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CN120842203B - 特异性检测shp2的近红外荧光探针的制备方法和应用 - Google Patents

特异性检测shp2的近红外荧光探针的制备方法和应用

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CN120842203B
CN120842203B CN202511365913.8A CN202511365913A CN120842203B CN 120842203 B CN120842203 B CN 120842203B CN 202511365913 A CN202511365913 A CN 202511365913A CN 120842203 B CN120842203 B CN 120842203B
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near infrared
fluorescent probe
infrared fluorescent
shp2
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Abstract

本发明属于肿瘤细胞光学成像技术领域，具体涉及特异性检测SHP2的近红外荧光探针的制备方法和应用。所述近红外荧光探针具有如I所示的结构，其中，R为二氰基异佛尔酮类荧光团或二氰基亚甲基‑4H‑吡喃类荧光团。本发明的探针结构新颖，对SHP2蛋白的结合亲和力强，具有良好的荧光特性，且反应时间快、专属性强，可以特异性识别SHP2蛋白。本发明的近红外荧光探针可以用于SHP2蛋白高表达的肿瘤细胞的标记。本发明探针原料便宜易得，反应步骤简单，后处理过程简便。。

Description

特异性检测SHP2的近红外荧光探针的制备方法和应用
技术领域
本发明属于肿瘤细胞光学成像技术领域，具体涉及特异性检测SHP2的近红外荧光探针的制备方法和应用。
背景技术
蛋白酪氨酸磷酸酶，英文全称为Protein tyrosine phosphatase，缩写为PTP，含Src同源2结构域蛋白酪氨酸磷酸酶，英文全称为Src homology 2-containing proteintyrosine phosphatase 2，缩写为SHP2，其由原癌基因PTPN11编码，是一种首次在细胞质中发现的致癌非受体蛋白酪氨酸磷酸酶。SHP2在受体酪氨酸激酶的招募下驱动细胞信号传导并参与多种致癌信号级联，正向调节由生长因子、细胞因子和激素激活的细胞信号通路，促进细胞生长、运动、分化和存活，与其他能催化酪氨酸磷酸化的蛋白酪氨酸激酶共同调节机体内多种信号通路的信号传导。
SHP2能够调节Ras-Raf-MAPK、PI3K-Akt和JAK-STAT等多种癌细胞信号通路，参与细胞增殖、分化、存活和凋亡，与肿瘤生长、转移和耐药密切相关。有研究发现，乳腺癌、胃癌、肺癌、肝癌、前列腺癌和宫颈癌等几种癌症都与SHP2过表达有关。SHP2可诱导癌症的起始、进展和转移，表明其具有癌蛋白的作用。SHP2的过表达已被视为一种预后和预测生物标志物。通过分析肿瘤形成过程中的SHP2的表达水平，有助于癌症的早期临床诊断。因此开发特异性检测SHP2的有效工具，建立一种靶向SHP2的检测系统，对于癌症的诊断和治疗起着十分重要的作用。
荧光成像技术可实现高灵敏度和高时空分辨率的无创实时成像，在临床前和基础研究中发挥着不可或缺的作用，是疾病早期诊断和后续治疗的有力工具。为了提高荧光成像的准确性和灵敏度，扩大光学成像的应用范围，研究人员不断寻求开发新的化学工具，以检测越来越多的与疾病相关的生物活性分子，监测疾病关键的生理过程。
