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CN120813607A - 抗psma抗体、缀合物和使用方法 - Google Patents

抗psma抗体、缀合物和使用方法

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CN120813607A
CN120813607A CN202480014604.3A CN202480014604A CN120813607A CN 120813607 A CN120813607 A CN 120813607A CN 202480014604 A CN202480014604 A CN 202480014604A CN 120813607 A CN120813607 A CN 120813607A
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CN202480014604.3A
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古内惠司
郑新
鲍幸峰
山根义伸
镝木洋介
黃冠群
E·F·阿尔博内
J·斯皮德尔
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Original Assignee
Sanitary Material R&d Management Co ltd
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Abstract

披露了结合PSMA的抗体、抗原结合片段及其缀合物(例如，抗体‑药物缀合物)，以及STING激动剂连接子‑药物缀合物及其制备。本披露进一步涉及用于通过施用本文提供的组合物来治疗例如癌症的方法和组合物。

Description

抗PSMA抗体、缀合物和使用方法
本申请要求2023年2月28日提交的美国临时申请号63/487,553和2024年2月23日提交的美国临时申请号63/557,342的权益，将这两个申请的内容均通过引用以其全文并入。
本披露涉及抗PSMA抗体及其抗原结合片段，以及缀合物(如抗体药物缀合物(ADC)、例如包含STING激动剂的那些缀合物)，以及它们用于治疗和诊断表达PSMA和/或适合于通过调节STING通路活性或通过施用本文披露的组合物进行治疗的癌症的用途。
前列腺癌是第二常见的癌症类型，也是男性癌症死亡的第二大原因。目前转移性前列腺癌的治疗选择有限且此类病例的预后较差，需要开发更有效的治疗方法。
前列腺特异性膜抗原(PSMA)是一种在前列腺癌中高表达的细胞表面抗原。PSMA的表达水平随着前列腺癌的进展而增加，并且在转移部位维持PSMA的高表达。先前已经产生了抗PSMA抗体，包括在人类中具有减少的免疫原性的经修饰的抗体。参见，例如美国专利号7,045,605和美国专利号11,059,903。结合PSMA的抗体的实例是J591和去免疫J591(deJ591)。deJ591抗体的重链可变结构域的氨基酸序列在本文中给出为SEQ ID NO:40，并且相应的轻链可变结构域在本文中给出为SEQ ID NO:41。然而，使用这种抗体的临床试验已显示出免疫原性的不良影响，包括骨髓抑制和肝酶异常。参见，例如de Bono等人(2021)Clin Cancer Res[临床癌症研究]27(13):3602-3609。仍然需要改进的PSMA抗体，例如完全人源化以最大限度地减少免疫原性同时保留所需特性(如良好的靶标结合亲和力、低脱靶结合和良好的稳定性)的那些抗体。
鉴于PSMA在前列腺癌中的高表达，它可以用作肿瘤抗原特异性药物递送方法(例如，抗体介导的方法)的靶标。还探索了与细胞毒性化合物(如化疗药)缀合的抗体，以增强基于抗体的药物递送至肿瘤细胞的细胞杀伤活性。然而，仍然需要提供合适的抗体和/或ADC，例如提供有效的前列腺肿瘤靶向、中靶效应和/或减少的脱靶效应的组合的那些。
STING(干扰素基因刺激因子)是一种模式识别受体，可感知胞质溶胶中的环状二核苷酸并诱导I型干扰素和其他炎性细胞因子(例如，干扰素-β(IFN-β)、肿瘤坏死因子α(TNFα)、C-X-C基序趋化因子配体10(CXCL10)、白细胞介素-6(IL-6))的表达，进而介导对感染或疾病(例如癌症)的先天免疫反应。STING信号传导已被证明具有抗肿瘤作用，例如调节脉管系统和增强适应性免疫。第一代STING激动剂(例如环状二核苷酸)通常需要肿瘤内注射并且仅显示出适度的全身功效。这些STING激动剂的膜渗透性也很差，这可能会限制它们在细胞内部接合STING的能力。
尽管本领域已经报道了STING激动剂用于治疗感染或疾病的用途，但是对于允许全身施用特异性靶向肿瘤位点的STING激动剂的递送系统的需求仍然未得到满足。同样，本领域仍然需要改进的结合PSMA的抗体，其具有优异的特性，例如在抗原结合和/或将有效载荷(如STING激动剂)有效递送至表达PSMA的靶细胞或组织的能力方面。
发明内容
在各个实施例中，本披露部分地提供了能够特异性结合PSMA并且可以单独使用或与一种或多种额外的药剂(例如，作为ADC)连接并作为药物组合物的一部分施用的新型抗体和抗原结合片段。在一些实施例中，本披露的抗体、抗原结合片段和/或ADC可用于减缓、抑制和/或逆转哺乳动物中的肿瘤生长，并且可用于治疗人类癌症患者。
在各个实施例中，本披露更具体地涉及能够结合和/或杀伤表达PSMA的细胞的抗体和抗体-药物缀合物化合物。在各个实施例中，这些化合物在结合后还能够内化到表达PSMA的靶细胞中。披露了包含如下连接子的抗PSMA-ADC化合物，该连接子将STING激动剂部分(例如式(III)、式(IV)、或表14的化合物、例如化合物1)与抗PSMA抗体部分附接。抗PSMA抗体部分可以是全长抗体或抗原结合片段。
在各个实施例中，本披露提供了人源化抗前列腺特异性膜抗原(PSMA)抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片段特异性结合人PSMA，并且其中该抗体或抗原结合片段包含(i)三个HCDR，其包含以下氨基酸序列：SEQ ID NO:21(HCDR1)、SEQ ID NO:22(HCDR2)和SEQ ID NO:27(HCDR3)；以及三个LCDR，其包含SEQ ID NO:32(LCDR1)、SEQ IDNO:35(LCDR2)和SEQ ID NO:37(LCDR3)，如由Kabat编号系统所定义的；或(ii)三个HCDR，其包含以下氨基酸序列：SEQ ID NO:21(HCDR1)、SEQ ID NO:22(HCDR2)和SEQ ID NO:27(HCDR3)；以及三个LCDR，其包含SEQ ID NO:33(LCDR1)、SEQ ID NO:36(LCDR2)和SEQ IDNO:37(LCDR3)，如由Kabat编号系统所定义的；或(iii)三个HCDR，其包含以下氨基酸序列：SEQ ID NO:28(HCDR1)、SEQ ID NO:29(HCDR2)和SEQ ID NO:30(HCDR3)；以及三个LCDR，其包含SEQ ID NO:38(LCDR1)、SEQ ID NO:39(LCDR2)和SEQ ID NO:37(LCDR3)，如由IMGT编号系统所定义的。
在一些实施例中，抗PSMA抗体或抗原结合片段包含三个HCDR，其包含以下氨基酸序列：SEQ ID NO:21(HCDR1)、SEQ ID NO:22(HCDR2)和SEQ ID NO:27(HCDR3)；以及三个LCDR，其包含SEQ ID NO:32(LCDR1)、SEQ ID NO:35(LCDR2)和SEQ ID NO:37(LCDR3)，如由Kabat编号系统所定义的；或三个HCDR，其包含以下氨基酸序列：SEQ ID NO:28(HCDR1)、SEQID NO:29(HCDR2)和SEQ ID NO:30(HCDR3)；以及三个LCDR，其包含SEQ ID NO:38(LCDR1)、SEQ ID NO:39(LCDR2)和SEQ ID NO:37(LCDR3)，如由IMGT编号系统所定义的。
在一些实施例中，抗PSMA抗体或抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，抗PSMA抗体或抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ IDNO:15的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，抗PSMA抗体或抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，抗PSMA抗体或抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，抗PSMA抗体或抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的轻链可变区。
在一些实施例中，抗PSMA抗体或抗原结合片段包含人IgG1重链恒定区。在一些实施例中，抗PSMA抗体或抗原结合片段包含人Igκ轻链恒定区。
在一些实施例中，抗PSMA抗原结合片段具有>80℃的解链温度(Tm)。在一些实施例中，抗原结合片段是Fab。
在一些实施例中，抗PSMA抗体或抗原结合片段与至少一个连接子附接。在一些实施例中，至少一个连接子是可切割的。在一些实施例中，至少一个连接子与细胞毒性剂或可检测试剂缀合。
在各个实施例中，本披露还部分地提供了新型连接子-有效载荷缀合物。在各个实施例中，本披露更具体地涉及包含如下连接子的连接子-有效载荷缀合物，该连接子将STING激动剂部分(例如式(III)、式(IV)、或表14的化合物、例如化合物1)与抗PSMA抗体部分附接。
在各个实施例中，本披露提供了一种包含L-D的连接子-有效载荷缀合物，其中L是与D共价附接的连接子，其中D包含根据下式之一的化合物：
其异构体、该化合物或异构体的氘代衍生物；或者该化合物、异构体或氘代衍生物的盐；
其中，对于每次出现独立地是：
■Pa和Pb中的每个，当不是外消旋时，独立地选自(R)-立体化学和(S)-立体化学；
■Qa和Qb中的每个独立地选自NH和O；
■Va和Vb中的每个独立地选自F和OH；
■W选自H和NH2；
■Xa和Xb中的每个独立地选自OH和SH；
■Ya和Yb中的每个独立地选自O和S；
■Za和Zb各自独立地选自CH2、O和NH；以及
■意味着键选自单键(-)、(E)-或(Z)-构型的双键(＝)、或三键；
条件是Za和Zb中的至少一个是NH或Xa和Xb中的至少一个是SH。
在一些实施例中，Pa是(S)-构型且Pb是(R)-构型。在一些实施例中，Pa是(R)-构型且Pb是(R)-构型。在一些实施例中，Qa和Qb是O。在一些实施例中，Va和Vb是OH。在一些实施例中，Va和Vb是F。在一些实施例中，W是H。在一些实施例中，Za和Zb中的至少一个是NH。在一些实施例中，Za和Zb是NH。在一些实施例中，包含(E)-或(Z)-构型的双键(＝)。在一些实施例中，桥具有结构在一些实施例中，Ya和Yb中的至少一个是O。在一些实施例中，Ya和Yb是O。在一些实施例中，Xa和Xb中的至少一个是SH。在一些实施例中，Xa和Xb是SH。在一些实施例中，D包含具有式(III)的化合物。
在一些实施例中，D包含选自以下的具有式(III)的化合物：
及其盐。
在一些实施例中，D包含选自以下的具有式(III)的化合物：
及其盐。
在一些实施例中，D包含化合物1。
在一些实施例中，D包含化合物2。
在一些实施例中，Xa和Xb中的至少一个是SH并且L通过S-2硫或S-14硫处的硫原子与D附接。在一些实施例中，Xb是SH并且L在S-2硫处与D附接。在一些实施例中，Xa是SH并且L在S-14硫处与D附接。
在一些实施例中，Za和Zb中的至少一个是NH并且L通过N-34氮或N-39氮处的氮原子与D附接。在一些实施例中，Zb是NH并且L在N-34氮处与D附接。在一些实施例中，Za是NH并且L在N-39氮处与D附接。
在一些实施例中，L是可切割连接子。在一些实施例中，可切割连接子包含可切割肽部分。在一些实施例中，可切割肽部分可被蛋白酶切割，任选地其中该蛋白酶是组织蛋白酶或半胱氨酸蛋白酶(legumain)。在一些实施例中，可切割肽部分包含氨基酸单元。在一些实施例中，氨基酸单元包含Val-Ala、Val-Cit、Val-Lys、Ala-Ala-Asn、Ala-(NMe)Ala-Asn、Asn、Gly-Gly-Phe-Gly、Glu-Val-Ala、或Gly-Val-Ala。在一些实施例中，可切割连接子包含Val-Cit。在一些实施例中，可切割连接子包含Val-Ala。
在一些实施例中，连接子包含马来酰亚胺(Mal)部分。在一些实施例中，Mal部分包含马来酰亚胺基己酰基(MC)。在一些实施例中，Mal部分通过抗体或抗原结合片段上的半胱氨酸残基与该抗体或抗原结合片段接合。
在一些实施例中，连接子进一步包含至少一个间隔子单元。在一些实施例中，至少一个间隔子单元包含至少一个聚乙二醇(PEG)部分。在一些实施例中，至少一个PEG部分包含-(PEG)m-并且m是1至10的整数。在一些实施例中，m是2至8的整数。在一些实施例中，m是2至5的整数。在一些实施例中，m是2。在一些实施例中，至少一个间隔子单元包含PEG2-Lys(ε-PEG8-OMe)-PEG2。
在一些实施例中，至少一个间隔子单元包含在一些实施例中，至少一个间隔子单元包含
在一些实施例中，连接子进一步包含至少一个自消解单元(self-immolativeunit)。在一些实施例中，连接子包含第一自消解单元。在一些实施例中，在通过第一自消解单元的自消解切割连接子后，该连接子能够从D中除去。在一些实施例中，第一自消解单元包含任选地被选自甲基、氟、氯、三氟甲基、芳基和杂芳基的1-3个取代基取代的对氨基苄基(pAB)。在一些实施例中，第一自消解单元包含对氨基苄基(pAB)。在一些实施例中，连接子包含MC-Val-Ala-pAB。
在一些实施例中，第一自消解单元包含对氨基苄氧基羰基(pABC)。
在一些实施例中，连接子进一步包含第二自消解单元。在一些实施例中，在通过第一自消解单元的自消解和/或第二自消解单元的自消解切割连接子后，该连接子能够从D中除去。在一些实施例中，在通过第一自消解单元的自消解、然后是第二自消解单元的自消解以逐步方式切割连接子后，该连接子从D中除去。
在一些实施例中，连接子包含可切割连接子、第一自消解单元、和第二自消解单元。在一些实施例中，可切割连接子包含Val-Ala。在一些实施例中，可切割连接子包含Val-Cit。在一些实施例中，可切割连接子包含式(II)。
在一些实施例中，第二自消解单元包含以下部分之一：
或其异构体。
在一些实施例中，可切割连接子包含Val-Ala，并且其中第二自消解单元包含以下部分之一：
或其异构体。
在一些实施例中，第二自消解单元包含单元1(MEC)部分。在一些实施例中，第二自消解单元包含单元8部分。在一些实施例中，第二自消解单元包含单元11部分。在一些实施例中，第二自消解单元包含单元9部分。
在一些实施例中，连接子包含Val-Ala-pABC-MEC部分。在一些实施例中，连接子包含MC-Val-Ala-pABC-MEC部分。
在一些实施例中，L-D包含LP1：
在一些实施例中，连接子包含Val-Cit-pABC-MEC部分。在一些实施例中，连接子包含MC-Val-Cit-pABC-MEC部分。在一些实施例中，MC-Val-Cit-pABC-MEC-化合物1。
在一些实施例中，连接子包含Val-Ala-pABC-单元8部分。在一些实施例中，连接子包含MC-Val-Ala-pABC-单元8部分。
在一些实施例中，L-D包含LP16：
在一些实施例中，连接子包含Val-Cit-pABC-单元8部分。在一些实施例中，连接子包含MC-Val-Cit-pABC-单元8部分。在一些实施例中，L-D包含MC-Val-Cit-pABC-单元8-化合物1。
在一些实施例中，连接子包含Val-Ala-pABC-单元11部分。在一些实施例中，连接子包含MC-Val-Ala-pABC-单元11部分。
在一些实施例中，L-D包含LP28：
在一些实施例中，连接子包含Val-Cit-pABC-单元11部分。在一些实施例中，连接子包含MC-Val-Cit-pABC-单元11部分。在一些实施例中，L-D包含MC-Val-Cit-pABC-单元11-化合物1。
在一些实施例中，连接子包含Val-Ala-pABC-单元9部分。在一些实施例中，连接子包含MC-Val-Ala-pABC-单元9部分。
在一些实施例中，L-D包含LP20：
在一些实施例中，连接子包含Val-Cit-pABC-单元9部分。在一些实施例中，连接子包含MC-Val-Cit-pABC-单元9部分。在一些实施例中，L-D包含MC-Val-Cit-pABC-单元9-化合物1。
在一些实施例中，连接子包含式(II)-Val-Cit-pABC。在一些实施例中，连接子包含式(II)-Val-Cit-pABC-MEC部分。在一些实施例中，连接子包含Mal-式(II)-Val-Cit-pABC-MEC部分。在一些实施例中，L-D包含Mal-式(II)-Val-Cit-pABC-MEC-化合物1。在一些实施例中，连接子包含式(II)-Val-Cit-pABC-单元8部分。在一些实施例中，连接子包含Mal-式(II)-Val-Cit-pABC-单元8部分。在一些实施例中，L-D包含Mal-式(II)-Val-Cit-pABC-单元8-化合物1。在一些实施例中，连接子包含式(II)-Val-Cit-pABC-单元11部分。在一些实施例中，连接子包含Mal-式(II)-Val-Cit-pABC-单元11部分。在一些实施例中，L-D包含Mal-式(II)-Val-Cit-pABC-单元11-化合物1。在一些实施例中，连接子包含式(II)-Val-Cit-pABC-单元9部分。在一些实施例中，连接子包含Mal-式(II)-Val-Cit-pABC-单元9部分。在一些实施例中，L-D包含Mal-式(II)-Val-Cit-pABC-单元9-化合物1。
在一些实施例中，连接子包含式(II)-Val-Ala-pABC。在一些实施例中，连接子包含式(II)-Val-Ala-pABC-MEC部分。在一些实施例中，连接子包含Mal-式(II)-Val-Ala-pABC-MEC部分。在一些实施例中，L-D包含Mal-式(II)-Val-Ala-pABC-MEC-化合物1。在一些实施例中，连接子包含式(II)-Val-Ala-pABC-单元8部分。在一些实施例中，连接子包含Mal-式(II)-Val-Ala-pABC-单元8部分。在一些实施例中，L-D包含Mal-式(II)-Val-Ala-pABC-单元8-化合物1。在一些实施例中，连接子包含式(II)-Val-Ala-pABC-单元11部分。在一些实施例中，连接子包含Mal-式(II)-Val-Ala-pABC-单元11部分。在一些实施例中，L-D包含Mal-式(II)-Val-Ala-pABC-单元11-化合物1。在一些实施例中，连接子包含式(II)-Val-Ala-pABC-单元9部分。在一些实施例中，连接子包含Mal-式(II)-Val-Ala-pABC-单元9部分。在一些实施例中，L-D包含Mal-式(II)-Val-Ala-pABC-单元9-化合物1。
在一些实施例中，连接子包含式(II)-Val-Cit-pAB。在一些实施例中，连接子包含式(II)-Val-Cit-pAB-单元9部分。在一些实施例中，连接子包含Mal-式(II)-Val-Cit-pAB。在一些实施例中，连接子包含Mal-式(II)-Val-Cit-pAB-单元9部分。在一些实施例中，L-D包含Mal-式(II)-Val-Cit-pAB-单元9-化合物1。
在一些实施例中，连接子包含式(II)-Val-Ala-pAB。在一些实施例中，连接子包含式(II)-Val-Ala-pAB-单元9部分。在一些实施例中，连接子包含Mal-式(II)-Val-Ala-pAB。在一些实施例中，连接子包含Mal-式(II)-Val-Ala-pAB-单元9部分。
在一些实施例中，L-D包含LP25：
在一些实施例中，连接子包含式(II)-Val-Cit-pAB-单元11部分。在一些实施例中，连接子包含Mal-式(II)-Val-Cit-pAB-单元11部分。在一些实施例中，L-D包含Mal-式(II)-Val-Cit-pAB-单元11-化合物1。
在一些实施例中，连接子包含式(II)-Val-Ala-pAB-单元11部分。在一些实施例中，连接子包含Mal-式(II)-Val-Ala-pAB-单元11部分。
在一些实施例中，L-D包含LP26：
在各个实施例中，本披露提供了一种具有式(I)的抗体-药物缀合物：
Ab-(L-D)p(I)
其中Ab是本文披露的抗PSMA抗体或其抗原结合片段；L-D是本文披露的连接子-有效载荷缀合物；并且p是1至20的整数。
在一些实施例中，p是1至12的整数。在一些实施例中，p是2至8的整数。在一些实施例中，p是2至4的整数。在一些实施例中，p是2。在一些实施例中，p是4。
在一些实施例中，可切割连接子包含可切割部分，该可切割部分的位置使得在切割时连接子或者抗体或抗原结合片段的任何部分不与D保持结合。
在一些实施例中，连接子-有效载荷缀合物通过Mal部分与抗体或抗原结合片段附接。在一些实施例中，Mal部分通过抗体或抗原结合片段上的半胱氨酸残基与该抗体或抗原结合片段接合。在一些实施例中，半胱氨酸残基位于抗体或抗原结合片段的轻链上。在一些实施例中，半胱氨酸残基位于抗体或抗原结合片段的重链上。
在一些实施例中，抗体或抗原结合片段包含三个HCDR，其包含以下氨基酸序列：SEQ ID NO:21(HCDR1)、SEQ ID NO:22(HCDR2)和SEQ ID NO:27(HCDR3)；以及三个LCDR，其包含以下氨基酸序列：SEQ ID NO:32(LCDR1)、SEQ ID NO:34(LCDR2)和SEQ ID NO:36(LCDR3)，如由Kabat编号系统所定义的。
在一些实施例中，抗体或抗原结合片段包含三个HCDR，其包含以下氨基酸序列：SEQ ID NO:28(HCDR1)、SEQ ID NO:29(HCDR2)和SEQ ID NO:30(HCDR3)；以及三个LCDR，其包含以下氨基酸序列：SEQ ID NO:37(LCDR1)、SEQ ID NO:38(LCDR2)和SEQ ID NO:36(LCDR3)，如由IMGT编号系统所定义的。
在一些实施例中，抗体或抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的轻链可变区。
在一些实施例中，L-D包含LP16、LP20、LP26或LP28。
在一些实施例中，L-D包含LP16：
在一些实施例中，L-D包含LP20：
在一些实施例中，L-D包含LP26：
在一些实施例中，L-D包含LP28：
在各个实施例中，本披露提供了一种药物配制品，其包含如本文所披露的抗PSMAADC、抗体、其抗原结合片段、或连接子-有效载荷缀合物，以及药学上可接受的载剂。
在各个实施例中，本披露提供了一种组合物，其包含多个拷贝的具有式(I)的抗体-药物缀合物：
Ab-(L-D)p(I)
其中
Ab是如本文所披露的抗PSMA抗体或抗原结合片段；
L-D是如本文所披露的连接子-有效载荷缀合物；并且
p是每个Ab的L-D部分的平均数量，其中该组合物中这些抗体-药物缀合物的平均p是约2至约8。
在一些实施例中，抗体或抗原结合片段包含三个HCDR，其包含以下氨基酸序列：SEQ ID NO:21(HCDR1)、SEQ ID NO:22(HCDR2)和SEQ ID NO:27(HCDR3)；以及三个LCDR，其包含SEQ ID NO:32(LCDR1)、SEQ ID NO:35(LCDR2)和SEQ ID NO:37(LCDR3)，如由Kabat编号系统所定义的；或三个HCDR，其包含以下氨基酸序列：SEQ ID NO:28(HCDR1)、SEQ ID NO:29(HCDR2)和SEQ ID NO:30(HCDR3)；以及三个LCDR，其包含SEQ ID NO:38(LCDR1)、SEQ IDNO:39(LCDR2)和SEQ ID NO:37(LCDR3)，如由IMGT编号系统所定义的；并且
该L-D包含LP16：
在一些实施例中，抗体或抗原结合片段包含三个HCDR，其包含以下氨基酸序列：SEQ ID NO:21(HCDR1)、SEQ ID NO:22(HCDR2)和SEQ ID NO:27(HCDR3)；以及三个LCDR，其包含SEQ ID NO:32(LCDR1)、SEQ ID NO:35(LCDR2)和SEQ ID NO:37(LCDR3)，如由Kabat编号系统所定义的；或三个HCDR，其包含以下氨基酸序列：SEQ ID NO:28(HCDR1)、SEQ ID NO:29(HCDR2)和SEQ ID NO:30(HCDR3)；以及三个LCDR，其包含SEQ ID NO:38(LCDR1)、SEQ IDNO:39(LCDR2)和SEQ ID NO:37(LCDR3)，如由IMGT编号系统所定义的；并且
该L-D包含LP20：
在一些实施例中，抗体或抗原结合片段包含三个HCDR，其包含以下氨基酸序列：SEQ ID NO:21(HCDR1)、SEQ ID NO:22(HCDR2)和SEQ ID NO:27(HCDR3)；以及三个LCDR，其包含SEQ ID NO:32(LCDR1)、SEQ ID NO:35(LCDR2)和SEQ ID NO:37(LCDR3)，如由Kabat编号系统所定义的；或三个HCDR，其包含以下氨基酸序列：SEQ ID NO:28(HCDR1)、SEQ ID NO:29(HCDR2)和SEQ ID NO:30(HCDR3)；以及三个LCDR，其包含SEQ ID NO:38(LCDR1)、SEQ IDNO:39(LCDR2)和SEQ ID NO:37(LCDR3)，如由IMGT编号系统所定义的；并且
该L-D包含LP26：
在一些实施例中，抗体或抗原结合片段包含三个HCDR，其包含以下氨基酸序列：SEQ ID NO:21(HCDR1)、SEQ ID NO:22(HCDR2)和SEQ ID NO:27(HCDR3)；以及三个LCDR，其包含SEQ ID NO:32(LCDR1)、SEQ ID NO:35(LCDR2)和SEQ ID NO:37(LCDR3)，如由Kabat编号系统所定义的；或三个HCDR，其包含以下氨基酸序列：SEQ ID NO:28(HCDR1)、SEQ ID NO:29(HCDR2)和SEQ ID NO:30(HCDR3)；以及三个LCDR，其包含SEQ ID NO:38(LCDR1)、SEQ IDNO:39(LCDR2)和SEQ ID NO:37(LCDR3)，如由IMGT编号系统所定义的；并且
该L-D包含LP28：
在一些实施例中，抗体或抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的轻链可变区。
在各个实施例中，本披露提供了治疗患有癌症或有患癌症风险的患者的方法，这些方法包括向该患者施用治疗有效量的如本文所披露的抗PSMA ADC、抗体、其抗原结合片段、或连接子-有效载荷缀合物。在各个实施例中，本披露提供了减少或抑制癌症生长的方法，这些方法包括施用治疗有效量的如本文所披露的抗PSMA ADC、抗体、其抗原结合片段、或连接子-有效载荷缀合物。在一些实施例中，癌症表达PSMA。在一些实施例中，癌症是前列腺癌。
在各个实施例中，本披露提供了如本文所披露的抗PSMA ADC、抗体、其抗原结合片段、或连接子-有效载荷缀合物在治疗癌症中的用途。在一些实施例中，癌症表达PSMA。在一些实施例中，癌症是前列腺癌。
在各个实施例中，本披露提供了产生抗PSMA ADC的方法，这些方法包括使如本文所披露的抗体或其抗原结合片段与如本文所披露的连接子-有效载荷缀合物反应。在各个实施例中，本披露提供了产生抗体-药物缀合物的方法，其中该方法包括在适合附接的条件下将如本文所披露的抗体或抗原结合片段与如本文所披露的连接子-有效载荷缀合物缀合。
在各个实施例中，本披露提供了产生L-D缀合物(V)的方法：
该方法包括使如本文所披露的具有式(III)的化合物：
或其盐与活化连接子反应，该活化连接子包含具有以下结构的合适连接子：
以产生该L-D缀合物(V)，
其中Zb是NH。
在一些实施例中，Pb具有(S)-构型，并且活化连接子优先与Zb反应。在一些实施例中，具有式(III)的化合物是化合物1。
在各个实施例中，本披露提供了产生L-D缀合物(VI)的方法：
该方法包括使如本文所披露的具有式(III)的化合物：
或其盐与活化连接子反应，该活化连接子包含具有以下结构的合适连接子：
以产生该L-D缀合物(VI)，
其中Zb是NH。
在一些实施例中，Pb具有(S)-构型，并且活化连接子优先与Zb反应。在一些实施例中，具有式(III)的化合物是化合物1。
在各个实施例中，本披露提供了组合物，其包含如本文所披露的连接子-有效载荷缀合物。在一些实施例中，本披露提供了组合物，其包含根据本文披露的方法产生的连接子-有效载荷缀合物。
附图说明
图1显示了J591 VH和VL与人种系序列的比对。带下划线的残基是人特异性残基，小写的残基是小鼠特异性残基。
图2显示了使用BioLuminate软件生成的J591 Fv的计算机模型。CDR残基显示为空间填充的(space-fill)、小鼠和HCzu1-Lczu1之间不同的框架残基，它们与显示为球棒(ball-stick)的CDR相邻。残基编号根据Kabat进行。
图3显示了与Lczu1配对的人源化重链(HC)变体1-10的类似PSMA结合。Hczu1-10与LCzu1配对，并通过ELISA分析了与PSMA的结合。
图4显示了J591的超人源化。所得PSMA抗体具有很强的结合亲和力。通过ELISA分析了人源化J591变体与PSMA的结合。
图5A显示了deJ591的热稳定性。图5B显示了与deJ591相比，人源化J591变体HC1-LC1、HC2-LC1、HC3-LC1、HC14-LC1和HC14-LC5的热稳定性。图5C显示了与deJ591和J591相比，修饰为包括位点特异性缀合残基的HC14-LC5(H14L5)IgG1抗体的热稳定性。
图6A显示了J591重链可变结构域上的9mer肽序列的免疫原性预测评分。图6B显示了deJ591重链可变结构域上的9mer肽序列的免疫原性预测评分。图6C显示了zuJ591-H14重链可变结构域上的9mer肽序列的免疫原性预测评分。
图7A显示了J591轻链可变结构域上的9mer肽序列的免疫原性预测评分。图7B显示了deJ591轻链可变结构域上的9mer肽序列的免疫原性预测评分。图7C显示了zuJ591-L5轻链可变结构域上的9mer肽序列的免疫原性预测评分。
图8显示了抗PSMA与表达PSMA的LNCaP细胞的特异性结合。
图9显示了如通过流式细胞术评估的PSMA依赖性ADCP活性。显示了摄取至少一种靶细胞的巨噬细胞的百分比。
图10显示了如通过流式细胞术测量的抗PSMA ADC内化的靶细胞依赖性。
图11显示了抗PSMA ADC处理导致的ADCP依赖性IFNβ生产。
图12显示了抗PSMA ADC处理导致的ADCP依赖性骨髓细胞活化。
图13显示了PSMA阳性LNCaP异种移植模型中抗PSMA ADC的体内抗肿瘤活性。
图14A显示了在用抗PSMA抗体(PSMA对照)、抗PSMA-LP3ADC、或阴性对照(抗SEB-LP3)处理的LNCaP异种移植模型中如通过RNA-seq评估的1型干扰素基因表达的热图。图14B显示了抗PSMA-LP3 ADC处理调节对STING通路具有特异性的细胞因子。图14C显示了当用抗PSMA-LP3 ADC处理时，肿瘤微环境中巨噬细胞极化从M2转变为M1。
图15A显示了用抗PSMA抗体或抗PSMA ADC处理时人前列腺癌22RV1异种移植小鼠(去势)中的肿瘤体积(左)和体重变化百分比(右)。图15B显示了用抗PSMA抗体或抗PSMAADC处理时人前列腺癌22RV1异种移植小鼠(未去势)中的肿瘤体积(左)和体重变化百分比(右)。Sp＝化合物1上的S硫代磷酸酯连接子附接点；Rp＝化合物1上的R硫代磷酸酯连接子附接点。
图16A显示了22RV1异种移植模型中抗PSMA ADC的体内功效的模型。图16B显示了注射抗PSMA ADC后6h血浆中小鼠TNFα(左)或IFNβ(右)的浓度。
图17显示了抗PSMA ADC的DAR的变化百分比。
图18A、18B和18C显示了S附接的连接子随时间的DAR变化。
图19A、19B和19C显示了S附接的连接子随时间的游离化合物1。
图20A、20B和20C显示了S附接的连接子随时间的单体百分比。
图21A、21B、21C、21D、21E、21F和21G显示了N附接的连接子随时间的DAR变化。
图22A、22B、22C、22D、22E、22F和22G显示了N附接的连接子随时间的游离化合物1。
图23A、23B、23C、23D、23E、23F和23G显示了N附接的连接子随时间的单体百分比。
图24A显示了化合物1从小鼠血浆中的抗PSMA ADC释放随时间的百分比。图24B显示了小鼠血浆中抗PSMA ADC随时间的平均DAR。图24C显示了小鼠血浆中抗PSMA ADC相对于起始DAR的变化百分比。图24D显示了小鼠血浆中随时间的游离化合物1。
图25显示了S连接的抗PSMA化合物1ADC的小鼠血浆稳定性。
图26显示了化合物1和化合物1的单磷酸盐形式的结构。
图27A显示了抗PSMA ADC LP3的平均DAR(随机DAR4和RESPECT-L DAR4)。图27B显示了抗PSMA ADC LP3随机DAR4的代谢。图27C显示了抗PSMA ADC LP3 RESPECT-L DAR4的代谢。
图28A显示了在10天处理内小鼠血浆中N连接的抗PSMA ADC的稳定性。图28B显示了第7天小鼠血浆中N连接的抗PSMA ADC的稳定性。
图29显示了第7/10天小鼠血浆中N连接的抗PSMA化合物1ADC的DAR。
图30显示了用抗PSMA ADC处理时C4-2/THP1共培养物中的hIFN-β产生。
图31显示了用抗PSMA ADC处理的异种移植肿瘤中的平均肿瘤体积和体重减轻百分比。
图32显示了抗PSMA-LP ADC在22Rv1异种移植模型中的抗肿瘤活性(群组1)。显示了平均肿瘤生长和平均体重变化。
图33显示了22Rv1异种移植模型中PSMA-LP ADC的血清细胞因子分析(群组1)。n＝3；每个点代表一个单独的值。数据表示为平均值±SEM。
图34显示了抗PSMA-LP ADC在22Rv1异种移植模型中的抗肿瘤活性(群组2)。显示了平均肿瘤生长和平均体重变化。
图35显示了22Rv1异种移植模型中PSMA-LP ADC的血清细胞因子分析(群组2)。n＝3；每个点代表一个单独的值。数据表示为平均值±SEM。
图36显示了抗PSMA-LP ADC在22Rv1异种移植模型中的抗肿瘤活性(群组3)。显示了平均肿瘤生长和平均体重变化。
图37显示了22Rv1异种移植模型中PSMA-LP ADC的血清细胞因子分析(群组3)。n＝3；每个点代表一个单独的值。数据表示为平均值±SEM。
图38显示了抗PSMA-LP ADC在C4-2异种移植模型中的抗肿瘤活性。显示了平均肿瘤生长和平均体重变化。
图39显示了22Rv1异种移植模型中PSMA-LP ADC的血清细胞因子分析(群组3)。n＝3；每个点代表一个单独的值。数据表示为平均值±SEM。
图40显示了1mpk IV剂量的抗PSMA LP3 ADC(随机DAR4)在正常小鼠中的药代动力学。
图41显示了3和9mg/kgIV剂量的抗PSMA LP3 ADC(RESPECT-L DAR2)在C4-2荷瘤小鼠中的药代动力学。
图42显示了来自给予了抗PSMA LP3 ADC(RESPECT-L DAR2)或抗PSMA LP1 ADC(RESPECT-L DAR4)的C4-2荷瘤小鼠的血浆中化合物1的水平。
图43显示了给予了抗PSMA LP3 ADC(RESPECT-L DAR2)或抗PSMA LP1 ADC(RESPECT-L DAR4)的C4-2荷瘤小鼠中化合物1的肿瘤内水平。
图44显示了来自给予了抗PSMA LP3 ADC(RESPECT-L DAR2)和抗PSMA LP1 ADC(RESPECT-L DAR4)的C4-2荷瘤小鼠的肿瘤PK参数。
图45显示了两步有效载荷释放测定的方案。以LP2为例。
图46显示了用抗PSMA S附接ADC处理后的体外IFN-β释放。标记为A的分图(左栏)显示了THP-1单一培养物中的IFN-β释放，而标记为B的分图(右栏)显示了C4-2和THP-1共培养物中的IFN-β释放。
图47显示了用抗PSMA N附接ADC治疗后的体外IFN-β释放。标记为A的分图(左栏)显示了THP-1单一培养物中的IFN-β释放，而标记为B的分图(右栏)显示了C4-2和THP-1共培养物中的IFN-β释放。
具体实施方式
通过结合附图，参考以下详细描述可更容易地理解所披露的组合物和方法，这些附图形成本披露的一部分。
在整个本文中，这些描述涉及组合物和使用所述组合物的方法。当本披露描述或声明与组合物相关的特征或实施例时，这样的特征或实施例同等地适用于使用所述组合物的方法。同样，当本披露描述或声明与使用组合物的方法相关的特征或实施例时，这样的特征或实施例同等地适用于该组合物。
当表示值的范围时，它包括使用该范围内的任何特定值的实施例。此外，对按范围陈述的值的提及包括该范围内的每一值。所有范围均包括其端点且可组合。当通过在前面使用“约”以近似值表示值时，应理解该特定值形成另一实施例。除非上下文另外明确地指示，否则对特定数值的提及至少包括该特定值。
本文引用的所有参考文献均出于任何目的通过引用并入。在参考文献与本说明书矛盾的情况下，以本说明书为准。
应理解，出于清楚起见本文在单独实施例的上下文中描述的所披露的组合物和方法的某些特征也可以在单个实施例中组合提供。相反地，出于简便起见在单个实施例的上下文中描述的所披露的组合物和方法的各种特征也可以单独地或以任何子组合的形式提供。
定义
整个说明书和权利要求中使用了与本说明书的各方面相关的各种术语。除非另外指示，否则这些术语应具有其在本领域中的普通含义。其他具体定义的术语将以与本文提供的定义一致的方式解释。
如本文所用，单数形式“一个/种(a/an)”和“该(the)”包括复数形式，除非上下文另外明确地指示。
在数值和范围的上下文中，术语“约”或“大约”是指近似或接近所述值或范围以使得本实施例可以如预期进行的值或范围，例如在反应混合物中具有所需量的核酸或多肽，这对技术人员来说从本文所包含的教导中是显而易见的。在一些实施例中，“约”意指数值量±10％。
术语“药剂”在本文中用于指化合物、化合物的混合物、生物大分子或由生物材料制成的提取物。术语“治疗剂”、“药物”或“药物部分”是指能够调节生物过程和/或具有生物活性的药剂。
如本文所用，术语“脂肪族”或“脂肪族基团”意指完全饱和的或者含有一个或多个不饱和单元的直链的(即无支链的)或支链的、经取代的或未取代的烃链。在一些实施例中，脂肪族基团含有1-8个脂肪族碳原子。在一些实施例中，脂肪族基团含有1-6个脂肪族碳原子。在一些实施例中，脂肪族基团含有1-4个脂肪族碳原子。在一些实施例中，脂肪族基团含有4个脂肪族碳原子。
如本文所用，术语“环境条件”意指室温、露天条件和不受控制的湿度条件。术语“室温”和“环境温度”意指15℃至30℃。
术语“抗体-药物缀合物”、“抗体缀合物”、“缀合物”、“免疫缀合物”和“ADC”可互换使用，并且是指与抗体(例如抗PSMA抗体)连接且可由以下通式定义的化合物或其衍生物：Ab-(L-D)p(式I)，其中Ab＝抗体部分(即抗体或抗原结合片段)，L＝连接子部分，D＝药物部分，并且p＝药物部分的数目/抗体部分。在一些实施例中，连接子L可以包括在抗体或抗原结合片段与治疗性化合物之间的可切割部分。在一些实施例中，连接子L可以包括可例如通过间隔子单元与抗体或抗原结合片段和治疗性化合物中的任一者或两者附接的可切割部分。本文描述并举例说明了示例性可切割连接子。
术语“抗体”在最广泛意义上用于指通过免疫球蛋白分子的可变区内的至少一个抗原识别位点识别且特异性结合靶标(如蛋白质、多肽、碳水化合物、多核苷酸、脂质或前述物质的组合)的免疫球蛋白分子。抗体的重链(HC)由重链可变结构域(VH)和重链恒定区(CH)构成。轻链(LC)由轻链可变结构域(VL)和轻链恒定结构域(CL)构成。如本文所用，术语“结构域”和“区域”可互换使用(例如，术语“可变结构域”可与术语“可变区”互换使用，并且被理解为是指抗体的同一部分)。出于本申请的目的，成熟的重链和轻链可变结构域各自包含从N末端至C末端排列的四个框架区(FR1、FR2、FR3和FR4)内的三个互补决定区(CDR1、CDR2和CDR3；也称为“高可变区”)：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。CDR可以根据Kabat和/或IMGT编号系统进行鉴定(Kabat,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest[具有免疫学意义的蛋白质序列](National Institutes of Health[国立卫生研究院],贝塞斯达,马里兰州(1987和1991)；国际免疫遗传学信息系统(InternationalImMunoGeneTics Information System))。“抗体”可以是天然存在的或人造的，例如通过常规杂交瘤技术产生的单克隆抗体。术语“抗体”包括全长单克隆抗体和全长多克隆抗体，以及例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv的抗体片段，以及单链抗体。抗体可以是免疫球蛋白的五种主要类别中的任一种：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，或其亚类(例如，同种型IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)。任一上述类别或亚类的抗体还可以包含两个功能相似类别的轻链之一：Igκ(本文中也称为“Ig kappa”或“kappa”)和Igλ(本文中也称为“Ig lambda”或“lambda”)。术语“抗体”涵盖人抗体、嵌合抗体、人源化抗体及含有抗原识别位点的任何经修饰的免疫球蛋白分子，只要其表现出所需生物活性即可。
如本文所用的术语“嵌合抗体”是指其中免疫球蛋白分子的氨基酸序列来源于两个或更多个物种的抗体。在一些情况下，重链和轻链两者的可变区对应于来源于具有所需特异性、亲和力和活性特性的一个物种的抗体的可变区，而恒定区与来源于另一物种(例如人)的抗体同源以使后一物种中的免疫反应减至最少。
如本文所用的术语“人抗体”是指由人产生的抗体或具有由人产生的抗体的氨基酸序列的抗体。
如本文所用，术语“人源化抗体”是指含有来自非人(例如鼠)抗体以及人抗体的序列的抗体形式。这样的抗体是含有来源于非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。通常，人源化抗体将包含至少一个且通常两个可变结构域的实质上全部，其中所有或实质上所有的高可变区对应于非人免疫球蛋白的那些高可变区且所有或实质上所有的框架(FR)区是人免疫球蛋白序列的那些框架区。人源化抗体任选地还将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的恒定区的至少一部分。人源化抗体可以通过Fv框架区中和/或所替代的非人残基内残基的取代而进一步修饰，以改进并优化抗体特异性、亲和力和/或活性。人源化抗体还可以通过Fc结构域中残基的取代而进一步修饰，以减少其与各种细胞受体(如Fcγ受体(FcγR)和其他免疫分子)的结合。
如本文所用的术语“单克隆抗体”是指从实质上均质的抗体群体获得的抗体，即，除了可能少量存在的可能的天然存在的突变之外，构成该群体的各个抗体是相同的。单克隆抗体针对单一抗原性表位具有高度特异性。相反，常规的(多克隆)抗体制剂通常包括针对不同表位或对其具有特异性的多种抗体。修饰语“单克隆”表示从实质上均质的抗体群体获得的抗体的特征，而不应解释为要求通过任何特定方法生产抗体。例如，根据本披露使用的单克隆抗体可通过首先由Kohler等人(1975)Nature[自然]256:495描述的杂交瘤方法来制造，或可通过重组DNA方法来制造。参见，例如美国专利号4,816,567。还可以使用例如Clackson等人(1991)Nature[自然]352:624-8以及Marks等人(1991)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]222:581-97中描述的技术从噬菌体抗体文库分离单克隆抗体。
本文所述的单克隆抗体具体地包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与来源于特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的对应序列相同或同源，而该链的其余部分与来源于另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体、以及这样的抗体的片段中的对应序列相同或同源，只要它们特异性结合靶抗原和/或展现出所需生物活性即可。
如本文所用的术语抗体的“抗原结合片段”或“抗原结合部分”是指抗体中保留特异性结合抗原(例如PSMA)的能力的一个或多个片段。抗原结合片段优选地还保留了内化到表达抗原的细胞中的能力。在一些实施例中，抗原结合片段还保留了免疫效应子活性。已证明全长抗体的片段可执行全长抗体的抗原结合功能。术语抗体的“抗原结合片段”或“抗原结合部分”内所涵盖的结合片段的实例包括(i)Fab片段，一种由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，一种包含通过铰链区处的二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)dAb片段，其包含单一可变结构域，例如VH结构域(参见，例如Ward等人(1989)Nature[自然]341:544-6；和Winter等人,WO 90/05144)；以及(vi)分离的互补决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由单独的基因编码，但它们可以使用重组方法通过能够使其制成单条蛋白质链的合成连接子来接合，在该单条蛋白质链中，VL和VH区配对以形成单价分子(称为单链Fv(scFv))。参见，例如Bird等人(1988)Science[科学]242:423-6；和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]85:5879-83。这样的单链抗体也意图涵盖在术语抗体的“抗原结合片段”或“抗原结合部分”内，并且在本领域中已知为能在结合时内化到细胞中的示例性结合片段类型。参见，例如Zhu等人(2010)9:2131-41；He等人(2010)J Nucl.Med.[核医学杂志]51:427-32；和Fitting等人(2015)MAbs[单克隆抗体]7:390-402。在某些实施例中，scFv分子可掺入融合蛋白中。还涵盖了单链抗体(例如双抗体)的其他形式。双抗体是二价双特异性抗体，其中VH和VL结构域在单条多肽链上表达，但使用太短而不允许同一链上的两个结构域之间进行配对的连接子，由此迫使这些结构域与另一链的互补结构域配对且产生两个抗原结合位点。参见，例如Holliger等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]90:6444-8；和Poljak等人(1994)Structure[结构]2:1121-3)。抗原结合片段使用本领域技术人员已知的常规技术获得，并且这些结合片段以与完整抗体相同的方式进行效用(例如，结合亲和力、内化)筛选。抗原结合片段可例如通过切割完整蛋白，例如通过蛋白酶或化学切割来制备。
术语“抗PSMA抗体”或“特异性结合PSMA的抗体”是指特异性结合PSMA的抗体或其片段的任何形式，并且涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体和具有生物学功能的抗体片段，只要它们特异性结合PSMA即可。优选地，本文披露的ADC中使用的抗PSMA抗体是内化抗体或内化抗体片段。如本文所用，术语“特异性”、“特异性结合(specificallybinds和binds specifically)”是指抗体与靶抗原或表位相对于替代抗原或表位的选择性结合。可通过在一组给定条件下将与适当抗原的结合同与不相关抗原或抗原混合物的结合进行比较来测试抗体的结合特异性。如果抗体与适当抗原的结合亲和力比与不相关抗原或抗原混合物的结合亲和力高至少2倍，或优选至少50倍、至少100倍、或至少1000倍，则它被认为是特异性的，例如，如通过表面等离子共振所测量的，例如分析。在一个实施例中，特异性抗体是结合PSMA抗原但不结合其他抗原(或展现出与其他抗原的最小结合)的抗体。
术语“芳基”是指来源于芳族环的基团或取代基，并且涵盖单环芳族环以及二环、三环和稠环系统(总共具有六至十四个环成员)，其中该系统中的至少一个环是芳族的。芳基基团可以任选地被一个或多个取代基取代。
术语“杂芳基”是指包含至少一个为杂原子(例如O、N或S)的环原子的环状基团。杂芳基基团涵盖总共具有五至十四个环成员的单环、二环和三环系统，其中该系统中的至少一个环是芳族的，该系统中的至少一个环含有一个或多个杂原子，并且其中该系统中的每个环含有三至七个环成员。
术语“至少一个”是指一个或多个。
术语“桥”是指本披露的大环桥接的STING激动剂化合物中的一组原子，其从该大环桥接的STING激动剂化合物中的第一核酸碱基延伸至该大环桥接的STING激动剂化合物中的第二核酸碱基。
术语“癌症”是指哺乳动物中的生理病况，其中细胞群的特征为不受调控的细胞生长。癌症的实例包括但不限于癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病。这样的癌症的更特定的实例包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞癌、胆道癌(例如胆管癌)、食道癌、鼻咽癌、腹膜癌、肝细胞癌(hepatocellular cancer)(例如肝细胞癌(hepatocellular carcinoma))、胃肠癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、骨肉瘤、皮肤癌(例如黑色素瘤)、结肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、卵巢癌、唾液腺癌、肾癌、肝癌、前列腺癌(例如晚期前列腺癌、转移性去势抵抗性前列腺癌)、外阴癌、甲状腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)、骨癌和各种类型的头颈癌。
术语“癌细胞”和“肿瘤细胞”是指来源于肿瘤的单个细胞或总细胞群，包括非致瘤细胞和癌症干细胞。当仅提及缺乏更新和分化能力的那些肿瘤细胞时，如本文所用的术语“肿瘤细胞”将由术语“非致瘤”修饰以将那些肿瘤细胞与癌症干细胞进行区分。
术语“肿瘤”和“赘瘤”是指由过量细胞生长或增殖造成的良性或恶性的任何组织肿块，包括癌前病变。
术语“化疗剂”或“抗癌剂”在本文中用于指不管作用机制如何，均有效治疗癌症的化合物。抑制转移或血管生成通常是化疗剂的特性。刺激抗肿瘤免疫反应也可能是化疗剂的特性。化疗剂的非限制性实例包括刺激剂，例如STING激动剂。此外，化疗剂包括抗体、生物分子和小分子。化疗剂可以是细胞毒性剂或细胞生长抑制剂。
术语“细胞毒性剂”是指通过干扰细胞的表达活性和/或功能或者通过刺激导致细胞死亡的反应(例如免疫反应)而导致细胞死亡的物质。细胞毒性剂的实例包括但不限于STING激动剂，例如化合物1。
如本文所披露的ADC的“有效量”是足以进行具体陈述的目的(例如，在施用后产生治疗性效果，例如减小肿瘤生长速率或肿瘤体积、减少癌症症状或治疗功效的一些其他指标)的量。有效量可以以与所陈述目的相关的常规方式来测定。术语“治疗有效量”是指有效治疗受试者的疾病或病症的ADC的量。在癌症的情况下，治疗有效量的ADC可减少癌细胞的数目、减小肿瘤尺寸、抑制(例如减缓或停止)肿瘤转移、抑制(例如减缓或停止)肿瘤生长和/或缓解一种或多种症状。“预防有效量”是指在必要的剂量下和时间段内有效实现所需预防结果的量。典型地，因为预防剂量在疾病之前或在疾病早期阶段时用于受试者中，所以预防有效量将小于治疗有效量。
术语“表位”是指能够由抗体识别且特异性结合的抗原部分。当抗原是多肽时，表位可以由连续氨基酸或通过多肽的三级折叠并置的非连续氨基酸形成。抗体所结合的表位可使用本领域中已知的任何表位作图技术来鉴定，该表位作图技术包括用于表位鉴定的X射线结晶学(其通过直接目测抗原-抗体复合物进行)，以及监测抗体与抗原的片段或突变型变体的结合，或监测抗体和抗原的不同部分的溶剂可及性。用于给抗体表位作图的示例性策略包括但不限于基于阵列的寡肽扫描、限制性蛋白水解、定点诱变、高通量诱变作图、氢-氘交换和质谱法。参见，例如Gershoni等人(2007)21:145-56；以及Hager-Braun和Tomer(2005)Expert Rev.Proteomics[蛋白质组学专家评论]2:745-56)。
如本文所用的术语“化合物1”是指如下所示的化合物1或其盐的结构：
化合物1是一种大环桥接的STING激动剂(MBSA)，具有锁定的环状二核苷酸的生物活性U形构象，在核酸碱基之间包含跨环大环桥。如本文所用，“化合物1”可以包括化合物1的盐，例如化合物1的二铵盐和/或钠盐。术语“化合物1部分”、“E7766”、“E7766激动剂部分”或“E7766部分”是指ADC的组分，其具有化合物1的结构，并且例如通过化合物1部分的N-34氮、N-39氮、S-2硫或S-14硫与ADC的连接子附接。WO 2018/152450披露了包括施用化合物1的抑制患者肿瘤生长的组合物和方法，将该专利的所有化合物1结构和合成这些结构的方法通过引用以其全文并入本文。
如本文所提及的，化合物1中的原子可以如下所示进行编号：
如本文所用的术语“化合物2”是指如下所示的化合物2或其盐的结构：
如本文所提及的，化合物2中的原子可以如下所示进行编号：
在本披露的各个实施例中，“N-34氮”、“N-39氮”、“S-2硫”或“S-14硫”可用于指其他STING激动剂中的氮或硫原子，这些氮或硫原子对应于化合物1或化合物2中经编号的氮或硫原子，无论这些原子是否根据命名规则以其他方式进行编号。在一些情况下，对于具有式(III)、式(IV)的化合物或表14的化合物、例如化合物1或化合物2，在N-34氮处附接的L-D缀合物可称为“RN”或“RN”，而在N-39氮处附接的L-D缀合物可被称为“SN”或“SN”。
“Fcγ受体”、“Fc-gamma受体”或“FcγR”是指通常在各种类型的免疫细胞(例如中性粒细胞)上发现的细胞表面蛋白。抗体的Fc区与Fcγ受体的结合可以诱导不同的效应子功能，例如抗体依赖性细胞毒性(ADCC)或抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)。
如本文所用，术语“卤素”或“卤代”意指F、Cl、Br或I。
术语“同源物”是指通过例如在对应位置处具有相同或类似的化学残基的序列而展现与另一分子的同源性的分子。
如本文所用的术语“IgG1 Fc”、“IgG1 Fc结构域”或“含有IgG1 Fc的抗体”是指至少具有IgG1 CH2和CH3结构域的抗体，如分别由SEQ ID NO:70和SEQ ID NO:71所鉴定的。
“野生型IgG1 Fc结构域”是指包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列或其片段的人IgG1Fc结构域。
如本文所用的术语“抑制(inhibit或inhibition of)”意指减少可测量的量，并且可包括但不需要完全预防或抑制。
如本文关于抗体或抗原结合片段所用的“内化”是指抗体或抗原结合片段在与细胞结合时能够穿过细胞的脂质双层膜进入内部隔室(即，“内化”)，优选进入细胞中的降解隔室中。例如，内化抗PSMA抗体是一种在与细胞膜上的PSMA结合后能够进入细胞中的抗体。
术语“KD”是指特定抗体-抗原相互作用的平衡解离常数。KD通过ka/kd来计算。该速率可以使用标准测定(如或ELISA测定)来测定。
术语“kon”或“ka”是指抗体与抗原缔合以形成抗体/抗原复合物的缔合速率常数。该速率可以使用标准测定(如或ELISA测定)来测定。
术语“koff”或“kd”是指抗体自抗体/抗原复合物解离的解离速率常数。该速率可以使用标准测定(如或ELISA测定)来测定。
“连接子”或“连接子部分”指能够将化合物、通常是药物部分(如化疗剂)与另一部分(如抗体部分)共价接合的任何化学部分。连接子可以在化合物或抗体仍保持活性的条件下易于以下切割或对以下切割有实质性抗性：酸诱导的切割、肽酶诱导的切割、基于光的切割、酯酶诱导的切割和/或二硫键切割。“可切割连接子”是包含可切割部分并且可因此易于切割的任何连接子。可切割部分可以是可切割肽部分。术语“可切割肽部分”是指可被细胞内环境中存在的药剂切割的任何化学键连接的氨基酸(天然或合成氨基酸衍生物)。
除非另外指示其具体使用情形，否则“或”的使用意指“和/或”。
术语“p”或“抗体:药物比率”或“药物与抗体比率”或“DAR”是指药物部分的数目/抗体部分，即载药量，或具有式I的ADC中L-D部分的数目/抗体或抗原结合片段(Ab)。在包括具有式I的ADC的多个拷贝的组合物中，“p”是指L-D部分的平均数目/抗体或抗原结合片段，也被称为平均载药量。
“药物组合物”是指呈准许施用活性成分且随后提供活性成分的预期生物活性和/或实现治疗性效果的形式，且不含对应施用配制品的受试者具有不可接受毒性的额外组分的制剂。药物组合物可以是无菌的。
“药物赋形剂”包含例如辅助剂、载剂、pH调节剂和缓冲剂、张力调节剂、润湿剂、防腐剂等的材料。
“药学上可接受的”意指美国联邦管理机构或州政府审批通过或可由其审批通过，或美国药典(U.S.Pharmacopeia)或其他普遍公认药典中列出可用于动物且更特别地用于人。
如本文所用，术语“π键”意指由相邻原子的p轨道形成的共价键。当两个原子之间存在多重键(即双键或三键)时，就存在π键。例如，碳-碳双键由一个π键组成，而碳-碳三键由两个π键组成。
如本文所用的术语“前列腺特异性膜抗原”或“PSMA”是指人PSMA的任何天然形式。该术语涵盖全长PSMA(例如，NCBI参考序列：NP_004467.1；SEQ ID NO:67)，以及由细胞加工产生的任何形式的人PSMA。该术语还可涵盖天然存在的PSMA的变体，包括但不限于剪接变体、等位基因变体和异形体。结合PSMA的抗体可能不结合所有变体，这对于本领域技术人员来说是显而易见的。PSMA可以从人中分离，或者可以以重组方式或通过合成方法产生。术语“PSMA”和“前列腺特异性膜抗原”可与“谷氨酸羧肽酶II(GCPII)”、“叶酸水解酶1”、“N-乙酰化-α-连接的酸性二肽酶I(NAALAD酶I)”和本领域已知的由FOLH1编码的蛋白质的任何其他名称互换。
如本文所用的术语“保护基团”是指通过官能团的化学修饰引入分子中以获得后续化学反应中的化学选择性的任何化学基团。
添加(通常称为“保护”的方法)和去除(通常称为“去保护”的方法)保护基团的方法是本领域熟知的并且可见于例如：P.J.Kocienski,Protecting Groups[保护基团],第3版(Thieme[德国蒂墨出版集团],2005)以及Greene和Wuts,Protective Groupsin OrganicSynthesis[有机合成中的保护基团],第4版(John Wiley&Sons[约翰威利父子公司],纽约,2007)，将这两者通过引用以其全文特此并入。
可用于本披露的胺的有用保护基团的非限制性实例包括单价保护基团，例如叔丁氧基羰基(Boc)、苄基(Bn)、9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)、苄氧基羰基(Cbz)、甲酰基、乙酰基(Ac)、三氟乙酰基(TFA)和对甲苯磺酰基(Ts)；以及二价保护基团，例如亚苄基、N-邻苯二甲酰亚胺、N-二硫杂琥珀酰亚胺、N-2,3-二苯基马来酰亚胺、N-2,3-二甲基马来酰亚胺和N-2,5-二甲基吡咯。
可用于本披露的醇的有用保护基团的非限制性实例包括例如，乙酰基(Ac)、苯甲酰基(Bz)、苄基(Bn)、β-甲氧基乙氧基甲基(MEM)、二甲氧基三苯甲基(DMT)、甲氧基甲基(MOM)、甲氧基三苯甲基(MMT)、对甲氧基苄基(PMB)、新戊酰基(Piv)、四氢吡喃基(THP)、三苯甲基(Tr)、4-硝基苯基碳酸酯、三甲基甲硅烷基(TMS)、三乙基甲硅烷基(TES)、三异丙基甲硅烷基(TIPS)、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBS)和叔丁基二苯基甲硅烷基(TBDPS)。
可用于本披露的羧酸的有用保护基团的非限制性实例包括例如，甲基酯或乙基酯、经取代的烷基酯如9-芴基甲基、甲氧基甲基(MOM)、四氢吡喃基(THP)、四氢呋喃基、β-甲氧基乙氧基甲基(MEM)、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基甲基(SEM)、苄氧基甲基(BOM)、乙酰基(Ac)、苯甲酰甲基、经取代的苯甲酰甲基酯、叔丁基、烯丙基、苯基(Ph)、甲硅烷基酯、苄基和经取代的苄基酯、2,6-二烷基苯基和五氟苯基(PFP)。
可用于本披露的胺碱的非限制性实例包括例如，1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU)、N-甲基吗啉(NMM)、三乙胺(Et3N；TEA)、二异丙基乙胺(i-Pr2EtN；DIPEA)、吡啶、2,2,6,6-四甲基哌啶、1,5,7-三氮杂双环[4.4.0]癸-5-烯(TBD)、7-甲基-1,5,7-三氮杂双环[4.4.0]癸-5-烯(MTBD)、t-Bu-四甲基胍、1,5-二氮杂双环[4.3.0]壬-5-烯(DBN)、双(三甲基甲硅烷基)酰胺锂(LiHMDS)和双(三甲基甲硅烷基)酰胺钾(KHMDS)。
可用于本披露的碱性碳酸盐的非限制性实例包括例如，碳酸钠(Na2CO3)、碳酸钾(K2CO3)、碳酸铯(Cs2CO3)、碳酸锂(Li2CO3)、碳酸氢钠(NaHCO3)和碳酸氢钾(KHCO3)。
可用于本披露的碱性磷酸盐的非限制性实例包括例如，磷酸三钠(Na3PO4)、磷酸三钾(K3PO4)、磷酸氢二钾(K2HPO4)和磷酸二氢钾(KH2PO4)。
可用于本披露的酸的非限制性实例包括例如，乙酸(AcOH)、三氟乙酸(TFA)、盐酸(HCl)、樟脑磺酸(CSA)、甲磺酸(MsOH)、甲酸(FA)、磷酸(H3PO4)和硫酸(H2SO4)。
肽偶联试剂的非限制性实例包括例如，N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)、1-乙基-3-[3-(二甲基氨基)丙基]碳二亚胺(EDCI)、4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉-4-鎓氯化物(DMT-MM)、1-乙氧基羰基-2-乙氧基-1,2-二氢喹啉(EEDQ)、1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸盐(HATU)、1-羟基苯并三唑(HOBT)和N,N,N,N'-四甲基-O-(N-琥珀酰亚胺基)脲四氟硼酸盐(TSTU)。
对于氨基酸序列，可以通过使用本领域已知的标准技术、或通过检查来测定序列同一性和/或相似性，这些技术包括但不限于以下：Smith和Waterman,(1981),Adv.Appl.Math.[应用数学进展]2:482的局部序列同一性算法、Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443的序列同一性比对算法、Pearson和Lipman(1988)Proc.Nat.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]85:2444的相似性搜索方法、这些算法的计算机化实现(威斯康辛遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，遗传学计算机组(Genetics Computer Group),科学路575号,麦迪逊,威斯康星州)、Devereux等人(1984)Nucl.Acid Res.[核酸研究]12:387-95描述的最佳拟合序列程序(优选地使用默认设置)。优选地，同一性百分比通过FastDB基于以下参数来计算：错配罚分1；空位罚分1；空位尺寸罚分0.33；以及接合罚分30。参见“Current Methodsin Sequence Comparison andAnalysis[当前序列比较和分析方法]”,Macromolecule Sequencing and Synthesis,Selected Methods and Applications[大分子测序与合成、所选方法与应用],第127-149页(1988),Alan R.Liss,Inc.[艾伦利斯出版公司]。
有用算法的一个实例是PILEUP。PILEUP使用渐进性成对比对由一组相关序列产生多序列比对。它还可以绘制显示用于产生该比对的聚类关系的树形图。PILEUP使用Feng和Doolittle(1987)J.Mol.Evol.[分子进化杂志]35:351-60的渐进性比对方法的简化形式；该方法类似于Higgins和Sharp(1989)CABIOS[计算机在生物学中的应用]5:151-3所述的方法。有用的PILEUP参数包括默认空位权重3.00、默认空位长度权重0.10、以及加权的末端空位。
有用算法的另一实例是BLAST算法。参见，例如Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]215:403-10；Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.[核酸研究]25:3389-402；和Karin等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]90:5873-87。特别有用的BLAST程序是从Altschul等人(1996)Methodsin Enzymology[酶学方法]266:460-80获得的WU-BLAST-2程序。WU-BLAST-2使用几个搜索参数，其中大部分设置为默认值。可调参数按以下值设置：重叠跨度＝l、重叠分数＝0.125、字串阈值(T)＝II。HSP S和HSP S2参数是动态值，并且通过程序本身根据特定序列的组成和检索目的序列的特定数据库的组成而确立；然而，可以调整这些值以增加灵敏度。
额外的有用算法是Altschul等人(1993)Nucl.Acids Res.[核酸研究]25:3389-402所报告的带空位的BLAST。带空位的BLAST使用BLOSUM-62取代评分；阈值T参数设置为9；两次命中方法(two-hit method)用于触发无空位的延伸，电荷空位长度为k，代价为10+k；Xu设置为16，而Xg在数据库检索阶段设置为40且在算法输出阶段设置为67。带空位的比对通过对应于约22比特的评分触发。
通常，本文披露的蛋白质及其变体(例如，保留原始蛋白质功能的变体)，包括PSMA的变体和抗体可变结构域的变体(包括个别变体CDR)，具有至少80％的氨基酸同源性、相似性或同一性，且更典型地至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％和几乎100％或100％的同源性或同一性。
以类似方式，关于本文鉴定的抗体和其他蛋白质的核酸序列的“核酸序列同一性百分比(％)”被定义为候选序列中与抗原结合蛋白编码序列中的核苷酸残基相同的核苷酸残基的百分比。具体的方法使用设置为默认参数的WU-BLAST-2的BLASTN模块，其中重叠跨度和重叠分数分别设置为1和0.125。
如本文所用的术语“稳定的”是指如下化合物，在出于本文披露的一个或多个目的而经受其产生、检测和优选地其回收、纯化和使用的条件时，它们基本上不发生改变。
术语“受试者”与“患者”在本文中可互换用于指任何动物，如任何哺乳动物，包括但不限于人、非人灵长类动物、啮齿动物等。在一些实施例中，哺乳动物是小鼠。在一些实施例中，哺乳动物是人。
术语“靶标阴性”或“靶抗原阴性”是指细胞或组织不存在靶抗原表达。术语“靶标阳性”或“靶抗原阳性”是指存在靶抗原表达。例如，不表达靶抗原的细胞或细胞系可描述为靶标阴性的，而表达靶抗原的细胞或细胞系可描述为靶标阳性的。
如本文所用，术语“溶剂”是指产物至少部分可溶于其中(产物的溶解度>1g/L)的任何液体。
如本文所用，术语“异构体”是指具有相同分子式但原子或键的空间排列不同的化合物。异构体包括立体异构体、顺反异构体、阻转异构体和互变异构体。
如本文所用，术语“立体异构体”是指对映异构体和非对映异构体两者。
应当理解，本发明的某些化合物可以作为单独的立体异构体或对映异构体和/或那些立体异构体或对映异构体的混合物存在。如本文披露的化学结构中所用，立构原子的“楔形(wedge)”或“散形(hash)”键表示已知绝对立体化学的手性中心(即，一种立体异构体)。如本文所用，用(R)或(S)表示的立构原子表示根据Cahn-Ingold-Prelog惯例该立构原子的立体化学名称。如本文披露的化学结构中所用，立构原子的(“直形”)键表示存在混合物(例如外消旋体或富集物)。如本文所用，双键碳的两个(“直形”)键表示双键具有如图所示的E/Z立体化学。
本文披露的某些化合物可以作为互变异构体存在，并且两种互变异构形式都是预期的，即使仅描述了单个互变异构结构。
本披露还提供了用于制备本披露化合物的盐的方法。
本披露的化合物的盐是在酸和化合物的碱性基团(如氨基官能团)之间，或碱和化合物的酸性基团(如羧基官能团)之间形成的。根据化合物中的碱性或酸性基团与酸或碱的化合价的比率，一种化合物可以与酸/碱的一个或多个分子单元形成盐，或者多个单元的化合物可以与一个单元的酸/碱形成盐。在一些实施例中，盐是钠盐。在一些实施例中，盐是二铵盐。在一些实施例中，盐是二烷基铵盐。在一些实施例中，盐是双(三乙铵)盐。
如本文所用的术语“干扰素基因刺激因子”或“STING”是指人STING的任何天然形式。该术语涵盖全长STING(例如，NCBI参考序列：NP_938023.1；SEQ ID NO:68)，以及由细胞加工产生的任何形式的人STING。该术语还涵盖天然存在的STING的变体，包括但不限于剪接变体、等位基因变体和异形体。STING可以从人中分离，或者可以以重组方式或通过合成方法产生。
如本文所用，“治疗”或“治疗性”和语法上相关的术语是指疾病的任何后果的任何改善，如延长的存活期、较低的发病率和/或减轻的由替代治疗性模式引起的副作用。如本领域容易理解的，完全根除疾病是治疗行为优选的，但不是必需的。如本文所用的“治疗(treatment或treat)”是指将所述ADC或抗体施用至受试者、例如患者。治疗可以是治愈、愈合、减轻、缓解、改变、补救、改善、缓和、改良或影响病症(例如癌症)、病症的症状或患病症的倾向性。
如本文所用，术语“不饱和”意指部分具有一个或多个不饱和单元。
抗PSMA抗体和抗原结合片段
本披露提供了特异性结合PSMA并且可以单独使用的抗体，例如配制为治疗性或诊断性抗体组合物，例如用于在治疗或检测表达PSMA的癌症中使用。可以将这些抗体包装或制备用于治疗性用途，作为抗体、其抗原结合片段或作为ADC的部分。
本文披露的抗体可以以≤1mM、≤100nM、或≤10nM或其间的任何量的解离常数(KD)结合PSMA，如通过例如分析所测量的。在一些实施例中，KD是500pM至1nM或1nM至10nM。在一些实施例中，KD是≤10nM、≤5nM、≤1nM、或≤0.5nM。
在一些实施例中，抗体是包含两条重链和两条轻链的四链抗体(也称为免疫球蛋白)。在一些实施例中，抗体是双链半抗体(一条轻链和一条重链)或免疫球蛋白的抗原结合片段。
在一些实施例中，抗体是内化抗体或其内化抗原结合片段。在一些实施例中，内化抗体结合细胞表面表达的PSMA并在结合时或结合后进入细胞。在一些实施例中，ADC的药物部分在ADC进入之后从ADC的抗体部分释放且存在于表达PSMA的细胞中(即在ADC已内化之后)。在一些实施例中，内化抗体结合细胞的细胞表面表达的PSMA，并且该细胞随后被吞噬(例如，发生抗体依赖性细胞吞噬作用)。在一些实施例中，ADC的药物部分在ADC进入之后从ADC的抗体部分释放且存在于吞噬细胞(例如巨噬细胞、树突状细胞)中。
本文披露的特异性结合PSMA蛋白的抗体可以包含三个重链CDR(HCDR1、HCDR2和HCDR3)，其具有选自下文表1和/或3中列出的HC CDR的氨基酸序列，如由Kabat编号系统所定义的，和三个轻链CDR(LCDR1、LCDR2和LCDR3)，其具有选自下文表1和/或3中列出的LCCDR的氨基酸序列，如由Kabat编号系统所定义的。在一些实施例中，抗体包含三个重链CDR(HCDR1、HCDR2和HCDR3)，其具有选自下文表5中列出的HC CDR的氨基酸序列，如由IMGT编号系统所定义的，和三个轻链CDR(LCDR1、LCDR2和LCDR3)，其具有选自下文表5中列出的LCCDR的氨基酸序列，如由IMGT编号系统所定义的。
在一些实施例中，本文披露的抗体包含VH结构域，其具有选自下文表2和/或7中列出的SEQ ID NO:1-14的氨基酸序列。在一些实施例中，抗体包含VL结构域，其具有选自下文表2和/或7中列出的SEQ ID NO:15-20的氨基酸序列。
在一些实施例中，本文披露的抗原结合片段保留PSMA结合。在一些实施例中，抗原结合片段通过包含以下而保留PSMA结合：三个重链CDR(HCDR1、HCDR2和HCDR3)，其包含选自下文表1和/或3中列出的HC CDR的氨基酸序列，如由Kabat编号系统所定义的，和三个轻链CDR(LCDR1、LCDR2和LCDR3)，其包含选自下文表1和/或3中列出的LC CDR的氨基酸序列，如由Kabat编号系统所定义的。在一些实施例中，抗原结合片段包含三个重链CDR(HCDR1、HCDR2和HCDR3)，其包含选自下文表5中列出的HC CDR的氨基酸序列，如由IMGT编号系统所定义的，和三个轻链CDR(LCDR1、LCDR2和LCDR3)，其包含选自下文表5中列出的LC CDR的氨基酸序列，如由IMGT编号系统所定义的。在一些实施例中，本文披露的抗原结合片段可通过包含以下而保留PSMA结合：VH结构域，其包含选自下文表2和/或7中列出的SEQ ID NO:1-14的氨基酸序列，和VL结构域，其包含选自下文表2和/或7中列出的SEQ ID NO:15-20的氨基酸序列。
在一些实施例中，抗PSMA抗体或抗原结合片段包含三个HCDR，其包含以下氨基酸序列：SEQ ID NO:21(HCDR1)、SEQ ID NO:44(HCDR2)和SEQ ID NO:27(HCDR3)；以及三个LCDR，其包含SEQ ID NO:45(LCDR1)、SEQ ID NO:46(LCDR2)和SEQ ID NO:37(LCDR3)，如由Kabat编号系统所定义的。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段包含IgG1结构域。
在一些实施例中，抗PSMA抗体或抗原结合片段包含三个HCDR，其包含以下氨基酸序列：SEQ ID NO:21(HCDR1)、SEQ ID NO:22(HCDR2)和SEQ ID NO:27(HCDR3)；以及三个LCDR，其包含SEQ ID NO:32(LCDR1)、SEQ ID NO:35(LCDR2)和SEQ ID NO:37(LCDR3)，如由Kabat编号系统所定义的；或三个HCDR，其包含以下氨基酸序列：SEQ ID NO:28(HCDR1)、SEQID NO:29(HCDR2)和SEQ ID NO:30(HCDR3)；以及三个LCDR，其包含SEQ ID NO:38(LCDR1)、SEQ ID NO:39(LCDR2)和SEQ ID NO:37(LCDR3)，如由IMGT编号系统所定义的。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQID NO:19的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段包含IgG1结构域。
在一些实施例中，本文披露的抗PSMA抗体和抗原结合片段具有有利的热稳定性。在一些实施例中，本文披露的抗PSMA抗体或抗原结合片段具有>70℃、>75℃、或>80℃的解链温度(Tm)。在一些实施例中，本文披露的抗PSMA抗体或抗原结合片段具有>80℃的解链温度(Tm)。在一些实施例中，本文披露的抗PSMA抗体或抗原结合片段具有比替代抗PSMA抗体(例如J591和deJ591)更高的解链温度(Tm)。参见美国专利号11,059,903和美国专利号7,045,605。
可选择抗PSMA抗体或抗原结合片段以改进或保留多种因素，包括保留靶标结合亲和力、增强热稳定性和/或最大限度地减少免疫原性。在一些实施例中，选择在多于一种类别中展现出优异性的抗PSMA抗体。在一些实施例中，选择在多于一种类别中展现出改进的抗PSMA抗体，即使不一定是任何一种类别中最好的抗体。
在一些实施例中，选择如下抗PSMA抗体或抗原结合片段，该抗PSMA抗体或抗原结合片段包含三个HCDR，其包含以下氨基酸序列：SEQ ID NO:21(HCDR1)、SEQ ID NO:22(HCDR2)和SEQ ID NO:27(HCDR3)；以及三个LCDR，其包含SEQ ID NO:32(LCDR1)、SEQ IDNO:35(LCDR2)和SEQ ID NO:37(LCDR3)，如由Kabat编号系统所定义的；或三个HCDR，其包含以下氨基酸序列：SEQ ID NO:28(HCDR1)、SEQ ID NO:29(HCDR2)和SEQ ID NO:30(HCDR3)；以及三个LCDR，其包含SEQ ID NO:38(LCDR1)、SEQ ID NO:39(LCDR2)和SEQ ID NO:37(LCDR3)，如由IMGT编号系统所定义的，与其他抗PSMA抗体(例如J591和/或deJ591)相比，该抗PSMA抗体或抗原结合片段展现出保留的靶标结合亲和力、增强的热稳定性和最大限度减少的免疫原性。在一些实施例中，选择如下抗PSMA抗体或抗原结合片段，该抗PSMA抗体或抗原结合片段包含三个HCDR，其包含以下氨基酸序列：SEQ ID NO:21(HCDR1)、SEQ ID NO:22(HCDR2)和SEQ ID NO:27(HCDR3)；以及三个LCDR，其包含SEQ ID NO:32(LCDR1)、SEQ IDNO:35(LCDR2)和SEQ ID NO:37(LCDR3)，如由Kabat编号系统所定义的；或三个HCDR，其包含以下氨基酸序列：SEQ ID NO:28(HCDR1)、SEQ ID NO:29(HCDR2)和SEQ ID NO:30(HCDR3)；以及三个LCDR，其包含SEQ ID NO:38(LCDR1)、SEQ ID NO:39(LCDR2)和SEQ ID NO:37(LCDR3)，如由IMGT编号系统所定义的，与其他抗PSMA抗体(例如J591、deJ591和/或本文披露的抗PSMA抗体)相比，该抗PSMA抗体或抗原结合片段展现出保留的靶标结合亲和力和最大限度减少的免疫原性。
在一些实施例中，选择如下抗PSMA抗体或抗原结合片段，该抗PSMA抗体或抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的轻链可变区，与其他抗PSMA抗体(例如J591和/或deJ591)相比，该抗PSMA抗体或抗原结合片段展现出保留的靶标结合亲和力、增强的热稳定性和最大限度减少的免疫原性。在一些实施例中，选择如下抗PSMA抗体或抗原结合片段，该抗PSMA抗体或抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的轻链可变区，与其他抗PSMA抗体(例如J591、deJ591和/或本文披露的抗PSMA抗体)相比，该抗PSMA抗体或抗原结合片段展现出保留的靶标结合亲和力和最大限度减少的免疫原性。
在一些实施例中，本文披露的抗体可以包含IgG恒定结构域，例如IgG1结构域或与含野生型恒定结构域(例如，含野生型IgG1)的抗体相比已被修饰以减少与Fc受体、例如Fcγ受体(FcγR)的结合的IgG1结构域。与Fc受体、例如FcγR的结合的减少可以通过与不含修饰的抗体与同一受体的结合进行比较来测量。与含有未修饰的恒定结构域的抗体相比，结合的减少可以是至少约10倍，并且优选至少约100倍。结合的减少可以使用本领域已知的任何测定来测量。例如，结合的减少可以使用荧光共振能量转移(FRET)测定来测量。
在一些实施例中，本文披露的抗体可以包含IgG恒定结构域，例如IgG1结构域或与含野生型恒定结构域(例如，含野生型IgG1)的抗体相比已被修饰以增加与Fc受体、例如Fcγ受体(FcγR)的结合的IgG1结构域。与Fc受体、例如FcγR的结合增加可以通过与不含修饰的抗体与同一受体的结合进行比较来测量。与含有未修饰的恒定结构域的抗体相比，结合增加可以是至少约5倍，并且优选至少约10倍。结合增加可以使用荧光共振能量转移(FRET)测定来测量。在一些实施例中，经修饰的IgG恒定结构域通过Fc工程改造和/或聚糖修饰(例如无岩藻糖基化)进行修饰。
在一些实施例中，本文披露的抗体可以包含IgG1结构域，其包含根据Kabat的EU编号的突变L234A、L235A、P238S、H268Q和/或K274Q(例如，包含所有这些突变)。参见，例如Wang等人(2017)Protein Cell[蛋白质与细胞]9(1):63-73；Vafa等人(2014)Methods[方法]1；65(1):114-26；和Tam等人(2017)Antibodies[抗体]1 6(3):12。不受理论的束缚，这些突变可以减少抗体与Fcγ受体(FcγR)的结合，这可以减少免疫细胞(如中性粒细胞)对抗体或ADC的非抗原介导的摄取，从而减少中性粒细胞减少症。中性粒细胞减少症的减少可以使用本领域已知的任何测定来测量。例如，中性粒细胞减少症的减少可以使用流式细胞术测定来测量。
在一些实施例中，特异性结合PSMA蛋白的抗体包含如下重链，其具有选自下文表8中列出的SEQ ID NO:47-60的氨基酸序列和/或包含来自表8中的氨基酸序列的一组CDR和/或可变结构域。在一些实施例中，特异性结合PSMA蛋白的抗体包含如下轻链，其具有选自下文表8中列出的SEQ ID NO:61-66的氨基酸序列和/或包含来自表8中的氨基酸序列的一组CDR和/或可变结构域。
表1-9中列出了本披露的示例性抗体的氨基酸和核酸序列。单克隆抗体Kabat CDR和可变区共有序列(分别为表1和2)反映了由SEQ ID NO:1-20表示的重链和轻链可变区序列的比对(图1)。克隆之间不同的残基由SEQ ID NO:42-46中的“X”表示。如本文所述的抗PSMA抗体或抗原结合片段可以通过表1的共有CDR序列与表3的CDR序列组合来定义，例如，通过选择表1的HC CDR2、LC CDR1和/或LCDR2序列以及表3的HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LCCDR1、LC CDR2和/或LC CDR3来通过其三个重链和三个轻链CDR序列来描述抗体。
表1.共有mAb Kabat CDR的氨基酸序列
X1＝A或N；X2＝E或Q；X3＝Q或E；X4＝G或D；X5＝R或K；X6＝V或L；X7＝D或N；并且X8＝S或T
表2.共有mAb可变区的氨基酸序列
X9＝V或T；X10＝M或I；X11＝A或N；X12＝E或Q；X13＝Q或E；X14＝G或D；X15＝A或V；X16＝T或K；X17＝D或S；X18＝T或A；X19＝R或K；X20＝L或V；X21＝N或D；并且X22＝S或T
表3.mAb Kabat CDR的氨基酸序列
表4.编码mAb Kabat CDR的核酸序列
表5.mAb IMGT CDR的氨基酸序列
表6.编码mAb IMGT CDR的核酸序列
表7.mAb可变区的氨基酸序列
加粗的文本表示根据Kabat系统对应于CDR序列的氨基酸位置；带下划线的文本表示根据IMGT系统对应于CDR序列的氨基酸位置。既不加粗也不带下划线的文本对应于框架区。
表8.编码mAb可变区的核酸序列
表9.全长mAb Ig链的氨基酸序列
加粗的文本表示根据Kabat系统对应于CDR序列的氨基酸位置；带下划线的文本表示根据IMGT系统对应于CDR序列的氨基酸位置。既不加粗也不带下划线的文本对应于框架区。
表10.全长mAbIg链的核酸序列
与其他抗PSMA抗体(例如J591和/或deJ591)相比，由SEQ ID NO:1-39和42-46提供的抗PSMA抗体或抗原结合片段可以提供改进的特性。在一些实施例中，与其他抗PSMA抗体(例如J591和/或deJ591)相比，本文披露的抗PSMA抗体或抗原结合片段具有优异的稳定性。在一些实施例中，与其他抗PSMA抗体(例如J591和/或deJ591)相比，本文披露的抗PSMA抗体或抗原结合片段具有更低的免疫原性。
在一些实施例中，重链可变结构域、轻链可变结构域、全长重链和全长轻链的序列可以“混合并匹配”以产生抗PSMA抗体的变体。可以使用本领域已知的结合测定(例如，ELISA和实例中描述的其他测定)来测试这样的“混合并匹配的”抗PSMA抗体。在各个实施例中，本文披露的抗体可以包含上表中列出的任何重链和轻链可变结构域组，或来自重链和轻链组的六个CDR序列组。在一些实施例中，抗体进一步包含人重链和轻链恒定结构域或其片段。在各个实施例中，抗体可以包含上表中列出的任何全长重链和全长轻链序列组。在一些实施例中，抗体可以包含人IgG重链恒定结构域和人κ轻链恒定结构域。在一些实施例中，抗体可以包含人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重链恒定结构域。在各个实施例中，本发明的抗体包含人免疫球蛋白G亚型1(IgG1)重链恒定结构域和人Igκ轻链恒定结构域。在一些实施例中，恒定结构域是人恒定结构域的经修饰的形式，例如，包含人IgG1重链恒定结构域的L234A、L235A、P238S、H268Q和/或K274Q修饰中的一个或多个。
