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CN117838878A - 抗体-sting激动剂缀合物及其在免疫疗法中的用途 - Google Patents

抗体-sting激动剂缀合物及其在免疫疗法中的用途 Download PDF

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CN117838878A
CN117838878A CN202311611339.0A CN202311611339A CN117838878A CN 117838878 A CN117838878 A CN 117838878A CN 202311611339 A CN202311611339 A CN 202311611339A CN 117838878 A CN117838878 A CN 117838878A
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石和平
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陈绰
孙立军
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Immunosensor Therapy Co ltd
University of Texas System
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Abstract

本公开涉及包含缀合至抗体的STING激动剂环状二核苷酸的抗体‑药物缀合物、其制备方法及其用途。

Description

抗体-STING激动剂缀合物及其在免疫疗法中的用途
本申请是母案为中国发明专利申请202080064941.5的分案申请。
1.序列表
本申请包含序列表，该序列表已以ASCII格式通过电子方式提交，并通过引用将其全部内容并入本申请。所述ASCII副本创建于2020年7月17日，命名为400160_005US_SL_ST25.txt，且大小为44,502字节。
2.领域
本公开涉及抗体-药物缀合物(ADC)中STING激动剂用于免疫疗法的用途；包括该ADC的组合物、制备该ADC的方法和使用该ADC治疗癌症的方法，以及其它内容。
3.背景
胞质DNA传感途径除了其在宿主防御含DNA的微生物入侵中的主要功能外，还在启动和维持针对恶性肿瘤的免疫应答中起关键作用。来自受损肿瘤细胞的胞质DNA触发一种称作环状AMP-GMP合酶(cGAS)的酶的激活，该酶合成2'3'-环状AMP-GMP(cGAMP)。作为内源性配体，cGAMP结合并激活ER衔接蛋白干扰素基因刺激物(STING)，并且导致干扰素和炎性细胞因子的诱导、抗原呈递细胞的募集和成熟，最终导致T细胞和自然杀伤(NK)细胞进行的抗肿瘤免疫。许多模拟cGAMP但具有改进的治疗特性的STING激动剂正在用于癌症免疫疗法的开发中。尽管这些药物有望用于治疗一系列实体瘤，但它们存在明显的局限性。这些化合物依赖于瘤内给药，由于它们如果以其他方式注射可能诱导系统细胞因子反应。即使瘤内注射也可能会引起不需要的细胞因子反应，因为迅速渗漏到外周组织。这些化合物在肿瘤环境中短暂暴露于免疫细胞也降低了它们的作用。因此，迫切需要能够将STING激动剂特异性递送至肿瘤环境并具有延长保留时间的新型治疗剂。
4.概述
本公开提供了特定的环状二核苷酸(CDN)，其可以与靶向患病细胞或组织微环境中特定抗原的抗体或抗原结合片段缀合。例如，抗体或其抗原结合片段可以靶向于肿瘤微环境中细胞例如肿瘤细胞或免疫细胞上存在的癌症相关抗原。本公开的CDN能够激动STING，从而刺激免疫系统。当本公开的CDN与靶向患病细胞或组织中的抗原的抗体缀合时，它们提供CDN在患病细胞或组织的微环境中的充分暴露，同时减少伴发的与广泛CDN渗漏至外周组织中相关的副作用。
在一方面，本公开提供了具有式I的结构的抗体-药物缀合物(ADC)：
(式I)Ab-[-L-(D)m]n
其中：
“D”表示CDN(例如，如本申请中所述的CDN，例如式II的CDN)；
“Ab”表示结合靶抗原的抗体或其结合片段；
“L”每次出现时独立地表示使一次或多次出现的D连接至Ab的连接基；
“m”表示连接至特定连接基的D出现的次数；且
“n”表示连接至Ab的连接基的数量。
在某些实施方案中，本公开提供了具有式Ia的结构的ADC：
(式Ia)Ab-[-L-D]n
其中：
“D”表示CDN(例如，如本申请中所述的CDN，例如式II的CDN)；
“Ab”表示结合靶抗原的抗体或其结合片段；
