)の手順に従って、63〜77％の全収率で、７から２段階で調 製された。 3'-アジド-5'-O-ベンゾイル-3'-デオキシアラビノウリジン９は、Reichmanら( 上で引用した)の方法に従って、８および無水NH₄N₃から調製した(Obenland、C.O .；Mangold、D.J.；Marino、M.P．Inorg．Synth．1966、８、53-56に記述されて いる)が、うまく再結晶できなかった。質量収率は、98％以上であったが、NMRは 、位置異性体である2'-アジド-5'-O-ベンゾイル-2'-デオキシキシロウリジン、 9i(これは、シリカゲルTLCにより、所望の生成物と共に溶出した)が25〜35％で あることを示唆していた。主成分の¹H NMR ９： 2'-フルオロ-3'-アジド-5'-O-ベンゾイル-2',3'-ジデオキシウリジン10は、以 下のようにして調製された：無水CH₂Cl₂(30mL)中の粗製９(25％の9iを含有する) 5.0ｇ(13.4mmol)に、ジエチルアミノスルファトリフルオライド8.8mL(66.6mmol) を添加した。48時間撹拌した後、混合物をCH₂Cl₂(100mL)で希釈し、そして飽和N aHCO₃水溶液200mLに注いだ。気体の発生が終わったとき、CH₂Cl₂層を、新たなNa HCO₃溶液100mLで洗浄し、次いで、水(２×100mL)で洗浄した。CH₂Cl₂層を真空下 で濃縮し、フラッシュクロマトグラフィーにかけると、大部分がクロマトグラフ ィーでは分割できない異性体不純物である10ｉ(20％)を含有する生成物3.5ｇ(70 ％)が得られた。¹H NMR 主成分10： 2'-フルオロ-3'-アミノ-5'-O-ベンゾイル-2',3'-ジデオキシウリジン11は、以 下のようにして調製された：95％エタノール200mL中の粗製10(20％の10ｉ)3.5ｇ (9.3mmol)に、炭素上の10％パラジウム600mgを添加した。懸濁液を2.8・10⁵Pa(40 psi)で一晩水素化し、次いで、触媒を、濾過により除去した。溶媒を真空下にて 除去して、TLCにより分割可能な２種の化合物からなる淡黄色の固形物2.9 3ｇ(90％)を得た。フラッシュクロマトグラフィーにより、純白色の固形物とし て、所望生成物1.96ｇ(収率60％)を得た。質量スペクトル、FAB⁺、M＋H⁺は、350 .1152(計算値)、350.1152(実測値)であった。 2'-フルオロ-3'-(4-メトキシトリチル)アミノ-2',3'-ジデオキシウリジン12は 、以下のようにして調製された：無水ピリジン50mL中の11(1.0ｇ、2.9mmol)に、 4-メトキシトリチルクロライド1.0ｇ(3.2mmol)を添加した。混合物を一晩撹拌し 、飽和NaHCO₃水溶液５mLを添加し、そして混合物を、真空下でオイルまで濃縮し た。オイルを酢酸エチル125mLに溶解し、これを水(３×100mL)で洗浄し、そして 真空下で再濃縮して泡状物2.05ｇとした。 泡状物を、メタノール40mL、ジオキサン40mLおよび水10mLの混合物に溶解した 。NaOH(１ｇ、25mmol)を添加し、そして混合物を一晩撹拌した。溶液を真空下で 濃縮してシロップとし、これを酢酸エチル100mLに溶解し、そして水(３×100mL) で洗浄した。有機層の真空下での濃縮により、泡状物1.11ｇが得られ、これをフ ラッシュクロマトグラフィーにかけると、白色固形物1.05ｇ(76％)が得られた。 質量スペクトル、FAB⁺、M＋H⁺は、518.2091(計算値)、518.2076(実測値)であっ た。 N⁴-ベンゾイル-2'-フルオロ-3'-(4-メトキシトリチル)アミノ-2',3'-ジデオキ シウリジン5'-(2-シアノエチルN,N-ジイソプロピル)ホスホルアミダイト2u は、以下のようにして調製された：無水CH₂Cl₂(20mL)中の12(700mg、1.35mmol) に、ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド200mg(1.17mmol)および2-シアノ エチルN,N,N',N'-テトライソプロピルホスホロジアミダイト0.5mL(1.57mmol)を 添加した。混合物を３時間撹拌した後、溶媒を真空下で除去し、そして残留物を 、４mm板を用い、そしてCH₂Cl₂中の０〜３％メタノール、0.5％トリエチルアミ ンで溶出するChromatotron上で精製した。生成物を真空下で濃縮してオイルとし 、これを、CH₂Cl₂(10mL)に溶解し、そして急速撹拌ヘキサン100mLにゆっくりと 添加することにより、沈殿させた。上澄み液をデカントした後、生成物をP₂O₅で 真空乾燥して、白色粉末680mg(70％)を得た。質量スペクトル、FAB⁺、M＋H⁺は、 718.3170(計算値)、718.3194(実測値)てあった。 