在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:44的重链CDR2(HCDR2)，其中SEQ ID NO:44包含NINPNNGGTTYX1X2KFX3X4，如由Kabat编号系统所定义的。在一些实施例中，在SEQ ID NO:44中，X1是A或N，X2是E或Q，X3是Q或E，且X4是G或D。在一些实施例中，在SEQ ID NO:44中，X1是A，X2是E，X3是Q，和/或X4是G。在一些实施例中，在SEQ ID NO:44中，X1是N，X2是E，X3是Q，和/或X4是G。在一些实施例中，在SEQ ID NO:44中，X1是N，X2是Q，X3是Q，和/或X4是G。在一些实施例中，在SEQ ID NO:44中，X1是N，X2是Q，X3是E，和/或X4是G。在一些实施例中，在SEQ ID NO:44中，X1是N，X2是Q，X3是E，和/或X4是D。
在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:45的轻链CDR1(LCDR1)，其中SEQ ID NO:45包含X5ASQDVGTAX6X7，如由Kabat编号系统所定义的。在一些实施例中，在SEQ ID NO:45中，X5是R或K，X6是V或L，X7是D或N。在一些实施例中，在SEQ ID NO:45中，X5是R，X6是V，和/或X7是D。在一些实施例中，在SEQ ID NO:45中，X5是K，X6是V，和/或X7是D。在一些实施例中，在SEQ ID NO:45中，X5是R，X6是L，和/或X7是N。
在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:46的轻链CDR2(LCDR2)，其中SEQ ID NO:46包含WASTRHX8，如由Kabat编号系统所定义的。在一些实施例中，在SEQ ID NO:46中，X8是S或T。在一些实施例中，在SEQ ID NO:46中，X8是S。在一些实施例中，在SEQ ID NO:46中，X8是T。
在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含如下的三个重链CDR和三个轻链CDR：包含SEQ ID NO:21的重链CDR1(HCDR1)、包含SEQ ID NO:44的重链CDR2(HCDR2)、包含SEQ ID NO:27的重链CDR3(HCDR3)；包含SEQ ID NO:45的轻链CDR1(LCDR1)、包含SEQ ID NO:46的轻链CDR2(LCDR2)和包含SEQ ID NO:37的轻链CDR3(LCDR3)，如由Kabat编号系统所定义的。在一些实施例中，在SEQ ID NO:44中，X1是A，X2是E，X3是Q，和/或X4是G。在一些实施例中，在SEQ ID NO:44中，X1是N，X2是E，X3是Q，和/或X4是G。在一些实施例中，在SEQ ID NO:44中，X1是N，X2是Q，X3是Q，和/或X4是G。在一些实施例中，在SEQ ID NO:44中，X1是N，X2是Q，X3是E，和/或X4是G。在一些实施例中，在SEQ ID NO:44中，X1是N，X2是Q，X3是E，和/或X4是D。在一些实施例中，在SEQ ID NO:45中，X5是R，X6是V，和/或X7是D。在一些实施例中，在SEQ ID NO:45中，X5是K，X6是V，和/或X7是D。在一些实施例中，在SEQ ID NO:45中，X5是R，X6是L，和/或X7是N。在一些实施例中，在SEQ ID NO:46中，X8是S。在一些实施例中，在SEQ ID NO:46中，X8是T。
在一些实施例中，在SEQ ID NO:44中，X1是A，X2是E，X3是Q，且X4是G；在SEQ ID NO:45中，X5是R，X6是V，且X7是D；并且在SEQ ID NO:46中，X8是S。在一些实施例中，在SEQ IDNO:44中，X1是A，X2是E，X3是Q，且X4是G；在SEQ ID NO:45中，X5是R，X6是V，且X7是D；并且在SEQ ID NO:46中，X8是T。在一些实施例中，在SEQ ID NO:44中，X1是A，X2是E，X3是Q，且X4是G；在SEQ ID NO:45中，X5是K，X6是V，且X7是D；并且在SEQ ID NO:46中，X8是S。在一些实施例中，在SEQ ID NO:44中，X1是A，X2是E，X3是Q，且X4是G；在SEQ ID NO:45中，X5是K，X6是V，且X7是D；并且在SEQ ID NO:46中，X8是T。在一些实施例中，在SEQ ID NO:44中，X1是A，X2是E，X3是Q，且X4是G；在SEQ ID NO:45中，X5是R，X6是L，且X7是N；并且在SEQ ID NO:46中，X8是S。在一些实施例中，在SEQ ID NO:44中，X1是A，X2是E，X3是Q，且X4是G；在SEQ ID NO:45中，X5是R，X6是L，且X7是N；并且在SEQ ID NO:46中，X8是T。在一些实施例中，在SEQ ID NO:44中，X1是N，X2是E，X3是Q，且X4是G；在SEQ ID NO:45中，X5是R，X6是V，且X7是D；并且在SEQ ID NO:46中，X8是S。在一些实施例中，在SEQ ID NO:44中，X1是N，X2是E，X3是Q，且X4是G；在SEQ ID NO:45中，X5是R，X6是V，且X7是D；并且在SEQ ID NO:46中，X8是T。在一些实施例中，在SEQ IDNO:44中，X1是N，X2是E，X3是Q，且X4是G；在SEQ ID NO:45中，X5是K，X6是V，且X7是D；并且在SEQ ID NO:46中，X8是S。在一些实施例中，在SEQ ID NO:44中，X1是N，X2是E，X3是Q，且X4是G；在SEQ ID NO:45中，X5是K，X6是V，且X7是D；并且在SEQ ID NO:46中，X8是T。在一些实施例中，在SEQ ID NO:44中，X1是N，X2是E，X3是Q，且X4是G；在SEQ ID NO:45中，X5是R，X6是L，且X7是N；并且在SEQ ID NO:46中，X8是S。在一些实施例中，在SEQ ID NO:44中，X1是N，X2是E，X3是Q，且X4是G；在SEQ ID NO:45中，X5是R，X6是L，且X7是N；并且在SEQ ID NO:46中，X8是T。在一些实施例中，在SEQ ID NO:44中，X1是N，X2是Q，X3是Q，且X4是G；在SEQ ID NO:45中，X5是R，X6是V，且X7是D；并且在SEQ ID NO:46中，X8是S。在一些实施例中，在SEQ ID NO:44中，X1是N，X2是Q，X3是Q，且X4是G；在SEQ ID NO:45中，X5是R，X6是V，且X7是D；并且在SEQ ID NO:46中，X8是T。在一些实施例中，在SEQ ID NO:44中，X1是N，X2是Q，X3是Q，且X4是G；在SEQ ID NO:45中，X5是K，X6是V，且X7是D；并且在SEQ ID NO:46中，X8是S。在一些实施例中，在SEQ IDNO:44中，X1是N，X2是Q，X3是Q，且X4是G；在SEQ ID NO:45中，X5是K，X6是V，且X7是D；并且在SEQ ID NO:46中，X8是T。在一些实施例中，在SEQ ID NO:44中，X1是N，X2是Q，X3是Q，且X4是G；在SEQ ID NO:45中，X5是R，X6是L，且X7是N；并且在SEQ ID NO:46中，X8是S。在一些实施例中，在SEQ ID NO:44中，X1是N，X2是Q，X3是Q，且X4是G；在SEQ ID NO:45中，X5是R，X6是L，且X7是N；并且在SEQ ID NO:46中，X8是T。在一些实施例中，在SEQ ID NO:44中，X1是N，X2是Q，X3是E，且X4是G；在SEQ ID NO:45中，X5是R，X6是V，且X7是D；并且在SEQ ID NO:46中，X8是S。在一些实施例中，在SEQ ID NO:44中，X1是N，X2是Q，X3是E，且X4是G；在SEQ ID NO:45中，X5是R，X6是V，且X7是D；并且在SEQ ID NO:46中，X8是T。在一些实施例中，在SEQ ID NO:44中，X1是N，X2是Q，X3是E，且X4是G；在SEQ ID NO:45中，X5是K，X6是V，且X7是D；并且在SEQ ID NO:46中，X8是S。在一些实施例中，在SEQ ID NO:44中，X1是N，X2是Q，X3是E，且X4是G；在SEQ ID NO:45中，X5是K，X6是V，且X7是D；并且在SEQ ID NO:46中，X8是T。在一些实施例中，在SEQ IDNO:44中，X1是N，X2是Q，X3是E，且X4是G；在SEQ ID NO:45中，X5是R，X6是L，且X7是N；并且在SEQ ID NO:46中，X8是S。在一些实施例中，在SEQ ID NO:44中，X1是N，X2是Q，X3是E，且X4是G；在SEQ ID NO:45中，X5是R，X6是L，且X7是N；并且在SEQ ID NO:46中，X8是T。在一些实施例中，在SEQ ID NO:44中，X1是N，X2是Q，X3是E，且X4是D；在SEQ ID NO:45中，X5是R，X6是V，且X7是D；并且在SEQ ID NO:46中，X8是S。在一些实施例中，在SEQ ID NO:44中，X1是N，X2是Q，X3是E，且X4是D；在SEQ ID NO:45中，X5是R，X6是V，且X7是D；并且在SEQ ID NO:46中，X8是T。在一些实施例中，在SEQ ID NO:44中，X1是N，X2是Q，X3是E，且X4是D；在SEQ ID NO:45中，X5是K，X6是V，且X7是D；并且在SEQ ID NO:46中，X8是S。在一些实施例中，在SEQ ID NO:44中，X1是N，X2是Q，X3是E，且X4是D；在SEQ ID NO:45中，X5是R，X6是L，且X7是N；并且在SEQ ID NO:46中，X8是S。在一些实施例中，在SEQ ID NO:44中，X1是N，X2是Q，X3是E，且X4是D；在SEQ ID NO:45中，X5是R，X6是L，且X7是N；并且在SEQ ID NO:46中，X8是T。
在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含如下的三个重链CDR和三个轻链CDR：包含SEQ ID NO:21的重链CDR1(HCDR1)、包含SEQ ID NO:22的重链CDR2(HCDR2)、包含SEQ ID NO:27的重链CDR3(HCDR3)；包含SEQ ID NO:34的轻链CDR1(LCDR1)、包含SEQ ID NO:35的轻链CDR2(LCDR2)和包含SEQ ID NO:37的轻链CDR3(LCDR3)，如由Kabat编号系统所定义的。
在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含如下的三个重链CDR和三个轻链CDR：包含SEQ ID NO:21的重链CDR1(HCDR1)、包含SEQ ID NO:23的重链CDR2(HCDR2)、包含SEQ ID NO:27的重链CDR3(HCDR3)；包含SEQ ID NO:34的轻链CDR1(LCDR1)、包含SEQ ID NO:35的轻链CDR2(LCDR2)和包含SEQ ID NO:37的轻链CDR3(LCDR3)，如由Kabat编号系统所定义的。
在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含如下的三个重链CDR和三个轻链CDR：包含SEQ ID NO:21的重链CDR1(HCDR1)、包含SEQ ID NO:24的重链CDR2(HCDR2)、包含SEQ ID NO:27的重链CDR3(HCDR3)；包含SEQ ID NO:34的轻链CDR1(LCDR1)、包含SEQ ID NO:35的轻链CDR2(LCDR2)和包含SEQ ID NO:37的轻链CDR3(LCDR3)，如由Kabat编号系统所定义的。
在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含如下的三个重链CDR和三个轻链CDR：包含SEQ ID NO:21的重链CDR1(HCDR1)、包含SEQ ID NO:25的重链CDR2(HCDR2)、包含SEQ ID NO:27的重链CDR3(HCDR3)；包含SEQ ID NO:34的轻链CDR1(LCDR1)、包含SEQ ID NO:35的轻链CDR2(LCDR2)和包含SEQ ID NO:37的轻链CDR3(LCDR3)，如由Kabat编号系统所定义的。
在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含如下的三个重链CDR和三个轻链CDR：包含SEQ ID NO:21的重链CDR1(HCDR1)、包含SEQ ID NO:26的重链CDR2(HCDR2)、包含SEQ ID NO:27的重链CDR3(HCDR3)；包含SEQ ID NO:34的轻链CDR1(LCDR1)、包含SEQ ID NO:35的轻链CDR2(LCDR2)和包含SEQ ID NO:37的轻链CDR3(LCDR3)，如由Kabat编号系统所定义的。
在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含如下的三个重链CDR和三个轻链CDR：包含SEQ ID NO:21的重链CDR1(HCDR1)、包含SEQ ID NO:22的重链CDR2(HCDR2)、包含SEQ ID NO:27的重链CDR3(HCDR3)；包含SEQ ID NO:32的轻链CDR1(LCDR1)、包含SEQ ID NO:35的轻链CDR2(LCDR2)和包含SEQ ID NO:37的轻链CDR3(LCDR3)，如由Kabat编号系统所定义的。
在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含如下的三个重链CDR和三个轻链CDR：包含SEQ ID NO:21的重链CDR1(HCDR1)、包含SEQ ID NO:23的重链CDR2(HCDR2)、包含SEQ ID NO:27的重链CDR3(HCDR3)；包含SEQ ID NO:32的轻链CDR1(LCDR1)、包含SEQ ID NO:35的轻链CDR2(LCDR2)和包含SEQ ID NO:37的轻链CDR3(LCDR3)，如由Kabat编号系统所定义的。
在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含如下的三个重链CDR和三个轻链CDR：包含SEQ ID NO:21的重链CDR1(HCDR1)、包含SEQ ID NO:24的重链CDR2(HCDR2)、包含SEQ ID NO:27的重链CDR3(HCDR3)；包含SEQ ID NO:32的轻链CDR1(LCDR1)、包含SEQ ID NO:35的轻链CDR2(LCDR2)和包含SEQ ID NO:37的轻链CDR3(LCDR3)，如由Kabat编号系统所定义的。
在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含如下的三个重链CDR和三个轻链CDR：包含SEQ ID NO:21的重链CDR1(HCDR1)、包含SEQ ID NO:25的重链CDR2(HCDR2)、包含SEQ ID NO:27的重链CDR3(HCDR3)；包含SEQ ID NO:32的轻链CDR1(LCDR1)、包含SEQ ID NO:35的轻链CDR2(LCDR2)和包含SEQ ID NO:37的轻链CDR3(LCDR3)，如由Kabat编号系统所定义的。
在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含如下的三个重链CDR和三个轻链CDR：包含SEQ ID NO:21的重链CDR1(HCDR1)、包含SEQ ID NO:26的重链CDR2(HCDR2)、包含SEQ ID NO:27的重链CDR3(HCDR3)；包含SEQ ID NO:32的轻链CDR1(LCDR1)、包含SEQ ID NO:35的轻链CDR2(LCDR2)和包含SEQ ID NO:37的轻链CDR3(LCDR3)，如由Kabat编号系统所定义的。
在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含如下的三个重链CDR和三个轻链CDR：包含SEQ ID NO:21的重链CDR1(HCDR1)、包含SEQ ID NO:22的重链CDR2(HCDR2)、包含SEQ ID NO:27的重链CDR3(HCDR3)；包含SEQ ID NO:33的轻链CDR1(LCDR1)、包含SEQ ID NO:35的轻链CDR2(LCDR2)和包含SEQ ID NO:37的轻链CDR3(LCDR3)，如由Kabat编号系统所定义的。
在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含如下的三个重链CDR和三个轻链CDR：包含SEQ ID NO:21的重链CDR1(HCDR1)、包含SEQ ID NO:23的重链CDR2(HCDR2)、包含SEQ ID NO:27的重链CDR3(HCDR3)；包含SEQ ID NO:33的轻链CDR1(LCDR1)、包含SEQ ID NO:35的轻链CDR2(LCDR2)和包含SEQ ID NO:37的轻链CDR3(LCDR3)，如由Kabat编号系统所定义的。
在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含如下的三个重链CDR和三个轻链CDR：包含SEQ ID NO:21的重链CDR1(HCDR1)、包含SEQ ID NO:24的重链CDR2(HCDR2)、包含SEQ ID NO:27的重链CDR3(HCDR3)；包含SEQ ID NO:33的轻链CDR1(LCDR1)、包含SEQ ID NO:35的轻链CDR2(LCDR2)和包含SEQ ID NO:37的轻链CDR3(LCDR3)，如由Kabat编号系统所定义的。
在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含如下的三个重链CDR和三个轻链CDR：包含SEQ ID NO:21的重链CDR1(HCDR1)、包含SEQ ID NO:25的重链CDR2(HCDR2)、包含SEQ ID NO:27的重链CDR3(HCDR3)；包含SEQ ID NO:33的轻链CDR1(LCDR1)、包含SEQ ID NO:35的轻链CDR2(LCDR2)和包含SEQ ID NO:37的轻链CDR3(LCDR3)，如由Kabat编号系统所定义的。
在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含如下的三个重链CDR和三个轻链CDR：包含SEQ ID NO:21的重链CDR1(HCDR1)、包含SEQ ID NO:26的重链CDR2(HCDR2)、包含SEQ ID NO:27的重链CDR3(HCDR3)；包含SEQ ID NO:33的轻链CDR1(LCDR1)、包含SEQ ID NO:35的轻链CDR2(LCDR2)和包含SEQ ID NO:37的轻链CDR3(LCDR3)，如由Kabat编号系统所定义的。
在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含如下的三个重链CDR和三个轻链CDR：包含SEQ ID NO:21的重链CDR1(HCDR1)、包含SEQ ID NO:22的重链CDR2(HCDR2)、包含SEQ ID NO:27的重链CDR3(HCDR3)；包含SEQ ID NO:34的轻链CDR1(LCDR1)、包含SEQ ID NO:36的轻链CDR2(LCDR2)和包含SEQ ID NO:37的轻链CDR3(LCDR3)，如由Kabat编号系统所定义的。
在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含如下的三个重链CDR和三个轻链CDR：包含SEQ ID NO:21的重链CDR1(HCDR1)、包含SEQ ID NO:23的重链CDR2(HCDR2)、包含SEQ ID NO:27的重链CDR3(HCDR3)；包含SEQ ID NO:34的轻链CDR1(LCDR1)、包含SEQ ID NO:36的轻链CDR2(LCDR2)和包含SEQ ID NO:37的轻链CDR3(LCDR3)，如由Kabat编号系统所定义的。
在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含如下的三个重链CDR和三个轻链CDR：包含SEQ ID NO:21的重链CDR1(HCDR1)、包含SEQ ID NO:24的重链CDR2(HCDR2)、包含SEQ ID NO:27的重链CDR3(HCDR3)；包含SEQ ID NO:34的轻链CDR1(LCDR1)、包含SEQ ID NO:36的轻链CDR2(LCDR2)和包含SEQ ID NO:37的轻链CDR3(LCDR3)，如由Kabat编号系统所定义的。
在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含如下的三个重链CDR和三个轻链CDR：包含SEQ ID NO:21的重链CDR1(HCDR1)、包含SEQ ID NO:25的重链CDR2(HCDR2)、包含SEQ ID NO:27的重链CDR3(HCDR3)；包含SEQ ID NO:34的轻链CDR1(LCDR1)、包含SEQ ID NO:36的轻链CDR2(LCDR2)和包含SEQ ID NO:37的轻链CDR3(LCDR3)，如由Kabat编号系统所定义的。
在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含如下的三个重链CDR和三个轻链CDR：包含SEQ ID NO:21的重链CDR1(HCDR1)、包含SEQ ID NO:26的重链CDR2(HCDR2)、包含SEQ ID NO:27的重链CDR3(HCDR3)；包含SEQ ID NO:34的轻链CDR1(LCDR1)、包含SEQ ID NO:36的轻链CDR2(LCDR2)和包含SEQ ID NO:37的轻链CDR3(LCDR3)，如由Kabat编号系统所定义的。
在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含如下的三个重链CDR和三个轻链CDR：包含SEQ ID NO:21的重链CDR1(HCDR1)、包含SEQ ID NO:22的重链CDR2(HCDR2)、包含SEQ ID NO:27的重链CDR3(HCDR3)；包含SEQ ID NO:32的轻链CDR1(LCDR1)、包含SEQ ID NO:36的轻链CDR2(LCDR2)和包含SEQ ID NO:37的轻链CDR3(LCDR3)，如由Kabat编号系统所定义的。
在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含如下的三个重链CDR和三个轻链CDR：包含SEQ ID NO:21的重链CDR1(HCDR1)、包含SEQ ID NO:23的重链CDR2(HCDR2)、包含SEQ ID NO:27的重链CDR3(HCDR3)；包含SEQ ID NO:32的轻链CDR1(LCDR1)、包含SEQ ID NO:36的轻链CDR2(LCDR2)和包含SEQ ID NO:37的轻链CDR3(LCDR3)，如由Kabat编号系统所定义的。
在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含如下的三个重链CDR和三个轻链CDR：包含SEQ ID NO:21的重链CDR1(HCDR1)、包含SEQ ID NO:24的重链CDR2(HCDR2)、包含SEQ ID NO:27的重链CDR3(HCDR3)；包含SEQ ID NO:32的轻链CDR1(LCDR1)、包含SEQ ID NO:36的轻链CDR2(LCDR2)和包含SEQ ID NO:37的轻链CDR3(LCDR3)，如由Kabat编号系统所定义的。
在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含如下的三个重链CDR和三个轻链CDR：包含SEQ ID NO:21的重链CDR1(HCDR1)、包含SEQ ID NO:25的重链CDR2(HCDR2)、包含SEQ ID NO:27的重链CDR3(HCDR3)；包含SEQ ID NO:32的轻链CDR1(LCDR1)、包含SEQ ID NO:36的轻链CDR2(LCDR2)和包含SEQ ID NO:37的轻链CDR3(LCDR3)，如由Kabat编号系统所定义的。
在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含如下的三个重链CDR和三个轻链CDR：包含SEQ ID NO:21的重链CDR1(HCDR1)、包含SEQ ID NO:26的重链CDR2(HCDR2)、包含SEQ ID NO:27的重链CDR3(HCDR3)；包含SEQ ID NO:32的轻链CDR1(LCDR1)、包含SEQ ID NO:36的轻链CDR2(LCDR2)和包含SEQ ID NO:37的轻链CDR3(LCDR3)，如由Kabat编号系统所定义的。
在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含如下的三个重链CDR和三个轻链CDR：包含SEQ ID NO:21的重链CDR1(HCDR1)、包含SEQ ID NO:22的重链CDR2(HCDR2)、包含SEQ ID NO:27的重链CDR3(HCDR3)；包含SEQ ID NO:33的轻链CDR1(LCDR1)、包含SEQ ID NO:36的轻链CDR2(LCDR2)和包含SEQ ID NO:37的轻链CDR3(LCDR3)，如由Kabat编号系统所定义的。
在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含如下的三个重链CDR和三个轻链CDR：包含SEQ ID NO:21的重链CDR1(HCDR1)、包含SEQ ID NO:23的重链CDR2(HCDR2)、包含SEQ ID NO:27的重链CDR3(HCDR3)；包含SEQ ID NO:33的轻链CDR1(LCDR1)、包含SEQ ID NO:36的轻链CDR2(LCDR2)和包含SEQ ID NO:37的轻链CDR3(LCDR3)，如由Kabat编号系统所定义的。
在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含如下的三个重链CDR和三个轻链CDR：包含SEQ ID NO:21的重链CDR1(HCDR1)、包含SEQ ID NO:24的重链CDR2(HCDR2)、包含SEQ ID NO:27的重链CDR3(HCDR3)；包含SEQ ID NO:33的轻链CDR1(LCDR1)、包含SEQ ID NO:36的轻链CDR2(LCDR2)和包含SEQ ID NO:37的轻链CDR3(LCDR3)，如由Kabat编号系统所定义的。
在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含如下的三个重链CDR和三个轻链CDR：包含SEQ ID NO:21的重链CDR1(HCDR1)、包含SEQ ID NO:25的重链CDR2(HCDR2)、包含SEQ ID NO:27的重链CDR3(HCDR3)；包含SEQ ID NO:33的轻链CDR1(LCDR1)、包含SEQ ID NO:36的轻链CDR2(LCDR2)和包含SEQ ID NO:37的轻链CDR3(LCDR3)，如由Kabat编号系统所定义的。
在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含如下的三个重链CDR和三个轻链CDR：包含SEQ ID NO:28的重链CDR1(HCDR1)、包含SEQ ID NO:29的重链CDR2(HCDR2)、包含SEQ ID NO:30的重链CDR3(HCDR3)；包含SEQ ID NO:38的轻链CDR1(LCDR1)、包含SEQ ID NO:39的轻链CDR2(LCDR2)和包含SEQ ID NO:37的轻链CDR3(LCDR3)，如由IMGT编号系统所定义的(国际免疫遗传学信息系统)。
在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含如下的三个重链CDR和三个轻链CDR：包含SEQ ID NO:28的重链CDR1(HCDR1)、包含SEQ ID NO:29的重链CDR2(HCDR2)、包含SEQ ID NO:31的重链CDR3(HCDR3)；包含SEQ ID NO:38的轻链CDR1(LCDR1)、包含SEQ ID NO:39的轻链CDR2(LCDR2)和包含SEQ ID NO:37的轻链CDR3(LCDR3)，如由IMGT编号系统所定义的。
在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:42的重链可变区，其中SEQ ID NO:42包含氨基酸序列：
EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKX9SGYTFTEYTIHWVQQAP GKGLEWX10GNINPNNGGTTYX11X12KFX13X14RVTITX15DX16STX17TAYMELSSLRSEDTAVYYCAX18GWNFDYWGQGTLLTVSS
其中X9是V或T，X10是M或I，X11是A或N，X12是E或Q，X13是Q或E，X14是G或D，X15是A或V，X16是T或K，X17是D或S，且X18是T或A。在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:43的轻链可变区，其中SEQ ID NO:43包含氨基酸序列：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCX19ASQDVGTAX20X21WYQQK PGKAPKLLIYWASTRHX22GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAT YYCQQYNSYPLTFGQGTKLEIK
其中X19是R或K，X20是L或V，X21是N或D，且X22是S或T。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO:42的重链可变区和SEQ ID NO:43的轻链可变区，其中X9是V或T，X10是M或I，X11是A或N，X12是E或Q，X13是Q或E，X14是G或D，X15是A或V，X16是T或K，X17是D或S，X18是T或A，X19是R或K，X20是L或V，X21是N或D，且X22是S或T。
在一些实施例中，在SEQ ID NO:42中，X9是V，X10是M，X11是A，X12是E，X13是Q，X14是G，X15是A，X16是T，X17是D，和/或X18是T。在一些实施例中，在SEQ ID NO:42中，X9是V，X10是M，X11是N，X12是E，X13是Q，X14是G，X15是A，X16是T，X17是D，和/或X18是T。在一些实施例中，在SEQ IDNO:42中，X9是V，X10是M，X11是N，X12是Q，X13是Q，X14是G，X15是A，X16是T，X17是D，和/或X18是T。在一些实施例中，在SEQ ID NO:42中，X9是V，X10是M，X11是N，X12是Q，X13是E，X14是G，X15是A，X16是T，X17是D，和/或X18是T。在一些实施例中，在SEQ ID NO:42中，X9是T，X10是I，X11是N，X12是Q，X13是E，X14是D，X15是A，X16是T，X17是D，和/或X18是A。在一些实施例中，在SEQ ID NO:42中，X9是T，X10是I，X11是N，X12是Q，X13是E，X14是D，X15是A，X16是K，X17是S，和/或X18是A。在一些实施例中，在SEQ ID NO:42中，X9是V，X10是I，X11是N，X12是Q，X13是E，X14是D，X15是A，X16是K，X17是D，和/或X18是A。在一些实施例中，在SEQ ID NO:42中，X9是V，X10是M，X11是N，X12是Q，X13是E，X14是D，X15是A，X16是K，X17是D，和/或X18是A。在一些实施例中，在SEQ ID NO:42中，X9是V，X10是M，X11是N，X12是Q，X13是E，X14是D，X15是A，X16是T，X17是S，和/或X18是T。在一些实施例中，在SEQ ID NO:42中，X9是V，X10是M，X11是N，X12是Q，X13是E，X14是D，X15是A，X16是K，X17是D，和/或X18是T。在一些实施例中，在SEQ ID NO:42中，X9是V，X10是M，X11是N，X12是Q，X13是E，X14是D，X15是V，X16是T，X17是D，和/或X18是T。在一些实施例中，在SEQ ID NO:42中，X9是V，X10是I，X11是N，X12是Q，X13是E，X14是D，X15是A，X16是T，X17是D，和/或X18是T。在一些实施例中，在SEQ ID NO:42中，X9是T，X10是M，X11是N，X12是Q，X13是E，X14是D，X15是A，X16是T，X17是D，和/或X18是T。在一些实施例中，在SEQ ID NO:42中，X9是V，X10是M，X11是N，X12是Q，X13是E，X14是D，X15是A，X16是T，X17是D，和/或X18是T。在一些实施例中，在SEQ ID NO:43中，X19是K，X20是V，X21是D，和/或X22是T。在一些实施例中，在SEQ ID NO:43中，X19是R，X20是V，X21是D，和/或X22是T。在一些实施例中，在SEQ ID NO:43中，X19是R，X20是L，X21是N，和/或X22是T。在一些实施例中，在SEQ ID NO:43中，X19是K，X20是V，X21是D，和/或X22是S。在一些实施例中，在SEQ ID NO:43中，X19是R，X20是V，X21是D，和/或X22是S。在一些实施例中，在SEQ ID NO:43中，X19是R，X20是L，X21是N，和/或X22是S。
在一些实施例中，在SEQ ID NO:42中，X9是V，X10是M，X11是A，X12是E，X13是Q，X14是G，X15是A，X16是T，X17是D，且X18是T，并且在SEQ ID NO:43中，X19是K，X20是V，X21是D，且X22是T。在一些实施例中，在SEQ ID NO:42中，X9是V，X10是M，X11是A，X12是E，X13是Q，X14是G，X15是A，X16是T，X17是D，且X18是T，并且在SEQ ID NO:43中，X19是R，X20是V，X21是D，且X22是T。在一些实施例中，在SEQ ID NO:42中，X9是V，X10是M，X11是A，X12是E，X13是Q，X14是G，X15是A，X16是T，X17是D，且X18是T，并且在SEQ ID NO:43中，X19是R，X20是L，X21是N，且X22是T。在一些实施例中，在SEQ ID NO:42中，X9是V，X10是M，X11是A，X12是E，X13是Q，X14是G，X15是A，X16是T，X17是D，且X18是T，并且在SEQ ID NO:43中，X19是K，X20是V，X21是D，且X22是S。在一些实施例中，在SEQID NO:42中，X9是V，X10是M，X11是A，X12是E，X13是Q，X14是G，X15是A，X16是T，X17是D，且X18是T，并且在SEQ ID NO:43中，X19是R，X20是V，X21是D，且X22是S。在一些实施例中，在SEQ ID NO:42中，X9是V，X10是M，X11是A，X12是E，X13是Q，X14是G，X15是A，X16是T，X17是D，且X18是T，并且在SEQID NO:43中，X19是R，X20是L，X21是N，且X22是S。在一些实施例中，在SEQ ID NO:42中，X9是V，X10是M，X11是N，X12是E，X13是Q，X14是G，X15是A，X16是T，X17是D，且X18是T，并且在SEQ ID NO:43中，X19是K，X20是V，X21是D，且X22是T。在一些实施例中，在SEQ ID NO:42中，X9是V，X10是M，X11是N，X12是E，X13是Q，X14是G，X15是A，X16是T，X17是D，且X18是T，并且在SEQ ID NO:43中，X19是R，X20是V，X21是D，且X22是T。在一些实施例中，在SEQ ID NO:42中，X9是V，X10是M，X11是N，X12是E，X13是Q，X14是G，X15是A，X16是T，X17是D，且X18是T，并且在SEQ ID NO:43中，X19是R，X20是L，X21是N，且X22是T。在一些实施例中，在SEQ ID NO:42中，X9是V，X10是M，X11是N，X12是E，X13是Q，X14是G，X15是A，X16是T，X17是D，且X18是T，并且在SEQ ID NO:43中，X19是K，X20是V，X21是D，且X22是S。在一些实施例中，在SEQ ID NO:42中，X9是V，X10是M，X11是N，X12是E，X13是Q，X14是G，X15是A，X16是T，X17是D，且X18是T，并且在SEQ ID NO:43中，X19是R，X20是V，X21是D，且X22是S。在一些实施例中，在SEQ ID NO:42中，X9是V，X10是M，X11是N，X12是E，X13是Q，X14是G，X15是A，X16是T，X17是D，且X18是T，并且在SEQ ID NO:43中，X19是R，X20是L，X21是N，且X22是S。在一些实施例中，在SEQ ID NO:42中，X9是V，X10是M，X11是N，X12是Q，X13是Q，X14是G，X15是A，X16是T，X17是D，且X18是T，并且在SEQ ID NO:43中，X19是K，X20是V，X21是D，且X22是T。在一些实施例中，在SEQ ID NO:42中，X9是V，X10是M，X11是N，X12是Q，X13是Q，X14是G，X15是A，X16是T，X17是D，且X18是T，并且在SEQ ID NO:43中，X19是R，X20是V，X21是D，且X22是T。在一些实施例中，在SEQID NO:42中，X9是V，X10是M，X11是N，X12是Q，X13是Q，X14是G，X15是A，X16是T，X17是D，且X18是T，并且在SEQ ID NO:43中，X19是R，X20是L，X21是N，且X22是T。在一些实施例中，在SEQ ID NO:42中，X9是V，X10是M，X11是N，X12是Q，X13是Q，X14是G，X15是A，X16是T，X17是D，且X18是T，并且在SEQID NO:43中，X19是K，X20是V，X21是D，且X22是S。在一些实施例中，在SEQ ID NO:42中，X9是V，X10是M，X11是N，X12是Q，X13是Q，X14是G，X15是A，X16是T，X17是D，且X18是T，并且在SEQ ID NO:43中，X19是R，X20是V，X21是D，且X22是S。在一些实施例中，在SEQ ID NO:42中，X9是V，X10是M，X11是N，X12是Q，X13是Q，X14是G，X15是A，X16是T，X17是D，且X18是T，并且在SEQ ID NO:43中，X19是R，X20是L，X21是N，且X22是S。在一些实施例中，在SEQ ID NO:42中，X9是V，X10是M，X11是N，X12是Q，X13是E，X14是G，X15是A，X16是T，X17是D，且X18是T，并且在SEQ ID NO:43中，X19是K，X20是V，X21是D，且X22是T。在一些实施例中，在SEQ ID NO:42中，X9是V，X10是M，X11是N，X12是Q，X13是E，X14是G，X15是A，X16是T，X17是D，且X18是T，并且在SEQ ID NO:43中，X19是R，X20是V，X21是D，且X22是T。在一些实施例中，在SEQ ID NO:42中，X9是V，X10是M，X11是N，X12是Q，X13是E，X14是G，X15是A，X16是T，X17是D，且X18是T，并且在SEQ ID NO:43中，X19是R，X20是L，X21是N，且X22是T。在一些实施例中，在SEQ ID NO:42中，X9是V，X10是M，X11是N，X12是Q，X13是E，X14是G，X15是A，X16是T，X17是D，且X18是T，并且在SEQ ID NO:43中，X19是K，X20是V，X21是D，且X22是S。在一些实施例中，在SEQ ID NO:42中，X9是V，X10是M，X11是N，X12是Q，X13是E，X14是G，X15是A，X16是T，X17是D，且X18是T，并且在SEQ ID NO:43中，X19是R，X20是V，X21是D，且X22是S。在一些实施例中，在SEQ ID NO:42中，X9是V，X10是M，X11是N，X12是Q，X13是E，X14是G，X15是A，X16是T，X17是D，且X18是T，并且在SEQ ID NO:43中，X19是R，X20是L，X21是N，且X22是S。在一些实施例中，在SEQID NO:42中，X9是T，X10是I，X11是N，X12是Q，X13是E，X14是D，X15是A，X16是T，X17是D，且X18是A，并且在SEQ ID NO:43中，X19是K，X20是V，X21是D，且X22是T。在一些实施例中，在SEQ ID NO:42中，X9是T，X10是I，X11是N，X12是Q，X13是E，X14是D，X15是A，X16是T，X17是D，且X18是A，并且在SEQID NO:43中，X19是R，X20是V，X21是D，且X22是T。在一些实施例中，在SEQ ID NO:42中，X9是T，X10是I，X11是N，X12是Q，X13是E，X14是D，X15是A，X16是T，X17是D，且X18是A，并且在SEQ ID NO:43中，X19是R，X20是L，X21是N，且X22是T。在一些实施例中，在SEQ ID NO:42中，X9是T，X10是I，X11是N，X12是Q，X13是E，X14是D，X15是A，X16是T，X17是D，且X18是A，并且在SEQ ID NO:43中，X19是K，X20是V，X21是D，且X22是S。在一些实施例中，在SEQ ID NO:42中，X9是T，X10是I，X11是N，X12是Q，X13是E，X14是D，X15是A，X16是T，X17是D，且X18是A，并且在SEQ ID NO:43中，X19是R，X20是V，X21是D，且X22是S。在一些实施例中，在SEQ ID NO:42中，X9是T，X10是I，X11是N，X12是Q，X13是E，X14是D，X15是A，X16是T，X17是D，且X18是A，并且在SEQ ID NO:43中，X19是R，X20是L，X21是N，且X22是S。在一些实施例中，在SEQ ID NO:42中，X9是T，X10是I，X11是N，X12是Q，X13是E，X14是D，X15是A，X16是K，X17是S，且X18是A，并且在SEQ ID NO:43中，X19是K，X20是V，X21是D，且X22是T。在一些实施例中，在SEQ ID NO:42中，X9是T，X10是I，X11是N，X12是Q，X13是E，X14是D，X15是A，X16是K，X17是S，且X18是A，并且在SEQ ID NO:43中，X19是R，X20是V，X21是D，且X22是T。在一些实施例中，在SEQ ID NO:42中，X9是T，X10是I，X11是N，X12是Q，X13是E，X14是D，X15是A，X16是K，X17是S，且X18是A，并且在SEQ ID NO:43中，X19是R，X20是L，X21是N，且X22是T。在一些实施例中，在SEQ ID NO:42中，X9是T，X10是I，X11是N，X12是Q，X13是E，X14是D，X15是A，X16是K，X17是S，且X18是A，并且在SEQ ID NO:43中，X19是K，X20是V，X21是D，且X22是S。在一些实施例中，在SEQID NO:42中，X9是T，X10是I，X11是N，X12是Q，X13是E，X14是D，X15是A，X16是K，X17是S，且X18是A，并且在SEQ ID NO:43中，X19是R，X20是V，X21是D，且X22是S。在一些实施例中，在SEQ ID NO:42中，X9是T，X10是I，X11是N，X12是Q，X13是E，X14是D，X15是A，X16是K，X17是S，且X18是A，并且在SEQID NO:43中，X19是R，X20是L，X21是N，且X22是S。在一些实施例中，在SEQ ID NO:42中，X9是V，X10是I，X11是N，X12是Q，X13是E，X14是D，X15是A，X16是K，X17是D，且X18是A，并且在SEQ ID NO:43中，X19是K，X20是V，X21是D，且X22是T。在一些实施例中，在SEQ ID NO:42中，X9是V，X10是I，X11是N，X12是Q，X13是E，X14是D，X15是A，X16是K，X17是D，且X18是A，并且在SEQ ID NO:43中，X19是R，X20是V，X21是D，且X22是T。在一些实施例中，在SEQ ID NO:42中，X9是V，X10是I，X11是N，X12是Q，X13是E，X14是D，X15是A，X16是K，X17是D，且X18是A，并且在SEQ ID NO:43中，X19是R，X20是L，X21是N，且X22是T。在一些实施例中，在SEQ ID NO:42中，X9是V，X10是I，X11是N，X12是Q，X13是E，X14是D，X15是A，X16是K，X17是D，且X18是A，并且在SEQ ID NO:43中，X19是K，X20是V，X21是D，且X22是S。在一些实施例中，在SEQ ID NO:42中，X9是V，X10是I，X11是N，X12是Q，X13是E，X14是D，X15是A，X16是K，X17是D，且X18是A，并且在SEQ ID NO:43中，X19是R，X20是V，X21是D，且X22是S。在一些实施例中，在SEQ ID NO:42中，X9是V，X10是I，X11是N，X12是Q，X13是E，X14是D，X15是A，X16是K，X17是D，且X18是A，并且在SEQ ID NO:43中，X19是R，X20是L，X21是N，且X22是S。在一些实施例中，在SEQ ID NO:42中，X9是V，X10是M，X11是N，X12是Q，X13是E，X14是D，X15是A，X16是K，X17是D，且X18是A，并且在SEQ ID NO:43中，X19是K，X20是V，X21是D，且X22是T。在一些实施例中，在SEQ ID NO:42中，X9是V，X10是M，X11是N，X12是Q，X13是E，X14是D，X15是A，X16是K，X17是D，且X18是A，并且在SEQ ID NO:43中，X19是R，X20是V，X21是D，且X22是T。在一些实施例中，在SEQID NO:42中，X9是V，X10是M，X11是N，X12是Q，X13是E，X14是D，X15是A，X16是K，X17是D，且X18是A，并且在SEQ ID NO:43中，X19是R，X20是L，X21是N，且X22是T。在一些实施例中，在SEQ ID NO:42中，X9是V，X10是M，X11是N，X12是Q，X13是E，X14是D，X15是A，X16是K，X17是D，且X18是A，并且在SEQID NO:43中，X19是K，X20是V，X21是D，且X22是S。在一些实施例中，在SEQ ID NO:42中，X9是V，X10是M，X11是N，X12是Q，X13是E，X14是D，X15是A，X16是K，X17是D，且X18是A，并且在SEQ ID NO:43中，X19是R，X20是V，X21是D，且X22是S。在一些实施例中，在SEQ ID NO:42中，X9是V，X10是M，X11是N，X12是Q，X13是E，X14是D，X15是A，X16是K，X17是D，且X18是A，并且在SEQ ID NO:43中，X19是R，X20是L，X21是N，且X22是S。在一些实施例中，在SEQ ID NO:42中，X9是V，X10是M，X11是N，X12是Q，X13是E，X14是D，X15是A，X16是T，X17是S，且X18是T，并且在SEQ ID NO:43中，X19是K，X20是V，X21是D，且X22是T。在一些实施例中，在SEQ ID NO:42中，X9是V，X10是M，X11是N，X12是Q，X13是E，X14是D，X15是A，X16是T，X17是S，且X18是T，并且在SEQ ID NO:43中，X19是R，X20是V，X21是D，且X22是T。在一些实施例中，在SEQ ID NO:42中，X9是V，X10是M，X11是N，X12是Q，X13是E，X14是D，X15是A，X16是T，X17是S，且X18是T，并且在SEQ ID NO:43中，X19是R，X20是L，X21是N，且X22是T。在一些实施例中，在SEQ ID NO:42中，X9是V，X10是M，X11是N，X12是Q，X13是E，X14是D，X15是A，X16是T，X17是S，且X18是T，并且在SEQ ID NO:43中，X19是K，X20是V，X21是D，且X22是S。在一些实施例中，在SEQ ID NO:42中，X9是V，X10是M，X11是N，X12是Q，X13是E，X14是D，X15是A，X16是T，X17是S，且X18是T，并且在SEQ ID NO:43中，X19是R，X20是V，X21是D，且X22是S。在一些实施例中，在SEQ ID NO:42中，X9是V，X10是M，X11是N，X12是Q，X13是E，X14是D，X15是A，X16是T，X17是S，且X18是T，并且在SEQ ID NO:43中，X19是R，X20是L，X21是N，且X22是S。在一些实施例中，在SEQID NO:42中，X9是V，X10是M，X11是N，X12是Q，X13是E，X14是D，X15是A，X16是K，X17是D，且X18是T，并且在SEQ ID NO:43中，X19是K，X20是V，X21是D，且X22是T。在一些实施例中，在SEQ ID NO:42中，X9是V，X10是M，X11是N，X12是Q，X13是E，X14是D，X15是A，X16是K，X17是D，且X18是T，并且在SEQID NO:43中，X19是R，X20是V，X21是D，且X22是T。在一些实施例中，在SEQ ID NO:42中，X9是V，X10是M，X11是N，X12是Q，X13是E，X14是D，X15是A，X16是K，X17是D，且X18是T，并且在SEQ ID NO:43中，X19是R，X20是L，X21是N，且X22是T。在一些实施例中，在SEQ ID NO:42中，X9是V，X10是M，X11是N，X12是Q，X13是E，X14是D，X15是A，X16是K，X17是D，且X18是T，并且在SEQ ID NO:43中，X19是K，X20是V，X21是D，且X22是S。在一些实施例中，在SEQ ID NO:42中，X9是V，X10是M，X11是N，X12是Q，X13是E，X14是D，X15是A，X16是K，X17是D，且X18是T，并且在SEQ ID NO:43中，X19是R，X20是V，X21是D，且X22是S。在一些实施例中，在SEQ ID NO:42中，X9是V，X10是M，X11是N，X12是Q，X13是E，X14是D，X15是A，X16是K，X17是D，且X18是T，并且在SEQ ID NO:43中，X19是R，X20是L，X21是N，且X22是S。在一些实施例中，在SEQ ID NO:42中，X9是V，X10是M，X11是N，X12是Q，X13是E，X14是D，X15是V，X16是T，X17是D，且X18是T，并且在SEQ ID NO:43中，X19是K，X20是V，X21是D，且X22是T。在一些实施例中，在SEQ ID NO:42中，X9是V，X10是M，X11是N，X12是Q，X13是E，X14是D，X15是V，X16是T，X17是D，且X18是T，并且在SEQ ID NO:43中，X19是R，X20是V，X21是D，且X22是T。在一些实施例中，在SEQ ID NO:42中，X9是V，X10是M，X11是N，X12是Q，X13是E，X14是D，X15是V，X16是T，X17是D，且X18是T，并且在SEQ ID NO:43中，X19是R，X20是L，X21是N，且X22是T。在一些实施例中，在SEQ ID NO:42中，X9是V，X10是M，X11是N，X12是Q，X13是E，X14是D，X15是V，X16是T，X17是D，且X18是T，并且在SEQ ID 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NO:43中，X19是R，X20是L，X21是N，且X22是S。在一些实施例中，在SEQ ID NO:42中，X9是T，X10是M，X11是N，X12是Q，X13是E，X14是D，X15是A，X16是T，X17是D，且X18是T，并且在SEQ ID NO:43中，X19是K，X20是V，X21是D，且X22是T。在一些实施例中，在SEQ ID NO:42中，X9是T，X10是M，X11是N，X12是Q，X13是E，X14是D，X15是A，X16是T，X17是D，且X18是T，并且在SEQ ID NO:43中，X19是R，X20是V，X21是D，且X22是T。在一些实施例中，在SEQID NO:42中，X9是T，X10是M，X11是N，X12是Q，X13是E，X14是D，X15是A，X16是T，X17是D，且X18是T，并且在SEQ ID NO:43中，X19是R，X20是L，X21是N，且X22是T。在一些实施例中，在SEQ ID NO:42中，X9是T，X10是M，X11是N，X12是Q，X13是E，X14是D，X15是A，X16是T，X17是D，且X18是T，并且在SEQID NO:43中，X19是K，X20是V，X21是D，且X22是S。在一些实施例中，在SEQ ID NO:42中，X9是T，X10是M，X11是N，X12是Q，X13是E，X14是D，X15是A，X16是T，X17是D，且X18是T，并且在SEQ ID NO:43中，X19是R，X20是V，X21是D，且X22是S。在一些实施例中，在SEQ ID NO:42中，X9是T，X10是M，X11是N，X12是Q，X13是E，X14是D，X15是A，X16是T，X17是D，且X18是T，并且在SEQ ID NO:43中，X19是R，X20是L，X21是N，且X22是S。在一些实施例中，在SEQ ID NO:42中，X9是V，X10是M，X11是N，X12是Q，X13是E，X14是D，X15是A，X16是T，X17是D，且X18是T，并且在SEQ ID NO:43中，X19是K，X20是V，X21是D，且X22是T。在一些实施例中，在SEQ ID NO:42中，X9是V，X10是M，X11是N，X12是Q，X13是E，X14是D，X15是A，X16是T，X17是D，且X18是T，并且在SEQ ID NO:43中，X19是R，X20是V，X21是D，且X22是T。在一些实施例中，在SEQ ID NO:42中，X9是V，X10是M，X11是N，X12是Q，X13是E，X14是D，X15是A，X16是T，X17是D，且X18是T，并且在SEQ ID NO:43中，X19是R，X20是L，X21是N，且X22是T。在一些实施例中，在SEQ ID NO:42中，X9是V，X10是M，X11是N，X12是Q，X13是E，X14是D，X15是A，X16是T，X17是D，且X18是T，并且在SEQ ID NO:43中，X19是K，X20是V，X21是D，且X22是S。在一些实施例中，在SEQ ID NO:42中，X9是V，X10是M，X11是N，X12是Q，X13是E，X14是D，X15是A，X16是T，X17是D，且X18是T，并且在SEQ ID NO:43中，X19是R，X20是V，X21是D，且X22是S。在一些实施例中，在SEQ ID NO:42中，X9是V，X10是M，X11是N，X12是Q，X13是E，X14是D，X15是A，X16是T，X17是D，且X18是T，并且在SEQ ID NO:43中，X19是R，X20是L，X21是N，且X22是S。
在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQIDNO:16的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQID NO:2的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ IDNO:3的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQID NO:17的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQID NO:16的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQID NO:15的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQID NO:20的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQID NO:19的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQID NO:18的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQID NO:17的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ IDNO:11的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ IDNO:16的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQID NO:12的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ IDNO:15的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQID NO:13的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ IDNO:20的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQID NO:14的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ IDNO:19的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的轻链可变区。
在一些实施例中，抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQID NO:15的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的轻链可变区。
在一些实施例中，抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQID NO:15的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的轻链可变区。
在一些实施例中，抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的轻链可变区。
在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，其与SEQ ID NO:1具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％同一性。在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，其与SEQ ID NO:2具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％同一性。在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，其与SEQ ID NO:3具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％同一性。在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，其与SEQ ID NO:14具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％同一性。在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，其与SEQ ID NO:15具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％同一性。在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，其与SEQ ID NO:19具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％同一性。
在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，其与SEQ ID NO:40具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％同一性(即，与SEQ ID NO:40不具有100％同一性)，其中与其他抗PSMA抗体(例如J591和/或deJ591)相比，该抗PSMA抗体或抗原结合片段提供了改进的特性。在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，其与SEQ ID NO:41具有至少至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％同一性(即，与SEQ ID NO:41不具有100％同一性)，其中与其他抗PSMA抗体(例如J591和/或deJ591)相比，该抗PSMA抗体或抗原结合片段提供了改进的特性。在一些实施例中，抗PSMA抗体或抗原结合片段包含与SEQ ID NO:40具有至少86％同一性的重链可变区以及与SEQ ID NO:41具有至少87％同一性的轻链可变区(但与任一可变区不具有100％同一性)，其中与其他抗PSMA抗体(例如J591和/或deJ591)相比，该抗PSMA抗体或抗原结合片段提供了改进的特性。改进的特性可包括优异的稳定性和/或更低的免疫原性。
在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，其与SEQ ID NO:40具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％同一性，其中该抗PSMA抗体或抗原结合片段至少包含以下不同于SEQ ID NO:40的氨基酸：
相对于SEQ ID NO:40的位置 氨基酸
9 A
38 Q
67 R
68 V
70 I
111 V
其中与其他抗PSMA抗体(例如J591和/或deJ591)相比，该抗PSMA抗体或抗原结合片段提供了改进的特性。改进的特性可包括优异的稳定性和/或更低的免疫原性。相对于SEQ ID NO:40的位置通过将抗PSMA抗体或抗原结合片段的重链可变区与SEQ ID NO:40进行比对，任选地使用BLAST算法，然后从经比对的序列的N末端开始计数氨基酸位置来确定。
在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，其与SEQ ID NO:41具有至少至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％同一性，其中该抗PSMA抗体或抗原结合片段至少包含以下不同于SEQ ID NO:41的氨基酸：
相对于SEQ ID NO:41的位置 氨基酸
13 A
21 I
42 K
43 A
58 V
85 T
100 Q
104 L
105 E
其中与其他抗PSMA抗体(例如J591和/或deJ591)相比，该抗PSMA抗体或抗原结合片段提供了改进的特性。改进的特性可包括优异的稳定性和/或更低的免疫原性。相对于SEQ ID NO:41的位置通过将抗PSMA抗体或抗原结合片段的重链可变区与SEQ ID NO:41进行比对，任选地使用BLAST算法，然后从经比对的序列的N末端开始计数氨基酸位置来确定。
在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，其与SEQ ID NO:42具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％同一性，其中与其他抗PSMA抗体(例如J591和/或deJ591)相比，该抗PSMA抗体或抗原结合片段提供了改进的特性。在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，其与SEQ ID NO:43具有至少至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％同一性，其中与其他抗PSMA抗体(例如J591和/或deJ591)相比，该抗PSMA抗体或抗原结合片段提供了改进的特性。抗PSMA抗体或抗原结合片段不包含与SEQ IDNO:40具有100％同一性的重链可变区以及与SEQ ID NO:41具有100％同一性的轻链可变区。改进的特性可包括优异的稳定性和/或更低的免疫原性。
在各个实施例中，本文披露的任一抗PSMA抗体可以包含人IgG1Fc结构域。在一些实施例中，抗PSMA抗体包含人IgG1 Fc结构域，与具有野生型IgG1 Fc结构域的含IgG1 Fc的抗体相比，该人IgG1 Fc结构域被修饰以减少与FcγR的结合。在一些实施例中，抗PSMA抗体包含突变的人IgG1 Fc结构域，其包含对人IgG1重链恒定结构域的L234A、L235A、P238S、H268Q和K274Q修饰中的一个或多个(例如全部)。
在各个实施例中，抗PSMA抗体包含人Igκ轻链恒定区。在各个实施例中，抗PSMA抗体包含人Igλ轻链恒定区。
在一些实施例中，本文提供的抗PSMA抗体包含含有选自SEQ ID NO:47-60的氨基酸序列的重链和含有选自SEQ ID NO:61-66的氨基酸序列的轻链。
在一些实施例中，抗PSMA抗体包含SEQ ID NO:47的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:61的轻链氨基酸序列。在一些实施例中，抗PSMA抗体包含SEQ ID NO:47的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:62的轻链氨基酸序列。在一些实施例中，抗PSMA抗体包含SEQ ID NO:47的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:63的轻链氨基酸序列。在一些实施例中，抗PSMA抗体包含SEQID NO:47的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:64的轻链氨基酸序列。在一些实施例中，抗PSMA抗体包含SEQ ID NO:47的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:65的轻链氨基酸序列。在一些实施例中，抗PSMA抗体包含SEQ ID NO:47的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:66的轻链氨基酸序列。在一些实施例中，抗PSMA抗体包含SEQ ID NO:48的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:61的轻链氨基酸序列。在一些实施例中，抗PSMA抗体包含SEQ ID NO:48的重链氨基酸序列和SEQID NO:62的轻链氨基酸序列。在一些实施例中，抗PSMA抗体包含SEQ ID NO:48的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:63的轻链氨基酸序列。在一些实施例中，抗PSMA抗体包含SEQ ID NO:48的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:64的轻链氨基酸序列。在一些实施例中，抗PSMA抗体包含SEQ ID NO:48的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:65的轻链氨基酸序列。在一些实施例中，抗PSMA抗体包含SEQ ID NO:48的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:66的轻链氨基酸序列。在一些实施例中，抗PSMA抗体包含SEQ ID NO:49的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:61的轻链氨基酸序列。在一些实施例中，抗PSMA抗体包含SEQ ID NO:49的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:62的轻链氨基酸序列。在一些实施例中，抗PSMA抗体包含SEQ ID NO:49的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:63的轻链氨基酸序列。在一些实施例中，抗PSMA抗体包含SEQ ID NO:49的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:64的轻链氨基酸序列。在一些实施例中，抗PSMA抗体包含SEQID NO:49的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:65的轻链氨基酸序列。在一些实施例中，抗PSMA抗体包含SEQ ID NO:49的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:66的轻链氨基酸序列。在一些实施例中，抗PSMA抗体包含SEQ ID NO:50的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:61的轻链氨基酸序列。在一些实施例中，抗PSMA抗体包含SEQ ID NO:50的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:62的轻链氨基酸序列。在一些实施例中，抗PSMA抗体包含SEQ ID NO:50的重链氨基酸序列和SEQID NO:63的轻链氨基酸序列。在一些实施例中，抗PSMA抗体包含SEQ ID NO:50的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:64的轻链氨基酸序列。在一些实施例中，抗PSMA抗体包含SEQ ID NO:50的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:65的轻链氨基酸序列。在一些实施例中，抗PSMA抗体包含SEQ ID NO:50的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:66的轻链氨基酸序列。在一些实施例中，抗PSMA抗体包含SEQ ID NO:51的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:61的轻链氨基酸序列。在一些实施例中，抗PSMA抗体包含SEQ ID NO:51的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:62的轻链氨基酸序列。在一些实施例中，抗PSMA抗体包含SEQ ID NO:51的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:63的轻链氨基酸序列。在一些实施例中，抗PSMA抗体包含SEQ ID NO:51的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:64的轻链氨基酸序列。在一些实施例中，抗PSMA抗体包含SEQ ID NO:51的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:65的轻链氨基酸序列。在一些实施例中，抗PSMA抗体包含SEQID NO:51的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:66的轻链氨基酸序列。在一些实施例中，抗PSMA抗体包含SEQ ID NO:52的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:61的轻链氨基酸序列。在一些实施例中，抗PSMA抗体包含SEQ ID NO:52的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:62的轻链氨基酸序列。在一些实施例中，抗PSMA抗体包含SEQ ID NO:52的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:63的轻链氨基酸序列。在一些实施例中，抗PSMA抗体包含SEQ ID NO:52的重链氨基酸序列和SEQID NO:64的轻链氨基酸序列。在一些实施例中，抗PSMA抗体包含SEQ ID NO:52的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:65的轻链氨基酸序列。在一些实施例中，抗PSMA抗体包含SEQ ID NO:52的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:66的轻链氨基酸序列。在一些实施例中，抗PSMA抗体包含SEQ ID NO:53的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:61的轻链氨基酸序列。在一些实施例中，抗PSMA抗体包含SEQ ID NO:53的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:62的轻链氨基酸序列。在一些实施例中，抗PSMA抗体包含SEQ ID NO:53的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:63的轻链氨基酸序列。在一些实施例中，抗PSMA抗体包含SEQ ID NO:53的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:64的轻链氨基酸序列。在一些实施例中，抗PSMA抗体包含SEQ ID NO:53的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:65的轻链氨基酸序列。在一些实施例中，抗PSMA抗体包含SEQ ID NO:53的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:66的轻链氨基酸序列。在一些实施例中，抗PSMA抗体包含SEQID NO:54的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:61的轻链氨基酸序列。在一些实施例中，抗PSMA抗体包含SEQ ID NO:54的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:62的轻链氨基酸序列。在一些实施例中，抗PSMA抗体包含SEQ ID NO:54的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:63的轻链氨基酸序列。在一些实施例中，抗PSMA抗体包含SEQ ID NO:54的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:64的轻链氨基酸序列。在一些实施例中，抗PSMA抗体包含SEQ ID NO:54的重链氨基酸序列和SEQID NO:65的轻链氨基酸序列。在一些实施例中，抗PSMA抗体包含SEQ ID NO:54的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:66的轻链氨基酸序列。在一些实施例中，抗PSMA抗体包含SEQ ID NO:55的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:61的轻链氨基酸序列。在一些实施例中，抗PSMA抗体包含SEQ ID NO:55的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:62的轻链氨基酸序列。在一些实施例中，抗PSMA抗体包含SEQ ID NO:55的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:63的轻链氨基酸序列。在一些实施例中，抗PSMA抗体包含SEQ ID NO:55的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:64的轻链氨基酸序列。在一些实施例中，抗PSMA抗体包含SEQ ID NO:55的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:65的轻链氨基酸序列。在一些实施例中，抗PSMA抗体包含SEQ ID NO:55的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:66的轻链氨基酸序列。在一些实施例中，抗PSMA抗体包含SEQ ID NO:56的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:61的轻链氨基酸序列。在一些实施例中，抗PSMA抗体包含SEQID NO:56的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:62的轻链氨基酸序列。在一些实施例中，抗PSMA抗体包含SEQ ID NO:56的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:63的轻链氨基酸序列。在一些实施例中，抗PSMA抗体包含SEQ ID NO:56的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:64的轻链氨基酸序列。在一些实施例中，抗PSMA抗体包含SEQ ID NO:56的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:65的轻链氨基酸序列。在一些实施例中，抗PSMA抗体包含SEQ ID NO:56的重链氨基酸序列和SEQID NO:66的轻链氨基酸序列。在一些实施例中，抗PSMA抗体包含SEQ ID NO:57的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:61的轻链氨基酸序列。在一些实施例中，抗PSMA抗体包含SEQ ID NO:57的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:62的轻链氨基酸序列。在一些实施例中，抗PSMA抗体包含SEQ ID NO:57的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:63的轻链氨基酸序列。在一些实施例中，抗PSMA抗体包含SEQ ID NO:57的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:64的轻链氨基酸序列。在一些实施例中，抗PSMA抗体包含SEQ ID NO:57的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:65的轻链氨基酸序列。在一些实施例中，抗PSMA抗体包含SEQ ID NO:57的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:66的轻链氨基酸序列。在一些实施例中，抗PSMA抗体包含SEQ ID NO:58的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:61的轻链氨基酸序列。在一些实施例中，抗PSMA抗体包含SEQ ID NO:58的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:62的轻链氨基酸序列。在一些实施例中，抗PSMA抗体包含SEQID NO:58的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:63的轻链氨基酸序列。在一些实施例中，抗PSMA抗体包含SEQ ID NO:58的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:64的轻链氨基酸序列。在一些实施例中，抗PSMA抗体包含SEQ ID NO:58的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:65的轻链氨基酸序列。在一些实施例中，抗PSMA抗体包含SEQ ID NO:58的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:66的轻链氨基酸序列。在一些实施例中，抗PSMA抗体包含SEQ ID NO:59的重链氨基酸序列和SEQID NO:61的轻链氨基酸序列。在一些实施例中，抗PSMA抗体包含SEQ ID NO:59的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:62的轻链氨基酸序列。在一些实施例中，抗PSMA抗体包含SEQ ID NO:59的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:63的轻链氨基酸序列。在一些实施例中，抗PSMA抗体包含SEQ ID NO:59的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:64的轻链氨基酸序列。在一些实施例中，抗PSMA抗体包含SEQ ID NO:59的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:65的轻链氨基酸序列。在一些实施例中，抗PSMA抗体包含SEQ ID NO:59的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:66的轻链氨基酸序列。在一些实施例中，抗PSMA抗体包含SEQ ID NO:60的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:61的轻链氨基酸序列。在一些实施例中，抗PSMA抗体包含SEQ ID NO:60的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:62的轻链氨基酸序列。在一些实施例中，抗PSMA抗体包含SEQ ID NO:60的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:63的轻链氨基酸序列。在一些实施例中，抗PSMA抗体包含SEQID NO:60的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:64的轻链氨基酸序列。在一些实施例中，抗PSMA抗体包含SEQ ID NO:60的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:65的轻链氨基酸序列。在一些实施例中，抗PSMA抗体包含SEQ ID NO:60的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:66的轻链氨基酸序列。
在一些实施例中，抗PSMA抗体包含SEQ ID NO:47的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:61的轻链氨基酸序列。在一些实施例中，抗PSMA抗体包含SEQ ID NO:48的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:61的轻链氨基酸序列。在一些实施例中，抗PSMA抗体包含SEQ ID NO:49的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:61的轻链氨基酸序列。在一些实施例中，抗PSMA抗体包含SEQID NO:60的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:61的轻链氨基酸序列。
在一些实施例中，抗PSMA抗体包含SEQ ID NO:60的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:65的轻链氨基酸序列。
在上文讨论的任一抗体中，重链氨基酸序列可能缺少C末端赖氨酸。
在各个实施例中，可以进行氨基酸取代，同时保留本文披露的抗体的结合亲和力和/或特异性和/或提供一种或多种额外的有益特性，例如通过在框架、恒定结构域和/或CDR序列中进行一种或多种变化。在一些实施例中，取代是单个残基的取代。例如，在一些实施例中，抗PSMA抗体包含人IgG1 Fc结构域，与具有野生型IgG1 Fc结构域的含IgG1 Fc的抗体相比，该人IgG1 Fc结构域包含氨基酸取代以减少与FcγR的结合。在一些实施例中，抗PSMA抗体包含突变的人IgG1 Fc结构域，其包含取代L234A、L235A、P238S、H268Q和K274Q。插入的数量级通常为约1至约20个氨基酸残基，但只要保留生物功能(例如，与PSMA的结合)，就可以容许显著更大的插入。缺失通常在约1至约20个氨基酸残基的范围内，但在一些情况下，缺失可能要大得多。取代、缺失、插入或其任何组合可用于获得最终衍生物或变体。通常，这些变化是在几个氨基酸上进行的，以最大限度地减少分子的改变，特别是抗原结合蛋白的免疫原性和特异性。然而，在某些情况下，可以容许更大的变化。保守取代通常根据以下表11中描绘的图表进行。
表11.