“L”每次出现时独立地表示使D连接至Ab的连接基；且
“n”表示经由连接基(L)连接至Ab的D出现的次数。
在另一方面，本公开提供了特定的CDN(D)，其可以作为自身施用或作为式I的ADC的一部分施用。这些CDN可以具有式II的结构：
其中
R1为C1-6烷基，例如C2-6烷基或C2-3烷基，其被羟基、巯基、氨基、C1-6烷基氨基或-PEG-OH基团取代；
R3和R4独立地为氢、卤素、C1-6烷基、C2-6烯基或C2-6炔基，其中C1-6烷基、C2-6烯基和C2-6炔基独立地任选地被一个或多个基团取代，所述基团选自卤素、巯基、羟基、羧基、C1-6烷氧基、C1-6羟基烷氧基、-OC(O)C1-6烷基、-N(H)C(O)C1-6烷基、-N(C1-3烷基)C(O)C1-6烷基、氨基、C1-6烷基氨基、二(C1-6烷基)氨基、氧代和叠氮基；
R2、R5和R6独立地为氢、卤素、羟基、叠氮基、氨基、C1-6烷基氨基、二(C1-6烷基)氨基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C2-6烯基、C3-6烯基-O-、C2-6炔基或C3-6炔基-O-，其中C1-6烷基、C1-6烷氧基、C2-6烯基、C3-6烯基-O-、C2-6炔基和C3-6炔基-O-独立地任选地被一个或多个基团取代，所述基团选自卤素、巯基、羟基、羧基、C1-6烷氧基、C1-6羟基烷氧基、-OC(O)C1-6烷基、-N(H)C(O)C1-6烷基、-N(C1-3烷基)C(O)C1-6烷基、氨基、C1-6烷基氨基、二(C1-6烷基)氨基、氧代和叠氮基；或R6和R5一起为＝CH2；或R6和R4一起形成越过包含选自亚乙基、-O-CH2-和-NH-CH2-的V2的环的桥；
V1和V2独立地为O、S或CH2；
从包含V1的环上的碳开始的BG1和从包含V2的环上的碳开始的BG2独立地为-O-P(O)Rp-O-、-O-P(S)Rp-O-、-O-P(O)Rp-S-、-O-P(S)Rp-S-、-S-P(O)Rp-O-、-S-P(S)Rp-O-、-S-P(O)Rp-S-、-S-P(S)Rp-S-或-NH-SO2-NH-；其中
Rp每次出现时独立地为羟基、巯基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C3-6烯基-O-、C3-6炔基-O-、-PEG-OH、硼烷基(-BH3 -)或-NR’R”，其中C1-6烷基、C1-6烷氧基、C3-6烯基-O-和C3-6炔基-O-独立地任选地被一个或多个基团取代，所述基团选自卤素、巯基、羟基、羧基、C1-6烷氧基、C1-6羟基烷氧基、-OC(O)C1-6烷基、-N(H)C(O)C1-6烷基、-N(C1-3烷基)C(O)C1-6烷基、氨基、C1-6烷基氨基、二(C1-6烷基)氨基、氧代和叠氮基；且
R’和R”独立地为氢或C1-6烷基，该C1-6烷基任选地被一个或多个基团取代，所述基团选自卤素、巯基、羟基、羧基、C1-6烷氧基、C1-6羟基烷氧基、-OC(O)C1-6烷基、-N(H)C(O)C1-6烷基、-N(C1-3烷基)C(O)C1-6烷基、氨基、C1-6烷基氨基、二(C1-6烷基)氨基、氧代和叠氮基；或同一氮上的R’和R”一起形成C3-5杂环；
Ra1、Rb1、Ra2和Rb2独立地为氢或C1-3烷基；且
B1和B2独立地选自：
其中
V3为O或S，特别是O；
Z1、Z2、Z3、Z4、Z5和Z6每次出现时独立地为CRz或N；
Za为O(当Z5为N时除外)或NR’；其中
Rz每次出现时独立地为氢、卤素、叠氮基、氨基、C1-6烷基氨基、二(C1-6烷基)氨基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C2-6烯基、C3-6烯基-O-、C2-6炔基、C3-6炔基-O-、-NO2、-CN、-C(O)C1-6烷基、-CO2H、-CO2C1-6烷基、-S(O)C1-6烷基、-S(O)2C1-6烷基、-C(O)NR’、-C(O)NR’R”、-SO2NR’R”、-OC(O)C1-6烷基、-NR’C(O)C1-6烷基、-N(R’)C(O)NR’R”、-N(R’)SO2NR’R”、-N(R)SO2C1-6烷基或-OC(O)NR’R”，其中
C1-6烷基、C1-6烷氧基、C2-6烯基、C3-6烯基-O-、C2-6炔基和C3-6炔基-O-每次出现时独立地任选地被一个或多个基团取代，所述基团选自卤素、巯基、羟基、羧基、C1-6烷氧基、C1-6羟基烷氧基、-OC(O)C1-6烷基、-N(H)C(O)C1-6烷基、-N(C1-3烷基)C(O)C1-6烷基、氨基、C1-6烷基氨基、二(C1-6烷基)氨基、氧代和叠氮基；且