実施例17 N⁴- ベンゾイル-2'-フルオロ-3'-(4-メトキシトリチル)アミノ- 2',3'- ジデオキシシチジン 5'-(2- シアノエチルN,N-ジイソプロピル)ホスホルアミダイト 粗製中間体10を、以下のスキームVIで示すように、適切に保護したシチジンホ スホルアミダイト２cの調製に使用した。10のウラシル塩基は、DivakarおよびRe ese、J．Chem．Soc.、Perkin．Trans．１ 1982、1171-1176の方法を適用するこ とにより、シトシンに転化された。引き続く4-Nベンゾイル化および3'-アジドの アミノ基への還元により、化合物13が得られ、これは、シリカゲルクロマトグラ フィーにより、位置異性体から分離可能であった。3'-アミンのMMT基での保護に 続いて、選択的な5'-O-脱ベンゾイル化により、中間体15が生成した。引き続く5 '-ホスフィチル化により、アンヒドロヌクレオシド８を基準にした全収率10％で 、所望のホスホルアミダイト2cが生じる。 スキームVI さらに特定すると、これらの工程は、以下のようにして行った：N⁴,5'-O-ジべン ゾイル-2'-フルオロ-3'-アミノ-2',3−ジデオキシシチジン13は、以下のように して調製された：無水CH₃CN(50mL)中の粗製10(35％の10ｉを含有する)6.9ｇ(18. 4mL)に、1,2,4-トリアゾール11.7ｇ(169mmol)およびP0Cl₃(3.35mL、36.1mmol)の 無水CH₃CN(90mL)氷冷溶液を添加した。混合物を氷浴中で冷却し、そして無水ト リエチルアミン(23mL、165mmol)を添加し、次いで、反応系を、撹拌しながら、 室温まで暖めた。90分後、トリエチルアミン15mL(108mmol)および水４mLを添加 し、そして混合物を10分間撹拌した。溶媒を真空下で除去し、次いで、酢酸エチ ル250mLを添加すると、溶液のTLCは、出発物質と同じ移動度を有する蛍光中間体 を示した。 混合物を真空下で濃縮して泡状物6.7ｇとした。ジオキサン(100mL)および濃ア ンモニア水20mLを添加し、そして３時間後、混合物を真空下で濃縮して黄色ゲル とした。ゲルを酢酸エチル100mLに溶解し、そして水(３×200mL)で洗浄した。真 空下での濃縮およびP₂O₅での真空乾燥により、固形物5.4ｇを得、これは、シリ カゲルTLCにより、スポットを１個だけ与えた。¹⁹F NMRにより、有意のシグナル を２個だけ認めた。主成分：δ-192.8(ddd、J＝22.8、22.8、53.1Hz)；副成分: δ-200.7(ddd、J＝13.6、19.9、53.4Hz)。 無水ピリジン(100mL)を添加し、溶液を４℃まで冷却した。撹拌しながら、塩 化ベンゾイル(11.7mL，100mmol)を添加し、そして混合物を室温まで暖めた。２ 時間後、水5mLを添加し、そして溶媒を真空下で除去して、褐色のオイルを得、 これを酢酸エチル200mLに溶解し、水(３×200mL)で洗浄し、次いで、真空下で再 濃縮してオイル状泡状物とした。 エタノール(150mL)、および活性炭上の10％パラジウム２ｇを添加し、そして 混合物を2.8・10⁵Pa(40psi)Ｈ₂で一晩水素化した。TLCにより、２種の新規でゆっ くりと近接して移動する化合物の形成が示された。 触媒を濾過により除去し、そして濾液を真空下で濃縮して黄色のオイル状泡状 物とした。シリカゲルフラッシュクロマトグラフィー(500mLシリカ、CH₂Cl₂中の ０〜３％CH₃OHで溶出する)により、半純粋(semi-pure)生成物1.85ｇを得、これ を、CH₂Cl₂(10mL)に溶解した。固形物が急速に沈殿し、これを濾過により集めて 、新しいCH₂Cl₂で洗浄した。真空乾燥により、細かい白色結晶として、1.5gの生 成物13(９および9iからの収率11％)を得た。質量スペクトル、FAB⁺、M＋H⁺は、4 53.1574(計算値)、453.1574(実測値)であった。 N⁴,5'-O-ジベンゾイル-2'-フルオロ-3-(4-メトキシトリチル)アミノ-2',3'-ジ デオキシシチジン14は、以下のようにして調製された：無水ピリジン25mL中の13 (0.9ｇ、2.0mmol)に、4-メトキシトリチルクロライド0.86ｇ(2.8mmol)を 添加し、そして混合物を一晩撹拌した。反応系をH₂O(0.5mL)でクエンチし、そし て真空下で濃縮した。CH₂Cl₂(50mL)を添加し、そして飽和NaHCO₃水溶液50mLおよ び水(２×50mL)で洗浄した。溶媒を真空下で除去し、CH₂Cl₂(10mL)で置き換え、 そしてピペットで、急速撹拌ヘキサン/エーテル(1/1)80mL中に入れた。さらに２ 時間撹拌した後、生成物を濾過により集め、そして真空下にて乾燥して、白色粉 末として、生成物1.3ｇ(収率88％)を得た。