原始残基 示例性取代
Ala Ser
Arg Lys
Asn Gln、His
Asp Glu
Cys Ser
Gln Asn
Glu Asp
Gly Pro
His Asn、Gln
Ile Leu、Val
Leu Ile、Val
Lys Arg、Gln、Glu
Met Leu、Ile
Phe Met、Leu、Tyr
Ser Thr
Thr Ser
Trp Tyr
Tyr Trp、Phe
Val Ile、Leu
在其中变体抗体序列用于ADC中的各个实施例中，变体可以展现出相同的定性生物活性并且引发相同的免疫反应，尽管也可以根据需要选择变体来修饰抗原结合蛋白的特征。例如，本文提供的抗PSMA抗体可以包含人IgG1 Fc结构域，与具有野生型IgG1 Fc结构域的含IgG1 Fc的抗体相比，该人IgG1 Fc结构域经突变以减少与FcγR的结合。可替代地，变体可设计成使得抗原结合蛋白的生物活性被改变。
本文披露的任一抗PSMA抗体和抗原结合片段可以用作例如与可检测剂和/或另一治疗剂的缀合物。在一些实施例中，抗PSMA抗体或抗原结合片段可以用于抗体-药物缀合物(ADC)中，例如本文披露的任一ADC中，优选地以将ADC中的药物靶向癌细胞。如下所示，出人意料地，本文披露的ADC中的连接子-毒素与也在本文披露的抗PSMA抗体一起是有效的。这些抗体可以与本文披露的连接子和毒素(例如化合物1)一起使用。
连接子
在各个实施例中，本文披露的抗PSMA抗体和抗原结合片段可以通过连接子与药物部分(例如，细胞毒性有效载荷，例如化合物1)接合以产生抗体-药物缀合物(ADC)。
在一些实施例中，ADC中的连接子以足以具有治疗有效性的方式具有细胞外稳定性。在一些实施例中，连接子在细胞外部是稳定的，使得ADC在存在于细胞外条件(例如，在转运或递送至细胞中之前)中时保持完整。在ADC的上下文中使用的术语“完整”意指抗体部分保持与药物部分(例如化合物1)附接。如本文所用，在连接子或包含连接子的ADC的上下文中，“稳定”意指在设置的时间段内进行评估时，在ADC存在于细胞外条件中时，ADC样品中的不超过约20％、不超过约15％、不超过约10％、不超过约5％、不超过约3％、或不超过约1％(或其间的任何百分比)的连接子被切割(或在总体ADC在其他方面不完整的情况下)。在一些实施例中，选择本文披露的ADC中的连接子以保持稳定超过约48小时、超过约60小时、超过约72小时、超过约84小时或超过约96小时。
可以例如通过在血浆中包括ADC持续预先确定的时间段(例如，2、4、6、8、16或24小时)、然后定量血浆中存在的游离药物部分的量来确定连接子是否具有细胞外稳定性。稳定性可允许ADC有时间定位至靶标肿瘤细胞并防止药物过早释放，这可能会因无差别地损害正常组织和肿瘤组织两者而降低ADC的治疗指数。在一些实施例中，连接子在靶细胞外部是稳定的，并且一旦处于细胞内部就会从ADC释放药物部分，使得药物部分可结合其靶标(例如，结合STING)。因此，有效连接子将：(i)维持抗体部分的特异性结合特性；(ii)允许通过与抗体部分的稳定附接而递送(例如，细胞内递送)药物部分；(iii)保持稳定和完整直到ADC已经转运或递送至其靶位点；以及(iv)允许切割后药物部分的治疗性效果，例如细胞毒性作用。
连接子可能影响ADC的物理-化学特性。由于许多细胞毒性剂本质上具有疏水性，因此将它们与具有额外疏水性部分的抗体连接可能会引起聚集。ADC聚集物不可溶且通常限制抗体上可实现的载药量，这可能不利地影响ADC的效力。通常，生物制品的蛋白质聚集物还与免疫原性增加相关。如下所示，本文披露的连接子使ADC具有低聚集水平以及所需载药量水平。在各个实施例中，连接子通过半胱氨酸与抗体或抗原结合片段缀合。在各个实施例中，连接子通过赖氨酸与抗体或抗原结合片段缀合。用于将本披露的连接子与抗体缀合的合适的方法包括用于与抗体重链上的赖氨酸、抗体重链上的半胱氨酸和抗体轻链上的半胱氨酸直接附接的技术，例如，如以下所披露的：PCT申请WO 2017/213267、WO 2017/106643和WO 2016/205618，以及Junutula等人(2008)Journalof ImmunologicalMethods[免疫学方法杂志]332:41–52，将所有这些通过引用以其全文并入本文。在一些实施例中，连接子与轻链上的抗体或抗原结合片段缀合，例如在轻链上的半胱氨酸处，例如在轻链上的半胱氨酸80处。在一些实施例中，连接子与重链上的抗体或抗原结合片段缀合，例如在重链上的半胱氨酸处，例如在重链上的半胱氨酸118处。
本文所用的连接子可以是“可切割的”或“不可切割的”(Ducry和Stump,Bioconjugate Chem.[生物缀合化学](2010)21:5-13)。可切割连接子被设计成当经受某些环境因素(例如，当内化到靶细胞中)时释放药物，而不可切割连接子通常依赖抗体部分本身的降解。
在一些实施例中，连接子是不可切割连接子。在一些实施例中，ADC的药物部分通过抗体部分的降解而释放。
在一些实施例中，连接子是可切割的。可切割连接子被设计成当经受某些环境因素(例如，当内化到靶细胞中)时释放药物。可切割连接子是指包含可切割部分的任何连接子。如本文所用，术语“可切割部分”是指可被切割的任何化学键。合适的可切割化学键是本领域中已知的，并且包括但不限于酸不稳定性键、蛋白酶/肽酶不稳定性键、光不稳定性键、二硫键和酯酶不稳定性键。包含可切割部分的连接子可以通过在连接子中的特定位点处进行切割而允许药物部分从ADC释放。
在一些实施例中，连接子可在细胞内条件下切割，使得连接子的切割在细胞内环境中充分地从抗体部分释放药物部分以激活药物和/或使药物在治疗上有效。在一些实施例中，在ADC进入表达对ADC的抗体部分具有特异性的抗原的细胞之前，药物部分不会从抗体部分切割，而是在进入细胞时，药物部分从抗体部分切割。在一些实施例中，连接子包含可切割部分，该可切割部分的位置使得在切割时连接子或抗体部分的任何部分不与药物部分保持结合。示例性可切割连接子包括酸不稳定性连接子、蛋白酶/肽酶敏感性连接子、光不稳定性连接子、含二甲基连接子、含二硫化物连接子或含磺酰胺连接子。
在一些实施例中，连接子可被细胞内环境中(例如，溶酶体、胞内体或小凹内)存在的切割剂(例如，酶)切割。连接子可以是例如被细胞内肽酶或蛋白酶(包括但不限于溶酶体或胞内体蛋白酶)切割的肽连接子。在一些实施例中，连接子是可切割肽连接子。如本文所用，可切割肽连接子是指包含可切割肽部分的任何连接子。术语“可切割肽部分”是指可被细胞内环境中存在的药剂切割的任何化学键连接的氨基酸(天然或合成氨基酸衍生物)。在一些实施例中，与酸不稳定性连接子相比，可切割肽连接子更稳定地与本文披露的抗体缀合。
在一些实施例中，连接子是酶可切割连接子，并且连接子中的可切割肽部分可被酶切割。在一些实施例中，可切割肽部分可被溶酶体酶，例如组织蛋白酶或半胱氨酸蛋白酶(也称为天冬酰胺酰内肽酶或液泡加工酶)切割。在一些实施例中，连接子是组织蛋白酶可切割连接子。在一些实施例中，连接子是半胱氨酸蛋白酶可切割连接子。在一些实施例中，连接子中的可切割肽部分可被溶酶体半胱氨酸组织蛋白酶(如组织蛋白酶B、C、F、H、K、L、O、S、V、X或W)切割。在一些实施例中，可切割肽部分可被组织蛋白酶B切割。可被组织蛋白酶B切割的示例性二肽是缬氨酸-瓜氨酸(Val-Cit)。参见，例如Dubowchik等人(2002)Bioconjugate Chem.[生物缀合化学]13:855-69。可被组织蛋白酶B切割的另一示例性二肽是缬氨酸-丙氨酸(Val-Ala)。参见，例如Fu和Ho(2002)Antib.Ther.[抗体治疗]1(2):33-43。
在一些实施例中，连接子中的可切割肽部分可被溶酶体半胱氨酸内肽酶(如半胱氨酸蛋白酶)切割。可被半胱氨酸蛋白酶切割的示例性单肽是天冬酰胺(Asn)。可被半胱氨酸蛋白酶切割的另一示例性单肽是天冬氨酸(Asp)。
在一些实施例中，连接子或连接子中的可切割肽部分包含氨基酸单元。在一些实施例中，氨基酸单元允许蛋白酶切割连接子，从而在暴露于一种或多种细胞内蛋白酶(如一种或多种溶酶体酶)时促进药物部分从ADC释放。参见，例如Doronina等人(2003)Nat.Biotechnol.[自然生物技术]21:778-84；以及Dubowchik和Walker(1999)Pharm.Therapeutics[药理学与治疗学]83:67-123。示例性氨基酸单元包括但不限于单肽、二肽、三肽、四肽和五肽。示例性单肽包括但不限于天冬酰胺(Asn)和天冬氨酸(Asp)。示例性二肽包括但不限于缬氨酸-瓜氨酸(Val-Cit)、丙氨酸-天冬酰胺(Ala-Asn)、丙氨酸-苯丙氨酸(Ala-Phe)、苯丙氨酸-赖氨酸(Phe-Lys)、丙氨酸-赖氨酸(Ala-Lys)、丙氨酸-缬氨酸(Ala-Val)、缬氨酸-丙氨酸(Val-Ala)、缬氨酸-赖氨酸(Val-Lys)、赖氨酸-赖氨酸(Lys-Lys)、苯丙氨酸-瓜氨酸(Phe-Cit)、亮氨酸-瓜氨酸(Leu-Cit)、异亮氨酸-瓜氨酸(Ile-Cit)、色氨酸-瓜氨酸(Trp-Cit)、和苯丙氨酸-丙氨酸(Phe-Ala)。示例性三肽包括但不限于丙氨酸-丙氨酸-天冬酰胺(Ala-Ala-Asn)、甘氨酸-缬氨酸-瓜氨酸(Gly-Val-Cit)、谷氨酸-缬氨酸-瓜氨酸、甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸(Gly-Gly-Gly)、苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸(Phe-Phe-Lys)、丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸(Ala-Phe-Lys)、甘氨酸-缬氨酸-丙氨酸(Gly-Val-Ala)、和甘氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸(Gly-Phe-Lys)。示例性四肽包括但不限于甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸(Gly-Gly-Phe-Gly)。其他示例性氨基酸单元包括但不限于Gly-Phe-Leu-Gly、Ala-Leu-Ala-Leu、Phe-N9-甲苯磺酰基-Arg、和Phe-N9-硝基-Arg，如在例如美国专利号6,214,345中所描述的。在一些实施例中，氨基酸单元可以包含含有至少一个甲基基团，例如一甲基或二甲基基团的氨基酸残基。包含含有至少一个甲基基团的氨基酸残基的示例性氨基酸单元包括但不限于N-甲基化丙氨酸((NMe)Ala)、甲基化天冬氨酸(Asp(OMe))和二甲基化赖氨酸(Val-Lys(Me)2)。在一些实施例中，连接子中的氨基酸单元包含Val-Ala。在一些实施例中，连接子中的氨基酸单元包含Val-Cit。氨基酸单元可以包含天然存在的氨基酸残基和/或次级氨基酸和/或非天然存在的氨基酸类似物(如瓜氨酸)。可以设计和优化氨基酸单元以进行特定酶，例如肿瘤相关蛋白酶、溶酶体蛋白酶(如半胱氨酸蛋白酶或组织蛋白酶B、C、D或S)的酶促切割。
在一些实施例中，本文披露的ADC中的连接子可以包含抗体附接部分。抗体附接部分可用于例如将抗体部分与连接子连接，而连接子又可以例如通过可切割部分(例如可切割肽)与药物部分间接连接。
在一些实施例中，连接子包含含有马来酰亚胺部分(Mal)的抗体附接部分。如本文所用的术语“马来酰亚胺部分”意指含有马来酰亚胺基团且可与硫氢基基团(例如抗体部分上的半胱氨酸残基的硫氢基基团)反应的化合物。可与硫氢基基团(硫醇)反应并因此可用来代替Mal的其他官能团包括但不限于碘乙酰胺、溴乙酰胺、乙烯基吡啶、二硫化物、吡啶基二硫化物、异氰酸酯和异硫氰酸酯。
在一些实施例中，连接子通过Mal部分与抗体或抗原结合片段附接。在一些实施例中，Mal部分可与抗体或抗原结合片段上的半胱氨酸残基反应。在一些实施例中，Mal部分通过半胱氨酸残基与抗体或抗原结合片段接合。
在一些实施例中，Mal部分是马来酰亚胺基己酰基(MC)部分。在一些实施例中，连接子通过MC部分与抗体或抗原结合片段附接。在一些实施例中，MC部分可与抗体或抗原结合片段上的半胱氨酸残基反应。在一些实施例中，MC部分通过半胱氨酸残基与抗体或抗原结合片段接合。
在一些实施例中，连接子包含Mal部分和可切割肽部分。在一些实施例中，可切割肽部分包含氨基酸单元。在一些实施例中，氨基酸单元包含Val-Cit。在一些实施例中，氨基酸单元包含Val-Ala。在一些实施例中，Mal部分将抗体部分与连接子中的可切割肽部分附接。在一些实施例中，可切割肽部分包含氨基酸单元。在一些实施例中，氨基酸单元包含Val-Cit。在一些实施例中，氨基酸单元包含Val-Ala。在一些实施例中，连接子包含Mal-Val-Cit。在一些实施例中，连接子包含Mal-Val-Ala。
在一些实施例中，连接子包含MC部分和可切割肽部分。在一些实施例中，可切割肽部分包含氨基酸单元。在一些实施例中，氨基酸单元包含Val-Cit。在一些实施例中，氨基酸单元包含Val-Ala。在一些实施例中，MC部分将抗体部分与连接子中的可切割肽部分附接。在一些实施例中，可切割肽部分包含氨基酸单元。在一些实施例中，氨基酸单元包含Val-Cit。在一些实施例中，氨基酸单元包含Val-Ala。在一些实施例中，连接子包含MC-Val-Cit。在一些实施例中，连接子包含MC-Val-Ala。
在一些实施例中，本文披露的ADC中的任一连接子可以包含至少一个将抗体部分与药物部分接合的间隔子单元。在一些实施例中，间隔子单元将连接子中的切割位点(例如可切割肽部分)与抗体部分接合。在一些实施例中，间隔子单元将连接子中的切割位点(例如可切割肽部分)与药物部分接合。在一些实施例中，连接子和/或连接子中的间隔子单元实质上具有亲水性。在一些实施例中，连接子包括一个或多个聚乙二醇(PEG)部分，例如1、2、3或4个PEG部分。在一些实施例中，连接子包括一个或多个烷基部分，例如1、2、3、4或5个烷基部分。
在一些实施例中，连接子中的间隔子单元包含一个或多个PEG部分。在一些实施例中，间隔子单元包含-(PEG)m-且m是1至10的整数。在一些实施例中，m在1至4范围内；或在2至4范围内。在一些实施例中，m是2。在一些实施例中，m是3。在一些实施例中，m是4。在一些实施例中，间隔子单元包含(PEG)2、(PEG)3或(PEG)4。在一些实施例中，间隔子单元包含PEG2-Lys(ε-PEG8-OMe)-PEG2。
在一些实施例中，连接子中的间隔子单元包含烷基部分。在一些实施例中，间隔子单元包含-(CH2)n-且n是1至10的整数(即n可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)。在一些实施例中，n是3、4或5。在一些实施例中，间隔子单元包含(CH2)3或(CH2)4或(CH2)5。在一些实施例中，间隔子单元包含CH2-CH2。
在一些实施例中，间隔子单元包含在一些实施例中，间隔子单元包含和(PEG)2。在一些实施例中，间隔子单元包含与(PEG)2缀合的在一些实施例中，间隔子单元包含
在一些实施例中，本文披露的连接子可用于具有其他D部分的L-D构建体中。在一些实施例中，使用包含含有式(II)的间隔子单元的连接子可以为各种D部分提供益处，包括例如与包含替代间隔子单元的其他连接子相比改进的缀合稳定性、改进的血浆稳定性和/或体内抗肿瘤活性。在一些实施例中，不受理论的束缚，使用包含式(II)的连接子与本文披露的STING激动剂，例如具有式(III)、式(IV)的化合物或表14的化合物、例如化合物1的益处可以包括改进的缀合稳定性、改进的血浆稳定性和/或体内抗肿瘤活性。在一些实施例中，包含式(II)的连接子和包含本文披露的STING激动剂，例如具有式(III)、式(IV)的化合物或表14的化合物的有效载荷当与本文披露的抗PSMA抗体缀合时表现出优异的特性。这样的L-D和抗体-药物缀合物的优异益处的示例性证据显示在实例4、9、12和15中。
例如，可使用间隔子单元以将抗体部分与药物部分直接或间接连接。在一些实施例中，间隔子单元将抗体部分与药物部分直接连接。在一些实施例中，抗体部分和药物部分通过包含一个或多个烷基部分(例如(CH2)3或(CH2)4或(CH2)5)的间隔子单元附接。在一些实施例中，抗体部分和药物部分通过包含一个或多个PEG部分(例如(PEG)2或(PEG)3或(PEG)4)的间隔子单元附接。在一些实施例中，抗体部分和药物部分通过包含式(II)的间隔子单元附接。在一些实施例中，间隔子单元将抗体部分与药物部分间接连接。在一些实施例中，间隔子单元通过可切割部分(例如可切割肽)和/或用于将间隔子单元与抗体部分接合的抗体附接部分(例如马来酰亚胺部分或苄氧羰基-L-谷氨酰胺酰-甘氨酸部分)将抗体部分与药物部分间接连接。
在一些实施例中，间隔子单元通过马来酰亚胺部分(Mal)与抗体部分(即抗体或抗原结合片段)附接。通过Mal与抗体或抗原结合片段附接的间隔子单元在本文中称为“Mal-间隔子单元”。在一些实施例中，Mal-间隔子单元可与抗体或抗原结合片段上的半胱氨酸残基反应。在一些实施例中，Mal-间隔子单元通过半胱氨酸残基与抗体或抗原结合片段接合。在一些实施例中，Mal-间隔子单元包含PEG部分。在一些实施例中，Mal-间隔子单元包含烷基部分。在一些实施例中，Mal-间隔子单元包含式(II)。在一些实施例中，间隔子单元通过马来酰亚胺基己酰基部分(MC)与抗体部分(即抗体或抗原结合片段)附接。通过MC与抗体或抗原结合片段附接的间隔子单元在本文中称为“MC-间隔子单元”。在一些实施例中，MC-间隔子单元可与抗体或抗原结合片段上的半胱氨酸残基反应。在一些实施例中，MC-间隔子单元通过半胱氨酸残基与抗体或抗原结合片段接合。在一些实施例中，MC-间隔子单元包含PEG部分。在一些实施例中，MC-间隔子单元包含烷基部分。在一些实施例中，MC-间隔子单元包含式(II)。
在一些实施例中，连接子包含Mal-间隔子单元或MC-间隔子单元和可切割肽部分。在一些实施例中，可切割肽部分包含氨基酸单元。在一些实施例中，氨基酸单元包含Val-Cit。在一些实施例中，氨基酸单元包含Val-Ala。在一些实施例中，连接子包含Mal-间隔子单元或MC-间隔子单元和氨基酸单元。在一些实施例中，连接子包含Mal-(CH2)n和氨基酸单元，其中n是3至5，或3、4或5。在一些实施例中，连接子包含MC-(CH2)n和氨基酸单元，其中n是3至5，或3、4或5。
在一些实施例中，连接子包含Mal-(PEG)m和氨基酸单元，其中m是2至4，或2、3或4。在一些实施例中，连接子包含MC-(PEG)m和氨基酸单元，其中m是2至4，或2、3或4。在一些实施例中，连接子进一步包含可切割二肽，例如Val-Cit或Val-Ala。在一些实施例中，连接子包含Mal-(PEG)n-Val-Cit，其中n是1到10之间的任何数字。在一些实施例中，连接子包含Mal-(PEG)n-Val-Ala，其中n是1到10之间的任何数字。在一些实施例中，连接子包含MC-(PEG)n-Val-Cit，其中n是1到10之间的任何数字。在一些实施例中，连接子包含MC-(PEG)n-Val-Ala，其中n是1到10之间的任何数字。
在一些实施例中，连接子包含Mal-式(II)和氨基酸单元。在一些实施例中，连接子包含可切割二肽，例如Val-Cit或Val-Ala。在一些实施例中，连接子包含Mal-式(II)-Val-Cit。在一些实施例中，连接子包含Mal-式(II)-Val-Ala。
在一些实施例中，Mal-间隔子单元或MC-间隔子单元将抗体部分(即抗体或抗原结合片段)与连接子中的可切割部分附接。在一些实施例中，Mal-间隔子单元或MC-间隔子单元将抗体或抗原结合片段与可切割肽部分附接。在一些实施例中，可切割肽部分包含氨基酸单元。在一些实施例中，连接子包含Mal-间隔子单元-氨基酸单元。在一些实施例中，Mal-间隔子单元包含PEG部分。在一些实施例中，Mal-间隔子单元包含烷基部分。在一些实施例中，Mal-间隔子单元包含式(II)。在一些实施例中，连接子包含MC-间隔子单元-氨基酸单元。在一些实施例中，MC-间隔子单元包含PEG部分。在一些实施例中，MC-间隔子单元包含烷基部分。
在各个实施例中，连接子中的可切割部分与药物部分和/或抗体部分直接接合。在其他实施例中，间隔子单元用于将连接子中的可切割部分与药物部分和/或抗体部分附接。在各个实施例中，药物部分可以是本文披露的任何STING激动剂药物部分，例如具有式(III)、式(IV)的化合物、或下文表14中披露的化合物。在各个实施例中，药物部分通过间隔子单元与连接子中的可切割部分附接。在各个实施例中，药物部分是化合物1。在各个实施例中，化合物1部分通过间隔子单元与连接子中的可切割部分附接。在一些实施例中，药物部分、例如化合物1通过自消解单元与连接子中的可切割部分附接。在一些实施例中，药物部分、例如化合物1通过自消解单元与连接子中的可切割部分附接，可切割部分包含氨基酸单元，并且另外的间隔子单元(例如，包含一个或多个烷基或PEG部分或式(II))将可切割部分与抗体部分接合。在一些实施例中，药物部分、例如化合物1通过连接子中的Mal-间隔子单元与抗PSMA抗体接合，该连接子中的Mal-间隔子单元与可切割肽部分和pAB或pABC自消解单元接合。在一些实施例中，药物部分、例如化合物1通过连接子中的MC-间隔子单元与抗PSMA抗体接合，该连接子中的MC-间隔子单元与可切割肽部分和pAB或pABC自消解单元接合。
间隔子单元可以是“自消解的”或“非自消解的”。“非自消解”间隔子单元是在连接子切割时间隔子单元的一部分或全部仍结合药物部分的间隔子单元。非自消解单元的实例包括但不限于甘氨酸间隔子单元和甘氨酸-甘氨酸间隔子单元。非自消解单元最终可随时间而降解，但在细胞条件下不会容易地完全释放所连接的天然药物。“自消解”单元包含允许在施用至受试者后，例如在细胞内条件下释放天然药物部分的任何结构。“天然药物”是在间隔子单元切割/降解后不保留间隔子单元的部分或其他化学修饰的天然药物。
自消解化学是本领域中已知的，并且可针对所披露的ADC容易地选择。在各个实施例中，将连接子中的可切割部分与药物部分(例如化合物1)附接的间隔子单元是自消解的，并且在细胞内条件下可切割部分切割的同时或之前/之后不久经历自消解。
在各个实施例中，本文披露的连接子可以包含至少一个自消解单元。本文披露的任一连接子可以包含第一自消解单元。短语“第一自消解单元”可以表示包含一个自消解单元的连接子或包含一个或多个自消解单元的连接子。在一些实施例中，本文披露的连接子包含第一自消解单元和第二自消解单元。
在某些实施例中，连接子中的至少一个自消解单元包含对氨基苄基单元。在一些实施例中，对氨基苄醇(pABOH)通过酰胺键与连接子中的氨基酸单元或其他可切割部分附接，并且在pABOH和药物部分之间形成氨基甲酸酯、氨基甲酸甲酯或碳酸酯。参见，例如Hamann等人(2005)Expert Opin.Ther.Patents[治疗剂专利专家评论]15:1087-103。在一些实施例中，至少一个自消解单元是或包含对氨基苄基(pAB)。在一些实施例中，至少一个自消解单元是或包含对氨基苄氧基羰基(pABC)。不受理论的束缚，认为pAB或pABC的自消解涉及自发的1,6-消除反应。参见，例如Jain等人(2015)Pharm Res[药物研究]32:3526-40。
在各个实施例中，所披露的ADC中使用的对氨基苄基(pAB)的结构如下所示：
在各个实施例中，所披露的ADC中使用的对氨基苄氧基羰基(pABC)的结构如下所示：
自消解单元中的pAB或pABC的结构可以被取代。
在一些实施例中，pAB被选自甲基、氟、氯、三氟甲基、C6-C10芳基和C5-C12杂芳基的1-3个取代基取代。示例性经取代的pAB单元披露于表12中。在一些实施例中，本文披露的连接子可以包含选自下文表12中披露的自消解单元的自消解单元。
表12.示例性经取代的pAB部分
可以修饰连接子部分以实现ADC的所需特性，例如稳定性、耐受性和/或功效。例如，与包含pAB或pABC的连接子相比，包含经修饰的pAB或pABC部分的连接子可以增加ADC稳定性和/或体内ADC耐受性(如通过例如体重减轻百分比所确定的)，同时最大限度地减少ADC功效降低。可能需要对连接子-药物结构，例如间隔子单元或经修饰的药物部分附接点进行某些额外修饰，以获得一种或多种(例如，所有这些)特性。例如，可能需要进行某些修饰或修饰的组合以增强ADC稳定性，同时避免功效损失。例如，在一些实施例中，与其他抗PSMA ADC相比，包含LP1、LP2、LP16、LP20、LP26或LP28的ADC可以实现ADC的所需特性，例如稳定性、耐受性和/或功效。
在一些实施例中，本文披露的任一连接子可以包含另外的自消解单元。在一些实施例中，另外的自消解单元将第一自消解单元与药物部分(例如化合物1)附接。与包含本文披露的任一有效载荷化合物的其他连接子-有效载荷缀合物相比，将一个或多个另外的自消解单元添加至如本文所披露的连接子-有效载荷缀合物中可以提供优异的技术益处，例如优异的稳定性和/或改进的活性。本文披露的任一连接子可以包含第二自消解单元。
示例性额外的自消解单元披露于表13中。在一些实施例中，连接子-有效载荷缀合物包含下文表13中列出的第二自消解单元。在一些实施例中，连接子-有效载荷缀合物包含Val-Ala-pAB和选自表13的第二自消解单元。在一些实施例中，连接子-有效载荷缀合物包含Val-Ala-pABC和选自表13的第二自消解单元。在一些实施例中，连接子-有效载荷缀合物包含Val-Cit-pAB和选自表13的第二自消解单元。在一些实施例中，连接子-有效载荷缀合物包含Val-Cit-pABC和选自表13的第二自消解单元。
表13.示例性自消解单元
单元2和9-13包括所有立体异构体。
在一些实施例中，另外的自消解单元包含单元1(MEC)部分。在一些实施例中，MEC部分将第一自消解单元与药物部分(例如化合物1)附接(“自消解单元-MEC部分”)。在一些实施例中，另外的自消解单元包含单元2部分。在一些实施例中，单元2部分将第一自消解单元与药物部分(例如化合物1)附接(“自消解单元-单元2部分”)。在一些实施例中，另外的自消解单元包含单元3部分。在一些实施例中，单元3部分将第一自消解单元与药物部分(例如化合物1)附接(“自消解单元-单元3部分”)。在一些实施例中，另外的自消解单元包含单元4部分。在一些实施例中，单元4部分将第一自消解单元与药物部分(例如化合物1)附接(“自消解单元-单元4部分”)。在一些实施例中，另外的自消解单元包含单元5部分。在一些实施例中，单元5部分将第一自消解单元与药物部分(例如化合物1)附接(“自消解单元-单元5部分”)。在一些实施例中，另外的自消解单元包含单元6部分。在一些实施例中，单元6部分将第一自消解单元与药物部分(例如化合物1)附接(“自消解单元-单元6部分”)。在一些实施例中，另外的自消解单元包含单元7部分。在一些实施例中，单元7部分将第一自消解单元与药物部分(例如化合物1)附接(“自消解单元-单元7部分”)。在一些实施例中，另外的自消解单元包含单元8部分。在一些实施例中，单元8部分将第一自消解单元与药物部分(例如化合物1)附接(“自消解单元-单元8部分”)。在一些实施例中，另外的自消解单元包含单元9部分。在一些实施例中，单元9部分将第一自消解单元与药物部分(例如化合物1)附接(“自消解单元-单元9部分”)。在一些实施例中，另外的自消解单元包含单元10部分。在一些实施例中，单元10部分将第一自消解单元与药物部分(例如化合物1)附接(“自消解单元-单元10部分”)。在一些实施例中，另外的自消解单元包含单元11部分。在一些实施例中，单元11部分将第一自消解单元与药物部分(例如化合物1)附接(“自消解单元-单元11部分”)。在一些实施例中，另外的自消解单元包含单元12部分。在一些实施例中，单元12部分将第一自消解单元与药物部分(例如化合物1)附接(“自消解单元-单元12部分”)。在一些实施例中，另外的自消解单元包含单元13部分。在一些实施例中，单元13部分将第一自消解单元与药物部分(例如化合物1)附接(“自消解单元-单元13部分”)。
在各个实施例中，连接子中的可切割部分与药物部分中的硫直接或间接附接。药物部分可以是本文披露的任何合适的药物部分，例如具有式(III)、式(IV)的化合物、或下文表14中披露的化合物。在一些实施例中，药物部分是或包含化合物1。在一些实施例中，连接子中的可切割部分与本文披露的STING激动剂药物部分(例如化合物1)中的S-14硫直接或间接附接。在一些实施例中，一个或多个自消解单元包含pAB。在一些实施例中，pAB将连接子中的可切割部分与本文披露的STING激动剂药物部分(例如化合物1)中的S-14硫附接。在一些实施例中，pAB在可切割部分切割时经历自消解，并且STING激动剂药物部分(例如化合物1)以其天然活性形式从ADC释放。在一些实施例中，可切割部分包含氨基酸单元。在一些实施例中，连接子包含氨基酸单元-pAB。在一些实施例中，氨基酸单元是Val-Cit。在一些实施例中，连接子包含Val-Cit-pAB。在一些实施例中，氨基酸单元是Val-Ala。在一些实施例中，连接子包含Val-Ala-pAB。
在各个实施例中，连接子中的可切割部分与药物部分中的氮直接或间接附接。药物部分可以是本文披露的STING激动剂药物部分，例如具有式(III)、式(IV)的化合物、或下文表14中披露的化合物。在一些实施例中，药物部分是或包含化合物1。在一些实施例中，STING激动剂药物部分(例如化合物1)中的氮是N-34氮。在一些实施例中，STING激动剂药物部分(例如化合物1)中的氮是N-39氮。在一些实施例中，一个或多个自消解单元包含pAB。在一些实施例中，一个或多个自消解单元包含pABC。在一些实施例中，一个或多个自消解单元包含MEC部分。在一些实施例中，一个或多个自消解单元包含pABC-MEC部分。在一些实施例中，pABC的羧酸酯部分与MEC的n-甲基部分结合以形成N-甲基氨基甲酸酯部分。在一些实施例中，一个或多个自消解单元包含单元8部分。在一些实施例中，一个或多个自消解单元包含pABC-单元8部分。在一些实施例中，一个或多个自消解单元包含单元9部分。在一些实施例中，一个或多个自消解单元包含pABC-单元9部分。在一些实施例中，一个或多个自消解单元包含单元11部分。在一些实施例中，一个或多个自消解单元包含pABC-单元11部分。
在一些实施例中，连接子包含第一间隔子单元和第二间隔子单元之间的第三间隔子单元。在一些实施例中，第二和/或第三间隔子单元选自上文表13的部分。在一些实施例中，连接子包含pABC间隔子单元和MEC间隔子单元之间的第三间隔子单元。在一些实施例中，连接子包含pABC间隔子单元和单元8间隔子单元之间的第三间隔子单元。在一些实施例中，连接子包含pABC间隔子单元和单元9间隔子单元之间的第三间隔子单元。在一些实施例中，连接子包含pABC间隔子单元和单元11间隔子单元之间的第三间隔子单元。在一些实施例中，pABC将连接子中的可切割部分与化合物1中的N-34氮附接。在一些实施例中，pABC将连接子中的可切割部分与化合物1中的N-39氮附接。
在一些实施例中，pABC-MEC部分将连接子中的可切割部分与化合物1中的N-34氮附接。在一些实施例中，pABC-MEC部分将连接子中的可切割部分与化合物1中的N-39氮附接。在一些实施例中，pABC或pABC-MEC部分在可切割部分切割时经历自消解，并且化合物1以其天然活性形式从ADC释放。在一些实施例中，化合物1从抗体和连接子的释放以逐步方式发生，其中首先切割连接子中的可切割部分、然后pABC部分经历自消解、然后MEC部分经历自消解。在一些实施例中，可切割部分包含氨基酸单元。在一些实施例中，连接子包含氨基酸单元-pABC。在一些实施例中，连接子包含氨基酸单元-pABC-MEC部分。在一些实施例中，氨基酸单元是Val-Cit。在一些实施例中，连接子包含Val-Cit-pABC。在一些实施例中，连接子包含Val-Cit-pABC-MEC部分。在一些实施例中，氨基酸单元是Val-Ala。在一些实施例中，连接子包含Val-Ala-pABC。在一些实施例中，连接子包含Val-Ala-pABC-MEC部分。
在一些实施例中，pABC-单元8部分将连接子中的可切割部分与化合物1中的N-34氮附接。在一些实施例中，pABC-单元8部分将连接子中的可切割部分与化合物1中的N-39氮附接。在一些实施例中，pABC或pABC-单元8部分在可切割部分切割时经历自消解，并且化合物1以其天然活性形式从ADC释放。在一些实施例中，化合物1从抗体和连接子的释放以逐步方式发生，其中首先切割连接子中的可切割部分、然后pABC部分经历自消解、然后单元8部分经历自消解。在一些实施例中，可切割部分包含氨基酸单元。在一些实施例中，连接子包含氨基酸单元-pABC。在一些实施例中，连接子包含氨基酸单元-pABC-单元8部分。在一些实施例中，氨基酸单元是Val-Cit。在一些实施例中，连接子包含Val-Cit-pABC。在一些实施例中，连接子包含Val-Cit-pABC-单元8部分。在一些实施例中，氨基酸单元是Val-Ala。在一些实施例中，连接子包含Val-Ala-pABC。在一些实施例中，连接子包含Val-Ala-pABC-单元8部分。
在一些实施例中，pABC-单元9部分将连接子中的可切割部分与化合物1中的N-34氮附接。在一些实施例中，pABC-单元9部分将连接子中的可切割部分与化合物1中的N-39氮附接。在一些实施例中，pABC或pABC-单元9部分在可切割部分切割时经历自消解，并且化合物1以其天然活性形式从ADC释放。在一些实施例中，化合物1从抗体和连接子的释放以逐步方式发生，其中首先切割连接子中的可切割部分、然后pABC部分经历自消解、然后单元9部分经历自消解。在一些实施例中，可切割部分包含氨基酸单元。在一些实施例中，连接子包含氨基酸单元-pABC。在一些实施例中，连接子包含氨基酸单元-pABC-单元9部分。在一些实施例中，氨基酸单元是Val-Cit。在一些实施例中，连接子包含Val-Cit-pABC。在一些实施例中，连接子包含Val-Cit-pABC-单元9部分。在一些实施例中，氨基酸单元是Val-Ala。在一些实施例中，连接子包含Val-Ala-pABC。在一些实施例中，连接子包含Val-Ala-pABC-单元9部分。
在一些实施例中，pABC-单元11部分将连接子中的可切割部分与化合物1中的N-34氮附接。在一些实施例中，pABC-单元11部分将连接子中的可切割部分与化合物1中的N-39氮附接。在一些实施例中，pABC或pABC-单元11部分在可切割部分切割时经历自消解，并且化合物1以其天然活性形式从ADC释放。在一些实施例中，化合物1从抗体和连接子的释放以逐步方式发生，其中首先切割连接子中的可切割部分、然后pABC部分经历自消解、然后单元11部分经历自消解。在一些实施例中，可切割部分包含氨基酸单元。在一些实施例中，连接子包含氨基酸单元-pABC。在一些实施例中，连接子包含氨基酸单元-pABC-单元11部分。在一些实施例中，氨基酸单元是Val-Cit。在一些实施例中，连接子包含Val-Cit-pABC。在一些实施例中，连接子包含Val-Cit-pABC-单元11部分。在一些实施例中，氨基酸单元是Val-Ala。在一些实施例中，连接子包含Val-Ala-pABC。在一些实施例中，连接子包含Val-Ala-pABC-单元11部分。
在一些实施例中，至少一个自消解单元(例如pAB、pABC、pABC-MEC部分、pABC-单元8部分、pABC-单元9部分或pABC-单元11部分)在连接子中的可切割肽部分切割时经历自消解。在一些实施例中，至少一个自消解单元(例如pAB、pABC、pABC-MEC部分、pABC-单元8部分、pABC-单元9部分或pABC-单元11部分)的自消解在连接子中的可切割肽部分切割后以逐步方式发生，从最靠近可切割肽部分的自消解部分开始。在一些实施例中，至少一个自消解单元(例如pAB、pABC、pABC-MEC部分、pABC-单元8部分、pABC-单元9部分或pABC-单元11部分)在连接子中的可切割肽部分切割后以逐步方式经历自消解，其中第一自消解单元(例如pABC或pAB)在第二自消解单元(例如MEC部分、单元8部分、单元9部分、单元11部分)的自消解之前经历自消解。在一些实施例中，可切割肽部分包含氨基酸单元。在一些实施例中，连接子包含氨基酸单元-pAB。在一些实施例中，连接子包含氨基酸单元-pABC。在一些实施例中，连接子包含氨基酸单元-pABC-MEC部分。在一些实施例中，连接子包含氨基酸单元-pABC-单元8部分。在一些实施例中，连接子包含氨基酸单元-pABC-单元9部分。在一些实施例中，连接子包含氨基酸单元-pABC-单元11部分。在一些实施例中，氨基酸单元是Val-Cit。在一些实施例中，连接子包含Val-Cit-pAB。在一些实施例中，连接子包含Val-Cit-pABC。在一些实施例中，连接子包含Val-Cit-pABC-MEC部分。在一些实施例中，连接子包含Val-Cit-pABC-单元8部分。在一些实施例中，连接子包含Val-Cit-pABC-单元9部分。在一些实施例中，连接子包含Val-Cit-pABC-单元11部分。在一些实施例中，氨基酸单元是Val-Ala。在一些实施例中，连接子包含Val-Ala-pAB。在一些实施例中，连接子包含Val-Ala-pABC。在一些实施例中，连接子包含Val-Ala-pABC-MEC部分。在一些实施例中，连接子包含Val-Ala-pABC-单元8部分。在一些实施例中，连接子包含Val-Ala-pABC-单元9部分。在一些实施例中，连接子包含Val-Ala-pABC-单元11部分。
在各个方面，ADC的抗体部分通过连接子与药物部分缀合，其中该连接子包含MC-间隔子单元、可切割氨基酸单元和pAB。在一些实施例中，连接子包含MC-Val-Cit-pAB。在一些实施例中，连接子包含MC-Val-Ala-pAB。
在各个方面，ADC的抗体部分通过连接子与药物部分缀合，其中该连接子包含MC-间隔子单元、可切割氨基酸单元和pABC。在一些实施例中，连接子包含MC-Val-Cit-pABC。在一些实施例中，连接子包含MC-Val-Ala-pABC。
在各个方面，ADC的抗体部分通过连接子与药物部分缀合，其中该连接子包含MC单元、可切割氨基酸单元、pABC和MEC部分。在一些实施例中，连接子包含MC-Val-Cit-pABC-MEC部分。在一些实施例中，连接子包含MC-Val-Ala-pABC-MEC部分。
在各个方面，ADC的抗体部分通过连接子与药物部分缀合，其中该连接子包含MC单元、可切割氨基酸单元、pABC和单元8部分。在一些实施例中，连接子包含MC-Val-Cit-pABC-单元8部分。在一些实施例中，连接子包含MC-Val-Ala-pABC-单元8部分。
在各个方面，ADC的抗体部分通过连接子与药物部分缀合，其中该连接子包含MC单元、可切割氨基酸单元、pABC和单元9部分。在一些实施例中，连接子包含MC-Val-Cit-pABC-单元9部分。在一些实施例中，连接子包含MC-Val-Ala-pABC-单元9部分。
在各个方面，ADC的抗体部分通过连接子与药物部分缀合，其中该连接子包含MC单元、可切割氨基酸单元、pABC和单元11部分。在一些实施例中，连接子包含MC-Val-Cit-pABC-单元11部分。在一些实施例中，连接子包含MC-Val-Ala-pABC-单元11部分。
在一些实施例中，抗体部分通过包含马来酰亚胺基己酰基部分(MC)和氨基酸的连接子与药物部分缀合。在一些实施例中，抗体部分通过包含马来酰亚胺基己酰基部分(MC)、氨基酸和pAB的连接子与药物部分缀合。在一些实施例中，抗体部分通过包含马来酰亚胺基己酰基部分(MC)、氨基酸和pABC的连接子与药物部分缀合。在一些实施例中，抗体部分通过包含马来酰亚胺基己酰基部分(MC)、氨基酸、pABC和MEC部分的连接子与药物部分缀合。在一些实施例中，抗体部分通过包含马来酰亚胺基己酰基部分(MC)、氨基酸、pABC和单元8部分的连接子与药物部分缀合。在一些实施例中，抗体部分通过包含马来酰亚胺基己酰基部分(MC)、氨基酸、pABC和单元9部分的连接子与药物部分缀合。在一些实施例中，抗体部分通过包含马来酰亚胺基己酰基部分(MC)、氨基酸、pABC和单元11部分的连接子与药物部分缀合。
在各个方面，ADC的抗体部分通过连接子与药物部分缀合，其中该连接子包含Mal-间隔子单元、可切割氨基酸单元和pAB。在一些实施例中，连接子包含Mal-式(II)-Val-Cit-pAB。在一些实施例中，连接子包含Mal-式(II)-Val-Ala-pAB。在各个方面，ADC的抗体部分通过连接子与药物部分缀合，其中该连接子包含Mal-间隔子单元、可切割氨基酸单元和pABC。在一些实施例中，连接子包含Mal-式(II)-Val-Cit-pABC。在一些实施例中，连接子包含Mal-式(II)-Val-Ala-pABC。
在各个方面，ADC的抗体部分通过连接子与药物部分缀合，其中该连接子包含Mal单元、可切割氨基酸单元、pABC和MEC部分。在一些实施例中，连接子包含Mal-式(II)-Val-Cit-pABC-MEC部分。在一些实施例中，连接子包含Mal-式(II)-Val-Ala-pABC-MEC部分。
在各个方面，ADC的抗体部分通过连接子与药物部分缀合，其中该连接子包含Mal单元、可切割氨基酸单元、pABC和单元8部分。在一些实施例中，连接子包含Mal-式(II)-Val-Cit-pABC-单元8部分。在一些实施例中，连接子包含Mal-式(II)-Val-Ala-pABC-单元8部分。
在各个方面，ADC的抗体部分通过连接子与药物部分缀合，其中该连接子包含Mal单元、可切割氨基酸单元、pABC和单元9部分。在一些实施例中，连接子包含Mal-式(II)-Val-Cit-pABC-单元9部分。在一些实施例中，连接子包含Mal-式(II)-Val-Ala-pABC-单元9部分。
在各个方面，ADC的抗体部分通过连接子与药物部分缀合，其中该连接子包含Mal单元、可切割氨基酸单元、pABC和单元11部分。在一些实施例中，连接子包含Mal-式(II)-Val-Cit-pABC-单元11部分。在一些实施例中，连接子包含Mal-式(II)-Val-Ala-pABC-单元11部分。
在一些实施例中，药物部分是化合物1。
在一些实施例中，药物部分是化合物2。
药物部分
本文披露的连接子-药物缀合物和ADC的药物部分(D)可以是任何化疗剂。在一些实施例中，药物部分是STING激动剂。示例性STING激动剂是本领域中已知的，并且包括环状二核苷酸、例如大环桥接的STING激动剂，非环状二核苷酸。在一些实施例中，药物部分是非环状二核苷酸。在一些实施例中，药物部分是大环桥接的STING激动剂。
本文披露的连接子-药物缀合物和ADC的药物部分包含根据下式之一的化合物：
其异构体、该化合物或异构体的氘代衍生物；或者该化合物、异构体或氘代衍生物的盐；
其中，对于每次出现独立地是：
■Pa和Pb中的每个，当不是外消旋时，独立地选自(R)-构型和(S)-构型；
■Qa和Qb中的每个独立地选自NH和O；
■Va和Vb中的每个独立地选自F和OH；
■W选自H和NH2；
■Xa和Xb中的每个独立地选自OH和SH；
■Ya和Yb中的每个独立地选自O和S；
■Za和Zb各自独立地选自CH2、O和NH；以及
■意味着键选自单键(-)、(E)-或(Z)-构型的双键(＝)、或三键
条件是Za和Zb中的至少一个是NH或Xa和Xb中的至少一个是SH。
如本文所提及的，式(III)和(IV)中的原子可以如下所示进行编号：
在一些实施例中，Pa和Pb中的每个是外消旋的。在一些实施例中，Pa是外消旋的且Pb选自(R)-构型和(S)-构型。在一些实施例中，Pa选自(R)-构型和(S)-构型且Pb是外消旋的。在一些实施例中，Pa和Pb中的每个选自(R)-构型和(S)-构型。
在一些实施例中，Pa是(R)-构型且Pb是(R)-构型。在一些实施例中，Pa是(R)-构型且Pb是(S)-构型。在一些实施例中，Pa是(S)-构型且Pb是(R)-构型。在一些实施例中，Pa是(S)-构型且Pb是(S)-构型。
在一些实施例中，Qa是O且Qb是O。在一些实施例中，Qa是NH且Qb是O。在一些实施例中，Qa是O且Qb是NH。在一些实施例中，Qa是NH且Qb是NH。
在一些实施例中，Va是OH且Vb是OH。在一些实施例中，Va是F且Vb是OH。在一些实施例中，Va是OH且Vb是F。在一些实施例中，Va是F且Vb是F。
在一些实施例中，W是H。在一些实施例中，W是NH2。
在一些实施例中，Xa是OH且Xb是OH。在一些实施例中，Xa是SH且Xb是OH。在一些实施例中，Xa是OH且Xb是SH。在一些实施例中，Xa是SH且Xb是SH。
在一些实施例中，Ya是O且Yb是O。在一些实施例中，Ya是S且Yb是O。在一些实施例中，Ya是O且Yb是S。在一些实施例中，Ya是S且Yb是S。
在一些实施例中，Za是NH且Zb选自CH2、O和NH。在一些实施例中，Za是NH且Zb是CH2。在一些实施例中，Za是NH且Zb是O。在一些实施例中，Za是NH且Zb是NH。
在一些实施例中，Za是O且Zb选自CH2、O和NH。在一些实施例中，Za是O且Zb是CH2。在一些实施例中，Za是O且Zb是O。在一些实施例中，Za是O且Zb是NH。
在一些实施例中，Za是CH2且Zb选自CH2、O和NH。在一些实施例中，Za是CH2且Zb是CH2。在一些实施例中，Za是CH2且Zb是O。在一些实施例中，Za是CH2且Zb是NH。
在一些实施例中，是单键。在一些实施例中，是(E)-构型的双键。在一些实施例中，是(Z)-构型的双键。在一些实施例中，是三键。
在一些实施例中，Xa和Xb中的至少一个是SH且Za和Zb中的每个独立地选自CH2、O和NH。在一些实施例中，Xa是SH且Za和Zb中的每个独立地选自CH2、O和NH。在一些实施例中，Xb是SH且Za和Zb中的每个独立地选自CH2、O和NH。在一些实施例中，Xa和Xb中的每个是SH且Za和Zb中的每个独立地选自CH2、O和NH。
在一些实施例中，Za和Zb中的至少一个是NH且Xa和Xb选自OH和SH。在一些实施例中，Za是NH且Xa和Xb选自OH和SH。在一些实施例中，Zb是NH且Xa和Xb选自OH和SH。在一些实施例中，Za和Zb中的每个是NH且Xa和Xb选自OH和SH。
在一些实施例中，药物部分的桥是脂肪族基团，其中至少一个CH2单元被NH基团替代。在一些实施例中，脂肪族基团是完全饱和的。在一些实施例中，脂肪族基团含有至少一个不饱和单元。在一些实施例中，桥是脂肪族基团，其中一个CH2单元被NH基团替代。在一些实施例中，桥是脂肪族基团，其中两个CH2单元被NH基团替代。在一些实施例中，桥原子包含在一些实施例中，桥原子包含在一些实施例中，桥原子包含
在一些实施例中，D包含具有式(III)的化合物且Xa是SH。在一些实施例中，D包含具有式(III)的化合物且Xb是SH。在一些实施例中，D包含具有式(IV)的化合物且Xa是SH。在一些实施例中，D包含具有式(IV)的化合物且Xb是SH。
在一些实施例中，D包含选自以下的具有式(III)的化合物：
及其盐。
在一些实施例中，具有式(III)的化合物选自：
及其盐。
在一些实施例中，D包含化合物1。在一些实施例中，D包含化合物2。
在一些实施例中，D包含选自以下的具有式(IV)的化合物：
及其盐。
在一些实施例中，D包含选自以下的具有式(IV)的化合物：
及其盐。
在一些实施例中，D包含化合物1。在一些实施例中，D包含化合物2。
在一些实施例中，D包含选自以下的化合物：
及其盐。
在一些实施例中，STING激动剂是化合物1。化合物1的结构如下所示：
如上所述，除非上下文另外说明，否则术语化合物1还涵盖如上所示结构的盐。在一些实施例中，药物部分是化合物1。在一些实施例中，连接子、例如ADC的连接子，通过化合物1上的S-14硫与化合物1附接。在一些实施例中，连接子、例如ADC的连接子，通过化合物1上的N-34氮与化合物1附接。在一些实施例中，连接子、例如ADC的连接子，通过化合物1上的N-39氮与化合物1附接。在一些实施例中，ADC的连接子通过pAB与化合物1上的S-14硫共价附接。在一些实施例中，pAB是如上所披露的pAB的类似物。在一些实施例中，ADC的连接子通过pABC与化合物1上的N-34氮共价附接。在一些实施例中，ADC的连接子通过pABC与化合物1上的N-39氮共价附接。在一些实施例中，ADC的连接子通过如下所披露的第二自消解单元与化合物1上的N-34氮共价附接。在一些实施例中，ADC的连接子通过如下所披露的第二自消解单元与化合物1上的N-39氮共价附接。
在一些实施例中，STING激动剂是化合物2。化合物2的结构如下所示：
除非上下文另外说明，否则术语化合物2还涵盖如上所示结构的盐。在一些实施例中，药物部分是化合物2。在一些实施例中，连接子、例如ADC的连接子，通过化合物2上的S-14硫与化合物1附接。在一些实施例中，连接子、例如ADC的连接子，通过化合物2上的N-34氮与化合物1附接。在一些实施例中，连接子、例如ADC的连接子，通过化合物2上的N-39氮与化合物1附接。在一些实施例中，ADC的连接子通过pAB与化合物2上的S-14硫共价附接。在一些实施例中，pAB是如上所披露的pAB的类似物。在一些实施例中，ADC的连接子通过pABC与化合物2上的N-34氮共价附接。在一些实施例中，ADC的连接子通过pABC与化合物2上的N-39氮共价附接。在一些实施例中，ADC的连接子通过如下所披露的第二自消解单元与化合物2上的N-34氮共价附接。在一些实施例中，ADC的连接子通过如下所披露的第二自消解单元与化合物2上的N-39氮共价附接。在一些实施例中，STING激动剂选自下文表14的化合物。
表14.示例性STING激动剂化合物
进一步披露了表14的化合物的异构体，这些化合物和异构体的氘代衍生物；以及这些化合物、异构体和氘代衍生物的盐。
在某些实施例中，中间体、例如上文披露的连接子的前体，在适当的条件下与药物部分反应。在某些实施例中，在药物和/或中间体或连接子上使用反应性基团。药物与中间体或衍生药物之间的反应产物随后在适当的条件下与抗体或抗原结合片段反应，例如根据下文讨论的方法。可替代地，连接子或中间体可以首先与抗体或衍生抗体反应，然后与药物或衍生药物反应。
许多不同的反应可用于药物和/或连接子与抗体部分的共价附接。这通常通过抗体分子的一个或多个氨基酸残基的反应来完成，包括赖氨酸的胺基、谷氨酸和天冬氨酸的游离羧酸基团、半胱氨酸的硫氢基基团以及芳族氨基酸的各个部分。例如，非特异性共价附接可以使用碳二亚胺反应进行，以将化合物上的羧基(或氨基)基团与抗体部分上的氨基(或羧基)基团连接。另外，还可以使用双官能试剂(如二醛或亚氨酸酯)将化合物上的氨基基团与抗体部分上的氨基基团连接。希夫碱(Schiff base)反应还可用于将药物与结合剂附接。此方法涉及过碘酸盐氧化含有二醇或羟基基团的药物，由此形成醛，然后使该醛与结合剂反应。通过与结合剂的氨基基团形成希夫碱而发生附接。也可以使用异硫氰酸酯作为偶联剂以用于将药物与结合剂共价附接。其他技术是技术人员已知的并且处于本披露的范围内。
连接子-药物缀合物
本披露提供了包含L-D的连接子-药物缀合物，其中L是与D共价附接的可切割连接子。术语“连接子-药物缀合物”和“连接子-有效载荷缀合物”在本文中可互换使用。本文披露的连接子-药物缀合物适合缀合至多种抗体，包括本文披露的抗PSMA抗体。在L-D的上下文中，D是与L形成共价键的化合物，其导致至少一个氢自由基的损失。在L-D的上下文中，D可以是任何能从所披露的连接子中受益的合适的化合物。在一些实施例中，D选自本文披露的任一化合物。在L-D的上下文中，L可以选自本文披露的任何连接子。D包含根据下式之一的化合物：
其异构体、该化合物或异构体的氘代衍生物；或者该化合物、异构体或氘代衍生物的盐；
其中，对于每次出现独立地是：
■Pa和Pb中的每个，当不是外消旋时，独立地选自(R)-构型和(S)-构型；
■Qa和Qb中的每个独立地选自NH和O；
■Va和Vb中的每个独立地选自F和OH；
■W选自H和NH2；
■Xa和Xb中的每个独立地选自OH和SH；
■Ya和Yb中的每个独立地选自O和S；
■Za和Zb各自独立地选自CH2、O和NH；以及
■意味着键选自单键(-)、(E)-或(Z)-构型的双键(＝)、或三键
条件是Za和Zb中的至少一个是NH或Xa和Xb中的至少一个是SH。
在一些实施例中，Pa和Pb中的每个是外消旋的。在一些实施例中，Pa是外消旋的且Pb选自(R)-构型和(S)-构型。在一些实施例中，Pa选自(R)-构型和(S)-构型且Pb是外消旋的。在一些实施例中，Pa和Pb中的每个选自(R)-构型和(S)-构型。
在一些实施例中，Pa是(R)-构型且Pb是(R)-构型。在一些实施例中，Pa是(R)-构型且Pb是(S)-构型。在一些实施例中，Pa是(S)-构型且Pb是(R)-构型。在一些实施例中，Pa是(S)-构型且Pb是(S)-构型。
在一些实施例中，Qa是O且Qb是O。在一些实施例中，Qa是NH且Qb是O。在一些实施例中，Qa是O且Qb是NH。在一些实施例中，Qa是NH且Qb是NH。
在一些实施例中，Va是OH且Vb是OH。在一些实施例中，Va是F且Vb是OH。在一些实施例中，Va是OH且Vb是F。在一些实施例中，Va是F且Vb是F。
在一些实施例中，W是H。在一些实施例中，W是NH2。
在一些实施例中，Xa是OH且Xb是OH。在一些实施例中，Xa是SH且Xb是OH。在一些实施例中，Xa是OH且Xb是SH。在一些实施例中，Xa是SH且Xb是SH。
在一些实施例中，Ya是O且Yb是O。在一些实施例中，Ya是S且Yb是O。在一些实施例中，Ya是O且Yb是S。在一些实施例中，Ya是S且Yb是S。
在一些实施例中，Za是NH且Zb选自CH2、O和NH。在一些实施例中，Za是NH且Zb是CH2。在一些实施例中，Za是NH且Zb是O。在一些实施例中，Za是NH且Zb是NH。
在一些实施例中，Za是O且Zb选自CH2、O和NH。在一些实施例中，Za是O且Zb是CH2。在一些实施例中，Za是O且Zb是O。在一些实施例中，Za是O且Zb是NH。
在一些实施例中，Za是CH2且Zb选自CH2、O和NH。在一些实施例中，Za是CH2且Zb是CH2。在一些实施例中，Za是CH2且Zb是O。在一些实施例中，Za是CH2且Zb是NH。
在一些实施例中，是单键。在一些实施例中，是(E)-构型的双键。在一些实施例中，是(Z)-构型的双键。在一些实施例中，是三键。
在一些实施例中，Xa和Xb中的至少一个是SH且Za和Zb中的每个独立地选自CH2、O和NH。在一些实施例中，Xa是SH且Za和Zb中的每个独立地选自CH2、O和NH。在一些实施例中，Xb是SH且Za和Zb中的每个独立地选自CH2、O和NH。在一些实施例中，Xa和Xb中的每个是SH且Za和Zb中的每个独立地选自CH2、O和NH。
在一些实施例中，Za和Zb中的至少一个是NH且Xa和Xb选自OH和SH。在一些实施例中，Za是NH且Xa和Xb选自OH和SH。在一些实施例中，Zb是NH且Xa和Xb选自OH和SH。在一些实施例中，Za和Zb中的每个是NH且Xa和Xb选自OH和SH。
在一些实施例中，D包含具有式(III)的化合物且Xa是SH。在一些实施例中，D包含具有式(III)的化合物且Xb是SH。在一些实施例中，D包含具有式(IV)的化合物且Xa是SH。在一些实施例中，D包含具有式(IV)的化合物且Xb是SH。
在一些实施例中，连接子-药物缀合物的桥是脂肪族基团，其中至少一个CH2单元被NH基团替代。在一些实施例中，脂肪族基团是完全饱和的。在一些实施例中，脂肪族基团含有至少一个不饱和单元。在一些实施例中，桥是脂肪族基团，其中一个CH2单元被NH基团替代。在一些实施例中，桥是脂肪族基团，其中两个CH2单元被NH基团替代。在一些实施例中，桥原子包含在一些实施例中，桥原子包含在一些实施例中，桥原子包含在一些实施例中，L通过硫原子与D附接。在一些实施例中，L在S-2硫或S-14硫处与D附接。在一些实施例中，L在S-2硫处与D附接。在一些实施例中，L在S-14硫处与D附接。
在一些实施例中，D包含具有式(III)的化合物且Za是NH。在一些实施例中，D包含具有式(III)的化合物且Zb是NH。在一些实施例中，D包含具有式(IV)的化合物且Za是NH。在一些实施例中，D包含具有式(IV)的化合物且Zb是NH。
在一些实施例中，L通过桥氮原子与D附接。在一些实施例中，L在N-34氮或N-39氮处与D附接。在一些实施例中，L在N-34氮处与D附接。在一些实施例中，L在N-39氮处与D附接。
在一些实施例中，D包含具有式(III)的化合物。示例性具有式(III)的化合物如下所示。在一些实施例中，D包含选自以下的具有式(III)的化合物：
及其盐。
在一些实施例中，D包含化合物1。在一些实施例中，D包含化合物2。
在一些实施例中，D包含选自以下的具有式(IV)的化合物：
及其盐。
在一些实施例中，D包含选自以下的具有式(IV)的化合物：
及其盐。
在一些实施例中，Xa或Xb是SH并且L通过S-2硫或S-14硫处的硫原子与D附接。在一些实施例中，Za或Zb是NH并且L通过N-34氮或N-39氮处的氮原子与D附接。
在一些实施例中，D包含具有式(III)的化合物，Xa是SH并且L在S-2硫处与D附接。在一些实施例中，D包含具有式(III)的化合物，Xb是SH并且L在S-14硫处与D附接。在一些实施例中，D包含具有式(III)的化合物，Za是NH并且L在N-34氮处与D附接。在一些实施例中，D包含具有式(III)的化合物，Zb是NH并且L在N-39氮处与D附接。
在一些实施例中，D包含具有式(IV)的化合物并且L在S-2硫处与D附接。在一些实施例中，D包含具有式(IV)的化合物并且L在S-14硫处与D附接。在一些实施例中，D包含具有式(IV)的化合物并且L在N-34氮处与D附接。在一些实施例中，D包含具有式(IV)的化合物并且L在N-39氮处与D附接。
在一些实施例中，D包含化合物1。在一些实施例中，D包含化合物2。
本披露提供了包含L-D的连接子-有效载荷缀合物，其中L是与D共价附接的可切割连接子，其中D包含选自以下的化合物：
及其盐。
在一些实施例中，L通过S-2硫或S-14硫处的硫原子与D附接。在一些实施例中，L在S-2硫处与D附接。在一些实施例中，L在S-14硫处与D附接。
在一些实施例中，L通过N-34氮或N-39氮处的氮原子与D附接。在一些实施例中，L在N-34氮处与D附接。在一些实施例中，L在N-39氮处与D附接。
在包含L-D的连接子-有效载荷缀合物的一些实施例中，L是本文披露的任何连接子。在包含L-D的连接子-有效载荷缀合物的一些实施例中，D是本文披露的任何药物部分。
在包含L-D的连接子-有效载荷缀合物的一些实施例中，其中L是与D共价附接的可切割连接子，该可切割连接子包含可切割肽部分。在一些实施例中，可切割肽部分可被蛋白酶切割。在一些实施例中，蛋白酶是半胱氨酸蛋白酶或组织蛋白酶。在一些实施例中，可切割肽部分包含氨基酸单元。在一些实施例中，氨基酸单元包含Val-Ala、Val-Cit、Val-Lys、Ala-Ala-Asn、Ala-(NMe)Ala-Asn、Asn、Gly-Gly-Phe-Gly、或Gly-Val-Ala。在一些实施例中，氨基酸单元包含Val-Ala。在一些实施例中，氨基酸单元包含Val-Cit。
在一些实施例中，连接子-有效载荷缀合物包含Val-Ala，并且D选自表14的化合物。在一些实施例中，连接子-有效载荷缀合物包含Val-Cit，并且D选自表14的化合物。
在一些实施例中，连接子-有效载荷缀合物包含式(II)，并且D选自表14的化合物。
在一些实施例中，连接子-有效载荷缀合物包含式(II)-Val-Ala，并且D选自表14的化合物。在一些实施例中，连接子-有效载荷缀合物包含式(II)-Val-Cit，并且D选自表14的化合物。
在一些实施例中，连接子-药物缀合物包含MC-Val-Cit-pABC-MEC-化合物1。在一些实施例中，连接子-药物缀合物包含MC-Val-Ala-pABC-MEC-化合物1(例如LP1或LP2)。在一些实施例中，连接子-药物缀合物包含MC-Val-Cit-pABC-单元8-化合物1。在一些实施例中，连接子-药物缀合物包含MC-Val-Ala-pABC-单元8-化合物1(例如LP16)。在一些实施例中，连接子-药物缀合物包含MC-Val-Cit-pABC-单元9-化合物1。在一些实施例中，连接子-药物缀合物包含MC-Val-Ala-pABC-单元9-化合物1(例如LP20)。在一些实施例中，连接子-药物缀合物包含MC-Val-Cit-pABC-单元11-化合物1。在一些实施例中，连接子-药物缀合物包含MC-Val-Ala-pABC-单元11-化合物1(例如LP28)。
在一些实施例中，连接子-药物缀合物包含Mal-式(II)-Val-Cit-pABC-MEC-化合物1。在一些实施例中，连接子-药物缀合物包含Mal-式(II)-Val-Cit-pABC-单元8-化合物1。在一些实施例中，连接子-药物缀合物包含Mal-式(II)-Val-Cit-pABC-单元9-化合物1。在一些实施例中，连接子-药物缀合物包含Mal-式(II)-Val-Cit-pABC-单元11-化合物1。在一些实施例中，连接子-药物缀合物包含Mal-式(II)-Val-Ala-pABC-MEC-化合物1。在一些实施例中，连接子-药物缀合物包含Mal-式(II)-Val-Ala-pABC-单元8-化合物1。在一些实施例中，连接子-药物缀合物包含Mal-式(II)-Val-Ala-pABC-单元9-化合物1。在一些实施例中，连接子-药物缀合物包含Mal-式(II)-Val-Ala-pABC-单元11-化合物1。
在一些实施例中，连接子-药物缀合物包含Mal-式(II)-Val-Cit-pAB-单元9-化合物1。在一些实施例中，连接子-药物缀合物包含Mal-式(II)-Val-Ala-pAB-单元9-化合物1。在一些实施例中，连接子-药物缀合物包含LP25。
在一些实施例中，连接子-药物缀合物包含Mal-式(II)-Val-Cit-pAB-单元11-化合物1。在一些实施例中，连接子-药物缀合物包含Mal-式(II)-Val-Ala-pAB-单元11-化合物1。在一些实施例中，连接子-药物缀合物包含LP26。
本发明的示例性连接子-药物缀合物披露于下文表15和16中。在各个实施例中，连接子-药物缀合物选自表15和16中所示的连接子-药物缀合物。
表15.示例性S附接的连接子-药物缀合物
表16.示例性N附接的连接子-药物缀合物
在一些实施例中，示例性连接子-药物缀合物或其盐可以称为“LP3”并且具有如下所示的LP3的结构：
在一些实施例中，示例性连接子-药物缀合物或其盐可以称为“LP1”并且具有如下所示的LP1的结构：
在一些实施例中，示例性连接子-药物缀合物或其盐可以称为“LP2”并且具有如下所示的LP2的结构：
在一些实施例中，示例性连接子-药物缀合物或其盐具有如下所示的LP16的结构：
在一些实施例中，示例性连接子-药物缀合物或其盐具有如下所示的LP20的结构：
一些实施例，示例性连接子-药物缀合物或其盐具有如下所示的LP26的结构：
在一些实施例中，示例性连接子-药物缀合物或其盐具有如下所示的LP28的结构：
在一些实施例中，与现有的连接子-STING激动剂缀合物相比，本文披露的连接子-有效载荷，例如LP1、LP2、LP16、LP20、LP26、LP28或LP3具有改进的特性。在一些实施例中，本文披露的连接子-有效载荷，例如LP1、LP2、LP3、LP16、LP20、LP26或LP28具有优于现有技术的连接子-STING激动剂缀合物的血浆稳定性。在一些实施例中，本文披露的连接子-有效载荷，例如LP1、LP2、LP3、LP16、LP20、LP26或LP28具有优于现有技术的连接子-STING激动剂缀合物的体内抗肿瘤活性。在一些实施例中，本文披露的连接子-有效载荷，例如LP1、LP2、LP3、LP16、LP20、LP26或LP28具有优于现有技术的连接子-STING激动剂缀合物的体内耐受性。
在本文披露的连接子-有效载荷缀合物的一些实施例中，其中D是STING激动剂，例如具有式(III)、式(IV)的化合物或表14的化合物、例如化合物1，并且L在N-34氮或N-39氮处与D缀合(例如，LP16、LP20、LP26或LP28)，与包含具有式(III)、式(IV)的化合物或表14的化合物的其他连接子-有效载荷缀合物(它们在替代附接点处，例如在硫(例如S-2或S-14)处与D缀合)相比，该连接子-有效载荷缀合物表现出优异的特性(例如，血浆稳定性、体外免疫反应、体内抗肿瘤活性、耐受性、在肿瘤微环境中刺激抗免疫反应)。这样的连接子-有效载荷缀合物的优异益处的示例性证据显示在实例4、9、12、14和15中。
在本文披露的连接子-有效载荷缀合物的一些实施例中，其中L包含含有式(II)的间隔子单元，与包含替代间隔子单元的其他连接子-有效载荷缀合物相比，该连接子-有效载荷缀合物表现出优异的特性(例如，改进的缀合稳定性、改进的血浆稳定性、体内抗肿瘤活性)。在一些实施例中，不受理论的束缚，使用包含式(II)的连接子与本文披露的STING激动剂，例如具有式(III)、式(IV)的化合物或表14的化合物、例如化合物1的益处可以包括改进的缀合稳定性、改进的血浆稳定性和体内抗肿瘤活性。在一些实施例中，包含含有式(II)的连接子和含有本文披露的STING激动剂，例如具有式(III)、式(IV)的化合物或表14的化合物的有效载荷的连接子-有效载荷缀合物当与本文披露的抗PSMA抗体缀合时表现出优异的特性。这样的连接子-有效载荷缀合物的优异益处(例如，与多种不同抗体缀合时可能提供的益处)的示例性证据显示在实例4、9、12和15中。
在一些实施例中，本文披露的ADC包含可切割连接子和如本文所述的内化抗PSMA抗体或其抗原结合片段。在一些实施例中，抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含三个HCDR，其包含以下氨基酸序列：SEQ ID NO:21(HCDR1)、SEQ ID NO:22(HCDR2)和SEQ ID NO:27(HCDR3)；以及三个LCDR，其包含SEQ ID NO:32(LCDR1)、SEQ ID NO:35(LCDR2)和SEQ IDNO:37(LCDR3)，如由Kabat编号系统所定义的。在一些实施例中，抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含三个HCDR，其包含以下氨基酸序列：SEQ ID NO:21(HCDR1)、SEQ ID NO:22(HCDR2)和SEQ ID NO:27(HCDR3)；以及三个LCDR，其包含SEQ ID NO:33(LCDR1)、SEQ ID NO:36(LCDR2)和SEQ ID NO:37(LCDR3)，如由Kabat编号系统所定义的。在一些实施例中，抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含三个HCDR，其包含以下氨基酸序列：SEQ ID NO:28(HCDR1)、SEQID NO:29(HCDR2)和SEQ ID NO:30(HCDR3)；以及三个LCDR，其包含SEQ ID NO:38(LCDR1)、SEQ ID NO:39(LCDR2)和SEQ ID NO:37(LCDR3)，如由IMGT编号系统所定义的。
在一些实施例中，抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQID NO:15的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQID NO:19的氨基酸序列的轻链可变区。
在一些实施例中，p是1至12或2至11。在一些实施例中，p是1至8。在一些实施例中，p是4至11。在一些实施例中，p是4至8。在一些实施例中，p是2。在一些实施例中，p是4。在一些实施例中，p是7。在一些实施例中，p是11。
本披露包括产生所描述的连接子-药物缀合物的方法。连接子-药物缀合物包含连接子和药物部分并且可以使用具有用于将连接子与药物部分共价附接的反应性官能性(reactive functionality)的连接子来制备。在一些实施例中，产生连接子-药物缀合物的方法包括使药物或其盐与活化连接子反应。
在一些实施例中，与活化连接子反应的药物是表14中披露的化合物；该化合物的异构体；该化合物或异构体的氘代衍生物；或者该化合物、异构体或氘代衍生物的盐。在一些实施例中，药物是表14中披露的化合物的钠盐。在一些实施例中，药物是表14中披露的化合物的二铵盐。在一些实施例中，药物是表14中披露的化合物的二烷基铵盐。在一些实施例中，药物是表14中披露的化合物的双(三乙铵)盐。
在一些实施例中，与表14中披露的化合物；该化合物的异构体；该化合物或异构体的氘代衍生物；或者该化合物、异构体或氘代衍生物的盐反应的活化连接子是在一些实施例中，与表14中披露的化合物；该化合物的异构体；该化合物或异构体的氘代衍生物；或者该化合物、异构体或氘代衍生物的盐反应的活化连接子是在一些实施例中，活化连接子的连接子部分包含本披露的连接子，例如上文披露的连接子，例如，如本节中所披露的。
在一些实施例中，产生连接子-药物缀合物的方法包括使表14中披露的化合物；该化合物的异构体；该化合物或异构体的氘代衍生物；或者该化合物、异构体或氘代衍生物的盐与本披露的活化连接子反应。在一些实施例中，化合物、异构体、氘代衍生物或盐的反应在有机金属碱的存在下进行。在一些实施例中，有机金属碱选自LDA、NaHMDS、LiHMDS和KHMDS。在一些实施例中，有机金属碱是LiHMDS。
在一些实施例中，产生活化连接子的方法包括使本披露的连接子与4-硝基苯基氯甲酸酯反应。在一些实施例中，连接子与4-硝基苯基氯甲酸酯的反应在碱的存在下进行。在一些实施例中，碱是吡啶。
在一些实施例中，产生活化连接子的方法包括使本披露的连接子与五氟苯酚反应。在一些实施例中，连接子与五氟苯酚的反应在肽偶联试剂的存在下进行。在一些实施例中，肽偶联试剂是DCC。
在一些实施例中，活化连接子用于产生L-D缀合物(V)的方法中：
在一些实施例中，产生L-D缀合物(V)的方法包括使具有式(III)的化合物或其盐与活化连接子反应。在一些实施例中，Zb是NH。在一些实施例中，Pb具有(S)-构型，并且活化连接子优先与Zb反应。如本文所用的“优先”(除非上下文另外说明)是指超过70％的反应，例如，70％的活化连接子与Zb氮反应而不是与Za氮反应。
在一些实施例中，活化连接子与Zb氮反应超过与Za氮反应的95％、超过90％、超过85％、超过80％、超过75％、或超过70％。在一些实施例中，活化连接子与Zb氮反应超过与Za氮反应的95％。在一些实施例中，活化连接子与Zb氮反应超过与Za氮反应的90％。在一些实施例中，活化连接子与Zb氮反应超过与Za氮反应的85％。在一些实施例中，活化连接子与Zb氮反应超过与Za氮反应的80％。在一些实施例中，活化连接子与Zb氮反应超过与Za氮反应的75％。在一些实施例中，活化连接子与Zb氮反应超过与Za氮反应的70％。
在一些实施例中，活化连接子用于产生L-D缀合物(VI)的方法中：
在一些实施例中，产生L-D缀合物(VI)的方法包括使具有式(III)的化合物或其盐与活化连接子反应。在一些实施例中，Zb是NH。在一些实施例中，Pb具有(S)-构型，并且活化连接子优先与Zb反应。
在一些实施例中，活化连接子与Zb氮反应超过与Za氮反应的95％、超过90％、超过85％、超过80％、超过75％、或超过70％。在一些实施例中，活化连接子与Zb氮反应超过与Za氮反应的95％。在一些实施例中，活化连接子与Zb氮反应超过与Za氮反应的90％。在一些实施例中，活化连接子与Zb氮反应超过与Za氮反应的85％。在一些实施例中，活化连接子与Zb氮反应超过与Za氮反应的80％。在一些实施例中，活化连接子与Zb氮反应超过与Za氮反应的75％。在一些实施例中，活化连接子与Zb氮反应超过与Za氮反应的70％。
抗体-药物缀合物
在各个实施例中，如本文所披露的抗PSMA抗体部分或其抗原结合片段可以与药物部分缀合(即共价附接，例如通过连接子)，其中药物部分当不与抗体部分缀合时具有细胞毒性或细胞生长抑制作用。在一些实施例中，药物部分当结合在缀合物中时展现出减少的细胞毒性或没有细胞毒性，但在从连接子和抗体部分切割后恢复细胞毒性。
用作人治疗剂(例如，用作肿瘤药剂)的ADC的研发和生产可能不仅仅需要鉴定能够结合一个或多个所需靶标且附接至单独使用以治疗癌症的药物的抗体。将抗体与药物连接可能对抗体和药物之一或两者的活性具有显著且不可预测的影响，这些影响将根据所选连接子和/或药物的类型而变化。因此，在一些实施例中，对ADC的组分进行选择以(i)保留单独的抗体和药物部分展现出的一种或多种治疗性特性；(ii)维持抗体部分的特异性结合特性；(iii)优化载药量以及药物与抗体比率；(iv)允许通过与抗体部分的稳定附接而靶向肿瘤细胞递送(例如，细胞内递送)药物部分；(v)减少与药物部分的非靶向和/或全身递送相比的毒性；(vi)保留ADC作为完整缀合物的稳定性直到转运或递送至靶位点；(vii)最大限度地减少施用前后ADC的聚集；(viii)展现出与单独的抗体和药物部分相当或优于其的体内抗癌治疗功效；(ix)最大限度地减少药物部分引起的脱靶杀伤；(x)展现出所需的药代动力学和药效学特性、可配制性和毒理学/免疫学特征；(xi)维持肿瘤微环境中抗免疫反应的刺激；和/或(xii)增加骨髓细胞(例如巨噬细胞或树突状细胞)对表达PSMA的细胞的吞噬作用。可能需要筛选这些特性中的各项以鉴定用于治疗性用途的改进的ADC。参见，例如Ab等人(2015)Mol.Cancer Ther.[分子癌症治疗学]14:1605-13。
在一些实施例中，与包含其他抗体(例如J591或deJ591)和/或其他连接子的ADC化合物相比，本披露的ADC化合物在转运或递送至靶位点之前作为完整缀合物具有优异的稳定性。在一些实施例中，与包含其他抗体(例如J591或deJ591)和/或其他连接子的ADC化合物相比，本披露的ADC化合物具有更低的免疫原性。
本披露的ADC化合物可以将有效剂量的细胞毒性剂或细胞生长抑制剂选择性地递送至癌细胞或肿瘤组织。已发现，所披露的ADC对表达PSMA的细胞具有有效的细胞毒性和/或细胞生长抑制活性。在一些实施例中，ADC的细胞毒性和/或细胞生长抑制活性取决于细胞中的PSMA表达水平。在一些实施例中，与低水平表达同一抗原的癌细胞相比，所披露的ADC在杀伤表达高水平PSMA的癌细胞方面特别有效。在一些实施例中，所披露的ADC在杀伤高表达PSMA的癌症、例如前列腺癌的方面特别有效。在一些实施例中，通过骨髓细胞(例如巨噬细胞和/或树突状细胞)的存在或募集来改进表达PSMA的癌细胞的靶向杀伤。
在一些实施例中，本文披露的ADC证明了对表达PSMA的细胞(例如，在表达PSMA的癌症中)的PSMA特异性结合。在一些实施例中，一旦结合PSMA，所披露的ADC就被内化。在一些实施例中，药物部分(例如化合物1)的释放导致STING通路活化并释放促炎细胞因子(例如IFNβ)。在一些实施例中，促炎细胞因子的释放促进骨髓细胞活化。在一些实施例中，促炎细胞因子的释放刺激I型IFN依赖性抗肿瘤活性。
在一些实施例中，所披露的ADC活化骨髓细胞、例如巨噬细胞或树突状细胞。不受理论的束缚，骨髓细胞活化可能是由所披露的ADC结合的表达PSMA的癌细胞的吞噬作用的结果。在一些实施例中，所披露的ADC活化巨噬细胞。在一些实施例中，活化的巨噬细胞是促炎(M1)巨噬细胞。在一些实施例中，肿瘤相关巨噬细胞或M2巨噬细胞在施用所披露的ADC时经历促炎活化。在一些实施例中，活化的巨噬细胞释放促炎细胞因子和趋化因子(例如，TNFα、CXCL10、IL-6、IFNβ和/或IL-1β)。在一些实施例中，活化的巨噬细胞进一步促进骨髓细胞活化。在一些实施例中，活化的巨噬细胞促进细胞毒性T细胞的产生。在一些实施例中，活化的巨噬细胞表现出对癌细胞的吞噬作用增加。在一些实施例中，所披露的ADC的施用刺激I型IFN依赖性抗肿瘤活性。如本文所用，“活化的巨噬细胞”与“极化的巨噬细胞”同义。
本文提供了ADC化合物，其包含靶向肿瘤细胞的抗体或其抗原结合片段(Ab)、药物部分(D)和将Ab与D共价附接的连接子部分(L)。在某些方面，抗体或抗原结合片段能够以高特异性和高亲和力结合肿瘤相关抗原(例如PSMA)。在某些实施例中，抗体或抗原结合片段在结合时内化到靶细胞中，例如内化到细胞中的降解隔室中。在一些实施例中，ADC在与靶细胞结合时内化，经历降解并释放药物部分。药物部分可以通过酶促作用、水解、氧化或任何其他机制从ADC的抗体和/或连接子部分释放。
在一些实施例中，ADC结合的靶细胞被骨髓细胞、例如巨噬细胞或树突状细胞吞噬。在一些实施例中，在吞噬作用发生时，ADC经历降解并释放药物部分。在一些实施例中，药物部分在骨髓细胞(例如巨噬细胞或树突状细胞)的吞噬溶酶体中释放。药物部分可以通过酶促作用、水解、氧化或任何其他机制从ADC的抗体和/或连接子部分释放。
示例性ADC具有式I：
Ab-(L-D)p(I)
其中Ab＝抗体部分(即抗体或抗原结合片段)，L＝连接子部分，D＝药物部分，并且p＝药物部分的数目/抗体部分。
在一些实施例中，本文披露的抗体-药物缀合物包含抗PSMA抗体或抗原结合片段。在一些实施例中，抗PSMA抗体或抗原结合片段包含如下重链，其具有选自上文表8中列出的SEQ ID NO:47-60的氨基酸序列和/或包含来自表8中的氨基酸序列的一组CDR和/或可变结构域。在一些实施例中，抗PSMA抗体或抗原结合片段包含如下轻链，其具有选自下文表8中列出的SEQ ID NO:61-66的氨基酸序列和/或包含来自表8中的氨基酸序列的一组CDR和/或可变结构域。
在一些实施例中，抗PSMA抗体或抗原结合片段包含表1的一个或多个共有CDR序列与表3的一个或多个CDR序列的组合，例如，通过选择表1的HC CDR2、LC CDR1和/或LCDR2序列以及表3的HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和/或LC CDR3来通过其三个重链和三个轻链CDR序列来描述抗体。
在一些实施例中，抗PSMA抗体或抗原结合片段包含三个HCDR，其包含以下氨基酸序列：SEQ ID NO:21(HCDR1)、SEQ ID NO:22(HCDR2)和SEQ ID NO:27(HCDR3)；以及三个LCDR，其包含SEQ ID NO:32(LCDR1)、SEQ ID NO:35(LCDR2)和SEQ ID NO:37(LCDR3)，如由Kabat编号系统所定义的。在一些实施例中，抗PSMA抗体或抗原结合片段包含三个HCDR，其包含以下氨基酸序列：SEQ ID NO:28(HCDR1)、SEQ ID NO:29(HCDR2)和SEQ ID NO:30(HCDR3)；以及三个LCDR，其包含SEQ ID NO:38(LCDR1)、SEQ ID NO:39(LCDR2)和SEQ IDNO:37(LCDR3)，如由IMGT编号系统所定义的。
在一些实施例中，抗PSMA抗体或抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的轻链可变区。
为了完成连接子和/或药物部分与抗体或其抗原结合片段的位点特异性缀合，在一些实施例中，包含硫醇反应性基团的连接子用于产生缀合的抗体或抗原结合片段，例如通过在半胱氨酸残基处与抗体或抗原结合片段反应。在一些实施例中，半胱氨酸残基位于轻链上的氨基酸位置80。在一些实施例中，半胱氨酸残基位于重链上的氨基酸位置118。完成连接子和/或药物部分与抗体或抗原结合片段的位点特异性缀合以产生ADC的方法是本领域已知的并且披露于PCT申请WO 2016/205618中，将该申请通过引用以其全文并入本文。
载药量
载药量由p表示，并且在本文中也称为药物与抗体比率(DAR)。在一些实施例中，载药量的范围可以是1至20(即，与每个抗体部分附接的连接子-药物的1至20个拷贝)，例如1至12个药物部分/抗体部分。在一些实施例中，p是1至12的整数。在一些实施例中，p是1至8的整数。在一些实施例中，p是1至12、1至11、1至10、1至9、1至8、1至7、1至6、1至5、1至4、1至3、或1至2的整数。在一些实施例中，p是2至12、2至11、2至10、2至9、2至8、2至7、2至6、2至5、2至4、或2至3的整数。在一些实施例中，p是2至11的整数。在一些实施例中，p是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12。在一些实施例中，p是2。在一些实施例中，p是4。在一些实施例中，p是7。在一些实施例中，p是8。在一些实施例中，p是11。在一些实施例中，载药量可以表示为抗体群体中的平均载量，例如约1-12、例如约2-11的平均载量。在一些实施例中，抗体群体中的平均载药量是约2至约8。在一些实施例中，抗体群体中的平均载药量是约2、约4或约8。
载药量可能受到抗体部分上附接位点数目的限制。在一些实施例中，ADC的连接子部分(L)通过抗体部分上的一个或多个氨基酸残基上的化学活性基团与抗体部分附接。例如，连接子可以通过游离氨基、亚氨基、羟基、硫醇或羧基基团与抗体部分(例如，与N末端或C末端、与一个或多个赖氨酸残基的ε氨基基团、与一个或多个谷氨酸或天冬氨酸残基的游离羧酸基团、或与一个或多个半胱氨酸残基的硫氢基基团)附接。与连接子附接的位点可以是抗体部分的氨基酸序列中的天然残基，或者它可以例如通过DNA重组技术(例如，通过将半胱氨酸或赖氨酸残基引入氨基酸序列中)或通过蛋白质生物化学(例如，通过还原、pH调节或水解)引入抗体部分中。在一些实施例中，连接子通过半胱氨酸残基与抗体部分附接。在一些实施例中，连接子通过赖氨酸残基与抗体部分附接。
在一些实施例中，可以与抗体部分缀合的药物部分的数目受到游离半胱氨酸残基数目的限制。例如，在附接是半胱氨酸硫醇基团的情况下，抗体可以具有仅一个或几个半胱氨酸硫醇基团，或者可以具有仅一个或几个具有足够反应性的硫醇基团，通过这些硫醇基团可以附接连接子。通常，抗体不含有许多可与药物部分连接的游离反应性半胱氨酸硫醇基团。实际上，抗体中的大多数半胱氨酸硫醇残基以二硫桥形式存在。连接子-毒素与抗体的过度附接可以通过还原可用于形成二硫桥的半胱氨酸残基来使抗体不稳定。因此，最佳的药物:抗体比率应当增加ADC的效力(通过增加所附接的药物部分的数目/抗体)，同时不会使抗体部分不稳定。在一些实施例中，最佳比率可以是约2、4、7或11。
在一些实施例中，使用一种或多种位点特异性缀合技术来附接ADC，例如产生具有确定的载药量(即，确定的药物与抗体比率(DAR))的均质ADC产物。在一些实施例中，可以在抗体的轻链或重链中产生游离半胱氨酸残基以通过残基特异性缀合技术(RESPECT)进行位点特异性缀合。Albone等人(2017)Cancer Biol.Ther.[癌症生物学与治疗]18(5):347-57以及国际公开号WO/2016205618和WO/2017106643描述了用于产生RESPECT形式的抗体的示例性方案，将这些文献中的每个关于进行位点特异性缀合的方法通过引用并入本文。在一些实施例中，使用位点特异性缀合产生ADC，以通过连接子将抗体部分与药物部分共价附接(例如，本文披露的连接子-有效载荷缀合物)。在一些实施例中，对于包含本文披露的化合物(例如具有式(III)、式(IV)的化合物或表14的化合物、例如化合物1)的ADC或组合物，使用位点特异性缀合来靶向约2的DAR。
在一些实施例中，通过Mal或MC部分与抗体部分附接的连接子可以提供约2、4、7或11的比率。在一些实施例中，包含与如本文所披露的抗PSMA抗体接合的MC-Val-Ala-pAB-化合物1的ADC具有约2、4、7或11的比率。在一些实施例中，包含与如本文所披露的抗PSMA抗体接合的MC-Val-Ala-pABC-MEC-化合物1的ADC具有约2、4、7或11的比率。在一些实施例中，包含与如本文所披露的抗PSMA抗体接合的MC-Val-Ala-pABC-单元8-化合物1的ADC具有约2、4、7或11的比率。在一些实施例中，包含与如本文所披露的抗PSMA抗体接合的MC-Val-Ala-pABC-单元9-化合物1的ADC具有约2、4、7或11的比率。在一些实施例中，包含与如本文所披露的抗PSMA抗体接合的MC-Val-Ala-pABC-单元11-化合物1的ADC具有约2、4、7或11的比率。
在一些实施例中，使抗体部分在缀合前暴露于还原条件以便产生一个或多个游离半胱氨酸残基。在一些实施例中，可以在部分或总体还原条件下用还原剂(如二硫苏糖醇(DTT)或三(2-羧乙基)膦(TCEP))还原抗体以产生反应性半胱氨酸硫醇基团。可以通过用受限摩尔当量的TCEP进行部分还原来产生未配对的半胱氨酸，该受限摩尔当量的TCEP优先还原连接轻链和重链(一对/H-L配对)以及铰链区中的两条重链(在人IgG1的情况下，两对/H-H配对)的链间二硫键，但使链内二硫键保持完整。参见，例如Stefano等人(2013)MethodsMol.Biol.[分子生物学方法]1045:145-71。在一些实施例中，例如通过采用施加交替还原和氧化电压的工作电极来以电化学方式还原抗体内的二硫键。此方法可允许二硫键还原与分析型装置(例如，电化学检测装置、NMR光谱仪或质谱仪)或化学分离装置(例如，液相色谱仪(例如HPLC))或电泳装置的在线偶联。参见，例如美国公开号20140069822。在某些实施例中，抗体经受变性条件以显露氨基酸残基(如赖氨酸或半胱氨酸)上的反应性亲核基团。
ADC的载药量可以以不同方式控制，例如通过：(i)限制药物-连接子中间体或连接子试剂相对于抗体的摩尔过量；(ii)限制缀合反应时间或温度；(iii)用于半胱氨酸硫醇修饰的部分或限制性还原条件；和/或(iv)通过重组技术工程改造抗体的氨基酸序列，使得半胱氨酸或赖氨酸残基的数目和位置得到改变以控制连接子-药物附接的数目和/或位置。
在一些实施例中，将游离半胱氨酸残基引入抗体部分的氨基酸序列中。例如，可以制备经半胱氨酸工程改造的抗体，其中亲本抗体的一个或多个氨基酸被半胱氨酸氨基酸替代。任何形式的抗体均可经如此工程改造，即突变。例如，亲本Fab抗体片段可经工程改造以形成经半胱氨酸工程改造的Fab，称为“ThioFab”。类似地，亲本单克隆抗体可经工程改造以形成“ThioMab”。单位点突变在ThioFab中产生单个经工程改造的半胱氨酸残基，而由于IgG抗体的二聚体性质，单位点突变在ThioMab中产生两个经工程改造的半胱氨酸残基。编码亲本多肽的氨基酸序列变体的DNA可由本领域已知的多种方法制备。参见，例如WO 2006/034488中描述的方法。这些方法包括但不限于通过先前所制备的编码多肽的DNA的定点(或寡核苷酸介导的)诱变、PCR诱变和盒式诱变进行的制备。重组抗体的变体还可通过限制性片段操作或通过用合成寡核苷酸进行重叠延伸PCR来构建。具有式I的ADC包括但不限于具有1、2、3或4个经工程改造的半胱氨酸氨基酸的抗体。参见Lyon等人(2012)MethodsEnzymol.[酶学方法]502:123-38。在一些实施例中，在不使用工程改造的情况下，一个或多个游离半胱氨酸残基已存在于抗体部分中，在此情况下可使用现有游离半胱氨酸残基来将抗体部分与药物部分缀合。
在包含抗体部分和连接子部分的多个拷贝的反应混合物中，在超过一个亲核基团与药物-连接子中间体或连接子部分试剂反应、随后与药物部分试剂反应的情况下，那么所得产物可以是ADC化合物的混合物，该混合物中分布有与混合物中的抗体部分的各拷贝附接的一个或多个药物部分。在一些实施例中，由缀合反应得到的ADC混合物中的载药量在1至12个所附接的药物部分/抗体部分的范围内。药物部分的平均数目/抗体部分(即平均载药量或平均p)可以通过本领域中已知的任何常规方法，例如通过质谱法(例如反相LC-MS)和/或高效液相色谱法(例如HPLC)来计算。在一些实施例中，药物部分的平均数目/抗体部分通过疏水相互作用色谱法-高效液相色谱法(HIC-HPLC)来确定。在一些实施例中，药物部分的平均数目/抗体部分通过反相液相色谱法-质谱法(LC-MS)来确定。在一些实施例中，药物部分的平均数目/抗体部分是约1至约11；约1至约8；约1至约7；约1至约4；或约1至约2。在一些实施例中，药物部分的平均数目/抗体部分是约2。在一些实施例中，药物部分的平均数目/抗体部分是约4。在一些实施例中，药物部分的平均数目/抗体部分是约7。在一些实施例中，药物部分的平均数目/抗体部分是约11。
具有特定DAR比率的各个ADC复合物或“种类”可在混合物中例如通过质谱法鉴定并且例如通过超高效液相色谱法(UPLC)或HPLC(例如疏水相互作用色谱法(HIC-HPLC))分离。在某些实施例中，具有单一负载值的均质或接近均质的ADC可以例如通过电泳或色谱法从缀合混合物分离。
本披露包括产生所描述的ADC的方法。简言之，ADC包含作为抗体部分的抗体或抗原结合片段、药物部分、以及将药物部分与抗体部分接合的连接子。在一些实施例中，可以使用具有用于与药物部分共价附接以及与抗体部分共价附接的反应性官能性的连接子来制备ADC。例如，在一些实施例中，抗体部分的半胱氨酸硫醇可以与连接子或药物-连接子中间体的反应性官能团(例如Mal或MC部分)形成键，该连接子或连接子中间体包含可以与官能试剂缀合的反应性基团(例如，包含化合物1的可切割肽)。
在一些实施例中，通过以下产生ADC：使抗体或抗原结合片段与连接子和药物部分以顺序方式接触，使得抗体部分先与连接子共价连接，然后预先形成的抗体-连接子中间体与药物部分反应。抗体-连接子中间体在接触药物部分之前可经受或可不经受纯化步骤。在其他实施例中，通过以下产生ADC：使抗体部分与连接子-药物缀合物或其盐接触，该连接子-药物缀合物或其盐通过连接子与药物部分反应而预先形成。预先形成的连接子-药物缀合物在接触抗体部分之前可经受或可不经受纯化步骤。在其他实施例中，抗体部分接触一种反应混合物中的连接子和药物部分，从而允许在抗体部分与连接子之间以及连接子与药物部分之间同时形成共价键。在一些实施例中，通过以下产生ADC：使抗体部分与接合至药物部分的连接子(如LP3)或其盐在允许缀合的条件下反应。在一些实施例中，通过以下产生ADC：使抗体部分与接合至药物部分的连接子(如LP1)或其盐在允许缀合的条件下反应。在一些实施例中，通过以下产生ADC：使抗体部分与接合至药物部分的连接子(如LP2)或其盐在允许缀合的条件下反应。在一些实施例中，通过以下产生ADC：使抗体部分与接合至药物部分的连接子(如LP16)或其盐在允许缀合的条件下反应。在一些实施例中，通过以下产生ADC：使抗体部分与接合至药物部分的连接子(如LP20)或其盐在允许缀合的条件下反应。在一些实施例中，通过以下产生ADC：使抗体部分与接合至药物部分的连接子(如LP26)或其盐在允许缀合的条件下反应。在一些实施例中，通过以下产生ADC：使抗体部分与接合至药物部分的连接子(如LP28)或其盐在允许缀合的条件下反应。允许缀合的条件可涉及本领域已知的用于缀合ADC的任何生物化学方法。这些条件包括但不限于在室温下在合适的缓冲液(例如，1x DBPS、pH 7.4的0.1M Tris-甘氨酸、10％丙二醇:90％1x DPBS、或1x DPBS、2mMEDTA)中孵育。缀合条件可包括或可不包括酶(例如转谷氨酰胺酶)的存在。
根据上述方法制备的ADC可以经受一个或多个纯化步骤。纯化步骤可涉及本领域已知的用于纯化蛋白质的任何生物化学方法或其任何方法组合。这些方法包括但不限于切向流过滤(TFF)、亲和色谱法、离子交换色谱法、基于电荷或等电点的任何色谱法、混合模式色谱法(例如，CHT(陶瓷羟磷灰石))、疏水相互作用色谱法、尺寸排阻色谱法、透析、过滤、选择性沉淀、脱盐色谱法、或其任何组合。
治疗性用途
本文披露了使用所披露的抗体和/或ADC来治疗受试者的病症、例如肿瘤病症的方法。抗体和/或ADC可以单独施用或与一种或多种额外的治疗剂组合施用，并且可以以任何药学上可接受的配制品、剂量和/或给药方案施用。可以针对毒性以及功效指标评估治疗功效并且相应地作出调整。功效量度包括但不限于体外或体内观察到的细胞生长抑制和/或细胞毒性作用、减小的肿瘤体积、肿瘤生长抑制和/或延长的存活期。
测定抗体或ADC是否对细胞发挥细胞生长抑制和/或细胞毒性作用的方法是已知的。例如，抗体或ADC的细胞毒性活性可通过以下测量：使表达抗体或ADC(例如PSMA)的靶蛋白的哺乳动物细胞暴露于细胞培养基中；将这些细胞与免疫细胞(例如骨髓细胞，如巨噬细胞)共培养一段时间，例如约6小时至约5天；以及测量细胞活力。基于细胞的体外测定可用于测量抗体或ADC的活力(增殖)、细胞毒性、生长抑制和对细胞凋亡的诱导(半胱天冬酶活化)。
在一些实施例中，为了测定细胞毒性，可以测量吞噬作用、坏死或细胞凋亡(程序性细胞死亡)。可以使用流式细胞术或显微镜检查来观察吞噬作用。坏死通常伴随质膜渗透性的增加、细胞膨胀和质膜破裂。细胞凋亡的典型特征是膜起泡、细胞质凝聚和内源性内切核酸酶的活化。针对对癌细胞的这些影响中的任一者的测定指示，抗体或ADC可用于治疗癌症。
细胞活力可以例如通过测定细胞中染料(如中性红、锥虫蓝、结晶紫或ALAMARTM蓝)的吸收来测量。参见，例如Page等人(1993)Intl.J.Oncology[国际肿瘤学杂志]3:473-6。在这样的测定中，在含有染料的培养基中孵育细胞，洗涤细胞，并且通过分光光度法测量反映细胞对染料的吸收的剩余染料。在某些实施例中，使用结晶紫测定评估所制备的抗体或ADC的体外效力。结晶紫是一种三芳基甲烷染料，可积聚在活细胞的细胞核中。在此测定中，使细胞暴露于抗体或ADC或对照剂持续一段时间，然后将细胞用结晶紫染色，用水充分洗涤，接着用1％ SDS溶解并通过分光光度法读取。蛋白质结合染料磺酰罗丹明B(SRB)也可用于测量细胞毒性。参见，例如Skehan等人(1990)J.Natl.CancerInst.[国家癌症研究所杂志]82:1107-12。
细胞凋亡可以例如通过测量DNA片段化来定量。用于定量体外测定DNA片段化的商业测光方法是可用的。这样的测定的实例(包括TUNEL(其检测片段化的DNA中的标记核苷酸的掺入)和基于ELISA的测定)在Biochemica[生物化学](1999)第2期,第34-37页(罗氏分子生物化学公司(Roche Molecular Biochemicals))中描述。
细胞凋亡也可以通过测量细胞的形态变化来测定。例如，如同坏死一样，质膜完整性的损失可以通过测量对某些染料(例如，荧光染料，如吖啶橙或溴化乙锭)的吸收来测定。用于测量凋亡细胞数目的方法已由Duke和Cohen,Current Protocolsin Immunology[免疫学实验指南]参见Coligan等人,编辑(1992)第3.17.1-3.17.16页描述。细胞也可以用DNA染料(例如吖啶橙、溴化乙锭或碘化丙锭)标记并观察细胞沿内部核膜的染色质凝聚和边缘化。可经测量以确定细胞凋亡的其他形态变化包括例如细胞质凝聚、增加的膜起泡和细胞收缩。
在一些实施例中，本披露提供了一种通过激动STING通路并将该激动作用靶向特定细胞(例如，表达PSMA的癌细胞(例如，相对于非癌细胞，PSMA的表达水平增加))来杀伤癌细胞或组织、或者抑制或调节癌细胞或组织的生长的方法。在一些实施例中，激动STING通路增强了抗肿瘤免疫，例如通过活化骨髓细胞(例如巨噬细胞或树突状细胞)、细胞毒性T细胞和/或1型T辅助细胞(Th1)偏向反应。该方法可用于增强抗肿瘤免疫提供了治疗性益处的任何受试者。无论PSMA表达水平如何，抗肿瘤免疫反应都可以靶向癌细胞。
在各个实施例中，可以施用所披露的抗体和/或ADC来影响表达PSMA的任何细胞或组织，例如表达PSMA的癌细胞或组织。示例性实施例包括通过全身递送抗PSMA ADC中的STING激动剂(例如具有式(III)、式(IV)的化合物或表14的化合物、例如化合物1)来杀伤细胞的方法。该方法可用于表达PSMA的任何细胞或组织，例如癌性细胞或转移性病变。在一些实施例中，表达PSMA的癌症是前列腺癌。在一些实施例中，前列腺癌是晚期前列腺癌。在一些实施例中，前列腺癌是转移性去势抵抗性前列腺癌。表达PSMA的细胞的非限制性实例包括22RV1、LNCaP和C4-2细胞，以及包含编码PSMA或其部分的重组核酸的细胞。不受理论的束缚，本文披露的抗PSMA抗体和ADC可以特别有效地通过靶向表达PSMA的细胞进行免疫清除、通过活化I型干扰素和其他炎性细胞因子(例如，IFN-β、TNFα、CXCL10和/或IL-6)、和/或通过将药物有效载荷(例如化合物1)递送至细胞来治疗表达PSMA的癌症。
在一些实施例中，ADC可用于将药物有效载荷(例如化合物1)递送至细胞，其中该药物有效载荷活化STING通路。不受理论的束缚，STING通路活化可能导致I型干扰素和其他炎性细胞因子(例如，IFN-β、TNFα、CXCL10和/或IL-6)的活化。在一些实施例中，本文披露的抗PSMA ADC的施用增加IFN-β的表达和/或分泌。在一些实施例中，本文披露的抗PSMA ADC的施用增加TNFα的表达和/或分泌。在一些实施例中，本文披露的抗PSMA ADC的施用增加CXCL10的表达和/或分泌。在一些实施例中，本文披露的抗PSMA ADC的施用增加IL-6的表达和/或分泌。I型干扰素和其他炎性细胞因子的活化可以通过活化树突状细胞和促炎(M1)巨噬细胞、通过促进细胞毒性T细胞反应的产生、和/或通过促进1型T辅助细胞(Th1)偏向反应的产生来刺激抗肿瘤免疫反应。然后，这些活化的免疫细胞可以靶向杀伤癌细胞或肿瘤。活化的树突状细胞和促炎(M1)巨噬细胞也可以产生I型干扰素和其他炎性细胞因子或趋化因子，从而增强抗肿瘤炎性反应。巨噬细胞的非限制性实例包括J774A.1、THP-1、骨髓源性巨噬细胞(BMDM)、人单核细胞源性巨噬细胞(HMDM)和外周血单核细胞(PBMC)。
在一些实施例中，本文披露的抗PSMA抗体和抗原结合片段提供了STING激动剂向癌细胞或组织的稳定的全身递送。在一些实施例中，STING激动剂是化合物1。在一些实施例中，癌细胞或组织表达PSMA。在一些实施例中，癌细胞或组织是前列腺癌。在一些实施例中，前列腺癌是晚期前列腺癌。在一些实施例中，前列腺癌是转移性去势抵抗性前列腺癌。
本文披露的示例性方法包括以下步骤：使细胞与有效量(例如，足以刺激STING活性的量)的如本文所述的抗体和/或ADC接触(例如，通过合适的施用途径向受试者施用抗体和/或ADC)。该方法可用于例如体外、离体或原位培养物中的细胞上。例如，表达PSMA的细胞(例如，通过肿瘤或转移性病变的活检收集的细胞；来自已建立的癌细胞系的细胞；或重组细胞)，可以在培养基中体外培养，并且可以通过向培养基中添加抗体和/或ADC来影响接触步骤。在与免疫细胞(例如巨噬细胞或树突状细胞)共培养的细胞中，该方法将导致表达PSMA的细胞(特别包括表达PSMA的肿瘤细胞)的杀伤。可替代地，抗体和/或ADC可以通过任何合适的施用途径(例如，静脉内、皮下或与肿瘤组织直接接触)施用至受试者以在体内发挥作用。
所披露的抗体和/或ADC的体内作用可以在合适的动物模型中进行评估。例如，可以使用异种癌症模型，其中将癌症外植体或传代的异种移植细胞或组织引入免疫受损的动物(例如裸小鼠或SCID小鼠)中。参见，例如Klein等人(1997)Nature Med.[自然医学]3:402-8。可以使用测量对肿瘤形成的抑制、肿瘤消退或转移等的测定来预测功效。在一些实施例中，与用替代治疗处理的携带异种移植物的小鼠相比，本文披露的抗PSMA抗体和ADC在抑制肿瘤生长方面更有效。
也可以使用测量PSMA和/或细胞因子的表达的测定。可以使用本领域已知的用于测量PSMA和/或细胞因子表达的任何方法，包括ELISA(酶联免疫吸附测定)、q-PCR(定量聚合酶链反应)、Meso Scale Discovery V-PLEX细胞因子面板、免疫组织化学、RNA-seq(RNA测序)、蛋白质印迹和流式细胞术。可以在从受试者分离的癌细胞中测定PSMA的表达。在一些实施例中，PSMA的表达在施用如本文所披露的抗体和/或ADC之前测定。在一些实施例中，PSMA的表达相对于非癌性和/或野生型组织或细胞中PSMA的表达升高。在一些实施例中，测量I型干扰素和其他炎性细胞因子(例如，IFN-β、TNFα、CXCL10、IL-6)的表达。这些细胞因子在所治疗受试者的肿瘤中的表达可以提供响应治疗而刺激抗肿瘤免疫反应的指示。
在各个实施例中，本文提供了治疗表达PSMA的癌症的方法。本文披露的抗体和ADC可以出于任何治疗性目的并通过任何合适的施用途径施用至非人哺乳动物或人受试者。这些治疗性方法可能需要向患有肿瘤(例如，表达PSMA的肿瘤)的哺乳动物施用生物学有效量的本文披露的抗体或包含与该抗体连接的所选化疗剂(例如化合物1)的ADC。
在一些实施例中，提供了一种治疗患有表达PSMA的癌症或有患表达PSMA的癌症风险的患者的方法，该方法包括向该患者施用治疗有效量的本披露的抗体和/或ADC。在一些实施例中，当单独施用时，患者对药物部分(例如化合物1)的治疗无反应或反应差，并且向患者施用本文披露的抗体或ADC。在其他实施例中，当单独施用时，患者对药物部分(例如化合物1)的治疗不耐受。例如，为了治疗癌症，患者可能需要导致全身毒性的化合物1剂量，而这可以通过将本文披露的抗体和/或ADC靶向递送至表达PSMA的癌症来克服，从而减少脱靶杀伤。在一些实施例中，患者患有无法局部注射药物部分(例如化合物1)的癌症。
在各个实施例中，本文披露的方法治疗前列腺癌。
本披露的抗体和/或ADC可出于兽医学目的或作为人类疾病的动物模型施用至表达PSMA的非人哺乳动物。就后者而言，这样的动物模型可用于评估所披露的抗体和ADC的治疗性功效(例如，剂量检测和施用时程)。
在一些实施例中，抗体或ADC的功效可以通过使来自受试者的肿瘤样品与该抗体或ADC接触并评估肿瘤生长速率或体积来评估。在一些实施例中，当确定抗体或ADC有效时，可以将其施用至受试者。在一些实施例中，抗体或ADC的功效可以通过使受试者与该抗体或ADC接触并监测肿瘤生长速率或体积来评估。在一些实施例中，抗体或ADC的功效可以通过使受试者与该抗体或ADC接触并监测I型干扰素和其他炎性细胞因子(例如，IFN-β、TNFα、CXCL10、IL-6)的表达来评估。
本文披露的抗体和ADC可以以合适的剂量施用至有需要的患者。使用前述方法治疗癌症的剂量和施用方案将随方法和靶标癌症而变化，并且通常取决于本领域所了解的许多其他因素。
在各个实施例中，治疗涉及通过可接受的施用途径单次推注或重复施用抗体或ADC制剂。
上述治疗性方法还可以与多种额外的手术、化疗或放射疗法方案中的任一种组合。在一些实施例中，上述治疗性方法与癌症免疫疗法，例如免疫检查点疗法(例如，PD-1/PD-L1抑制剂和CTLA4抑制剂)或过继性T细胞(ATC)疗法(例如，嵌合抗原受体(CAR)T细胞)组合。
本文进一步提供了所披露的抗体和/或ADC的治疗性用途。示例性实施例是抗体和/或ADC在治疗表达PSMA的癌症、如前列腺癌中的用途。用于鉴定患有表达PSMA的癌症的受试者的方法是本领域已知的，并且可用于鉴定适合用所披露的抗体或ADC治疗的患者。
另一示例性实施例是如本文所披露的ADC或抗体或抗原结合片段在制造用于治疗表达PSMA的癌症、如前列腺癌的药物中的用途。
药物组合物和配制品
可以将用于实施前述方法的抗体或ADC配制成适合施用至受试者、例如人受试者的药物组合物。在一些实施例中，药物组合物包含抗体和/或ADC以及适用于所需递送方法的药学上可接受的载剂。合适的载剂包括当与本文披露的抗体或ADC组合时允许该抗体或ADC保留其抗肿瘤功能并且通常不与患者的免疫系统反应的任何材料。药学上可接受的载剂可以包括生理上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。药学上可接受的载剂的实例包括水、生理盐水、磷酸盐缓冲生理盐水、右旋糖、甘油、乙醇、甲磺酸盐等中的一种或多种，以及其组合。在许多情况下，将优选在组合物中包括等渗剂，例如糖、多元醇(如甘露醇、山梨糖醇)或氯化钠。药学上可接受的载剂可进一步包含极少量的辅助物质，如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲液，这些辅助物质增强ADC的保存期限或有效性。
本文所述的药物组合物可以呈多种形式。这些形式包括例如液体、半固体和固体剂型，如液体溶液(例如，可注射溶液和可输注溶液)、分散体或悬浮液、片剂、丸剂、粉末、脂质体和栓剂。优选的形式取决于预期的施用方式和治疗性应用。
药物组合物可以被溶解并通过能够将组合物递送至肿瘤部位的任何途径施用。潜在有效的施用途径包括但不限于静脉内、肠胃外、腹膜内、肌内、瘤内、真皮内、器官内、正位等。药物组合物可以被冻干并作为无菌粉末储存，优选在真空下，然后在注射前在抑菌水(含有例如苄醇防腐剂)或无菌水中重构。施用可以是全身的或局部的。药物组合物可以包含抗体和/或ADC或其药学上可接受的盐(例如甲磺酸盐)。
在各个实施例中，用于本文所述的实验室应用和治疗性应用的试剂盒处于本披露的范围内。这样的试剂盒可以包含本文披露的抗体或ADC和载剂、包装或容器。载剂、包装或容器可以被分隔以容纳一个或多个容器，例如小瓶、试管等，该一个或多个容器中的每个包含以下：待用于本文披露的方法中的独立要素中之一和/或含有使用说明(例如本文所述的用途)的标签或插页。试剂盒可以进一步包含与其相关的一个或多个其他容器，这些容器包含从商业和用户角度来看所需的材料，包括缓冲液、稀释剂、过滤器、针头、注射器、载架(carrier)、包装、容器、小瓶和/或列出内容物和/或使用说明的试管标签、以及带有使用说明的包装插页。
标签可存在于容器上或容器中以指示组合物用于特定疗法或非治疗性应用，如预后、预防、诊断或实验室应用。标签还可指示关于体内或体外用途(如本文所述的用途)的指导。在包括在试剂盒中或试剂盒上的一个或多个插页或一个或多个标签上还可包括指导和/或其他信息。标签可处于容器上或与容器相关联。当将形成标签的字母、数字或其他字符模制或蚀刻至容器自身中时，标签可处于容器上。当标签存在于还固持容器的接受器或载架内时，标签可例如以包装插页形式与容器相关联。标签可指示组合物用于诊断或治疗病况(例如，如本文所述的癌症)。
本披露的示例性实施例
在各个实施例中，本披露提供了能够与抗体-药物缀合物中的抗体缀合的新型连接子-药物缀合物。
在一些实施例中，连接子-药物缀合物包含MC-Val-Ala-pABC-单元8部分和具有式(III)的化合物。在一些实施例中，连接子-药物缀合物包含MC-Val-Ala-pABC-单元8部分和具有式(IV)的化合物。在一些实施例中，连接子-药物缀合物包含MC-Val-Ala-pABC-单元8部分和选自表14的化合物的化合物。
在一些实施例中，连接子-药物缀合物包含MC-Val-Ala-pABC-单元8-化合物1。在一些实施例中，连接子-药物缀合物包含LP16。
在一些实施例中，连接子-药物缀合物包含MC-Val-Ala-pABC-单元9部分和具有式(III)的化合物。在一些实施例中，连接子-药物缀合物包含MC-Val-Ala-pABC-单元9部分和具有式(IV)的化合物。在一些实施例中，连接子-药物缀合物包含MC-Val-Ala-pABC-单元9部分和选自表14的化合物的化合物。
在一些实施例中，连接子-药物缀合物包含MC-Val-Ala-pABC-单元9-化合物1。在一些实施例中，连接子-药物缀合物包含LP20。
在一些实施例中，连接子-药物缀合物包含Mal-式(II)-Val-Ala-pAB-单元11部分和具有式(III)的化合物。在一些实施例中，连接子-药物缀合物包含Mal-式(II)-Val-Ala-pAB-单元11部分和具有式(IV)的化合物。在一些实施例中，连接子-药物缀合物包含Mal-式(II)-Val-Ala-pAB-单元11部分和选自表14的化合物的化合物。
在一些实施例中，连接子-药物缀合物包含Mal-式(II)-Val-Ala-pAB-单元11-化合物1。在一些实施例中，连接子-药物缀合物包含LP26。
在一些实施例中，连接子-药物缀合物包含MC-Val-Ala-pABC-单元11部分和具有式(III)的化合物。在一些实施例中，连接子-药物缀合物包含MC-Val-Ala-pABC-单元11部分和具有式(IV)的化合物。在一些实施例中，连接子-药物缀合物包含MC-Val-Ala-pABC-单元11部分和选自表14的化合物的化合物。
在一些实施例中，连接子-药物缀合物包含MC-Val-Ala-pABC-单元11-化合物1。在一些实施例中，连接子-药物缀合物包含LP28。
在各个实施例中，本披露提供了能够特异性结合PSMA的新型抗体-药物缀合物。
在一些实施例中，抗体-药物缀合物包含本文披露的任何抗PSMA抗体或抗原结合片段、含有MC-Val-Ala-pABC-单元8部分的连接子、以及含有具有式(III)的化合物的药物部分。在一些实施例中，抗体-药物缀合物包含本文披露的任何抗PSMA抗体或抗原结合片段、含有MC-Val-Ala-pABC-单元8部分的连接子、以及含有具有式(IV)的化合物的药物部分。在一些实施例中，抗体-药物缀合物包含本文披露的任何抗PSMA抗体或抗原结合片段、含有MC-Val-Ala-pABC-单元8部分的连接子、以及含有选自表14的化合物的化合物的药物部分。
在一些实施例中，抗体-药物缀合物包含本文披露的任何抗PSMA抗体或抗原结合片段和含有MC-Val-Ala-pABC-单元8-化合物1的连接子-药物缀合物。在一些实施例中，抗体-药物缀合物包含与LP16缀合的本文披露的任何抗PSMA抗体或抗原结合片段。
在一些实施例中，抗体-药物缀合物包含本文披露的任何抗PSMA抗体或抗原结合片段、含有MC-Val-Ala-pABC-单元9部分的连接子、以及含有具有式(III)的化合物的药物部分。在一些实施例中，抗体-药物缀合物包含本文披露的任何抗PSMA抗体或抗原结合片段、含有MC-Val-Ala-pABC-单元9部分的连接子、以及含有具有式(IV)的化合物的药物部分。在一些实施例中，抗体-药物缀合物包含本文披露的任何抗PSMA抗体或抗原结合片段、含有MC-Val-Ala-pABC-单元9部分的连接子、以及含有选自表14的化合物的化合物的药物部分。
在一些实施例中，抗体-药物缀合物包含本文披露的任何抗PSMA抗体或抗原结合片段和含有MC-Val-Ala-pABC-单元9-化合物1的连接子-药物缀合物。在一些实施例中，抗体-药物缀合物包含与LP20缀合的本文披露的任何抗PSMA抗体或抗原结合片段。
在一些实施例中，抗体-药物缀合物包含本文披露的任何抗PSMA抗体或抗原结合片段、含有Mal-式(II)-Val-Ala-pAB-单元11部分的连接子、以及含有具有式(III)的化合物的药物部分。在一些实施例中，抗体-药物缀合物包含本文披露的任何抗PSMA抗体或抗原结合片段、含有Mal-式(II)-Val-Ala-pAB-单元11部分的连接子、以及含有具有式(IV)的化合物的药物部分。在一些实施例中，抗体-药物缀合物包含本文披露的任何抗PSMA抗体或抗原结合片段、含有Mal-式(II)-Val-Ala-pAB-单元11部分的连接子、以及含有选自表14的化合物的化合物的药物部分。
在一些实施例中，抗体-药物缀合物包含本文披露的任何抗PSMA抗体或抗原结合片段和含有Mal-式(II)-Val-Ala-pAB-单元11-化合物1的连接子-药物缀合物。在一些实施例中，抗体-药物缀合物包含与LP26缀合的本文披露的任何抗PSMA抗体或抗原结合片段。
在一些实施例中，抗体-药物缀合物包含本文披露的任何抗PSMA抗体或抗原结合片段、含有MC-Val-Ala-pABC-单元11部分的连接子、以及含有具有式(III)的化合物的药物部分。在一些实施例中，抗体-药物缀合物包含本文披露的任何抗PSMA抗体或抗原结合片段、含有MC-Val-Ala-pABC-单元11部分的连接子、以及含有具有式(IV)的化合物的药物部分。在一些实施例中，抗体-药物缀合物包含本文披露的任何抗PSMA抗体或抗原结合片段、含有MC-Val-Ala-pABC-单元11部分的连接子、以及含有选自表14的化合物的化合物的药物部分。
在一些实施例中，抗体-药物缀合物包含本文披露的任何抗PSMA抗体或抗原结合片段和含有MC-Val-Ala-pABC-单元11-化合物1的连接子-药物缀合物。在一些实施例中，抗体-药物缀合物包含与LP28缀合的本文披露的任何抗PSMA抗体或抗原结合片段。在一些实施例中，抗体-药物缀合物包含抗PSMA抗体或其抗原结合片段，该抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含以下三个重链CDR和三个轻链CDR：包含SEQ ID NO:21的重链CDR1(HCDR1)、包含SEQ ID NO:22的重链CDR2(HCDR2)、包含SEQ ID NO:27的重链CDR3(HCDR3)；包含SEQ IDNO:32的轻链CDR1(LCDR1)、包含SEQ ID NO:35的轻链CDR2(LCDR2)和包含SEQ ID NO:37的轻链CDR3(LCDR3)，如由Kabat编号系统所定义的；本文披露的任何连接子；以及含有具有式(III)的化合物的药物部分。在一些实施例中，抗体-药物缀合物包含抗PSMA抗体或其抗原结合片段，该抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含以下三个重链CDR和三个轻链CDR：包含SEQID NO:21的重链CDR1(HCDR1)、包含SEQ ID NO:22的重链CDR2(HCDR2)、包含SEQ ID NO:27的重链CDR3(HCDR3)；包含SEQ ID NO:32的轻链CDR1(LCDR1)、包含SEQ ID NO:35的轻链CDR2(LCDR2)和包含SEQ ID NO:37的轻链CDR3(LCDR3)，如由Kabat编号系统所定义的；本文披露的任何连接子；以及含有具有式(IV)的化合物的药物部分。在一些实施例中，抗体-药物缀合物包含抗PSMA抗体或其抗原结合片段，该抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含以下三个重链CDR和三个轻链CDR：包含SEQ ID NO:21的重链CDR1(HCDR1)、包含SEQ ID NO:22的重链CDR2(HCDR2)、包含SEQ ID NO:27的重链CDR3(HCDR3)；包含SEQ ID NO:32的轻链CDR1(LCDR1)、包含SEQ ID NO:35的轻链CDR2(LCDR2)和包含SEQ ID NO:37的轻链CDR3(LCDR3)，如由Kabat编号系统所定义的；本文披露的任何连接子；以及含有选自表14的化合物的化合物的药物部分。
在一些实施例中，抗体-药物缀合物包含抗PSMA抗体或其抗原结合片段，该抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含以下三个重链CDR和三个轻链CDR：包含SEQ ID NO:28的重链CDR1(HCDR1)、包含SEQ ID NO:29的重链CDR2(HCDR2)、包含SEQ ID NO:30的重链CDR3(HCDR3)；包含SEQ ID NO:38的轻链CDR1(LCDR1)、包含SEQ ID NO:39的轻链CDR2(LCDR2)和包含SEQ ID NO:37的轻链CDR3(LCDR3)，如由IMGT编号系统所定义的；本文披露的任何连接子；以及含有具有式(III)的化合物的药物部分。在一些实施例中，抗体-药物缀合物包含抗PSMA抗体或其抗原结合片段，该抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含以下三个重链CDR和三个轻链CDR：包含SEQ ID NO:28的重链CDR1(HCDR1)、包含SEQ ID NO:29的重链CDR2(HCDR2)、包含SEQ ID NO:30的重链CDR3(HCDR3)；包含SEQ ID NO:38的轻链CDR1(LCDR1)、包含SEQ ID NO:39的轻链CDR2(LCDR2)和包含SEQ ID NO:37的轻链CDR3(LCDR3)，如由IMGT编号系统所定义的；本文披露的任何连接子；以及含有具有式(IV)的化合物的药物部分。在一些实施例中，抗体-药物缀合物包含抗PSMA抗体或其抗原结合片段，该抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含以下三个重链CDR和三个轻链CDR：包含SEQ ID NO:28的重链CDR1(HCDR1)、包含SEQ ID NO:29的重链CDR2(HCDR2)、包含SEQ ID NO:30的重链CDR3(HCDR3)；包含SEQID NO:38的轻链CDR1(LCDR1)、包含SEQ ID NO:39的轻链CDR2(LCDR2)和包含SEQ ID NO:37的轻链CDR3(LCDR3)，如由IMGT编号系统所定义的；本文披露的任何连接子；以及含有选自表14的化合物的化合物的药物部分。
在一些实施例中，抗体-药物缀合物包含抗PSMA抗体或其抗原结合片段，该抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ IDNO:19的氨基酸序列的轻链可变区；本文披露的任何连接子；以及含有具有式(III)的化合物的药物部分。在一些实施例中，抗体-药物缀合物包含抗PSMA抗体或其抗原结合片段，该抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的轻链可变区；本文披露的任何连接子；以及含有具有式(IV)的化合物的药物部分。在一些实施例中，抗体-药物缀合物包含抗PSMA抗体或其抗原结合片段，该抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的轻链可变区；本文披露的任何连接子；以及含有选自表14的化合物的化合物的药物部分。
在一些实施例中，抗体-药物缀合物包含抗PSMA抗体或其抗原结合片段，该抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含以下三个重链CDR和三个轻链CDR：包含SEQ ID NO:21的重链CDR1(HCDR1)、包含SEQ ID NO:22的重链CDR2(HCDR2)、包含SEQ ID NO:27的重链CDR3(HCDR3)；包含SEQ ID NO:32的轻链CDR1(LCDR1)、包含SEQ ID NO:35的轻链CDR2(LCDR2)和包含SEQ ID NO:37的轻链CDR3(LCDR3)，如由Kabat编号系统所定义的；本文披露的任何连接子；以及含有化合物1的药物部分。
在一些实施例中，抗体-药物缀合物包含抗PSMA抗体或其抗原结合片段，该抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含以下三个重链CDR和三个轻链CDR：包含SEQ ID NO:28的重链CDR1(HCDR1)、包含SEQ ID NO:29的重链CDR2(HCDR2)、包含SEQ ID NO:30的重链CDR3(HCDR3)；包含SEQ ID NO:38的轻链CDR1(LCDR1)、包含SEQ ID NO:39的轻链CDR2(LCDR2)和包含SEQ ID NO:37的轻链CDR3(LCDR3)，如由IMGT编号系统所定义的；本文披露的任何连接子；以及含有化合物1的药物部分。
在一些实施例中，抗体-药物缀合物包含抗PSMA抗体或其抗原结合片段，该抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ IDNO:19的氨基酸序列的轻链可变区；本文披露的任何连接子；以及含有化合物1的药物部分。
在一些实施例中，抗体-药物缀合物包含抗PSMA抗体或其抗原结合片段，该抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含以下三个重链CDR和三个轻链CDR：包含SEQ ID NO:21的重链CDR1(HCDR1)、包含SEQ ID NO:22的重链CDR2(HCDR2)、包含SEQ ID NO:27的重链CDR3(HCDR3)；包含SEQ ID NO:32的轻链CDR1(LCDR1)、包含SEQ ID NO:35的轻链CDR2(LCDR2)和包含SEQ ID NO:37的轻链CDR3(LCDR3)，如由Kabat编号系统所定义的；含有MC-Val-Ala-pABC-单元8的连接子；以及含有化合物1的药物部分。
在一些实施例中，抗体-药物缀合物包含抗PSMA抗体或其抗原结合片段，该抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含以下三个重链CDR和三个轻链CDR：包含SEQ ID NO:21的重链CDR1(HCDR1)、包含SEQ ID NO:22的重链CDR2(HCDR2)、包含SEQ ID NO:27的重链CDR3(HCDR3)；包含SEQ ID NO:32的轻链CDR1(LCDR1)、包含SEQ ID NO:35的轻链CDR2(LCDR2)和包含SEQ ID NO:37的轻链CDR3(LCDR3)，如由Kabat编号系统所定义的；以及含有LP16的连接子-药物缀合物。
在一些实施例中，抗体-药物缀合物包含抗PSMA抗体或其抗原结合片段，该抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含以下三个重链CDR和三个轻链CDR：包含SEQ ID NO:28的重链CDR1(HCDR1)、包含SEQ ID NO:29的重链CDR2(HCDR2)、包含SEQ ID NO:30的重链CDR3(HCDR3)；包含SEQ ID NO:38的轻链CDR1(LCDR1)、包含SEQ ID NO:39的轻链CDR2(LCDR2)和包含SEQ ID NO:37的轻链CDR3(LCDR3)，如由IMGT编号系统所定义的；含有MC-Val-Ala-pABC-单元8部分的连接子；以及含有化合物1的药物部分。
在一些实施例中，抗体-药物缀合物包含抗PSMA抗体或其抗原结合片段，该抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含以下三个重链CDR和三个轻链CDR：包含SEQ ID NO:28的重链CDR1(HCDR1)、包含SEQ ID NO:29的重链CDR2(HCDR2)、包含SEQ ID NO:30的重链CDR3(HCDR3)；包含SEQ ID NO:38的轻链CDR1(LCDR1)、包含SEQ ID NO:39的轻链CDR2(LCDR2)和包含SEQ ID NO:37的轻链CDR3(LCDR3)，如由IMGT编号系统所定义的；以及含有LP16的连接子-药物缀合物。
在一些实施例中，抗体-药物缀合物包含抗PSMA抗体或其抗原结合片段，该抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ IDNO:19的氨基酸序列的轻链可变区；含有MC-Val-Ala-pABC-单元8部分的连接子；以及含有化合物1的药物部分。