R’和R”每次出现时独立地为氢或C1-6烷基，该C1-6烷基任选地被一个或多个基团取代，所述基团选自卤素、巯基、羟基、羧基、C1-6烷氧基、C1-6羟基烷氧基、-OC(O)C1-6烷基、-N(H)C(O)C1-6烷基、-N(C1-3烷基)C(O)C1-6烷基、氨基、C1-6烷基氨基、二(C1-6烷基)氨基、氧代和叠氮基；或同一氮上的R’和R”一起形成C3-5杂环；
或其药学上可接受的盐。
本公开提供了通过使式II的CDN经由连接基缀合至抗体制备式I的ADC的方法。式II的CDN可以经由可裂解型或不可裂解型连接基缀合至抗体。在具体实施方案中，在连接基裂解时，CDN释放入肿瘤细胞、癌症相关免疫细胞或肿瘤微环境。
在式I的ADC中，其中CDN(D)具有式II，CDN可以在式II的CDN的R1位上在羟基、巯基、氨基、C1-6烷基氨基或-PEG-OH基团处共价键合至连接基(L)。
在本公开的一个实施方案中，式II的CDN具有式IIe：
其中R1、R5和R6；RP；且B1和B2如上对式II所定义；
或其药学上可接受的盐。
在本公开的一个实施方案中，式II的CDN具有式IIk：
其中
W、X、Y和Z独立地为CH或N；且
RP每次出现时独立地为如上对式II所定义；
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，本公开提供了包含CDN和碱的组合物，其中CDN为式II的化合物，例如上述式IIe或IIk的化合物，或下述式IIn或IIo的化合物。在这类实施方案的某些中，所述的组合物由CDN和碱组成。在一些实施方案中，所述碱为胺碱，例如吡啶。在这些实施方案的一些中，所述的组合物无水。
在某些实施方案中，本公开提供了包含CDN和连接基或偶联剂或者连接基和偶联剂二者的组合物，其中CDN为式II的化合物，例如上述式IIe或IIk的化合物，或下述式IIn或IIo的化合物，且其中偶联剂促进CDN偶联至连接基，例如通过在连接基上生成活化的酯。在一些实施方案中，所述的组合物还包含疏质子极性溶剂。在某些实施方案中，所述的组合物无水。
在一些实施方案中，本公开提供了化合物，该化合物为式L-CDN的偶联至连接基(L)的环状二核苷酸(CDN)。在某些实施方案中，CDN经由硫醚、酰胺、酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、脲、二硫化物或醚基团，特别是酰胺、氨基甲酸酯或二硫基团，偶联至连接基L。在某些实施方案中，CDN为式II的化合物，例如上述式IIe或IIk的化合物或下述式IIm、IIn或IIo的化合物，且CDN在式II的R1的巯基、氨基或C1-6烷基氨基上偶联至L，且L包括能够偶联至抗体上的互补位点的位点。
在一个实施方案中，式I的ADC具有式III的结构：
其中变量W、X、Y、Z、RP和n如上对式I和式II所定义。
在一个实施方案中，式I的ADC具有式IV的结构：
其中变量W、X、Y、Z、RP和n如上对式I和式II所定义。
在一个实施方案中，式I或式III的ADC衍生自具有如下结构(CDN-A)的CDN(D)：
或其药学上可接受的盐。要理解的是，措词“衍生自”表示CDN的R1位上的氨基(-NH2)官能团共价键合至连接基上的相应位置。例如，在一些实施方案中，氨基共价键合至连接基的羰基部分，由此形成酰胺或氨基甲酸酯键。
在另一个实施方案中，式I或式IV的ADC衍生自具有如下结构(CDN-B)的CDN(D)：
或其药学上可接受的盐。要理解的是，措词“衍生自”表示CDN的R1位上的巯基(-SH)官能团共价键合至连接基上的相应位置。例如，在一些实施方案中，CDN的巯基共价键合至连接基的巯基，由此形成二硫键。
在另一个实施方案中，式I或式III的ADC衍生自具有如下结构的CDN(D)：
或其药学上可接受的盐。
在另一个实施方案中，式I或式III的ADC衍生自具有如下结构的CDN(D)：
或其药学上可接受的盐。
在另一个实施方案中，式I或式III的ADC衍生自具有如下结构的CDN(D)：
或其药学上可接受的盐。
在某些实施方案中，式I、式III或式IV的ADC的抗体或抗原结合片段靶向在肿瘤微环境中肿瘤细胞或免疫细胞上表达的特异性抗原。在具体实施方案中，式I、式III或式IV的ADC的抗体或抗原结合片段靶向受体PD-L1。在其他具体实施方案中，抗体或其抗原结合片段特异性结合癌症相关肿瘤抗原，该抗原为生长因子受体(GFR)。在某些实施方案中，癌症相关肿瘤抗原为EGFR/ErbB/HER家族GFR。
在一方面，本公开提供了通过施用治疗有效量的式I、式III或式IV的ADC诱导受试者(例如，人类患者)的免疫应答的方法。例如，式I、式III或式IV的ADC可以用于诱导人类受试者中的干扰素-β(IFNβ)。