質量スペクトル、FAB⁺、M+H⁺は、725 .2775(計算値)、725.2761(実測値)であった。 N⁴-ベンゾイル-2'-フルオロ-3'-(4-メトキシトリチル)アミノ-2',3'-ジデオキ シシチジン15は、以下のようにして調製された：氷浴で冷却したピリジン/メタ ノール/水(65/30/５)20mL中の14(1.3ｇ，1.75mL)に、ピリジン/メタノール/水(6 5/30/５)中の冷２M NaOH(10mL)を添加した。混合物を冷やして20分間撹拌 した。５分後、樹脂を濾過により除去し、そしてメタノールで洗浄した。合わせ た濾液および洗浄液を真空下で濃縮してオイルとし、これを酢酸エチル100mLに 溶解した。混合物を飽和NaHCO₃水溶液（100mL）および水(２×100mL)で洗浄した 。真空下で濃縮して泡状物とした後、生成物をCH₂Cl₂(10mL)に溶解し、そしてピ ペットで、急速撹拌ヘキサン/エーテル(２/１)中に入れた。生成物を濾過により 集め、そして真空下にて乾燥して、白色粉末として、生成物1.13ｇ(収率102％) を得た。質量スペクトル、FAB⁺、M＋H⁺は、753.1489(計算値)、753.1499(実測値 )であった。 N⁴-ベンゾイル-2'-フルオロ-3'-(4-メトキシトリチル)アミノ-2',3'-ジデオキ シシチジン5'-(2-シアノエチルN,N-ジイソプロピル)ホスホルアミダイト2cは、 以下のようにして調製された：無水CH₂Cl₂(25mL)中の15(970mg、1.56mmol)に、 ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド200mg(1.17mmol)および2-シアノエチ ルN,N,N',N'-テトライソプロピルホスホロジアミダイト1.0mL(3.15mmol)を添加 した。混合物を３時間撹拌した後、溶媒を真空下で除去し、そして残留物を、４ mm板を用いて、そしてCH₂Cl₂中の０〜1.5％メタノール、0.5％トリエチルアミン で溶出するChromatotron上で精製した。生成物を真空下で泡状物まで濃縮し、こ れを、CH₂Cl₂(10mL)に溶解し、そして急速撹拌ヘキサン40mLにゆっくりと添加す ることにより、沈殿させた。上澄み液をデカントした後、生成物をP₂O₅で真空乾 燥して、白色粉末880mg(69％)を得た。質量スペクトル、FAB⁺、M＋H⁺は、953.25 68(計算値)、953.2531(実測値)であった。 実施例18 N⁴- ベンゾイル-2'-フルオロ-3'-(4-メトキシトリチル)アミノ- 2',3'- ジデオキシシチジン-5'-スクシニル付加CPG 中間体15を5'-スクシニル化し、そして標準的な手順 (例えば、 )により、CPG固体支持体に付加した。さらに特定すると、N4-ベンゾイル-2'-フ ルオロ-3'-(4-メトキシトリチル)アミノ-2',3'-ジデオキシシチジン5'-スクシニ ル付加CPGは、以下のようにして調製された：無水CH₂Cl₂(２mL)中の15(100mg、0 .16mmol)に、無水コハク酸55mg(0.55mmol)およびジメチルアミノピリジン65mg(0 .53mmol)を添加した。混合物を２時間撹拌し、次いで、真空下でエバポレートし てオイルとした。オイルをCH₂Cl₂(20mL)に溶解し、飽和NaHCO₃水溶液20mLおよび 水(２×20mL)で洗浄し、次いで、真空下で再濃縮して泡状物とした。泡状物に、 DMSO/N-メチルピロリジン(1/1)中の0.4Mジイソプロピルエチルアミン１mL、およ びDMSO/N-メチルピロリジン(1/1)中の0.2M 1-ヒドロキシベンゾトリアゾール、0 .2M 2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキ サフルオロホスフェート0.7mLを添加した。３分後、混合物を、長鎖アルキルア ミノ-CPG(1.2g)を含有する注射器10mLに取り入れた。追加のDMSO(５mL)洗浄液も また、注射器に取り入れた。CPG-ヌクレオシド混合物を1.5時間混合し、次いで 、CPGを、５容量の無水アセトニトリルで洗浄した。未反応CPGアミノ基は、２分 間にわたって、標準的なキャップ化溶液(PE Applied Biosystems、Foster City 、CA)によりアセチル化した。CPGを、５容量のアセトニトリルおよび５容量のCH₂ Cl₂で再び洗浄した。ヌクレオシド付加量は、標準的なトリチルアッセイにより 、およそ５μmole/gと決定された。 実施例19 オリゴ-2'-ヌクレオチド N3' →P5'ホスホルアミデートの固相合成 オリゴ-2'-ヌクレオチドN3'->P5'ホスホルアミデートは、スキームＶおよびVI のホスホルアミダイトモノマーを用いて、固相支持体上で合成された。