在一些实施例中，抗体-药物缀合物包含抗PSMA抗体或其抗原结合片段，该抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ IDNO:19的氨基酸序列的轻链可变区；以及含有LP16的连接子-药物缀合物。
在一些实施例中，抗体-药物缀合物包含抗PSMA抗体或其抗原结合片段，该抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含以下三个重链CDR和三个轻链CDR：包含SEQ ID NO:21的重链CDR1(HCDR1)、包含SEQ ID NO:22的重链CDR2(HCDR2)、包含SEQ ID NO:27的重链CDR3(HCDR3)；包含SEQ ID NO:32的轻链CDR1(LCDR1)、包含SEQ ID NO:35的轻链CDR2(LCDR2)和包含SEQ ID NO:37的轻链CDR3(LCDR3)，如由Kabat编号系统所定义的；含有MC-Val-Ala-pABC-单元9部分的连接子；以及含有化合物1的药物部分。
在一些实施例中，抗体-药物缀合物包含抗PSMA抗体或其抗原结合片段，该抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含以下三个重链CDR和三个轻链CDR：包含SEQ ID NO:21的重链CDR1(HCDR1)、包含SEQ ID NO:22的重链CDR2(HCDR2)、包含SEQ ID NO:27的重链CDR3(HCDR3)；包含SEQ ID NO:32的轻链CDR1(LCDR1)、包含SEQ ID NO:35的轻链CDR2(LCDR2)和包含SEQ ID NO:37的轻链CDR3(LCDR3)，如由Kabat编号系统所定义的；以及含有LP20的连接子-药物缀合物。
在一些实施例中，抗体-药物缀合物包含抗PSMA抗体或其抗原结合片段，该抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含以下三个重链CDR和三个轻链CDR：包含SEQ ID NO:28的重链CDR1(HCDR1)、包含SEQ ID NO:29的重链CDR2(HCDR2)、包含SEQ ID NO:30的重链CDR3(HCDR3)；包含SEQ ID NO:38的轻链CDR1(LCDR1)、包含SEQ ID NO:39的轻链CDR2(LCDR2)和包含SEQ ID NO:37的轻链CDR3(LCDR3)，如由IMGT编号系统所定义的；含有MC-Val-Ala-pABC-单元9部分的连接子；以及含有化合物1的药物部分。
在一些实施例中，抗体-药物缀合物包含抗PSMA抗体或其抗原结合片段，该抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含以下三个重链CDR和三个轻链CDR：包含SEQ ID NO:28的重链CDR1(HCDR1)、包含SEQ ID NO:29的重链CDR2(HCDR2)、包含SEQ ID NO:30的重链CDR3(HCDR3)；包含SEQ ID NO:38的轻链CDR1(LCDR1)、包含SEQ ID NO:39的轻链CDR2(LCDR2)和包含SEQ ID NO:37的轻链CDR3(LCDR3)，如由IMGT编号系统所定义的；以及含有LP20的连接子-药物缀合物。
在一些实施例中，抗体-药物缀合物包含抗PSMA抗体或其抗原结合片段，该抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ IDNO:19的氨基酸序列的轻链可变区；含有MC-Val-Ala-pABC-单元9部分的连接子；以及含有化合物1的药物部分。
在一些实施例中，抗体-药物缀合物包含抗PSMA抗体或其抗原结合片段，该抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ IDNO:19的氨基酸序列的轻链可变区；以及含有LP20的连接子-药物缀合物。
在一些实施例中，抗体-药物缀合物包含抗PSMA抗体或其抗原结合片段，该抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含以下三个重链CDR和三个轻链CDR：包含SEQ ID NO:21的重链CDR1(HCDR1)、包含SEQ ID NO:22的重链CDR2(HCDR2)、包含SEQ ID NO:27的重链CDR3(HCDR3)；包含SEQ ID NO:32的轻链CDR1(LCDR1)、包含SEQ ID NO:35的轻链CDR2(LCDR2)和包含SEQ ID NO:37的轻链CDR3(LCDR3)，如由Kabat编号系统所定义的；含有Mal-式(II)-Val-Ala-pAB-单元11部分的连接子；以及含有化合物1的药物部分。
在一些实施例中，抗体-药物缀合物包含抗PSMA抗体或其抗原结合片段，该抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含以下三个重链CDR和三个轻链CDR：包含SEQ ID NO:21的重链CDR1(HCDR1)、包含SEQ ID NO:22的重链CDR2(HCDR2)、包含SEQ ID NO:27的重链CDR3(HCDR3)；包含SEQ ID NO:32的轻链CDR1(LCDR1)、包含SEQ ID NO:35的轻链CDR2(LCDR2)和包含SEQ ID NO:37的轻链CDR3(LCDR3)，如由Kabat编号系统所定义的；以及含有LP26的连接子-药物缀合物。
在一些实施例中，抗体-药物缀合物包含抗PSMA抗体或其抗原结合片段，该抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含以下三个重链CDR和三个轻链CDR：包含SEQ ID NO:28的重链CDR1(HCDR1)、包含SEQ ID NO:29的重链CDR2(HCDR2)、包含SEQ ID NO:30的重链CDR3(HCDR3)；包含SEQ ID NO:38的轻链CDR1(LCDR1)、包含SEQ ID NO:39的轻链CDR2(LCDR2)和包含SEQ ID NO:37的轻链CDR3(LCDR3)，如由IMGT编号系统所定义的；含有Mal-式(II)-Val-Ala-pAB-单元11部分的连接子；以及含有化合物1的药物部分。
在一些实施例中，抗体-药物缀合物包含抗PSMA抗体或其抗原结合片段，该抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含以下三个重链CDR和三个轻链CDR：包含SEQ ID NO:28的重链CDR1(HCDR1)、包含SEQ ID NO:29的重链CDR2(HCDR2)、包含SEQ ID NO:30的重链CDR3(HCDR3)；包含SEQ ID NO:38的轻链CDR1(LCDR1)、包含SEQ ID NO:39的轻链CDR2(LCDR2)和包含SEQ ID NO:37的轻链CDR3(LCDR3)，如由IMGT编号系统所定义的；以及含有LP26的连接子-药物缀合物。
在一些实施例中，抗体-药物缀合物包含抗PSMA抗体或其抗原结合片段，该抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ IDNO:19的氨基酸序列的轻链可变区；含有Mal-式(II)-Val-Ala-pAB-单元11部分的连接子；以及含有化合物1的药物部分。
在一些实施例中，抗体-药物缀合物包含抗PSMA抗体或其抗原结合片段，该抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ IDNO:19的氨基酸序列的轻链可变区；以及含有LP26的连接子-药物缀合物。
在一些实施例中，抗体-药物缀合物包含抗PSMA抗体或其抗原结合片段，该抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含以下三个重链CDR和三个轻链CDR：包含SEQ ID NO:21的重链CDR1(HCDR1)、包含SEQ ID NO:22的重链CDR2(HCDR2)、包含SEQ ID NO:27的重链CDR3(HCDR3)；包含SEQ ID NO:32的轻链CDR1(LCDR1)、包含SEQ ID NO:35的轻链CDR2(LCDR2)和包含SEQ ID NO:37的轻链CDR3(LCDR3)，如由Kabat编号系统所定义的；含有MC-Val-Ala-pABC-单元11部分的连接子；以及含有化合物1的药物部分。
在一些实施例中，抗体-药物缀合物包含抗PSMA抗体或其抗原结合片段，该抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含以下三个重链CDR和三个轻链CDR：包含SEQ ID NO:21的重链CDR1(HCDR1)、包含SEQ ID NO:22的重链CDR2(HCDR2)、包含SEQ ID NO:27的重链CDR3(HCDR3)；包含SEQ ID NO:32的轻链CDR1(LCDR1)、包含SEQ ID NO:35的轻链CDR2(LCDR2)和包含SEQ ID NO:37的轻链CDR3(LCDR3)，如由Kabat编号系统所定义的；以及含有LP28的连接子-药物缀合物。
在一些实施例中，抗体-药物缀合物包含抗PSMA抗体或其抗原结合片段，该抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含以下三个重链CDR和三个轻链CDR：包含SEQ ID NO:28的重链CDR1(HCDR1)、包含SEQ ID NO:29的重链CDR2(HCDR2)、包含SEQ ID NO:30的重链CDR3(HCDR3)；包含SEQ ID NO:38的轻链CDR1(LCDR1)、包含SEQ ID NO:39的轻链CDR2(LCDR2)和包含SEQ ID NO:37的轻链CDR3(LCDR3)，如由IMGT编号系统所定义的；含有MC-Val-Ala-pABC-单元11部分的连接子；以及含有化合物1的药物部分。
在一些实施例中，抗体-药物缀合物包含抗PSMA抗体或其抗原结合片段，该抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含以下三个重链CDR和三个轻链CDR：包含SEQ ID NO:28的重链CDR1(HCDR1)、包含SEQ ID NO:29的重链CDR2(HCDR2)、包含SEQ ID NO:30的重链CDR3(HCDR3)；包含SEQ ID NO:38的轻链CDR1(LCDR1)、包含SEQ ID NO:39的轻链CDR2(LCDR2)和包含SEQ ID NO:37的轻链CDR3(LCDR3)，如由IMGT编号系统所定义的；以及含有LP28的连接子-药物缀合物。
在一些实施例中，抗体-药物缀合物包含抗PSMA抗体或其抗原结合片段，该抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ IDNO:19的氨基酸序列的轻链可变区；含有MC-Val-Ala-pABC-单元11部分的连接子；以及含有化合物1的药物部分。
在一些实施例中，抗体-药物缀合物包含抗PSMA抗体或其抗原结合片段，该抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ IDNO:19的氨基酸序列的轻链可变区；以及含有LP28的连接子-药物缀合物。
在本文披露的抗体-药物缀合物的一些实施例中，抗体-药物缀合物包含抗PSMA抗体或其抗原结合片段，该抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含三个HCDR，其包含以下氨基酸序列：SEQ ID NO:21(HCDR1)、SEQ ID NO:22(HCDR2)和SEQ ID NO:27(HCDR3)；以及三个LCDR，其包含SEQ ID NO:32(LCDR1)、SEQ ID NO:35(LCDR2)和SEQ ID NO:37(LCDR3)，如由Kabat编号系统所定义的；以及含有LP16、LP20、LP26或LP28的连接子-药物缀合物。不受理论的束缚，这些抗体-药物缀合物中的一种或多种可以表现出优于其他ADC(例如使用其他抗体、连接子和/或药物的那些，例如与本文披露的其他ADC相比)的特性(例如，改进的缀合稳定性、改进的血浆稳定性、低ADC聚集、中靶细胞毒性、低脱靶毒性、药代动力学和药效学特性、可配制性和毒理学/免疫学特征、在肿瘤微环境中刺激抗免疫反应、刺激骨髓细胞(例如巨噬细胞和/或树突状细胞)对表达PSMA的细胞的吞噬作用增加、和体内抗肿瘤活性)。在一些实施例中，不受理论的束缚，使用抗体-药物缀合物(该抗体-药物缀合物包含抗PSMA抗体或其抗原结合片段，该抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含三个HCDR，其包含以下氨基酸序列：SEQ ID NO:21(HCDR1)、SEQ ID NO:22(HCDR2)和SEQ ID NO:27(HCDR3)；以及三个LCDR，其包含SEQ ID NO:32(LCDR1)、SEQ ID NO:35(LCDR2)和SEQ ID NO:37(LCDR3)，如由Kabat编号系统所定义的；以及含有LP16、LP20、LP26或LP28的连接子-药物缀合物)的益处可以包括改进的缀合稳定性、改进的血浆稳定性、低ADC聚集、中靶细胞毒性、低脱靶毒性、药代动力学和药效学特性、可配制性和毒理学/免疫学特征、在肿瘤微环境中刺激抗免疫反应、刺激骨髓细胞(例如巨噬细胞和/或树突状细胞)对表达PSMA的细胞的吞噬作用增加、和体内抗肿瘤活性。这样的抗体-药物缀合物的优异益处的示例性证据显示在实例9、12、14和15中。
在本文披露的抗体-药物缀合物的一些实施例中，抗体-药物缀合物包含抗PSMA抗体或其抗原结合片段，该抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含三个HCDR，其包含以下氨基酸序列：SEQ ID NO:28(HCDR1)、SEQ ID NO:29(HCDR2)和SEQ ID NO:30(HCDR3)；以及三个LCDR，其包含SEQ ID NO:38(LCDR1)、SEQ ID NO:39(LCDR2)和SEQ ID NO:37(LCDR3)，如由IMGT编号系统所定义的；以及含有LP16、LP20、LP26或LP28的连接子-药物缀合物。不受理论的束缚，与其他抗PSMA抗体-药物缀合物相比，这些抗体-药物缀合物中的一种或多种可以表现出优于其他ADC(例如使用其他抗体、连接子和/或药物的那些，例如与本文披露的其他ADC相比)的特性(例如，改进的缀合稳定性、改进的血浆稳定性、低ADC聚集、中靶细胞毒性、低脱靶毒性、药代动力学和药效学特性、可配制性和毒理学/免疫学特征、在肿瘤微环境中刺激抗免疫反应、刺激骨髓细胞(例如巨噬细胞和/或树突状细胞)对表达PSMA的细胞的吞噬作用增加、和体内抗肿瘤活性)。在一些实施例中，不受理论的束缚，使用抗体-药物缀合物(该抗体-药物缀合物包含抗PSMA抗体或其抗原结合片段，该抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含三个HCDR，其包含以下氨基酸序列：SEQ ID NO:28(HCDR1)、SEQ ID NO:29(HCDR2)和SEQ ID NO:30(HCDR3)；以及三个LCDR，其包含SEQ ID NO:38(LCDR1)、SEQ ID NO:39(LCDR2)和SEQ ID NO:37(LCDR3)，如由IMGT编号系统所定义的；以及含有LP16、LP20、LP26或LP28的连接子-药物缀合物)的益处可以包括改进的缀合稳定性、改进的血浆稳定性、低ADC聚集、中靶细胞毒性、低脱靶毒性、药代动力学和药效学特性、可配制性和毒理学/免疫学特征、在肿瘤微环境中刺激抗免疫反应、刺激骨髓细胞(例如巨噬细胞和/或树突状细胞)对表达PSMA的细胞的吞噬作用增加、和体内抗肿瘤活性。这样的抗体-药物缀合物的优异益处的示例性证据显示在实例9、12、14和15中。
在本文披露的抗体-药物缀合物的一些实施例中，抗体-药物缀合物包含抗PSMA抗体或其抗原结合片段，该抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的轻链可变区；以及含有LP16、LP20、LP26或LP28的连接子-药物缀合物。不受理论的束缚，这些抗体-药物缀合物中的一种或多种可以表现出优于其他ADC(例如使用其他抗体、连接子和/或药物的那些，例如与本文披露的其他ADC相比)的特性(例如，改进的缀合稳定性、改进的血浆稳定性、低ADC聚集、中靶细胞毒性、低脱靶毒性、药代动力学和药效学特性、可配制性和毒理学/免疫学特征、在肿瘤微环境中刺激抗免疫反应、刺激骨髓细胞(例如巨噬细胞和/或树突状细胞)对表达PSMA的细胞的吞噬作用增加、和体内抗肿瘤活性)。在一些实施例中，不受理论的束缚，使用抗体-药物缀合物(该抗体-药物缀合物包含抗PSMA抗体或其抗原结合片段，该抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的轻链可变区；以及含有LP16、LP20、LP26或LP28的连接子-药物缀合物)的益处可以包括改进的缀合稳定性、改进的血浆稳定性、低ADC聚集、中靶细胞毒性、低脱靶毒性、药代动力学和药效学特性、可配制性和毒理学/免疫学特征、在肿瘤微环境中刺激抗免疫反应、刺激骨髓细胞(例如巨噬细胞和/或树突状细胞)对表达PSMA的细胞的吞噬作用增加、和体内抗肿瘤活性。这样的抗体-药物缀合物的优异益处的示例性证据显示在实例9、12、14和15中。
对于本领域技术人员显而易见的是，在不脱离本文披露的发明或实施例的范围的情况下，本文所述的本发明的方法的其他合适的修改和调整是显而易见的并且可以使用合适的等同物进行。现在已经详细描述了本发明，通过参考以下实例将更清楚地理解它们，所包括的这些实例仅用于说明的目的而不旨在具有限制性。
实例
实例1.连接子-有效载荷合成
在以下说明性实例中，除非另外说明，否则
(i)温度以摄氏度(℃)给出；
(ii)有机溶液经无水硫酸钠或硫酸镁干燥；
(iii)使用旋转蒸发器在减压(0-1000毫巴)下在高达60℃的浴温下进行有机溶剂的蒸发；
(iv)柱色谱法意指在硅胶或预填充硅胶柱(12g、24g、40g等)上的快速色谱法；
(v)在硅胶板上进行薄层色谱法(TLC)；
(vi)正相和反相快速柱色谱法使用Teledyne ISCO系统或快速柱进行，根据制造商的说明使用，并且分别从苏必利尔街4700号，林肯NE68504，美国或拜泰齐公司(Biotage AB)，邮政信箱8 751 03，瑞典乌普萨拉大学获得；
(vii)制备型TLC意指在纯化中使用的制备型TLC板；
(viii)通常，通过TLC或液相色谱法/质谱法(LC/MS)跟踪反应过程，并且给出反应时间仅用于说明；
(ix)最终产物具有令人满意的质子核磁共振(NMR)谱和/或质谱数据；
(x)如果需要更多材料，则重复制备过程；
(xi)当给出时，1H NMR数据呈主要诊断性质子的δ值形式，以相对于作为内标的四甲基硅烷(TMS，0ppm)的百万分之一(ppm)给出。残留溶剂峰也可以用作内标。耦合常数以赫兹(Hz)为单位报告。裂分形式的缩写如下：s：单峰；d：双峰；t：三重峰；m：多重峰；以及brs：宽单峰；
(xii)如果分配给给定化合物的命名法与本文描述的化合物结构不一致，则以结构为准；以及
(xiii)制备型HPLC意指制备型高效液相色谱法，是指使用下文列出的反相HPLC柱进行纯化，并根据制造商的说明使用。
缩写
可以在整个实例中使用以下缩写。
Boc：叔丁氧基羰基
AcOH：乙酸
Cbz：苄氧基羰基
CSA：樟脑磺酸
DCC：N,N'-二环己基碳二亚胺
DCM：二氯甲烷
DIBAL-H：二异丁基氢化铝
DIEA：N,N-二异丙基乙胺
DIPEA：N,N-二异丙基乙胺
DME：1,2-二甲氧基乙烷
DMF：N,N-二甲基甲酰胺
DMT-MM：4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉-4-鎓氯化物
DPPA：二苯基磷酰基叠氮化物
EDCI：1-乙基-3-[3-(二甲基氨基)丙基]碳二亚胺
EEDQ:1-乙氧基羰基-2-乙氧基-1,2-二氢喹啉
eq：当量
ESI：电喷雾电离
EtOAc：乙酸乙酯
FA：甲酸
h：小时
HATU：1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸盐
HFIP：1,1,1,3,3,3-六氟丙烷-2-醇
HOBT：1-羟基苯并三唑
HPLC：高效液相色谱法
IPA：2-丙醇
LAH：氢化铝锂
LC-MS：液相色谱法-质谱法
LiHMDS：双(三甲基甲硅烷基)酰胺锂
MeCN：乙腈
MTBE：甲基叔丁基醚
NMM：4-甲基吗啉
PE：石油醚
Prep：制备型
Py：吡啶
RT：保留时间
rt：室温
TBAF：四正丁基氟化铵
TBS：叔丁基二甲基甲硅烷基
TEA：三乙胺
tert-：叔
TFA：三氟乙酸
THF：四氢呋喃
TLC：薄层色谱法
TMSOTf：三甲基甲硅烷基三氟甲磺酸酯
TSTU：N,N,N,N'-四甲基-O-(N-琥珀酰亚胺基)脲四氟硼酸盐
1.LP2的合成
LP2的合成如下所示：
(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27}]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸2-[(叔丁氧基羰基)(甲基)氨基]乙基酯(1)的合成如下所示：
在-78℃，将双(三甲基甲硅烷基)酰胺锂(LiHMDS)(1.6mmol)的溶液添加至化合物1的二铵盐(150mg，0.201mmol)在四氢呋喃(THF)(10mL)中的搅拌溶液中。将所得混合物在氮气气氛下在-78℃搅拌30min。然后在-78℃，将1-[({2-[(叔丁氧基羰基)(甲基)氨基]乙氧基}羰基)氧基]-4-硝基苯(68mg，0.201mmol)添加至所得混合物中。将所得混合物在2h内缓慢加温至室温(rt)。将反应用AcOH(96.52mg，1.608mmol)淬灭。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过制备型TLC(CH2Cl2/MeOH 7:1)纯化以获得100mg呈白色固体的目标产物1。LC-MS(ESI):948.1[M+H]+。
(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27}]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸2-(甲基氨基)乙基酯(2)的合成如下所示：
将三乙胺(TEA)(14.41mg，0.140mmol)添加至(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04, 8.07,12.019,24.023,27}]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸2-[(叔丁氧基羰基)(甲基)氨基]乙基酯(1)(27mg，0.028mmol)在CH2Cl2(2mL)中的搅拌溶液中。然后在室温，将三甲基甲硅烷基三氟甲磺酸酯(TMSOTf)(44.32mg，0.196mmol)添加至所得混合物中。将所得混合物在室温搅拌30min。将所得混合物在减压下浓缩，以提供呈无色油状物的目标产物2，其无需进一步纯化即可用于下一步骤。LC-MS(ESI):848.1[M+H]+。
(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27}]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸2-{[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[6-(2,5-二氧代吡咯-1-基)己酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基](甲基)氨基}乙基酯(LP2)的合成如下详细所示：
将碳酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[6-(2,5-二氧代吡咯-1-基)己酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲基4-硝基苯基酯(18.45mg，0.028mmol)和N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)(7.32mg，0.056mmol)添加至(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023 ,27}]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸2-(甲基氨基)乙基酯(2)(24mg，0.028mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)(1mL)中的搅拌溶液中。将所得混合物在室温搅拌14h。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过制备型TLC(乙酸乙酯(EtOAc)(1％ TEA)/MeOH 3/1)和制备型HPLC(柱：XBridge Prep PhenylOBD柱，19x250 mm，5μm；流动相A：水(0.3％ NH4HCO2)，流动相B：乙腈(MeCN)；流速：25mL/min；梯度：在10min内25％ B至40％ B，40％ B；波长：254nm；保留时间(RT)＝9min)纯化，以得到呈白色固体的目标产物LP2(6.0mg)。
LC-MS(ESI):1360.55[M+H]+。
1H NMR(300MHz,甲醇-d4)δ8.97–8.85(m,1H),8.84–8.62(m,2H),8.12(s,1H),7.69–7.51(m,2H),7.40–7.14(m,2H),6.88–6.72(s,2H),6.54–6.20(m,2H),6.11–5.97(m,1H),5.95–5.18(m,3H),5.09–4.95(m,2H),4.91–4.86(m,2H),4.72–4.57(m,3H),4.57–4.46(m,3H),4.48–4.36(m,2H),4.36–4.24(m,1H),4.24–4.12(m,2H),4.11–3.90(m,2H),3.72–3.54(m,1H),3.55–3.41(m,4H),2.85–2.68(m,3H),2.41–2.23(m,2H),2.18–2.02(m,1H),1.79–1.50(m,5H)1.50–1.41(m,3H),1.36–1.22(m,2H),1.09–0.88(m,7H)。
31P NMR(162MHz,甲醇-d4)δppm 54.82,55.19。
分析型HPLC RT＝3.60min(仪器：Shimadzu LC20AD；柱：HALO C18(4.6mmID x100mm)；流动相A：水(0.05％三氟乙酸(TFA))，流动相B：MeCN(0.05％ TFA)；流速：1.5mL/min；温度：40℃；梯度：10％ B(t＝0.01min)，95％ B(t＝8至10min)；波长：254nm)。
2.LP1的合成
LP1的合成如下所示：
碳酸4-硝基苯基2-(三甲基甲硅烷基)乙基酯的合成如下所示：
将4-硝基苯基氯甲酸酯(3.8g，19mmol)和吡啶(1.5g，19mmol)添加至2-(三甲基甲硅烷基)乙醇(1.50g，12.7mmol)在CH2Cl2(20mL)中的溶液中。将所得混合物在室温搅拌4h。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(用石油醚/EtOAc(1:2)洗脱)纯化。这产生2.7g呈淡黄色固体的碳酸4-硝基苯基2-(三甲基甲硅烷基)乙基酯。
(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27}]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙基酯(3)的合成如下所示：
在-78℃，将LiHMDS(0.80mmol)的溶液添加至化合物1的二铵盐(100mg)在THF(3mL)中的溶液中。将所得混合物在氮气气氛下在-78℃搅拌30min。在-78℃，向上述混合物中滴加碳酸4-硝基苯基2-(三甲基甲硅烷基)乙基酯(38mg，0.13mmol)。将所得混合物在氮气气氛下在-78℃搅拌1h。将反应用AcOH(48mg，0.804mmol)淬灭。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过制备型TLC(使用CH2Cl2/MeOH(7:1))纯化。这产生80mg呈白色固体的目标产物3。LC-MS(ESI):891[M+H]+。
N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-({[(2-羟基乙基)(甲基)氨基甲酰基]氧基}甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酸叔丁基酯的合成如下所示：
向碳酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲基4-硝基苯基酯(1.2g，2.1mmol)和N-甲基-乙醇胺(161mg，2.15mmol)在DMF(10mL)中的搅拌溶液中添加DIPEA(555mg，4.30mmol)。将所得混合物在室温搅拌2h。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(用CH2Cl2/MeOH(12:1)洗脱)纯化。这产生呈白色固体的N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-({[(2-羟基乙基)(甲基)氨基甲酰基]氧基}甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酸叔丁基酯(950mg)。LC-MS(ESI):495.2[M+H]+。
N-[(1S)-2-甲基-1-{[(1S)-1-{[4-({[甲基({2-[(4-硝基苯氧基羰基)氧基]乙基})氨基甲酰基]氧基}甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}丙基]氨基甲酸叔丁基酯的合成如下所示：
向N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-({[(2-羟基乙基)(甲基)氨基甲酰基]氧基}甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酸叔丁基酯(950mg，1.92mmol)和4-硝基苯基氯甲酸酯(581mg，2.88mmol)在二氯甲烷(DCM)(30mL)中的搅拌溶液中添加吡啶(228mg，2.88mmol)。将所得混合物在氮气气氛下在室温搅拌过夜。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(用石油醚/EtOAc(1:2)洗脱)纯化。这产生呈白色固体的N-[(1S)-2-甲基-1-{[(1S)-1-{[4-({[甲基({2-[(4-硝基苯氧基羰基)氧基]乙基})氨基甲酰基]氧基}甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}丙基]氨基甲酸叔丁基酯(1.1g)。LC-MS(ESI):660.2[M+H]+。
(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27}]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13,18-二甲酸13-(2-{[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基](甲基)氨基}乙基)18-[2-(三甲基甲硅烷基)乙基]酯(4)的合成如下所示：
在-78℃，将LiHMDS(0.54mmol)的溶液添加至(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04, 8.07,12.019,24.023,27}]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙基酯(3)(80mg，0.090mmol)在THF(3mL)中的混合物中。将所得混合物在氮气气氛下在-78℃搅拌30min。在-78℃，向上述混合物中分批添加N-[(1S)-2-甲基-1-{[(1S)-1-{[4-({[甲基({2-[(4-硝基苯氧基羰基)氧基]乙基})氨基甲酰基]氧基}甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}丙基]氨基甲酸叔丁基酯(59.3mg，0.090mmol)。将所得混合物在氮气气氛下在-78℃搅拌2h。将反应在-78℃通过添加AcOH淬灭。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过制备型TLC(CH2Cl2/MeOH 7:1)纯化。这产生60mg呈白色固体的目标产物4。LC-MS(ESI):1411[M+H]+。
(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27}]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸2-{[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基](甲基)氨基}-2-甲基丙基酯(5)的合成如下所示：
将四丁基氟化铵(TBAF)(0.22mmol)的溶液添加至(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04 ,8.07,12.019,24.023,27}]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13,18-二甲酸13-(2-{[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基](甲基)氨基}乙基)18-[2-(三甲基甲硅烷基)乙基]酯(4)(60mg，0.043mmol)在THF(3mL)中的混合物中。将所得混合物在室温搅拌1h。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过制备型TLC(EtOAc(1％ TEA)/MeOH 3:1)纯化。这产生48mg呈白色固体的目标产物5。LC-MS(ESI):1267[M+H]+。
(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27}]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸2-{[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基](甲基)氨基}乙基酯(6)的合成如下所示：
将TFA(0.5mL)添加至(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27}]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸2-{[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基](甲基)氨基}乙基酯(5)(40mg，0.032mmol)在DCM(3mL)中的混合物中。将所得混合物在0℃搅拌1h。将所得混合物在减压下浓缩。这产生60mg(粗品)呈油状物的目标产物6。LC-MS(ESI):1167[M+H]+。
(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27}]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸(1-{[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基](甲基)氨基}环丙基)甲基酯(LP1)的合成如下所示：
将6-(2,5-二氧代吡咯-1-基)己酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(21.1mg，0.068mmol)和DIPEA(13.3mg，0.102mmol)添加至(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07, 12.019,24.023,27}]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸2-{[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基](甲基)氨基}乙基酯(6)(40mg，0.034mmol)在DMF(2mL)中的混合物中。将所得混合物在室温搅拌1h。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(用制备型TLC(CH2Cl2/MeOH 5:1)洗脱)纯化。将粗制产物通过制备型HPLC用以下条件纯化：柱：XBridge Prep Phenyl OBD柱，19x250 mm，5μm；流动相A：水(0.3％ NH4HCO3)，流动相B：MeCN；流速：25mL/min；梯度：在10min内25％ B至40％ B，40％ B；波长：254nm；RT＝9min。这产生12.3mg呈白色固体的目标产物LP1。
LC-MS(ESI):1360.50[M+H]+。
1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ9.21-9.09(m,1H),8.80–8.70(m,1H),8.59–8.45(m,1H),8.20–7.73(m,3H),7.64–7.54(m,2H),7.35–7.27(m,1H),7.27–7.18(m,1H),6.83–6.77(m,2H),6.55–6.41(m,1H),6.40–6.16(m,1H),5.88–5.63(m,2H),5.60–5.49(m,1H),5.48–5.29(m,1H),5.15–4.91(m,5H),4.75–4.68(m,3H),4.67–4.59(m,2H),4.58–4.47(m,3H),4.46–4.38(m,2H),4.33–4.14(m,3H),4.11–4.02(m,1H),4.01–3.93(m,1H),3.71–3.60(m,2H),3.57–3.43(m,3H),2.80–2.69(m,3H),2.34–2.26(m,2H),2.15–2.04(m,1H),1.70–1.54(m,4H),1.50–1.44(m,3H),1.36–1.27(m,3H),1.03–0.95(m,6H)。
31P NMR(162MHz,甲醇-d4)δppm 55.26,55.71。
分析型HPLC RT＝7.70min(仪器：Shimadzu LC20AD；柱：XSelect HSS T3(4.6mmIDx 100mm)；流动相A：水(0.05％ TFA)，流动相B：MeCN(0.05％ TFA)；流速：1.2mL/min；温度：40℃；梯度：10％ B(t＝0.01min)、50％ B(t＝10min)、95％ B(t＝12至14min)；波长：254nm)。
3.LP3的合成
LP3的合成如下所示：
6-(2,5-二氧代吡咯-1-基)-N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]己酰胺的合成如下所示：
将DIPEA(1.32g，10.2mmol)和6-(2,5-二氧代吡咯-1-基)己酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(1.58g，5.11mmol)添加至(2S)-2-氨基-N-[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]-3-甲基丁酰胺(1.5g，5.1mmol)在DMF(40mL)中的溶液中。将所得混合物在室温搅拌2h。将所得混合物用EtOAc稀释、用水洗涤并浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(用CH2Cl2/MeOH(10:1)洗脱)纯化。这产生2.0g呈灰白色固体的6-(2,5-二氧代吡咯-1-基)-N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]己酰胺。LC-MS(ESI):487[M+H]+。
6-(2,5-二氧代吡咯-1-基)-N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(碘甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]己酰胺的合成如下所示：
将碘化铯(801mg，3.08mmol)和三氟化硼醚合物(BF3 Et2O)(438mg，3.08mmol)添加至6-(2,5-二氧代吡咯-1-基)-N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]己酰胺(1.0g，2.06mmol)在乙腈(10mL)中的溶液中。将所得混合物在室温搅拌2h。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(用CH2Cl2/iPrOH(10:1)洗脱)纯化。这产生700mg呈白色固体的6-(2,5-二氧代吡咯-1-基)-N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(碘甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]己酰胺。LC-MS(ESI):597[M+H]+。
N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-({[(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-39-硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023 ,27}]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-34-基]硫烷基}甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-6-(2,5-二氧代吡咯-1-基)己酰胺(LP3)的合成如下所示：
将6-(2,5-二氧代吡咯-1-基)-N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(碘甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]己酰胺(480mg，0.805mmol)和DIPEA(208mg，1.61mmol)添加至化合物1的二铵盐(600mg，0.805mmol)在DMF(5mL)中的溶液中。将所得混合物在室温搅拌2h。将粗制溶液通过制备型HPLC用以下条件纯化(柱：XBridge Prep OBDC18柱，19*x250 mm，5μm；流动相A：水(0.05％FA)，流动相B：MeCN；流速：25mL/min；梯度：在8min内32％B至32％ B，32％ B；波长：254nm；RT＝13min)。这产生108mg目标产物LP3。
LC-MS(ESI):1215.3[M+H]+。
1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ(ppm)＝8.77-8.46(m,1H),8.30-7.90(m,6H),7.40(brs,2H),7.22-6.85(m,2H),6.77(s,2H),6.45(br d,J＝14.5Hz,1H),6.25(br d,J＝19.9Hz,1H),5.90-5.10(m,6H),4.75-3.50(m,14H),,3.46(t,J＝7.0Hz,2H),2.28(t,J＝7.4Hz,2H),2.16-2.04(m,1H),1.70-1.50(m,4H),1.47-1.37(m,3H),1.35-1.24(m,2H),0.97(t,J＝7.0Hz,6H)。
分析型HPLC RT＝6.74min(仪器：Shimadzu LC20AD；柱：HALO C18(4.6mmID x100mm)；流动相A：水(0.05％ TFA)，流动相B：MeCN(0.05％ TFA)；流速：1.5mL/min；温度：40℃；梯度：10％ B(t＝0.01min)、70％ B(t＝10min)、95％ B(t＝12至14min)；波长：254nm)。
4.LP4的合成
LP4的合成如下所示：
(1R,2S)-2-(甲氧基羰基)环丙烷-1-甲酸的合成
在室温，将3-[(1R,2R)-2-(二甲基氨基)环己基]-1-苯基硫脲(618.80mg，2.231mmol)添加至3-氧杂双环[3.1.0]己烷-2,4-二酮(2.5g，22.3mmol)在Et2O(2.50L)中的溶液中。然后在氮气气氛下在0℃滴加MeOH(9.03mL)。将所得混合物在25℃再搅拌14h。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物溶解于Na2CO3水溶液(300mL)中并用DCM(300mL)洗涤以除去催化剂。将水层用HCl酸化至pH 1。将混合物用EtOAc(300mlx 2)萃取。将有机层在减压下浓缩。这产生呈黄色油状物的(1R,2S)-2-(甲氧基羰基)环丙烷-1-甲酸(2.5g)。
(1S,2R)-2-{[(苄氧基)羰基]氨基}环丙烷-1-甲酸甲基酯的合成
在室温，向(1R,2S)-2-(甲氧基羰基)环丙烷-1-甲酸(2500mg，17.3mmol)在甲苯(150mL)中的溶液中添加苯基甲醇(18757.51mg，173.5mmol)、TEA(1755.29mg，17.3mmol)和DPPA(4.7g，17.3mmol)。将所得混合物在55℃搅拌14h。将所得混合物在减压下浓缩。将粗制产物通过反相快速用以下条件纯化(柱：C18；流动相A：水(1％ FA)，流动相B：MeCN；梯度：在30min内5％ B至25％B；220/254nm)，以得到呈白色固体的(1S,2R)-2-{[(苄氧基)羰基]氨基}环丙烷-1-甲酸甲基酯(1000mg)。LC-MS(ESI):250.1[M+H]+。
N-[(1R,2S)-2-(羟基甲基)环丙基]氨基甲酸苄基酯的合成
在-78℃，向(1S,2R)-2-{[(苄氧基)羰基]氨基}环丙烷-1-甲酸甲基酯(1000mg，4.012mmol)在甲苯(6mL)中的溶液中滴加DIBAL-H(16.048mmol)。将所得混合物在N2气氛下在-78℃搅拌3h。将反应通过AcOH淬灭。将混合物用EtOAc稀释并用H2O洗涤。将所得混合物在减压下浓缩。将粗制产物通过反相快速用以下条件纯化(柱：C18；流动相A：水(1％ FA)，流动相B：MeCN；梯度：在30min内5B至20B；220/254nm)，以得到呈无色油状物的N-[(1R,2S)-2-(羟基甲基)环丙基]氨基甲酸苄基酯(400mg)。LC-MS(ESI):222.1[M+H]+。
N-[(1R,2S)-2-{[(叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基]甲基}环丙基]氨基甲酸苄基酯的合成
向N-[(1R,2S)-2-(羟基甲基)环丙基]氨基甲酸苄基酯(800mg，3.616mmol)和咪唑(369.23mg，5.424mmol)在DMF(5mL)中的溶液中添加叔丁基二甲基氯硅烷(817.44mg，5.424mmol)。将所得混合物在25℃搅拌14h。将所得混合物在真空下浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(用PE:EtOAc(5:1)洗脱)纯化，以得到呈无色油状物的N-[(1R,2S)-2-{[(叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基]甲基}环丙基]氨基甲酸苄基酯(600mg)。LC-MS(ESI):336.1[M+H]+。
N-[(1R,2S)-2-{[(叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基]甲基}环丙基]-N-甲基氨基甲酸苄基酯的合成
在氮气下在-78℃，向N-[(1R,2S)-2-{[(叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基]甲基}环丙基]氨基甲酸苄基酯(300mg，0.894mmol)在THF(20mL)中的溶液中滴加LiHMDS(2.682mmol)。将混合物在氮气气氛下在-78℃搅拌30min。在-78℃，向上述混合物中添加碘甲烷(761.48mg，5.364mmol)。将所得混合物在两小时内缓慢加温至室温。将反应通过AcOH淬灭。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过制备型TLC(PE:EtOAc＝5:1)纯化，以得到呈无色油状物的N-[(1R,2S)-2-{[(叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基]甲基}环丙基]-N-甲基氨基甲酸苄基酯(250mg)。LC-MS(ESI):350.2[M+H]+。
(1R,2S)-2-{[(叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基]甲基}-N-甲基环丙烷-1-胺的合成
向N-[(1R,2S)-2-{[(叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基]甲基}环丙基]-N-甲基氨基甲酸苄基酯(400mg，1.144mmol)在MeOH(5mL)中的溶液中添加Pd/C(80mg，10％)。将所得混合物在H2气氛下在25℃搅拌14h。将所得混合物过滤，将滤饼用MeOH洗涤。将滤液在减压下浓缩。这产生呈无色油状物的(1R,2S)-2-{[(叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基]甲基}-N-甲基环丙烷-1-胺(200mg)。LC-MS(ESI):216.2[M+H]+。
N-[(1R,2S)-2-{[(叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基]甲基}环丙基]-N-甲基氨基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲基酯的合成
向(1R,2S)-2-{[(叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基]甲基}-N-甲基环丙烷-1-胺(231.38mg，1.074mmol)和((S)-3-甲基-1-(((S)-1-((4-((((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代丙烷-2-基)氨基)-1-氧代丁烷-2-基)氨基甲酸叔丁基酯(400mg，0.716mmol)在DMF(4mL)中的溶液中添加DIEA(370.21mg，2.864mmol)。将所得混合物在25℃搅拌14h。将滤液在减压下浓缩。将残余物通过制备型TLC(DCM:EtOAc＝4:1)纯化，以得到呈黄色固体的N-[(1R,2S)-2-{[(叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基]甲基}环丙基]-N-甲基氨基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲基酯(350mg)。LC-MS(ESI):635.4[M+H]+。
N-[(1R,2S)-2-(羟基甲基)环丙基]-N-甲基氨基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲基酯的合成
在室温，向N-[(1R,2S)-2-{[(叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基]甲基}环丙基]-N-甲基氨基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲基酯(300mg，0.473mmol)在THF(3mL)中的溶液中添加TBAF(370.64mg，1.419mmol)。将所得混合物在室温搅拌3h。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过制备型TLC(PE/EtOAc＝1:4)纯化，以得到呈白色固体的N-[(1R,2S)-2-(羟基甲基)环丙基]-N-甲基氨基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲基酯(220mg)。柱：CHIRAL ART Cellulose-SC，2*25cm，5μm；流动相A：Hex(0.5％2M NH3-MeOH)—HPLC，流动相B：EtOH:DCM＝1:1—HPLC；流速：20mL/min；梯度：在16min内30％ B至30％ B；波长：220/254nm；LC-MS(ESI):521.3[M+H]+。
碳酸[(1S,2R)-2-{[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基](甲基)氨基}环丙基]甲基4-硝基苯基酯的合成
向4-硝基苯基氯甲酸酯(309.72mg，1.536mmol)和N-[(1R,2S)-2-(羟基甲基)环丙基]-N-甲基氨基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲基酯(400mg，0.768mmol)在DCM(3mL)中的溶液中添加吡啶(121.55mg，1.536mmol)。将混合物在N2气氛下在25℃搅拌6h。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(用(PE:EtOAc＝1:2)洗脱)纯化，以得到呈白色固体的碳酸[(1S,2R)-2-{[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基](甲基)氨基}环丙基]甲基4-硝基苯基酯(240mg)。LC-MS(ESI):686.3[M+H]+。
(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸[(1S,2R)-2-{[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基](甲基)氨基}环丙基]甲基酯的合成
在氮气气氛下在-78℃将化合物1(50mg，0.067mmol)在THF(3mL)中的溶液用LiHMDS(0.402mmol)处理30min，随后在-78℃滴加碳酸[(1S,2R)-2-{[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基](甲基)氨基}环丙基]甲基4-硝基苯基酯(46mg，0.067mmol)在THF(0.5mL)中的溶液。将混合物在一小时内缓慢加温至室温。将反应通过AcOH淬灭。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过制备型TLC(EtOAc(1％TEA):MeOH＝4:1)纯化，以得到呈白色固体的(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128 ,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸[(1S,2R)-2-{[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基](甲基)氨基}环丙基]甲基酯(40mg)。LC-MS(ESI):1293.4[M+H]+。
(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸[(1S,2R)-2-{[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基](甲基)氨基}环丙基]甲基酯的合成
将(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸[(1S,2R)-2-{[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基](甲基)氨基}环丙基]甲基酯(35mg，0.027mmol)和TFA(0.3mL)在DCM(1.8mL)中的溶液在0℃搅拌1h。将所得混合物在真空下浓缩。粗制产物无需进一步纯化即可直接用于下一步骤。LC-MS(ESI):1193.3[M+H]+。
(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸[(1S,2R)-2-{[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基](甲基)氨基}环丙基]甲基酯(LP4)的合成
向(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸[(1S,2R)-2-{[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基](甲基)氨基}环丙基]甲基酯(35mg，0.029mmol)和6-(2,5-二氧代吡咯-1-基)己酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(9.04mg，0.029mmol)在DMF(3mL)中的混合物中添加DIEA(18.96mg，0.145mmol)。将混合物在25℃搅拌2h。将所得混合物在真空下浓缩。将残余物通过制备型TLC(EtOAc(1％TEA):MeOH＝4:1)和制备型HPLC用以下条件纯化(柱：Xbridge Prep PhenylOBD柱，19x250mm，5μm；流动相A：水(50mmolHCO2NH4)，流动相B：MeCN；流速：25mL/min；梯度：在10min内25％ B至35％ B，35％ B；波长：254nm)，以得到呈白色固体的(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸[(1S,2R)-2-{[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基](甲基)氨基}环丙基]甲基酯(LP4)(7.6mg)。
LC-MS(ESI):1386.40[M+H]+。
1H NMR(300MHz,甲醇-d4)δ8.99–8.61(m,3H),8.20–8.03(m,1H),7.65–7.49(m,2H),7.35–7.14(m,2H),6.79(s,2H),6.53–6.23(m,2H),6.12–5.96(m,1H),5.93–5.55(m,2H),5.55–5.27(m,1H),5.16–4.90(m,3H),4.75–4.57(m,4H),4.55–4.33(m,4H),4.24–4.13(m,1H),4.15–3.89(m,4H),3.83–3.53(m,1H),3.53–3.42(m,2H),2.82(s,3H),2.78–2.64(m,1H),2.37–2.23(m,2H),2.23–1.99(m,1H),1.73–1.52(m,4H),1.52–1.42(m,3H),1.40–1.20(m,4H),1.09–0.85(m,7H),0.72–0.59(m,1H)。
5.LP5的合成
LP5的合成如下所示：
4-[(叔丁氧基羰基)(甲基)氨基]丁酸2,3,4,5,6-五氟苯基酯的合成
将DCC(1.90g，9.206mmol)添加至4-[(叔丁氧基羰基)(甲基)氨基]丁酸(1g，4.603mmol)和五氟苯酚(847.19mg，4.603mmol)在DCM(15mL)中的混合物中。将所得混合物在25℃搅拌2h。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(用PE/EtOAc(7:1)洗脱)纯化。这产生1.5g呈白色固体的4-[(叔丁氧基羰基)(甲基)氨基]丁酸2,3,4,5,6-五氟苯基酯。LC-MS(ESI):384[M+H]+。
N-{4-[(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-基]-4-氧代丁基}-N-甲基氨基甲酸叔丁基酯的合成
在-78℃，将LiHMDS(0.268mmol)添加至化合物1(50mg，0.067mmol)在THF(2mL)中的混合物中。将所得混合物在-78℃搅拌30min。在-78℃，向上述混合物中滴加4-[(叔丁氧基羰基)(甲基)氨基]丁酸2,3,4,5,6-五氟苯基酯(25mg，0.067mmol)。将所得混合物在1h内缓慢加温至0℃。在-78℃向上述混合物中添加LiHMDS(0.134mmol)并搅拌5min。在-78℃向混合物中滴加4-[(叔丁氧基羰基)(甲基)氨基]丁酸2,3,4,5,6-五氟苯基酯(25mg，0.067mmol)。将所得混合物在1h内缓慢加温至0℃。将反应用AcOH淬灭。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过制备型TLC(DCM/MeOH＝7:1)纯化。这产生40mg呈黄色固体的N-{4-[(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-基]-4-氧代丁基}-N-甲基氨基甲酸叔丁基酯。LC-MS(ESI):946[M+H]+。
(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-13-[4-(甲基氨基)丁酰基]-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-34,39-二酮的合成
将TMSOTf(41mg，0.185mmol)添加至N-{4-[(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04, 8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-基]-4-氧代丁基}-N-甲基氨基甲酸叔丁基酯(35mg，0.037mmol)和TEA(11mg，0.111mmol)在DCM(2mL)中的混合物中。将所得混合物在室温搅拌30min。将所得混合物在减压下浓缩。这产生呈黄色油状物的(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-13-[4-(甲基氨基)丁酰基]-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-34,39-二酮的粗品。LC-MS(ESI):846[M+H]+。
N-{4-[(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-基]-4-氧代丁基}-N-甲基氨基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1基)己酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲基酯(LP5)的合成
将DIEA(18.34mg，0.140mmol)添加至(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-13-[4-(甲基氨基)丁酰基]-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128 ,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-34,39-二酮(30mg，0.035mmol)和碳酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[6-(2,5-二氧代吡咯-1-基)己酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲基4-硝基苯基酯(23.12mg，0.035mmol)在DMF(1mL)中的混合物中。将所得混合物在25℃搅拌2h。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过以下纯化：硅胶柱色谱法(用制备型TLC(1％TEA)CH2Cl2/MeOH 7:1洗脱)和制备型HPLC(柱：XBridge PrepPhenylOBD柱，19x250 mm，5μm；流动相A：水(50mmolHCO2NH4)，流动相B：MeCN；流速：25mL/min；梯度：在10min内25％ B至40％ B，40％B；波长：254nm)。这产生10.1mg呈白色固体的N-{4-[(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-基]-4-氧代丁基}-N-甲基氨基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1基)己酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲基酯(LP5)。
LC-MS(ESI):1358.50[M+H]+。
1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ9.02–8.62(m,3H),8.19(s,1H),7.56(m,2H),7.36–7.16(m,2H),6.79(s,2H),6.52–6.30(m,2H),6.11–5.76(m,1H),5.73–5.44(m,2H),5.08–4.95(m,2H),4.72–4.41(m,9H),4.20–3.92(m,3H),3.75–3.40(m,4H),3.28–3.16(m,4H),2.81(s,3H),2.70–2.55(m,2H),2.49–2.03(m,4H),1.93–1.77(m,2H),1.68–1.60(m,3H),1.59–1.50(m,2H),1.48–1.41(m,4H),1.36–1.25(m,4H),1.03–0.95(m,6H)。
6.LP6的合成
LP6的合成如下所示：
1-{[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基](甲基)氨基}环丙烷-1-甲酸的合成
将DIEA(231.38mg，1.790mmol)和1-(甲基氨基)环丙烷-1-甲酸盐酸盐(136mg，0.895mmol)添加至碳酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲基4-硝基苯基酯(500mg，0.895mmol)在DMF(5mL)中的混合物中。将所得混合物在60℃搅拌14h。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(用DCM/MeOH(10:1)洗脱)纯化。这产生350mg呈白色固体的1-{[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基](甲基)氨基}环丙烷-1-甲酸。LC-MS(ESI):535[M+H]+。
N-[1-(羟基甲基)环丙基]-N-甲基氨基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲基酯的合成
在0℃，将2-甲基丙基氯甲酸酯(126mg，0.925mmol)和4-甲基吗啉(94mg，0.925mmol)添加至1-{[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基](甲基)氨基}环丙烷-1-甲酸(330mg，0.617mmol)在DME(5mL)中的混合物中。将所得混合物在0℃搅拌20min。向上述混合物中滴加在H2O(1mL)中的NaBH4(47mg，1.234mmol)。将所得混合物在25℃搅拌2h。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(用DCM/MeOH(10:1)洗脱)纯化。这产生260mg呈白色固体的N-[1-(羟基甲基)环丙基]-N-甲基氨基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲基酯。LC-MS(ESI):521[M+H]+。
碳酸(1-{[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基](甲基)氨基}环丙基)甲基4-硝基苯基酯的合成
将4-硝基苯基氯甲酸酯(140mg，0.692mmol)和吡啶(55mg，0.692mmol)添加至N-[1-(羟基甲基)环丙基]-N-甲基氨基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲基酯(240mg，0.461mmol)在DCM(5mL)中的混合物中。将所得混合物在25℃搅拌4h。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(用PE/EtOAc(1:2)洗脱)纯化。这产生250mg呈白色固体的碳酸(1-{[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基](甲基)氨基}环丙基)甲基4-硝基苯基酯。LC-MS(ESI):686[M+H]+。
(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸(1-{[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基](甲基)氨基}环丙基)甲基酯的合成
在-78℃，将LiHMDS(0.75mL 0.752mmol)添加至化合物1(70mg，0.094mmol)在THF(5mL)中的混合物中。将所得混合物在-78℃搅拌20min。在-78℃，向上述混合物中滴加碳酸(1-{[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基](甲基)氨基}环丙基)甲基4-硝基苯基酯(65mg，0.094mmol)。将所得混合物在-78℃搅拌2h。将反应通过添加AcOH淬灭。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过制备型TLC(DCM/MeOH 7:1)纯化。这产生55mg呈白色固体的(1R,3R,15,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04, 8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸(1-{[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基](甲基)氨基}环丙基)甲基酯。LC-MS(ESI):1293[M+H]+。
(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸(1-{[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基](甲基)氨基}环丙基)甲基酯的合成
将TFA(0.5mL)添加至(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸(1-{[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基](甲基)氨基}环丙基)甲基酯(50mg，0.039mmol)在DCM(3mL)中的混合物中。将所得混合物在0℃搅拌1h。将所得混合物在减压下浓缩。这产生呈油状物的(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸(1-{[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基](甲基)氨基}环丙基)甲基酯的粗品。LC-MS(ESI):1193[M+H]+。
(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸(1-{[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基](甲基)氨基}环丙基)甲基酯(LP6)的合成
在25℃，将6-(2,5-二氧代吡咯-1-基)己酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(21mg，0.068mmol)和DIEA(13mg，0.102mmol)添加至(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019, 24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸(1-{[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基](甲基)氨基}环丙基)甲基酯(40mg，0.034mmol)在DMF(1.5mL)中的混合物中。将所得混合物在25℃搅拌1h。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(用制备型TLC(DCM/MeOH 5:1)洗脱)纯化。将粗制产物通过制备型HPLC用以下条件纯化(柱：XBridge Prep Phenyl OBD柱，19x250 mm，5μm；流动相A：水(50mmolHCO2NH4)，流动相B：MeCN；流速：25mL/min；梯度：在10min内25％ B至40％ B；波长：254nm)。这产生16.3mg呈白色固体的(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07, 12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸(1-{[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基](甲基)氨基}环丙基)甲基酯(LP6)。
LC-MS(ESI):1386.50[M+H]+。
1H NMR(300MHz,甲醇-d4)δ9.03–8.63(m,3H),8.28–7.98(m,2H),7.57(d,J＝7.4Hz,2H),7.41–7.11(m,2H),6.80(s,2H),6.58–6.21(m,2H),6.10–5.25(m,4H),4.73–4.35(m,9H),4.29–3.87(m,6H),3.83–3.41(m,5H),2.82–2.51(m,3H),2.36–2.19(m,2H),2.17–1.99(m,1H),1.70–1.50(m,3H),1.51–1.17(m,9H),1.03–0.93(m,6H),0.91–0.80(m,6H)。
7.LP7的合成
LP7的合成如下所示：
N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-({[(1-羟基-2-甲基丙烷-2-基)(甲基)氨基甲酰基]氧基}甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酸叔丁基酯的合成
将2-甲基-2-(甲基氨基)丙烷-1-醇(185mg，1.790mmol)和DIEA(463mg，3.580mmol)添加至碳酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲基4-硝基苯基酯(1g，1.790mmol)在DMF(5mL)中的混合物中。将所得混合物在60℃搅拌14h。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(用DCM/MeOH(10:1)洗脱)纯化。这产生560mg呈白色固体的N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-({[(1-羟基-2-甲基丙烷-2-基)(甲基)氨基甲酰基]氧基}甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酸叔丁基酯。LC-MS(ESI):523[M+H]+。
N-[(1S)-2-甲基-1-{[(1S)-1-{[4-({[甲基({2-甲基-1-[(4-硝基苯氧基羰基)氧基]丙烷-2-基})氨基甲酰基]氧基}甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}丙基]氨基甲酸叔丁基酯的合成
将4-硝基苯基氯甲酸酯(313mg，1.549mmol)和吡啶(123mg，1.549mmol)添加至N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-({[(1-羟基-2-甲基丙烷-2-基)(甲基)氨基甲酰基]氧基}甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酸叔丁基酯(540mg，1.033mmol)在DCM(5mL)中的溶液中。将所得混合物在氮气气氛下在25℃搅拌4h。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(用PE/EtOAc(1:2)洗脱)纯化。这产生630mg呈白色固体的N-[(1S)-2-甲基-1-{[(1S)-1-{[4-({[甲基({2-甲基-1-[(4-硝基苯氧基羰基)氧基]丙烷-2-基})氨基甲酰基]氧基}甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}丙基]氨基甲酸叔丁基酯。LC-MS(ESI):688[M+H]+。
(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸2-{[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基](甲基)氨基}-2-甲基丙基酯的合成
将LiHMDS(0.75mL，0.752mmol)添加至化合物1(70mg，0.094mmol)在THF(3mL)中的混合物中。将所得混合物在氮气气氛下在-78℃搅拌30min。在-78℃，向上述混合物中滴加N-[(1S)-2-甲基-1-{[(1S)-1-{[4-({[甲基({2-甲基-1-[(4-硝基苯氧基羰基)氧基]丙烷-2-基})氨基甲酰基]氧基}甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}丙基]氨基甲酸叔丁基酯(65mg，0.094mmol)。将所得混合物在氮气气氛下在-78℃搅拌2h。将反应通过添加AcOH淬灭。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过制备型TLC(DCM/MeOH 7:1)纯化。
这产生45mg呈白色固体的(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸2-{[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基](甲基)氨基}-2-甲基丙基酯。LC-MS(ESI):1295[M+H]+。
(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸2-{[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基](甲基)氨基}-2-甲基丙基酯的合成
将TFA(0.5mL)添加至(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸2-{[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基](甲基)氨基}-2-甲基丙基酯(35mg，0.027mmol)在DCM(3mL)中的混合物中。将所得混合物在0℃搅拌1h。将所得混合物在减压下浓缩。这产生30mg呈油状物的(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023 ,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸2-{[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基](甲基)氨基}-2-甲基丙基酯。LC-MS(ESI):1195[M+H]+。
(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸2-{[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基](甲基)氨基}-2-甲基丙基酯(LP7)的合成
将6-(2,5-二氧代吡咯-1-基)己酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(15mg，0.050mmol)和DIEA(10mg，0.075mmol)添加至(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸2-{[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基](甲基)氨基}-2-甲基丙基酯(30mg，0.025mmol)在DMF(2mL)中的混合物中。将所得混合物在25℃搅拌1h。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(用制备型TLC(DCM/MeOH 5:1)洗脱)纯化。将粗制产物通过制备型HPLC用以下条件纯化(柱：XBridge Prep Phenyl OBD柱，19x250 mm，5μm；流动相A：水(50mmolHCO2NH4)，流动相B：MeCN；流速：25mL/min；梯度：在15min内25％ B至40％ B，40％ B；波长：254nm)。这产生10mg呈白色固体的(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07, 12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸2-{[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基](甲基)氨基}-2-甲基丙基酯(LP7)。
LC-MS(ESI):1388.55[M+H]+。
1H NMR(300MHz,甲醇-d4)δ9.01–8.70(m,3H),8.33–8.26(m,2H),8.11–8.01(m,2H),7.62(d,J＝8.0Hz,2H),7.27(d,J＝8.1Hz,2H),6.84–6.76(m,2H),6.58–6.24(m,2H),6.10–5.30(m,3H),5.13–4.98(m,3H),4.82–4.59(m,5H),4.56–4.14(m,8H),4.13–3.89(m,2H),3.74–3.54(m,1H),3.51–3.42(m,3H),2.78–2.62(m,3H),2.39–2.26(m,2H),2.23–2.10(m,1H),1.70–1.40(m,8H),1.36–1.22(m,9H),1.03–0.93(m,6H)。
8.LP8的合成
LP8的合成如下所示：
1-羟基-N-[(4-甲氧基苯基)甲基]-N-甲基环丙烷-1-甲酰胺的合成：
将HOBT(1.99g，14.692mmol)和EDCI(2.82g，14.692mmol)添加至1-羟基环丙烷-1-甲酸(1g，9.795mmol)在DMF(10mL)中的搅拌溶液中。将所得混合物在25℃搅拌30min。然后将[(4-甲氧基苯基)甲基](甲基)胺(1.48g，9.795mmol)和DIEA(3.80g，29.385mmol)添加至所得混合物中。将所得混合物在25℃搅拌2h。将所得混合物用EtOAc稀释并用水洗涤。将有机层在减压下浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(用PE/EtOAc(1/2)洗脱)纯化，以得到1.8g呈白色固体的1-羟基-N-[(4-甲氧基苯基)甲基]-N-甲基环丙烷-1-甲酰胺。LC-MS(ESI):236.1[M+H]+。
1-({[(4-甲氧基苯基)甲基](甲基)氨基}甲基)环丙烷-1-醇的合成：
将THF中的LiAlH4(7.65mL，7.650mmol)添加至1-羟基-N-[(4-甲氧基苯基)甲基]-N-甲基环丙烷-1-甲酰胺(1.8g，7.650mmol)在THF(10mL)中的搅拌溶液中。将所得混合物在60℃搅拌2h。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(用CH2Cl2/MeOH(10/1)洗脱)纯化，以得到780mg呈淡黄色油状物的1-({[(4-甲氧基苯基)甲基](甲基)氨基}甲基)环丙烷-1-醇。LC-MS(ESI):222.1[M+H]+。
1-[(甲基氨基)甲基]环丙烷-1-醇的合成
将Pd/C(220mg)添加至1-({[(4-甲氧基苯基)甲基](甲基)氨基}甲基)环丙烷-1-醇(1.1g，4.971mmol)在MeOH(10mL)中的搅拌溶液中。将所得混合物在氢气气氛下在25℃搅拌2h。将所得混合物过滤。将滤液在减压下浓缩。将残余物通过SCX纯化，以获得214mg呈淡棕色油状物的1-[(甲基氨基)甲基]环丙烷-1-醇。LC-MS(ESI):102.0[M+H]+。
N-[(1-羟基环丙基)甲基]-N-甲基氨基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲基酯的合成
将碳酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲基4-硝基苯基酯(1.10g，1.977mmol)和DIEA(511.12mg，3.954mmol)添加至1-[(甲基氨基)甲基]环丙烷-1-醇(200mg，1.977mmol)在DMF(10mL)中的搅拌溶液中。将所得混合物在25℃搅拌14h。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过制备型TLC(DCM/MeOH10/1)纯化，以得到504mg呈淡黄色油状物的N-[(1-羟基环丙基)甲基]-N-甲基氨基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲基酯。LC-MS(ESI):521.2[M+H]+。
碳酸1-({[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基](甲基)氨基}甲基)环丙基4-硝基苯基酯的合成
将{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲基4-硝基苯基氯甲酸酯(174.22mg，0.864mmol)添加至N-[(1-羟基环丙基)甲基]-N-甲基氨基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲基酯(300mg，0.576mmol)在DCM(10mL)中的搅拌溶液中。然后在0℃将吡啶(68.37mg，0.864mmol)添加至所得混合物中。将所得混合物在25℃搅拌14h。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(用PE/EtOAc(1/3)洗脱)纯化，以得到303mg呈白色固体的碳酸1-({[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基](甲基)氨基}甲基)环丙基4-硝基苯基酯。LC-MS(ESI):686.3[M+H]+。
(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸1-({[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基](甲基)氨基}甲基)环丙基酯的合成：
在-78℃，将LiHMDS(0.60mL，0.600mmol)添加至化合物1(75mg，0.100mmol)在THF(3mL)中的搅拌溶液中。将所得混合物在氮气气氛下在-78℃搅拌30min。然后将碳酸1-({[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基](甲基)氨基}甲基)环丙基4-硝基苯基酯(68.89mg，0.100mmol)添加至所得混合物中。将所得混合物在氮气气氛下在1小时内缓慢加温至25℃。将反应用AcOH淬灭。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过制备型TLC(EtOAc(1％TEA)/MeOH 3/1)纯化，以得到55mg呈白色固体的(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸1-({[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基](甲基)氨基}甲基)环丙基酯。LC-MS(ESI):1293.3[M+H]+。
(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸1-({[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基](甲基)氨基}甲基)环丙基酯的合成
在0℃，将HCOOH(2mL)添加至(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023 ,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸1-({[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基](甲基)氨基}甲基)环丙基酯(55mg，0.042mmol)在DCM(2mL)中的搅拌溶液中。将所得混合物在0℃搅拌1h。将所得混合物在减压下浓缩，以获得呈无色油状物的(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04, 8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸1-({[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基](甲基)氨基}甲基)环丙基酯的粗制产物。LC-MS(ESI):1193.3[M+H]+。
(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸1-({[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基](甲基)氨基}甲基)环丙基酯(LP8)的合成
将6-(2,5-二氧代吡咯-1-基)己酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(12.92mg，0.042mmol)和DIEA(16.25mg，0.126mmol)添加至(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07, 12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸1-({[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基](甲基)氨基}甲基)环丙基酯(50mg，0.042mmol)在DMF(2mL)中的搅拌溶液中。将所得混合物在25℃搅拌14h。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过制备型TLC(EtOAc(1％TEA)/MeOH 3/1)和制备型HPLC用以下条件纯化(柱：XBridge Prep OBD C18柱，19x250 mm，5μm；流动相A：水(50mmolNH4HCO2)，流动相B：MECN；流速：25mL/min；梯度：在10min内25％ B至35％ B，35％ B；波长：220/254nm)，以得到12.5mg呈白色固体的(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019, 24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸1-({[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基](甲基)氨基}甲基)环丙基酯(LP8)。
LC-MS(ESI):1386.40[M+H]+。
1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ9.03–8.80(m,1H),8.80–8.57(m,2H),8.39–8.20(m,1H),8.18–8.02(m,1H),7.68–7.50(m,2H),7.34–7.21(m,2H),6.82–6.73(m,2H),6.59–6.24(m,2H),6.14–5.86(m,1H),5.85–5.28(m,3H),5.12–4.98(m,2H),4.84–4.72(m,2H),4.71–4.55(m,3H),4.53–4.35(m,5H),4.23–4.10(m,1H),4.12–4.02(m,1H),3.99–3.88(m,2H),3.77–3.55(m,1H),3.54–3.44(m,3H),3.44–3.37(m,1H),2.96–2.79(m,3H),2.36–2.22(m,2H),2.18–2.00(m,1H),1.73–1.51(m,4H),1.51–1.41(m,3H),1.37–1.24(m,2H),1.23–1.10(m,1H),1.05–0.94(m,6H),0.94–0.60(m,3H)。
9.LP9的合成
LP9的合成如下所示：
N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酸叔丁基酯的合成
将2-乙氧基-1,2-二氢喹啉-1-甲酸乙基酯(32.13g，129.918mmol)和(2S)-2-[(2S)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-3-甲基丁酰胺基]丙酸(18.73g，64.959mmol)添加至对氨基苄醇(8g，64.959mmol)在MeOH(5mL)/DCM(30mL)中的搅拌溶液中。将所得混合物在25℃搅拌2h。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(用CH2Cl2/MeOH(10/1)洗脱)纯化，以得到23g呈淡黄色固体的N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酸叔丁基酯。LC-MS(ESI):394.2[M+H]+。
碳酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲基4-硝基苯基酯的合成
将4-硝基苯基氯甲酸酯(768.37mg，3.811mmol)和吡啶(301.54mg，3.811mmol)添加至N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酸叔丁基酯(1g，2.541mmol)在DCM(20mL)中的搅拌溶液中。将所得混合物在25℃搅拌2h。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(用PE/EtOAc(1/1)洗脱)纯化，以得到1.4g呈白色固体的碳酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲基4-硝基苯基酯。LC-MS(ESI):559.2[M+H]+。
(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲基酯的合成
将LiHMDS(0.40mL，0.402mmol)添加至化合物1(50mg，0.067mmol)在THF(2mL)中的搅拌溶液中。将所得混合物在-78℃搅拌30min。然后将碳酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲基4-硝基苯基酯(37.41mg，0.067mmol)添加至所得混合物中。将所得混合物在氮气气氛下在-78℃至25℃搅拌2h。将反应用AcOH淬灭。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过制备型TLC(EtOAc(1％TEA)/MeOH 3/1)纯化，以得到45mg呈白色固体的(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019, 24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲基酯。LC-MS(ESI):1166.2[M+H]+。
(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲基酯的合成
将TFA(1mL)添加至(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲基酯(45mg，0.039mmol)在DCM(6mL)中的搅拌溶液中。将所得混合物在0℃搅拌1h。将所得混合物在减压下浓缩，以获得呈无色油状物的(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲基酯的粗制产物。LC-MS(ESI):1066.2[M+H]+。
(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲基酯(LP9)的合成
将DIEA(24.86mg，0.190mmol)和6-(2,5-二氧代吡咯-1-基)己酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(11.86mg，0.038mmol)添加至(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019, 24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲基酯(41mg，0.038mmol)在DMF(2mL)中的搅拌溶液中。将所得混合物在25℃搅拌14h。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过制备型TLC(CH2Cl2(1％TEA)/MeOH 8/1)，然后是制备型TLC(EtOAc(1％TEA)/MeOH 3/1)纯化。将粗制产物通过制备型HPLC用以下条件纯化(柱：XBridge Prep Phenyl OBD柱，19x250 mm，5μm；流动相A：水(50mmolHCO2NH4)，流动相B：MeCN；流速：25mL/min；梯度：在15min内20％ B至40％B，40％ B；波长：254nm)，以得到5.1mg呈白色固体的(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04, 8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲基酯(LP9)。
LC-MS(ESI):1259.45[M+H]+。
1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ8.92(s,1H),8.77–8.69(m,2H),8.31(s,1H),8.15(s,1H),7.53(d,J＝8.25Hz,2H),7.23(d,J＝8.00Hz,2H),6.85–6.67(m,2H),6.52–6.41(m,1H),6.39–6.25(m,1H),6.09–5.40(m,4H),5.30–5.15(m,2H),5.09–4.95(m,2H),4.66–4.56(m,3H),4.55–4.45(m,2H),4.44–4.34(m,2H),4.22–4.13(m,1H),4.12–4.01(m,1H),4.00–3.92(m,1H),3.72–3.55(m,1H),3.52–3.43(m,2H),2.36–2.18(m,2H),2.15–2.04(m,1H),1.72–1.53(m,5H),1.48–1.40(m,3H),1.36–1.25(m,4H),1.04–0.90(m,6H)。
10.LP10的合成
LP10的合成如下所示：
(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸2-氨基乙基酯的合成
在室温，向(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸2-{双[(叔丁氧基)羰基]氨基}乙基酯(40mg，0.039mmol)在DCM(2mL)中的混合物中添加TEA(19.57mg，0.195mmol)和TMSOTf(60.19mg，0.273mmol)。将所得混合物在室温搅拌1h。将所得混合物在减压下浓缩。粗制产物无需进一步纯化即可直接用于下一步骤。LC-MS(ESI):834.2[M+H]+。
(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸2-{[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基]氨基}乙基酯(LP10)的合成
在室温，向(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸2-氨基乙基酯(32mg，0.038mmol)和碳酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[6-(2,5-二氧代吡咯-1-基)己酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲基4-硝基苯基酯(25.01mg，0.038mmol)在DMF(2mL)中的混合物中添加DIEA(24.81mg，0.190mmol)。将所得混合物在室温搅拌过夜。将所得混合物在真空下浓缩。将残余物通过制备型TLC(EtOAc/MeOH 3:1)和制备型HPLC用以下条件纯化(柱：XBridge Prep Phenyl OBD柱，19*250mm，5μm；流动相A：水(50mmol/LHCO2NH4)，流动相B：MeCN；流速：25mL/min；梯度：在10min内25％ B至50％ B，50％ B；波长：254nm)，以得到呈白色固体的(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸2-{[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基]氨基}乙基酯(LP10)(7.6mg)。
LC-MS(ESI):1346.45[M+H]+。
1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ8.92(s,2H),8.73(m,1H),8.19(m,2H),7.57(m,2H),7.30(m,2H),6.79(s,2H),6.39(m,1H),6.31(m,1H),6.05(s,1H)5.92(s,1H),5.78(s,1H),5.58–5.45(m,2H),5.02(m,2H),4.99(m,3H),4.61(m,5H),4.55–4.36(m,2H),4.36(m,2H),4.21(m,1H),4.14(m,1H),4.04(m,2H),3.76(m,1H),3.52(m,1H),3.55-3.40(m,2H),3.15(m,3H),2.29(m,2H),2.09(m,1H),1.94(m,4H),1.61(m,3H),1.37–1.18(m,2H),0.98(m,6H)。
11.LP11的合成
LP11的合成如下所示：
N-{2-[2-(2-{[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}乙氧基)乙氧基]乙基}氨基甲酸叔丁基酯的合成
向(2S)-2-氨基-N-[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]-3-甲基丁酰胺(400mg，1.363mmol)、3-(2-{2-[(叔丁氧基羰基)氨基]乙氧基}乙氧基)丙酸(378.12mg，1.363mmol)、HATU(570.29mg，1.499mmol)在DMF(3mL)中的溶液中添加DIEA(528.68mg，4.089mmol)。将溶液在室温搅拌2h。将所得混合物用EtOAc稀释并用H2O洗涤。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过制备型TLC(CH2Cl2/MeOH 8:1)纯化，以得到呈白色固体的N-{2-[2-(2-{[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}乙氧基)乙氧基]乙基}氨基甲酸叔丁基酯(420mg)。LC-MS(ESI):553.3[M+H]+。
(2S)-2-{3-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]丙酰胺基}-N-[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]-3-甲基丁酰胺的合成
在室温，将N-{2-[2-(2-{[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}乙氧基)乙氧基]乙基}氨基甲酸叔丁基酯(420mg，0.760mmol)在DCM(1.5mL)中的溶液用TFA(1.5mL)处理。将所得混合物在室温搅拌0.5h。将混合物在减压下浓缩。将残余物溶解于MeOH(2mL)/H2O(2mL)/THF(2mL)中。将K2CO3(577.66mg，4.180mmol)添加至上述溶液中并在室温搅拌一小时。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过制备型TLC(CH2Cl2/MeOH 4:1)纯化，以得到呈淡黄色固体的(2S)-2-{3-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]丙酰胺基}-N-[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]-3-甲基丁酰胺(300mg)。LC-MS(ESI):453.3[M+H]+。
(2S)-2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-6-(2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十六烷-26-酰胺基)己酸的合成
向(2S)-6-氨基-2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}己酸(287.61mg，1.168mmol)和2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十六烷-26-酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(350mg，0.687mmol)在DMF(3.00mL)中的溶液中添加DIEA(266.33mg，2.061mmol)。将所得混合物在室温搅拌2h。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(用CH2Cl2/MeOH(5:1)洗脱)纯化，以得到呈无色油状物的(2S)-2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-6-(2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十六烷-26-酰胺基)己酸(410mg)。LC-MS(ESI):641.4[M+H]+。
N-[(1S)-1-({2-[2-(2-{[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}乙氧基)乙氧基]乙基}氨基甲酰基)-5-(2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十六烷-26-酰胺基)戊基]氨基甲酸叔丁基酯的合成
在室温，向(2S)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-6-(2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十六烷-26-酰胺基)己酸(290mg，0.453mmol)在DMF(3mL)中的溶液中添加HOBT(91.73mg，0.679mmol)、EDCI(130.14mg，0.679mmol)。将所得混合物在室温搅拌0.5h。在室温，向上述溶液中添加(2S)-2-{3-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]丙酰胺基}-N-[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]-3-甲基丁酰胺(204.82mg，0.453mmol)和DIEA(175.48mg，1.359mmol)。将所得混合物在室温搅拌一小时。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过制备型TLC(CH2Cl2/MeOH 5:1)纯化，以得到呈黄色油状物的N-[(1S)-1-({2-[2-(2-{[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}乙氧基)乙氧基]乙基}氨基甲酰基)-5-(2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十六烷-26-酰胺基)戊基]氨基甲酸叔丁基酯(437mg)。LC-MS(ESI):1075.6[M+H]+。
N-[(5S)-5-氨基-5-({2-[2-(2-{[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}乙氧基)乙氧基]乙基}氨基甲酰基)戊基]-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十六烷-26-酰胺的合成
向N-[(1S)-1-({2-[2-(2-{[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}乙氧基)乙氧基]乙基}氨基甲酰基)-5-(2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十六烷-26-酰胺基)戊基]氨基甲酸叔丁基酯(430mg，0.400mmol)在DCM(2mL)中的溶液中添加TFA(2mL)。将所得混合物在室温搅拌0.5h。将混合物在减压下浓缩。将残余物溶解于MeOH(2mL)/H2O(2mL)/THF(2mL)中。将K2CO3(221.07mg，1.600mmol)添加至上述溶液中并在室温搅拌一小时。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过制备型TLC(DCM/MeOH 5:1)纯化，以得到呈黄色油状物的N-[(5S)-5-氨基-5-({2-[2-(2-{[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}乙氧基)乙氧基]乙基}氨基甲酰基)戊基]-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十六烷-26-酰胺(305mg)。LC-MS(ESI):975.6[M+H]+。
N-[(5S)-5-(3-{2-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基]乙氧基}丙酰胺基)-5-({2-[2-(2-{[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}乙氧基)乙氧基]乙基}氨基甲酰基)戊基]-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十六烷-26-酰胺的合成
向N-[(5S)-5-氨基-5-({2-[2-(2-{[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}乙氧基)乙氧基]乙基}氨基甲酰基)戊基]-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十六烷-26-酰胺(305mg，0.313mmol)和3-{2-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]乙氧基}丙酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(132.98mg，0.376mmol)在DMF(3.5mL)中的溶液中添加DIEA(80.85mg，0.626mmol)。将所得混合物在室温搅拌2h。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过制备型TLC(DCM/MeOH 5:1)纯化，以得到呈淡黄色固体的N-[(5S)-5-(3-{2-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基]乙氧基}丙酰胺基)-5-({2-[2-(2-{[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}乙氧基)乙氧基]乙基}氨基甲酰基)戊基]-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十六烷-26-酰胺(247mg)。LC-MS(ESI):1214.7[M+H]+。
碳酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[3-(2-{2-[(2S)-2-(3-{2-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基]乙氧基}丙酰胺基)-6-(2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十六烷-26-酰胺基)己酰胺基]乙氧基}乙氧基)丙酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲基4-硝基苯基酯的合成
向N-[(5S)-5-(3-{2-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基]乙氧基}丙酰胺基)-5-({2-[2-(2-{[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}乙氧基)乙氧基]乙基}氨基甲酰基)戊基]-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十六烷-26-酰胺(270mg，0.222mmol)在DCM(3.5mL)中的溶液中添加4-硝基苯基氯甲酸酯(134.44mg，0.666mmol)和吡啶(52.76mg，0.666mmol)。将所得混合物在室温搅拌2h。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过制备型TLC(DCM/MeOH 8:1)纯化，以得到呈淡黄色油状物的碳酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[3-(2-{2-[(2S)-2-(3-{2-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基]乙氧基}丙酰胺基)-6-(2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十六烷-26-酰胺基)己酰胺基]乙氧基}乙氧基)丙酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲基4-硝基苯基酯(160mg)。LC-MS(ESI):1379.7[M+H]+。
(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸2-{[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[3-(2-{2-[(2S)-2-(3-{2-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基]乙氧基}丙酰胺基)-6-(2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十六烷-26-酰胺基)己酰胺基]乙氧基}乙氧基)丙酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基](甲基)氨基}乙基酯(LP11)的合成
向碳酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[3-(2-{2-[(2S)-2-(3-{2-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基]乙氧基}丙酰胺基)-6-(2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十六烷-26-酰胺基)己酰胺基]乙氧基}乙氧基)丙酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲基4-硝基苯基酯(70mg，0.051mmol)和(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023 ,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸2-(甲基氨基)乙基酯(43.01mg，0.051mmol)在DMF(3mL)中的溶液中添加DIEA(45.91mg，0.357mmol)。将所得混合物在室温搅拌14h。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过制备型TLC(DCM(1％TEA)/MeOH 6:1)和制备型HPLC(柱：XBridge Prep OBD C18柱，19x250 mm，5μm；流动相A：水(50mmolHCO2NH4)，流动相B：MeCN；流速：25mL/min；梯度：在10min内25％ B至35％ B，35％B；波长：254nm)纯化，以得到呈白色固体的(1R,3R,15Z,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019, 24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸2-{[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[3-(2-{2-[(2S)-2-(3-{2-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基]乙氧基}丙酰胺基)-6-(2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十六烷-26-酰胺基)己酰胺基]乙氧基}乙氧基)丙酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基](甲基)氨基}乙基酯(LP11)(6mg)。