式I、式III或式IV的ADC可以与一种或多种另外的治疗剂联用。另外的治疗剂可以在施用该另外的治疗剂之前、与之同时或在其施用它们之后施用。在一个具体实施方案中，式I、式III或式IV的ADC可以与免疫检查点抑制剂联用。例如，式I、式III或式IV的ADC可以与PD-1、PD-L1或CTLA-4的抑制剂或其组合一起施用。
在另一个实施方案中，式I、式III或式IV的ADC可以与游离CDN一起施用，该游离CDN不与式I的抗体或抗原结合片段缀合。在这类情况下，游离CDN可以与缀合至式I、式III或式IV的ADC的抗体的CDN相同或不同。
5.附图简述
图1A-1D显示了ADC-I的结构表征和活性。图1A显示了ADC-I的化学结构。图1B和1C分别显示了在使用小鼠RAW-Lucia ISG细胞和人THP1-Lucia ISG细胞的萤光素酶报告基因测定法中IFN刺激活性的效能。图1D显示了在所显示的处理下带有B16-F10肿瘤的C57BL6小鼠的肿瘤进展。对比物抗PDL1抗体为Ab-A1。
图2A-2C显示了ADC-II的结构表征和活性。图2A显示了ADC-II的化学结构。图2B和2C分别显示了在使用小鼠RAW-Lucia ISG细胞和人THP1-Lucia ISG细胞的萤光素酶报告基因测定法中IFN刺激活性的效能。
图3A-3B显示了ADC-III的结构表征和活性。图3A显示了ADC-III的化学结构。图3B显示了在使用小鼠RAW Lucia ISG细胞的萤光素酶报告基因测定法中IFN刺激活性的效能。对比物抗EGFR抗体为Ab-B1。
图4A-4F显示了ADC-IV的结构表征和活性。图4A显示了ADC-IV的化学结构。图4B显示了在使用小鼠RAW Lucia ISG细胞的萤光素酶报告基因测定法中IFN刺激活性的效能(倍数变化相对于PBS刺激的细胞)。图4C和4D分别显示了在所显示的处理下在表达EGFR的带有B16F10肿瘤的C57BL6小鼠中的肿瘤进展和存活。图4E和4F分别显示了在所显示的处理下在表达EGFR的带有B16F10肿瘤的C57BL6小鼠中的肿瘤进展和存活。对比物抗EGFR抗体为Ab-B1且对比物抗PDL1抗体为Ab-A3。
图5A-5B显示ADC-V的结构表征和活性。图5A显示了ADC-V的化学结构。图5B显示了在使用小鼠RAW Lucia ISG细胞的萤光素酶报告基因测定法中IFN刺激活性的效能。对比物抗PDL1抗体为Ab-A3。
图6A-6F显示了ADC-VI的结构表征和活性。图6A显示了ADC-VI的化学结构。图6B显示了在使用小鼠RAW Lucia ISG细胞的萤光素酶报告基因测定法中IFN刺激活性的效能。图6C和6D分别显示了在所显示的处理下在表达EGFR的带有B16F10肿瘤的C57BL6小鼠中的肿瘤进展和存活。对比物抗PDL1抗体为Ab-A2。图6E和6F分别显示了在所显示的处理下在表达EGFR的带有B16F10肿瘤的C57BL6小鼠中的肿瘤进展和存活。
图7A-7F显示了ADC-VII的结构表征和活性。图7A显示了ADC-VII的化学结构。图7B显示了在使用小鼠RAW Lucia ISG细胞的萤光素酶报告基因测定法中IFN刺激活性的效能(倍数变化相对于PBS刺激的细胞)。图7C和7D分别显示了在所显示的处理下在表达EGFR的带有B16F10肿瘤的C57BL6小鼠中的肿瘤进展和存活。I.p.(腹膜内)注射在第7天、第11天和第15天进行。图7E和7F分别显示了在所显示的处理下在表达EGFR的带有B16F10肿瘤的C57BL6小鼠中的肿瘤进展和存活。I.p.注射在第7、11和15天进行。对比物抗EGFR抗体为Ab-B2且对比物抗PDL1抗体为Ab-A3。
图8A-8D显示LE ADC-VIII的结构表征和活性。图8A显示了ADC-VIII的化学结构。图8B显示了在使用小鼠RAW Lucia ISG细胞的萤光素酶报告基因测定法中IFN刺激活性的效能。图8C和8D分别显示了在所显示的处理下在表达EGFR的带有B16F10肿瘤的C57BL6小鼠中的肿瘤进展和存活。I.p.注射在第7、11和15天进行。对比物抗PDL1抗体为Ab-A3。
图9A-9D显示了ADC-IX的结构表征和活性。图9A显示了ADC-IX的化学结构。图9B显示了在使用小鼠RAW Lucia ISG细胞的萤光素酶报告基因测定法中IFN刺激活性的效能。图9C和9D分别显示了在所显示的处理下在表达EGFR的带有B16F10肿瘤的C57BL6小鼠中的肿瘤进展和存活。I.p.注射在第6、9和13天进行。对比物抗PDL1抗体为Ab-A3。