小分子荧光探针是细胞和体内病理过程可视化的重要工具，能够直接检测和成像活细胞中异常水平的酶，已广泛地应用于蛋白质、核酸等重要生物分子的生物学和药理学检测中，对疾病机制探讨、临床诊断及药物筛选等领域的发展具有重要的意义。其中近红外荧光探针具有深部穿透、低背景和高分辨率等优势，可以相对较深地穿透组织并且对生物样品造成的损伤较小，能够实现生物活体成像，已成为基础研究与临床诊断的重要工具。尽管目前已开发出检测磷酸酶的荧光探针，但由于蛋白酪氨酸磷酸酶的结构相似性和对磷酸酪氨酸固有底物特异性，开发选择性检测特定PTP的小分子近红外探针仍面临着挑战，目前尚未开发出特异性检测SHP2的近红外荧光探针。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供特异性检测SHP2的近红外荧光探针的制备方法和应用。
本发明是通过如下技术方案实现的：
第一方面，本发明提供一种特异性检测SHP2的近红外荧光探针，具有如式I所示的化学结构式：
；
其中，R为二氰基异佛尔酮类荧光团或二氰基亚甲基-4H-吡喃类荧光团。
进一步地，所述二氰基异佛尔酮类荧光团为(E)-2-[3-(4-氨基苯乙烯基)-5,5-二甲基环己-2-烯-1-亚基]丙二腈，所述二氰基亚甲基-4H-吡喃类荧光团为2-[2-[(E)-2-(4-氨基苯基)乙烯基]-4H-1-苯并吡喃-4-亚基]丙二腈。
更进一步地，当所述二氰基异佛尔酮类荧光团为(E)-2-[3-(4-氨基苯乙烯基)-5,5-二甲基环己-2-烯-1-亚基]丙二腈时，所述近红外荧光探针的化学结构式如式11所示：；
当所述二氰基亚甲基-4H-吡喃类荧光团为2-[2-[(E)-2-(4-氨基苯基)乙烯基]-4H-1-苯并吡喃-4-亚基]丙二腈时，所述近红外荧光探针的化学结构式如式12所示：。
SHP2具有高度保守的结构，包含位于N端和C端的两个SH2功能域、一个具有催化活性的PTP结构域，以及富含Y542和Y580两个酪氨酸磷酸化位点和脯氨酸基序的C末端尾部。SHP2存在多个潜在的变构结合位点，其中包括SH2与PTP结构域界面之间形成的隧道、闩锁和凹槽结合位点。化合物SHP099能够特异性结合SHP2的隧道变构口袋，使SHP2保持在自抑制状态，从而抑制其磷酸酶活性。研究发现，该隧道变构位点是SHP2所特有的，因此SHP099对SHP2具有高度选择性，对同源蛋白SHP1无活性。此外发现SHP099中与哌啶相连的氨基暴露于溶剂中，为了保证目标化合物的活性，保留SHP099的其他基团，对氨基进行结构修饰。
本发明基于SHP2与高亲和力配体SHP099复合体的结构模型，巧妙地选择了配体与靶标蛋白的非结合区域作为设计切入点。通过引入精心设计的连接臂和荧光基团，成功设计并合成了一系列特异性靶向SHP2的近红外荧光探针。实验结果揭示了一个关键现象：不同的连接臂和荧光基团组合对探针的性能产生了显著影响。具体而言，当SHP099中与哌啶相连的氨基通过酰胺化反应与连接臂的羧基连接形成酰胺基团时，其与SHP2的结合稳定性大幅降低，无法有效维持SHP2的自抑制状态。相反，当氨基被巧妙地修饰为仲胺基团时，探针则能够与SHP2实现稳定结合。
在前期的实验探索中，我们尝试将化合物SHP099通过酰胺键与荧光基团连接，合成了化合物A、化合物B和化合物C。然而，活性实验结果表明，在10μM的浓度下，这些化合物对SHP2的抑制率分别为26.4%、11.4%和24.7%。这一结果明确指出，这些化合物的抑制活性相对较弱，无法与SHP2实现有效结合。这进一步证实了连接臂和荧光基团的选择对于探针性能的至关重要性。。。。
本发明中，两个近红外荧光探针对SHP2的抑制活性实验表明，二者均可与SHP2结合。细胞实验结果显示，这两种探针能够实现细胞荧光成像，但在抑制肿瘤细胞增殖方面效果有限。这可能是因为细胞内部环境复杂，即使探针能够与靶标蛋白结合，肿瘤细胞也可能通过代偿通路维持存活，或者肿瘤细胞依赖多条信号通路，需要多靶点干预才能达到显著的抑制效果。
第二方面，本发明提供所述一种特异性检测SHP2的近红外荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
（1）以化合物1和化合物2为起始原料，通过铃木反应制备化合物3；向化合物3中引入叔丁氧羰基基团对氨基进行保护，形成化合物4，化合物4进行芳香族亲核取代反应得到化合物5；去除化合物5上叔丁氧羰基基团得到化合物6；化合物6通过亲核取代反应得到化合物7；合成反应式如下所示：
；