化合物22 〜25(表１)は、ホスホルアミダイトモノマーによって合成された。遊離MMT-カチ オンアッセイにより決定された平均カップリング効率は、１サイクルあたり単一 のカップリングで約94％であり、そして１合成サイクルあたり工程２の二重適用 では約96％であった。粗製オリゴマー合成の代表的なIE HPLCプロフィールを、 図４に示す。 均一変性したオリゴ-2'-ヌクレオチドN3'→P5'ホスホルアミデートは、以下の プロトコルを用いて、ABI 380B合成機上で、アミダイト移動反応により調製され た。 1）脱トリチル化、ジクロロメタン中の５％ジクロロ酢酸、１分間。 2）カップリング、0.1Mホスホルアミダイト2uまたは2c(それぞれ、スキームＶ またはVI)およびアセトニトリル中の0.45Mテトラゾール、３分間。 3）酸化、テトラヒドロフラン/ピリジン/水(10/10/1，v/v/v)中の0.1Ｍヨウ素 、１分間。 4）キャップ化、標準的なPE Applied Biosystems(Foster City、CA)キャップ 化溶液による未反応3'-アミノ基のアセチル化、30秒間。 サイクル内の化学工程に続いて、アセトニトリル洗浄、および乾燥アルゴンを 用いたフラッシング(0.2〜0.4分間)を行う。固体支持体からの切断および濃アン モニア水を用いた脱保護(１〜1.5時間、55℃)の後、オリゴヌクレオチドを、IE HPLCにより分析し精製した。オリゴヌクレオチドを、精製直後に、Pharmacia NA P-5またはNAP-10ゲル濾過カラム上で脱塩し、そして−18℃で、凍結保存または 凍結乾燥した。 5'-ホスホリル化オリゴヌクレオチドの調製は、スルホン誘導体化CPG(例えば 、Gryaznov、S.M.；Letsinger、R.L．Nucleic Acids Res．1993、21、1403-1408 )上で行った。 IE分析およびオリゴヌクレオチドの精製には、Dionex DX300またはDX500系を 用いた。粗製オリゴマーの分析および精製には、Pharmacia MonoQ 10/10カラム を使用し、10mM NaOH中の1.5M NaClを、１分間あたり２％の勾配で溶出した。他 の全てのIE HPLC分析には、10mM NaOH中の1.5M NaClを１分間あたり1.5％の勾配 で溶出するDionex NucleoPac PA100カラムを使用した。RP HPLCには、0.1M酢酸 トリエチルアンモニウム(pH7.0)中のアセトニトリルの１分間あたり１％の勾配 で、Waters HPLCシステムのHewlett Packard Hypersil ODS(５μカラム)を使用 した。 NMRスペクトルは、Bruker DRX-400分光計で記録された。化学シフトを、¹Hス ペクトル、¹⁹Fスペクトルおよび³¹Pスペクトルについて、それぞれ、TMS、CCl₃F およびH₃PO₄と比較して報告する。 薄層クロマトグラフィー(TLC)は、メタノール/ジクロロメタン溶出液を用いて 、Whatmanポリエステル裏打ちシリカゲル板上で行われた。 ダイマーdU^f _npTの0.17 OD₂₆₀の酸加水分解を、55℃で２時間にわたり、64％酢 酸25μL中で行い、そして反応混合物を、RP HPLCにより分析した。ダイマー(保 持時間(Rt)15.0分間)のおよそ83％を、加水分解して、主成分の5'-チミジル酸(R t 10.6分間)および2'-フルオロ-3'-アミノウリジン(Rt 11.2分間)に加水分解し 、真正な標準を用いた共注入により同定した。また、反応混合物中に約7.5％の チミジン(Rt 12.1分間)も見出された。 表１ オリゴヌクレオチドおよびそれらの二重鎖のT_m値 ａ すべての２'-デオキシ化合物；ｎｐ、ｆ、ｐおよびｎは、それぞれ、3'-N HP(O)(O-)0-5'ヌクレオシド間結合、2'-フッ素、5'-ホスフェート、および3'-ア ミンを表す。 ｂ Ｔｍは、３μＭのオリゴヌクレオチドで決定された；第１の値は、10mMリ ン酸ナトリウム、150mM塩化ナトリウム、pH7.04中で測定された；第２の値は、 さらに10mMの塩化マグネシウムを含む同様の緩衝液中で測定された；横棒は、測 定されなかったＴ_m ^Sについてである。 ｃ 相補的標的；実験１〜６についてポリ（dA）またはポリ（rA）、実験７， ８についてd(ATAAGGAAGAAGC)またはr(AUAAGGAAGAAGC)。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 フィーロン，カレン エル. アメリカ合衆国 カリフォルニア 94587, ユニオン シティ，レッドランズ ストリ ート 4339 (72)発明者 グリアズノフ，セルゲイ エム. アメリカ合衆国 カリフォルニア 94402, サン マテオ，ウェスト ベルビュー 138 (72)発明者 マッカーディー，サラ エヌ. アメリカ合衆国 カリフォルニア 94403, サン マテオ，シルバン アベニュー 347 (72)発明者 ネルソン，ジェフリー エス. アメリカ合衆国 カリフォルニア 94536, フレモント，トレス アベニュー 4375 (72)発明者 シュルツ，ロナルド ジー. アメリカ合衆国 カリフォルニア 94545, ヘイワード，ベイ センター プレイス 3832，リンクス セラピューティックス, インコーポレイテッド内