图10A-10E显示了ADC-X的结构表征和活性。图10A显示了ADC-X的化学结构。图10B显示了在使用小鼠RAW Lucia ISG细胞的萤光素酶报告基因测定法中IFN刺激活性的效能。图10C和10D分别显示了在所显示的处理下在表达EGFR的带有B16F10肿瘤的C57BL6小鼠中的肿瘤进展和存活。i.p.注射在第6天、第10天和第13天进行。对比物抗HER2抗体为Ab-C1(曲妥珠单抗)，且对比物抗PDL1抗体为Ab-A3。图10E显示了在所显示的处理下在表达EGFR的带有B16F10肿瘤的C57BL6小鼠中的肿瘤进展。I.p.和瘤内(i.t.)注射在第7天和第11天进行。
6.详细描述
本公开提供了抗体-药物缀合物(ADC)，其各自包含抗体、一个或多个环状二核苷酸(CDN)和一个或多个使所述CDN连接至所述抗体的连接基。本公开的ADC具有激动和/或结合STING并且促进免疫应答的能力。
6.1抗体-药物缀合物(ADC)
在某些实施方案中，一般而言本公开的ADC具有式I的结构：
(式I)Ab-[-L-(D)m]n
其中：
“D”表示CDN(例如，如本申请中所述的CDN，例如式II的CDN)；
“Ab”表示结合靶抗原的抗体或其结合片段；
“L”每次出现时独立地表示使一次或多次出现的D连接至Ab的连接基；
“m”表示连接至特定连接基的D出现的次数；且
“n”表示连接至Ab的连接基的数量。
在式I的某些实施方案中，m表示选自1-10的整数，包括1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一些情况下，m为1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9或1-10，例如1-2、1-3、1-4、1-5或1-6。在其他实施方案中，式I描述了ADC混合物中的ADC，其显出m值的范围，使得m为1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9或1-10，例如1-2、1-3、1-4、1-5或1-6。在某些实施方案中，式I描述了ADC混合物中的ADC，使得该混合物中超过60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的ADC具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10的m值。在一些实施方案中，式I描述了ADC混合物中的ADC，使得该混合物中超过60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的ADC具有1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9或1-10，例如1-2、1-3、1-4、1-5或1-6的m值。
在其他实施方案中，式I描述了ADC混合物中的ADC并且m被“mave”替代，其表示该混合物的m值的平均值，即，该混合物中连接至特定连接基(L)的CDN的平均数，其可以通过用该混合物中抗体-连接的CDN总数除以包含CDN的连接基(L)的总数来计算。在这类实施方案中，mave表示1-10，例如1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8或1-9，例如1-2、1-3、1-4、1-5或1-6的整数或非整数值。
在式I的一些实施方案中，n表示选自1-20的整数，包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在一些情况下，n为1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9、1-10、1-11、1-12、1-13、1-14、1-15、1-16、1-17、1-18、1-19或1-20，例如1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7或1-8。在其他实施方案中，式I描述了ADC混合物中的ADC，其显出n值的范围，使得n为1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9、1-10、1-11、1-12、1-13、1-14、1-15、1-16、1-17、1-18、1-19或1-20，例如1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9或1-10。在某些实施方案中，式I描述了ADC混合物中的ADC，使得该混合物中超过60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的ADC具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20的n值。