（2）4-(N-甲基-N-羟乙基)氨基苯甲醛通过叠氮化反应生成化合物8，化合物8与(3,5,5-三甲基环己-2-烯亚基)丙二腈通过缩合反应生成化合物9，化合物8与2-(2-甲基-4H-苯并吡喃-4-亚基)丙二腈通过缩合反应生成化合物10；合成反应式如下所示：
；
（3）化合物7分别与化合物9、化合物10通过点击化学反应生成化合物11和化合物12，即所述近红外荧光探针；合成反应式如下所示：
。
第三方面，本发明提供所述的近红外荧光探针在制备SHP2表达检测产品中的应用。
第四方面，本发明提供所述的近红外荧光探针在筛选SHP2抑制剂中的应用。
第五方面，本发明提供所述的近红外荧光探针在制备肿瘤检测产品中的应用，所述近红外荧光探针用于标记SHP2蛋白高表达的肿瘤细胞。
进一步地，所述肿瘤为乳腺癌、难治性肝癌、宫颈癌、前列腺癌、卵巢癌、胃癌、非小细胞肺癌或黑色素瘤。
本发明的有益效果：
1.本发明的探针结构新颖，对SHP2蛋白的结合亲和力强，且对周围环境的变化较为敏感，表明探针具有良好的荧光特性，且反应时间快、专属性强。
2.本发明的探针可以特异性识别SHP2蛋白。本发明的探针可以实现SHP2蛋白抑制剂的高通量筛选及在制备用于检测抑制SHP2蛋白试剂中的应用。本发明的荧光探针可以用于SHP2蛋白高表达的肿瘤细胞的标记。本发明的SHP2近红外荧光探针在制备筛选SHP2蛋白相关疾病的药物制剂中的应用，所述的相关疾病为恶性肿瘤；优选的，所述SHP2蛋白过表达相关恶性肿瘤为乳腺癌、难治性肝癌、宫颈癌、前列腺癌、卵巢癌、胃癌、非小细胞肺癌和黑色素瘤。
3.本发明探针原料便宜易得，后处理过程简便。
附图说明
图1为化合物1至化合物7的合成路线图。
图2为化合物9和化合物10的合成路线图。
图3为化合物11和化合物12的合成路线图。
图4为化合物11的荧光特性，A：不同浓度下化合物11在PBS缓冲溶液中的荧光激发光谱，B：不同浓度下化合物11在PBS缓冲溶液中的荧光发射光谱，C：不同的溶剂中化合物11的荧光激发光谱，D：不同溶剂中化合物11的荧光发射光谱。
图5为化合物12的荧光特性，A：不同浓度下化合物12在PBS缓冲溶液中的荧光激发光谱，B：不同浓度下化合物12在PBS缓冲溶液中的荧光发射光谱，C：不同的溶剂中化合物12的荧光激发光谱，D：不同溶剂中化合物12的荧光发射光谱。
图6为化合物11在MDA-MB-231细胞、MCF-7细胞和HUVEC细胞中的细胞毒性图，A：MDA-MB-231细胞，B：MCF-7细胞，C：HUVEC细胞。
图7为化合物12在MDA-MB-231细胞、MCF-7细胞和HUVEC细胞中的细胞毒性图，A：MDA-MB-231细胞，B：MCF-7细胞，C：HUVEC细胞。
图8为10µM化合物11在MDA-MB-231细胞、MCF-7细胞和HUVEC细胞中的成像，A：MDA-MB-231细胞明场通道，B：MCF-7细胞明场通道，C：HUVEC细胞明场通道，D：MDA-MB-231细胞荧光通道，E：MCF-7细胞荧光通道，F：HUVEC细胞荧光通道；比例尺为50μm。
图9为10µM化合物12在MDA-MB-231细胞、MCF-7细胞和HUVEC细胞中的成像，A：MDA-MB-231细胞明场通道，B：MCF-7细胞明场通道，C：HUVEC细胞明场通道，D：MDA-MB-231细胞荧光通道，E：MCF-7细胞荧光通道，F：HUVEC细胞荧光通道；比例尺为50μm。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例部分化合物名称及其对应CAS号：
化合物1:2,3-二氯苯硼酸，CAS号为151169-74-3。
化合物2:3-溴-6-氯吡嗪-2-胺，CAS号为212779-21-0。
PdCl2：二氯化钯，CAS号为72287-26-4。
(Boc)2O：二碳酸二叔丁酯，CAS号为24424-99-5。
(4-甲基哌啶-4-基)氨基甲酸叔丁酯：CAS号为163271-08-7。
4-[N-(2-羟乙基)-N-甲基]氨基苯甲醛：CAS号为27913-86-6。
2-(3,5,5-三甲基环己基-2-烯亚基)丙二腈：CAS号为23051-44-7。