LC-MS(ESI):2087.77[M+H]+。
1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ8.91(s,1H),8.84–8.56(m,2H),8.13(s,1H),7.66–7.55(m,2H),7.32(d,J＝8.2Hz,1H),7.21(d,J＝8.1Hz,1H),6.83(s,2H),6.57–6.25(m,2H),6.09–5.88(m,1H),5.84–5.04(m,5H),4.73–4.48(m,6H),4.47–4.32(m,4H),4.30–4.13(m,1H),4.10–3.91(m,2H),3.84–3.69(m,7H),3.69–3.47(m,50H),3.26–3.14(m,3H),2.85–2.69(m,3H),2.63–2.41(m,7H),2.15(s,2H),1.90–1.76(m,1H),1.73–1.60(m,1H),1.56–1.26(m,10H),1.09–0.92(m,6H)。
12.LP12的合成
LP12的合成如下所示：
1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十七烷-27-酰胺的合成
将(2S)-2-氨基-N-[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]-3-甲基丁酰胺(100mg，0.341mmol)、1-(2,5-二氧代吡咯-1-基)-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十七烷-27-酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(210.87mg，0.341mmol)和DIEA(88.11mg，0.682mmol)在DMF(3mL)中的溶液在室温搅拌2h。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过制备型TLC(DCM/MeOH 8:1)纯化，以得到呈白色固体的1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十七烷-27-酰胺(180mg)。LC-MS(ESI):797.4[M+H]+。
碳酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十七烷-27-酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲基4-硝基苯基酯的合成
在室温，将吡啶(44.67mg，0.565mmol)添加至1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十七烷-27-酰胺(180mg，0.226mmol)和4-硝基苯基氯甲酸酯(113.82mg，0.565mmol)在DCM(2mL)中的溶液中。将溶液在室温搅拌3h。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过制备型TLC(DCM/IPA 10:1)纯化，以得到呈淡黄色油状物的碳酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十七烷-27-酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲基4-硝基苯基酯(109mg)。LC-MS(ESI):962.4[M+H]+。
(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸2-{[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十七烷-27-酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基](甲基)氨基}乙基酯(LP12)的合成
在室温，将DIEA(47.02mg，0.365mmol)添加至(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04, 8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸2-(甲基氨基)乙基酯(61.68mg，0.073mmol)和碳酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十七烷-27-酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲基4-硝基苯基酯(70mg，0.073mmol)在DMF(2.5mL)中的溶液中。将溶液在室温搅拌3h。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过制备型TLC(DCM/MeOH 6:1)和制备型HPLC(柱：XBridge Prep OBD C18柱，19x250 mm，5μm；流动相A：水(50mmolHCO2NH4)，流动相B：MeCN；流速：25mL/min；梯度：在10min内25％ B至35％ B，35％ B；波长：220/254nm)纯化，以得到呈白色固体的(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸2-{[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十七烷-27-酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基](甲基)氨基}乙基酯(LP12)(23.5mg)。
LC-MS(ESI):1671.70[M+H]+。
1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ8.92(s,1H),8.82–8.66(m,2H),8.30–7.99(m,2H),7.71–7.53(m,2H),7.37–7.28(m,1H),7.26–7.14(m,1H),6.84(s,2H),6.56–6.22(m,2H),6.08–5.86(m,1H),5.84–5.23(m,4H),5.13–4.94(m,2H),4.76–4.40(m,7H),4.37–4.13(m,3H),4.09–3.89(m,2H),3.81–3.74(m,2H),3.72–3.68(m,2H),3.67–3.56(m,24H),2.83–2.69(m,3H),2.65–2.55(m,2H),2.30–2.04(m,1H),1.54–1.40(m,3H),1.08–0.91(m,6H)。
13.LP13的合成
LP13的合成如下所示：
(2S)-2-(3-{2-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基]乙氧基}丙酰胺基)-N-[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]-3-甲基丁酰胺的合成
在0℃，向(2S)-2-氨基-N-[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]-3-甲基丁酰胺(200mg，0.682mmol)和3-{2-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]乙氧基}丙酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(241.55mg，0.682mmol)在DMF(5mL)中的混合物中添加DIEA(264.34mg，2.046mmol)。将所得混合物在室温搅拌2h。将所得混合物在真空下浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(用DCM/MeOH(10:1)洗脱)纯化，以得到呈白色固体的(2S)-2-(3-{2-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基]乙氧基}丙酰胺基)-N-[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]-3-甲基丁酰胺(170mg)。LC-MS(ESI):533.3[M+H]+。
碳酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-(3-{2-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基]乙氧基}丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲基4-硝基苯基酯的合成
在0℃，向(2S)-2-(3-{2-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基]乙氧基}丙酰胺基)-N-[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]-3-甲基丁酰胺(150mg，0.282mmol)和4-硝基苯基氯甲酸酯(113.53mg，0.564mmol)在DCM(5mL)中的混合物中添加吡啶(33.42mg，0.423mmol)。将所得混合物在25℃搅拌4h。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过制备型TLC(CH2Cl2/IPA 10:1)纯化，以得到呈白色固体的碳酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-(3-{2-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基]乙氧基}丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲基4-硝基苯基酯(70mg)。LC-MS(ESI):698.4[M+H]+。
(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸2-{[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-(3-{2-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基]乙氧基}丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基](甲基)氨基}乙基酯(LP13)的合成
在室温，向碳酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-(3-{2-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基]乙氧基}丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲基4-硝基苯基酯(36mg，0.052mmol)和(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸2-(甲基氨基)乙基酯(43.74mg，0.052mmol)在DMF(2mL)中的混合物中添加DIEA(33.34mg，0.260mmol)。将所得混合物在室温搅拌过夜。将所得混合物在真空下浓缩。将残余物通过制备型TLC(EtOAc/MeOH 3:1)和制备型HPLC用以下条件纯化(柱：XBridge Prep Phenyl OBD柱，19x250 mm，5μm；流动相A：水(50mmol/LHCO2NH4)，流动相B：MeCN；流速：25mL/min；梯度：在15min内35％ B至60％ B，60％ B；波长：254nm)，以得到呈白色固体的(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸2-{[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-(3-{2-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基]乙氧基}丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基](甲基)氨基}乙基酯(LP13)(3.5mg)。
LC-MS(ESI):1406.40[M+H]+。
1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ8.92(s,1H),8.72(m,2H),8.31–8.02(m,2H),7.60(m,2H),7.31(m,1H),7.21(m,1H),6.82(s,2H),6.43(m,1H),6.32(m,1H),6.02(s,1H),5.84(m,1H),5.51(m,1H),5.02(s,2H),4.92(m,4H),4.62(m,4H),4.54–4.45(m,3H),4.42(s,2H),4.35–4.13(m,2H),4.09(m,4H),3.84(m,4H),3.79–3.61(m,3H),3.42(m,4H),2.9(m,2H),2.73(m,3H),2.55(m,2H),2.24–2.07(m,1H),1.50–1.39(m,3H),1.00(m,6H)。
14.LP14的合成
LP14的合成如下所示：
N-[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-{[4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酸叔丁基酯的合成
在室温，将2-乙氧基-1,2-二氢喹啉-1-甲酸乙基酯(2.64g，10.682mmol)添加至(2S)-2-[(2S)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-3-甲基丁酰胺基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊酸(2g，5.341mmol)和对氨基苄醇(657.81mg，5.341mmol)在DCM(12mL)和MeOH(2mL)中的混合物中。将所得混合物在25℃搅拌2h。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(用DCM/MeOH(5:1)洗脱)纯化，以得到呈淡粉色固体的N-[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-{[4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酸叔丁基酯(1.8g)。LC-MS(ESI):480.5[M+H]+。
(2S)-2-[(2S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基]-5-(氨基甲酰基氨基)-N-[4-(羟基甲基)苯基]戊酰胺的合成
在0℃，将TFA(10mL)添加至N-[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-{[4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酸叔丁基酯(1.8g，3.753mmol)在DCM(10mL)中的混合物中。将所得混合物在25℃搅拌30min。将所得混合物在减压下浓缩。然后在0℃，将K2CO3(2.07g，15.012mmol)添加至上述中间体在MeOH(5mL)、THF(5mL)和H2O(5mL)中的混合物中。将所得混合物在25℃搅拌2h。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(用DCM/MeOH(3:1)洗脱)纯化，以得到呈白色固体的(2S)-2-[(2S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基]-5-(氨基甲酰基氨基)-N-[4-(羟基甲基)苯基]戊酰胺(1.3g)。LC-MS(ESI):380.4[M+H]+。
N-[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-{[4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-6-(2,5-二氧代吡咯-1-基)己酰胺的合成
在25℃，将DIEA(1.33g，10.278mmol)添加至(2S)-2-[(2S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基]-5-(氨基甲酰基氨基)-N-[4-(羟基甲基)苯基]戊酰胺(1.3g，3.426mmol)和6-(2,5-二氧代吡咯-1-基)己酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(1.06g，3.426mmol)在DMF(5mL)中的混合物中。将所得混合物在25℃搅拌3h。将残余物通过反相快速色谱法用以下条件纯化：柱，C18硅胶；流动相A：水(0.1％ FA)，流动相B：MeCN，在30min内10％至35％梯度；检测器，UV254nm。这产生呈白色固体的N-[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-{[4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-6-(2,5-二氧代吡咯-1-基)己酰胺(1.5g)。LC-MS(ESI):573.6[M+H]+。
碳酸{4-[(2S)-5-(氨基甲酰基氨基)-2-[(2S)-2-[6-(2,5-二氧代吡咯-1-基)己酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]戊酰胺基]苯基}甲基4-硝基苯基酯的合成
在25℃，将吡啶(82.88mg，1.048mmol)添加至N-[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-{[4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-6-(2,5-二氧代吡咯-1-基)己酰胺(300mg，0.524mmol)和4-硝基苯基氯甲酸酯(211.18mg，1.048mmol)在DCM(5mL)中的混合物中。将所得混合物在25℃搅拌14h。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过反相快速色谱法用以下条件纯化：柱，C18硅胶；流动相A：水(0.1％ FA)，流动相B：MeCN，在20min内20％至50％梯度；检测器，UV 254nm。这产生呈黄色固体的碳酸{4-[(2S)-5-(氨基甲酰基氨基)-2-[(2S)-2-[6-(2,5-二氧代吡咯-1-基)己酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]戊酰胺基]苯基}甲基4-硝基苯基酯(110mg)。LC-MS(ESI):738.7[M+H]+
(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸2-{[({4-[(2S)-5-(氨基甲酰基氨基)-2-[(2S)-2-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]戊酰胺基]苯基}甲氧基)羰基](甲基)氨基}乙基酯(LP14)的合成
在氮气气氛下，将DIEA(26.28mg，0.205mmol)添加至碳酸{4-[(2S)-5-(氨基甲酰基氨基)-2-[(2S)-2-[6-(2,5-二氧代吡咯-1-基)己酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]戊酰胺基]苯基}甲基4-硝基苯基酯(30mg，0.041mmol)和(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07, 12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸2-(甲基氨基)乙基酯(34.47mg，0.041mmol)在DMF(1mL)中的混合物中。将所得混合物在氮气气氛下在25℃搅拌3h。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过制备型TLC(EtOAc(1％ TEA)/MeOH 4:1)纯化。将粗制产物(30mg)通过制备型HPLC用以下条件纯化(柱：XBridge Prep OBD C18柱，19x250 mm，5μm；流动相A：水(50mmol/L HCO2NH4)，流动相B：MeCN；流速：25mL/min；梯度：在10min内20％ B至30％ B，30％ B；波长：220nm)，以得到呈白色固体的(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸2-{[({4-[(2S)-5-(氨基甲酰基氨基)-2-[(2S)-2-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]戊酰胺基]苯基}甲氧基)羰基](甲基)氨基}乙基酯(LP14)(6.3mg)。
LC-MS(ESI):1446.45[M+H]+。
1H NMR(300MHz,甲醇-d4)δ8.95–8.68(m,3H),8.57–8.53(m,3H),8.09(s,1H),7.64–7.57(m,2H),7.39–7.16(m,2H),6.80(s,1H),6.50–6.24(m,2H),6.11–5.66(m,2H),5.62–5.25(m,2H),4.36–4.11(m,3H),4.10–3.91(m,2H),3.67(s,2H),3.58–3.44(m,3H),2.88(s,1H),2.76(d,J＝15.0Hz,2H),2.31–2.20(m,3H),2.14–1.73(m,4H),1.72–1.49(m,8H),1.07–0.78(m,16H)。
15.LP15的合成
LP15的合成如下所示：
(2S)-2-[(2S)-2-{[(苄氧基)羰基]氨基}-3-甲基丁酰胺基]-6-[(叔丁氧基羰基)氨基]己酸的合成
在室温，向(2S)-2-{[(苄氧基)羰基]氨基}-3-甲基丁酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(1g，2.871mmol)和(2S)-2-氨基-6-[(叔丁氧基羰基)氨基]己酸(707.06mg，2.871mmol)在DMF(5mL)中的混合物中添加DIEA(1.11g，8.613mmol)。将所得混合物在室温搅拌过夜。将溶液通过反相快速色谱法用以下条件纯化：柱：C18；流动相A：水(0.5％FA)，流动相B：MeCN；梯度：在30min内20％ B至50％ B；220/254nm。这产生呈灰白色固体的(2S)-2-[(2S)-2-{[(苄氧基)羰基]氨基}-3-甲基丁酰胺基]-6-[(叔丁氧基羰基)氨基]己酸(1g)。LC-MS(ESI):480.6[M+H]+
N-[(1S)-1-{[(1S)-5-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-1-{[4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}戊基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酸苄基酯的合成
向(2S)-2-[(2S)-2-{[(苄氧基)羰基]氨基}-3-甲基丁酰胺基]-6-[(叔丁氧基羰基)氨基]己酸(1g，2.085mmol)和对氨基苄醇(256.80mg，2.085mmol)在DCM(6mL)/MeOH(1mL)中的混合物中添加2-乙氧基-1,2-二氢喹啉-1-甲酸乙基酯(515.64mg，2.085mmol)。将所得混合物在室温搅拌过夜。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(用DCM/MeOH(10:1)洗脱)纯化，以得到呈白色固体的N-[(1S)-1-{[(1S)-5-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-1-{[4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}戊基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酸苄基酯(1g)。LC-MS(ESI):585.3[M+H]+
N-[(5S)-5-[(2S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基]-5-{[4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}戊基]氨基甲酸叔丁基酯的合成
在室温，向N-[(1S)-1-{[(1S)-5-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-1-{[4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}戊基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酸苄基酯(1g，1.710mmol)在THF(10mL)中的混合物中添加Pd/C(200mg)。将所得混合物在氢气气氛下在室温搅拌过夜。将所得混合物过滤，将滤饼用THF洗涤。将滤液在减压下浓缩。这产生呈绿色固体的N-[(5S)-5-[(2S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基]-5-{[4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}戊基]氨基甲酸叔丁基酯(800mg)。LC-MS(ESI):451.3[M+H]+。
N-[(5S)-5-[(2S)-2-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]-5-{[4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}戊基]氨基甲酸叔丁基酯的合成
在室温，向N-[(5S)-5-[(2S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基]-5-{[4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}戊基]氨基甲酸叔丁基酯(800mg，1.775mmol)和6-(2,5-二氧代吡咯-1-基)己酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(68.42mg，0.222mmol)在DMF(5mL)中的混合物中添加DIEA(688.43mg，5.325mmol)。将所得混合物在室温搅拌1h。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(用DCM/MeOH(10:1)洗脱)纯化，以得到呈灰白色固体的N-[(5S)-5-[(2S)-2-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]-5-{[4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}戊基]氨基甲酸叔丁基酯(650mg)。LC-MS(ESI):644.5[M+H]+。
碳酸{4-[(2S)-6-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-2-[(2S)-2-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]己酰胺基]苯基}甲基4-硝基苯基酯的合成
在室温，向N-[(5S)-5-[(2S)-2-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]-5-{[4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}戊基]氨基甲酸叔丁基酯(100mg，0.155mmol)和4-硝基苯基氯甲酸酯(62.62mg，0.310mmol)在DCM(2mL)中的混合物中添加吡啶(18.43mg，0.232mmol)。将所得混合物在室温搅拌4h。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(用PE/EtOAc(1:3)洗脱)纯化，以得到呈白色固体的碳酸{4-[(2S)-6-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-2-[(2S)-2-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]己酰胺基]苯基}甲基4-硝基苯基酯(60mg)。LC-MS(ESI):809.5[M+H]+。
(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸2-{[({4-[(2S)-6-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-2-[(2S)-2-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]己酰胺基]苯基}甲氧基)羰基](甲基)氨基}乙基酯的合成
在室温，向碳酸{4-[(2S)-6-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-2-[(2S)-2-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]己酰胺基]苯基}甲基4-硝基苯基酯(60mg，0.074mmol)和(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸2-(甲基氨基)乙基酯(62.88mg，0.074mmol)在DMF(2mL)中的混合物中添加DIEA(47.94mg，0.370mmol)。将所得混合物在室温搅拌4h。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过制备型TLC(DCM/MeOH 5:1)纯化，以得到呈白色固体的(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸2-{[({4-[(2S)-6-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-2-[(2S)-2-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]己酰胺基]苯基}甲氧基)羰基](甲基)氨基}乙基酯(30mg)。LC-MS(ESI):1517.5[M+H]+。
(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸2-{[({4-[(2S)-6-氨基-2-[(2S)-2-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]己酰胺基]苯基}甲氧基)羰基](甲基)氨基}乙基酯(LP15)的合成
在室温，向(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸2-{[({4-[(2S)-6-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-2-[(2S)-2-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]己酰胺基]苯基}甲氧基)羰基](甲基)氨基}乙基酯(40mg，0.026mmol)在DCM(2mL)中的混合物中添加甲酸(2mL)。将所得混合物在室温搅拌1h。将所得混合物在减压下浓缩。将粗制产物通过制备型HPLC用以下条件纯化(柱：XBridge Prep OBD C18柱，19*250mm，5μm；流动相A：水(50mmol/L HCO2NH4)，流动相B：MeCN；流速：25mL/min；梯度：在10min内20％ B至30％ B，30％ B；波长：254nm)，以得到呈白色固体的(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019, 24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸2-{[({4-[(2S)-6-氨基-2-[(2S)-2-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]己酰胺基]苯基}甲氧基)羰基](甲基)氨基}乙基酯(LP15)(10.6mg)。
LC-MS(ESI):1418.65[M+H]+。
1H NMR(400MHz甲醇-d4)δ8.94–8.43(m,3H),8.28–7.85(m,2H),7.70–7.39(m,2H),7.32–7.00(m,2H),6.81(m,2H),6.30(s,1H),6.05–5.75(m,4H),5.70–5.27(m,1H),4.69–4.54(m,5H),4.51–4.39(m,7H),4.19–4.05(m,5H),4.09–3.88(m,2H),3.66–3.40(m,2H),3.05–2.93(m,3H),2.91–2.78(m,2H),2.70(s,1H),2.40–2.20(m,2H),2.20–2.02(m,1H),2.01–1.90(m,1H),1.82–1.69(m,3H),1.70–1.45(m,7H),1.44–1.22(m,5H),1.10–0.86(m,6H)。
16.LP16的合成
LP16的合成如下所示：
2-({[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基](甲基)氨基}甲基)苯甲酸的合成
将2-[(甲基氨基)甲基]苯甲酸(177mg，1.074mmol)和DIEA(555mg，4.296mmol)添加至碳酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲基4-硝基苯基酯(600mg，1.074mmol)在DMF(5mL)中的混合物中。将所得混合物在25℃搅拌2h。将所得混合物用EtOAc稀释、用水洗涤并浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(用CH2Cl2/MeOH(10:1)洗脱)纯化。这产生600mg呈白色固体的2-({[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基](甲基)氨基}甲基)苯甲酸。LC-MS(ESI):585[M+H]+。
2-({[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基](甲基)氨基}甲基)苯甲酸2,3,4,5,6-五氟苯基酯的合成
将五氟苯酚(378mg，2.052mmol)和DCC(424mg，2.052mmol)添加至2-({[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基](甲基)氨基}甲基)苯甲酸(600mg，1.026mmol)在DCM(10mL)中的混合物中。将所得混合物在25℃搅拌1h。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(用PE/EtOAc(1:1)洗脱)纯化。这产生830mg呈白色固体的2-({[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基](甲基)氨基}甲基)苯甲酸2,3,4,5,6-五氟苯基酯。LC-MS(ESI):751[M+H]+。
N-({2-[(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-羰基]苯基}甲基)-N-甲基氨基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲基酯的合成
将LiHMDS(0.48mmol)添加至化合物1(60mg，0.080mmol)在THF(5mL)中的混合物中。将所得混合物在-78℃搅拌30min。在-78℃，向上述混合物中滴加2-({[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基](甲基)氨基}甲基)苯甲酸2,3,4,5,6-五氟苯基酯(60mg，0.08mmol)。将所得混合物在-78℃再搅拌3h。如果未消耗化合物1，则在78℃添加2eq LHMDS和1eq 2-({[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基](甲基)氨基}甲基)苯甲酸2,3,4,5,6-五氟苯基酯。将反应用AcOH淬灭。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(用DCM/MeOH(8:1)洗脱)纯化。这产生60mg呈白色固体的N-({2-[(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-羰基]苯基}甲基)-N-甲基氨基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲基酯。LC-MS(ESI):1313[M+H]+。
N-({2-[(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-羰基]苯基}甲基)-N-甲基氨基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲基酯的合成
将TFA(0.6mL)添加至N-({2-[(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023 ,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-羰基]苯基}甲基)-N-甲基氨基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲基酯(80mg，0.061mmol)在DCM(3.6mL)中的混合物中。将所得混合物在0℃搅拌1h。将所得混合物在减压下浓缩。这产生80mg呈粗制油状物的N-({2-[(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04, 8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-羰基]苯基}甲基)-N-甲基氨基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲基酯。LC-MS(ESI):1212[M+H]+。
N-({2-[(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-羰基]苯基}甲基)-N-甲基氨基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲基酯(LP16)的合成
将6-(2,5-二氧代吡咯-1-基)己酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(41mg，0.132mmol)和DIEA(85mg，0.660mmol)添加至N-({2-[(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019, 24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-羰基]苯基}甲基)-N-甲基氨基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲基酯(80mg，0.066mmol)在DMF(2mL)中的混合物中。将所得混合物在25℃搅拌1h。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过制备型TLC(DCM/MeOH 7:1)和制备型HPLC(柱：XBridge Prep Phenyl OBD柱，19x250 mm，5μm；流动相A：水(50mmolHCO2NH4)，流动相B：MeCN；流速：25mL/min；梯度：在15min内25％ B至50％ B；波长：254nm)纯化。这产生25.3mg呈白色固体的N-({2-[(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-羰基]苯基}甲基)-N-甲基氨基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲基酯(LP16)。
LC-MS(ESI):1406.55[M+H]+。
1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ8.97(s,1H),8.52–8.28(m,2H),8.26–8.13(m,2H),8.09–7.99(m,1H),7.64–7.50(m,2H),7.41–7.33(m,1H),7.28–7.17(m,2H),7.06–6.93(m,2H),6.80(s,2H),6.43–6.23(m,2H),6.13–5.45(m,4H),5.14(d,J＝7.0Hz,3H),4.87–4.72(m,3H),4.70–4.30(m,8H),4.24–4.13(m,1H),4.10–4.00(m,1H),3.99–3.83(m,1H),3.77–3.59(m,1H),3.54–3.42(m,3H),3.31–3.14(m,3H),3.02–2.91(m,3H),2.37–2.25(m,2H),2.16–2.04(m,1H),1.68–1.53(m,4H),1.47–1.42(m,3H),1.40–1.25(m,3H),1.03–0.95(m,6H)。
17.LP17的合成
LP17的合成如下所示：
在室温，向N-({2-[(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-羰基]苯基}甲基)-N-甲基氨基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲基酯三氟乙酸盐(16mg，0.012mmol)在DMF(1mL)中的溶液中添加DIEA(10.53μl，0.06mmol)和2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(4.56mg，0.018mmol)。将反应混合物在室温搅拌2小时。将反应混合物通过反相快速色谱法(使用在水(0.1％甲酸)中的3％至70％梯度的MeCN)纯化，以给出呈无色固体的N-({2-[(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-羰基]苯基}甲基)-N-甲基氨基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰氨基]-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲基酯(LP17)(7.2mg)。
LC-MS(ESI):1350.40[M+H]+。
18.LP20的合成
LP20的合成如下所示：
(2S)-2-(羟基甲基)吡咯烷-1-甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲基酯的合成
在室温，向脯氨醇(50mg，0.494mmol)在DMF(5mL)中的混合物中添加碳酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲基4-硝基苯基酯(276.12mg，0.494mmol)和DIEA(191.67mg，1.482mmol)。将所得混合物在室温搅拌过夜。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(用CH2Cl2/MeOH(10:1)洗脱)纯化，以得到呈白色油状物的(2S)-2-(羟基甲基)吡咯烷-1-甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲基酯(250mg)。LC-MS(ESI):521.6[M+H]+。
(2S)-2-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)吡咯烷-1-甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲基酯的合成
在室温，向(2S)-2-(羟基甲基)吡咯烷-1-甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲基酯(250mg，0.480mmol)和4-硝基苯基氯甲酸酯(145.18mg，0.720mmol)在DCM(7mL)中的混合物中添加吡啶(56.97mg，0.720mmol)。将所得混合物在室温搅拌过夜。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过制备型TLC(PE/EtOAc 1:3)纯化，以得到呈白色油状物的(2S)-2-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)吡咯烷-1-甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲基酯(230mg)。LC-MS(ESI):686.7[M+H]+。
(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸[(2S)-1-[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基]吡咯烷-2-基]甲基酯的合成
在氮气气氛下在-78℃，向化合物1(60mg，0.080mmol)在THF(5mL)中的混合物中添加LiHMDS(0.480mmol)。将所得混合物在-78℃搅拌30min。在氮气气氛下在-78℃，向所得混合物中添加(2S)-2-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)吡咯烷-1-甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲基酯(55.11mg，0.080mmol)。将所得混合物在一小时内缓慢加温至0℃。将反应通过添加AcOH淬灭。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过制备型TLC(EtOAc/MeOH 3:1)纯化，以得到呈白色固体的(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸[(2S)-1-[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基]吡咯烷-2-基]甲基酯(50mg)。LC-MS(ESI):1293.4[M+H]+。
(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸[(2S)-1-[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基]吡咯烷-2-基]甲基酯的合成
在0℃，向(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸[(2S)-1-[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-3甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基]吡咯烷-2-基]甲基酯(50mg，0.039mmol)在DCM(6mL)中的混合物中添加TFA(1mL)。将所得混合物在0℃搅拌1h。将所得混合物在减压下浓缩。粗品无需进一步纯化即可直接用于下一步骤。LC-MS(ESI):1193.1[M+H]+。
(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸[(2S)-1-[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基]吡咯烷-2-基]甲基酯(LP20)的合成
在室温，向(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸[(2S)-1-[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基]吡咯烷-2-基]甲基酯(10mg，0.008mmol)和6-(2,5-二氧代吡咯-1-基)己酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(25.84mg，0.084mmol)在DMF(3mL)中的混合物中添加DIEA(16.25mg，0.126mmol)。将所得混合物在室温搅拌1h。将所得混合物在真空下浓缩。将残余物通过制备型TLC(DCM/MeOH 5:1)和制备型HPLC用以下条件纯化(柱：XBridge Prep OBD C18柱，19*250mm，5μm；流动相A：水(50mmol/L HCO2NH4)，流动相B：MeCN；流速：25mL/min；梯度：在12min内25％ B至35％ B，35％ B；波长：254nm)，以得到呈白色固体的(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸[(2S)-1-[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基]吡咯烷-2-基]甲基酯(LP20)(11.4mg)。LC-MS(ESI):1386.40[M+H]+；1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ9.14–8.62(m,3H),8.24–7.98(m,1H),7.69–7.47(m,2H),7.41–7.17(m,2H),6.94–6.64(m,2H),6.62–6.14(m,2H),6.11–5.31(m,4H),5.09–4.92(m,3H),4.74–4.58(m,4H),4.54–4.39(m,4H),4.35–4.17(m,2H),4.12–3.87(m,4H),3.79–3.55(m,1H),3.56–3.41(m,3H),3.23–2.98(m,1H),2.70(s,1H),2.36–2.27(m,2H),2.24–2.05(m,2H),2.00–1.75(m,1H),1.74–1.51(m,8H),1.52–1.43(m,3H),1.40–1.22(m,5H),1.06–0.85(m,6H)。
19.LP18的合成
LP18的合成如下所示：
化合物(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸[(2S)-1-[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰氨基]-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基]吡咯烷-2-基]甲基酯(LP18)通过类似于LP20的程序的程序，通过使用2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯代替6-(2,5-二氧代吡咯-1-基)己酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯获得。
LC-MS(ESI):1330.72[M+H]+。
20.LP19的合成
LP19的合成如下所示：
化合物(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸[(2S)-1-[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-(3-{2-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基]乙氧基}丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基]吡咯烷-2-基]甲基酯(LP19)通过类似于LP20的程序的程序，通过使用3-{2-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基]乙氧基}丙酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯代替6-(2,5-二氧代吡咯-1-基)己酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯获得。
LC-MS(ESI):1432.88[M+H]+。
21.LP29的合成
LP29的合成如下所示：
向(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸[(2R)-1-[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基]吡咯烷-2-基]甲基酯(20mg，0.015mmol)在DCM(0.5mL)中的混合物中添加TFA(0.5mL)。将所得混合物在室温搅拌15min。将所得混合物在减压下浓缩并溶解于DCM/甲苯中，然后在减压下浓缩三次。将粗制残余物溶解于DMF(0.5mL)中，然后将三乙胺(31.3mg，0.309mmol)和6-(2,5-二氧代吡咯-1-基)己酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(9.5mg，0.031mmol)添加至混合物中。将所得混合物在室温搅拌30min。将所得混合物用甲酸(20.2mg，0.387mmol)淬灭并通过ODS硅胶色谱法(MeCN中的0.1％甲酸/水＝1:9至4:6)直接纯化，以得到粗制产物。将粗制产物通过ODS硅胶色谱法(MeCN中的0.1％ TFA/水＝1:9至4:6)纯化，以得到(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04, 8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸[(2R)-1-[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基]吡咯烷-2-基]甲基酯(LP29)(3.97mg)。
LC-MS(ESI):1386.59[M+H]+。
22.LP25的合成
LP25的合成如下所示：
在室温，向碳酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-{3-[2-(2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}乙氧基)乙氧基]丙酰胺基}-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲基4-硝基苯基酯(100mg，0.139mmol)在THF(2.0mL)中的溶液中添加THF(0.4mL)中的L-脯氨醇(42.3mg，0.418mmol)。将反应混合物在室温搅拌2h 50min。将溶剂在减压下除去。将残余物通过硅胶柱色谱法(EtOAc-MeOH＝100:0至85:15)纯化，以给出呈无色油状物的(2S)-2-(羟基甲基)吡咯烷-1-甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-{3-[2-(2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}乙氧基)乙氧基]丙酰胺基}-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲基酯(98.8mg)。LC-MS(ESI):680.45[M+H]+。
(2S)-2-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)吡咯烷-1-甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-{3-[2-(2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}乙氧基)乙氧基]丙酰胺基}-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲基酯的合成
在室温，向(2S)-2-(羟基甲基)吡咯烷-1-甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-{3-[2-(2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}乙氧基)乙氧基]丙酰胺基}-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲基酯(98.8mg，0.139mmol)在DCM(3.0mL)中的溶液中添加吡啶(22.4μL，0.277mmol)和4-硝基苯基氯甲酸酯(55.1mg，0.273mmol)。将混合物在室温搅拌2h 45min。将乙酸乙酯(10mL)和10％水性柠檬酸(5mL)添加至反应混合物中，并且将有机层分离、用盐水洗涤、经硫酸钠干燥、过滤并在减压下浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(EtOAc-MeOH＝100:0至90:10)纯化，以给出呈无色油状物的(2S)-2-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)吡咯烷-1-甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-{3-[2-(2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}乙氧基)乙氧基]丙酰胺基}-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲基酯(91.9mg)。LC-MS(ESI):845.54[M+H]+。
(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸[(2S)-1-[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-{3-[2-(2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}乙氧基)乙氧基]丙酰胺基}-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基]吡咯烷-2-基]甲基酯的合成
在室温，向化合物1(45mg，0.053mmol)在THF(5.0mL)中的白色悬浮液中滴加LiHMDS(0.487mL，0.633mmol)持续4min。将反应混合物在室温搅拌30min。然后将它冷却至-78℃。向混合物中添加THF(0.5mL)中的(2S)-2-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)吡咯烷-1-甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-{3-[2-(2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}乙氧基)乙氧基]丙酰胺基}-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲基酯(46.3mg，0.055mmol)(用THF冲洗(0.25mLx 2))。将反应混合物在-78℃搅拌10min。然后使反应混合物加温至室温。在室温搅拌30min后，将反应混合物冷却至-78℃并在-78℃用乙酸(0.076mL，1.319mmol)淬灭。然后将它在0℃搅拌1h 45min。将混合物在减压下浓缩。将残余物通过ODS硅胶柱色谱法(H2O-MeCN(0.1％甲酸)＝95:5至35:65)纯化，以给出呈白色固体的(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04 ,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸[(2S)-1-[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-{3-[2-(2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}乙氧基)乙氧基]丙酰胺基}-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基]吡咯烷-2-基]甲基酯(53.3mg)。LC-MS(ESI):1452.48[M+H]+。
(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸[(2S)-1-[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[3-(2-{2-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)丙酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基]吡咯烷-2-基]甲基酯(LP25)的合成
在0℃，向(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸[(2S)-1-[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-{3-[2-(2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}乙氧基)乙氧基]丙酰胺基}-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基]吡咯烷-2-基]甲基酯(52.8mg，0.036mmol)在二氯甲烷(4.0mL)中的悬浮液中添加三氟乙酸(0.4mL)。将混合物在室温搅拌1h。通过与甲苯共沸(三次)除去所有挥发物。将残余物在高真空下干燥。将该材料溶解于DMF(2.0mL)中。在0℃，向溶液中添加DIEA(63μL，0.364mmol)和2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(36.7mg，0.145mmol)。将混合物在0℃搅拌1h。将反应在0℃通过添加甲酸(0.014mL，0.364mmol)淬灭。在高真空下除去所有挥发物。将残余物通过ODS硅胶柱色谱法(H2O-MeCN(0.1％甲酸)＝95:5至55:45)纯化，以给出呈白色固体的(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04 ,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸[(2S)-1-[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[3-(2-{2-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)丙酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基]吡咯烷-2-基]甲基酯(LP25)(31.56mg)。
LC-MS(ESI):1489.43[M+H]+。
23.LP28的合成
LP28的合成如下所示：
(2S)-4,4-二氟-2-(羟基甲基)吡咯烷-1-甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲基酯的合成
在25℃，将DIEA(347.07mg，2.685mmol)添加至碳酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲基4-硝基苯基酯(500mg，0.895mmol)和[(2S)-4,4-二氟吡咯烷-2-基]甲醇(122.75mg，0.895mmol)在DMF(5mL)中的搅拌溶液中。将所得混合物在25℃搅拌2h。将所得混合物用EtOAc稀释并用水洗涤。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(用DCM/MeOH(15/1)洗脱)纯化，以得到呈白色固体的(2S)-4,4-二氟-2-(羟基甲基)吡咯烷-1-甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲基酯(480mg)。LC-MS(ESI):557.2[M+H]+。
(2S)-4,4-二氟-2-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)吡咯烷-1-甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲基酯的合成
在25℃，将吡啶(136.43mg，1.724mmol)添加至(2S)-4,4-二氟-2-(羟基甲基)吡咯烷-1-甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲基酯(480mg，0.862mmol)和4-硝基苯基氯甲酸酯(347.64mg，1.724mmol)在DCM(10mL)中的搅拌溶液中。将所得混合物在25℃搅拌14h。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(用PE/EtOAc(1/2)洗脱)纯化，以得到呈白色固体的(2S)-4,4-二氟-2-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)吡咯烷-1-甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲基酯(600mg)。LC-MS(ESI):722.2[M+H]+。
(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸[(2S)-1-[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基]-4,4-二氟吡咯烷-2-基]甲基酯的合成
在氮气气氛下在-78℃，将LiHMDS(0.40mL，0.402mmol)添加至化合物1在THF(5mL)中的搅拌溶液中。将所得混合物在氮气气氛下在-78℃搅拌30min。然后添加(2S)-4,4-二氟-2-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)吡咯烷-1-甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲基酯(48mg，0.067mmol)。将所得混合物在氮气气氛下在1h内缓慢加温至0℃。将反应用AcOH淬灭。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过制备型TLC(DCM(1％ TEA)/MeOH(6/1))纯化，以得到呈白色固体的(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸[(2S)-1-[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基]-4,4-二氟吡咯烷-2-基]甲基酯(44mg)。LC-MS(ESI):1329.3[M+H]+。
(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸[(2S)-1-[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基]-4,4-二氟吡咯烷-2-基]甲基酯的合成
在氮气气氛下在0℃，将TFA(0.6mL)添加至(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04, 8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸[(2S)-1-[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基]-4,4-二氟吡咯烷-2-基]甲基酯(44mg，0.033mmol)在DCM(2.4mL)中的搅拌溶液中。将所得混合物在氮气气氛下在0℃搅拌2h。将所得混合物在减压下浓缩，以获得呈无色油状物的(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸[(2S)-1-[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基]-4,4-二氟吡咯烷-2-基]甲基酯的粗制产物。LC-MS(ESI):1229.2[M+H]+。
(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸[(2S)-1-[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基]-4,4-二氟吡咯烷-2-基]甲基酯(LP28)的合成
在氮气气氛下在25℃，将DIEA(25.24mg，0.198mmol)添加至(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13 ,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸[(2S)-1-[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基]-4,4-二氟吡咯烷-2-基]甲基酯(40mg，0.033mmol)和6-(2,5-二氧代吡咯-1-基)己酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(10.03mg，0.033mmol)在DMF(2mL)中的混合物中。将所得混合物在氮气气氛下在25℃搅拌4h。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过制备型TLC(DCM(1％TEA)/MeOH(7/1))和制备型HPLC用以下条件纯化(柱：Xbridge Prep OBD C18柱，19*250mm，5μm；流动相A：水(50mmolHCO2NH4)，流动相B：MeCN；流速：25mL/min；梯度：在10min内25％ B至35％ B，35％ B；波长：254nm)，以得到呈灰白色固体的(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04 ,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸[(2S)-1-[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基]-4,4-二氟吡咯烷-2-基]甲基酯(LP28)(12.8mg)。
LC-MS(ESI):1423.60[M+H]+。
1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ8.94–8.90(m,1H),8.78–8.73(m,2H),8.17–8.00(m,3H),7.65–7.59(m,2H),7.31–7.27(m,2H),6.81–6.76(m,2H),6.49–6.44(m,1H),6.33–6.29(m,1H),6.06–5.87(m,2H),5.85–5.57(m,2H),,5.17–4.94(m,3H),4.69–4.58(m,5H),4.55–4.46(m,3H),4.46–4.36(m,3H),4.34–4.22(m,2H),4.22–4.02(m,2H),4.01–3.97(m,1H),3.80–3.76(m,1H),3.66–3.57(m,1H),3.51–3.43(m,2H),3.33–3.16(m,1H),2.56-2.36(m,1H),2.34–2.26(m,2H),2.25–1.92(m,2H),1.70–1.53(m,4H),1.52–1.42(m,3H),1.38–1.21(m,2H),1.03–0.94(m,6H)。
24.LP26的合成
LP26的合成如下所示：
N-{2-[2-(2-{[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}乙氧基)乙氧基]乙基}氨基甲酸叔丁基酯的合成
向N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲基酯(410mg，0.795mmol)在DMF(5mL)中的溶液中添加二乙胺(0.828mL，7.95mmol)。将混合物搅拌1h。将所得混合物浓缩并在减压下与甲苯共沸。向DMF(5mL)中的残余物中添加3-[2-(2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}乙氧基)乙氧基]丙酸(250mg，0.901mmol)、DIEA(0.278mL，1.59mmol)和HATU(454mg，1.19mmol)。将混合物搅拌90min。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物用EtOAc和水稀释。将有机层分离并用盐水洗涤、经Na2SO4干燥并在减压下浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(EtOAc/庚烷＝1/19至1/10)纯化，以给出粗制材料。将粗制材料通过NH硅胶柱色谱法(EtOAc/庚烷＝1/1至1/0、然后EtOAc/MeOH＝10/1)纯化，以给出N-{2-[2-(2-{[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}乙氧基)乙氧基]乙基}氨基甲酸叔丁基酯(354.4mg)。LC-MS(ESI):553.5[M+H]+。
碳酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-{3-[2-(2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}乙氧基)乙氧基]丙酰胺基}-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲基4-硝基苯基酯的合成
向N-{2-[2-(2-{[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}乙氧基)乙氧基]乙基}氨基甲酸叔丁基酯(354.4mg，0.641mmol)在DCM(15mL)中的溶液中添加4-硝基苯基氯甲酸酯(323mg，1.60mmol)和吡啶(0.130mL，1.60mmol)。将混合物搅拌1h。将所得混合物用EtOAc和10％水性柠檬酸稀释。将有机层分离并用盐水洗涤、经Na2SO4干燥并在减压下浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(EtOAc/庚烷＝1/1至1/0)纯化，以给出碳酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-{3-[2-(2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}乙氧基)乙氧基]丙酰胺基}-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲基4-硝基苯基酯(412.2mg)。LC-MS(ESI):718.4[M+H]+。
(2S)-4,4-二氟-2-(羟基甲基)吡咯烷-1-甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-{3-[2-(2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}乙氧基)乙氧基]丙酰胺基}-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲基酯的合成
向碳酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-{3-[2-(2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}乙氧基)乙氧基]丙酰胺基}-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲基4-硝基苯基酯(150mg，0.209mmol)在THF(4mL)和DIEA(0.183mL，1.05mmol)中的溶液中添加[(2S)-4,4-二氟吡咯烷-2-基]甲醇盐酸盐(43.5mg，0.251mmol)。将混合物搅拌77h。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过NH硅胶柱色谱法(EtOAc/庚烷＝1/1至1/0、然后EtOAc/MeOH＝10/1)纯化，以给出(2S)-4,4-二氟-2-(羟基甲基)吡咯烷-1-甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-{3-[2-(2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}乙氧基)乙氧基]丙酰胺基}-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲基酯(138.3mg)。LC-MS(ESI):716.5[M+H]+。
(2S)-4,4-二氟-2-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)吡咯烷-1-甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-{3-[2-(2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}乙氧基)乙氧基]丙酰胺基}-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲基酯的合成
向(2S)-4,4-二氟-2-(羟基甲基)吡咯烷-1-甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-{3-[2-(2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}乙氧基)乙氧基]丙酰胺基}-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲基酯(138.3mg，0.193mmol)在DCM(5mL)中的溶液中添加4-硝基苯基氯甲酸酯(78mg，0.386mmol)和吡啶(0.031mL，0.386mmol)。将混合物搅拌1h。向混合物中添加吡啶(0.016mL，0.193mmol)和4-硝基苯基氯甲酸酯(38.9mg，0.193mmol)。将混合物搅拌4h。将所得混合物用EtOAc和10％水性柠檬酸稀释。将有机层分离、用盐水洗涤、经Na2SO4干燥并在减压下浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(EtOAc/庚烷＝1/1至1/0、然后EtOAc/MeOH＝10/1)纯化，以给出(2S)-4,4-二氟-2-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)吡咯烷-1-甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-{3-[2-(2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}乙氧基)乙氧基]丙酰胺基}-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲基酯(173.8mg)。LC-MS(ESI):881.5[M+H]+。
(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸[(2S)-1-[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-{3-[2-(2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}乙氧基)乙氧基]丙酰胺基}-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基]-4,4-二氟吡咯烷-2-基]甲基酯的合成
在室温，向化合物1(50mg，0.059mmol)在THF(5mL)中的悬浮液中添加LiHMDS(0.586mmol)。将所得混合物在室温搅拌30min并冷却至-78℃。向上述混合物中添加THF(0.5mL)中的(2S)-4,4-二氟-2-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)吡咯烷-1-甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-{3-[2-(2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}乙氧基)乙氧基]丙酰胺基}-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲基酯(54.2mg，0.062mmol)(用THF冲洗(0.5mL))并在-78℃搅拌10min。将所得混合物加温至室温并搅拌3h。将反应用AcOH(0.252mL，4.40mmol)淬灭并搅拌10min。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过ODS硅胶柱色谱法(H2O/MeCN(包含0.1％甲酸)＝95/25至20/80)纯化，以给出(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019, 24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸[(2S)-1-[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-{3-[2-(2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}乙氧基)乙氧基]丙酰胺基}-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基]-4,4-二氟吡咯烷-2-基]甲基酯(41.1mg)。LC-MS(ESI):1488.4[M+H]+。
(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸[(2S)-1-[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[3-(2-{2-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)丙酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基]-4,4-二氟吡咯烷-2-基]甲基酯(LP26)的合成
在0℃，向(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸[(2S)-1-[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-{3-[2-(2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}乙氧基)乙氧基]丙酰胺基}-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基]-4,4-二氟吡咯烷-2-基]甲基酯(21.1mg，0.014mmol)在DCM(2mL)中的悬浮液中添加TFA(200mL，2.60mmol)。将混合物在室温搅拌30min。将所得混合物浓缩并在减压下与甲苯共沸。在0℃，向DMF(1mL)中的残余物中添加DIEA(0.025mL，0.142mmol)和2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(14.30mg，0.057mmol)。将混合物在室温搅拌2h。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过ODS硅胶柱色谱法(H2O/MeCN(包含0.1％甲酸)＝95/25至20/80)纯化，以给出(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019, 24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸[(2S)-1-[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[3-(2-{2-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)丙酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基]-4,4-二氟吡咯烷-2-基]甲基酯(LP26)(6.85mg)。
LC-MS(ESI):1525.6[M+H]+。
在1H NMR谱中观察到旋转异构体。1H NMR(700MHz,DMSO-d6)δppm 9.91–10.11(m,2H)8.81(br s,1H)8.59–8.72(m,2H)8.31–8.39(m,1H)8.17–8.27(m,2H)8.08–8.17(m,1H)7.84–7.92(m,1H)7.65–7.75(m,1H)7.55–7.62(m,2H)7.45–7.50(m,1H)7.24(br s,2H)7.22(s,1H)7.15(s,1H)7.05–7.11(m,3H)6.92–6.96(m,1H)6.46–6.53(m,1H)6.35–6.44(m,1H)5.78–5.94(m,2H)5.69(br s,1H)5.54–5.61(m,1H)5.29–5.36(m,1H)5.23(br s,1H)5.08–5.16(m,1H)5.01–5.08(m,1H)4.97(br s,2H)4.90(br s,1H)4.71(br d,J＝12.76Hz,1H)4.65(br s,1H)4.56(br d,J＝11.44Hz,1H)4.42(br s,1H)4.33–4.41(m,5H)4.27–4.33(m,3H)4.18–4.27(m,4H)4.11–4.16(m,2H)4.02(s,2H)3.81(br d,J＝5.72Hz,1H)3.64–3.77(m,4H)3.56–3.63(m,3H)3.44–3.50(m,4H)3.39(t,J＝5.72Hz,2H)3.19(q,J＝5.72Hz,2H)2.45–2.48(m,1H)2.36–2.41(m,1H)1.88–2.05(m,3H)1.28–1.36(m,4H)1.19–1.28(m,5H)0.86–0.88(m,3H)0.83(br d,J＝6.60Hz,3H)。
25.LP27的合成
LP27的合成如下所示：
向(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸[(2S)-1-[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基]-4,4-二氟吡咯烷-2-基]甲基酯三氟乙酸盐(15mg，0.011mmol)和DIEA(9.75μl，0.056mmol)在DMF(2ml，25.829mmol)中的溶液中添加2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(4.22mg，0.017mmol)并在室温搅拌1小时。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过反相硅胶色谱法(ODS C18柱，H2O/MeCN/HCOOH＝95/5/0.1至40/60/0.1)纯化，以给出呈白色粉末的(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸[(2S)-1-[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰氨基]-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基]-4,4-二氟吡咯烷-2-基]甲基酯(LP27)。
LC-MS(ESI)[M+H]+＝1366.30。
1H NMR(396MHz,DMSO-d6)δppm 0.80(br d,J＝16.76Hz,4H)0.82(br d,J＝16.76Hz,3H)1.17–1.23(m,4H)1.27(br d,J＝5.89Hz,4H)1.82–2.04(m,2H)4.08(s,3H)4.17–4.28(m,5H)4.30–4.42(m,3H)4.43–4.74(m,3H)4.93(br s,1H)5.11(br s,1H)5.14 -5.33(m,1H)5.38(br d,J＝1.36Hz,1H)5.46–5.60(m,1H)5.60–5.81(m,1H)5.82–5.96(m,1H)6.26–6.53(m,1H)7.05(s,2H)7.21(br d,J＝7.25Hz,2H)7.53(br d,J＝8.16Hz,2H)8.22(br d,J＝8.61Hz,1H)8.28(br d,J＝6.80Hz,1H)8.32–8.39(m,1H)8.52–8.69(m,2H)8.69–8.83(m,1H)9.88–10.11(m,1H)。
26.LP24的合成
LP24的合成如下所示：
(2S)-2-(羟基甲基)吡咯烷-1-甲酸[4-(2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}乙酰氨基)苯基]甲基酯的合成
在室温，将[(2S)-吡咯烷-2-基]甲醇(272mg，2.69mmol)添加至碳酸[4-(2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}乙酰氨基)苯基]甲基4-硝基苯基酯(1.00g，2.25mmol)和DIEA(1.45g，11.2mmol)在THF(41.8mL)中的溶液中。将溶液在室温搅拌30min。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(用EtOAc/庚烷(1/3至1/0)洗脱)纯化，以给出(2S)-2-(羟基甲基)吡咯烷-1-甲酸[4-(2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}乙酰氨基)苯基]甲基酯(873mg)。LC-MS(ESI):408.3[M+H]+。
(2S)-2-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)吡咯烷-1-甲酸[4-(2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}乙酰氨基)苯基]甲基酯的合成
在室温，将吡啶(164mg，2.08mmol)添加至(2S)-2-(羟基甲基)吡咯烷-1-甲酸[4-(2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}乙酰氨基)苯基]甲基酯(423mg，1.04mmol)和4-硝基苯基氯甲酸酯(418mg，2.08mmol)在DCM(17.4mL)中的溶液中。将溶液在室温搅拌1h。将所得混合物用EtOAc和10％水性柠檬酸稀释。将有机层分离并用盐水洗涤且在减压下浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(用EtOAc/庚烷，1/3至1/0洗脱)纯化，以给出(2S)-2-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)吡咯烷-1-甲酸[4-(2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}乙酰氨基)苯基]甲基酯(542mg)。LC-MS(ESI):573.3[M+H]+。
(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸[(2S)-1-({[4-(2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}乙酰氨基)苯基]甲氧基}羰基)吡咯烷-2-基]甲基酯的合成
在室温，将LiHMDS(1.17mmol)添加至化合物1(100mg，0.117mmol)在THF(10mL)中的溶液中。将所得混合物在室温搅拌30min并冷却至-78℃。向上述混合物中添加THF(2mL)中的(2S)-2-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)吡咯烷-1-甲酸[4-(2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}乙酰氨基)苯基]甲基酯(67.1mg，0.117mmol)并在-78℃搅拌10min。将所得混合物加温至0℃并搅拌30min。将反应用AcOH淬灭、然后加温至室温并搅拌10min。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过ODS硅胶柱色谱法(用H2O中的0.1％ HCO2H/MeCN中的0.1％HCO2H(99/1至20/80)洗脱)纯化，以给出(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019, 24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸[(2S)-1-({[4-(2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}乙酰氨基)苯基]甲氧基}羰基)吡咯烷-2-基]甲基酯(56.7mg)。LC-MS(ESI):1180.5[M+H]+。
(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸[(2S)-1-({[4-(2-氨基乙酰氨基)苯基]甲氧基}羰基)吡咯烷-2-基]甲基酯的合成
在0℃，将TFA(1.11mL)添加至(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023 ,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸[(2S)-1-({[4-(2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}乙酰氨基)苯基]甲氧基}羰基)吡咯烷-2-基]甲基酯(56.7mg，0.048mmol)在DCM(3.71mL)中的溶液中。将所得混合物在0℃搅拌45min。将所得混合物用甲苯(2mL)稀释并在减压下浓缩。将残余物通过ODS硅胶柱色谱法(用H2O中的0.1％ NH3/MeCN中的0.1％ NH3，95/5至35/65洗脱)纯化，以给出(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸[(2S)-1-({[4-(2-氨基乙酰氨基)苯基]甲氧基}羰基)吡咯烷-2-基]甲基酯(32.1mg)。LC-MS(ESI):1080.4[M+H]+。
(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸[(2S)-1-{[(4-{2-[(2S)-2-(2-{2-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基]乙酰氨基}乙酰氨基)-3-苯基丙酰胺基]乙酰氨基}苯基)甲氧基]羰基}吡咯烷-2-基]甲基酯(LP24)的合成
在室温，将DIEA(2.4mg，0.019mmol)添加至(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04, 8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸[(2S)-1-({[4-(2-氨基乙酰氨基)苯基]甲氧基}羰基)吡咯烷-2-基]甲基酯(10mg，0.0093mmol)和(2S)-2-(2-{2-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基]乙酰氨基}乙酰氨基)-3-苯基丙酸(6.6mg，0.014mmol)在DMF(1.0mL)中的溶液中。将所得混合物冷却0℃并添加DMT-MM(4.1mg)。将所得混合物加温至室温并搅拌10min。然后在0℃添加额外的DMT-MM(0.8mg)。将所得混合物加温至室温并搅拌10min。将混合物通过ODS硅胶柱色谱法(用H2O中的0.1％HCO2H/MeCN中的0.1％ HCO2H，95/5至50/50洗脱)直接纯化，以给出(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13 ,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸[(2S)-1-{[(4-{2-[(2S)-2-(2-{2-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基]乙酰氨基}乙酰氨基)-3-苯基丙酰胺基]乙酰氨基}苯基)甲氧基]羰基}276吡咯烷-2-基]甲基酯(LP24)(8.8mg)。
LC-MS(ESI):768.2[1/2M+H]+。
27.LP30的合成
LP30的合成如下所示：
(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-双({[(2-硝基苯基)甲基]硫烷基})-34,39-二氧代-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸2-{[(叔丁氧基)羰基](甲基)氨基}乙基酯的合成
在25℃，将TEA(32.03mg，0.315mmol)添加至(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04, 8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸2-{[(叔丁氧基)羰基](甲基)氨基}乙基酯(60mg，0.063mmol)和1-(溴甲基)-2-硝基苯(34.19mg，0.158mmol)在DMF(2mL)中的搅拌溶液中。将所得混合物在氮气气氛下在25℃搅拌3h。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过制备型TLC(CH2Cl2(1％TEA)/MeOH(8/1))纯化，以得到呈白色固体的(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-双({[(2-硝基苯基)甲基]硫烷基})-34,39-二氧代-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019, 24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸2-{[(叔丁氧基)羰基](甲基)氨基}乙基酯(70mg)。LC-MS(ESI):1218.2[M+H]+。
(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,36R,41R)-29,41-二氟-34,39-二羟基-34,39-二氧代-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸2-{[(叔丁氧基)羰基](甲基)氨基}乙基酯的合成
在室温，将NH4OH(2mL)添加至(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-双({[(2-硝基苯基)甲基]硫烷基})-34,39-二氧代-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13, 36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸2-[(叔丁氧基羰基)(甲基)氨基]乙基酯(70mg，0.057mmol)在MeOH(2mL)中的搅拌混合物中。将所得混合物在氮气气氛下在25℃搅拌6h。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过制备型TLC(CH2Cl2(1％ TEA)/MeOH(6/1))纯化，以得到呈白色固体的(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,36R,41R)-29,41-二氟-34,39-二羟基-34,39-二氧代-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04 ,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸2-{[(叔丁氧基)羰基](甲基)氨基}乙基酯(40mg)。LC-MS(ESI):916.2[M+H]+。
(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,36R,41R)-29,41-二氟-34,39-二羟基-34,39-二氧代-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸2-(甲基氨基)乙基酯的合成
在25℃，将TEA(22.10mg，0.220mmol)添加至(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,36R,41R)-29,41-二氟-34,39-二羟基-34,39-二氧代-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019, 24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸2-[(叔丁氧基羰基)(甲基)氨基]乙基酯(40mg，0.044mmol)在DCM(2mL)中的搅拌溶液中。然后添加TMSOTf(67.96mg，0.308mmol)。将所得混合物在25℃搅拌30min。将所得混合物在减压下浓缩，以获得呈无色油状物的(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,36R,41R)-29,41-二氟-34,39-二羟基-34,39-二氧代-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸2-(甲基氨基)乙基酯的粗制产物。LC-MS(ESI):816.1[M+H]+。
(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,36R,41R)-29,41-二氟-34,39-二羟基-34,39-二氧代-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸2-{[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基](甲基)氨基}乙基酯(LP30)的合成
在室温，将DIEA(29.75mg，0.230mmol)添加至(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,36R,41R)-29,41-二氟-34,39-二羟基-34,39-二氧代-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019, 24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸2-(甲基氨基)乙基酯(37.55mg，0.046mmol)和碳酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[6-(2,5-二氧代吡咯-1-基)己酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲基4-硝基苯基酯(30mg，0.046mmol)在DMF(2mL)中的混合物中。将混合物在氮气气氛下在室温搅拌14h。将所得混合物在减压下浓缩。将粗制混合物通过制备型HPLC用以下条件纯化(柱：XBridge Prep PhenylOBD柱，19*250mm，5μm；流动相A：水(50mmol HCO2NH4)，流动相B：MeCN；流速：25mL/min；梯度：在10min内20％ B至30％ B，30％ B；波长：254nm)，以得到呈白色固体的(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,36R,41R)-29,41-二氟-34,39-二羟基-34,39-二氧代-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019, 24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸2-{[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基](甲基)氨基}乙基酯(LP30)(12.3mg)。LC-MS(ESI):1328.40[M+H]+。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ8.88–8.69(m,2H),8.50–8.44(m,1H),8.29–8.23(m,1H),8.15–8.09(m,1H),7.91–7.85(m,1H),7.61–7.55(m,2H),7.33–7.20(m,2H),6.82–6.76(m,2H),6.52–6.42(m,1H),6.36–6.30(m,1H),5.66–5.38(m,5H),5.02–4.96(m,1H),4.63–4.57(m,5H),4.56–4.47(m,2H),4.47–4.42(m,1H),4.43–4.28(m,2H),4.23–4.04(m,2H),3.68–3.62(m,1H),3.53–3.42(m,3H),2.81–2.68(m,3H),2.35–2.24(m,2H),2.17–2.02(m,1H),1.73–1.51(m,4H),1.51–1.40(m,3H),1.41–1.23(m,2H),1.04–0.94(m,6H)。
28.LP21的合成
LP21的合成如下所示：
碳酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}丙酰胺基]丙酰胺基]-3-[(三苯基甲基)氨基甲酰基]丙酰胺基]苯基}甲基4-硝基苯基酯的合成
向N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}-2-[(三苯基甲基)氨基甲酰基]乙基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酸叔丁基酯(205mg，0.284mmol，CAS2461517-95-1，按EP4108675中的方法制备)在THF(3.0mL)中的溶液中添加吡啶(0.046mL，0.568mmol)和4-硝基苯基氯甲酸酯(114mg，0.568mmol)。在室温搅拌2h后，在室温添加额外的吡啶(11μL)和4-硝基苯基氯甲酸酯(29mg)。在室温搅拌45min后，将乙酸乙酯(10mL)和10％水性柠檬酸(5mL)添加至反应混合物中。分离各层。将有机层用盐水洗涤(两次)、经硫酸钠干燥、过滤并浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(EtOAc-庚烷＝60:40至100:0)纯化，以给出呈白色固体的碳酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}丙酰胺基]丙酰胺基]-3-[(三苯基甲基)氨基甲酰基]丙酰胺基]苯基}甲基4-硝基苯基酯(173mg)。LC-MS(ESI):887.5[M+H]+。
(2S)-2-(羟基甲基)吡咯烷-1-甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}丙酰胺基]丙酰胺基]-3-[(三苯基甲基)氨基甲酰基]丙酰胺基]苯基}甲基酯的合成
在室温，向碳酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}丙酰胺基]丙酰胺基]-3-[(三苯基甲基)氨基甲酰基]丙酰胺基]苯基}甲基4-硝基苯基酯(173mg，0.195mmol)在四氢呋喃(2.0mL)中的溶液中添加THF(0.4mL)中的L-脯氨醇(61.4mg，0.607mmol)。将反应混合物在室温搅拌40min。将溶剂通过蒸发除去。将残余物通过硅胶柱色谱法(EtOAc-庚烷＝90:10至100:0、然后EtOAc-MeOH＝90:10至80:20)纯化，以给出呈无色油状物的(2S)-2-(羟基甲基)吡咯烷-1-甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}丙酰胺基]丙酰胺基]-3-[(三苯基甲基)氨基甲酰基]丙酰胺基]苯基}甲基酯(165mg)。LC-MS(ESI):849.4[M+H]+。
(2S)-2-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)吡咯烷-1-甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}丙酰胺基]丙酰胺基]-3-[(三苯基甲基)氨基甲酰基]丙酰胺基]苯基}甲基酯的合成
在室温，向(2S)-2-(羟基甲基)吡咯烷-1-甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}丙酰胺基]丙酰胺基]-3-[(三苯基甲基)氨基甲酰基]丙酰胺基]苯基}甲基酯(165mg，0.194mmol)在DCM(4.0mL)中的溶液中添加吡啶(31.4μL，0.388mmol)和4-硝基苯基氯甲酸酯(78.7mg，0.39mmol)。将混合物在室温搅拌1.5h。将乙酸乙酯(15mL)和10％水性柠檬酸(5mL)添加至反应混合物中，并且将有机层分离、用盐水洗涤(两次)、经硫酸钠干燥并在减压下浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(EtOAc-庚烷＝70:30至100:0)纯化，以给出呈无色油状物的(2S)-2-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)吡咯烷-1-甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}丙酰胺基]丙酰胺基]-3-[(三苯基甲基)氨基甲酰基]丙酰胺基]苯基}甲基酯(183mg)。LC-MS(ESI):1014.6[M+H]+。
(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸[(2S)-1-[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}丙酰胺基]丙酰胺基]-3-[(三苯基甲基)氨基甲酰基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基]吡咯烷-2-基]甲基酯的合成
在室温，向化合物1(51.6mg，0.066mmol)在四氢呋喃(5.0mL)中的白色悬浮液中滴加LiHMDS(0.51mL，0.663mmol)持续2min。将反应混合物在室温搅拌40min。然后将它冷却至-78℃。向混合物中添加THF(0.5mL)中的(2S)-2-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)吡咯烷-1-甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}丙酰胺基]丙酰胺基]-3-[(三苯基甲基)氨基甲酰基]丙酰胺基]苯基}甲基酯(67.7mg，0.067mmol)(用THF冲洗(0.25mL x 2))。将反应混合物在-78℃搅拌15min。除去冷却浴，并使反应混合物加温至室温。40min后，将反应混合物冷却至-70℃。将反应在-70℃用乙酸(95μL，1.652mmol)淬灭。然后将它在4℃搅拌1h。将混合物在减压下浓缩。将残余物通过ODS硅胶柱色谱法(H2O-MeCN＝90:10至30:70，包含0.1％甲酸)纯化，以给出呈白色固体的(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128 ,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸[(2S)-1-[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}丙酰胺基]丙酰胺基]-3-[(三苯基甲基)氨基甲酰基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基]吡咯烷-2-基]甲基酯(60.3mg)。LC-MS(ESI):811.61/2[M+2H]2+
(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸[(2S)-1-[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-氨基丙酰胺基]丙酰胺基]-3-氨基甲酰基丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基]吡咯烷-2-基]甲基酯二铵盐的合成
在0℃，向(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸[(2S)-1-[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}丙酰胺基]丙酰胺基]-3-[(三苯基甲基)氨基甲酰基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基]吡咯烷-2-基]甲基酯(30mg，0.019mmol)在1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇(3.0mL)中的溶液中添加CSA(86mg，0.37mmol)。将反应混合物在0℃搅拌3h。将反应混合物用MeOH淬灭。将混合物在减压下浓缩至约1mL。将残余物通过ODS硅胶柱色谱法(H2O-MeCN(含0.1％NH3)＝95:5至55:45)纯化，以给出呈白色固体的(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07, 12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸[(2S)-1-[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-氨基丙酰胺基]丙酰胺基]-3-氨基甲酰基丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基]吡咯烷-2-基]甲基酯二铵盐(11.8mg)。LC-MS(ESI):1279.4[M+H]+。
(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸[(2S)-1-[({4-[(2S)-3-氨基甲酰基-2-[(2S)-2-[(2S)-2-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基]丙酰胺基]丙酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基]吡咯烷-2-基]甲基酯(LP21)的合成
在室温，向(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸[(2S)-1-[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-氨基丙酰胺基]丙酰胺基]-3-氨基甲酰基丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基]吡咯烷-2-基]甲基酯二铵盐(11.8mg，8.986μmol)和6-马来酰亚胺己酸N-琥珀酰亚胺基酯(3.5mg，0.011mmol)在DMF(1000μL，12.915mmol)中的溶液中添加DIEA(3.13μL，0.018mmol)。将反应混合物在室温搅拌。搅拌1h后，添加额外的6-马来酰亚胺己酸N-琥珀酰亚胺基酯(3.7mg)和DIEA(3.13μL)。搅拌2h后，将反应混合物通过ODS硅胶柱色谱法(H2O-MeCN＝95:5至55:45)直接纯化，以给出呈固体的(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸[(2S)-1-[({4-[(2S)-3-氨基甲酰基-2-[(2S)-2-[(2S)-2-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基]丙酰胺基]丙酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基]吡咯烷-2-基]甲基酯(LP21)(6.11mg)。
LC-MS(ESI):737.2 1/2[M+2H]2+。
29.LP22的合成
LP22的合成如下所示：
(2S)-2-[(2S)-2-({[(9H-芴-9-基)甲氧基]羰基}氨基)-N-甲基丙酰胺基]丙酸叔丁基酯的合成
向(2S)-2-({[(9H-芴-9-基)甲氧基]羰基}氨基)丙酸(300mg，0.964mmol)在DMF(8mL)中的溶液中添加DIEA(0.505mL，2.89mmol)和HATU(440mg，1.16mmol)。将混合物搅拌10min。向混合物中添加(2S)-2-(甲基氨基)丙酸叔丁基酯盐酸盐(198mg，1.01mmol)。将混合物搅拌1h。将所得混合物用EtOAc和水稀释。将有机层分离、用盐水洗涤、经Na2SO4干燥并在减压下浓缩。将残余物通过NH硅胶柱色谱法(EtOAc/庚烷＝1/5)纯化，以给出(2S)-2-[(2S)-2-({[(9H-芴-9-基)甲氧基]羰基}氨基)-N-甲基丙酰胺基]丙酸酯(399.1mg)。LC-MS(ESI):453.4[M+H]+。