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．オリゴヌクレオチドN3'→P5'ホスホルアミデートを合成する方法であって、 以下の工程を包含する、方法： (a)固相支持体に結合した第一ヌクレオシドを提供する工程であって、該第一 ヌクレオシドが、保護3'-アミノ基を有する、工程； (b)該保護3'-アミノ基を脱保護して、遊離3'-アミノ基を形成する工程; (c)該遊離3'-アミノ基を3'-保護アミノヌクレオシド-5'-ホスホルアミダイト モノマーと反応させて、インターヌクレオシドN3'-P5'ホスホルアミダイト結合 を形成する工程；および (d)該結合を酸化する工程。 ２．前記反応工程および酸化工程を複数回繰り返す工程をさらに包含する、請求 項１に記載の方法。 ３．前記複数回が、２回以上４回以下である、請求項２に記載の方法。 ４．前記オリゴヌクレオチドN3'→P5'ホスホルアミデートが合成されるまで、工 程(b)〜(d)を繰り返す工程をさらに包含する、請求項３に記載の方法。 ５．前記3'-保護アミノヌクレオシド-5'-ホスホルアミダイトモノマーが、少な くとも10M^-1のテトラゾール活性化平衡定数を有する、請求項４に記載の方法。 ６．前記3'-保護アミノヌクレオシド-5'-ホスホルアミダイトモノマーと反応し ない前記遊離3'-アミノ基をキャップ化する工程をさらに包含する、請求項５に 記載の方法。 ７．前記3'-保護アミノヌクレオシド-5'-ホスホルアミダイトモノマーが、少な くとも100M^-1のテトラゾール活性化平衡定数を有する、請求項６に記載の方法。 ８．前記3'-保護アミノヌクレオシド-5'-ホスホルアミダイトモノマーが、少な くとも10のpK_aを有するホスホルアミダイトアミノ基を有する、請求項７に記載 の方法。 ９．前記3'-保護アミノヌクレオシド-5'-ホスホルアミダイトモノマーが、次式 により定義される、請求項８に記載の方法：ここで、 Bは、ピリミジン、プリン、またはそれらのアナログである； R¹は、ホスフェート保護基である； Wは、-NHR²-または-OR⁷のいずれかであり、ここで、R²は、アミノ保護基であ り、そしてR⁷は、ヒドロキシル保護基である； R³は、水素、ヒドロキシル、フルオロまたは-OR'であり、ここで、R'は、１個 〜３個の炭素原子を有するアルキル、またはヒドロキシル保護基である；そして R⁴およびR⁵は、それらが結合した窒素と一緒になって、炭素、酸素、イオウお よび窒素からなる群から選択される40個までの原子を有するアルキルアミノ脱離 基またはアリールアミノ脱離基を形成する。 10．R³が、水素であり、そしてR⁴およびR⁵が、独立して、合計で６個〜20個の炭 素原子を有するアルキル、アラルキル、シクロアルキルまたはシクロアルキルア ルキルである、請求項９に記載の方法。 11．前記反応工程が、前記3'-保護アミノヌクレオシド-5'-ホスホルアミダイト モノマーを求核性触媒で処理して、反応性中間体を形成する工程をさらに包含す る、請求項10に記載の方法。 12．前記求核性触媒が、テトラゾール活性化剤である、請求項11に記載の方法。 13．前記酸化工程が、前記結合を、過酸化水素およびヨウ素からなる群から選択 される酸化剤で処理する工程をさらに包含する、請求項12に記載の方法。 14．R³が、水素であり、そしてR⁴およびR⁵が、一緒になって、その主鎖に12個ま での炭素原子を含有し全体で４個〜20個の炭素原子を含有するアルキレン鎖を形 成し、該鎖の両方の末端原子価結合は、R⁴およびR⁵が結合した窒素原子に結合し ている、請求項９に記載の方法。 15．前記反応工程が、前記3'-保護アミノヌクレオシド-5'-ホスホルアミダイト モノマーを求核性触媒で処理して、反応性中間体を形成する工程をさらに包含す る、請求項14に記載の方法。 16．前記求核性触媒が、テトラゾール活性化剤である、請求項15に記載の方法。 17．前記酸化工程が、前記結合を、過酸化水素およびヨウ素からなる群から選択 される酸化剤で処理する工程をさらに包含する、請求項16に記載の方法。 