2-(2-甲基-4H-苯并吡喃-4-亚基)丙二腈：CAS号为15058-15-8。
实施例1：特异性检测SHP2的近红外荧光探针的制备。
参照图1－图3，制备步骤如下：
制备化合物3：将1g的化合物1、1.09g的化合物2、383mg的PdCl2和20mL体积分数为50%的1,4-二氧六环水溶液混合，混合物在110℃，氮气保护下，搅拌12h；冷却至室温后，用Celite硅藻土过滤，然后用乙酸乙酯洗涤；减压除去溶剂；粗产物经硅胶色谱纯化，PE/EA=100:1-20:1，纯化后得到黄色固体807mg，产率56%。1H NMR(400MHz,CDCl3) δ 8.01(s,1H),7.59(dd,J=7.8,1.9Hz,1H),7.36(t,J=7.7Hz,1H),7.31(dd,J=7.6,1.9Hz,1H),4.71(s,2H)。
制备化合物4：将200mg的化合物3、398mg的(Boc)2O和10mg的4-二甲氨基吡啶溶于10mL二氯甲烷，室温搅拌8h；反应混合物用1M的HCl稀释，用盐水洗涤，用MgSO4干燥；粗产物用硅胶色谱纯化，PE/EA=100:1-30:1，纯化后得到黄色油状产物175mg，产率50%。1H NMR(400MHz,CDCl3) δ 8.67(s,1H),7.56(dd,J=7.8,1.7Hz,1H),7.34(dd,J=7.7,1.7Hz,1H),7.28(t,J=7.8Hz,1H),1.37(s,6H)。
制备化合物5：将753mg的化合物4、410mg的(4-甲基哌啶-4-基)氨基甲酸叔丁酯和0.4mL的N,N-二异丙基乙胺加入至8mL的二甲基甲酰胺，在80℃下搅拌8h；用乙酸乙酯稀释反应混合物，用水和盐水洗涤；有机层用MgSO4干燥，过滤，浓缩得到粗化合物；粗产物经快速色谱法纯化，PE/EA=100:1-5:1，纯化后得到黄色油状物689mg，产率68%。1H NMR(400MHz,DMSO-d 6 ) δ 8.41(s,1H),7.67(dd,J=8.1,1.5Hz,1H),7.42(t,J=7.9Hz,1H),7.28(dd,J=7.8,1.5Hz,1H),6.67(s,1H),3.90(dd,J=13.7,4.7Hz,2H),3.29(d,J=11.5Hz,2H),2.14(d,J=13.4Hz,2H),1.47(d,J=10.1Hz,2H),1.39(s,10H),1.27(s,20H)。
制备化合物6：将689mg的化合物5在24mL浓度为4M的HCl/EtOAc中室温搅拌8h，过滤后得到黄色固体382mg，产率92%。1H NMR(400MHz,DMSO-d 6 ) δ 8.35(s,3H),7.71(dd,J=7.9,1.7Hz,1H),7.59(s,1H),7.45(t,J=7.8Hz,1H),7.39(dd,J=7.7,1.7Hz,1H),4.01(d,J=5.0Hz,2H),3.37(ddd,J=13.4,9.4,3.6Hz,2H),1.87–1.68(m,4H),1.39(s,3H)。
制备化合物7：将500mg的化合物6溶解于乙腈中，搅拌下，加入169mg的溴丙炔、535mg的碳酸钾和21mg的碘化钾，80℃加热回流反应。反应完成后将反应液旋干，加入水用乙酸乙酯萃取，合并有机相，用饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，浓缩后得到粗品，粗产物经硅胶柱层析纯化，DCM/MeOH=97%:3%，纯化后得黄色固体210mg，产率42%。1H NMR(400MHz,DMSO-d 6) δ 7.67–7.59(m,1H),7.50(s,1H),7.40(t,J=7.8Hz,1H),7.36–7.29(m,1H),5.63(s,2H),3.72–3.56(m, 2H),3.57–3.45(m,2H),3.02(s,1H),1.68–1.52(m,2H),1.50–1.36(m,2H),1.10(s,3H)。