(2S)-2-[(2S)-2-氨基-N-甲基丙酰胺基]丙酸叔丁基酯的合成
在0℃，向(2S)-2-[(2S)-2-({[(9H-芴-9-基)甲氧基]羰基}氨基)-N-甲基丙酰胺基]丙酸酯(199.1mg，0.44mmol)在DMF(6mL)中的溶液中添加哌啶(0.436mL，4.40mmol)。将混合物在0℃搅拌2h。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过ODS硅胶柱色谱法(H2O/MeCN(包含0.1％甲酸)＝98/2至50/50)纯化，以给出(2S)-2-[(2S)-2-氨基-N-甲基丙酰胺基]丙酸叔丁基酯(41.7mg)。LC-MS(ESI):231.2[M+H]+。
(2S)-2-[(2S)-2-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基]-N-甲基丙酰胺基]丙酸叔丁基酯的合成
向6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(125mg，0.405mmol)和DIEA(0.129mL，0.736mmol)在DMF(3mL)中的溶液中添加(2S)-2-[(2S)-2-氨基-N-甲基丙酰胺基]丙酸叔丁基酯(84.8mg，0.368mmol)。将混合物搅拌30min。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过ODS硅胶柱色谱法(H2O/MeCN(含有0.1％甲酸)＝98/2至50/50)纯化，以给出(2S)-2-[(2S)-2-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基]-N-甲基丙酰胺基]丙酸叔丁基酯(108.4mg)。LC-MS(ESI):424.4[M+H]+。
(2S)-2-[(2S)-2-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基]-N-甲基丙酰胺基]丙酸的合成
在0℃，向(2S)-2-[(2S)-2-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基]-N-甲基丙酰胺基]丙酸叔丁基酯(108.4mg)在DCM(2mL)中的溶液中添加TFA(2mL，25.96mmol)。将混合物在0℃搅拌30min。将混合物加温至室温并搅拌90min。将所得混合物浓缩并在减压下与甲苯共沸，以给出(2S)-2-[(2S)-2-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基]-N-甲基丙酰胺基]丙酸(94.5mg)。所获得的材料无需进一步纯化即可使用。LC-MS(ESI):368.3[M+H]+。
(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸[(2S)-1-[({4-[(2S)-2-氨基-3-氨基甲酰基丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基]吡咯烷-2-基]甲基酯二铵盐的合成
在0℃，向(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸[(2S)-1-[({4-[(2S)-2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-3-[(三苯基甲基)氨基甲酰基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基]吡咯烷-2-基]甲基酯(50mg，0.034mmol)在1,1,1,3,3,3-六氟丙烷-2-醇(5mL)中的溶液中添加[(1S,4R)-7,7-二甲基-2-氧代双环[2.2.1]庚烷-1-基]甲磺酸(157mg，0.676mmol)。将混合物在0℃搅拌3h。将反应混合物用MeOH淬灭。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过ODS硅胶柱色谱法(H2O/MeCN(包括0.1％氨)＝98/2至40/60)纯化，以给出(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07, 12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸[(2S)-1-[({4-[(2S)-2-氨基-3-氨基甲酰基丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基]吡咯烷-2-基]甲基酯二铵盐(16.1mg)。
LC-MS(ESI):1137.4[M+H]+。
(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸[(2S)-1-[({4-[(2S)-3-氨基甲酰基-2-[(2S)-2-[(2S)-2-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基]-N-甲基丙酰胺基]丙酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基]吡咯烷-2-基]甲基酯双(三乙胺)盐(LP22·2NEt3)的合成
向(2S)-2-[(2S)-2-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基]-N-甲基丙酰胺基]丙酸(16.7mg，0.045mmol)和DIEA(0.048mL，0.275mmol)在DCM(1mL)中的溶液中添加TSTU(12.4mg，0.0.41mmol)。将混合物搅拌1h。向混合物中添加TSTU(6.5mg)。将混合物搅拌30min。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物用DMF(500mL)稀释并添加至(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸[(2S)-1-[({4-[(2S)-2-氨基-3-氨基甲酰基丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基]吡咯烷-2-基]甲基酯二胺(16.1mg，0.14mmol)和DIEA(20mL，0.115mmol)在DMF(1mL)中的溶液中。将混合物搅拌90min。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过ODS硅胶柱色谱法(H2O/MeCN(包含0.1％甲酸)＝98/2至40/60)纯化，以给出粗制材料。将粗制材料通过制备型TLC(CHCl3/MeOH(含有1％ TEA)＝4/1)纯化，以给出(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04, 8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸[(2S)-1-[({4-[(2S)-3-氨基甲酰基-2-[(2S)-2-[(2S)-2-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基]-N-甲基丙酰胺基]丙酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基]吡咯烷-2-基]甲基酯双(三乙胺)盐(LP22·2NEt3)(3.40mg)。
LC-MS(ESI):1486.4[M+H]+。
30.LP23的合成
LP23的合成如下所示：
(2S)-2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-3-[(三苯基甲基)氨基甲酰基]丙酸的合成
在0℃，向(2S)-2-氨基-3-[(三苯基甲基)氨基甲酰基]丙酸(2g，5.34mmol)在THF(14.0mL)和水(14.0mL)中的溶液中添加碳酸钠(1.19g，11.2mmol)。10min后，将二碳酸二叔丁基酯(1.63g，7.48mmol)添加至混合物中。将混合物在室温搅拌4h 20min。将5N HCl添加至混合物中直到pH 4。将水层用EtOAc萃取，并将有机层在减压下浓缩。所获得的粗制(2S)-2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-3-[(三苯基甲基)氨基甲酰基]丙酸(2.53g)无需纯化即可用于下一步骤。LC-MS(ESI):475.4[M+H]+。
N-[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}-2-[(三苯基甲基)氨基甲酰基]乙基]氨基甲酸叔丁基酯的合成
在0℃，向(2S)-2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-3-[(三苯基甲基)氨基甲酰基]丙酸(1.3g，2.74mmol)和(4-氨基苯基)甲醇(0.371g，3.01mmol)在DCM(30mL)和MeOH(10mL)中的溶液中添加2-乙氧基-1,2-二氢喹啉-1-甲酸乙基酯(1.36g，5.48mmol)。将溶液在室温搅拌18h。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(EtOAc/庚烷＝1/1至3/1)纯化，以给出N-[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}-2-[(三苯基甲基)氨基甲酰基]乙基]氨基甲酸叔丁基酯(1.22g)。LC-MS(ESI):580.4[M+H]+。
碳酸{4-[(2S)-2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-3-[(三苯基甲基)氨基甲酰基]丙酰胺基]苯基}甲基4-硝基苯基酯的合成
向N-[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}-2-[(三苯基甲基)氨基甲酰基]乙基]氨基甲酸叔丁基酯(1000mg，1.73mmol)在DCM(30mL)中的溶液中添加4-硝基苯基氯甲酸酯(695mg，3.45mmol)和吡啶(0.279mL，3.45mmol)。将溶液在室温搅拌3.5小时。将所得混合物用EtOAc和10％水性柠檬酸稀释。将有机层分离、用盐水洗涤、经Na2SO4干燥并在减压下浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(EtOAc/庚烷＝1/4至1/1)纯化，以给出碳酸{4-[(2S)-2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-3-[(三苯基甲基)氨基甲酰基]丙酰胺基]苯基}甲基4-硝基苯基酯(1.26g)。LC-MS(ESI):745.6[M+H]+。
(2S)-2-(羟基甲基)吡咯烷-1-甲酸{4-[(2S)-2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-3-[(三苯基甲基)氨基甲酰基]丙酰胺基]苯基}甲基酯的合成
向碳酸{4-[(2S)-2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-3-[(三苯基甲基)氨基甲酰基]丙酰胺基]苯基}甲基4-硝基苯基酯(400mg，0.537mmol)在THF(10mL)和DIEA(0.469mL，2.69mmol)中的溶液中添加[(2S)-吡咯烷-2-基]甲醇(65.2mg，0.644mmol)。将溶液在室温搅拌2h。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过NH硅胶柱色谱法(EtOAc/庚烷＝4/1至1/0)纯化，以给出(2S)-2-(羟基甲基)吡咯烷-1-甲酸{4-[(2S)-2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-3-[(三苯基甲基)氨基甲酰基]丙酰胺基]苯基}甲基酯(343.3mg)。LC-MS(ESI):707.5[M+H]+。
(2S)-2-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)吡咯烷-1-甲酸{4-[(2S)-2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-3-[(三苯基甲基)氨基甲酰基]丙酰胺基]苯基}甲基酯的合成
向(2S)-2-(羟基甲基)吡咯烷-1-甲酸{4-[(2S)-2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-3-[(三苯基甲基)氨基甲酰基]丙酰胺基]苯基}甲基酯(343.3mg，0.486mmol)在DCM(10mL)中的溶液中添加4-硝基苯基氯甲酸酯(196mg，0.971mmol)和吡啶(0.079mL，0.971mmol)。将溶液在室温搅拌2h。将所得混合物用EtOAc和10％水性柠檬酸稀释。将有机层分离、用盐水洗涤、经Na2SO4干燥并在减压下浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(EtOAc/庚烷＝1/4至1/1)纯化，以给出(2S)-2-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)吡咯烷-1-甲酸{4-[(2S)-2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-3-[(三苯基甲基)氨基甲酰基]丙酰胺基]苯基}甲基酯(340mg)。LC-MS(ESI):872.5[M+H]+。
(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸[(2S)-1-[({4-[(2S)-2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-3-[(三苯基甲基)氨基甲酰基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基]吡咯烷-2-基]甲基酯的合成
在室温，向化合物1(50mg，0.059mmol)在THF(5mL)中的悬浮液中添加LiHMDS(0.527mmol)。将所得混合物在室温搅拌30min并冷却至-78℃。向上述混合物中添加THF(0.5mL)中的(2S)-2-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)吡咯烷-1-甲酸{4-[(2S)-2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-3-[(三苯基甲基)氨基甲酰基]丙酰胺基]苯基}甲基酯(45.9mg，0.053mmol)(用THF冲洗(0.5mL))且在-78℃搅拌10min。将所得混合物加温至0℃并搅拌1h。将反应用AcOH(226mL，3.95mmol)淬灭。将混合物加温至室温并搅拌10min。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过ODS硅胶柱色谱法(H2O/MeCN(包含0.1％甲酸)＝95/5至20/80)纯化，以给出(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸[(2S)-1-[({4-[(2S)-2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-3-[(三苯基甲基)氨基甲酰基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基]吡咯烷-2-基]甲基酯(52.3mg)。LC-MS(ESI):1480.6[M+H]+。
(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸[(2S)-1-[({4-[(2S)-3-氨基甲酰基-2-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基]吡咯烷-2-基]甲基酯双(三乙胺)盐(LP23·2NEt3)的合成
在0℃，向(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸[(2S)-1-[({4-[(2S)-2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-3-[(三苯基甲基)氨基甲酰基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基]吡咯烷-2-基]甲基酯(45mg，0.03mmol)在1,1,1,3,3,3-六氟丙烷-2-醇(4mL)中的溶液中添加CSA(141mg，0.608mmol)。将混合物在0℃搅拌4h。将反应混合物用MeOH淬灭。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过ODS硅胶柱色谱法(H2O/MeCN(包含0.1％甲酸)＝98/2至50/50)纯化，以给出粗制化合物(191.4mg)。向DMF(500mL)中的一部分所获得的粗制材料(63.8mg)和DIEA(52.9mL，0.303mmol)中添加6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(2.80mg，9.09mmol)。将混合物搅拌1h。向混合物中添加6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(12mg)并搅拌30min。向混合物中添加6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(18mg)并搅拌30min。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过ODS硅胶柱色谱法(H2O/MeCN(包含0.1％甲酸)＝98/2至50/50)纯化，以给出粗制材料。将粗制材料通过正相制备型TLC(CHCl3/MeOH(包括1％TEA)＝4/1)纯化，以给出(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-34,39-二硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-13-甲酸[(2S)-1-[({4-[(2S)-3-氨基甲酰基-2-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲氧基)羰基]吡咯烷-2-基]甲基酯双(三乙胺)盐(LP23·2NEt3)(3.35mg)。
LC-MS(ESI):1330.8[M+H]+。
31.LP32和LP31的合成
LP32和LP31的合成如下所示：
Boc-Val-Ala-pAB-MEC-(N39)-化合物2和Boc-Val-Ala-pAB-MEC-(N34)-化合物2的合成
向化合物2的二铵盐(50mg，0.064mmol)中添加THF(3mL)并将所得浆液真空浓缩。将该共沸干燥过程再重复两次。将所得材料溶解于THF(5mL)中并在室温用LiHMDS(1.5M，0.385mL，0.578mmol)在THF中的溶液处理。在室温10min后，将反应混合物冷却至-78℃。然后添加甲基(2-(((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)乙基)氨基甲酸4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)苄基酯(42.4mg，0.064mmol)在THF(0.84mL)中的溶液。将所得混合物在1.5h内缓慢加温至0℃。在0℃-10℃之间1.5h后，将反应用AcOH(0.1mL，1.7mmol)淬灭。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过制备型HPLC在以下条件下纯化：柱：XBridge Prep OBD C18柱，19*100mm，5μm；流动相A：水(50mM TEA+50mM六氟异丙醇)，流动相B：MeCN(50mM TEA+50mM六氟异丙醇)；流速：40mL/min；温度：rt；梯度：1％ B(t＝0-2.0min)、15％ B(t＝2.1min)、35％ B(t＝16.3min)、95％ B(t＝16.4min)、1％ B(t＝17.2-17.9min)；波长：260nm；运行时间＝18min。这产生18.9mg Boc-Val-Ala-pAB-MEC-(N39)-化合物2和5.2mg Boc-Val-Ala-pAB-MEC-(N34)-化合物2。
Boc-Val-Ala-pAB-MEC-(N39)-化合物2：LC-MS(ESI):1265.32[M+H]+。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ8.88(br s,1H),8.78-8.64(m,1H),8.59(br s,1H),8.16(s,1H),7.61-7.50(m,2H),7.28(br d,J＝7.5Hz,1H),7.19(br d,J＝7.3Hz,1H),6.45-6.24(m,2H),6.04(d,J＝51.4Hz,1H),5.51(d,J＝51.3Hz,1H),5.17-4.92(m,2H),4.95-4.54(m,5H),4.49(brd,J＝10.4Hz,2H),4.44-4.30(m,3H),4.29-4.12(m,1H),4.02(br dd,J＝3.6,11.4Hz,1H),3.98-3.87(m,2H),3.86-3.70(m,1H),3.65-3.40(m,2H),3.35(s,1H),3.25-3.11(m,12H),2.83-2.70(m,3H),2.07(br d,J＝4.6Hz,1H),1.44(br s,12H),1.28(br t,J＝7.3Hz,18H),0.98(br d,J＝6.5Hz,3H),0.93(br d,J＝6.4Hz,3H)。分析型HPLC RT＝9.70min[柱：Xbridge Premier BEH C18柱，2.5μm(2.1mm ID x150mm)；流动相A：水(50mM TEA+50mM六氟异丙醇)，流动相B：MeCN(50mM TEA+50mM六氟异丙醇)；流速：0.5mL/min；温度：60；梯度：1％B(t＝0-1.0min)、15％ B(t＝1.1min)、35％B(t＝20.9min)、95％ B(t＝21.0min)、1％ B(t＝22.1-24.0min)；波长：260nm；运行时间＝25min]。
Boc-Val-Ala-pAB-MEC-(N34)-化合物2：LC-MS(ESI):1265.32[M+H]+。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ9.30(br s,0.5H),9.09(br s,0.5H),8.83-8.63(m,1H),8.47(br s,1H),8.13(br s,0.5H),7.97(br s,0.5H),7.61-7.51(m,2H),7.28(br d,J＝7.0Hz,1H),7.20(br d,J＝7.4Hz,1H),6.54-6.15(m,2H),5.94-5.28(m,2H),5.22-5.06(m,1H),4.97(br s,1H),4.82-4.57(m,5H),4.49(br d,J＝7.0Hz,2H),4.41(br s,2H),4.35-4.11(m,2H),4.04(br d,J＝9.6Hz,1H),3.99-3.76(m,3H),3.60-3.43(m,1H),3.37-3.34(m,2H),3.26-3.09(m,12H),2.76(br s,3H),2.17-2.00(m,1H),1.44(s,12H),1.30(t,J＝7.3Hz,18H),0.98(br d,J＝6.5Hz,3H),0.94(br d,J＝6.6Hz,3H)。分析型HPLC RT＝8.98[柱：Xbridge Premier BEH C18柱，2.5μm(2.1mm ID x 150mm)；流动相A：水(50mM TEA+50mM六氟异丙醇)，流动相B：MeCN(50mM TEA+50mM六氟异丙醇)；流速：0.5mL/min；温度：60；梯度：1％ B(t＝0-1.0min)、15％ B(t＝1.1min)、35％B(t＝20.9min)、95％ B(t＝21.0min)、1％B(t＝22.1-24.0min)；波长：260nm；运行时间＝25min]。
Val-Ala-pAB-MEC-(N39)-化合物2的合成
在室温，向Boc-Val-Ala-pAB-MEC-(N39)-化合物2(18.9mg，0.013mmol)在DCM(2mL)中的溶液中添加TFA(0.75mL)。将反应混合物在室温搅拌0.5h，然后用MTBE(5mL)处理。对所得浆液混合物进行离心。将所得固体倾析，随后真空干燥过夜，得到16.5mg呈灰白色固体的目标产物。LC-MS(ESI):1165.05[M+H]+。
Val-Ala-pAB-MEC-(N34)-化合物2的合成
在室温，向Boc-Val-Ala-pAB-MEC-(N34)-化合物2(5.2mg，0.0052mmol)在DCM(0.8mL)中的溶液中添加TFA(0.3mL)。将反应混合物在室温搅拌0.5h，然后用MTBE(2.5mL)处理。对所得浆液混合物进行离心。将所得固体倾析，随后真空干燥过夜，得到4.0mg呈灰白色固体的目标产物。LC-MS(ESI):1165.10[M+H]+。
LP32的合成
在室温，向Val-Ala-pAB-MEC-(N39)-化合物2(5.3mg，0.0041mmol)在DMF(0.5mL)中的溶液中添加TEA(0.010mL，0.072mmol)和6-(2,5-二氧代吡咯-1-基)己酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(2.0mg，0.0065mmol)。将所得混合物在室温搅拌10min并用额外的6-(2,5-二氧代吡咯-1-基)己酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(2.0mg，0.0065mmol)处理。在室温搅拌3h后，将反应混合物保持在-20℃过周末、加温至室温并通过硅胶柱色谱法(15％至30％MeOH，在EtOAc中，用1％三乙胺缓冲)纯化。这产生3.2mg呈白色固体的目标产物LP32·2NEt3。
LC-MS(ESI):1358.00[M+H]+。
1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ8.89(br s,1H),8.77-8.65(m,1H),8.63-8.53(m,1H),8.16(br s,1H),7.56(br dd,J＝7.9,14.3Hz,2H),7.37-7.25(m,1H),7.19(br d,J＝7.3Hz,1H),6.77(br s,2H),6.42-6.22(m,2H),6.04(d,J＝49.8Hz,1H),5.51(d,J＝49.5Hz,1H),5.15-4.92(m,3H),4.82-4.53(m,4H),4.52-4.25(m,5H),4.24-4.12(m,2H),4.02(br dd,J＝3.8,11.4Hz,1H),3.93(br d,J＝8.4Hz,1H),3.88-3.70(m,1H),3.67-3.52(m,1H),3.50-3.35(m,4H),3.24-3.13(m,12H),2.78(br s,3H),2.28(br s,2H),2.15-2.05(m,1H),1.67-1.49(m,4H),1.44(br d,J＝6.9Hz,3H),1.29(br t,J＝7.3Hz,18H),1.18-1.05(m,2H),0.99-0.88(m,6H)。
LP31的合成
在室温，向Val-Ala-pAB-MEC-(N34)-化合物2(4.0mg，0.0031mmol)在DMF(0.4mL)中的溶液中添加TEA(0.010mL，0.072mmol)和6-(2,5-二氧代吡咯-1-基)己酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(4.0mg，0.013mmol)。在室温搅拌8h后，将反应混合物通过硅胶柱色谱法(15％至30％ MeOH，在EtOAc中，用1％三乙胺缓冲)纯化。这产生3.3mg呈白色固体的目标产物LP31·2NEt3。
LC-MS(ESI):1359.96[M+H]+。
1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ9.40-9.25(m,0.5H),9.15-9.03(m,0.5H),8.85-8.62(m,1H),8.55-8.39(m,1H),8.23-7.91(m,1H),7.62-7.49(m,2H),7.33-7.25(m,1H),7.22-7.12(m,1H),6.78(s,2H),6.56-6.17(m,2H),5.93-5.31(m,2H),5.23-5.06(m,1H),5.01-4.93(m,1H),4.74-4.54(m,5H),4.53-4.24(m,5H),4.18(br d,J＝7.0Hz,2H),4.09-4.00(m,1H),3.98-3.89(m,1H),3.86-3.70(m,1H),3.58-3.38(m,5H),3.28-3.12(m,12H),2.76(br s,3H),2.28(br t,J＝6.7Hz,2H),2.17-2.01(m,1H),1.69-1.50(m,4H),1.45(br d,J＝6.3Hz,3H),1.31(t,J＝7.2Hz,18H),1.21-1.07(m,2H),1.04-0.90(m,6H)。
32.LP33的合成和LP3的替代合成
LP3的合成如下所示：
6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]己酰胺的合成
将DIPEA(1.32g，10.2mmol)和6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(1.58g，5.11mmol)添加至(2S)-2-氨基-N-[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]-3-甲基丁酰胺(1.5g，5.1mmol)在DMF(40mL)中的溶液中。将所得混合物在室温搅拌2h。将所得混合物用EtOAc稀释、用水洗涤并浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(用CH2Cl2/MeOH(10:1)洗脱)纯化。这产生2.0g呈灰白色固体的6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]己酰胺。LC-MS(ESI):487[M+H]+。
6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(碘甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]己酰胺的合成
将碘化铯(801mg，3.08mmol)和BF3.Et2O(438mg，3.08mmol)添加至6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]己酰胺(1.0g，2.06mmol)在乙腈(10mL)中的溶液中。将所得混合物在室温搅拌2h。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(用CH2Cl2/iPrOH(10:1)洗脱)纯化。这产生700mg呈白色固体的6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(碘甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]己酰胺。LC-MS(ESI):597[M+H]+。
N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-({[(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-39-硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023 ,27}]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-34-基]硫烷基}甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-6-(2,5-二氧代吡咯-1-基)己酰胺(LP3)和N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-({[(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-39-硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-34-基]硫烷基}甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺(LP33)的合成
将6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(碘甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]己酰胺(480mg，0.805mmol)和DIPEA(208mg，1.61mmol)添加至化合物1(600mg，0.805mmol)在DMF(5mL)中的溶液中。将所得混合物在室温搅拌2小时。将粗制溶液通过制备型HPLC用以下条件纯化(柱：XBridge Prep OBDC18柱，19*250mm，5μm；流动相A：水(0.05％FA)，流动相B：MeCN；流速：25mL/min；梯度：在8min内32％ B至32％ B，32％ B；波长：254nm；RT＝13min)。这产生108mg目标产物LP3和78.9mg LP33。
LP3：LC-MS(ESI):1215.3[M+H]+。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ(ppm)＝8.77-8.46(m,1H),8.30-7.90(m,6H),7.40(br s,2H),7.22-6.85(m,2H),6.77(s,2H),6.45(br d,J＝14.5Hz,1H),6.25(br d,J＝19.9Hz,1H),5.90-5.10(m,6H),4.75-3.50(m,14H),,3.46(t,J＝7.0Hz,2H),2.28(t,J＝7.4Hz,2H),2.16-2.04(m,1H),1.70-1.50(m,4H),1.47-1.37(m,3H),1.35-1.24(m,2H),0.97(t,J＝7.0Hz,6H)。分析型HPLC RT＝6.74min(仪器：ShimadzuLC20AD；柱：HALO C18(4.6mmID x 100mm)；流动相A：水(0.05％ TFA)，流动相B：MeCN(0.05％TFA)；流速：1.5mL/min；温度：40℃；梯度：10％ B(t＝0.01min)、70％ B(t＝10min)、95％ B(t＝12至14min)；波长：254nm)
LP33：LC-MS(ESI):1215.3[M+H]+。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ8.75–8.43(m,1H),8.37–7.79(m,3H),7.70–7.37(m,4H),6.89–6.78(m,2H),6.57–6.22(m,2H),5.98–5.51(m,2H),4.62–4.35(m,4H),4.36–4.21(m,3H),4.18–3.96(m,4H),3.93–3.71(m,1H),3.54–3.42(m,2H),2.34–2.24(m,2H),2.16–2.01(m,1H),1.70–1.51(m,4H),1.44–1.36(m,3H),1.36–1.26(m,3H),1.06–0.89(m,6H)。分析型HPLC RT＝6.64min(仪器：Shimadzu LC20AD；柱：HALO C18(4.6mmID x 100mm)；流动相A：水(0.05％ TFA)，流动相B：MeCN(0.05％ TFA)；流速：1.5mL/min；温度：40℃；梯度：10％ B(t＝0.01min)、70％ B(t＝10min)、95％ B(t＝12至14min)；波长：254nm)
33.LP34的合成
LP34的合成如下所示：
6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-((S)-1-(((S)-1-((4-(碘甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊烷-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)己酰胺的合成
在室温，向6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-((S)-1-(((S)-1-((4-(羟基甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊烷-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)己酰胺(55mg，0.096mmol)在DMF(0.5mL)中的溶液中添加甲基三苯氧基碘化鏻(90mg，0.199mmol)。将所得混合物在室温避光搅拌过夜。添加额外的甲基三苯氧基碘化鏻(30mg)。4h后，将反应混合物用20mL EtOAc稀释并用Na2S2O3的饱和溶液(10mL)洗涤。将水层用EtOAc(10mL)萃取。将合并的有机层用30％ NaCl水溶液(5mL)洗涤并经Na2SO4干燥、过滤并真空浓缩。将所得固体进一步真空干燥并且无需进一步纯化即可用于下一步骤。LC-MS(ESI):683.20[M+H]+。
N-((S)-1-(((S)-1-((4-((((19S,22R,23R,23Ar,25S,27Ar,29R,210R,210Ar,212R,214Ar,39S,E)-23,210-二氟-212-巯基-25,212-二氧化物-23,23a,27a,29,210,210a,214,214a-八氢-19H,22H,27H,39H-4,9-二氮杂-1,3(9,6)-二嘌呤杂-2(2,9)-二呋喃并[3,2-d:3’,2’-j][1,3,7,9]四氧杂[2,8]二磷杂环十二烷环九蕃(diphosphacyclododecinacyclononaphan)-6-烯-25-基)硫代)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊烷-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺(LP34)的合成
将(19S,22R,23R,23Ar,25R,27Ar,29R,210R,210Ar,212S,214Ar,39S,E)-23,210-二氟-25,212-二巯基-23,23a,27a,29,210,210a,214,214a-八氢-19H,22H,27H,39H-4,9-二氮杂-1,3(9,6)-二嘌呤杂-2(2,9)-二呋喃并[3,2-d:3’,2’-j][1,3,7,9]四氧杂[2,8]二磷杂环十二烷环九蕃-6-烯25,212-二氧化物,二钠盐(50mg，0.063mmol)和6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-((S)-1-(((S)-1-((4-(碘甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊烷-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)己酰胺(65.6mg，0.053mmol)在DMF(2.5ml)中的溶液在室温避光搅拌过夜。将所得溶液通过制备型HPLC纯化，这产生10.4mg目标产物LP34。
LC-MS(ESI):1301.38[M+H]+。
34.LP35的合成
LP35的合成如下所示：
N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲基酯的合成
在黑暗下向(2S)-2-[(2S)-2-({[(9H-芴-9-基)甲氧基]羰基}氨基)-3-甲基丁酰胺基]丙酸(5.53g，13.472mmol)在DCM(150ml)和MeOH(20ml)中的溶液中分批添加4-氨基苄醇(1.991g，16.167mmol)和1-乙氧基羰基-2-乙氧基-1,2-二氢喹啉(6.66g，26.945mmol)。将混合物在室温搅拌16小时。收集沉淀物并将它用DCM/MeOH(200mL，9/1)和MTBE(100mL)洗涤，以给出N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲基酯(4.57g)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm0.87(brd,J＝6.78Hz,3H)0.90(br d,J＝6.78Hz,3H)1.31(d,J＝7.03Hz,3H)1.94-2.06(m,1H)3.92(br t,J＝7.97Hz,1H)4.17-4.35(m,3H)4.44(br d,J＝5.52Hz,3H)5.11(t,J＝5.65Hz,1H)7.24(d,J＝8.41Hz,2H)7.29-7.37(m,2H)7.38-7.49(m,3H)7.54(d,J＝8.28Hz,2H)7.75(brt,J＝7.15Hz,2H)7.90(d,J＝7.40Hz,2H)8.18(br d,J＝7.03Hz,1H),9.93(s,1H)
(2S)-2-(3-{2-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基]乙氧基}丙酰胺基)-N-[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]-3-甲基丁酰胺的合成
向((S)-1-(((S)-1-((4-(羟基甲基)苯基)氨基)-1-氧代丙烷-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲基酯(382mg，0.741mmol)在DMF(10ml)中的溶液中添加二乙胺(0.369ml，3.528mmol)。将反应混合物在室温搅拌1小时。将溶剂在减压下除去。将所获得的残余物溶解于DMF(10ml)中并添加3-{2-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基]乙氧基}丙酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(250mg，0.706mmol)。将反应在室温搅拌16小时。将溶剂真空除去，并将所获得的残余物通过硅胶色谱法纯化，以给出(2S)-2-(3-{2-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基]乙氧基}丙酰胺基)-N-[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]-3-甲基丁酰胺(117mg)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 0.84(br d,J＝6.78Hz,3H)0.88(br d,J＝6.78Hz,3H)1.31(d,J＝7.15Hz,3H)1.90–2.02(m,1H)2.32-2.48(m,2H)3.40-3.60(m,10H)4.21(dd,J＝8.34,6.96Hz,1H)4.36-4.45(m,3H)5.10(t,J＝5.71Hz,1H)7.03(s,2H)7.24(d,J＝8.41Hz,2H)7.54(d,J＝8.53Hz,2H)7.87(br d,J＝8.66Hz,1H)8.16(br d,J＝7.03Hz,1H)9.84(s,1H)。
(2S)-2-(3-{2-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基]乙氧基}丙酰胺基)-N-[(1S)-1-{[4-(碘甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]-3-甲基丁酰胺的合成
在室温，向(S)-2-(3-(2-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙氧基)丙酰胺基)-N-((S)-1-((4-(羟基甲基)苯基)氨基)-1-氧代丙烷-2-基)-3-甲基丁酰胺(70mg，0.131mmol)在乙腈(2ml，38.292mmol)中的溶液中添加三氟化硼乙醚络合物(0.021ml，0.171mmol)，然后是碘化铯(41.0mg，0.158mmol)。将混合物在室温搅拌16小时。将反应混合物用DCM(50mL)稀释，并将有机层用H2O(10mL)和饱和水性NaHCO3(10mL)洗涤。将合并的水层用DCM(15mlx2)萃取。然后将合并的有机层用5％水性NaHSO3洗涤并经Na2SO4干燥。滤出固体并将溶剂在减压下除去。所获得的粗制材料(66.4mg)无需进一步纯化即可用于下一步骤。
(2S)-N-[(1S)-1-{[4-({[(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-39-硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-34-基]硫烷基}甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]-2-(3-{2-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基]乙氧基}丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺(LP35)的合成
在0℃，向化合物1(70mg，0.094mmol)和DIPEA(0.066ml，0.375mmol)在DMF(2ml)中的悬浮液中添加DMF(2ml)中的粗制(S)-2-(3-(2-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙氧基)丙酰胺基)-N-((S)-1-((4-(碘甲基)苯基)氨基)-1-氧代丙烷-2-基)-3-甲基丁酰胺(60.2mg)。使反应混合物加温至室温并搅拌16小时。将溶剂在减压下除去，并将所获得的粗制材料通过反相HPLC纯化，以给出(2S)-N-[(1S)-1-{[4-({[(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-39-硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-34-基]硫烷基}甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]-2-(3-{2-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基]乙氧基}丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺(LP35)(14.6mg)。
ESI[M+H]+1261.03。
35.LP36的合成
LP36的合成如下所示：
1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺的合成
向((S)-1-(((S)-1-((4-(羟基甲基)苯基)氨基)-1-氧代丙烷-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲基酯(306mg，0.593mmol)在DMF(10ml)中的溶液中添加二乙胺(0.295ml，2.825mmol)。将反应混合物在室温搅拌1小时，然后将溶剂在减压下除去。将所获得的残余物溶解于DMF(10ml)中并添加1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(250mg，0.565mmol)并将反应混合物在室温搅拌16小时。将溶剂在减压下除去，并将所获得的残余物通过硅胶色谱法纯化，以给出产物(223mg)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 0.84(br d,J＝6.78Hz,3H)0.88(br d,J＝6.65Hz,3H)1.31(br d,J＝7.03Hz,3H)1.91–2.03(m,1H)2.33-2.48(m,2H)3.42-3.62(m,18H)4.21(br dd,J＝8.47,6.84Hz,1H)4.35-4.46(m,3H)5.10(t,J＝5.65Hz,1H)7.03(s,2H)7.24(d,J＝8.41Hz,2H)7.54(d,J＝8.41Hz,2H)7.89(brd,J＝8.53Hz,1H)8.16(br d,J＝6.90Hz,1H)9.84(s,1H)。
1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(碘甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺的合成
在室温，向1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺(80mg，0.129mmol)在乙腈(2ml)中的溶液中添加三氟化硼乙醚络合物(0.021ml，0.168mmol)，然后添加碘化铯(40.2mg，0.155mmol)(分批)。将反应混合物在室温搅拌16小时、然后用DCM(50mL)稀释。将有机层用H2O(10mL)和饱和水性NaHCO3(10mL)洗涤，并将合并的水层用DCM(15ml x 2)萃取。将合并的有机层用5％水性NaHSO3洗涤并经Na2SO4干燥。用过滤器除去固体并将溶剂在减压下除去。粗制材料无需进一步纯化即可用于下一步骤。
N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-({[(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-39-硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023 ,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-34-基]硫烷基}甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺(LP36)的合成
在0℃，向化合物1(70mg，0.094mmol)和DIPEA(0.066ml，0.375mmol)在DMF(2ml)中的溶液中添加DMF(2ml)中的1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(碘甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺(68.5mg，0.075mmol)。使反应混合物加温至室温并搅拌16小时。将溶剂在减压下除去，并将所获得的粗制材料通过反相HPLC纯化，以给出LP36(14.0mg)。
ESI[M+H]+:1349.18。
36.LP37的合成
LP37的合成如下所示：
(S)-2-((S)-2-(3-(2-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-N-(4-(碘甲基)苯基)-5-脲基戊酰胺的合成
在室温，向(S)-2-((S)-2-(3-(2-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-N-(4-(羟基甲基)苯基)-5-脲基戊酰胺(50mg，0.081mmol)在DMF(1mL)中的溶液中添加甲基三苯氧基碘化鏻(110mg，0.242mmol)。将所得混合物在室温避光搅拌5h。将反应混合物用20mL EtOAc稀释并用Na2S2O3的饱和溶液(5mL)洗涤。将水层用EtOAc(10mL)萃取。将合并的有机层用30％ NaCl水溶液(5mL)洗涤、经Na2SO4干燥、过滤并真空浓缩。将所得固体进一步真空干燥并且无需进一步纯化即可用于下一步骤。LC-MS(ESI):729.32[M+H]+。
(S)-N-(4-((((19S,22R,23R,23aR,25S,27aR,29R,210R,210aR,212R,214aR,39S,E)-23,210-二氟-212-巯基-25,212-二氧化物-23,23a,27a,29,210,210a,214,214a-八氢-19H,22H,27H,39H-4,9-二氮杂-1,3(9,6)-二嘌呤杂-2(2,9)-二呋喃并[3,2-d:3',2'-j][1,3,7,9]四氧杂[2,8]二磷杂环十二烷环九蕃-6-烯-25-基)硫代)甲基)苯基)-2-((S)-2-(3-(2-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺(LP37)的合成
将(19S,22R,23R,23aR,25R,27aR,29R,210R,210aR,212S,214aR,39S,E)-23,210-二氟-25,212-二巯基-23,23a,27a,29,210,210a,214,214a-八氢-19H,22H,27H,39H-4,9-二氮杂-1,3(9,6)-二嘌呤杂-2(2,9)-二呋喃并[3,2-d:3',2'-j][1,3,7,9]四氧杂[2,8]二磷杂环十二烷环九蕃-6-烯25,212-二氧化物,二钠盐(70mg，0.088mmol)和(S)-2-((S)-2-(3-(2-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-N-(4-(碘甲基)苯基)-5-脲基戊酰胺(57.2mg，0.071mmol)在DMF(2.5ml)中的溶液在室温避光搅拌30min。将所得溶液保持在-20℃过周末、加温至室温并用40mL EtoAc处理。将所得固体通过过滤收集、用EtOAc冲洗并真空干燥。将所得固体通过制备型HPLC进一步纯化，这产生8.7mg目标产物LP37。
LC-MS(ESI):1347.28[M+H]+。
37.LP38的合成
LP38的合成如下所示：
1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-((S)-1-(((S)-1-((4-(碘甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊烷-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺的合成
在室温，向1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-((S)-1-(((S)-1-((4-(羟基甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊烷-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺(70mg，0.099mmol)在DMF(1mL)中的溶液中添加甲基三苯氧基碘化鏻(134mg，0.297mmol)。将所得混合物在室温避光搅拌过夜。将反应混合物用15mLDCM稀释并用Na2S2O3的饱和溶液(5mL)洗涤。将水层用DCM(10mL)萃取。将合并的有机层用30％ NaCl水溶液(5mL)洗涤、经Na2SO4干燥、过滤并真空浓缩。将所得固体进一步真空干燥并且无需进一步纯化即可用于下一步骤。LC-MS(ESI):817.22[M+H]+。N-((S)-1-(((S)-1-((4-((((19S,22R,23R,23aR,25S,27aR,29R,210R,210aR,212R,214aR,39S,E)-23,210-二氟-212-巯基-25,212-二氧化物-23,23a,27a,29,210,210a,214,214a-八氢-19H,22H,27H,39H-4,9-二氮杂-1,3(9,6)-二嘌呤杂-2(2,9)-二呋喃并[3,2-d:3',2'-j][1,3,7,9]四氧杂[2,8]二磷杂环十二烷环九蕃-6-烯-25-基)硫代)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊烷-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺(LP38)的合成
将(19S,22R,23R,23aR,25R,27aR,29R,210R,210aR,212S,214aR,39S,E)-23,210-二氟-25,212-二巯基-23,23a,27a,29,210,210a,214,214a-八氢-19H,22H,27H,39H-4,9-二氮杂-1,3(9,6)-二嘌呤杂-2(2,9)-二呋喃并[3,2-d:3',2'-j][1,3,7,9]四氧杂[2,8]二磷杂环十二烷环九蕃-6-烯25,212-二氧化物,二钠盐(80mg，0.101mmol)和1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-((S)-1-(((S)-1-((4-(碘甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊烷-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺(82mg，0.10mmol)在DMF(2.5ml)中的溶液在室温避光搅拌1h。将所得溶液用30mL EtOAc处理。将所得固体通过过滤收集、用EtOAc冲洗并真空干燥。将所得固体通过制备型HPLC进一步纯化，这产生13.5mg目标产物LP38。
LC-MS(ESI):1435.32[M+H]+。
38.LP39的合成
LP39的合成如下所示：
N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[3-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲基酯的合成
向Fmoc-Val-Ala-OH(400mg，0.974mmol)和(3-氨基苯基)甲醇(180mg，1.462mmol)在DMF(10mL)中的溶液中添加DIPEA(0.851mL，4.872mmol)和HATU(741mg，1.949mmol)。将反应混合物在室温搅拌2小时，然后在减压下除去过量的DMF。向所获得的残余物中添加水(50mL)以给出沉淀物。收集沉淀物并将它用H2O和MTBE洗涤，以给出呈淡棕色固体的产物(318mg)。
6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[3-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]己酰胺的合成
向((S)-1-(((S)-1-((3-(羟基甲基)苯基)氨基)-1-氧代丙烷-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲基酯(299mg，0.579mmol)在DMF(6ml)中的溶液中添加二乙胺(0.288ml，2.757mmol)。将反应混合物在室温搅拌1小时，然后将溶剂在减压下除去。将所获得的残余物溶解于DMF(6ml)中并添加6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(170mg，0.551mmol)且在室温搅拌2小时。将溶剂在减压下除去，并将所获得的残余物通过反相硅胶色谱法(H2O/MeCN/HCOOH＝95/5/0.1至50/50/0.1)纯化，以给出产物(85.1mg)。
6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[3-(碘甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]己酰胺的合成
在室温，向6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-((S)-1-(((S)-1-((3-(羟基甲基)苯基)氨基)-1-氧代丙烷-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)己酰胺(86.1mg，0.177mmol)在乙腈(2ml)中的溶液中添加三氟化硼乙醚络合物(0.028ml，0.23mmol)，然后是碘化铯(55.2mg，0.212mmol)。将混合物在室温搅拌16小时，然后用DCM(50mL)稀释。将有机层用H2O(10mL)和饱和水性NaHCO3(10mL)洗涤。将合并的水层用DCM(15mlx 2)萃取，并且将合并的有机层用5％水性NaHSO3洗涤并经Na2SO4干燥。用过滤器除去固体并将溶剂在减压下除去。所获得的粗制材料无需进一步纯化即可用于下一步骤。
N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[3-({[(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-39-硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023 ,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-34-基]硫烷基}甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺(LP39)的合成
在0℃，向化合物1(50mg，0.067mmol)和DIPEA(0.047ml，.268mmol)在DMF(2ml，25.829mmol)中的悬浮液中添加DMF(2ml)中的6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[3-(碘甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]己酰胺(53.3mg，0.054mmol)。使反应混合物加温至室温并搅拌16小时。将溶剂在减压下除去，并将所获得的粗制材料通过反相HPLC纯化，以给出LP39(6.5mg)。
LC-MS(ESI):1214.93[M+H]+。
39.LP40的合成
LP40的合成如下所示：
N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[3-氯-4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲基酯的合成
向(2S)-2-[(2S)-2-({[(9H-芴-9-基)甲氧基]羰基}氨基)-3-甲基丁酰胺基]丙酸(600mg，1.462mmol)和(4-氨基-2-氯苯基)甲醇(346mg，2.193mmol)在DMF中的溶液中添加DIPEA(1277μl，7.309mmol)，然后是HATU(1112mg，2.923mmol)。将反应在室温搅拌2小时，然后在减压下除去DMF。将水(50mL)添加至残余物中并收集出现的沉淀物。将沉淀物通过硅胶色谱法(己烷/EtOAc＝50/50至0/100)纯化，以给出产物(197mg)。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δppm 0.87
–1.11(m,6H)1.11–1.35(m,3H)1.45(dd,J＝7.15,1.88Hz,2H)1.95
–2.14(m,1H)3.10 -3.31(m,1H)3.34–3.38(m,1H)3.80(br d,J＝8.53Hz,1H)3.96(br d,J＝6.90Hz,1H)4.07–4.31(m,1H)4.34–4.57(m,3H)4.61(s,1H)4.66(s,1H)7.25–7.50(m,5H)7.53–7.73(m,3H)7.76–7.82(m,2H)。
N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[3-氯-4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺的合成
向((S)-1-(((S)-1-((3-氯-4-(羟基甲基)苯基)氨基)-1-氧代丙烷-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲基酯(196mg，0.357mmol)在DMF(5ml)中的溶液中添加二乙胺(0.169ml，1.622mmol)。将反应混合物在室温搅拌1小时，然后将溶剂在减压下除去。将所获得的残余物溶解于DMF(5ml)中并添加添加6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(100mg，0.324mmol)且在室温搅拌2小时。将溶剂在减压下除去，并将所获得的残余物通过反相硅胶色谱法(H2O/MeCN/HCOOH＝95/5/0.1至50/50/0.1)纯化，以给出粗制产物。将粗制产物悬浮于DCM/MeOH(9/1)中，并且收集并干燥沉淀物，以给出呈白色固体的产物(97.0mg)。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δppm0.92–1.14(m,6H)1.14–1.36(m,4H)1.42–1.69(m,7H)2.07(br d,J＝16.06Hz,1H)2.22–2.34(m,2H)2.83–2.89(m,1H)3.01(s,1H)3.34–3.53(m,2H)3.96(br d,J＝8.41Hz,1H)4.18(br s,1H)4.43–4.58(m,1H)4.66(s,2H)6.78(s,1H)6.79–6.82(m,1H)7.40–7.51(m,1H)7.64–7.71(m,1H)7.79(s,1H)7.87(s,1H)8.00(s,1H)。
N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[3-氯-4-(碘甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺的合成
在室温，向N-((S)-1-(((S)-1-((3-氯-4-(羟基甲基)苯基)氨基)-1-氧代丙烷-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺(93.4mg，0.179mmol)在乙腈(2ml)中的溶液中添加三氟化硼乙醚络合物(0.029ml，0.233mmol)，然后是碘化铯(55.9mg，0.215mmol)。将混合物在室温搅拌16小时，然后用DCM(50mL)稀释。将有机层用H2O(10mL)和饱和水性NaHCO3(10mL)洗涤。将合并的水层用DCM(15ml x 2)萃取，并且将合并的有机层用5％水性NaHSO3洗涤并经Na2SO4干燥。用过滤器除去固体并将溶剂在减压下除去。所获得的粗制材料无需进一步纯化即可用于下一步骤(80.4mg，通过UPLC上的UV测得纯度为58％)。LC-MS(ESI):631.67[M+H]+。
N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[3-氯-4-({[(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-39-硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019, 24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-34-基]硫烷基}甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺(LP40)的合成
在0℃，向化合物1(70mg，0.094mmol)和DIPEA(0.047ml，.268mmol)在DMF(2ml)中的悬浮液中添加DMF(2ml)中的N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[3-氯-4-(碘甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺(79.0mg，58％纯度，0.0726mmol)。使反应混合物加温至室温并搅拌16小时。将溶剂在减压下除去，并将所获得的粗制材料通过反相HPLC纯化，以给出LP40(9.7mg)。
LC-MS(ESI):1249.01[M+H]+。
40.LP41的合成
LP41的合成如下所示：
N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[6-(羟基甲基)吡啶-3-基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲基酯的合成
向(2S)-2-[(2S)-2-({[(9H-芴-9-基)甲氧基]羰基}氨基)-3-甲基丁酰胺基]丙酸(840mg，2.046mmol)和(5-氨基吡啶-2-基)甲醇(381mg，3.07mmol)在DMF(15ml)中的溶液中添加DIPEA(1.787ml，10.232mmol)，然后添加HATU(1556mg，4.093mmol)(分批)。将反应在室温搅拌2小时并在减压下除去DMF。向所获得的残余物中添加水(50mL)并收集出现的沉淀物。将沉淀物用H2O和MTBE洗涤，以给出呈淡棕色固体的产物(1.15g)。
6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[6-(羟基甲基)吡啶-3-基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]己酰胺的合成
向((S)-1-(((S)-1-((6-(羟基甲基)吡啶-3-基)氨基)-1-氧代丙烷-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲基酯(1117mg，1.946mmol)在DMF(20ml)中的溶液中添加二乙胺(0.847ml，8.109mmol)。将反应混合物在室温搅拌1小时，然后将溶剂在减压下除去。将所获得的残余物溶解于DMF(20ml)中并添加6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(500mg，1.622mmol)且在室温搅拌2小时。将溶剂在减压下除去，并将所获得的残余物通过反相色谱法(H2O/MeCN/HCOOH＝95/5/0.1至50/50/0.1)纯化，以给出产物。产物含有杂质，因此将材料悬浮于DCM/MeOH(9/1)中，并且收集并干燥沉淀物，以给出白色固体(110mg)。
6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[6-(碘甲基)吡啶-3-基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]己酰胺的合成
在室温，向6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-((S)-1-(((S)-1-((6-(羟基甲基)吡啶-3-基)氨基)-1-氧代丙烷-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)己酰胺(71mg，0.146mmol)在DMF(2ml)中的溶液中分批添加甲基三苯氧基碘化鏻(198mg，0.437mmol)。将反应搅拌2小时，然后将混合物用EtOAc(50mL)稀释，然后将反应通过添加10％水性NaS2O3(20mL)淬灭。分离各相，并将水层用EtOAc(20mL)萃取一次。将合并的有机层用H2O和盐水(每次20mL)洗涤、然后经Na2SO4干燥。用过滤器除去固体并将溶剂在减压下除去，以给出所需产物。产物无需进一步纯化即可用于下一步骤(253mg，35％纯度)。
N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[6-({[(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-39-硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023 ,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-34-基]硫烷基}甲基)吡啶-3-基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺(LP41)的合成
在0℃，向化合物1(80mg，0.107mmol)和DIPEA(0.094ml，0.536mmol)在DMF(3ml)中的溶液中添加DMF(3ml)中的6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[6-(碘甲基)吡啶-3-基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]己酰胺(146mg，35％纯度，0.086mmol)。使反应混合物加温至室温并搅拌16小时。将溶剂在减压下除去，并将所获得的材料通过反相HPLC纯化，以给出LP41(3.5mg)。
LC-MS(ESI):1216.14[M+H]+。
41.LP42的合成
LP42的合成如下所示：
N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)苯基](甲基)氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲基酯的合成
在25℃，将2-乙氧基-1,2-二氢喹啉-1-甲酸乙基酯(1.20g，4.872mmol)添加至(2S)-2-[(2S)-2-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}-3-甲基丁酰胺基]丙酸(1g，2.436mmol)和[4-(甲基氨基)苯基]甲醇(0.33g，2.436mmol)在DCM(18mL)和MeOH(3mL)中的搅拌混合物中。将所得混合物在35℃搅拌14小时。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(用PE/EtOAc(1:9)洗脱)纯化，以得到呈白色固体的N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)苯基](甲基)氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲基酯(600mg)。LC-MS(ESI):530.3[M+H]+。
(2S)-2-氨基-N-[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)苯基](甲基)氨基甲酰基}乙基]-3-甲基丁酰胺的合成
在25℃，将二乙胺(414.27mg，5.665mmol)添加至N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)苯基](甲基)氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲基酯(600mg，1.133mmol)在DMF(5mL)中的搅拌混合物中。将所得混合物在25℃搅拌2h。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(用CH2Cl2/MeOH(4:1)洗脱)纯化，以得到呈无色油状物的(2S)-2-氨基-N-[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)苯基](甲基)氨基甲酰基}乙基]-3-甲基丁酰胺(300mg)。LC-MS(ESI):308.2[M+H]+。
6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)苯基](甲基)氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]己酰胺的合成
在25℃，将DIEA(252.27mg，1.952mmol)添加至(2S)-2-氨基-N-[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)苯基](甲基)氨基甲酰基}乙基]-3-甲基丁酰胺(300mg，0.976mmol)和6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(270.79mg，0.878mmol)在DMF(3mL)中的搅拌混合物中。将所得混合物在25℃搅拌14h。将所得混合物用EtOAc稀释。将残余物用水洗涤。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(用CH2Cl2/MeOH(13:1)洗脱)纯化，以得到呈白色固体的6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)苯基](甲基)氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]己酰胺(400mg)。LC-MS(ESI):501.3[M+H]+。
6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(碘甲基)苯基](甲基)氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]己酰胺的合成
在氮气气氛下在25℃，将甲基三苯氧基碘化鏻(352.31mg，0.780mmol)添加至6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)苯基](甲基)氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]己酰胺(130mg，0.260mmol)在DMF(3mL)中的搅拌混合物中。将所得混合物在氮气气氛下在25℃搅拌5小时。将所得混合物用EtOAc稀释。将残余物用冰水洗涤。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过制备型TLC(CH2Cl2/IPA 13:1)纯化，以得到呈白色固体的6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(碘甲基)苯基](甲基)氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]己酰胺(110mg)。LC-MS(ESI):611.2[M+H]+。
N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-({[(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-39-硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023 ,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-34-基]硫烷基}甲基)苯基](甲基)氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺(LP42)的合成
在0℃，将6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(碘甲基)苯基](甲基)氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]己酰胺(103.03mg，0.169mmol)添加至化合物1(70mg，0.094mmol)和DIEA在DMF(3mL)中的搅拌混合物中。将所得混合物在0℃搅拌2小时。将粗制产物通过制备型HPLC用以下条件纯化(柱：XBridge PrepOBD C18柱，19*250mm，5μm；流动相A：水(0.1％FA)，流动相B：MeCN；流速：25mL/min；梯度：在12min内20％ B至40％ B、在12.2min内40％ B至95％ B、在14min内95％ B至95％ B、在14.2min内95％ B至20％ B、在16min内20％ B至20％B；波长：254nm；RT1(min)：11)，以得到呈白色固体的N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-({[(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-39-硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023 ,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-34-基]硫烷基}甲基)苯基](甲基)氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺(LP42)(13.6mg)。
LC-MS(ESI):1229.70[M+H]+。
42.LP43的合成
L43的合成如下所示：
(4-氨基-3-氯苯基)甲醇的合成
在0℃，将LiAlH4(3.32g，87.423mmol)添加至4-氨基-3-氯苯甲酸(5g，29.141mmol)在THF(100mL)中的搅拌溶液中。将所得混合物在氮气气氛下在60℃搅拌14h。将反应在0℃用MeOH淬灭。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(用PE/EtOAc(3:1)洗脱)纯化，以得到呈黄色固体的(4-氨基-3-氯苯基)甲醇(1.6g)。LC-MS(ESI):158.03[M+H]+。
N-[(1S)-1-{[2-氯-4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酸叔丁基酯的合成
将EEDQ(7.53g，30.456mmol)和(2S)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]丙酸(2.88g，15.228mmol)添加至(4-氨基-3-氯苯基)甲醇(2.4g，15.228mmol)在DCM(12mL)和MeOH(2mL)中的搅拌混合物中。将所得混合物在25℃搅拌14h。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(用PE/EtOAc(2:1)洗脱)纯化，以得到呈白色固体的N-[(1S)-1-{[2-氯-4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酸叔丁基酯(3.7g)。LC-MS(ESI):329.12[M+H]+。
(2S)-2-氨基-N-[2-氯-4-(羟基甲基)苯基]丙酰胺的合成
在0℃，将TFA(10.00mL)添加至N-[(1S)-1-{[2-氯-4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酸叔丁基酯(3.7g，11.253mmol)在DCM(10mL)中的搅拌混合物中。将所得混合物在25℃搅拌2h。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(用CH2Cl2/MeOH(6:1)洗脱)纯化，以得到呈白色固体的(2S)-2-氨基-N-[2-氯-4-(羟基甲基)苯基]丙酰胺(2.5g)。LC-MS(ESI):229.07[M+H]+。
N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[2-氯-4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酸叔丁基酯的合成
将DIEA(2.49g，19.240mmol)和(2S)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-3-甲基丁酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(3.02g，9.620mmol)添加至(2S)-2-氨基-N-[2-氯-4-(羟基甲基)苯基]丙酰胺(2.2g，9.620mmol)在DMF(6mL)中的搅拌混合物中。将所得混合物在25℃搅拌14h。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(用PE/EtOAc(1:1)洗脱)纯化，以得到呈白色固体的N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[2-氯-4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酸叔丁基酯(2g)。LC-MS(ESI):428.19[M+H]+。
(2S)-2-氨基-N-[(1S)-1-{[2-氯-4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]-3-甲基丁酰胺的合成
在0℃，将N-[(1S)-1-{[2-氯-4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酸叔丁基酯(2g，6.083mmol)添加至HCl(气体)在1,4-二噁烷(10mL，329.119mmol)中的搅拌混合物中。将所得混合物在25℃搅拌2h。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(用CH2Cl2/MeOH(3:1)洗脱)纯化，以得到呈白色固体的(2S)-2-氨基-N-[(1S)-1-{[2-氯-4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]-3-甲基丁酰胺(1.3g)。LC-MS(ESI):328.14[M+H]+。
N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[2-氯-4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-6-(2,5-二氧代吡咯-1-基)己酰胺的合成
将DIEA(1.18g，9.152mmol)和6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(1.41g，4.576mmol)添加至(2S)-2-氨基-N-[(1S)-1-{[2-氯-4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]-3-甲基丁酰胺(1.5g，4.576mmol)在DMF(5mL)中的搅拌混合物中。将所得混合物在25℃搅拌2h。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过反相快速色谱法用以下条件纯化：柱：C18；流动相A：水(0.5％FA)，流动相B：MeCN；梯度：在30min内20％ B至30％ B；220/254nm。这产生呈白色固体的N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[2-氯-4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺(1.2g)。LC-MS(ESI):521.21[M+H]+。
N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[2-氯-4-(碘甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺的合成
将甲基三苯氧基碘化鏻(520.78mg，1.152mmol)添加至N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[2-氯-4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺(200mg，0.384mmol)在DMF(2mL)中的搅拌混合物中。将所得混合物在氮气气氛下在25℃搅拌2h。将所得混合物用EtOAc(20mL)稀释。将所得混合物用3x10 mL的水洗涤。将残余物通过硅胶柱色谱法(用CH2Cl2/IPA(10:1)洗脱)纯化，以得到呈白色固体的N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[2-氯-4-(碘甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺(140mg)。LC-MS(ESI):631.11[M+H]+。
N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[2-氯-4-({[(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-39-硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019, 24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-34-基]硫烷基}甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺(LP43)的合成
在0℃，将N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[2-氯-4-(碘甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺(50.70mg，0.080mmol)和DIEA添加至化合物1(20mg，0.027mmol)在DMF(1mL)中的搅拌混合物中。将所得混合物在0℃搅拌3h。将粗制产物通过制备型HPLC用以下条件纯化(柱：XBridge PrepOBD C18柱，19*250mm，5μm；流动相A：MeCN，流动相B：水(0.1％ FA)；流速：25mL/min；梯度：在14min内20％ B至40％ B，40％ B；波长：254/220nm；RT1(min)：11.65-12.5；以得到呈白色固体的N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[2-氯-4-({[(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-39-硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019, 24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-34-基]硫烷基}甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺(LP43)(7.8mg)。
LC-MS(ESI):1249.35[M+H]+。
43.LP44的合成
LP44的合成如下所示：
N-[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)-2-(三氟甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酸叔丁基酯的合成
在氮气气氛下在25℃，将BrettPhos(631.41mg，1.176mmol)、BrettPhos Pd G3(533.16mg，0.588mmol)和K2CO3(1.63g，11.763mmol)添加至[4-溴-3-(三氟甲基)苯基]甲醇(1.5g，5.882mmol)和N-[(1S)-1-氨基甲酰基乙基]氨基甲酸叔丁基酯(2.21g，11.763mmol)在1,4-二噁烷(20mL)中的搅拌混合物中。将所得混合物在氮气气氛下在90℃搅拌14h。将所得混合物在减压下浓缩。将所得混合物用EtOAc稀释。将所得混合物用水洗涤。将残余物通过硅胶柱色谱法(用PE/EtOAc(3:1)洗脱)纯化，以得到呈白色固体的N-[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)-2-(三氟甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酸叔丁基酯(930mg)。LC-MS(ESI):363.2[M+H]+。
(2S)-2-氨基-N-[4-(羟基甲基)-2-(三氟甲基)苯基]丙酰胺的合成
在0℃，将TFA(6mL)添加至N-[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)-2-(三氟甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酸叔丁基酯(900mg，2.484mmol)在DCM(6mL)中的搅拌混合物中。将所得混合物在25℃搅拌30min。将所得混合物在减压下浓缩。在0℃，将K2CO3(1.37g，9.935mmol)添加至MeOH(3mL)、THF(3mL)和H2O(3mL)的搅拌混合物中。将所得混合物在25℃搅拌2h。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(用CH2Cl2/MeOH(5:1)洗脱)纯化，以得到呈无色油状物的(2S)-2-氨基-N-[4-(羟基甲基)-2-(三氟甲基)苯基]丙酰胺(530mg)。LC-MS(ESI):263.1[M+H]+。
N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)-2-(三氟甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酸叔丁基酯的合成
在25℃，将DIEA(1.48g，11.442mmol)添加至(2S)-2-氨基-N-[4-(羟基甲基)-2-(三氟甲基)苯基]丙酰胺(500mg，1.907mmol)和(2S)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-3-甲基丁酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(599.35mg，1.907mmol)在DMF(5mL)中的搅拌混合物中。将所得混合物在25℃搅拌14h。将所得混合物用EtOAc稀释。将所得混合物用水洗涤。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(用PE/EtOAc(1:1)洗脱)纯化，以得到呈白色固体的N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)-2-(三氟甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酸叔丁基酯(850mg)。LC-MS(ESI):462.2[M+H]+。
(2S)-2-氨基-N-[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)-2-(三氟甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]-3-甲基丁酰胺的合成
在0℃，将TFA(4mL)添加至N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)-2-(三氟甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酸叔丁基酯(830mg，1.799mmol)在DCM(4mL)中的搅拌混合物中。将所得混合物在25℃搅拌30min。将所得混合物在减压下浓缩。然后在0℃，将K2CO3(994.28mg，7.194mmol)添加至THF(3mL)、MeOH(3mL)和H2O(3mL)的搅拌混合物中。将所得混合物在25℃搅拌2h。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(用CH2Cl2/MeOH(5:1)洗脱)纯化，以得到呈白色固体的(2S)-2-氨基-N-[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)-2-(三氟甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]-3-甲基丁酰胺(500mg)。LC-MS(ESI):362.2[M+H]+。
6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)-2-(三氟甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]己酰胺的合成
在25℃，将DIEA(357.65mg，2.768mmol)添加至(2S)-2-氨基-N-[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)-2-(三氟甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]-3-甲基丁酰胺(500mg，1.384mmol)和6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(383.91mg，1.246mmol)在DMF(5mL)中的搅拌混合物中。将所得混合物在25℃搅拌14h。将所得混合物用EtOAc稀释。将所得混合物用水洗涤。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(用CH2Cl2/MeOH(11:1)洗脱)纯化，以得到呈白色固体的6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)-2-(三氟甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]己酰胺(530mg)。LC-MS(ESI):555.2[M+H]+。
6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(碘甲基)-2-(三氟甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]己酰胺的合成
在氮气气氛下在0℃，将甲基三苯氧基碘化鏻(489.76mg，1.083mmol)添加至6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)-2-(三氟甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]己酰胺(200mg，0.361mmol)在DMF(5mL)中的搅拌混合物中。将所得混合物在氮气气氛下在25℃搅拌2h。将所得混合物用EtOAc稀释。将残余物用冰水洗涤。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(用CH2Cl2/IPA(30:1)洗脱)纯化，以得到呈淡黄色固体的6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(碘甲基)-2-(三氟甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]己酰胺(180mg)。LC-MS(ESI):665.1[M+H]+。
N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-({[(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-39-硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023 ,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-34-基]硫烷基}甲基)-2-(三氟甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺(LP44)的合成
在0℃，将DIEA(57.99mg，0.450mmol)添加至6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(碘甲基)-2-(三氟甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]己酰胺(149.07mg，0.225mmol)和化合物1(67mg，0.090mmol)在DMF(2mL)中的搅拌混合物中。将所得混合物在0℃搅拌1h。将粗制产物通过制备型HPLC用以下条件纯化(柱：XBridge Prep OBD C18柱，19*250mm，5μm；流动相A：水(0.1％FA)，流动相B：MeCN；流速：25mL/min；梯度：在10min内30％ B至30％ B，30％ B；波长：254nm；RT1(min)：8.9)，以得到呈白色固体的N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-({[(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-39-硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07 ,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-34-基]硫烷基}甲基)-2-(三氟甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺(LP44)(13.6mg)。
LC-MS(ESI):1283.40[M+H]+。
44.LP45的合成
LP45的合成如下所示：
N-[(1S)-1-{[2-氟-4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酸叔丁基酯的合成
将(4-氨基-3-氟苯基)甲醇(750mg，5.31mmol)、(2S)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]丙酸(1.21g，6.37mmol)和2-乙氧基-1,2-二氢喹啉-1-甲酸乙基酯(2.63g，10.62mmol)在DCM(6mL)和MeOH(1mL)中的混合物在室温搅拌过夜。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(用PE/EtOAc(2/1)洗脱)纯化，以得到呈黄色固体的N-[(1S)-1-{[2-氟-4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酸叔丁基酯(1.53g)。
(2S)-2-氨基-N-[2-氟-4-(羟基甲基)苯基]丙酰胺的合成
将N-[(1S)-1-{[2-氟-4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酸叔丁基酯(700mg，2.24mmol)和TFA(1mL)在DCM(5mL)中的溶液在室温搅拌30min。将所得混合物在减压下浓缩，以得到呈黄色油状物的(2S)-2-氨基-N-[2-氟-4-(羟基甲基)苯基]丙酰胺(600mg，粗品)。
N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[2-氟-4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酸叔丁基酯的合成
将(2S)-2-氨基-N-[2-氟-4-(羟基甲基)苯基]丙酰胺(456mg，2.15mmol)和DIEA(2.78g，21.49mmol)在DMF(10mL)中的混合物在室温搅拌1h。将反应进行处理，并将残余物通过硅胶柱色谱法(用DCM/EtOAc(3/1)洗脱)纯化，以得到呈黄色固体的N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[2-氟-4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酸叔丁基酯(805mg)。
(2S)-2-氨基-N-[(1S)-1-{[2-氟-4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]-3-甲基丁酰胺的合成
将N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[2-氟-4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酸叔丁基酯(795mg，1.93mmol)和TFA(2mL)在DCM(6mL)中的溶液在室温搅拌30min。将所得混合物在减压下浓缩，以得到呈黄色油状物的(2S)-2-氨基-N-[(1S)-1-{[2-氟-4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]-3-甲基丁酰胺(600mg，粗品)。
6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[2-氟-4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]己酰胺的合成
将(2S)-2-氨基-N-[(1S)-1-{[2-氟-4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]-3-甲基丁酰胺(500mg，1.60mmol)、6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(544.58mg，1.76mmol)和DIEA(2075.48mg，16.06mol)在DMF(5mL)中的混合物在室温搅拌1h。将反应进行处理，并将残余物通过硅胶柱色谱法(用PE/EtOAc(3/1)洗脱)纯化，以得到呈白色固体的6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[2-氟-4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]己酰胺(340mg)。
N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(溴甲基)-2-氟苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺的合成
将6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[2-氟-4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]己酰胺(150mg，0.29mmol)和PBr3(80.47mg，0.29mmol)在Et2O(2mL)中的溶液在0℃搅拌30min。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(用CH2Cl2/IPA(10/1)洗脱)纯化，以得到呈白色固体的N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(溴甲基)-2-氟苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺(90mg)。
N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-({[(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-39-硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023 ,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-34-基]硫烷基}甲基)-2-氟苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺(LP45)的合成
将N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(溴甲基)-2-氟苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺(90.81mg，0.15mmol)、化合物1(58mg，0.07mmol)和DIEA(100.4mg，0.78mmol)在DMF(2mL)中的混合物在氮气气氛下在0℃搅拌1h。将所得混合物在减压下浓缩。将粗制产物(60mg)通过制备型HPLC用以下条件纯化(柱：XBridge Prep PhenylOBD柱，19*150mm，5μm；流动相A：水(0.1％FA)，流动相B：MeCN；流速：60mL/min；梯度：在8min内27％ B至30％ B，30％ B；波长：254nm)，以得到呈白色固体的N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-({[(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-39-硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023 ,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-34-基]硫烷基}甲基)-2-氟苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺(LP45)(8.5mg)。
LC-MS(ESI):[M-H]-:1231.45。
45.LP46的合成
LP46的合成如下所示：
N-[(1S)-1-{[3-氟-4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酸叔丁基酯的合成
将(4-氨基-2-氟苯基)甲醇(1g，7.145mmol)和(2S)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]丙酸(1.61g，8.500mmol)和2-乙氧基-1,2-二氢喹啉-1-甲酸乙基酯(3.54g，15.201mmol)在DCM(12mL)和MeOH(2mL)中的溶液在室温搅拌过夜。将所得混合物在真空下浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(用PE/EtOAc＝(1/1)洗脱)纯化，以得到呈白色固体的N-[(1S)-1-{[3-氟-4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酸叔丁基酯(2.2g)。
(2S)-2-氨基-N-[3-氟-4-(羟基甲基)苯基]丙酰胺的合成
将N-[(1S)-1-{[3-氟-4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酸叔丁基酯(2g，6.404mmol)在TFA(2mL)和DCM(10mL)中的溶液在室温搅拌2h。将所得混合物在真空下浓缩。这产生呈白色油状物的(2S)-2-氨基-N-[3-氟-4-(羟基甲基)苯基]丙酰胺(1g)。所得混合物无需进一步纯化即可直接用于下一步骤。
N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[3-氟-4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酸叔丁基酯的合成
将(2S)-2-氨基-N-[3-氟-4-(羟基甲基)苯基]丙酰胺(1g，4.625mmol)和(2S)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-3-甲基丁酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(1.7g，5.1241mmol)在DIEA(6.8g，49.7152mmol)和DMF(10mL)中的溶液在室温搅拌2h。将反应进行处理，并将残余物通过硅胶柱色谱法(用DCM/EtOAc＝(1/1)洗脱)纯化，以得到呈白色固体的N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[3-氟-4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酸叔丁基酯(1.6g)。
(2S)-2-氨基-N-[(1S)-1-{[3-氟-4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]-3-甲基丁酰胺的合成
将N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[3-氟-4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酸叔丁基酯(1.6g，3.9671mmol)在TFA(2mL)和DCM(10mL)中的溶液在室温搅拌2h。将所得混合物在真空下浓缩。这产生呈白色油状物的(2S)-2-氨基-N-[(1S)-1-{[3-氟-4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]-3-甲基丁酰胺(1.15g)。所得混合物无需进一步纯化即可直接用于下一步骤。
6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[3-氟-4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]己酰胺的合成
将(2S)-2-氨基-N-[(1S)-1-{[3-氟-4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]-3-甲基丁酰胺(1.2g，3.5147mmol)和6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(1.2g，3.886mmol)在DIEA(4.6g，35.320mmol)和DMF(10mL)中的溶液在室温搅拌过夜。将反应进行处理，并将残余物通过硅胶柱色谱法(用DCM/MeOH＝(10/1)洗脱)纯化，以得到呈白色固体的6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[3-氟-4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]己酰胺(900mg)。
6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[3-氟-4-(碘甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]己酰胺的合成
将6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[3-氟-4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]己酰胺(900mg，1.798mmol)和甲基三苯氧基碘化鏻(3.7g，9.861mmol)在DMF(9mL)中的溶液在氮气气氛下在0℃搅拌过夜。将所得混合物用EtOAc萃取。将合并的有机层用H2O洗涤、经无水Na2SO4干燥。过滤后，将滤液在减压下浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(用DCM/IPA＝(10/1)洗脱)纯化，以得到呈白色固体的6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[3-氟-4-(碘甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]己酰胺(700mg)。
N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-({[(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-39-硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023 ,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-34-基]硫烷基}甲基)-3-氟苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺(LP46)的合成
将化合物1(55mg，0.082mmol)和6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[3-氟-4-(碘甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]己酰胺(95.3mg，0.1530mmol)在DIEA(51.93mg，0.390mmol)和DMF(1mL)中的溶液在氮气气氛下在0℃搅拌1h。将粗制产物通过反相快速用以下条件纯化(柱：Xselect CSH C18 OBD柱，30x150mm，5μm；流动相A：水(0.1％FA)，流动相B：MeCN；流速：60mL/min；梯度：在8min内26％ B至30％B，30％ B；波长：254nm)，以得到呈白色固体的N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-({[(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-39-硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-34-基]硫烷基}甲基)-3-氟苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺(LP46)(3.3mg)。
LC-MS(ESI):[M+H]+:1233.2。
46.LP47的合成
LP47的合成如下所示：
(4-氨基-2,6-二氯苯基)甲醇的合成
在室温，向4-氨基-2,6-二氯苯甲酸甲基酯(500mg，2.272mmol)在THF中的搅拌混合物中分批添加LiAlH4(258.7mg，6.816mmol)。将所得混合物在70℃搅拌2h。将反应在0℃用水/冰淬灭。将所得混合物用DCM萃取。将合并的有机层用水洗涤，经无水Na2SO4干燥。过滤后，将滤液在减压下浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(用PE/EtOAc(5/1)洗脱)纯化，以得到呈灰色固体的(4-氨基-2,6-二氯苯基)甲醇(202mg)。
N-[(1S)-1-{[3,5-二氯-4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酸叔丁基酯的合成