18．R³が、水素であり、そしてR⁴およびR⁵が、一緒になって、それらが結合した 窒素と共に、その主鎖に10個までの炭素原子またはヘテロ原子を有し、かつ全体 で４個〜20個の炭素原子またはヘテロ原子を有する飽和窒素複素環を形成し、そ の結果、R⁴およびR⁵が、一緒になって、それらが結合した窒素原子と共に、窒素 、酸素およびイオウからなる群から選択される３個までのヘテロ原子を含有する 、請求項９に記載の方法。 19．前記反応工程が、前記3'-保護アミノヌクレオシド-5'-ホスホルアミダイト モノマーを求核性触媒で処理して、反応性中間体を形成する工程をさらに包含す る、請求項18に記載の方法。 20．前記求核性触媒が、テトラゾール活性化剤である、請求項19に記載の方法。 21．前記酸化工程が、前記結合を、過酸化水素およびヨウ素からなる群から選択 される酸化剤で処理する工程をさらに包含する、一請求項20に記載の方法。 22．前記3'-保護アミノヌクレオシド-5'-ホスホルアミダイトモノマーが、少な くとも10のpK_aを有するホスホルアミダイトアミノ基を有する、請求項４に記載 の方法。 23．前記3'-保護アミノヌクレオシド-5'-ホスホルアミダイトモノマーが、少な くとも10M^-1のテトラゾール活性化平衡定数を有する、請求項22に記載の方法。 24．前記3'-保護アミノヌクレオシド-5'-ホスホルアミダイトモノマーと反応し ない前記遊離3'-アミノ基をキャップ化する工程をさらに包含する、請求項23に 記載の方法。 25．前記3'-保護アミノヌクレオシド-5'-ホスホルアミダイトモノマーが、少な くとも100M^-1のテトラゾール活性化平衡定数K,を有する、請求項24に記載の方法 。 26．前記反応工程が、前記3'-保護アミノヌクレオシド-5'-ホスホルアミダイト モノマーを求核性触媒で処理して、反応性中間体を形成する工程をさらに包含す る、請求項25に記載の方法。 27．前記求核性触媒が、テトラゾール活性化剤である、請求項26に記載の方法。 28．前記酸化工程が、前記結合を、過酸化水素およびヨウ素からなる群から選択 される酸化剤で処理する工程をさらに包含する、請求項27に記載の方法。 29．前記オリゴヌクレオチドN3'→P5'ホスホルアミデートが合成されるまで、工 程(b)〜(d)を繰り返す工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。 30．前記3'-保護アミノヌクレオシド-5'-ホスホルアミダイトモノマーが、少な くとも10のpK_aを有する立体障害ホスホルアミダイトアミノ基を有する、請求項2 9に記載の方法。 31．前記3'-保護アミノヌクレオシド-5'-ホスホルアミダイトモノマーと反応し ない前記遊離3'-アミノ基をキャップ化する工程をさらに包含する、請求項30に 記載の方法。 32．前記立体障害ホスホルアミダイトアミノ基が、６個〜20個の炭素原子を有す るアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、シクロアルキルアミノ、ジシクロアルキ ルアミノまたはアラルキルアミノである、請求項31に記載の方法。 33．前記反応工程が、前記3'-保護アミノヌクレオシド-5'-ホスホルアミダイト モノマーを求核性触媒で処理して、反応性中間体を形成する工程をさらに包含す る、請求項32に記載の方法。 34．前記求核性触媒が、テトラゾール活性化剤である、請求項33に記載の方法。 35．前記3'-保護アミノヌクレオシド-5'-ホスホルアミダイトモノマーが、少な くとも100M^-1のテトラゾール活性化平衡定数を有する、請求項34に記載の方法。 36．前記酸化工程が、前記結合を、過酸化水素およびヨウ素からなる群から選択 される酸化剤で処理する工程をさらに包含する、請求項35に記載の方法。 37．次式のオリゴヌクレオチドを合成する方法：ここで、Bは、プリンまたはピリミジンまたはそれらのアナログである；Xは、酸 素またはイオウである；R³は、水素、フルオロまたはヒドロキシルである；R⁶は 、アミノまたはヒドロキシルである；そしてZは、水素、アルカリ金属またはア ミンカチオンである；そしてｎは、少なくとも１である；該方法は、以下の工程 を包含する： (a)固相支持体に結合した第一ヌクレオシドを提供する工程であって、該第一 ヌクレオシドが、保護3'-アミノ基を有する、工程； (b)該保護3'-アミノ基を脱保護して、遊離3'-アミノ基を形成する工程； (c)該遊離3'-アミノ基を、求核性触媒の存在下にて、3'-保護アミノヌクレオ シド-5'-ホスホルアミダイトモノマーと反応させて、インターヌクレオシドN3' −P5'ホスホルアミダイト結合を形成する工程； (d)該結合を酸化する工程；および (e)前記オリゴヌクレオチドが合成されるまで、工程(b)〜(d)を繰り返す工程 。 