制备化合物8：将1.79g的4-[N-(2-羟乙基)-N-甲基]氨基苯甲醛和4.13g的叠氮磷酸二苯酯溶于25mL的四氢呋喃，在0℃下滴加2.28mg的1,8－二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯，将混合物在0℃下搅拌1h，然后缓慢升温至70℃，搅拌12h。真空除去溶剂后，将粗产物经硅胶柱层析纯化，PE/EA=96%:4%，纯化后得到黄色油状产物1.747g，产率85%。1H NMR(400MHz,DMSO-d 6 ) δ 9.65(s,1H),7.67(d,J=8.6Hz,2H),6.84(d,J=8.6Hz,2H),3.65(t,J=5.9Hz,2H),3.50(t,J=5.8Hz,2H),3.02(s,3H)。
制备化合物9：将549mg的化合物8和500mg的2-(3,5,5-三甲基环己基-2-烯亚基)丙二腈溶于15mL乙腈中，加入0.5mL哌啶，在40℃下搅拌8h，氮气保护。反应完成后将反应液旋干，加入水，用二氯甲烷萃取，合并有机相，用饱和食盐水洗，无水硫酸镁干燥，用硅胶柱层析纯化，PE/EA=94%:6%，纯化后得到深色固体859mg，产率为86%。熔点：136-138℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d 6) δ 7.50(d,J=8.5Hz,2H),7.18(d,J=16.0Hz,1H),7.07(d,J=15.9Hz,1H),6.72(d,J=8.5Hz,2H),6.68(s,1H),3.58(t,J=5.9Hz,2H),3.45(t,J=5.8Hz,2H),2.95(s,3H),2.46(s,4H),0.94(s,6H)。
制备化合物10：将490mg的化合物8和500mg的2-(2-甲基-4H-苯并吡喃-4-亚基)丙二腈溶于15mL的乙腈中，加入0.5mL的哌啶，在40℃下搅拌8h，氮气保护。反应完成后将反应液旋干，加入水，用二氯甲烷萃取，合并有机相，用饱和食盐水洗，无水硫酸镁干燥，除去溶剂得到粗化合物，粗产物经硅胶柱层析纯化，PE/EA=93%:7%，纯化后得到深色固体765mg，产率80%。熔点：138-140℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d 6) δ 8.68(d,J=8.3Hz,1H),7.85(t,J=7.9Hz,1H),7.73(d,J=8.4Hz,1H),7.65(d,J=15.8Hz,1H),7.61–7.50(m,3H),7.15(d,J=15.8Hz,1H),6.86(s,1H),6.79(d,J=8.5Hz,2H),3.62(t,J=5.8Hz,2H),3.49(t,J=5.9Hz,2H),3.00(s,3H)。
制备化合物11：将104mg的化合物7用四氢呋喃和水等体积混合的混合溶液溶解，搅拌下依次加入101mg的化合物9，54mg的硫酸铜和160mg的抗坏血酸钠，室温下反应。待反应完全后，向反应液中加入水，用乙酸乙酯萃取，合并有机层，用饱和食盐水洗涤，用无水硫酸镁干燥，浓缩后得到粗品，粗产物经硅胶柱层析纯化，DCM/MeOH=97%:3%，纯化后得到深色固体50mg，收率24%，熔点：154-156℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d 6) δ 7.93(s,1H),7.59(d,J=8.0Hz,1H),7.49(d,J=8.6Hz,2H),7.45(s,1H),7.36(t,J=7.8Hz,1H),7.27(d,J=7.6Hz,1H),7.20(d,J=15.9Hz,1H),7.11(d,J=15.9Hz,1H),6.72(s,1H),6.64(d,J=8.6Hz,2H),5.60(s,2H),4.50(t,J=6.4Hz,2H),3.84(t,J=6.1Hz,2H),3.69(s,2H),3.60–3.52(m,2H),3.51–3.44(m,2H),2.79(s,3H),1.62–1.55(m,2H),1.48–1.40(m,2H),1.20(s,4H),1.11(s,3H),0.97(s,6H).13C NMR(101MHz,DMSO-d 6) δ 170.46,157.79,153.62,151.11,150.28,149.51,139.90,139.60,138.74,132.49,131.99,131.10,130.32,130.14,128.69,124.95,124.35,120.87,117.05,114.96,114.15,112.28,73.68,67.87,52.00,47.26,42.78,40.65,38.69,38.38,32.12,27.93。