在一些实施方案中，式I描述了ADC混合物中的ADC，使得该混合物中超过60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的ADC具有1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9、1-10、1-11、1-12、1-13、1-14、1-15、1-16、1-17、1-18、1-19或1-20，例如1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9或1-10的n值。
在其他实施方案中，式I描述ADC混合物中的ADC并且n被“nave”替代，其表示该混合物的n值的平均值，即，该混合物中连接至特定抗体(Ab)的连接基(L)的平均数，其可以通过用该混合物中抗体-连接的连接基(L)的总数除以包含连接基的抗体(Ab)的总数来计算。在这类实施方案中，nave表示1-20的整数或非整数值，例如1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9、1-10、1-11、1-12、1-13、1-14、1-15、1-16、1-17、1-18、1-19或1-20，例如1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9或1-10。
在某些实施方案中，m为1，在这种情况下，ADC具有比例为1:1的连接基与CDN并且可以用式Ia表示：
(式Ia)Ab-[-L-D]n
其中：
“D”表示CDN(例如，如本申请中所述的CDN，例如式II的CDN)；
“Ab”表示结合靶抗原的抗体或其结合片段；
“L”每次出现时独立地表示使一次或多次出现的D连接至Ab的连接基；且
“n”表示经由连接基(L)连接至Ab的D出现的次数。
在式Ia的一些实施方案中，n表示选自1-20的整数，包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在一些情况下，n为1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9、1-10、1-11、1-12、1-13、1-14、1-15、1-16、1-17、1-18、1-19或1-20，例如1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7或1-8。在其他实施方案中，式Ia描述了ADC混合物中的ADC，其显出n值的范围，使得n为1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9、1-10、1-11、1-12、1-13、1-14、1-15、1-16、1-17、1-18、1-19或1-20，例如1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7或1-8。在某些实施方案中，式Ia描述了ADC混合物中的ADC，使得该混合物中超过60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的ADC具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20的n值。在一些实施方案中，式Ia描述了ADC混合物中的ADC，使得该混合物中超过60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的ADC具有1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9、1-10、1-11、1-12、1-13、1-14、1-15、1-16、1-17、1-18、1-19或1-20，例如1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7或1-8的n值。
在其他实施方案中，式Ia描述ADC混合物中的ADC并且n被“nave”替代，其表示该混合物的n值的平均值，即，该混合物中连接至特定抗体(Ab)的连接基(L)的平均数，其可以通过用该混合物中抗体-连接的连接基(L)的总数除以包含连接基的抗体(Ab)的总数来计算。在这类实施方案中，nave表示1-20，例如为1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9、1-10、1-11、1-12、1-13、1-14、1-15、1-16、1-17、1-18、1-19或1-20，例如1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9或1-10的整数或非整数值。