在室温，向(4-氨基-2,6-二氯苯基)甲醇(200mg，1.041mmol)和(2S)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]丙酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(745.4mg，2.603mmol)在DCM(2.4mL)和MeOH(0.4mL)中的搅拌混合物中分批添加6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(745.4mg，2.603mmol)。将所得混合物在室温搅拌2h。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(用PE/EtOAc(5/1)洗脱)纯化，以得到呈白色固体的N-[(1S)-1-{[3,5-二氯-4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酸叔丁基酯(320mg)。
(2S)-2-氨基-N-[3,5-二氯-4-(羟基甲基)苯基]丙酰胺的合成
将N-[(1S)-1-{[3,5-二氯-4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酸叔丁基酯(300mg，0.826mmol)和TFA(1mL)在DCM(5mL)中的混合物在室温搅拌0.5h。将所得混合物在减压下浓缩，以得到呈灰色油状物的(2S)-2-氨基-N-[3,5-二氯-4-(羟基甲基)苯基]丙酰胺(470mg)。粗制产物无需进一步纯化即可直接用于下一步骤。
N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[3,5-二氯-4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酸叔丁基酯的合成
然后在室温，向(2S)-2-氨基-N-[3,5-二氯-4-(羟基甲基)苯基]丙酰胺(400mg，1.520mmol)和(2S)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-3-甲基丁酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(14.3mg，0.046mmol)在DMF(5mL)中的搅拌混合物中分批添加DIEA(1964.8mg，15.20mmol)。将所得混合物在室温搅拌过夜。将反应进行处理，并将残余物通过硅胶柱色谱法(用PE/EA(5/1)洗脱)纯化，以得到呈白色固体的N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[3,5-二氯-4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酸叔丁基酯(243mg)。
(2S)-2-氨基-N-[(1S)-1-{[3,5-二氯-4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]-3-甲基丁酰胺的合成
将N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[3,5-二氯-4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酸叔丁基酯(230mg，0.497mmol)和TFA(0.5mL)在DCM(2.5mL)中的混合物在室温搅拌2h。将所得混合物在减压下浓缩，以得到呈灰色油状物的(2S)-2-氨基-N-[(1S)-1-{[3,5-二氯-4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]-3-甲基丁酰胺(400mg)。粗制产物无需进一步纯化即可直接用于下一步骤。
N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[3,5-二氯-4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺的合成
在室温，向(2S)-2-氨基-N-[(1S)-1-{[3,5-二氯-4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]-3-甲基丁酰胺(400mg，1.104mmol)和6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(407.2mg，1.325mmol)在DMF(4mL)中的搅拌混合物中滴加DIEA(1427.1mg，11.040mmol)。将所得混合物在室温搅拌2h。将反应进行处理，并将残余物通过硅胶柱色谱法(用PE/EtOAc(5/1)洗脱)纯化，以得到呈黄色固体的N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[3,5-二氯-4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-6-(2,5-二氧代吡咯-1-基)己酰胺(271mg)。
N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[3,5-二氯-4-(碘甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺的合成
将N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[3,5-二氯-4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-6-(2,5-二氧代吡咯-1-基)己酰胺(80mg，0.144mmol)和甲基三苯氧基碘化鏻(195.4mg，0.432mmol)在DMF(1mL)中的混合物在氮气气氛下在0℃搅拌2h。将反应进行处理，并将残余物通过硅胶柱色谱法(用DCM/i-PrOH(10/1)洗脱)纯化，以得到呈白色固体的N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[3,5-二氯-4-(碘甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺(56mg)。
N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[3,5-二氯-4-({[(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-39-硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07, 12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-34-基]硫烷基}甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺(LP47)的合成
将N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[3,5-二氯-4-(碘甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺(99.8mg，0.150mmol)和化合物1(56mg，0.075mmol)在DMF(1mL)中的混合物在氮气气氛下在0℃搅拌1h。将粗制产物(56mg)通过制备型HPLC用以下条件纯化(柱：XBridge Prep Phenyl OBD柱，19*150mm，5μm；流动相A：水(0.05％TFA)，流动相B：MeCN；流速：60mL/min；梯度：在8min内30％ B至35％ B，35％ B；波长：254nm)，以得到呈白色固体的N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[3,5-二氯-4-({[(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-39-硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-34-基]硫烷基}甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺(LP47)(9.6mg)。
LC-MS(ESI):[M+H]+:1283.00。
47.LP48的合成
LP48的合成如下所示：
N-[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)-2-甲氧基苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酸叔丁基酯的合成
在25℃，将DIEA(2.53g，19.585mmol)添加至(2S)-2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}丙酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(8.41g，29.377mmol)和(4-氨基-3-甲氧基苯基)甲醇(1.5g，9.792mmol)在DMF(20mL)中的搅拌混合物中。将所得混合物在80℃搅拌14h。将所得混合物用EtOAc稀释。将残余物用水洗涤。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(用PE/EtOAc(3:1)洗脱)纯化，以得到呈棕色油状物的N-[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)-2-甲氧基苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酸叔丁基酯(800mg)。LC-MS(ESI):325.2[M+H]+。
(2S)-2-氨基-N-[4-(羟基甲基)-2-甲氧基苯基]丙酰胺的合成
在0℃，将TFA(3mL)添加至N-[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)-2-甲氧基苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酸叔丁基酯(800mg，2.466mmol)在DCM(3mL)中的搅拌混合物中。将所得混合物在25℃搅拌30min。将所得混合物在减压下浓缩。在0℃，将K2CO3(1.36g，9.865mmol)添加至MeOH(3mL)、THF(3mL)和H2O(3mL)的搅拌混合物中。将所得混合物在25℃搅拌2h。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(用DCM/MeOH(5:1)洗脱)纯化，以得到呈无色油状物的(2S)-2-氨基-N-[4-(羟基甲基)-2-甲氧基苯基]丙酰胺(420mg)。LC-MS(ESI):225.1[M+H]+。
N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)-2-甲氧基苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酸叔丁基酯的合成
在25℃，将DIEA(1.38g，10.702mmol)添加至(2S)-2-氨基-N-[4-(羟基甲基)-2-甲氧基苯基]丙酰胺(400mg，1.784mmol)和(2S)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-3-甲基丁酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(560.67mg，1.784mmol)在DMF(5mL)中的搅拌混合物中。将所得混合物在25℃搅拌14h。将所得混合物用EtOAc稀释。将所得混合物用水洗涤。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(用PE/EtOAc(1:1)洗脱)纯化，以得到呈白色固体的N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)-2-甲氧基苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酸叔丁基酯(470mg)。LC-MS(ESI):424.2[M+H]+。
(2S)-2-氨基-N-[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)-2-甲氧基苯基]氨基甲酰基}乙基]-3-甲基丁酰胺的合成
在0℃，将TFA(3mL)添加至N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)-2-甲氧基苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酸叔丁基酯(450mg，1.063mmol)在DCM(3mL)中的搅拌混合物中。将所得混合物在25℃搅拌30min。将所得混合物在减压下浓缩。在0℃，将K2CO3(585.30mg，4.252mmol)添加至MeOH(3mL)、THF(3mL)和H2O(3mL)的搅拌混合物中。将所得混合物在25℃搅拌2h。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(用DCM/MeOH(6:1)洗脱)纯化，以得到呈无色油状物的(2S)-2-氨基-N-[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)-2-甲氧基苯基]氨基甲酰基}乙基]-3-甲基丁酰胺(270mg)。LC-MS(ESI):324.2[M+H]+。
6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)-2-甲氧基苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]己酰胺的合成
在25℃，将DIEA(199.82mg，1.546mmol)添加至(2S)-2-氨基-N-[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)-2-甲氧基苯基]氨基甲酰基}乙基]-3-甲基丁酰胺(250mg，0.773mmol)和6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(214.49mg，0.696mmol)在DMF(3mL)中的搅拌混合物中。将所得混合物在25℃搅拌2h。将所得混合物用EtOAc稀释。将所得混合物用水洗涤。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(用DCM/MeOH(12:1)洗脱)纯化，以得到呈白色固体的6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)-2-甲氧基苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]己酰胺(250mg)。LC-MS(ESI):517.3[M+H]+。
N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(溴甲基)-2-甲氧基苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺的合成
在氮气气氛下在0℃，将PBr3(39.30mg，0.146mmol)添加至6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)-2-甲氧基苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]己酰胺(50mg，0.097mmol)在DCM(2mL)中的搅拌混合物中。将所得混合物在氮气气氛下在0℃搅拌1h。将残余物通过硅胶柱色谱法(用DCM/IPA(14:1)洗脱)纯化，以得到呈白色固体的N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(溴甲基)-2-甲氧基苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺(50mg)。LC-MS(ESI):579.2[M+H]+。
N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-({[(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-39-硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023 ,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-34-基]硫烷基}甲基)-2-甲氧基苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺(LP48)的合成
在0℃，将DIEA(27.70mg，0.214mmol)添加至N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(溴甲基)-2-甲氧基苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺(49.68mg，0.086mmol)和化合物1(32mg，0.043mmol)在DMF(2mL)中的搅拌混合物中。将所得混合物在25℃搅拌2h。将混合物通过制备型HPLC用以下条件纯化(柱：XBridge Prep OBD C18柱，19*250mm，5μm；流动相A：水(0.1％FA)，流动相B：MeCN；流速：25mL/min；梯度：在12min内20％ B至40％ B，40％ B；波长：254nm)，以得到呈白色固体的N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-({[(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-39-硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-34-基]硫烷基}甲基)-2-甲氧基苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺(LP48)(8.9mg)。
LC-MS(ESI):1245.80[M+H]+。
48.LP49的合成
LP49的合成如下所示：
(4-氨基-3-甲基苯基)甲醇的合成
在0℃，将LiAlH4(59.54mL，59.538mmol)添加至4-氨基-3-甲基苯甲酸(3g，19.846mmol)在THF(50mL)中的搅拌混合物中。将所得混合物在氮气气氛下在60℃搅拌2h。将反应在0℃通过添加MeOH(50mL)淬灭。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(用PE/EtOAc(1:1)洗脱)纯化，以得到呈黄色固体的(4-氨基-3-甲基苯基)甲醇(680mg)。LC-MS(ESI):138.09[M+H]+。
N-[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)-2-甲基苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酸叔丁基酯的合成
将EEDQ(3.61g，14.580mmol)和(2S)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]丙酸(1.38g，7.290mmol)添加至(4-氨基-3-甲基苯基)甲醇(1g，7.290mmol)在MeOH(2mL)和DCM(12mL)中的搅拌混合物中。将所得混合物在室温搅拌2h。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(用PE/EtOAc(1:1)洗脱)纯化，以得到呈白色固体的N-[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)-2-甲基苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酸叔丁基酯(1.1g)。LC-MS(ESI):309.18[M+H]+。
(2S)-2-氨基-N-[4-(羟基甲基)-2-甲基苯基]丙酰胺的合成
将TFA(3mL)添加至N-[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)-2-甲基苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酸叔丁基酯(1.1g，3.567mmol)在DCM(3mL)中的搅拌溶液中。将所得混合物在室温搅拌30min。将所得混合物在减压下浓缩。然后将H2O(1.5mL)、THF(1.5mL)和MeOH(1.5mL)中的K2CO3(1.47g，10.636mmol)添加至所得混合物中。将所得混合物在室温搅拌2h。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(用DCM:MeOH(2:1)洗脱)纯化，以得到呈淡黄色固体的(2S)-2-氨基-N-[4-(羟基甲基)-2-甲基苯基]丙酰胺(600mg)。LC-MS(ESI):209.12[M+H]+。
N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)-2-甲基苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酸叔丁基酯的合成
将DIEA(744.72mg，5.762mmol)、(2S)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-3-甲基丁酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(905.61mg，2.881mmol)添加至(2S)-2-氨基-N-[4-(羟基甲基)-2-甲基苯基]丙酰胺(600mg，2.881mmol)在DMF(4mL)中的搅拌混合物中。将所得混合物在室温搅拌2h。将所得混合物用EtOAc(100mL)稀释。将所得混合物用3x20mL的水洗涤。将残余物通过硅胶柱色谱法(用PE/EtOAc(1:2)洗脱)纯化，以得到呈黄色固体的N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)-2-甲基苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酸叔丁基酯(800mg)。LC-MS(ESI):408.25[M+H]+。
(2S)-2-氨基-N-[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)-2-甲基苯基]氨基甲酰基}乙基]-3-甲基丁酰胺的合成
将TFA(4mL)添加至N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)-2-甲基苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酸叔丁基酯(800mg，1.963mmol)在DCM(4mL)中的搅拌溶液中。将所得混合物在室温搅拌30min。将所得混合物在减压下浓缩。然后将H2O(1.5mL)、MeOH(1.5mL)和THF(1.5mL)中的K2CO3(1085.27mg，7.852mmol)添加至所得混合物中。将所得混合物在室温搅拌2h。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(用DCM/MeOH(1:2)洗脱)纯化，以得到呈白色固体的(2S)-2-氨基-N-[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)-2-甲基苯基]氨基甲酰基}乙基]-3-甲基丁酰胺(600mg)。LC-MS(ESI):309.19[M+H]+。
6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)-2-甲基苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]己酰胺的合成
将DIEA(496.13mg，3.838mmol)和6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(591.72mg，1.919mmol)添加至(2S)-2-氨基-N-[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)-2-甲基苯基]氨基甲酰基}乙基]-3-甲基丁酰胺(590mg，1.919mmol)在DMF(3mL)中的搅拌混合物中。将所得混合物在25℃搅拌2h。将所得混合物用EtOAc(60mL)稀释。将所得混合物用3x10 mL的水洗涤。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(用DCM/MeOH(17:1)洗脱)纯化，以得到呈白色固体的6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)-2-甲基苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]己酰胺(380mg)。LC-MS(ESI):501.27[M+H]+。
N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(氯甲基)-2-甲基苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺的合成
将SOCl2(42.78mg，0.360mmol)添加至6-(2,5-二氧代吡咯-1-基)-N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)-2-甲基苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]己酰胺(90mg，0.180mmol)在DCM(1mL)中的搅拌混合物中。将所得混合物在氮气气氛下在40℃搅拌2h。将残余物通过硅胶柱色谱法(用DCM/IPA(2:1)洗脱)纯化，以得到呈白色固体的N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(氯甲基)-2-甲基苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺(90mg)。LC-MS(ESI):519.23[M+H]+。
N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-({[(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-39-硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023 ,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-34-基]硫烷基}甲基)-2-甲基苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺(LP49)的合成
将NaI(12.05mg，0.080mmol)添加至N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(氯甲基)-2-甲基苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺(65mg，0.125mmol)在DMF(1.5mL)中的搅拌混合物中。将所得混合物在室温搅拌1h，然后添加化合物1(60mg，0.080mmol)和DIEA(51.93mg，0.400mmol)。将溶液在室温搅拌1h。将粗制产物通过制备型HPLC用以下条件纯化(柱：XBridge Prep OBD C18柱，19*250mm，5μm；流动相A：水(0.1％FA)，流动相B：MeCN；流速：25mL/min；梯度：在12min内29％ B至29％ B，29％ B；波长：254nm；RT1(min)：10.8)；以得到呈白色固体的N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-({[(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-39-硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-34-基]硫烷基}甲基)-2-甲基苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺(LP49)(9.9mg)。
LC-MS(ESI):1229.15[M+H]+。
49.LP50的合成
LP50的合成如下所示：
N-[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)-3-甲基苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酸叔丁基酯的合成
在室温，向(4-氨基-2-甲基苯基)甲醇(782mg，5.700mmol)和(2S)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]丙酸(1294.3mg，6.840mmol)在DCM(12mL)和MeOH(2mL)中的搅拌溶液中分批添加EEDQ(2819.3mg，11.400mmol)。将所得混合物在室温搅拌过夜。将所得混合物在真空下浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(用PE/EtOAc(60/40)洗脱)纯化，以得到呈白色固体的N-[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)-3-甲基苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酸叔丁基酯(1.7g)。
(2S)-2-氨基-N-[4-(羟基甲基)-3-甲基苯基]丙酰胺的合成
在室温，向N-[(1S)-1-{[3-氟-4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酸叔丁基酯(850mg，2.721mmol)在DCM(10mL)中的搅拌溶液中滴加TFA(2mL)。将所得混合物在室温搅拌2h。将所得混合物在真空下浓缩。这产生呈淡黄色油状物的(2S)-2-氨基-N-[3-氟-4-(羟基甲基)苯基]丙酰胺(815mg)。
N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)-3-甲基苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酸叔丁基酯的合成
在室温，向(2S)-2-氨基-N-[3-氟-4-(羟基甲基)苯基]丙酰胺(448mg，2.151mmol)和(2S)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-3-甲基丁酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(1328.2mg，4.225mmol)在DMF(5mL)中的搅拌溶液中滴加DIEA(2780.2mg，21.510mmol)。将所得混合物在室温搅拌2h。将所得混合物用EtOAc萃取。将合并的有机层用水洗涤，经无水Na2SO4干燥。过滤后，将滤液在减压下浓缩。将所得混合物在真空下浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(用PE/EtOAc(70/30)洗脱)纯化，以得到呈淡黄色固体的N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)-3-甲基苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酸叔丁基酯(601mg)。
(2S)-2-氨基-N-[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)-3-甲基苯基]氨基甲酰基}乙基]-3-甲基丁酰胺的合成
在室温，向N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)-3-甲基苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酸叔丁基酯(601mg，1.475mmol)在DCM(6mL)中的搅拌溶液中滴加TFA(2.0mL)。将所得混合物在室温搅拌1h。将所得混合物在真空下浓缩。这产生呈淡黄色油状物的(2S)-2-氨基-N-[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)-3-甲基苯基]氨基甲酰基}乙基]-3-甲基丁酰胺(245mg)。
6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)-3-甲基苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]己酰胺的合成
在氮气气氛下，向搅拌的DMF(5mL)中的(2S)-2-氨基-N-[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)-3-甲基苯基]氨基甲酰基}乙基]-3-甲基丁酰胺(400mg，1.303mmol)中分批添加6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(441.4mg，1.4332mmol)和DIEA(1680.7mg，13.0290mmol)。将所得混合物在氮气气氛下搅拌2h。将残余物通过硅胶柱色谱法(用DCM/MeOH(20/1)洗脱)纯化，以得到呈白色固体的6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)-3-甲基苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]己酰胺(340mg)。
6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(碘甲基)-3-甲基苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]己酰胺的合成
在氮气气氛下在室温，向6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)-3-甲基苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]己酰胺(120mg，0.2400mmol)和DMAP(11.7mg，0.096mmol)在DCM(1.5mL)中的搅拌溶液中分批添加PPh3(94.3mg，0.3600mmol)、I2和DIEA。将所得混合物在氮气气氛下在室温搅拌过夜。将所得混合物在真空下浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(用DCM/IPA(95/5)洗脱)纯化，以得到呈淡黄色固体的6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(碘甲基)-3-甲基苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]己酰胺(20mg)。
N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-({[(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-39-硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023 ,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-34-基]硫烷基}甲基)-3-甲基苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺(LP50)的合成
在氮气气氛下在0℃，向6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(碘甲基)-3-甲基苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]己酰胺(81.8mg，0.134mmol)和DIEA(43.28mg，0.335mmol)在DMF(1.2mL)中的搅拌溶液中滴加化合物1(50mg，0.067mmol)。将所得混合物在氮气气氛下在0℃搅拌1h。将粗制产物通过制备型HPLC用以下条件纯化(柱：Xcelect CSH F-pheny OBD柱，19*250mm，5μm；流动相A：水(0.1％FA)，流动相B：MeCN；流速：25mL/min；梯度：在13min内20％ B至40％ B，40％B；波长：254nm；RT1(min)：11.2)。这产生呈白色固体的N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-({[(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-39-硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-34-基]硫烷基}甲基)-3-甲基苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺(LP50)(6.8mg)。
LC-MS(ESI):[M+H]+:1229.10。
50.LP51的合成
LP51的合成如下所示：
N-[(1S)-1-{[2,5-二氯-4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酸叔丁基酯的合成
将(4-氨基-2,5-二氯苯基)甲醇(500mg，2.604mmol)、EEDQ(1.29g，5.208mmol)和(2S)-2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}丙酸在DCM(6mL)、MeOH(1mL)中的混合物在空气气氛下在室温搅拌过夜。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(用DCM/EtOAc(3/1)洗脱)纯化，以得到呈白色固体的N-[(1S)-1-{[2,5-二氯-4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酸叔丁基酯(248mg)。
(2S)-2-氨基-N-[2,5-二氯-4-(羟基甲基)苯基]丙烯酰胺的合成
将N-[(1S)-1-{[2,5-二氯-4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酸叔丁基酯(238mg，0.655mmol)和TFA(1mL)在DCM(3mL)中的溶液在室温搅拌30min。将所得混合物在减压下浓缩，以得到呈黄色油状物的(2S)-2-氨基-N-[2,5-二氯-4-(羟基甲基)苯基]丙酰胺(172mg)。
N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[2,5-二氯-4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酸叔丁基酯的合成
将(2S)-2-氨基-N-[2,5-二氯-4-(羟基甲基)苯基]丙酰胺(150mg，0.570mmol)、DIEA(736.79mg，5.700mmol)和(2S)-2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-3-甲基丁酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯在DMF(2mL)中的混合物在室温搅拌1h。将反应进行处理，并将残余物通过硅胶柱色谱法(用PE/EtOAc(5/1)洗脱)纯化，以得到呈黄色油状物的N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[2,5-二氯-4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酸叔丁基酯(171mg)。
(2S)-2-氨基-N-[(1S)-1-{[2,5-二氯-4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]-3-甲基丁酰胺的合成
将N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[2,5-二氯-4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酸叔丁基酯(160mg，0.346mmol)和TFA(1mL)在DCM(3mL)中的溶液在室温搅拌30min。将所得混合物在减压下浓缩，以得到呈黄色油状物的(2S)-2-氨基-N-[(1S)-1-{[2,5-二氯-4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]-3-甲基丁酰胺(100mg)。
N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[2,5-二氯-4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺的合成
将(2S)-2-氨基-N-[(1S)-1-{[2,5-二氯-4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]-3-甲基丁酰胺(90mg，0.248mmol)、6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(84.25mg，0.273mmol)和DIEA(321.10mg，2.480mmol)在DMF(2mL)中的混合物在室温搅拌1h。将反应进行处理，并将残余物通过硅胶柱色谱法(用DCM/MeOH(10/1)洗脱)纯化，以得到呈白色固体的N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[2,5-二氯-4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺(80mg)。
N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[2,5-二氯-4-(碘甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺的合成
将N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[2,5-二氯-4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺(40mg，0.063mmol)、I2(23.93mg，0.095mmol)、DMAP(3.07mg，0.025mmol)和PPh3(24.73mg，0.095mmol)在DCM(2mL)中的溶液在室温搅拌过夜。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(用DCM/IPA(10/1)洗脱)纯化，以得到呈白色固体的N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[2,5-二氯-4-(碘甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺(35mg)。
N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[2,5-二氯-4-({[(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-39-硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07, 12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-34-基]硫烷基}甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺(LP51)的合成
将N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[2,5-二氯-4-(碘甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺(73.12mg，0.108mmol)、化合物1(40mg，0.054mmol)和DIEA(34.62mg，0.270mmol)在DMF(1mL)中的混合物在氮气气氛下在0℃搅拌1h。将粗制产物通过制备型HPLC用以下条件纯化(柱：XBridgeShield RP18 OBD柱，19*250mm，10μm；流动相A：水(10mmol/L NH4HCO3)，流动相B：MeCN；流速：25mL/min；梯度：在13min内32％ B至32％ B，32％ B；波长：254nm；RT1(min)：11.5)；以得到呈白色固体的N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[2,5-二氯-4-({[(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-39-硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04 ,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-34-基]硫烷基}甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺(LP51)(5.5mg)。
LC-MS(ESI):[M+H]+:1282.95。
51.LP52的合成
LP52的合成如下所示：
4-氨基-2,5-二甲基苯甲酸的合成
将Zn(3.4g，51.235mmol)添加至2,5-二甲基-4-硝基苯甲酸(2g，10.247mmol)在MeOH(15mL)和AcOH(3mL)中的混合物中。将所得混合物在25℃搅拌16h。将所得混合物在减压下浓缩。将所得混合物用EtOAc稀释、用水洗涤并浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(用PE/EtOAc(1:1)洗脱)纯化。这产生1.1g呈灰白色固体的4-氨基-2,5-二甲基苯甲酸。LC-MS(ESI):166[M+H]+。
(4-氨基-2,5-二甲基苯基)甲醇的合成
在0℃，将LAH(13.3ml，13.318mmol)添加至4-氨基-2,5-二甲基苯甲酸(1.1g，6.659mmol)在THF(20mL)中的混合物中。将所得混合物在60℃搅拌2.5h。将反应在0℃通过添加MeOH(10mL)淬灭。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(用CH2Cl2/MeOH(10:1)洗脱)纯化。这产生500mg呈黄色固体的(4-氨基-2,5-二甲基苯基)甲醇。LC-MS(ESI):152[M+H]+。
N-[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)-2,5-二甲基苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酸叔丁基酯的合成
将EEDQ(1.4g，5.820mmol)添加至(4-氨基-2,5-二甲基苯基)甲醇(440mg，2.910mmol)和(2S)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]丙酸(551mg，2.910mmol)在DCM(6mL)和MeOH(1mL)中的混合物中。将所得混合物在25℃搅拌2h。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(用PE/EtOAc(1:1)洗脱)纯化。这产生800mg呈白色固体的N-[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)-2,5-二甲基苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酸叔丁基酯。LC-MS(ESI):323[M+H]+。
(2S)-2-氨基-N-[4-(羟基甲基)-2,5-二甲基苯基]丙酰胺的合成
在0℃，将TFA(5mL)添加至N-[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)-2,5-二甲基苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酸叔丁基酯(760mg，2.357mmol)在DCM(5mL)中的混合物中。将所得混合物在25℃搅拌2.5h。将所得混合物在减压下浓缩。在0℃，向上述混合物中滴加K2CO3(652mg，4.714mmol)、MeOH(4mL)、THF(4mL)和H2O(4mL)。将所得混合物在25℃再搅拌2h。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(用CH2Cl2/MeOH(5:1)洗脱)纯化。这产生460mg呈黄色固体的(2S)-2-氨基-N-[4-(羟基甲基)-2,5-二甲基苯基]丙酰胺。LC-MS(ESI):223[M+H]+。
N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)-2,5-二甲基苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酸叔丁基酯的合成
将(2S)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-3-甲基丁酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(650mg，2.069mmol)添加至(2S)-2-氨基-N-[4-(羟基甲基)-2,5-二甲基苯基]丙酰胺(460mg，2.069mmol)在DMF(5mL)中的混合物中。将所得混合物在25℃搅拌2h。将所得混合物用EtOAc稀释、用水洗涤并浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(用PE/EtOAc(1:2)洗脱)纯化。这产生呈黄色固体的N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)-2,5-二甲基苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酸叔丁基酯(520mg)。LC-MS(ESI):423[M+H]+。
(2S)-2-氨基-N-[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)-2,5-二甲基苯基]氨基甲酰基}乙基]-3-甲基丁酰胺的合成
在0℃，将TFA(5mL)添加至N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)-2,5-二甲基苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酸叔丁基酯(480mg，1.139mmol)在DCM(5mL)中的混合物中。将所得混合物在25℃搅拌2.5h。将所得混合物在减压下浓缩。在0℃，向上述混合物中滴加K2CO3(472.12mg，3.417mmol)、MeOH(5mL)、THF(5mL)和H2O(5mL)。将所得混合物在25℃再搅拌2h。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(用CH2Cl2/MeOH(5:1)洗脱)纯化。这产生500mg呈黄色油状物的(2S)-2-氨基-N-[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)-2,5-二甲基苯基]氨基甲酰基}乙基]-3-甲基丁酰胺。LC-MS(ESI):322[M+H]+。
6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)-2,5-二甲基苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]己酰胺的合成
将DIEA(386mg，2.986mmol)添加至(2S)-2-氨基-N-[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)-2,5-二甲基苯基]氨基甲酰基}乙基]-3-甲基丁酰胺(480mg，1.493mmol)和6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(460mg，1.493mmol)在DMF(5mL)中的混合物中。将所得混合物在25℃搅拌3h。将所得混合物用EtOAc稀释、用水洗涤并浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(用CH2Cl2/MeOH(10:1)洗脱)纯化。这产生600mg呈黄色固体的6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)-2,5-二甲基苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]己酰胺。LC-MS(ESI):515[M+H]+。
6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(碘甲基)-2,5-二甲基苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]己酰胺的合成
将碘化铯(76mg，0.291mmol)和BF3.Et2O(42mg，0.291mmol)添加至6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(羟基甲基)-2,5-二甲基苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]己酰胺(100mg，0.194mmol)在MeCN(3mL)中的混合物中。将所得混合物在氮气气氛下在25℃搅拌2h。将所得混合物用DCM稀释、用水洗涤并浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(用CH2Cl2/2-丙醇(10:1)洗脱)纯化。这产生85mg呈白色固体的6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(碘甲基)-2,5-二甲基苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]己酰胺。LC-MS(ESI):625[M+H]+。
N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-({[(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-39-硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023 ,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-34-基]硫烷基}甲基)-2,5-二甲基苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺(LP52)的合成
将DIEA(43mg，0.335mmol)添加至化合物1(50mg，0.067mmol)和6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(碘甲基)-2,5-二甲基苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]己酰胺(84mg，0.134mmol)在DMF(2mL)中的混合物中。将所得混合物在25℃搅拌1h。将粗品通过制备型HPLC用以下条件纯化(柱：Xbridge PrepPhenyl OBD柱，19*250mm，5μm；流动相A：水(0.1％FA)，流动相B：MeCN；流速：25mL/min；梯度：在10min内30％ B至45％ B，45％ B；波长：254nm；RT1(min)：9)。这产生8.7mg(10.45％)呈白色固体的N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-({[(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-39-硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023 ,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-34-基]硫烷基}甲基)-2,5-二甲基苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺(LP52)。
LC-MS(ESI):1243.5[M+H]+。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.15(s,1H),8.66(s,1H),8.39–7.99(m,4H),7.81(d,J＝8.8Hz,2H),7.24–7.06(m,2H),7.00(s,3H),6.88–6.64(m,1H),6.57(d,J＝15.8Hz,1H),6.46–6.32(m,1H),5.79–5.33(m,5H),5.32–4.63(m,2H),4.63–4.54(m,2H),4.52–4.29(m,6H),4.26–4.09(m,2H),4.05–3.81(m,3H),3.42–3.20(m,3H),2.48–2.42(m,1H),2.22–2.02(m,5H),1.99–1.93(m,2H),1.54–1.42(m,3H),1.32–1.11(m,6H),0.82(t,J＝7.7Hz,6H)。
52.LP53的合成
LP53的合成如下所示：
N-[(1S)-1-{[2-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酸叔丁基酯的合成
将2-乙氧基-1,2-二氢喹啉-1-甲酸乙基酯(16.1g，64.958mmol)添加至(2-氨基苯基)甲醇(4g，32.479mmol)和(2S)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]丙酸(6.2g，32.479mmol)在DCM(24mL)和MeOH(4mL)中的混合物中。将所得混合物在25℃搅拌2.5h。将所得混合物在减压下浓缩。将所得混合物用EtOAc稀释、用水洗涤并浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(用PE/EtOAc(1:2)洗脱)纯化。这产生9g呈白色固体的N-[(1S)-1-{[2-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酸叔丁基酯。LC-MS(ESI):295[M+H]+。
(2S)-2-氨基-N-[2-(羟基甲基)苯基]丙酰胺的合成
在0℃，将TFA(20ml)添加至N-[(1S)-1-{[2-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酸叔丁基酯(9g，30.576mmol)在DCM(20mL)中的混合物中。将所得混合物在25℃搅拌2h。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(用CH2Cl2/MeOH(5:1)洗脱)纯化。这产生5g呈黄色固体的(2S)-2-氨基-N-[2-(羟基甲基)苯基]丙酰胺。LC-MS(ESI):195[M+H]+。
N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[2-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酸叔丁基酯的合成：
将NMO(5.3g，45.306mmol)添加至(2S)-2-氨基-N-[2-(羟基甲基)苯基]丙酰胺(4.4g，22.653mmol)和(2S)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-3-甲基丁酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(7.1g，22.653mmol)在DMF(20mL)中的混合物中。将所得混合物在25℃搅拌2h。将所得混合物用EtOAc稀释、用水洗涤并浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(用CH2Cl2/MeOH(5:1)洗脱)纯化。这产生5.1g呈黄色固体的N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[2-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酸叔丁基酯。LC-MS(ESI):394[M+H]+。
(2S)-2-氨基-N-[(1S)-1-{[2-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]-3-甲基丁酰胺的合成
在0℃，将TFA(15mL)添加至N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[2-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酸叔丁基酯(5.1g，12.961mmol)在DCM(15mL)中的混合物中。将所得混合物在25℃搅拌2.5h。将所得混合物在减压下浓缩。在0℃，向上述混合物中滴加K2CO3(5.4g，38.883mmol)、MeOH(10mL)、THF(10mL)和H2O(10mL)。将所得混合物在25℃再搅拌2h。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(用CH2Cl2/MeOH(5:1)洗脱)纯化。这产生2.52g呈白色固体的(2S)-2-氨基-N-[(1S)-1-{[2-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]-3-甲基丁酰胺。LC-MS(ESI):294[M+H]+。
6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[2-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]己酰胺的合成
将DIEA(2.2g，17.044mmol)添加至(2S)-2-氨基-N-[(1S)-1-{[2-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]-3-甲基丁酰胺(2.5g，8.522mmol)和6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(2.63g，8.522mmol)在DMF(10mL)中的混合物中。将所得混合物在25℃搅拌2h。将所得混合物用EtOAc稀释、用水洗涤并浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(用PE/EtOAc(1:1)洗脱)纯化。这产生1.65g呈黄色固体的6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[2-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]己酰胺。LC-MS(ESI):487[M+H]+。
6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[2-(碘甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]己酰胺的合成
将碘化铯(400mg，1.542mmol)和BF3.Et2O(219mg，1.542mmol)添加至6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[2-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]己酰胺(500mg，1.028mmol)在MeCN(5mL)中的混合物中。将所得混合物在氮气气氛下在25℃搅拌2h。将所得混合物用DCM稀释、用水洗涤并浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(用CH2Cl2/2-丙醇(7:1)洗脱)纯化。这产生300mg呈白色固体的6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[2-(碘甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]己酰胺。LC-MS(ESI):597[M+H]+。
N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[2-({[(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-39-硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023 ,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-34-基]硫烷基}甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺(LP53)的合成
将DIEA(43mg，0.335mmol)添加至化合物1(50mg，0.067mmol)和6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[2-(碘甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]己酰胺(80mg，0.134mmol)在DMF(2mL)中的混合物中。将所得混合物在25℃搅拌1h。将粗品通过制备型HPLC用以下条件纯化：柱：XSelect CSH Prep C18 OBD柱，19*250mm，5μm；流动相A：水(10mmol/L NH4HCO3)，流动相B：MeCN；流速：25mL/min；梯度：在13min内30％ B至30％ B，30％ B；波长：254nm；RT1(min)：11.2。这产生12.7mg呈白色固体的N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[2-({[(1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34S,36R,39R,41R)-29,41-二氟-34,39-二氧代-39-硫烷基-2,33,35,38,40,42-六氧杂-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-十氮杂-34λ5,39λ5-二磷杂八环[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]四十二烷-5,7,9,11,15,19,21,23,25-壬烯-34-基]硫烷基}甲基)苯基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺(LP53)。LC-MS(ESI):1215.30[M+H]+。
实例2.J591的人源化
1 方法
1.1 计算机建模
使用抗体预测工具在薛定谔的BioLuminate中对J591进行建模。将J591与最接近的人种系IGHV1-2*06和IGKV1-13*02进行比对。分析这些亚家族在人群中的流行率，这些亚家族的代表性或相互配对程度不高。参见，例如Tiller等人(2013)mAbs[单克隆抗体]5:3,445-470。因此，使用非常相似的亚家族IGHV1-69-2*01和IGKV1-39*01。
小鼠的可变结构域和CDR移植序列用于生成计算机结构模型。遵循同源结构域方案，使用薛定谔的BioLuminate软件生成模型。
1.2基因合成与克隆
1.2.1InFusion克隆
人源化重可变结构域和轻可变结构域针对在HEK293细胞中的表达进行了密码子优化，并由赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)合成。可变结构域被合成为具有Kozak翻译起始序列和Ig分泌前导序列，并在5'和3'端处包括与亚克隆载体内的克隆位点同源的15个碱基对。使用InFusion HD克隆试剂盒(克隆技术公司(Clontech))将基因艺术公司(GeneArt)合成的PCR片段亚克隆到含有人γ或κ恒定区的表达质粒中。对所有克隆进行测序以证实插入序列的存在和保真性。
1.2.2定点诱变
根据制造商的方案，使用安捷伦公司(Agilent)的QuikChange Lightning生成突变。通过DNA测序证实了所需突变。
1.3细胞培养
1.3.1转染和稳定细胞系生成
对于待用ExpiFectamine(赛默飞世尔公司(ThermoFisher))转染的每毫升细胞，将333.3ng HC质粒和333.3ng LC质粒在50μLOpti-MEM(赛默飞世尔公司)中孵育5-10min。同样，将2.67μLExpiFectamine在50μL Opti-MEM中孵育。将ExpiFectamine溶液添加至DNA混合物中并在室温孵育20-30min。在涡旋的同时将DNA:ExpiFectamine混合物添加至细胞中并在37℃、8％ CO2、125rpm振荡下孵育。第二天，添加5μL增强子1和50μL增强子2/mL细胞至转染中，并且再继续孵育7-10天。
表达抗体的稳定池通过如下进行选择：转染后一到三天，将1mL转染子添加至T75烧瓶中的含10％胎牛血清的14mL DMEM(具有5μg/mL杀稻瘟菌素(赛默飞世尔公司)和400μg/mL博莱霉素(英维健公司(Invivogen)))中。在耐药细胞生长至汇合后，将培养基更换为FreeStyle 293表达培养基，培养24至48h。通过敲击烧瓶将细胞物理移出(胰蛋白酶消化(trypsinization)导致低活力，数据未显示)，然后以6x 105个细胞/mL接种到125mL摇瓶中的30mL FreeStyle293表达培养基中。将培养物在37℃、8％ CO2、125rpm振荡下孵育。
1.3.2MAb和Fab生产
将稳定转染的细胞系池以0.6x 106至1x 106个细胞/mL接种在FreeStyle 293表达培养基中。将细胞在37℃、8％ CO2、125rpm振荡下孵育。在培养物密度达到1x 106个细胞/mL两天后，用最终浓度10g/L精选大豆胨(BD生物科学公司(BD Biosciences))、5mM戊酸(西格玛奥德里奇公司(Sigma Aldrich))和1:100CD脂质浓缩物(赛默飞世尔公司)对培养物进行补料。当细胞活力低于50％(7-10天)时，将培养物在Beckman JLA8.1000转子中以8000rpm离心30min。然后将上清液通过0.2μm PES过滤器过滤并储存在4℃或-20℃直到纯化。
1.4MAb和Fab纯化
使用两种方法之一纯化MAb。对于少于10mL的mAb和Fab上清液，分别使用蛋白A树脂或抗κ树脂的批量纯化方法进行亲和色谱法。分别使用预填充蛋白A柱或抗κ柱纯化大于25mL的MAb和Fab上清液。
1.4.1批量纯化
使用DPBS平衡Prosep-vA高容量蛋白A树脂(密理博公司(Millipore))或CaptureSelectTMKappaSelect LC-κ树脂(赛默飞世尔公司)，并将100μL添加至3至6mL样品中。在4℃孵育1小时至过夜后，将树脂用1mL DPBS洗涤三次并以15,000x g离心30s。通过添加400μL 0.1M甘氨酸(pH 2.9)，随后以15,000x g离心30s，将样品从树脂洗脱下来。将样品用40μL的1M Tris(pH 8.0)中和。使用0.5mL Amicon Ultra、10k截留过滤器(密理博公司)，通过以15,000x g离心3至5分钟将样品浓缩至约100μL，从而更换缓冲液。将浓缩的样品在400μL DPBS中稀释，随后进行离心。该过程总共重复四次。
1.4.2柱纯化
蛋白A或HiTrap KappaSelect柱(通用电气医疗集团(GE Healthcare))用10个柱体积(CV)的20mM磷酸钠、10mM EDTA，pH 7.2进行平衡。然后加载样品，随后用10CV的平衡缓冲液洗涤未结合的材料。使用5CV的0.1M甘氨酸(pH 2.9)洗脱样品。合并含有mAb的级分，并使用MWCO 20K Slide-A-Lyzer(赛默飞世尔公司)在DPBS中进行透析。
1.5ELISA筛选
ELISA板(384孔高结合，格雷钠公司(Greiner)编号781061)用50mM碳酸盐-碳酸氢盐(pH 9.4)(皮尔斯公司(Pierce)编号28382)中的1μg/mL抗原包被，并在4℃孵育过夜。使用BioTek ELX405洗板机用洗涤缓冲液将板洗涤三次。洗涤缓冲液由PBS(康宁公司(Corning)编号46-013-CM)和0.05％ Tween20(塞拉凯公司(SeraCare)编号5460-0020)制成。用含有0.05％ Tween20和1％ BSA(西格玛公司(Sigma)A7906)的PBS制成的测定缓冲液封闭板，并在4℃孵育过夜。吸干板后添加样品，然后在4℃孵育过夜。将板洗涤三次，然后添加在测定缓冲液中以1:10,000稀释的HRP缀合的山羊抗兔IgG H+L抗体(杰克逊免疫研究公司(JacksonImmunoResearch)编号111-035-144)，并在室温孵育1小时。将板洗涤三次并添加TMB底物(塞拉凯公司编号5120-0078)，并且在室温孵育20分钟。在BMG CLARIOstar读板器上在370nm处读取板。
1.6用于结合分析的BIAcore方法
方法概述
抗PSMA抗体样品与人PSMA的亲和力通过表面等离子共振使用捕获测定形式测定，通过该捕获测定形式，抗体配体首先被BIAcore CM5芯片上固定的抗人Fc捕获。使用多循环结合测定形式并注射一系列浓度的人PSMA来测定抗体样品的亲和力。使用BIA评估、使用1:1Langmuir模型进行数据拟合。
抗人抗体芯片固定
采用标准偶联方案通过暴露的伯胺固定Fc特异性IgG。使用10mM乙酸钠(pH 5.0)(思蒂瓦公司(Cytiva)，BR1008390)将抗Fc IgG储备溶液(思蒂瓦公司，BR100839)稀释至25μg/mL。使用1XHBS-P+(思蒂瓦公司，BR100671)作为运行缓冲液在25℃进行固定。通过注入新鲜制备的1:1NHS:EDC(思蒂瓦公司，BR100050)7min(10μL/min)来活化CM5生物传感器芯片(思蒂瓦公司，29149603)上所有四个流动池的CM-葡聚糖表面。然后以5μl/min的流速注射25μg/mL抗FcIgG溶液持续6min。此偶联后注射7min(10μl/min)的1M乙醇胺(思蒂瓦公司，BR100050)，使残留反应性位点失活。通常，使用此方法偶联6,000RU的抗Fc IgG。
进一步的方法细节
筛选分析在BIAcore T-200仪器(思蒂瓦公司)上于25℃和10Hz数据收集速率下进行。在运行缓冲液(1X HBS-P+中的0.2％ BSA(BSA来自VWR公司，9048-46-8))中制备配体和分析物储备溶液，并在环境温度以18,000x rcf离心5分钟。
随后将配体溶液稀释至最终浓度5μg/mL，并将人PSMA分析物(R&D系统公司(R andD Systems))稀释至最终浓度50、12.5、3.125、0.781、0.195、0.049、0.012和0nM。芯片调理(conditioning)重复5次，其中在流动池2、3、4上注射5μg/mL抗PSMA抗体持续1min(5μL/min)。使用3M MgCl2(思蒂瓦公司，BR100839)将表面再生30sec(30μL/min)，随后稳定180sec。为了评估动力学结合，流动池1作为参考对照，并将配体溶液注射到流动池2、3、4上持续1min(5μL/min)。人PSMA样品以随机顺序以10μl/min的流速注射到四个表面上。与抗原注射液相同的缓冲液注射液是随机散布的，以达到双重参考的目的。结合和解离阶段分别监测5min和10min。如调理步骤中所提及的，对表面进行再生。为了确定相互作用的动力学参数，对每个数据集进行双重参考并全局拟合到1:1相互作用模型(使用BIA评估的Langmuir模型)。
1.7差示扫描量热法(DSC)分析
PEAQ差示扫描量热仪(马尔文仪器公司(MalvernInstruments)，PEAQ-DSC，s/nMAL1223867，带有MicroCalPEAQ-DSC软件v.1.53)用于解密和比较各个F(ab’)2片段和对照的高阶结构和热稳定性。使样品适应环境温度30分钟，随后进行涡旋。将样品(0.325mL，0.85mg/ml)添加至测定板(微量分析用品公司(Microliter Analytical Supply)，96孔，500μL，圆孔和圆底，目录号07-2100；新苏瑞公司(Sun Suri)板盖目录号300-005)的适当孔中。将0.325mL的20％Contrad溶液和0.325mL水添加至测定板的适当孔中。将密封板放入自动进样器中，保持4℃温度。
使用以下测定参数对运行进行编程和启动：
DSC控制：
起始温度＝20℃
最终温度＝100℃
扫描速率＝60℃/hr
扫描前恒温器＝10分钟
扫描后恒温器＝0分钟
反馈模式/增益＝无
样品参数：
孔板体积＝0.325mL
清除补充物的数目＝5
样品浓度＝0.85mg/ml
分子量(道尔顿)＝150,000
清洁设置＝扫描
溶剂储罐＝1号，20％ Contrad
冲洗体积＝10mL
使用Contrad/20℃-70℃的Contrad(60℃/小时)，随后使用两种缓冲液/缓冲液注射液进行在线清洁
样品分析参数：
Y轴刻度单位＝mCal/分钟
减去缓冲液
基线拟合＝样条曲线
拟合＝非两种状态拟合模型
迭代＝是
2 结果
2.1 人源化和亲和力表征
通常，人源化过程涉及将最接近的人种系序列与动物源性抗体序列进行匹配，然后将CDR区移植到人种系框架上。非人残基可能引发免疫原性反应，导致患者产生抗药物抗体反应，从而中和抗体的治疗性效果。使用IGBLAST(图1，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)，使用小鼠源性J591序列来搜索最接近的人种系序列。选择人VH种系家族IGVH1-69-2*01和人VL种系IGKV1-39*01作为种系框架。人源化变体是根据CDR的线性位置(由Kabat和IMGT两者定义)生成的。J591 CDR被移植到这些人框架上，由此小鼠源性CDR替代了人CDR。由于CDR长度有几种定义，因此所移植的CDR序列涵盖IMGT和Kabat定义两者(Vhzu1和Vkzu1)。这增加了将整个互补位移植到人框架上的可能性。取代了整个可变序列中额外的小鼠或人残基，以增加人性化(humanness)，而不影响对PSMA的亲和力。
生成了J591的计算机模型，并鉴定了与CDR相邻的、小鼠以及Vhzu1和Vkzu1人源化序列之间不同的框架残基(图2)。随后的人源化Vh变体2至10是通过在整个框架中添加小鼠残基生成的。未鉴定出额外的小鼠Vk残基对抗原结合有潜在影响。
人源化HC 1至10与人源化LCzu1配对，并通过ELISA测试了PSMA结合(图3)。将PSMA包被在板上，用封闭溶液封闭，然后与不同浓度的抗体一起孵育。洗涤板以除去未结合的抗体后，添加HRP缀合的检测抗体。除去未结合的检测抗体后，将TMB添加至板中。用H2SO4终止HRP和TMB之间的反应，并对板进行分析。除zu4之外的所有HC变体与PSMA的结合类似于或优于J591。HCzu4-LCzu1抗体表达较差，并且缺乏结合可能是由于蛋白质数量不足而不是HC序列所致。
通过SPR分析抗体-PSMA相互作用的KD。测定了每种抗体的KD，并且每种人源化变体、deJ591和J591的KD的差异很小(2.5倍内)(表17)。使用BIAcore T-200仪器通过SPR分析J591抗体变体和PSMA之间的结合动力学。
表17.所有人源化HC均以与J591和deJ591类似的亲和力结合PSMA
ka kd KD 备注
HCzu1LCzu1 3.24E+04 6.88E-05 2.12E-09
HCzu2LCzu1 2.90E+04 6.28E-05 2.17E-09
HCzu3LCzu1 3.45E+04 7.72E-05 2.24E-09
HCzu4LCzu1 6.95E+04 2.39E-04 3.45E-09 抗体捕获不良
HCzu5LCzu1 3.85E+04 1.19E-04 3.10E-09
HCzu6LCzu1 3.94E+04 1.07E-04 2.72E-09
HCzu7LCzu1 5.82E+04 1.00E-04 1.72E-09
HCzu8LCzu1 6.14E+04 9.38E-05 1.53E-09
HCzu9LCzu1 7.33E+04 1.01E-04 1.38E-09
HCzu10LCzu1 5.99E+04 1.05E-04 1.74E-09
J591 1.03E+05 1.27E-04 1.22E-09
de J591 7.81E+04 1.43E-04 1.82E-09
第一组中人源化程度最高的HC-LC组合是HCzu1-LCzu1，证明了人框架中不需要额外的小鼠残基来支持抗原结合。然后通过在CDRH2中Kabat定义的位置60和61，CDRL1中残基24、33和34，以及CDRL2中残基56处反向添加(add back)更多的人残基，对序列进行超人源化(图1)。每个HC与每个LC配对，并通过ELISA分析了PSMA结合。通过对与各个LC配对的单独的HC进行比较，HC的变化对抗原结合的影响很小(图4)。LCzu3和LCzu6配对往往表现出比其他超人源化变体更弱的结合。两种LC变体分别在位置33和34处含有Leu和Asn残基，表明该区域的小鼠残基改进了PSMA结合。选择这些抗体变体中的几种进行进一步表征。
HCzu1、HCzu2、HCzu3和HCzu14各自与LCzu1配对。通过SPR分析这些抗体对PSMA的亲和力。与LCzu1配对的人源化HC变体之间的KD几乎没有差异(表18)。HCzu14是最人性化的序列(the most human sequence)，并且被选为主要HC变体。HCzu14与每个人源化LC变体配对，并通过SPR测量对PSMA的亲和力(表19)。与J591类似，与LCzu1、2、4和5配对的HCzu14保留了对PSMA的亲和力。正如ELISA筛选所见，与LCzu3和LCzu6配对导致亲和力降低，再次证明了CDRL2残基33和34的作用。
表18.人源化程度最高的变体Hczu14-LCzu5保留与J591类似的PSMA亲和力
ka kd KD
J591-HCzu1LCzu1 5.29E+04 1.05E-04 1.98E-09
J591-HCzu2LCzu1 2.84E+04 7.71E-05 2.71E-09
J591-HCzu3LCzu1 3.89E+04 8.45E-05 2.17E-09
J591-HCzu14LCzu1 3.50E+04 1.42E-04 4.07E-09
J591-HCzu14LCzu5 4.14E+04 1.30E-04 3.13E-09
J591 1.06E+05 1.21E-04 1.14E-09
表19.人源化程度最高的变体Hczu14-LCzu5保留与J591类似的PSMA亲和力
配体 ka kd KD
J591 5.69E+04 6.56E-05 1.14E-09
Hzu14-Lzu1 3.79E+04 5.06E-05 1.34E-09
Hzu14-Lzu2 2.82E+04 5.84E-05 2.07E-09
Hzu14-Lzu3 2.62E+04 9.01E-05 3.44E-09
Hzu14-Lzu4 3.05E+04 5.19E-05 1.70E-09
Hzu14-Lzu5 2.73E+04 5.06E-05 1.85E-09
Hzu14-Lzu6 2.15E+04 1.34E-04 6.23E-09
2.2J591和人源化变体的热稳定性
通过差示扫描量热法分析人源化抗体的热稳定性。首先在完整抗体的上下文中分析Fab结构域的转变中点(Tm)。对三批deJ591进行了分析，Fab显示出两个重叠峰，其中平均Tm为67.3和70.37(图5A)。对于抗体来说，这种特征非常不寻常。Fab通常会显示Tm在mid-70s至mid-80s℃的单个峰。这些数据表明deJ591 Fab区域非常不稳定。通过DSC分析人源化变体HCzu1-LCzu1、HCzu2-LCzu1、HCzu3-LCzu1、HCzu14-LCzu1和HCzu14-LCzu5并与deJ591进行比较(图5B)。所有人源化变体均显示出抗体稳定性的显著改进。正如对HCzu14-LCzu1和HCzu14-LCzu5进行比较时所见，LCzu1和LCzu5在抗体稳定性方面没有显示出差异。HC变体之间的热稳定性存在微小差异。HCzu3是最稳定的变体，Tm为85.3℃。HCzu1和HCzu2非常相似，Tm分别为83.93℃和83.43℃。当与LCzu1和LCzu4配对时，HCzu14显示出最低的Tm，分别为82.36℃和82.25℃。这些数据表明Ile 48、Asn 60和Gln 61(由Kabat定义)在一定程度上有助于Fab稳定性。鉴于1)HCzu3和HCzu14的Tm差异仅为3℃，2)HCzu14-LCzu5的Tm较高，以及3)HCzu14-LCzu5是人源化程度最高的序列，因此选择人源化变体HCzu14-LCzu5进行进一步开发。
HCzu14-LCzu5-IgG1抗体被修饰为包括位点特异性缀合残基。将用于转谷氨酰胺酶介导的缀合的两个酰基受体位点和两个未配对的马来酰亚胺反应性半胱氨酸掺入IgG1主链中，并分析了Fab的稳定性。IgRH2在CH1中含有T135K突变，用于生成DAR 2缀合物。IgRH6在CH1中含有T135K和L193K突变，以生成DAR 4缀合物。IgG1-C80将Vκ中的Pro 80突变为Cys，以生成DAR 2缀合物。IgG1-A118C-C80将Vκ中的Pro 80突变为Cys，将CH1中的Ala118突变为Cys，以生成DAR 4缀合物。所有突变均在Fab片段内，并分析了每个Fab片段的Tm。对完整抗体进行酶促消化以生成Fab'2和Fc片段后，除去Fc，并通过DSC分析Fab'2。正如在完整IgG1的上下文中所见(图5B)，deJ591 Fab显示出具有低Tm的两个峰(图5C)。J591 Fab的Tm为单个峰，但显著(约8℃)低于HCzu14-LCzu5 Fab片段。尽管IgG1-C80-A118C显示出比其他三个略高的Tm，但位点特异性缀合位点对热稳定性的影响很小。
实例3.J591和人源化变体的计算机免疫原性预测
1J591和人源化变体的计算机免疫原性预测方法
阿布泽纳公司(Abzena)的iTope-AI是一个计算机免疫原性风险评估平台，使用机器学习预测算法来预测与代表最常见HLA等位基因的46种HLA-DR、DP和DQ同种型结合的重叠9mer肽。与人蛋白质组完全同源的肽序列通常被排除在分析之外。总体风险评分或头寸风险评分(Position Risk Score)是通过对于每个HLA同种异型，为单独的肽提供0至3的结合评分来计算的，其中将所有HLA-DR、DP和DQ等位基因的评分相加在一起。评分为1-2、3-5或6+的肽的头寸风险评分分别被认为是弱、中或强混杂MHC II类结合物。通过计算所有单独的肽的头寸风险评分的总和，为整个蛋白质序列分配一个总评分。具有头寸风险评分的肽与阿布泽纳公司的TCEDTM数据库进行交叉引用，该数据库包含>10,000种肽，这些肽在阿布泽纳公司的离体EpiScreenTM研究中刺激了T细胞反应。阿布泽纳公司声称“该算法能够准确预测先前通过X射线晶体学3D结构鉴定的95％的肽结合核心基序。”阿布泽纳公司使用iTope-AI分析了来自嵌合小鼠J591Vh-huIgG1、小鼠J591Vκ-huκ、deJ591-huIgG1、deJ591-huκ、zuJ591-H14-huIgG1和zuJ591-L5-huκ的重叠9mer序列的潜在免疫原性。
2J591和人源化变体的计算机免疫原性预测结果
嵌合小鼠J591Vh-huIgG1含有17个弱、中、和强亲和力的非种系9mer肽，产生了69的总评分和16的热点最大值(Hotspot Max)(即最高评分表位的值)(图6)。这些肽中的七种肽与先前鉴定的T细胞表位部分匹配。潜在的免疫原性肽涵盖CDRH1、CDRH2和CDRH3，其中大部分与FWRH3至FWRH4的Vh区的C末端一半重叠。“去免疫”deJ591-huIgG1除去了这些肽中的8种肽，并含有9个弱、中、和强亲和力的非种系肽，产生了35的总评分和9的热点最大值。这些肽中的五种肽与先前鉴定的T细胞表位部分匹配。这些肽涵盖CDRH1-FWRH2和CDRH3-FWRH4。zuJ591-H14-huIgG1的人源化进一步将潜在的免疫原性肽的数量减少到4个弱亲和力和强亲和力的非种系肽，产生了23的总评分和14的热点最大值。鉴定出与先前鉴定的T细胞表位的三个部分匹配。这些肽与CDRH1-FWRH2重叠。
嵌合小鼠J591Vκ-huκ含有23个弱、中、和强亲和力的非种系肽，产生了207的总评分和50的热点最大值(图7)。四种肽与先前鉴定的T细胞表位部分匹配。所鉴定的肽几乎遍布整个序列。“去免疫”deJ591-huκ将潜在的免疫原性肽的数量减少到7个弱、中、和强亲和力的非种系肽，产生了94的总评分和50的热点最大值。没有肽与先前鉴定的T细胞表位部分匹配。这些肽位于CDRL1、CDRL2和FWRL3-CDRL3中。zuJ591-L5-huκ的人源化显示出所鉴定的7个弱、中、和强亲和力的非种系肽，与先前鉴定的T细胞表位没有部分匹配。deJ591-huκ和zuJ591-L5-huκ之间CDRL1和CDRL2中的肽是相同的。然而，增加的zuJ591-L4人源化降低了CDRL2中肽的热点评分，除去了deJ591-huκ中的FWR3-CDRL3肽，并在CDRL3-FWRL4中产生了新的弱结合肽。zuJ591-huκ的总评分是88且热点最大值是48。
实例4.ADC缀合和表征
抗PSMA ADC缀合方法
抗PSMA ADC被制备为与未配对的半胱氨酸缀合的位点特异性DAR4(抗PSMA-LP1和抗PSMA-LP2)，同时抗体保持完整，并且被制备为与抗体部分还原产生的半胱氨酸缀合的随机DAR4(抗PSMA-LP3)。LP4–LP29评估了对连接子的修饰，并且LP30–LP32评估了对有效载荷的修饰。
1.1抗PSMA-LP1部分和抗PSMA-LP2部分，位点特异性缀合的制备
抗PSMA-LP1部分缀合的制备方案如下所示：
抗PSMA-LP2部分缀合的制备方案如下所示：
1.2方法
抗体脱帽：抗hPSMA-zuJ591-H14L5-hIgG1-A118C-C80用于缀合。抗体在轻链C80和重链A118C处含有未配对的半胱氨酸，两者在抗体生产过程中均被半胱氨酸化。为了使半胱氨酸能够缀合，使用Explorer纯化平台(通用电气医疗集团)进行纯化。适当尺寸的Mabselect sure柱(思蒂瓦公司)用6个柱体积(CV)的20mM磷酸钠、10mM EDTA，pH 7.2进行平衡。将含有抗体的条件培养基通过0.2μm膜过滤，然后加载到柱上，随后用10CV的平衡缓冲液洗涤未结合的材料。然后进行以下两者之一：
A.然后用含有10mM EDTA、10mM半胱氨酸的20mM磷酸钠缓冲液，pH 7.2以低流速洗涤柱16小时。此步骤之后用20mM Tris(pH 7.5)以低流速再次洗涤60小时。使用5CV的0.1M甘氨酸(pH2.9)洗脱样品。将洗脱的材料加载到在1X磷酸盐缓冲盐水(PBS)中平衡的26/10HiPrep脱盐柱(通用电气医疗集团)上，并在相同缓冲液中洗脱。合并峰级分并过滤。也可以使用1X PBS透析代替脱盐。使用BCA(二辛可宁酸)测定来测定抗体浓度。
B.使用5CV的0.1M甘氨酸(pH 2.9)洗脱样品。将洗脱的材料添加到在1x磷酸盐缓冲盐水(PBS)中平衡的26/10HiPrep脱盐柱(通用电气医疗集团)上，并在相同缓冲液中洗脱。合并峰级分并过滤。也可以使用1x PBS透析代替脱盐。使用BCA测定来测定抗体浓度。向抗体(10mg/mL)在1x DPBS/2mM EDTA中的溶液中添加等体积的TCEP溶液(10mM，在1x DPBS/2mM EDTA中，pH 7.5)。将溶液混合90分钟，然后使用Hitrap脱盐通过FPLC(快速蛋白质液相色谱法)纯化到1x DPBS/2mM EDTA中。然后，将脱氢抗坏血酸(DHAA)添加至抗体溶液中，最终浓度为1mM DHAA。将溶液混合1小时，然后使用Hitrap脱盐通过FPLC纯化到1x DPBS/2mMEDTA中。使用BCA测定来测定抗体浓度。
缀合和纯化：向脱帽的抗体(5.8mg/mL，3.5mL；或7.5mg/mL，2mL)在1X PBS、2mMEDTA中的溶液中添加连接子-有效载荷(4.29摩尔当量，来自LP1或LP2或其盐的10mM DMSO储备溶液；或5摩尔当量，来自LP4–LP32或其盐的10mM DMSO储备溶液)。立即充分混合缀合反应，并使缀合在室温进行0.5小时的时间段，然后使用Hitrap脱盐(2x 5mL)柱通过FPLC纯化到25mM柠檬酸钠、100mM蔗糖，pH 6.0中。将洗脱物合并，过滤灭菌(Whatman Puradisc13，目录号6791-1302)，并储存在4℃。分析纯化的ADC的总蛋白质含量(二辛可宁酸测定，Pierce BCA方案，目录号23225)。通过HPLC-HIC(高效液相色谱法-疏水相互作用色谱法)、SEC(尺寸排阻色谱法)和RP-UPLC-MS(反相超高效色谱法-质谱法)对ADC产物进行表征。平均DAR(药物与抗体比率)和药物分布来源于HIC和LC-MS数据的说明。
1.3结果
抗PSMA-LP2：2.44mg/mL，8mL。总计19.52mg。产率百分比：96.2％。平均DAR(HIC-HPLC)＝4.12。产率百分比计算为[最终ADC产率]/[起始mAb]。起始mAb＝5.8mg/ml x 3.5ml＝20.3mg；最终ADC产率＝2.44mg/ml x 8ml＝19.52mg。
抗PSMA-LP1：1.87mg/mL，8mL。总计14.96mg。产率：73.7％，平均DAR(HIC-HPLC)＝4.07。计算产率百分比：起始mAb＝5.8mg/ml x 3.5ml＝20.3mg，最终ADC＝1.87mg/ml x8ml＝14.96mg。
表20中总结了抗PSMA-LP1和-LP2的缀合结果，以及LP4–LP32的缀合结果。
表20.ADC缀合结果
2.1抗PSMA-LP3部分，随机缀合的制备
PSMA-STING ADC被制备为与抗体部分还原产生的半胱氨酸缀合的随机DAR4(抗PSMA-LP33、LP35–LP36和LP39–LP53)。
制备PSMA S附接(例如抗PSMA-LP3(LP3)部分)的示例方案如下所示：
2.2方法
柠檬酸盐缓冲液的制备：向1L DI(去离子)水中添加34.2g蔗糖和7.35g柠檬酸钠二水合物。搅拌混合物，然后用1M HCl将pH调节至6.0。
缀合和纯化：抗hPSMA-zu591-H14L5-IgG1抗体用于缀合。使用Explorer纯化平台(通用电气医疗集团)进行抗体纯化。适当尺寸的Mabselect sure柱(思蒂瓦公司)用6个柱体积(CV)的20mM磷酸钠，pH 7.2进行平衡。将含有抗体的条件培养基通过0.2μm膜过滤，然后加载到柱上，随后用10CV的平衡缓冲液洗涤未结合的材料。使用5CV的0.1M甘氨酸(pH 2.9)洗脱样品。将洗脱的材料加载到在1X磷酸盐缓冲盐水(PBS)中平衡的26/10HiPrep脱盐柱(通用电气医疗集团)上，并在相同缓冲液中洗脱。合并峰级分并过滤。也可以使用1X PBS透析代替脱盐。使用如下所述的BCA测定来测定抗体浓度。
向抗体(5mg/mL，2.5mL)在1X DPBS缓冲液中的溶液中添加0.5M EDTA储备溶液至最终EDTA浓度为2mM。以1:3.336摩尔当量(mAb:TCEP)添加相同缓冲液中新鲜制备的储备液(1mM)的TCEP溶液。将溶液充分混合并在室温(21℃)孵育1小时。将还原的抗体溶液用等体积的50:50 1X DPBS:丙二醇进一步稀释，与LP3(7.44摩尔当量，来自10mM DMSO储备溶液)预混合，以获得最终蛋白质浓度为约2.315mg/mL的溶液。立即充分混合缀合反应，并使缀合在室温进行大约0.5小时的时间段，然后使用Hitrap脱盐(2x5mL)柱通过FPLC纯化到25mM柠檬酸钠缓冲液(含有100mM蔗糖，pH 6.0)中。将洗脱物合并，过滤灭菌(Whatman Puradisc13，目录号6791-1302)，并储存在4℃。分析纯化的ADC的总蛋白质含量(二辛可宁酸测定，Pierce BCA方案，目录号23225)。通过HPLC-HIC、SEC和RP-UPLC-MS对ADC产物进行表征。平均DAR和药物分布来源于HIC和LC-MS数据的说明。
阴性对照ADC抗SEB-LP3部分是根据上述方案制备的。抗SEB单克隆抗体79G9用于缀合。将0.5M EDTA储备溶液添加至抗SEB 79G9抗体(6mg/mL，1mL)在1X DPBS缓冲液中的溶液中至最终EDTA浓度为2mM。以1:3.75摩尔当量(mAb:TCEP)添加相同缓冲液中新鲜制备的储备液(1mM)的TCEP溶液。将溶液充分混合并在室温(21℃)孵育1小时。将还原的抗体溶液用等体积的50:50 1XDPBS:丙二醇进一步稀释，与LP3(7.44摩尔当量，来自10mM DMSO储备溶液)预混合，以获得最终蛋白质浓度为约2.5mg/mL的溶液。立即充分混合缀合反应，并使缀合在室温进行大约0.5小时的时间段，然后使用Hitrap脱盐(2x 5mL)柱通过FPLC纯化到25mM柠檬酸钠缓冲液(含有100mM蔗糖，pH 6.0)中。将洗脱物合并，过滤灭菌(WhatmanPuradisc 13，目录号6791-1302)，并储存在4℃。
2.3结果
抗PSMA-LP3：制备为1.16mg/mL，6mL，总计6.96mg，DAR 3.95，55.7％产率。计算产率百分比：起始mAb量＝5mg/mlx 2.5ml＝12.5mg；ADC产率＝1.16ng/ml x 6ml＝6.96mg。
表21中总结了抗PSMA-LP3的缀合结果，以及LP33–LP53的缀合结果。
表21.S附接ADC缀合结果
3抗PSMA-LP33，随机缀合的制备
抗PSMA-LP33部分的制备方案如下所示：
缀合和纯化：向抗体(4mg/mL，3.5mL)在1x DPBS缓冲液中的溶液中添加0.5M EDTA储备溶液至最终EDTA浓度为2mM。以1:4.18摩尔当量(mAb:TCEP)添加相同缓冲液中新鲜制备的储备液(1mM)的TCEP溶液。将溶液充分混合并在室温(21℃)孵育80分钟。将还原的抗体溶液用等体积的50:50 1x DPBS:丙二醇进一步稀释，与LP33连接子-药物缀合物(4.18摩尔当量，来自10mM DMSO储备溶液)预混合，以获得最终蛋白质浓度为约1.79mg/mL的溶液。立即充分混合缀合反应，并使缀合在室温进行大约0.5小时的时间段，然后使用Hitrap脱盐(4x5 mL)柱通过FPLC纯化到1x DPBS中。将洗脱物合并，过滤灭菌(Whatman Puradisc 13，目录号6791-1302)，并储存在4℃。分析纯化的ADC的总蛋白质含量(二辛可宁酸测定，Pierce BCA方案，目录号23225)。通过HPLC-HIC、SEC和RP-UPLC-MS对ADC产物进行表征。
结果：抗PSMA-LP33：1.70mg/mL，8mL。总计15.3mg。产率百分比：97.1％，DAR 4.00。计算产率百分比：起始mAb＝4mg/mlx3.5ml＝14mg；最终ADC＝1.7mg/ml x 8ml＝13.6mg。
4ADC表征方法
4.1蛋白质浓度-BCA测定
使用UV/Vis 96孔板，使用BCA测定(赛默科技公司(Thermo Scientific)，目录号23225或23227)来测定蛋白质浓度。向20μl连续稀释的ADC样品或牛丙种球蛋白2mg/ml标准品中添加160μl制备的BCA试剂(新鲜混合的200μL试剂B和10mL试剂A)，并将样品充分混合。将样品在37℃孵育30min。在SpectraMax M5读板器(分子装置公司(Molecular Devices)，S/N MV05371)上在562nm处读取板。使用SoftMax Pro软件和4参数拟合模型对数据进行分析。
4.2HIC-HPLC
抗体药物缀合物于室温在连接到安捷伦公司1260系列HPLC的Butyl-NPR柱(东曹生物科学公司(Tosoh Bioscience)；4.6mm x 35mmi.d.；2.5μm粒径)上经受疏水相互作用色谱法(HIC)。以1mg/mL或以上浓度注入样品(10μL)(所有稳定性样品均为1mg/mL)。采用线性梯度洗脱，以100％流动相A/0％流动相B开始，在15min的时间段内以0.7mL/min或0.6mL/min过渡到0％流动相A/100％流动相B(流动相A：1.5M硫酸铵、25mM磷酸钠，pH7.0，流动相B：25％异丙醇、25mM磷酸钠，pH 7.0)。注射未修饰的抗体提供了一种鉴定DAR＝0的峰的方法。根据280nm处的吸光度检测抗体。使用安捷伦公司化学工作站软件分析峰面积。
DAR(药物与抗体比率)计算如下：
实例：
DAR 0：10％
DAR 2：25％
DAR 4：25％
DAR 6：25％
DAR 8：15％
平均DAR＝(10*0/100)+(25*2/100)+(25*4/100)+(25*6/100)+(15*8/100)＝4.20
4.3SEC-HPLC
在配备DAD(二极管阵列检测器)的安捷伦公司1200HPLC系统上使用SEC分析抗体药物缀合物的聚集和片段化。保护型柱(安捷伦公司AdvanceBio SEC 300A，2.7um，7.8x50mm，PL1180-1301)和分析型柱(安捷伦公司AdvanceBio SEC 300A，2.7um，7.8x300mm，PL1180-5301)在流动相(0.1M磷酸钠、0.15M氯化钠、5％ IPA，pH 7.4)中以3个柱体积进行平衡。纯注入8μL ADC，并以0.5mL/min运行36分钟。ADC在280nm处检测，参考波长为360nm。使用安捷伦公司化学工作站软件(BC.01.07版)分析数据，并根据峰积分结果将数据报告为聚集％、单体％和片段化％。
实例5.体外研究
1PSMA特异性结合分析
将抗PSMA抗体、抗PSMA-LP3(ADC)和对照抗人IgG1与Alexa Fluor 647(AF647)琥珀酰亚胺酯(赛默公司(Thermo)，目录号A20006)以mAb:AF647＝1:10的摩尔比在室温缀合1小时，然后使用抗体缀合纯化试剂盒(赛默公司，目录号A33086)按照制造商的说明进行纯化。
使用BD Fortessa流式细胞术测量ADC与表达PSMA的细胞的结合。将1x 105个LNCaP细胞/孔进行胰蛋白酶消化，然后与直接用NHS-AF647标记的抗体、ADC或hIgG1对照一起在冰上孵育30分钟，浓度范围为0.003-100nM，作为半对数连续稀释度。使用FACS缓冲液(1x PBS中的2％ FBS，不含钙和镁)洗涤样品两次，然后将样品用100μL含有FixableViability染料的FACS缓冲液(1:5000稀释)重悬，并通过流式细胞术进行分析。AF647-抗PSMA和AF647-PSMA-LP3显示出与细胞的类似的结合亲和力，而AF647-hIgG1不与细胞结合(图8)。结果表明抗PSMA抗体和抗PSMA ADC均与PSMA阳性LNCaP细胞结合。
2PSMA依赖性抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)活性
将新鲜的人单核细胞在M-CSF(巨噬细胞集落刺激因子)存在下培养6天，以将细胞分化为人巨噬细胞。将LNCaP(PSMA高)和DU-145(PSMA无效)细胞用羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯(CFSE；艾博康公司(Abcam)，目录号ab113853)标记、洗涤、然后以1x105个细胞/孔接种到96孔U型底板中。以1x 105个细胞/孔添加人巨噬细胞并充分混合。将测试试剂(PSMA-LP3、SEB-LP3(葡萄球菌肠毒素B-LP3)、PSMA抗体和化合物1)连续稀释并以0.01-100nM范围内的最终浓度添加至细胞中，如图所示(图9)。将板在37℃孵育2小时。然后使用流式细胞术分析细胞。吞噬作用百分比分析为CFSE+(FITC)CD14+(APC)/[CFSE+/CD14+和CFSE-/CD14+]X 100；CD14被用作巨噬细胞的标记物。数据报告为摄取至少一种靶细胞的巨噬细胞的百分比。
如图9所示，在LNCaP和巨噬细胞的共培养物中观察到抗原依赖性吞噬作用，但在DU-145和巨噬细胞细胞的共培养物中未观察到抗原依赖性吞噬作用。抗PSMA-LP3和抗PSMA抗体促进了相当的对肿瘤细胞的吞噬作用，而阴性对照ADC(抗SEB-LP3)没有观察到活性。
3靶细胞依赖性ADC内化
将抗PSMA-LP3 ADC与pHrodo Red琥珀酰亚胺酯(赛默公司，目录号P36600)以mAb:pHrodo Red＝1:10的摩尔比在室温缀合1小时，然后使用抗体缀合纯化试剂盒(赛默公司，目录号A33086)按照制造商的说明进行纯化。
将THP1细胞、C4-2细胞和混合的C4-2/THP1细胞(C4-2:THP1＝1:1)进行胰蛋白酶消化，并以1x 105个细胞/孔接种到96孔测定板中，然后用pHrodo缀合的抗PSMA-LP3 ADC(最终浓度范围为0.001-100nM ADC)在37℃、5％ CO2下处理2小时。将细胞离心并用无血清培养基洗涤两次。使用NovoCyte Quanteon流式细胞仪测量内化抗体。使用ADC浓度(X轴)相对于观察到的MFI(Y轴)绘制ADC内化(图10)。如图10所示，在C4-2单一培养物和C4-2/THP1共培养物中以剂量依赖性方式观察到内化，其中对于THP1单一培养物观察到低得多的内化速率。
4ADCP依赖性IFNβ生产
使用96孔平底组织培养板，将C4-2细胞以1x 105个细胞/孔(100μl)接种到10％c/RPMI培养基中。将ADC的储备溶液按稀释系列的10x进行连续稀释，并将20μL的ADC溶液添加至孔中并在37℃孵育10分钟。以1x 105个细胞/孔(总计80μL)添加THP-1细胞。
在经处理以阻断吞噬作用的细胞中测量了用抗PSMA ADC处理后的hIFNβ生产(图11，左分图)。将细胞松弛素D(CytoD；细胞信号传导公司(CellSignaling)，目录号94946S)溶解于DMSO中，以产生5mM储备溶液，然后添加至半对数稀释的抗PSMA-LP2溶液中至最终浓度为10μM。在室温孵育10分钟后，添加THP1细胞，并将板在37℃、5％ CO2下孵育6小时。然后，收获细胞培养物上清液用于hIFNβ定量。
还在用抗PSMA ADC(与抗PSMA抗体或同种型对照竞争)处理的细胞中测量了hIFNβ生产(图11，右分图)。将抗PSMA-LP1ADC溶液在同种型对照(抗人IgG1)抗体或抗PSMA抗体(例如，用于生成抗PSMA-LP1 ADC的相同抗体)(均为2μM)存在下连续稀释，然后添加至测试板中，最终ADC浓度范围为0.001-100nM。将板在37℃、5％ CO2下孵育6小时。然后，收获细胞培养物上清液用于hIFNβ定量。
使用人IFNβQuantikine ELISA试剂盒(R&D系统公司，目录号DIFNB0)，按照制造商的说明测量IFNβ释放。测定结束时，使用QuantaBlu荧光过氧化物酶底物(赛默公司，目录号15169)来探测信号。在分子装置公司M5读板器上在320nM的激发和405nM的发射处读取板。
5ADCP依赖性骨髓细胞活化
将新鲜的人单核细胞与M-CSF一起培养6天，以分化为人巨噬细胞，然后收获用于研究。将LNCaP或DU-145细胞进行胰蛋白酶消化，并以1x 105个细胞/孔接种到96孔板中。将人巨噬细胞细胞添加至每个孔中，然后添加抗体和ADC，抗体和ADC的最终浓度范围为0.01-30nM，而单独的化合物1的最终浓度范围为0.04-120nM。将细胞板在37℃、5％ CO2下孵育20小时，然后收获细胞进行流式细胞术分析。如图12所示，巨噬细胞中的CD80表达(Y轴)相对于ADC浓度(nM)作图。
抗PSMA-LP3 ADC在LNCaP细胞存在的情况下活化巨噬细胞，如通过浓度低至0.1nM时CD80表达上调所证明的(图12，左分图)。用单独的抗PSMA抗体或单独的化合物1处理，CD80表达保持不变，并且在高浓度的抗SEB-LP3 ADC(阴性对照抗体-化合物1缀合物)下仅观察到对CD80表达的微小影响。
在存在不表达PSMA的DU-145细胞的情况下，在抗PSMA-LP3处理的巨噬细胞中未观察到CD80表达的上调(图12，右分图)。
实例6.LNCaP异种移植模型
1PSMA+LNCaP异种移植模型中抗PSMA-化合物1ADC的体内抗肿瘤活性
6-8周龄的CB17 SCID小鼠用于本研究。将LNCaP-FGC(ECACC，目录号891102117)细胞以与基质胶混合的0.2mlPBS(50:50)中的10x 106个细胞皮下接种于右胁部。接种后第15天对小鼠进行去势。将小鼠分为10只小鼠/组，总计五组。对小鼠进行单次剂量静脉内(IV)给药，并监测肿瘤体积和体重长达35天。
如图13所示，0.5mg/kg和1.0mg/kg的抗PSMA-LP3 ADC(“抗PSMA-LP3 VAP-Sp”)显著减少了肿瘤生长。对照抗SEB-LP3 ADC也显示出抗肿瘤作用，而单独的抗PSMA抗体和媒介物之间没有观察到统计学显著性。应用双因素方差分析检验进行统计学分析。
2抗PSMA-LP3 ADC对I型干扰素基因的调节
药效学研究与上述功效研究一起进行。额外的6只小鼠/组用于媒介物、PSMA抗体、抗PSMA-LP3 ADC和对照SEB-LP3 ADC组。将LNCaP-FGC(ECACC，目录号891102117)细胞以与基质胶混合的0.2mlPBS(50:50)中的10x 106个细胞皮下接种于右胁部。接种后第15天对小鼠进行去势。第23天，当平均肿瘤体积达到约400mm3时，对小鼠以1mg/kg的单次静脉内剂量的抗体或ADC给药6小时，然后从每只小鼠身上收集肿瘤和血液进行RNA-seq分析。
将肿瘤样品保存在RNAlater中用于RNA分离。cDNA文库制备、测序和原始读取过滤方法均在BGI执行，如前所述(Ren等人,2012)。使用STAR将异种移植模型的读数与组合的hg19和mm10基因组进行比对(参见Dobin等人(2013)Bioinformatics[生物信息学]29(1):15-21)，并且基因异形体计数由Kallisto定量(参见Bray等人(2016)NatureBiotechnology[自然生物技术]34:525-527)。基因定量以TPM(每百万转录本数)为单位给出。
如图14所示，四种STING通路特异性细胞因子(CXCL10、IFNβ、IL6、TNFα)通过抗PSMA-LP3 ADC处理来调节(图14A和14B)。还观察到肿瘤微环境中巨噬细胞极化从M2转变为M1。
实例7.22RV1异种移植模型
1 22RV1异种移植模型：去势条件
Balb/c去势雄性裸鼠用于本研究。将悬浮在100μL含有50％基质胶的1X PBS中的2.5x 106个22RV1细胞皮下植入每只小鼠的右臂，并监测肿瘤生长。将小鼠随机分为六组(8只小鼠/组)，并在肿瘤尺寸达到约210mm3(212.52至216.42mm3)时接受如下所示的治疗。每次治疗对小鼠进行静脉内治疗，每周一次，持续五周(Q7D X5)，或使用单次剂量。每周两次监测肿瘤尺寸和体重。
第1组，媒介物(IV)Q7D X 5
第2组，1mg/kg抗PSMA抗体(IV)Q7D X 5
第3组，1mg/kg抗SEB-LP3 ADC(IV)Q7D X 5
第4组，1mg/kg抗PSMA-LP3 ADC(IV)Q7D X 5
第5组，1mg/kg抗PSMA-LP3 ADC(IV)单次剂量
第6组，2mg/kg抗PSMA-LP3 ADC(IV)单次剂量
在第23天，在接受了单次剂量2mg/kg PSMA-LP3 ADC治疗的小鼠中观察到显著的抗肿瘤作用(图15A)。在PSMA-LP3 ADC治疗组中观察到短暂的体重减轻，这种短暂的体重减轻随时间会恢复。
2 22RV1异种移植模型：非去势条件
Balb/c nu/nu雄性小鼠用于本研究。将悬浮在100μL含有50％基质胶的1X PBS中的5x 106个22RV1细胞皮下植入每只小鼠的右胁部，并监测肿瘤生长。将小鼠随机分为五组(8只小鼠/组)，并在肿瘤尺寸达到约100mm3(110.4至111.4mm3)时接受如下所示的治疗。对小鼠以1mg/kg剂量的单次静脉内剂量进行治疗，并监测肿瘤尺寸和体重23天。
第1组，媒介物(IV)单次剂量
第2组，1mg/kg抗PSMA抗体(IV)单次剂量
第3组，1mg/kg抗SEB-LP3 ADC(IV)单次剂量
第4组，1mg/kg抗PSMA-LP3 ADC(IV)单次剂量
第5组，1mg/kg抗PSMA-LP33 ADC(IV)单次剂量
抗PSMA-LP3 ADC治疗在1mg/kg的单次静脉内剂量下显示出统计学的肿瘤生长抑制(图15B)。阴性对照抗SEB-LP3 ADC和抗PSMA抗体对肿瘤生长没有显示出影响。在所有条件下，在1mg/kg下观察到最小的体重变化。
实例8.ADC稳定性：pAB类似物
1 22RV1模型中S-连接子有效载荷的体内功效
在携带皮下22RV1人前列腺癌肿瘤的Balb/c雄性裸鼠中，以2个剂量水平/ADC评估了与各种连接子改变的pAB类似物缀合的PSMA-LP3 ADC的抗肿瘤活性。
将含有50％基质胶的1X PBS(100μL)中的2.5X 106个细胞的22RV1细胞皮下注射到每只小鼠的右胁部。监测肿瘤生长以达到平均100-150mm3以进行治疗。将小鼠随机分为十一组(8只小鼠/组)接受单次静脉内剂量，如下所示。每周两次测量肿瘤尺寸和体重，直到第21天。
第1组，媒介物(PBS)(IV)，单次剂量
第2组，1mg/kg抗PSMA-LP3(IV)，单次剂量
第3组，2mg/kg抗PSMA-LP3(IV)，单次剂量
第4组，1mg/kg抗PSMA-LP49(IV)，单次剂量
第5组，2mg/kg抗PSMA-LP49(IV)，单次剂量
第6组，1mg/kg抗PSMA-LP53(IV)，单次剂量
第7组，2mg/kg抗PSMA-LP53(IV)，单次剂量
第8组，1mg/kg抗PSMA LP44(IV)，单次剂量
第9组，2mg/kg抗PSMA LP44(IV)，单次剂量
第10组，1mg/kg抗PSMA-LP40(IV)，单次剂量
第11组，2mg/kg抗PSMA-LP40(IV)，单次剂量
计算研究结束时每组的平均肿瘤尺寸，并将肿瘤抑制百分比计算为[肿瘤尺寸(媒介物)-肿瘤尺寸(治疗)]/肿瘤尺寸(媒介物)x 100。绘制了最大体重减轻百分比(BW减轻％，X轴)相对于肿瘤抑制百分比(相对于媒介物)的图(图16A)。LP3、LP49和LP53的连接子-有效载荷被鉴定为十个测试的连接子-有效载荷中的优选的连接子-有效载荷选项，因为它们在体内表现出高肿瘤抑制活性和低体重损失。
2S-连接子有效载荷的剂量依赖性
上述研究中还评估了剂量反应活性。注射后六小时，从每只小鼠尾部收集血液，转移至肝素锂管中，并在4℃以2000g离心20min。离心后，在-20℃收集血浆用于检测。
测量了小鼠TNFα和IFNβ。使用Quantikine小鼠IFNβELISA试剂盒(R&D系统公司，目录号MIFNB0)测量血浆IFNβ，测定范围为15.6-1000pg/ml。使用Quantikine小鼠TNFαELISA试剂盒(R&D系统公司，目录号MTA00B)，测定范围为10.9-700pg/ml，按照制造商的说明测量血浆TNFα。
与媒介物组相比，所有抗PSMA ADC治疗组均显示TNFα和IFNβ细胞因子释放增加(图16B)。还观察到剂量依赖性TNFα释放。
3ADC中pAB类似物的进一步表征
3.1连接子-有效载荷的缓冲液稳定性研究
将如表22中所示的每个连接子-有效载荷在DMSO中的溶液(10mM，4μL)用新鲜制备的N-乙酰基半胱氨酸在DMSO中的溶液(3.3mM，36μL)处理。将所得混合物在37℃孵育5分钟以完成马来酰亚胺的封端(capping)。然后，将20μL所得连接子-有效载荷溶液添加至在37℃预热的980μL D-PBS(pH 7.4)中。将所得溶液在37℃、以350rpm孵育，同时在每个时间点(t＝0、6、24、48、120和168小时)取出125μL等分试样并与25μL内标溶液混合。将所得分析样品在-20℃储存，随后加温至4℃并通过UPLC进行分析。
然后按如下方式计算半衰期。亲本连接子-有效载荷峰与内标峰相比的UV面积％(260nm)的时间过程用于半衰期计算。绘制采样时间点和每个时间的剩余亲本峰，并将曲线拟合到方程N(t)/N0＝e-lt。半衰期用衰变常数l计算，公式如下：
T1/2＝ln(2)/λ
内标样品：将10μL 4-乙酰基哌嗪-1-甲酸4-[({[(2S,5S,6S)-6-[(2E,4E,6S)-7-[(2S,3S)-3-[(2R,3R,4R)-4-羟基-3-甲氧基戊烷-2-基]-2-甲基环氧乙烷-2-基]-6-甲基庚-2,4-二烯-2-基]-5-甲基噁烷-2-基]甲基}氨基甲酰基)氨基]丁基酯的10mM DMSO溶液用990μL 1:1乙腈:D-PBS(pH 7.4)稀释。
3.2游离有效载荷百分比的计算
所有ADC均在37℃进行热稳定性评估。通过将ADC在含有100mM蔗糖的25mM柠檬酸钠缓冲液(pH 6.0)中稀释至1mg/mL来制备样品。然后将样品在37℃储存长达336小时或504小时。在每个时间点(T＝0、24、48、72、168、336、504小时)，取出等分试样并储存在-80℃直到分析。通过HIC-HPLC和SEC-HPLC分析样品。DAR是根据HIC-HPLC分析报告得出的。
使用下面的LC-MS方法对第14天(336小时)的样品中释放的游离有效载荷进行分析。％游离有效载荷＝100x定量游离有效载荷浓度(T14d，37℃)/总有效载荷浓度，其中总有效载荷浓度是根据T＝0时的ADC浓度和DAR计算得出的。
通过LC-MS进行化合物1的定量。将化合物1参考标准(粉末状试剂)溶解于LC-MS级水中。化合物1标准曲线也是在LC-MS级水中制备的。将ADC样品在LC-MS级水中稀释10x。每个样品注入10μL进行LC-MS分析。使用TargetLynx(沃特世公司(Waters))进行定量。
LC-MS方法参数如下所示：
仪器：
LC-MS方法：
3.3体外效力测定
体外IFNβ生产(报告为AUC)的方法如下。将LNCap细胞以60,000个细胞/孔接种在96孔板的100μL细胞培养基(完全RPMI-10％ FBS)中，然后以0.01-100nM的半对数连续稀释度添加20μLADC，充分混合，并在37℃、5％ CO2下孵育10分钟，将80μL培养基中的THP1细胞按60,000个细胞/孔添加至孔中，并将细胞板在37℃、5％CO2下孵育20小时。将板以1500rpm离心5分钟，收集上清液，然后储存在-20℃以进行hIFNβ测量。
使用人IFNβQuantikine试剂盒(R&D系统公司，目录号DIFNB0)，按照制造商的说明测试hIFNβ的水平。使用1x PBS将上清液按1:5稀释以进行测定。hIFNβ的动态范围是7.8-500pg/ml。将IFNβ生产曲线绘制为浓度(X轴)相对于IFNβ释放(Y轴)，将曲线拟合为非线性回归拟合，并使用GraphPad Prism软件计算AUC(曲线下面积)。
IFNβ生产比率(RIP)计算为每个ADC的IFNβ生产的AUC(曲线下面积)除以来自抗PSMA-LP2的IFNβ生产的AUC。
体外效力报告为RIP/DAR。
ADC中pAB类似物的进一步表征结果显示在表22中。连接子-LP3缀合物内的pAB类似物的结构如下所示：
表22.