38．前記3'-保護アミノヌクレオシド-5'-ホスホルアミダイトモノマーと反応し ない前記遊離3'-アミノ基をキャップ化する工程をさらに包含する、請求項37に 記載の方法。 39．前記3'-保護アミノヌクレオシド-5'-ホスホルアミダイトモノマーが、少な くとも10のpK_aを有する立体障害ホスホルアミダイトアミノ基を有する、請求項3 8に記載の方法。 40．前記工程(b)〜(d)の各サイクル中に、前記工程(c)および(d)を複数回繰り返 す工程をさらに包含する、請求項39に記載の方法。 41．前記工程(c)および(d)が、前記工程(b)〜(d)の各サイクル中に、２回繰り返 される、請求項40に記載の方法。 42．前記3'-保護アミノヌクレオシド-5'-ホスホルアミダイトモノマーが、以下 の形態である、請求項41に記載の方法： ここで、 Bは、ピリミジン、プリン、またはそれらのアナログである； R¹は、ホスフェート保護基である； Wは、-NHR²-または-OR⁷のいずれかであり、ここで、R²は、アミノ保護基であ り、そしてR⁷は、ヒドロキシル保護基である； R³は、水素、ヒドロキシル、フルオロまたは-OR'であり、ここで、R'は、１個 〜３個の炭素原子を有するアルキル、またはヒドロキシル保護基である：そして R⁴およびR⁵は、それらが結合した窒素と一緒になって、炭素、酸素、イオウお よび窒素からなる群から選択される40個までの原子を有するアルキルアミノ脱離 基またはアリールアミノ脱離基を形成する。 43．R³が、水素であり、前記求核性触媒が、テトラゾール活性化剤であり、そし てR⁴およびR⁵が、独立して、全体で６個〜20個の炭素原子を有するアルキル、ア ラルキル、シクロアルキルまたはシクロアルキルアルキルである、請求項42に 記載の方法。 44．前記酸化工程が、前記結合を、ヨウ素、塩素、ヒドロペルオキシド、過酸、 混合アシルスルフィン酸無水物、過酸化物、オゾン、元素イオウ、チウラムジス ルフィド、アシルジスルフィド、ホスフィノチオニルジスルフィドおよび1,1,- ジオキソ-3H-1,2-ベンゾジチオール-3-オンからなる群から選択される酸化剤で 処理する工程をさらに包含する、請求項43に記載の方法。 45．R¹が、メチル、β-シアノエチルまたは4-ニトロフェニルエチルであり、R² が、トリフェニルメチルであり、そしてｎが、１〜50の範囲である、請求項44に 記載の方法。 46．R³が、水素であり、そしてR⁴およびR⁵が、一緒になって、その主鎖に６個ま での炭素原子を有し、かつ全体で４個〜12個の炭素原子を有するアルキレン鎖を 形成し、該鎖の両方の末端原子価結合は、R⁴およびR⁵が結合した窒素原子に結合 している、請求項42に記載の方法。 47．前記求核性触媒が、テトラゾール活性化剤であり、R¹が、メチル、β-シア ノエチルまたは4-ニトロフェニルエチルであり、R²が、トリフェニルメチルであ り、ｎが、１〜50の範囲であり；そして、前記酸化工程が、前記結合を、ヨウ素 、塩素、ヒドロペルオキシド、過酸、混合アシルスルフィン酸無水物、過酸化物 、オゾン、元素イオウ、チウラムジスルフィド、アシルジスルフィド、ホスフィ ノチオニルジスルフィドおよび1,1,-ジオキソ-3H-1,2-ベンゾジチオール-3-オン からなる群から選択される酸化剤で処理する工程をさらに包含する、請求項46に 記載の方法。 48．R³が、水素であり、そしてR⁴およびR⁵が、一緒になって、それらが結合した 窒素と共に、その主鎖に10個までの炭素原子またはヘテロ原子を有し、かつ全体 で４個〜20個の炭素原子またはヘテロ原子を有する飽和窒素複素環を形成し、 その結果、R⁴およびR⁵が、一緒になって、それらが結合した窒素原子と共に、窒 素、酸素およびイオウからなる群から選択した３個までのヘテロ原子を含有する 、請求項42に記載の方法。 49．前記求核性触媒が、テトラゾール活性化剤であり、そして前記酸化工程が、 前記結合を、ヨウ素、塩素、ヒドロペルオキシド、過酸、混合アシルスルフィン 酸無水物、過酸化物、オゾン、元素イオウ、チウラムジスルフィド、アシルジス ルフィド、ホスフィノチオニルジスルフィドおよび1,1,-ジオキソ-3H-1,2-ベン ゾジチオール-3-オンからなる群から選択した酸化剤で処理する工程をさらに包 含する、請求項48に記載の方法。 50．R¹が、メチル、β-シアノエチルまたは4-ニトロフエニルエチルであり、R² が、トリフェニルメチルであり、そしてｎが、１〜50の範囲である、請求項49に 記載の方法。 51．