本申请中所公开的ADC事实上为“模块”，因为它们各自具有上述模块组分Ab、L和D。在整个本公开中，描述了这些模块组分的各种具体的非限制性实施方案和实施例。预想的是，所述的所有具体实施方案的模块可以相互组合，如同单独明确地描述了每个具体组合。
本领域技术人员还将理解的是，本申请中所述的各种ADC可以为盐的形式，且在一些具体实施方案中，为药学上可接受的盐。
6.2环状二核苷酸(CDN)
本申请中所用的CDN包含通过两个桥基团结合的两个核苷。在某些实施方案中，CDN为2’3’-CDN，意指每个核苷包括环5-碳糖(戊糖)，其中第一个核苷在其糖的2’-位上连接至第二个核苷糖的5’-位，例如通过居间桥基团连接，形成2’-5’键，且第二个核苷在其糖的3’-位上连接至第一个核苷糖的5’-位，例如通过居间桥基团连接，形成3’-5’键。适合的实例2’3’-CDN包括2’3’-cGAMP及其类似物或衍生物，包括药学上可接受的盐。下式II的CDN为2’3’-CDN。
在其他实施方案中，CDN为3’3’-CDN，其中第一个核苷酸连接至第二个核苷酸，例如通过居间桥基团，以如上所述的类似方式通过3’-5’键，且第二个核苷酸连接至第一个核苷酸，例如通过居间桥基团，也以如上所述的类似方式通过3’-5’键。适合的实例3’3’-CDN包括3’3’-cGAMP及其类似物或衍生物，包括药学上可接受的盐。
在其他实施方案中，CDN为2’2’-CDN，其中第一个核苷酸连接至第二个核苷酸，例如通过居间桥基团，以如上所述类似方式通过2’-5’键，且第二个核苷酸连接至第一个核苷酸，例如通过居间桥基团，也以如上所述类似方式通过2’-5’键。适合的实例2’2’-CDN包括2’2’-cGAMP及其类似物或衍生物，包括药学上可接受的盐。
在其他实施方案中，CDN为3’2’-CDN，其中第一个核苷酸连接至第二个核苷酸，例如通过居间桥基团，以如上所述的类似方式通过3’-5’键，且第二个核苷酸连接至第一个核苷酸，例如通过居间桥基团，以如上所述类似方式通过2’-5’键。适合的实例3’2’-CDN包括3’2’-cGAMP及其类似物或衍生物，包括药学上可接受的盐。
6.2.1核苷
在一些情况下，CDN的每个核苷包括核碱基，该核碱基可以彼此独立地为嘧啶碱基或嘌呤碱基。例如，每个核碱基可以为规范的核碱基(例如，腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶或胞嘧啶)或非规范的、修饰的、非天然的核碱基(例如，黄嘌呤、次黄嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5,6-二氢尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-羟基甲基胞嘧啶、1-甲基胞嘧啶、2,6-二氨基嘌呤、6,8-二氨基嘌呤、2-氨基咪唑并[1,2a][1,3,5]三嗪-4(1H)-酮、6-氨基-5-硝基吡啶-2-酮、异鸟嘌呤、异胞嘧啶、5-(2,4-二氨基嘧啶)、4-硫尿嘧啶、假尿嘧啶等)。适合的核碱基包括以下针对变量B1和B2所述的核碱基。
在某些情况下，CDN包含两个核苷，这些核苷包含两个嘧啶碱基或两个嘌呤碱基或一个嘧啶碱基和一个嘌呤碱基。在一些实施方案中，两个核苷包含两个嘌呤碱基，例如腺嘌呤和鸟嘌呤，两个腺嘌呤或两个鸟嘌呤，特别是腺嘌呤和鸟嘌呤或两个腺嘌呤。应当理解，在特定核碱基或其他所定义的化学结构(例如，“腺嘌呤”)之前描述不定冠词“一”或“一个”表示考虑了规范核碱基及其修饰变体。
在一些实施方案中，CDN包含两个核苷，每个核苷包含环状5-碳糖(戊糖)、D-或L-核糖或脱氧核糖、D-或L-阿拉伯糖、D-或L-来苏糖、D-或L-木糖，或它们经修饰的形式。在某些情况下，CDN的戊糖之一(例如，核糖)在该糖的3’-位上连接至连接基(L)，例如经由3’位上的C1-6烷基(例如，C2-6烷基)，C1-6烷基任选地被羟基、巯基、氨基、C1-6烷基氨基或-PEG-OH基团取代；被羟基、巯基、氨基或C1-6烷基氨基取代；被巯基、氨基或C1-6烷基氨基取代；或被巯基或氨基取代。在其他实施方案中，CDN的戊糖之一(例如，核糖)在该糖的2’-位上连接至连接基(L)，例如经由2’位上的C1-6烷基(例如，C2-6烷基)，C1-6烷基任选地被羟基、巯基、氨基、C1-6烷基氨基或-PEG-OH基团取代；被羟基、巯基、氨基或C1-6烷基氨基取代；被巯基、氨基或C1-6烷基氨基取代；或被巯基或氨基取代。在一些实施方案中，连接基(L)通过替代羟基、巯基、氨基、C1-6烷基氨基或-PEG-OH基团的质子连接至CDN。