制备化合物12：将104mg的化合物7用四氢呋喃和水等体积混合的混合溶液溶解，搅拌下依次加入107mg的化合物9，54mg的硫酸铜和160mg的抗坏血酸钠，室温下反应。待反应完全后，向反应液中加入水，用乙酸乙酯萃取，合并有机层，用饱和食盐水洗涤，用无水硫酸镁干燥，浓缩后得到粗品，粗产物经硅胶柱层析纯化，DCM/MeOH=96%:4%，纯化后得到深色固体30mg，收率14%，熔点：148-150℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d 6) δ 8.69(d,J=8.3Hz,1H),7.96(s,1H),7.86(t,J=7.8Hz,1H),7.75(d,J=8.4Hz,1H),7.66(d,J=15.7Hz,1H),7.59–7.55(m,3H),7.45(s,1H),7.35(t,J=7.6Hz,1H),7.26(d,J=7.6Hz,1H),7.17(d,J=16.0Hz,2H),6.88(s,1H),6.71(d,J=8.3Hz,2H),6.66(s,1H),5.59(s,2H),5.29(t,J=4.9Hz,2H),4.52(s,2H),3.87(s,2H),3.74–3.65(m,2H),3.60–3.52(m,2H),2.80(s,3H),1.63–1.56(m,2H),1.44–1.40(m,2H),1.12(s,3H).13C NMR(101MHz,DMSO-d 6) δ 159.94,153.54,153.10,152.52,151.10,150.80,140.41,139.84,135.54,132.48,131.96,131.07,130.78,130.12,128.68,126.39,125.02,123.27,119.39,118.20,117.65,117.05,116.86,114.05,112.35,105.54,58.23,52.02,47.31,38.50,35.58,31.77,29.55,29.05,27.02,25.59,22.58。
实验例1：探针化合物光学活性的测定实验。
实施例1制得的荧光探针化合物11、化合物12用二甲基亚砜配制成浓度为10mM的浓储备液，用PBS缓冲溶液稀释得到不同浓度的溶液；用不同的有机溶剂稀释成5µM的溶液，使用荧光分光光度计测定不同浓度和不同溶剂下探针化合物的荧光光谱，以探究探针的荧光特性。从实验结果可以得出，化合物11、化合物12随浓度升高荧光强度增强，且对周围环境的变化较为敏感，表明探针具有良好的荧光特性，见图4和图5。此外，以甲酚紫为参比物质，测定化合物11、化合物12的荧光量子产率，见表1。
表1：探针化合物的光学性质。
实验例2：探针化合物生物活性的测定实验。
测定荧光探针化合物SHP2蛋白的结合活性实验，将30µL的探针化合物、20µL的SHP2和10µL的2p-IRS1肽加入到96孔黑色酶标板中并在4℃下孵育10min，然后加入30μL的DiFMUP并在37℃孵育20min。通过酶标仪测定350nm/450nm的荧光强度。
结果如表2所示，实验结果显示，化合物11、化合物12在10μM时对SHP2的抑制率在50%以上，说明化合物11、化合物12可以与靶酶SHP2结合，具有较好的亲和力。
表2：探针化合物对SHP2蛋白的抑制活性测定
实验例3：探针化合物细胞毒性实验。
将对数生长期的MDA-MB-231细胞、MCF-7细胞和HUVEC细胞种在透明的96孔板中，每孔100μL，约7×103-8×103个细胞，放入37℃，5%二氧化碳的培养箱中培养贴壁12h后，加入100μL不同浓度的探针溶液，每个测试浓度设置三个复孔，并设置只有细胞而不添加化合物的对照组和不加细胞与化合物的空白组，培养箱中孵育24h。孵育结束后，向每孔加入10μL的CCK-8溶液，置于培养箱中2h，酶标仪上测定吸光度值，化合物11、化合物12的细胞毒性结果如图6、图7所示。实验结果说明，在上述不同浓度探针化合物的孵育下，各个细胞均有良好的存活率，表明探针化合物具有较好的生物相容性和较低的细胞毒性，可用于后续的活细胞荧光成像实验等。