&RIP＝IFNβ生产AUC与参考ADC(LP3)的比率。DBDE＝δ键解离能
实例9.ADC稳定性：连接子-药物附接
1ADC缓冲液稳定性方法和结果
1.1N附接的连接子
将每个ADC在含有100mM蔗糖的25mM柠檬酸钠缓冲液(pH6.0)中稀释至1mg/mL。然后将样品在37℃储存长达336小时(对于S附接的连接子)或504小时(对于N附接的连接子)。在每个时间点(T＝0、24、48、72、168、336和504小时)，取出等分试样并储存在-80℃直到分析。通过HIC-HPLC和SEC-HPLC分析样品。HIC-HPLC和SEC-HPLC方法如上所述。通过HIC-HPLC计算了DAR。DAR变化％报告如下：
DAR变化％＝100*Tn的DAR/T0的DAR
如图17所示，与测试的其他连接子-有效载荷选项相比，ADC-LP3显示出DAR随时间的最大变化百分比。S附接的连接子的缓冲液稳定性结果显示在图18-20和表23中。
表23.S附接ADC缓冲液稳定性结果
1.2N附接的连接子
如上所述测试了N附接的连接子的缓冲液稳定性。N附接的连接子的缓冲液稳定性结果显示在图21-23和表24中。
表24.N附接ADC缓冲液稳定性结果
2 ADC血浆稳定性2.1 样品制备
通过将J591-化合物1ADC在小鼠血浆(BioIVT，使用3.8％柠檬酸钠作为抗凝剂制备的BALB/C小鼠血浆)中稀释至0.3mg/mL或0.4mg/mL来制备血浆稳定性样品，并等分到0.1mL或0.2mL时间点样品中。将样品放入37℃培养箱中，并在0、2、6、24、48、72、168和240小时取出等分试样，且取出后立即冷冻在-80℃。
2.2通过LC-MS进行ADC结构和DAR的分析
通过用PBS洗涤3次来制备用于免疫捕获的磁珠(Dynabeads，英杰公司(Invitrogen)，目录号65602)，每次洗涤后用DynaMag-2磁铁(英杰公司，12321D)收集磁珠。将40μg生物素抗人Fc(南方生物公司(Southern Biotech)，9040-08)/200μL原珠(stockbead)添加至这些珠中，并在室温混合1hr。用PBS洗涤珠3次，然后在PBS中恢复至原始体积。将100μL血浆样品添加至200μL抗人Fc固定的磁珠中，在室温混合2hr，用PBS洗涤2次，并重悬于100μL2％乙酸中。将珠在室温混合30min。收集上清液并用50μL 1M碳酸氢铵中和。将1单位的FabRICATOR酶(吉诺维斯公司(Genovis)，A0-FR1)/μg ADC添加至洗脱的/中和的样品中并在室温孵育1hr，或用微波辅助的消化(快速酶消化系统，哈德逊表面技术公司(Hudson Surface Technologies))、400W、37℃消化15min。添加4μL 100mM DTT以还原样品并在37℃孵育20min。将样品转移至LC样品瓶中，并在配有Waters Acquity UPLC的WatersSynapt G2上通过LC-MS进行分析。DAR计算为：
DAR＝[(DPA cLC/(DPA cLC+DPA ucLC))+(DPA cHC/(DPA cHC+
DPA ucHC))]x 2
DPA＝解卷积峰面积
cLC＝LCcys80处缀合的轻链
ucLC＝未缀合的轻链
cHC＝HCcys118处缀合的重链ucHC＝未缀合的重链
DAR的变化百分比计算为：100-[(x时间的DAR/起始DAR)x 100]LC-MS方法参数显示在下表25和26中。
表25.LC-MS方法参数：仪器
表26.LC-MS方法参数
2.3通过定量LC-MS进行游离有效载荷的分析
将化合物1和D6-化合物1内标(IS)粉末状试剂溶解于LC-MS级水中。在小鼠血浆中制备化合物1参考标准品(标准曲线)和QC标准品(QC-低、QC-中和QC-高)，并在水中制备注射用内标。将10μLIS添加至每个标准曲线样品、QC对照和稳定性样品中，并且所有样品均使用固相萃取(SPE)进行制备。对于SPE，使用真空用100μL水洗涤固相萃取板(沃特世公司，186001828BA)。将100μL的每个样品施加在板上并使用真空抽吸(drawn through)。使用真空用5％甲醇(在水中)洗涤孔。用25μL乙腈:甲醇(60:40)将样品洗脱到干净的收集板中。将收集板短暂离心以将所有洗脱的材料收集至收集孔底部，然后向每个孔中添加100μL水。然后将样品用于定量LC-MS分析。每个洗脱的样品注入5μL或10μL进行LC-MS分析。使用TargetLynx(沃特世公司)进行定量。化合物1的LOQ是0.01ng/mL，而Rp-单磷酸盐-化合物1和Sp-单磷酸盐-化合物1的LOQ是0.05ng/mL。
LC-MS参数显示在下表27和28中。
表27.LC-MS仪器
表28.LC-MS方法
2.4结果
血浆稳定性结果显示在图24中。与LP3相比，用抗PSMA-LP2或抗PSMA LP1处理的小鼠血清中随时间的有效载荷释放百分比更低(图24A)。与S连接的ADC(LP3)相比，N连接的ADC中平均DAR随时间的下降幅度最小(图24B和24C)。用N连接的ADC进行处理导致血清中游离化合物1随时间显著减少(图24D)。
2.4.1S连接的抗PSMA化合物1ADC的稳定性
在小鼠血浆中检查了通过化合物1中的硫代磷酸酯键连接的抗PSMA ADC(“S连接的ADC”)的稳定性，浓度为0.4mg/mL。连接子-有效载荷结构显示在表15和16中。它们通过链间二硫键部分还原(随机DAR4)或通过LC cys80(RESPECT-L)和LC A118C(RESPECT-L DAR4)产生的未配对的半胱氨酸与人源化抗人PSMA deJ591缀合。
对血浆样品进行SPE萃取后，使用Waters TQ-XS三重四极杆质谱仪通过定量LC-MS对释放的有效载荷进行分析。其结果显示在图25中。
发现随机和RESPECT-L缀合的LP3 ADC在小鼠血浆中通常不稳定，因为DAR4的0.4mg/mL ADC样品中的总缀合有效载荷是7957ng/mL。还发现释放了三种分子形式的有效载荷–化合物1、Rp-单磷酸盐-化合物1和Sp-单磷酸盐-化合物1。这些形式可能是由于代谢过程中连接子-有效载荷中的S-P或C-S键切割造成的，也可能是由于释放过程中或释放后硫代磷酸酯键的异构化造成的。三种释放的有效载荷形式的结构显示在图26中。
从小鼠血浆中免疫捕获ADC后，还通过混合LC-MS分析了抗PSMA ADC LP3稳定性样品。其结果显示在图27中。AUC值是解卷积质谱的AUC，对应于每个指示的结构。所有物种在T0时的总AUC值均已归一化。
两种ADC均表现出显著的有效载荷代谢和连接子释放(LC+连接子和HC+连接子增加)。对于随机缀合的ADC，仅观察到LC+1连接子和HC+1连接子；其他多重缀合形式(例如，HC+1连接子+1LP3、HC+2连接子、HC+2连接子+1LP3等)的丰度可能太低，无法可靠地检测和定量。对于RESPECT-L ADC，代谢几乎完全是由于连接子释放有效载荷所致，而不是由于逆向迈克尔解缀合(retro-Michael deconjugation)而从抗体释放连接子-有效载荷，这由未缀合的LC和HC没有增加表明。对于随机缀合的LP3 ADC，观察到连接子有效载荷的代谢(导致游离有效载荷的释放)和连接子-有效载荷的逆向迈克尔解缀合(导致游离LC和HC的增加)两者。这可能解释了LP3 ADC的RESPECT-L缀合形式的DAR损失速率较低的原因。
2.4.2N连接的抗PSMA化合物1ADC的稳定性
在小鼠血浆中检查了通过化合物1中的桥氮连接的抗PSMA ADC(“N连接的ADC”)的稳定性，浓度为0.3mg/mL或0.4mg/mL。这些ADC通过RESPECT-L DAR4与LC cys80和HC A118C未配对的半胱氨酸的缀合来制备。对血浆样品进行SPE萃取后，使用Waters TQ-XS三重四极杆质谱仪通过定量LC-MS评估释放的游离有效载荷。为了在ADC之间进行比较，游离有效载荷表示为时间T0时的总缀合有效载荷的百分比。这些结果显示在图28中。
抗PSMA ADC LP3(随机和RESPECT-L)包含在绘制数据中(化合物1、Rp-单磷酸盐化合物1和Sp-单磷酸盐化合物1的总计)。通常，所有N连接的抗PSMA化合物1ADC都比S连接的ADC更稳定。此外，化合物1是唯一检测到的释放的有效载荷；没有释放出单磷酸盐形式。抗PSMA LP22(mcA(NMe)AN-单元9-SN-化合物1)表现出比其他间隔子、切割位点或第二间隔子变体显著更高的有效载荷释放。通常，L-F2Pro和Bz第二间隔子似乎在小鼠血浆中最不稳定(游离有效载荷释放最高)，其次是L-Pro，然后是MEC。另外，无论第二间隔子结构如何(与C2和C2-PEG2间隔子相比)，马来酰亚胺和切割位点之间的mc间隔子似乎都会导致较低的有效载荷释放水平。
从小鼠血浆中免疫捕获ADC后，还通过混合LC-MS分析了抗PSMA化合物1ADC稳定性样品。为了比较所有ADC，数据被绘制为剩余DAR相对于第0天的DAR的百分比。抗PSMA ADCLP3(随机和RESPECT-L)包含在绘制数据中。绘制了第7天或第10天的数据(例如，显示稳定性研究的最后一个时间点)。这些结果显示在图29中。
所有N连接的ADC均表现出比S连接的ADC更好的整体DAR保留。此外，分析表明，N连接的ADC的DAR损失是由于连接子-有效载荷的逆向迈克尔释放所致，而不是由于连接子的有效载荷的代谢(将DAR与游离有效载荷进行比较)，正如在抗PSMA ADC LP3中观察到的那样。具有己酰基间隔子的ADC在稳定性方面是变动的，而C2和C2PEG2间隔子变体在连接子-有效载荷释放方面通常非常稳定，这可能是由于缀合后马来酰亚胺水解所致。
实例10.N-连接子附接在体外和体内均表现出功效
1C4-2+THP1共培养物中的hIFNβ释放
将C4-2细胞以1x 105个细胞/孔接种在96孔板的100μL细胞培养基(完全RPMI，10％ FBS)中，然后以0.03-1000nM的半对数连续稀释度添加20μL ADC试剂，充分混合，并在37℃、5％ CO2下孵育10分钟。将1x 105个细胞/孔的THP1细胞(在80μL培养基中)添加至孔中，并将细胞板在37℃、5％ CO2下孵育6小时。将板以1500rpm离心5分钟，并收集上清液且储存在-80℃以进行hIFNβ测量。
使用人IFNβU-PLEX(MSD公司，目录号K151VIK-2)，按照制造商的说明测量hIFNβ。hIFNβ的动态范围是3.1-100,000pg/ml。
如图30所示，在C4-2/THP1共培养物测定中，AB2-RL4-LP3比AB2-RL4-LP1和AB2-RL4-LP2诱导更多的IFNβ生产。AB2-RL4-LP1和AB2-RL4-LP2在C4-2/THP1共培养物测定中显示出类似的IFNβ诱导。
2C4-2模型中的体内功效
CB17 SCID雄性小鼠用于本研究。将悬浮在100μL含有50％基质胶的1X PBS中的10x 106个C4-2细胞皮下植入每只小鼠的右胁部，并监测肿瘤生长。将小鼠随机分为五组(10只小鼠/组)，并在肿瘤尺寸达到约150mm3时接受如下所示的治疗。对小鼠以所指示的单次静脉内剂量进行治疗，并监测肿瘤尺寸和体重35天。
第1组，媒介物(PBS)(IV)，单次剂量
第2组，8mg/kg抗PSMA-LP1(IV)，单次剂量
第3组，4mg/kg抗PSMA-LP1(IV)，单次剂量
第4组，8mg/kg抗PSMA-LP2(IV)，单次剂量
第5组，4mg/kg抗PSMA-LP2(IV)，单次剂量
4mg/kg和8mg/kg的两个抗PSMA ADC组均显示出肿瘤消退(图31)。两个ADC组均观察到短暂的体重减轻(<20％)，但最终恢复。与用包含LP2的ADC治疗的组相比，用包含LP1的ADC治疗的组显示出更少的体重减轻。媒介物组在小鼠患病25天后开始体重减轻，而其他四个治疗组在肿瘤生长受到抑制时开始体重增加。
实例11.ADC在C57BL/6小鼠的RM1-hPSMAg(Teton)鼠前列腺癌模型中的体内功效研究
1方法总结
在本研究中，评估了SEB-LP3 ADC、AB2-RL4-LP2、AB2-RL4-LP3和恩杂鲁胺在治疗C57BL/6小鼠皮下模型RM1-hPSMAg中的功效。
将RM1-hPSMAg肿瘤细胞接种到雄性C57BL/6小鼠体内。当肿瘤达到平均肿瘤体积约84mm3时启动治疗。将小鼠随机分为十组(10只小鼠/组)，如下所示。
i.v.＝静脉内
随机分组后每周两次测量体重和肿瘤体积。肿瘤接种日表示为第1天。多西环素治疗在随机分组日当天开始。随机分组后第二天开始媒介物、SEB-LP3 ADC、AB2-RL4-LP1和AB2-RL4-LP3治疗。
第1-4组的小鼠在随机分组日当天和随机分组后第二天接受多西环素治疗。在随机分组后第二天，在多西环素治疗后4-6小时，给予小鼠媒介物或SEB-LP3 ADC、AB2-RL4-LP1或AB2-RL4-LP3。
第6-8组的小鼠在随机分组日当天开始接受多西环素治疗且连续治疗4天。在第四次施用多西环素时，在多西环素治疗后4-6小时，给予小鼠媒介物或AB2-RL4-LP1或AB2-RL4-LP3。
第5组的小鼠在随机分组日当天和随机分组后第二天接受多西环素治疗。在随机分组后第二天，在多西环素治疗后4-6小时，给予小鼠恩杂鲁胺。
在随机分组后第二天，给予第9组和第10组的小鼠媒介物(第9组)或AB2-RL4-LP3。
连续三天给予第2、3、4、7、8和10组的小鼠皮下液体补充剂，并且使用SEB-LP3ADC、AB2-RL4-LP1或AB2-RL4-LP3治疗后24小时开始补充。
使用卡尺每周两次在两个维度上测量肿瘤体积，并使用以下公式以mm3表示体积：V＝(L x W x W)/2，其中V是肿瘤体积，L是肿瘤长度(最长的肿瘤尺寸)，W是肿瘤宽度(垂直于L)。而且每周两次测量体重。
所有小鼠于第26天处死。
为了比较不同组在预先指定的日期的肿瘤体积，使用巴特利检验(Bartlett'stest)来检查所有组之间的方差同质性假设。当巴特利检验的p值≥0.05时，运行单因素方差分析来检验所有组之间平均值的总体相等性。如果单因素方差分析的p值<0.05，则通过运行针对所有成对比较的图凯HSD(诚实显著差异)检验以及针对每个治疗组与媒介物组进行比较的邓奈特检验来进行事后检验。当巴特利检验的p值<0.05时，运行克鲁斯卡尔-沃利斯检验来检验所有组之间中位数的总体相等性。如果克鲁斯卡尔-沃利斯检验的p值<0.05，则通过运行针对所有成对比较或针对每个治疗组与媒介物组进行比较的科诺弗非参数检验来进行事后检验，两者均采用单步p值调整。
此外，进行成对比较而无需多重检验校正，并且标称/未校正的p值直接从韦尔奇t检验或曼-惠特尼U检验报告。具体来说，巴特利检验首先用于检查一对组的方差同质性假设。当巴特利检验的p值≥0.05时，进行韦尔奇t检验；否则，进行曼-惠特尼U检验以获得标称p值。
2结果
在四个剂量的多西环素治疗后，4mg/kg单次静脉内剂量的AB2-RL4-LP1(第7组)和1mg/kg单次静脉内剂量的AB2-RL4-LP3(第8组)在第26天表现出对模型RM1-hPSMAg的统计学上显著的功效(p<0.05)。在没有任何多西环素治疗的情况下，1mg/kg单次静脉内剂量的AB2-RL4-LP3在第26天也表现出对模型RM1-hPSMAg的统计学上显著的功效(p<0.05)。结果显示在下表29中。
小鼠对治疗的耐受性良好。给予了SEB-LP3 ADC、AB2-RL4-LP1或AB2-RL4-LP3的小鼠表现出体重减轻，在连续三天向小鼠提供饮食凝胶剂和皮下液体补充剂后体重有所恢复。对于其他小鼠治疗组，没有观察到体重减轻。
表29.测试ADC在治疗C57BL/6小鼠模型RM1-hPSMAg中的抗肿瘤活性
实例12.抗PSMA ADC的体内抗肿瘤活性以及ADC体内治疗后的细胞因子生产
抗PSMA抗体deJ591与STING激动剂化合物1或化合物2缀合。化合物1或化合物2上的两个不同的附接点用于连接子附接至(S)-硫代磷酸酯上的硫(“S连接的”)或附接至桥氮(“N连接的”)。对连接子进行了各种结构改变，以评估间隔子、切割位点和第二间隔子(第二消解有效载荷释放步骤)修饰对所得ADC的效力、毒性和稳定性的影响。本实例显示了抗PSMA ADC在荷瘤小鼠中的体内抗肿瘤活性，并通过测量小鼠细胞因子生产(包括I型干扰素)来评估药效学(PD)效果。
1方法总结
1.1抗PSMA-LP ADC的列表
本实例中评估的与连接子-有效载荷(LP)缀合的抗PSMA列于下表30中。
表30.抗PSMA-LP ADC的列表
1.2 22Rv1异种移植模型中的体内功效[群组1]
6周龄的雄性BALB/c裸鼠(查尔斯河公司(Charles River))用于本研究。22Rv1细胞(批号：RJT07NOV22p14)在含有10％ HI-FBS的RPMI培养基中生长。将含有50％基质胶的1X PBS中的5x106个22Rv1细胞以200μL的体积皮下注射到小鼠的右胁部。通过卡尺监测肿瘤生长至平均达到150-200mm3(约161mm3)，然后将荷瘤小鼠随机分为治疗组和对照组，6只小鼠/组(群组1有12组，群组2有11组，群组3有15组，如下详述)。入选小鼠接受单次静脉内(IV)注射100μL媒介物或药物。通过颌下(面部)静脉将血液样品收集到血清收集管中。使血液在室温凝结，然后通过在4℃以1,200g离心15min来分离血清。将分离的血清转移到干净的聚丙烯管中并储存在-80℃。监测肿瘤体积和体重26天(群组1)、35天(群组2)或21天(群组3)。
表31.22Rv1给药组–群组1
表32.22Rv1给药组–群组2
表33.22Rv1给药组–群组3
1.3C4-2异种移植模型中的体内功效
6周龄的雄性Fox Chase SCID小鼠(恩维戈公司(Envigo))用于本研究。C4-2细胞(批号：RJT07NOV22p11)在含有10％ HI-FBS的RPMI培养基中生长。将含有50％基质胶的1XPBS中的1x 107个C4-2细胞以200μL的体积皮下注射到小鼠的右胁部。通过卡尺监测肿瘤生长至平均达到150-200mm3(约170mm3)，然后将荷瘤小鼠随机分为治疗组和对照组，5只小鼠/组(有6组，如下详述)。入选小鼠接受单次静脉内(IV)注射100μL媒介物或药物。通过颌下(面部)静脉将血液样品收集到血清收集管中。使血液在室温凝结，然后通过在4℃以2000xg离心15min来分离血清。将分离的血清转移到干净的聚丙烯管中并储存在-80℃。监测肿瘤体积和体重35天。
表34.C4-2给药组
1.4血清和血浆细胞因子分析
治疗后六小时收集血清和血浆样品并储存在-80℃直到分析。使用Luminex xMAP多重试剂盒(英杰公司编号PPX-08-MX2XANK)对样品进行测定，该试剂盒旨在检测和定量以下细胞因子：IFN-β、IFN-γ、IL-6、IL-13、IP-10(CXCL10)、MCP-1(CCL2)、MIP-1α(CCL3)和MIP-1β(CCL4)。根据制造商的指导制备所有试剂。将标准品和样品与磁珠一起孵育过夜，并且所有洗涤步骤均使用安捷伦公司的配备磁铁插件(magnetinsert)的自动洗板机进行。使用Luminex xMAP Intelliflex收集数据，并使用EMD密理博公司的Belysa软件进行分析。
1.5统计学分析
使用双因素方差分析对媒介物治疗组和抗PSMA-LP ADC治疗组之间的平均肿瘤体积差异进行统计学分析，以检验所有组之间平均值的总体相等性。使用邓奈特方法检查各组的所有成对比较。
2结果
2.1抗PSMA LP ADC在22Rv1异种移植小鼠模型中的抗肿瘤活性和血清细胞因子分析(群组1)
抗PSMA-LP ADC(随机DAR2-4)以单次IV推注剂量施用至雄性BALB/c裸鼠模型中的22Rv1异种移植物。将治疗组的平均肿瘤体积与对照组1(媒介物/PBS)进行比较，并测量体重变化(相对于第0天归一化)。该分析的结果显示在图32中。分析表明，在给药后第11天，抗PSMA-LP16、-LP28、-LP20和-LP10具有显著的抗肿瘤活性。在给药后第19天观察到抗PSMA-LP16(mcVAPC-单元8-SN-化合物1)和-LP28(mcVAPC-单元11-SN-化合物1)的持续抗肿瘤活性。抗PSMA-LP16(mcVAPC-单元8-SN-化合物1)和-LP28(mcVAPC-单元11-SN-化合物1)治疗的小鼠到第4天显示出暂时性体重减轻超过10％，而抗PSMA-LP3(mcVAP-Sp-化合物1)和-LP20(mcVAPC-单元9-SN-化合物1)到第4天显示出暂时性体重减轻5％。测试的其他抗PSMA-LP ADC显示出有限的体重减轻。
为了进行血清细胞因子分析，在治疗后6小时收集小鼠血清。使用Luminex xMAP多重试剂盒测量并定量细胞因子浓度。该分析的结果显示在图33和表35中。分析表明，给药后六小时产生了细胞因子。这些数据表明，具有理想的抗肿瘤活性的抗PSMA-LP16和-LP28也刺激了细胞因子的大量生产。使用抗PSMA-LP16或-LP28治疗导致暂时性体重减轻超过10％。抗PSMA-LP3(mcVAP-Sp-化合物1)也刺激了细胞因子的大量生产。虽然抗PSMA-LP3组的抗肿瘤活性较低，但也导致了体重急剧减轻。抗PSMA-LP10和-LP20 ADC显示出抗肿瘤活性，并且还刺激了细胞因子生产。
表35.22Rv1异种移植模型中抗PSMA-LP ADC的抗肿瘤活性和细胞因子生产的总结(群组1)
*层级：根据抗肿瘤活性的分类的LP
**层级之外：层级之外，第11天(D11)没有有意义的抗肿瘤活性
2.2抗PSMA LP ADC在22Rv1异种移植小鼠模型中的抗肿瘤活性和血清细胞因子分析(群组2)
抗PSMA-LP ADC(随机DAR2-4)以单次IV推注剂量施用至雄性BALB/c裸鼠模型中的22Rv1异种移植物。将治疗组的平均肿瘤体积与对照组1(媒介物/PBS)进行比较，并测量体重变化(相对于第0天归一化)。该分析的结果显示在图34中。分析表明，在第10天用抗PSMA-LP3、-LP9和-LP16治疗的组具有统计学上显著的抗肿瘤活性，用抗PSMA-LP2、-LP4、-LP5、-LP6、-LP7和-LP12治疗的组的统计学显著性较弱(p<0.05)，而用抗PSMA-LP30治疗的组则表现出较低的抗肿瘤活性。在用抗PSMA-LP3(mcVAP-Sp-化合物1)和抗PSMA-LP9(mcVAPC-SN-化合物1)治疗的组中观察到持续的抗肿瘤活性，直到给药后第17天。抗PSMA-LP3、-LP9和-LP16治疗的小鼠到第4天显示出暂时性体重减轻超过10％。
在治疗后6小时收集小鼠血清。使用Luminex xMAP多重试剂盒测量并定量细胞因子浓度。该分析的结果显示在图35和表36中。分析表明，给药后六小时产生了细胞因子。值得注意的是，抗PSMA-LP9(mcVAPC-SN-化合物1)和LP16(与群组1相同)具有优异的抗肿瘤活性，产生的细胞因子与抗PSMA-LP3的丰度类似，但表现出体重急剧减轻。另一方面，第3层级的组(抗PSMA-LP2、-LP4、-LP5、-LP6、-LP7和-LP12)也产生细胞因子，但与第1层级和第2层级相比水平较低。
表36.22Rv1异种移植模型中抗PSMA-LP ADC的抗肿瘤活性和细胞因子生产的总结(群组2)
*层级：根据抗肿瘤活性的分类的LP
**层级之外：层级之外，第10天(D10)没有有意义的抗肿瘤活性
2.3抗PSMA LP ADC在22Rv1异种移植小鼠模型中的抗肿瘤活性和血清细胞因子分析(群组3)
抗PSMA-LP ADC(随机DAR2-4)以单次IV推注剂量施用至荷瘤雄性BALB/c裸鼠中的22Rv1异种移植物。将治疗组的平均肿瘤体积与对照组1(媒介物/PBS)进行比较，并测量体重变化(相对于第0天归一化)。该分析的结果显示在图36中。分析表明，从第7天开始，抗PSMA-LP17和-LP27的抗肿瘤活性具有统计学上的优异性(p<0.0001)，并且在给药后第21天，用抗PSMA-LP17、-LP18、-LP26、-LP27、-LP32(p<0.0001)以及-LP21和-LP22(P<0.001)治疗的组具有显著的抗肿瘤活性。到给药后第21天观察到，用抗PSMA-LP24(mcGGFG-单元9-SN-化合物1)治疗的小鼠也具有显著的抗肿瘤活性(p<0.05)。总体而言，三种抗PSMA-ADC(LP-17、-27和-26)在研究中显示出很强的抗肿瘤活性。值得注意的是，抗PSMA-LP17和-LP27到第3天显示出暂时性体重减轻20％或以上，而用抗PSMA-LP26、-LP19、-LP18 ADC治疗的小鼠体重减轻约10％。
在治疗后6小时收集小鼠血浆。使用Luminex xMAP多重试剂盒测量并定量细胞因子浓度。该分析的结果显示在图37和表37中。在所有抗PSMA-LP ADC中均观察到细胞因子生产。经抗PSMA-LP19治疗的小鼠产生了更大量的所检查的大多数细胞因子，但抗肿瘤活性有限且体重减轻相对较高。另一方面，具有较强抗肿瘤活性的三种抗PSMA-ADC(LP-17、-27和-26)也产生了较高水平的细胞因子，如IFN-γ、IL-6和IL-13，但在本研究中，与其他两种抗PSMA-LP17和-LP27 ADC相比，抗PSMA-LP26刺激更多细胞因子生产。值得注意的是，抗PSMA-LP26显示出暂时性体重减轻10％，而观察到用抗PSMA-LP17和-27ADC治疗的小鼠体重减轻超过20％。
表37.22Rv1异种移植模型中抗PSMA-LP ADC的抗肿瘤活性和细胞因子生产的总结(群组3)
*层级：根据第21天(D21)抗肿瘤活性的分类的LP
**层级之外：层级之外，D21没有有意义的抗肿瘤活性
2.4抗PSMA-LP ADC在C4-2异种移植SCID小鼠模型中的抗肿瘤活性
抗PSMA-LP ADC(随机DAR2-4)以单次IV推注剂量施用至荷瘤雄性SCID小鼠中的C4-2异种移植物。将治疗组的平均肿瘤体积与对照组1(媒介物/PBS)进行比较，并测量体重变化(相对于第0天归一化)。该分析的结果显示在图38中。分析表明，从给药后第10天开始，抗PSMA-LP16(mcVAPC-单元8-SN-化合物1)具有统计学上优异的抗肿瘤活性，并且其抗肿瘤活性持续到终点。到给药后第17天，给予了抗PSMA-LP28(mcVAPC-单元11-SN-化合物1)的小鼠也具有显著的抗肿瘤活性(P<0.05)，呈高斯分布范围。在此模型中，在第17天在抗PSMA-LP2、-LP14组中观察到抗肿瘤活性，但不显著。虽然抗PSMA-LP16、-LP20和-LP28治疗的小鼠到第4天表现出暂时性体重减轻超过10％，但测试的其他抗PSMA-LP ADC在C4-2模型中表现出有限的体重减轻。
在治疗后6小时收集小鼠血清。使用Luminex xMAP多重试剂盒测量并定量细胞因子浓度。该分析的结果显示在图39和表38中。在所有抗PSMA-LP ADC中均观察到细胞因子生产，并且在此C4-2异种移植小鼠模型中对抗PSMA-LP16、LP28、-LP20、-LP2和-LP14中的细胞因子生产进行了排名。抗PSMA-LP16和-LP28显示出统计学上显著的抗肿瘤活性，也刺激了该模型中细胞因子的大量生产。
表38.C4-2异种移植模型中抗PSMA-LP ADC的抗肿瘤活性和细胞因子生产的总结
*层级：根据抗肿瘤活性的分类的LP
实例13.抗人PSMA-LP3 ADC在小鼠体内的药代动力学
1方法
1.1动物给药和样品采集(非荷瘤小鼠)
6周龄的雄性balb/c裸鼠(杰克逊实验室(Jackson Labs))用于研究非荷瘤小鼠的药代动力学(PK)。在给药前(1mpk最终给药)，将抗PSMA-LP3在PBS中稀释至5mg ADC/kg小鼠体重的浓度。给小鼠静脉内注射200μL的抗PSMA-LP3。用氯胺酮(0.9mL)和赛拉嗪(0.5mL)在0.9％生理盐水(8.6mL)中制备麻醉混合物。在给药后10分钟、30分钟、2小时、6小时、24小时、72小时、168小时和336小时(3只小鼠/时间点)，用200μL氯胺酮/赛拉嗪混合物腹膜内麻醉小鼠。使用27G针头和3mL注射器通过心脏穿刺抽血，随后通过颈脱位立即安乐死。将收集的血液立即转移至柠檬酸钠管中，并在2000g离心15min后收集血浆。将血浆储存在-80℃直到使用。
1.2动物给药和样品采集(荷瘤小鼠)
C4-2肿瘤(去势抵抗性人前列腺癌LnCAP亚系)在6周龄的雄性CB17 SCID小鼠(恩维戈公司)中皮下建立。在给药前(3mpk和9mpk最终给药)，将抗PSMA-LP3在PBS中稀释至15mg和45mg ADC/kg小鼠体重的浓度。当平均肿瘤尺寸达到约100mm3时开始治疗。给小鼠静脉内注射200μL的抗PSMA-LP3。用氯胺酮(0.9mL)和赛拉嗪(0.5mL)在0.9％生理盐水(8.6mL)中制备麻醉混合物。在给药后5分钟、30分钟、2小时、6小时、24小时、72小时、168小时和504小时(3只小鼠/时间点)，用200μL氯胺酮/赛拉嗪混合物腹膜内麻醉小鼠。使用27G针头和3mL注射器通过心脏穿刺抽血，随后通过颈脱位立即安乐死。通过解剖分离肿瘤和所选器官，快速冷冻，并储存在-80℃直到使用。将收集的血液立即转移至柠檬酸钠管中，并在2000g离心15min后收集血浆。将血浆储存在-80℃直到使用。
1.3肿瘤组织处理
将冷冻的肿瘤与300μL裂解缓冲液和5μL核酸酶在2mL螺旋盖微量离心管中混合。添加珠并在Fast-Prep 24 5G珠搅拌器裂解系统(MP生物医学公司(MP Biomedical))中以6mps、30sec/循环的设置均质化样品，总共三个循环，循环之间在冰上休息30sec。将裂解的样品在4℃以12,000x g离心10min。取出上清液，进行等分，速冻，并储存在-80℃直到使用。
1.4抗PSMA-LP3总抗体和完整ADC测定
抗PSMA-LP3总抗体和完整ADC测定在Gyros xPand纳升级微流体免疫测定仪器平台(Gyros蛋白质技术公司(Gyros Protein Technologies))上进行。将含有链霉亲和素的BioAffy 1000CD(Gyros蛋白质技术公司)平衡至室温至少30min。将测试小鼠血浆/肿瘤裂解物样品在Rexxip HN缓冲液(Gyros蛋白质技术公司)中的2％ Tween20中以1:10(针对血浆)和1:500(针对肿瘤裂解物)进行最低限度稀释，以进入基于估计浓度的测定的定量范围。对于总抗体测定和完整ADC标准曲线两者，首先将抗PSMA-LP3 ADC在Rexxip HN缓冲液中从50μg/mL储备液稀释至800ng/mL，然后以2.2倍稀释6次(范围为800ng/mL–7.06ng/mL，总共7个标准品)。对于总抗体测定，捕获试剂是Rexxip HN缓冲液中的2％ Tween-20中的25μg/mL生物素化的人PSMA(R&D系统公司)，检测试剂是Rexxip F缓冲液中的25μg/mL Alexa-Fluor 647标记的小鼠抗人IgG Fc(CH2结构域)(伯乐公司(BioRad)MCA4774)。对于完整ADC测定，捕获试剂是Rexxip HN缓冲液中的2％ Tween-20中的50μg/mL生物素化的抗化合物1Fab(2.1A3)片段，检测试剂是Rexxip F缓冲液中的25μg/mL Alexa-Fluor 647标记的小鼠抗人IgG Fc(CH2结构域)(伯乐公司MCA4774)。所有样品和标准品均以5,000x g离心5min。然后在Gyros xPand上运行以下方案，进行总抗体测定和完整ADC测定两者，流速为2nL/sec(用于洗涤和试剂处理的体积为200nL)：
-用Gyros洗涤缓冲液，pH 11(Gyros蛋白质技术公司，P0020096)洗涤针，然后用PBST洗涤
-用PBST洗涤柱2次
-使捕获试剂通过柱
-用PBST洗涤柱2次
-使测试样品和标准品通过柱
-用PBST洗涤柱2次
-在添加检测试剂之前设置背景
-使检测试剂通过柱
-用PBST洗涤柱4次
-使用1％ PMT设置检测总捕获信号
-用Gyros洗涤缓冲液，pH 11洗涤针，然后用PBST洗涤
使用Gyros Evaluator软件、使用具有响应加权的5参数曲线拟合，或使用WatsonLIMS、使用5％ PMT设置和具有标准曲线1/y2加权的5参数曲线拟合来分析收集的数据。纯血浆中总抗体测定和完整ADC测定的定量限(LOQ)均为10ng/mL，最低需求血浆稀释度(MRD)为1:10。使用Winnonlin(赛塔拉公司(Certara))对收集的数据进行药代动力学分析。
1.5通过定量LC-MS进行游离有效载荷的分析
通过定量LC-MS分析游离有效载荷的方法在上文实例9中描述。
2结果
2.1抗PSMA LP3 ADC(随机DAR4)在非荷瘤小鼠中的药代动力学
将抗PSMA LP3(随机DAR4)以单次IV推注剂量施用至正常裸鼠，并使用总抗体、完整ADC和游离有效载荷测定来测定ADC和代谢物的浓度。对于游离化合物1，仅检测到化合物1，并且没有发现单磷酸盐形式。使用2隔室模型测定完整ADC和总抗体PK参数，并使用非隔室拟合测定游离化合物1。该分析的结果显示在图40中。
分析表明，ADC在循环中具有不稳定性，如通过与总抗体相比，完整ADC的AUC和半衰期更低且清除速率增加所证明的。这与血浆稳定性研究一致，表明通过化合物1的(S)硫代磷酸酯中的硫连接的化合物1的快速切割。
2.2抗PSMA LP3 ADC(RESPECT-L DAR2)和抗PSMA LP1(RESPECT-L DAR4)在C4-2荷瘤小鼠中的药代动力学
2.2.1抗PSMA LP3 ADC(RESPECT-L DAR2)的血浆PK
将抗PSMA LP3(RESPECT-L DAR2)和抗PSMA LP1(RESPECT-L DAR4)以3mg/kg和9mg/kg单次IV推注剂量施用至C4-2荷瘤小鼠，并且使用总抗体、完整ADC和抗PSMA LP3(RESPECT-L DAR2)的游离有效载荷测定来测定ADC和代谢物的浓度。特异性研究表明，抗化合物1(抗有效载荷)试剂抗体2.1.A3不能识别化合物1通过桥氮缀合的ADC(“N连接的”ADC)上的化合物1，因此仅测定来自抗PSMA LP1(RESPECT-L DAR4)给药动物的样品的游离有效载荷。对于释放的游离有效载荷，化合物1是检测到的主要有效载荷，尽管在给予了9mg/kg抗PSMA LP3(RESPECT-L DAR2)的动物的早期时间点检测到低水平的Rp-和Sp-单磷酸盐-化合物1。使用2隔室模型测定完整ADC和总抗体PK参数，并使用非隔室拟合测定游离化合物1。该分析的结果显示在图41中。
在携带C4-2肿瘤的小鼠中观察到抗PSMA LP3(RESPECT-LDAR2)的类似不稳定性，正如在非荷瘤动物中观察到随机缀合的DAR4 ADC的不稳定性。观察到总抗体、完整ADC和释放的化合物1的AUC明显剂量反应。
2.2.2抗PSMA LP3 ADC(RESPECT-L DAR2)和抗PSMA LP1ADC(RESPECT-L DAR4)的瘤内PK
在收集并均质化所治疗小鼠的C4-2肿瘤后，测定抗PSMA LP3ADC(RESPECT-LDAR2)和抗PSMA LP1 ADC(RESPECT-L DAR4)的游离化合物1浓度。数据以ng/kg绘制，以便与肿瘤摄取进行比较。这些结果显示在图42中。
即使DAR增加，抗PSMA LP1 ADC(RESPECT-L DAR4)给药动物的血浆中的游离化合物1也比给予了抗PSMA LP3 ADC(RESPECT-L DAR2)的动物低得多，其中Cmax水平低50倍。这与LP1 ADC的改进的体外血浆稳定性(与基于LP3的形式相比)一致。相对于抗PSMA LP3 ADC(RESPECT-L DAR2)，抗PSMA LP1 ADC(RESPECT-L DAR4)的Cmax也延迟。
还测量了来自这些相同给药动物的肿瘤裂解物中游离化合物1的水平。将浓度相对于g肿瘤重量归一化。这些结果显示在图43中。
相对于抗PSMA LP3 ADC(RESPECT-L DAR2)，化合物1在抗PSMA LP1 ADC(RESPECT-L DAR4)给药动物中保留更高水平(4至5倍高的Cmax)且更长时间，并且肿瘤Cmax/血浆Cmax高出3个对数单位(图44)。
实例14.PSMA-STING ADC的有效载荷释放测定
1两步有效载荷释放测定方法
N连接的PSMA-STING ADC的LP主要分两步释放其有效载荷。在第一步中，在酸性条件下对可切割氨基酸单元进行酶促切割(例如，通过半胱氨酸蛋白酶(LP21-23)或组织蛋白酶B(LP1-20、24和27-32))。对氨基苄基氨基甲酸酯(pABC)间隔子立即通过第一自消解反应除去。结果是，释放由有效载荷和第二间隔子组成的中间体。在第二步中，通过第二消解反应从中间体除去第二间隔子，并释放有效载荷。中间体在酸性pH下相对稳定，但第二消解反应在中性pH范围内快速进行。
在该测定中，在pH 5下用组织蛋白酶B或半胱氨酸蛋白酶处理连接子-有效载荷以监测第一步反应，然后将溶液的pH调节至7以评估第二步反应的动力学。代表性LP2的有效载荷释放测定的方案如图45所示。
1.1LP中马来酰亚胺的失活
在有效载荷释放测定之前，通过缀合N-乙酰基半胱氨酸(NAC)使反应性马来酰亚胺部分失活。将每个LP用二甲基亚砜(DMSO)中的3摩尔当量的NAC处理以制备NAC-LP。
1.2有效载荷释放测定
第一步反应的评估(酶促触发物切割速率(enzymatic trigger cleavagerate))。通过合适的条件C1、C2或L评估每个LP的第一步反应的动力学。适用于每个LP的条件显示在下文表39、40和41中。
条件C1：将组织蛋白酶B(西格玛奥德里奇公司，目录号C8571)在含有30mM二硫苏糖醇(DTT)和15mM乙二胺四乙酸(EDTA)的25mM乙酸钠缓冲液，pH 5.5中稀释至125μg/mL，并在室温活化10min。将NAC-LP在250μL含有20μM NAC-LP和1mM EDTA的25mM乙酸钠缓冲液，pH5.0中稀释至20μM。取五十(50)μL溶液并添加50μL含有1％甲酸的甲醇。溶液用于分析初始(t0)样品。将活化的酶以最终浓度1.25ug/mL添加至剩余的200μL NAC-LP溶液中。
条件C2：将组织蛋白酶B(西格玛奥德里奇公司，目录号C8571)在含有30mM DTT的20mM乙酸钠缓冲液，pH 5.5中稀释至125μg/mL，并在37℃活化30min。将NAC-LP在250μL含有1mM DTT的20mM乙酸钠缓冲液，pH 5.0中稀释至20μM。取50μL溶液并添加50μL含有1％甲酸的甲醇。溶液用于分析初始(t0)样品。将活化的酶以最终浓度1.25μg/mL添加至剩余的200μL NAC-LP溶液中。
条件L：将半胱氨酸蛋白酶(飞世尔科技公司2199-CY-010)在含有100mM NaCl的20mM乙酸钠缓冲液，pH 4.0中稀释至47μg/mL，并在37℃活化30min。将NAC-LP在250μL含有1mM DTT的20mM乙酸钠缓冲液，pH 5.0中稀释至20μM。取50μL溶液并添加50μL含有1％甲酸的甲醇。溶液用于分析初始(t0)样品。将活化的酶以最终浓度1.2μg/mL添加至剩余的200μLNAC-LP溶液中。
每个测定条件的采样时间表都是通用的。在t＝15min、30min和240min(分别为t15、t30和t240)时对30μL溶液进行采样，并添加30μL含有1％甲酸的甲醇以终止反应。通过HPLC分析这些溶液。剩余溶液作为t’0溶液用于第二步反应的评估。
1.3有效载荷释放测定：第二步反应的评估(第二间隔子的自消解速率)
无论第一步反应的测定条件如何，程序都是通用的。在第一步反应(对t240溶液进行采样)后，立即将50μL 200mM磷酸盐缓冲液，pH 7.0添加至50μL t’0溶液中以启动第二步反应。在t’＝15min和30min(分别为t’15和t’30)时，对30μL溶液进行采样，并添加30μL含有1％甲酸的甲醇以终止反应。通过HPLC分析这些溶液。
1.4HPLC条件
对于测定条件C1：
系统：Waters Acquity UPLC
柱：Waters Acquity CSH C18，2.1x 50mm，粒径1.7um
检测：UV260 nm
流速：0.5mL/min
流动相A：水和甲酸铵的混合物(1000/1，w/v)
流动相B：水、乙腈和甲酸铵的混合物(100/900/1，v/v/w)
梯度程序(t，B浓度)：(0至0.2min，5％)-(0.2至1.5min，5％至60％)-(1.5至1.8min，60％至95％)-(1.8至2.0min，95％)-(2.01至2.5min，5％)
柱温：40℃
样品温度：5℃
注射体积：5μL
对于测定条件C2和L：
系统：Waters Acquity UPLC
柱：Waters Acquity CSH C18，2.1x 50mm，粒径1.7um
检测：UV260 nm
流速：0.3mL/min
流动相A：水和甲酸铵的混合物(1000/1，w/v)
流动相B：水、乙腈和甲酸铵的混合物(100/900/1，v/v/w)
梯度程序(t，B浓度)：(0至0.2min，5％)-(0.2至1.8min，5％至60％)-(1.8至2.2min，60％至95％)-(2.21至3min，5％)
柱温：40℃
样品温度：15℃
注射体积：5μL
1.5数据分析
第一步反应的动力学分析如下进行。
计算t15和t30的速率常数k，并将它们的平均值用作第一步反应的速率常数(酶促触发物切割速率)。
第二步反应的动力学分析如下进行。
计算t’15和t’30的速率常数k’，并将它们的平均值用作第二步反应的速率常数(第二间隔子的自消解速率)。t’0处的残留比率是根据t240样品中每个峰面积计算的。
ALP：NAC-LP的HPLC峰面积
AINT：INT的HPLC峰面积
AP：有效载荷的HPLC峰面积
t：第一步反应的采样时间(min)
t’：第二步反应的采样时间(min)(t’0＝t240＝通过添加200mM磷酸盐缓冲液将pH调节至7的时间点)
2结果
在测定中评估了30个LP。结果总结在表39和40中。表39中列出的LP在测定方法C1中评估，而表40中列出的那些通过方法C2或L评估(方法L仅适用于具有半胱氨酸蛋白酶可切割触发物的LP21-23)。LP2的结果表明，测定方法C1和C2之间的细微差别对第一步和第二步反应的影响很小。
表39.有效载荷释放速率的总结(1)
a：此表中列出的LP都是组织蛋白酶可切割的，并通过测定条件C1进行评估。
b：由LP2的k归一化的每个LP的相对k值。
c：由LP2的k’归一化的每个LP的相对k’值。
d：LP没有第二间隔子。
e：即使在pH 5下(第一反应步骤期间)，第二间隔子也被除去得太快，并且自消解速率高于该测定方法的上限。
表40.有效载荷释放速率的总结(2)
a：LP 21-23具有半胱氨酸蛋白酶可切割触发物并通过方法L进行评估。其他具有组织蛋白酶B可切割触发物并通过方法C2进行评估。
b：由LP2的k归一化的每个LP的相对k值(LP21-23除外，请参见下面的脚注e)。高k值表示高触发物切割速率。
c：由LP2的k’归一化的每个LP的相对k’值。高k’值表示高第二自消解速率。
d：即使在pH 5下(第一反应步骤期间)，第二间隔子也被除去得太快，并且自消解速率高于该测定方法的上限。
e：由LP21的k归一化的每个LP的相对k值。
表41.有效载荷释放速率的总结(3)
a：此表中列出的LP都是组织蛋白酶可切割的，并通过测定条件C2进行评估。
b：由LP2的k归一化的每个LP的相对k值。高k值表示高触发物切割速率。
c：由LP2的k’归一化的每个LP的相对k’值。高k’值表示高第二自消解速率。
d：即使在pH 5下(第一反应步骤期间)，第二间隔子也被除去得太快，并且自消解速率高于该测定方法的上限。
触发物切割速率主要取决于触发物肽序列，并且也可能受到第二间隔子的影响。关于第二间隔子，观察到苯甲酸盐(LP16和LP17)、二-F-(L)-脯氨醇(LP26、LP27和LP28)和(L)-脯氨醇(LP18-25)间隔子具有高自消解速率，这可能是提高ADC效力的重要属性。间隔子(马来酰亚胺和触发物之间)和触发物的结构对第二自消解速率的影响很小。
实例15.PSMA-STING ADC的体外干扰素-β(IFN-β)释放测定1方法
本实例中测试了LP1-32、39、42-48、50和53。
1.1体外IFN-β释放测定
STING活化后，经修饰的STING会招募TBK1和IRF3基因，并最终调节促炎细胞因子(包括IFN-β)的表达和分泌。
测量了IFN-β释放以确定所示PSMA-STING ADC的体外效力。已广泛用于研究单核细胞/巨噬细胞功能的PSMA阳性前列腺癌细胞系(C4-2)和人白血病单核细胞系(THP-1)用于该测定。ADC在C4-2和THP-1细胞的共培养物以及THP-1的单一培养物中进行了测试。共培养物释放的IFN-β代表了ADC的效力，而单一培养物释放的IFN-β仅代表了ADC对免疫细胞的作用(脱靶效应)。
1.1.1C4-2和THP-1共培养物的体外IFN-β释放
将C4-2细胞以15,000个细胞/孔接种在96孔平底培养板的100μL细胞培养基(完全RPMI-10％ FBS)中，并在37℃、5％ CO2下孵育过夜。第二天，添加50μL/孔的ADC试剂并连续稀释至0.01-100nM，随后在50μL/孔的细胞培养基中以15,000个细胞/孔添加THP-1细胞，然后充分混合并在37℃、5％ CO2下孵育20-22小时。孵育后，将培养板以1500rpm离心5分钟，然后收集上清液并储存在-80℃，然后测量人IFN-β。
1.1.2THP-1单一培养物的体外IFN-β释放
将THP-1细胞以30,000个细胞/孔接种在96孔平底培养板的100μL细胞培养基(完全RPMI-10％ FEBS)中。然后添加100μL/孔的ADC试剂，从0.01-100nM进行连续稀释，充分混合，然后在37℃、5％CO2下孵育20-22小时。孵育后，将培养板以1500rpm离心5分钟，收集上清液，储存在-80℃，然后测量人IFN-β。
1.1.3通过ELISA进行的人IFN-β测量
除7.8–1,000pg/ml的扩展标准范围外，使用人IFN-βDuoSet ELISA(R&D系统公司，目录号DY814-05)按照制造商的说明测量人IFN-β。测定结束时，使用QuantaBlu荧光过氧化物酶底物(赛默公司，目录号15169)来探测信号。在BMG Labtech Clariostar读板器上在320nM的激发和405nM的发射处读取板。根据IFN-β标准曲线(7.8-1,000pg/ml)对IFN-β进行定量，并使用GraphPad Prism生成数据图。
2结果
总共评估了42个ADC。显示了单一培养物和共培养物的定量IFN-β。具有S附接(SP)和N附接(SN)的ADC显示在图46和47中。还显示了最大IFN-β释放。检测低于检测限的样品显示为“<LOD”。
通常，与S附接ADC相比，N附接ADC显示出更高水平的IFN-β释放。连接子设计的其他变化影响了IFN-β释放。
所选序列

Claims (180)

1.一种人源化抗前列腺特异性膜抗原(PSMA)抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段特异性结合人PSMA，并且其中所述抗体或抗原结合片段包含
(i)三个HCDR，其包含以下氨基酸序列：SEQ ID NO:21(HCDR1)、SEQ ID NO:22(HCDR2)和SEQ ID NO:27(HCDR3)；以及三个LCDR，其包含SEQ ID NO:32(LCDR1)、SEQ ID NO:35(LCDR2)和SEQ ID NO:37(LCDR3)，如由Kabat编号系统所定义的；或
(ii)三个HCDR，其包含以下氨基酸序列：SEQ ID NO:21(HCDR1)、SEQ ID NO:22(HCDR2)和SEQ ID NO:27(HCDR3)；以及三个LCDR，其包含SEQ ID NO:33(LCDR1)、SEQ ID NO:36(LCDR2)和SEQ ID NO:37(LCDR3)，如由Kabat编号系统所定义的；或
(iii)三个HCDR，其包含以下氨基酸序列：SEQ ID NO:28(HCDR1)、SEQ ID NO:29(HCDR2)和SEQ ID NO:30(HCDR3)；以及三个LCDR，其包含SEQ ID NO:38(LCDR1)、SEQ IDNO:39(LCDR2)和SEQ ID NO:37(LCDR3)，如由IMGT编号系统所定义的。
2.如权利要求1所述的抗PSMA抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含
(i)三个HCDR，其包含以下氨基酸序列：SEQ ID NO:21(HCDR1)、SEQ ID NO:22(HCDR2)和SEQ ID NO:27(HCDR3)；以及三个LCDR，其包含SEQ ID NO:32(LCDR1)、SEQ ID NO:35(LCDR2)和SEQ ID NO:37(LCDR3)，如由Kabat编号系统所定义的；或
(ii)三个HCDR，其包含以下氨基酸序列：SEQ ID NO:28(HCDR1)、SEQ ID NO:29(HCDR2)和SEQ ID NO:30(HCDR3)；以及三个LCDR，其包含SEQ ID NO:38(LCDR1)、SEQ ID NO:39(LCDR2)和SEQ ID NO:37(LCDR3)，如由IMGT编号系统所定义的。
3.如权利要求1所述的抗PSMA抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含
(i)包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链可变区，以及包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的轻链可变区；或
(ii)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的重链可变区，以及包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的轻链可变区；或
(iii)包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链可变区，以及包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的轻链可变区；或
(iv)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的重链可变区，以及包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的轻链可变区；或
(v)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的重链可变区，以及包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的轻链可变区。
4.如权利要求1至3中任一项所述的抗PSMA抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的轻链可变区。
5.如权利要求1至4中任一项所述的抗PSMA抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含人IgG重链恒定区。
6.如权利要求1至5中任一项所述的抗PSMA抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含人IgG1重链恒定区。
7.如权利要求1至6中任一项所述的抗PSMA抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含人Igκ轻链恒定区。
8.如权利要求1至4中任一项所述的抗PSMA抗体或抗原结合片段，其中所述抗原结合片段具有>80℃的解链温度(Tm)，其中任选地所述抗原结合片段是Fab。
9.如权利要求1至8中任一项所述的抗PSMA抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段与至少一个连接子附接，其中任选地所述至少一个连接子是可切割的。
10.如权利要求9所述的抗PSMA抗体或抗原结合片段，其中所述至少一个连接子与细胞毒性剂或可检测试剂缀合。
11.一种包含L-D的连接子-有效载荷缀合物，其中L是与D共价附接的连接子，其中D包含根据下式之一的化合物：
其异构体、所述化合物或异构体的氘代衍生物；或者所述化合物、异构体或氘代衍生物的盐；
其中，对于每次出现独立地是：
■Pa和Pb中的每个，当不是外消旋时，独立地选自(R)-立体化学和(S)-立体化学；
■Qa和Qb中的每个独立地选自NH和O；
■Va和Vb中的每个独立地选自F和OH；
■W选自H和NH2；
■Xa和Xb中的每个独立地选自OH和SH；
■Ya和Yb中的每个独立地选自O和S；
■Za和Zb各自独立地选自CH2、O和NH；以及
■意味着键选自单键(-)、(E)-或(Z)-构型的双键(＝)、或三键(≡)；
条件是Za和Zb中的至少一个是NH或Xa和Xb中的至少一个是SH。
12.如权利要求11所述的连接子-有效载荷缀合物，其中Pa是(S)-构型且Pb是(R)-构型。
13.如权利要求11所述的连接子-有效载荷缀合物，其中Pa是(R)-构型且Pb是(R)-构型。
14.如权利要求11至13中任一项所述的连接子-有效载荷缀合物，其中Qa和Qb是O。
15.如权利要求11至14中任一项所述的连接子-有效载荷缀合物，其中Va和Vb是OH。
16.如权利要求11至14中任一项所述的连接子-有效载荷缀合物，其中Va和Vb是F。
17.如权利要求11至16中任一项所述的连接子-有效载荷缀合物，其中W是H。
18.如权利要求11至17中任一项所述的连接子-有效载荷缀合物，其中Za和Zb中的至少一个是NH。
19.如权利要求11至18中任一项所述的连接子-有效载荷缀合物，其中Za和Zb是NH。
20.如权利要求11至19中任一项所述的连接子-有效载荷缀合物，其中包含(E)-或(Z)-构型的双键(＝)。
21.如权利要求11至19中任一项所述的连接子-有效载荷缀合物，其中桥具有结构
22.如权利要求11至21中任一项所述的连接子-有效载荷缀合物，其中Ya和Yb中的至少一个是O。
23.如权利要求11至22中任一项所述的连接子-有效载荷缀合物，其中Ya和Yb是O。
24.如权利要求11至23中任一项所述的连接子-有效载荷缀合物，其中Xa和Xb中的至少一个是SH。
25.如权利要求11至24中任一项所述的连接子-有效载荷缀合物，其中Xa和Xb是SH。
26.如权利要求11至25中任一项所述的连接子-有效载荷缀合物，其中D包含具有式(III)的化合物。
27.如权利要求11所述的连接子-有效载荷缀合物，其中D包含选自以下的具有式(III)的化合物：
及其盐。
28.如权利要求11或权利要求27所述的连接子-有效载荷缀合物，其中D包含选自以下的具有式(III)的化合物：
及其盐。
29.如权利要求27或权利要求28所述的连接子-有效载荷缀合物，其中D包含化合物1。
30.如权利要求27或权利要求28所述的连接子-有效载荷缀合物，其中D包含化合物2。
31.如权利要求11至30中任一项所述的连接子-有效载荷缀合物，其中Xa和Xb中的至少一个是SH并且L通过S-2硫或S-14硫处的硫原子与D附接。
32.如权利要求31所述的连接子-有效载荷缀合物，其中Xb是SH并且L在S-2硫处与D附接。
33.如权利要求31所述的连接子-有效载荷缀合物，其中Xa是SH并且L在S-14硫处与D附接。
34.如权利要求11至30中任一项所述的连接子-有效载荷缀合物，其中Za和Zb中的至少一个是NH并且L通过N-34氮或N-39氮处的氮原子与D附接。
35.如权利要求34所述的连接子-有效载荷缀合物，其中Zb是NH并且L在N-34氮处与D附接。
36.如权利要求34所述的连接子-有效载荷缀合物，其中Za是NH并且L在N-39氮处与D附接。
37.如权利要求11至36中任一项所述的连接子-有效载荷缀合物，其中L是可切割连接子。
38.如权利要求37所述的连接子-有效载荷缀合物，其中所述可切割连接子包含可切割肽部分。
39.如权利要求38所述的连接子-有效载荷缀合物，其中所述可切割肽部分可被蛋白酶切割，任选地其中所述蛋白酶是组织蛋白酶或半胱氨酸蛋白酶。
40.如权利要求38或权利要求39所述的连接子-有效载荷缀合物，其中所述可切割肽部分包含氨基酸单元。
41.如权利要求40所述的连接子-有效载荷缀合物，其中所述氨基酸单元包含Val-Ala、Val-Cit、Val-Lys、Ala-Ala-Asn、Ala-(NMe)Ala-Asn、Asn、Gly-Gly-Phe-Gly、Glu-Val-Ala、或Gly-Val-Ala。
42.如权利要求37至41中任一项所述的连接子-有效载荷缀合物，其中所述可切割连接子包含Val-Ala。
43.如权利要求11至42中任一项所述的连接子-有效载荷缀合物，其中所述连接子包含马来酰亚胺(Mal)部分。
44.如权利要求43所述的连接子-有效载荷缀合物，其中所述Mal部分包含马来酰亚胺基己酰基(MC)。
45.如权利要求43或权利要求44所述的连接子-有效载荷缀合物，其中所述Mal部分通过抗体或抗原结合片段上的半胱氨酸残基与所述抗体或抗原结合片段接合。
46.如权利要求11至45中任一项所述的连接子-有效载荷缀合物，其中所述连接子进一步包含至少一个间隔子单元。
47.如权利要求46所述的连接子-有效载荷缀合物，其中所述至少一个间隔子单元包含至少一个聚乙二醇(PEG)部分。
48.如权利要求47所述的连接子-有效载荷缀合物，其中所述至少一个PEG部分包含-(PEG)m-并且m是1至10的整数。
49.如权利要求48所述的连接子-有效载荷缀合物，其中m是2至8的整数。
50.如权利要求48或权利要求49所述的连接子-有效载荷缀合物，其中m是2至5的整数。
51.如权利要求48至50中任一项所述的连接子-有效载荷缀合物，其中m是2。
52.如权利要求46或权利要求47所述的连接子-有效载荷缀合物，其中所述至少一个间隔子单元包含PEG2-Lys(ε-PEG8-OMe)-PEG2。
53.如权利要求46所述的连接子-有效载荷缀合物，其中所述至少一个间隔子单元包含
54.如权利要求46或权利要求53所述的连接子-有效载荷缀合物，其中所述至少一个间隔子单元包含
55.如权利要求11至54中任一项所述的连接子-有效载荷缀合物，其中所述连接子进一步包含至少一个自消解单元。
56.如权利要求55所述的连接子-有效载荷缀合物，其中所述连接子包含第一自消解单元。
57.如权利要求56所述的连接子-有效载荷缀合物，其中在通过所述第一自消解单元的自消解切割所述连接子后，所述连接子能够从D中除去。
58.如权利要求56或权利要求57所述的连接子-有效载荷缀合物，其中所述第一自消解单元包含任选地被选自甲基、氟、氯、三氟甲基、芳基和杂芳基的1-3个取代基取代的对氨基苄基(pAB)。
59.如权利要求58所述的连接子-有效载荷缀合物，其中所述第一自消解单元包含对氨基苄基(pAB)。
60.如权利要求55至59中任一项所述的连接子-有效载荷缀合物，其中所述连接子包含MC-Val-Ala-pAB。
61.如权利要求56至59中任一项所述的连接子-有效载荷缀合物，其中所述第一自消解单元包含对氨基苄氧基羰基(pABC)。
62.如权利要求56至61中任一项所述的连接子-有效载荷缀合物，其中所述连接子进一步包含第二自消解单元。
63.如权利要求62所述的连接子-有效载荷缀合物，其中在通过所述第一自消解单元的自消解和/或所述第二自消解单元的自消解切割所述连接子后，所述连接子能够从D中除去。
64.如权利要求62或权利要求63所述的连接子-有效载荷缀合物，其中在通过所述第一自消解单元的自消解、然后是所述第二自消解单元的自消解以逐步方式切割所述连接子后，所述连接子从D中除去。
65.如权利要求11至41和43至64中任一项所述的连接子-有效载荷缀合物，其中所述连接子包含可切割连接子、第一自消解单元、和第二自消解单元。
66.如权利要求65所述的连接子-有效载荷缀合物，其中所述可切割连接子包含Val-Ala。
67.如权利要求65所述的连接子-有效载荷缀合物，其中所述可切割连接子包含Val-Cit。
68.如权利要求65至67中任一项所述的连接子-有效载荷缀合物，其中所述可切割连接子包含式(II)。
69.如权利要求65所述的连接子-有效载荷缀合物，其中所述第二自消解单元包含以下部分之一：
或其异构体。
70.如权利要求65所述的连接子-有效载荷缀合物，其中所述可切割连接子包含Val-Ala，并且其中所述第二自消解单元包含以下部分之一：
或其异构体。
71.如权利要求62至70中任一项所述的连接子-有效载荷缀合物，其中所述第二自消解单元包含单元1(MEC)部分。
72.如权利要求62至70中任一项所述的连接子-有效载荷缀合物，其中所述第二自消解单元包含单元8部分。
73.如权利要求62至70中任一项所述的连接子-有效载荷缀合物，其中所述第二自消解单元包含单元11部分。
74.如权利要求62至70中任一项所述的连接子-有效载荷缀合物，其中所述第二自消解单元包含单元9部分。
75.如权利要求70所述的连接子-有效载荷缀合物，其中所述连接子包含Val-Ala-pABC-MEC部分。
76.如权利要求70所述的连接子-有效载荷缀合物，其中所述连接子包含MC-Val-Ala-pABC-MEC部分。
77.如权利要求11所述的连接子-有效载荷缀合物，其中所述L-D包含LP1：
78.如权利要求69所述的连接子-有效载荷缀合物，其中所述连接子包含Val-Cit-pABC-MEC部分。
79.如权利要求69所述的连接子-有效载荷缀合物，其中所述连接子包含MC-Val-Cit-pABC-MEC部分。
80.如权利要求69所述的连接子-有效载荷缀合物，其中所述L-D包含MC-Val-Cit-pABC-MEC-化合物1。
81.如权利要求70所述的连接子-有效载荷缀合物，其中所述连接子包含Val-Ala-pABC-单元8部分。
82.如权利要求70所述的连接子-有效载荷缀合物，其中所述连接子包含MC-Val-Ala-pABC-单元8部分。
83.如权利要求11所述的连接子-有效载荷缀合物，其中所述L-D包含LP16：
84.如权利要求69所述的连接子-有效载荷缀合物，其中所述连接子包含Val-Cit-pABC-单元8部分。
85.如权利要求69所述的连接子-有效载荷缀合物，其中所述连接子包含MC-Val-Cit-pABC-单元8部分。
86.如权利要求69所述的连接子-有效载荷缀合物，其中所述L-D包含MC-Val-Cit-pABC-单元8-化合物1。
87.如权利要求70所述的连接子-有效载荷缀合物，其中所述连接子包含Val-Ala-pABC-单元11部分。
88.如权利要求70所述的连接子-有效载荷缀合物，其中所述连接子包含MC-Val-Ala-pABC-单元11部分。
89.如权利要求11所述的连接子-有效载荷缀合物，其中所述L-D包含LP28：
90.如权利要求69所述的连接子-有效载荷缀合物，其中所述连接子包含Val-Cit-pABC-单元11部分。
91.如权利要求69所述的连接子-有效载荷缀合物，其中所述连接子包含MC-Val-Cit-pABC-单元11部分。
92.如权利要求69所述的连接子-有效载荷缀合物，其中所述L-D包含MC-Val-Cit-pABC-单元11-化合物1。
93.如权利要求70所述的连接子-有效载荷缀合物，其中所述连接子包含Val-Ala-pABC-单元9部分。
94.如权利要求70所述的连接子-有效载荷缀合物，其中所述连接子包含MC-Val-Ala-pABC-单元9部分。
95.如权利要求11所述的连接子-有效载荷缀合物，其中所述L-D包含LP20：
96.如权利要求69所述的连接子-有效载荷缀合物，其中所述连接子包含Val-Cit-pABC-单元9部分。
97.如权利要求69所述的连接子-有效载荷缀合物，其中所述连接子包含MC-Val-Cit-pABC-单元9部分。
98.如权利要求69所述的连接子-有效载荷缀合物，其中所述L-D包含MC-Val-Cit-pABC-单元9-化合物1。
99.如权利要求69所述的连接子-有效载荷缀合物，其中所述连接子包含式(II)-Val-Cit-pABC。
100.如权利要求69所述的连接子-有效载荷缀合物，其中所述连接子包含式(II)-Val-Cit-pABC-MEC部分。
101.如权利要求69所述的连接子-有效载荷缀合物，其中所述连接子包含Mal-式(II)-Val-Cit-pABC-MEC部分。
102.如权利要求69所述的连接子-有效载荷缀合物，其中所述L-D包含Mal-式(II)-Val-Cit-pABC-MEC-化合物1。
103.如权利要求69所述的连接子-有效载荷缀合物，其中所述连接子包含式(II)-Val-Cit-pABC-单元8部分。
104.如权利要求69所述的连接子-有效载荷缀合物，其中所述连接子包含Mal-式(II)-Val-Cit-pABC-单元8部分。
105.如权利要求69所述的连接子-有效载荷缀合物，其中所述L-D包含Mal-式(II)-Val-Cit-pABC-单元8-化合物1。
106.如权利要求69所述的连接子-有效载荷缀合物，其中所述连接子包含式(II)-Val-Cit-pABC-单元11部分。
107.如权利要求69所述的连接子-有效载荷缀合物，其中所述连接子包含Mal-式(II)-Val-Cit-pABC-单元11部分。
108.如权利要求69所述的连接子-有效载荷缀合物，其中所述L-D包含Mal-式(II)-Val-Cit-pABC-单元11-化合物1。
109.如权利要求69所述的连接子-有效载荷缀合物，其中所述连接子包含式(II)-Val-Cit-pABC-单元9部分。
110.如权利要求69所述的连接子-有效载荷缀合物，其中所述连接子包含Mal-式(II)-Val-Cit-pABC-单元9部分。
111.如权利要求69所述的连接子-有效载荷缀合物，其中所述L-D包含Mal-式(II)-Val-Cit-pABC-单元9-化合物1。
112.如权利要求70所述的连接子-有效载荷缀合物，其中所述连接子包含式(II)-Val-Ala-pABC。
113.如权利要求70所述的连接子-有效载荷缀合物，其中所述连接子包含式(II)-Val-Ala-pABC-MEC部分。
114.如权利要求70所述的连接子-有效载荷缀合物，其中所述连接子包含Mal-式(II)-Val-Ala-pABC-MEC部分。
115.如权利要求70所述的连接子-有效载荷缀合物，其中所述L-D包含Mal-式(II)-Val-Ala-pABC-MEC-化合物1。
116.如权利要求70所述的连接子-有效载荷缀合物，其中所述连接子包含式(II)-Val-Ala-pABC-单元8部分。
117.如权利要求70所述的连接子-有效载荷缀合物，其中所述连接子包含Mal-式(II)-Val-Ala-pABC-单元8部分。
118.如权利要求70所述的连接子-有效载荷缀合物，其中所述L-D包含Mal-式(II)-Val-Ala-pABC-单元8-化合物1。
119.如权利要求70所述的连接子-有效载荷缀合物，其中所述连接子包含式(II)-Val-Ala-pABC-单元11部分。
120.如权利要求70所述的连接子-有效载荷缀合物，其中所述连接子包含Mal-式(II)-Val-Ala-pABC-单元11部分。
121.如权利要求70所述的连接子-有效载荷缀合物，其中所述L-D包含Mal-式(II)-Val-Ala-pABC-单元11-化合物1。
122.如权利要求70所述的连接子-有效载荷缀合物，其中所述连接子包含式(II)-Val-Ala-pABC-单元9部分。
123.如权利要求70所述的连接子-有效载荷缀合物，其中所述连接子包含Mal-式(II)-Val-Ala-pABC-单元9部分。
124.如权利要求70所述的连接子-有效载荷缀合物，其中所述L-D包含Mal-式(II)-Val-Ala-pABC-单元9-化合物1。
125.如权利要求69所述的连接子-有效载荷缀合物，其中所述连接子包含式(II)-Val-Cit-pAB。
126.如权利要求69所述的连接子-有效载荷缀合物，其中所述连接子包含式(II)-Val-Cit-pAB-单元9部分。
127.如权利要求69所述的连接子-有效载荷缀合物，其中所述连接子包含Mal-式(II)-Val-Cit-pAB。
128.如权利要求69所述的连接子-有效载荷缀合物，其中所述连接子包含Mal-式(II)-Val-Cit-pAB-单元9部分。
129.如权利要求69所述的连接子-有效载荷缀合物，其中所述L-D包含Mal-式(II)-Val-Cit-pAB-单元9-化合物1。
130.如权利要求70所述的连接子-有效载荷缀合物，其中所述连接子包含式(II)-Val-Ala-pAB。
131.如权利要求70所述的连接子-有效载荷缀合物，其中所述连接子包含式(II)-Val-Ala-pAB-单元9部分。
132.如权利要求70所述的连接子-有效载荷缀合物，其中所述连接子包含Mal-式(II)-Val-Ala-pAB。
133.如权利要求70所述的连接子-有效载荷缀合物，其中所述连接子包含Mal-式(II)-Val-Ala-pAB-单元9部分。
134.如权利要求11所述的连接子-有效载荷缀合物，其中所述L-D包含LP25：
135.如权利要求69所述的连接子-有效载荷缀合物，其中所述连接子包含式(II)-Val-Cit-pAB-单元11部分。
136.如权利要求69所述的连接子-有效载荷缀合物，其中所述连接子包含Mal-式(II)-Val-Cit-pAB-单元11部分。
137.如权利要求69所述的连接子-有效载荷缀合物，其中所述L-D包含Mal-式(II)-Val-Cit-pAB-单元11-化合物1。
138.如权利要求70所述的连接子-有效载荷缀合物，其中所述连接子包含式(II)-Val-Ala-pAB-单元11部分。
139.如权利要求70所述的连接子-有效载荷缀合物，其中所述连接子包含Mal-式(II)-Val-Ala-pAB-单元11部分。
140.如权利要求11所述的连接子-有效载荷缀合物，其中所述L-D包含LP26：
141.一种具有式(I)的抗体-药物缀合物：
Ab-(L-D)p(I)
其中Ab是如权利要求1至8中任一项所述的抗PSMA抗体或其抗原结合片段；
L-D是如权利要求11至140中任一项所述的连接子-有效载荷缀合物；并且
p是1至20的整数。
142.如权利要求141所述的抗体-药物缀合物，其中p是1至12的整数，优选地其中p是2至8的整数。
143.如权利要求141或权利要求142所述的抗体-药物缀合物，其中p是2至4的整数。
144.如权利要求141至143中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述连接子包含可切割部分，所述可切割部分的位置使得在切割时所述连接子或者所述抗体或抗原结合片段的任何部分不与D保持结合。
145.如权利要求141至144中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述连接子-有效载荷缀合物通过Mal部分与所述抗体或抗原结合片段附接，其中所述Mal部分通过所述抗体或抗原结合片段上的半胱氨酸残基与所述抗体或抗原结合片段接合。
146.如权利要求145所述的抗体-药物缀合物，其中所述半胱氨酸残基位于所述抗体或抗原结合片段的轻链上。
147.如权利要求145所述的抗体-药物缀合物，其中所述半胱氨酸残基位于所述抗体或抗原结合片段的重链上。
148.如权利要求141至147中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述抗体或抗原结合片段包含三个HCDR，其包含以下氨基酸序列：SEQ ID NO:21(HCDR1)、SEQ ID NO:22(HCDR2)和SEQ ID NO:27(HCDR3)；以及三个LCDR，其包含以下氨基酸序列：SEQ ID NO:32(LCDR1)、SEQ ID NO:35(LCDR2)和SEQ ID NO:37(LCDR3)，如由Kabat编号系统所定义的。
149.如权利要求141至147中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述抗体或抗原结合片段包含三个HCDR，其包含以下氨基酸序列：SEQ ID NO:28(HCDR1)、SEQ ID NO:29(HCDR2)和SEQ ID NO:30(HCDR3)；以及三个LCDR，其包含以下氨基酸序列：SEQ ID NO:38(LCDR1)、SEQ ID NO:39(LCDR2)和SEQ ID NO:37(LCDR3)，如由IMGT编号系统所定义的。
150.如权利要求148或权利要求149所述的抗体-药物缀合物，其中所述抗体或抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的轻链可变区。
151.如权利要求141至150中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中L-D包含LP16、LP20、LP26或LP28。
152.如权利要求141至151中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述L-D包含LP16：
153.如权利要求141至151中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述L-D包含LP20：
154.如权利要求141至151中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述L-D包含LP26：
155.如权利要求141至151中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述L-D包含LP28：
156.一种药物组合物，其包含如权利要求1至10中任一项所述的抗体或抗原结合片段、如权利要求11-140中任一项所述的连接子-有效载荷缀合物、或如权利要求141-155中任一项所述的抗体-药物缀合物，以及药学上可接受的载剂。
157.一种组合物，其包含多个拷贝的具有式(I)的抗体-药物缀合物：
Ab-(L-D)p(I)
其中
Ab是如权利要求1至8中任一项所述的抗PSMA抗体或其抗原结合片段；
L-D是如权利要求11至140中任一项所述的连接子-有效载荷缀合物；并且
p是每个Ab的L-D部分的平均数量，其中所述组合物中所述抗体-药物缀合物的平均p是约2至约8。
158.如权利要求157所述的组合物，其中
所述抗体或抗原结合片段包含三个HCDR，其包含以下氨基酸序列：SEQ ID NO:21(HCDR1)、SEQ ID NO:22(HCDR2)和SEQ ID NO:27(HCDR3)；以及三个LCDR，其包含SEQ IDNO:32(LCDR1)、SEQ ID NO:35(LCDR2)和SEQ ID NO:37(LCDR3)，如由Kabat编号系统所定义的；或三个HCDR，其包含以下氨基酸序列：SEQ ID NO:28(HCDR1)、SEQ ID NO:29(HCDR2)和SEQ ID NO:30(HCDR3)；以及三个LCDR，其包含SEQ ID NO:38(LCDR1)、SEQ ID NO:39(LCDR2)和SEQ ID NO:37(LCDR3)，如由IMGT编号系统所定义的；并且
所述L-D包含LP16：
159.如权利要求157所述的组合物，其中
所述抗体或抗原结合片段包含三个HCDR，其包含以下氨基酸序列：SEQ ID NO:21(HCDR1)、SEQ ID NO:22(HCDR2)和SEQ ID NO:27(HCDR3)；以及三个LCDR，其包含SEQ IDNO:32(LCDR1)、SEQ ID NO:35(LCDR2)和SEQ ID NO:37(LCDR3)，如由Kabat编号系统所定义的；或三个HCDR，其包含以下氨基酸序列：SEQ ID NO:28(HCDR1)、SEQ ID NO:29(HCDR2)和SEQ ID NO:30(HCDR3)；以及三个LCDR，其包含SEQ ID NO:38(LCDR1)、SEQ ID NO:39(LCDR2)和SEQ ID NO:37(LCDR3)，如由IMGT编号系统所定义的；并且
所述L-D包含LP20：
160.如权利要求157所述的组合物，其中
所述抗体或抗原结合片段包含三个HCDR，其包含以下氨基酸序列：SEQ ID NO:21(HCDR1)、SEQ ID NO:22(HCDR2)和SEQ ID NO:27(HCDR3)；以及三个LCDR，其包含SEQ IDNO:32(LCDR1)、SEQ ID NO:35(LCDR2)和SEQ ID NO:37(LCDR3)，如由Kabat编号系统所定义的；或三个HCDR，其包含以下氨基酸序列：SEQ ID NO:28(HCDR1)、SEQ ID NO:29(HCDR2)和SEQ ID NO:30(HCDR3)；以及三个LCDR，其包含SEQ ID NO:38(LCDR1)、SEQ ID NO:39(LCDR2)和SEQ ID NO:37(LCDR3)，如由IMGT编号系统所定义的；并且
所述L-D包含LP26：
161.如权利要求157所述的组合物，其中
所述抗体或抗原结合片段包含三个HCDR，其包含以下氨基酸序列：SEQ ID NO:21(HCDR1)、SEQ ID NO:22(HCDR2)和SEQ ID NO:27(HCDR3)；以及三个LCDR，其包含SEQ IDNO:32(LCDR1)、SEQ ID NO:35(LCDR2)和SEQ ID NO:37(LCDR3)，如由Kabat编号系统所定义的；或三个HCDR，其包含以下氨基酸序列：SEQ ID NO:28(HCDR1)、SEQ ID NO:29(HCDR2)和SEQ ID NO:30(HCDR3)；以及三个LCDR，其包含SEQ ID NO:38(LCDR1)、SEQ ID NO:39(LCDR2)和SEQ ID NO:37(LCDR3)，如由IMGT编号系统所定义的；并且
所述L-D包含LP28：
162.如权利要求157至161中任一项所述的组合物，其中所述抗体或抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的轻链可变区。
163.一种治疗患有癌症或有患癌症风险的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的如权利要求1至10中任一项所述的抗体或抗原结合片段、如权利要求11至140中任一项所述的连接子-有效载荷缀合物、如权利要求141至155中任一项所述的抗体-药物缀合物、如权利要求156所述的药物组合物、或如权利要求157至162中任一项所述的组合物。
164.一种减少或抑制癌症生长的方法，所述方法包括施用治疗有效量的如权利要求1至10中任一项所述的抗体或抗原结合片段、如权利要求11至140中任一项所述的连接子-有效载荷缀合物、如权利要求141至155中任一项所述的抗体-药物缀合物、如权利要求156所述的药物组合物、或如权利要求157至162中任一项所述的组合物。
165.如权利要求1至10中任一项所述的抗体或抗原结合片段、如权利要求11至140中任一项所述的连接子-有效载荷缀合物、如权利要求141至155中任一项所述的抗体-药物缀合物、如权利要求156所述的药物组合物、或如权利要求157至162中任一项所述的组合物在制造用于治疗癌症的药物中的用途。
166.如权利要求1至10中任一项所述的抗体或抗原结合片段、如权利要求11至140中任一项所述的连接子-有效载荷缀合物、如权利要求141至155中任一项所述的抗体-药物缀合物、如权利要求156所述的药物组合物、或如权利要求157至162中任一项所述的组合物在治疗癌症中的用途。
167.如权利要求163或权利要求164所述的方法或者如权利要求165或权利要求166所述的用途，其中所述癌症表达PSMA。
168.如权利要求163或权利要求164所述的方法或者如权利要求165或权利要求166所述的用途，其中所述癌症是前列腺癌。
169.一种产生如权利要求141至155中任一项所述的抗体-药物缀合物或如权利要求157至162中任一项所述的组合物的方法，所述方法包括使如权利要求1至8中任一项所述的抗体或抗原结合片段与如权利要求11至140中任一项所述的连接子-有效载荷缀合物反应。
170.一种抗体-药物缀合物，其根据如权利要求169所述的方法产生。
171.一种产生L-D缀合物(V)的方法：
所述方法包括使权利要求11的具有式(III)的化合物：
或其盐与活化连接子反应，所述活化连接子包含具有以下结构的合适连接子：
以产生所述L-D缀合物(V)，
其中Zb是NH。
172.如权利要求171所述的方法，其中Pb具有(S)-构型，并且所述活化连接子优先与Zb反应。
173.一种产生L-D缀合物(VI)的方法：
所述方法包括使权利要求11的具有式(III)的化合物：
或其盐与活化连接子反应，所述活化连接子包含具有以下结构的合适连接子：
以产生所述L-D缀合物(VI)，
其中Zb是NH。
174.如权利要求173所述的方法，其中Pb具有(S)-构型，并且所述活化连接子优先与Zb反应。
175.如权利要求171至174中任一项所述的方法，其中所述具有式(III)的化合物是化合物1。
176.一种连接子-药物缀合物，其通过如权利要求171至175中任一项所述的方法产生。
177.一种产生抗体-药物缀合物的方法，其中所述方法包括在适合附接的条件下将如权利要求1至8中任一项所述的抗体或抗原结合片段与如权利要求11至140中任一项所述的L-D缀合物缀合。
178.一种组合物，其包含如权利要求11至140中任一项所述的连接子-有效载荷缀合物。
179.一种组合物，其包含根据如权利要求171至175中任一项所述的方法产生的连接子-有效载荷缀合物。
180.如权利要求11所述的连接子-有效载荷缀合物，其中所述连接子-有效载荷缀合物选自以下连接子-有效载荷缀合物：
及其盐。
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