次式の化合物： ここで、 Bは、ピリミジン、プリン、またはそれらのアナログである； R¹は、ホスフェート保護基である； Wは、-NHR²-または-OR⁷のいずれかであり、ここで、R²は、アミノ保護基であ り、そしてR⁷は、ヒドロキシル保護基である； R³は、水素、ヒドロキシル、フルオロまたは-OR'であり、ここで、R'は、１個 〜３個の炭素原子を有するアルキル、またはヒドロキシル保護基である；そし て R⁴およびR⁵は、それらが結合した窒素と一緒になって、炭素、酸素、イオウお よび窒素からなる群から選択される40個までの原子を有するアルキルアミノ脱離 基またはアリールアミノ脱離基を形成する； ただし、以下の化合物は除く： 上記式を有する化合物であって、ここで、 Bが、N⁶-ベンゾイルアデニンまたはチミンである； R¹が、トリメチルシリルである； Wが、0-4,4'-ジメトキシトリチルである； R³が、水素である；そして R⁴およびR⁵が各々、イソプロピルである； 上記式の化合物であって、ここで、 Bが、ジメチルホルムアミドで保護されたアデニン、イソブチリルで保護さ れたシトシン、またはチミンである； R¹は、β-シアノエチルである； Wは、0-ジメトキシトリチルである； R³は、水素である；そして R⁴およびR⁵は各々、イソプロピルである。 52．R³が、水素であり；そしてR⁴およびR⁵が、独立して、合計で６個〜20個の炭 素原子を有するアルキル、アラルキル、シクロアルキルまたはシクロアルキルア ルキルである、請求項51に記載の化合物。 53．R¹が、メチル、β-シアノエチルまたは4-ニトロフェニルエチルであり、R² が、トリフェニルメチルであり、R⁷が、ジ-p-アニシルフェニルメチルであり、 そしてR⁴およびR⁵が、独立して、イソプロピル、sec-ブチル、イソブチル、t-ブ チル、シクロヘキシルまたは2-エチルヘキシルである、請求項51に記載の化合物 。 54．R³が、水素であり、そしてR⁴およびR⁵が、一緒になって、その主鎖に６個ま での炭素原子を有し、かつ全体で４個〜12個の炭素原子を有するアルキレン鎖を 形成し、該鎖の両方の末端原子価結合が、R⁴およびR⁵が結合した窒素原子に結合 している、請求項51に記載の化合物。 55．R³が、水素であり、そしてR⁴およびR⁵が、一緒になって、それらが結合した 窒素と共に、その主鎖に10個までの炭素原子またはヘテロ原子を有し、かつ全体 で４個〜20個の炭素原子またはヘテロ原子を有する飽和窒素複素環を形成し、そ の結果、R⁴およびR⁵が、一緒になって、それらが結合した窒素原子と共に、窒素 、酸素およびイオウからなる群から選択される３個までのヘテロ原子を含有する 、請求項51に記載の化合物。 56．R¹が、メチル、β-シアノエチルまたは4-ニトロフェニルエチルであり、R² が、トリフェニルメチルであり、そしてR⁴およびR⁵が、一緒になって、それらが 結合した窒素原子と共に、ジメチルピペリジニル（dimethylpipiridinyl）、ピ ロリジニル、ジメチルモルホリノ、テトラメチルモルホリノ、ジメチルピロリジ ニル、テトラメチルピロリジニルまたはテトラメチルピペリジニルとなる、請求 項55に記載の化合物。 57．固相支持体上でオリゴヌクレオチドN3'→P5'ホスホルアミデートを合成する 方法であって、以下の工程を包含する、方法： ホスホルアミダイトアミノ基を有する3'-保護アミノヌクレオシド-5'-ホスホ ルアミダイトモノマーを提供する工程；および 該モノマーのホスホルアミダイトアミノ基を該オリゴヌクレオチドN3'→P5'ホ スホルアミデートの3'-第一級アミノ基で交換することにより、該3'-保護アミノ ヌクレオシド-5'-ホスホルアミダイトモノマーを、該オリゴヌクレオチドN3'→P 5'ホスホルアミデートの該3'-第一級アミノ基とカップリングする工程。 58．前記3'-保護アミノヌクレオシド-5'-ホスホルアミダイトモノマーの前記ホ スホルアミダイトアミノ基が、少なくとも10のpK_aを有する、請求項57に記載の 方法。 59．前記カップリング工程が、N3'→P5'ホスホルアミダイト結合の形成をさらに 包含する、請求項58に記載の方法。 60．前記N3'→P5'ホスホルアミダイト結合を酸化して、N3'→P5'ホスホルアミデ ート結合またはN3'→P5'ホスホロチオアミデート結合を形成する工程をさらに包 含する、請求項59に記載の方法。 61．前記3'−保護アミノヌクレオシド-5'-ホスホルアミダイトモノマーが、少な くとも100M^-1のテトラゾール活性化平衡定数を有する、請求項60に記載の方法。 62．前記カップリング工程および酸化工程を複数回繰り返す工程をさらに包含す る、請求項61に記載の方法。 63．前記複数回が２回である、請求項62に記載の方法。 64．前記3'-保護アミノヌクレオシド-5'-ホスホルアミダイトモノマーとカップ リングしない前記3'-第一級アミノ基をキャップ化する工程をさらに包含する、 請求項63に記載の方法。