实验例4：探针化合物细胞荧光成像实验。
细胞荧光成像使用MDA-MB-231细胞、MCF-7细胞，同时选择HUVEC细胞作为对照。具体步骤为：MDA-MB-231细胞、MCF-7细胞和HUVEC细胞用含有10%胎牛血清的DMEM培养基，在37℃，5%二氧化碳的培养箱中培养。成像前，将处于对数生长期的MDA-MB-231细胞、MCF-7细胞和HUVEC细胞接种于6孔板中，12h贴壁生长之后，用移液枪弃去上层培养基，用PBS缓冲液清洗细胞3次。将1mL的浓度10μM的荧光探针溶液分别加入到MDA-MB-231细胞、MCF-7细胞和HUVEC细胞的6孔板中，室温下避光孵育30min，弃去荧光探针溶液，用PBS清洗2次，使用倒置荧光显微镜进行荧光成像。成像结果如图8、图9所示，化合物11、化合物12在过表达SHP2的MDA-MB-231、MCF-7细胞中可以发出荧光响应；而在正常细胞HUVEC中荧光响应值较低。说明化合物11、化合物12可以选择性地筛选SHP2蛋白过表达的肿瘤细胞，实现肿瘤细胞荧光成像。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

Claims (7)

1.一种特异性检测SHP2的近红外荧光探针，其特征在于，所述近红外荧光探针具有如式I所示的化学结构式：
；
其中，R为二氰基异佛尔酮类荧光团或二氰基亚甲基-4H-吡喃类荧光团；所述二氰基异佛尔酮类荧光团为(E)-2-[3-(4-氨基苯乙烯基)-5,5-二甲基环己-2-烯-1-亚基]丙二腈，所述二氰基亚甲基-4H-吡喃类荧光团为2-[2-[(E)-2-(4-氨基苯基)乙烯基]-4H-1-苯并吡喃-4-亚基]丙二腈；
当所述二氰基异佛尔酮类荧光团为(E)-2-[3-(4-氨基苯乙烯基)-5,5-二甲基环己-2-烯-1-亚基]丙二腈时，所述近红外荧光探针的化学结构式如式11所示：；
当所述二氰基亚甲基-4H-吡喃类荧光团为2-[2-[(E)-2-(4-氨基苯基)乙烯基]-4H-1-苯并吡喃-4-亚基]丙二腈时，所述近红外荧光探针的化学结构式如式12所示：。
2.权利要求1所述一种特异性检测SHP2的近红外荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）以化合物1和化合物2为起始原料，通过铃木反应制备化合物3；向化合物3中引入叔丁氧羰基基团对氨基进行保护，形成化合物4，化合物4进行芳香族亲核取代反应得到化合物5；去除化合物5上叔丁氧羰基基团得到化合物6；化合物6通过亲核取代反应得到化合物7；合成反应式如下所示：
；
（2）4-(N-甲基-N-羟乙基)氨基苯甲醛通过叠氮化反应生成化合物8，化合物8与(3,5,5-三甲基环己-2-烯亚基)丙二腈通过缩合反应生成化合物9，化合物8与2-(2-甲基-4H-苯并吡喃-4-亚基)丙二腈通过缩合反应生成化合物10；合成反应式如下所示：
；
（3）化合物7分别与化合物9和化合物10通过点击化学反应生成化合物11和化合物12，即所述近红外荧光探针；合成反应式如下所示：
。
3.权利要求1所述的近红外荧光探针在制备SHP2表达检测产品中的应用。
4.权利要求1所述的近红外荧光探针在筛选SHP2抑制剂中的应用。
5.权利要求1所述的近红外荧光探针在制备肿瘤检测产品中的应用。
6.根据权利要求5所述的近红外荧光探针在制备肿瘤检测产品中的应用，其特征在于，所述近红外荧光探针用于标记SHP2蛋白高表达的肿瘤细胞。
7.根据权利要求6所述的近红外荧光探针在制备肿瘤检测产品中的应用，其特征在于，所述肿瘤为乳腺癌、难治性肝癌、宫颈癌、前列腺癌、卵巢癌、胃癌、非小细胞肺癌或黑色素瘤。
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