下面对戊糖的3’-位上基团的描述也可以适用于戊糖的2’-位上的基团。
在某些情况下，戊糖(例如，核糖)3’-位上的基团为C1-6烷基，例如C2-6烷基，其被羟基，例如-亚乙基-OH、-亚丙基-OH、-亚丁基-OH或-亚戊基-OH取代。在一些实施方案中，连接基(L)通过替代上述基团之一中的羟基的质子而连接。
在一些情况下，戊糖(例如，核糖)3’-位上的基团为C1-6烷基，例如C2-6烷基，其被巯基，例如-亚乙基-SH、-亚丙基-SH、-亚丁基-SH或-亚戊基-SH取代。在一些实施方案中，连接基(L)通过替代上述基团之一中的巯基的质子而连接。
在某些情况下，戊糖(例如，核糖)3’-位上的基团为C1-6烷基，例如C2-6烷基，其被氨基，例如-亚乙基-NH2、-亚丙基-NH2、-亚丁基-NH2或-亚戊基-NH2取代。在一些实施方案中，连接基(L)通过替代上述基团之一中的氨基的质子而连接。
在一些实施方案中，戊糖(例如，核糖)3’-位上的基团为C1-6烷基，例如C2-6烷基，其被C1-6烷基氨基，例如-亚乙基-N(C1-6烷基)H、-亚丙基-N(C1-6烷基)H、-亚丁基-N(C1-6烷基)H或-亚戊基-N(C1-6烷基)H取代。在一些实施方案中，连接基(L)通过替代上述基团之一中的C1-6烷基氨基的质子而连接。
在某些实施方案中，戊糖(例如，核糖)3’-位上的基团为C1-6烷基，例如C2-6烷基，其被-PEG-OH基团，例如-亚乙基-PEG-OH、-亚丙基-PEG-OH、-亚丁基-PEG-OH或-亚戊基-PEG-OH取代。在一些实施方案中，连接基(L)通过替代-PEG-OH基团的末端羟基的质子而连接。应当理解，“PEG”是指聚合物聚乙二醇、聚环氧乙烷或聚氧乙烯，并且具有重复结构-(O-CH2-CH2)x-，且平均分子量为200-10000g/mol，例如200、400、800、1000、2000或4000-5000、60008000或10000g/mol，包括400-8,000g/mol、400-2000g/mol、5000-10000g/mol、1000-4000g/mol、1000-6000g/mol或2000-6000g/mol，包括小于4000、5000或6000g/mol。
在一些情况下，戊糖(例如，核糖)3’-位上的基团为C2-3烷基，其被羟基、巯基、氨基、C1-6烷基氨基或-PEG-OH基团，例如-亚乙基-OH、-亚丙基-OH、-亚乙基-SH、-亚丙基-SH、-亚乙基-NH2、-亚丙基-NH2、-亚乙基-N(C1-6烷基)H、-亚丙基-N(C1-6烷基)H、-亚乙基-PEG-OH或-亚丙基-PEG-OH取代。在一些实施方案中，连接基(L)通过替代上述基团之一中的羟基、巯基、氨基或C1-6烷基氨基或-PEG-OH基团的质子而连接。
在一些情况下，戊糖(例如，核糖)3’-位上的基团为C2烷基(乙基)，其被羟基、巯基、氨基、C1-6烷基氨基或-PEG-OH基团，例如-亚乙基-OH、-亚乙基-SH,-亚乙基-NH2、-亚乙基-N(C1-6烷基)H或-亚乙基-PEG-OH取代。在一些实施方案中，连接基(L)通过替代上述基团之一中的羟基、巯基、氨基或C1-6烷基氨基或-PEG-OH基团的质子而连接。
在一些情况下，戊糖(例如，核糖)3’-位上的基团为C3烷基(丙基)，其被羟基、巯基、氨基、C1-6烷基氨基或-PEG-OH基团，例如-亚丙基-OH、-亚丙基-SH、-亚丙基-NH2、-亚丙基-N(C1-6烷基)H或-亚丙基-PEG-OH取代。在一些实施方案中，连接基(L)通过替代上述基团之一中的羟基、巯基、氨基或C1-6烷基氨基或-PEG-OH基团的质子而连接。
在某些实施方案中，CDN的戊糖之一(例如，核糖)通过3’位上取代的甲基连接至该糖的3’-位上的连接基(L)，甲基被取代，例如被羟基、巯基、氨基、C1-6烷基氨基或-PEG-OH基团取代；被羟基、巯基、氨基或C1-6烷基氨基基团取代；被巯基、氨基或C1-6烷基氨基基团取代；被巯基或氨基取代；或被巯基取代。在一些实施方案中，连接基(L)通过替代羟基、巯基、氨基、C1-6烷基氨基或-PEG-OH基团的质子连接至CDN。
在某些实施方案中，CDN包含两个核苷，其各自包括核糖，其中核糖之一经由核糖环的3’-位上的C2-6烷基(例如，C2烷基、C3烷基或C2-3烷基)连接至连接基(L)，C2-6烷基任选地被羟基、巯基、氨基、C1-6烷基氨基或-PEG-OH基团取代；任选地被羟基、巯基、氨基或C1-6烷基氨基取代；任选地被巯基、氨基或C1-6烷基氨基取代；或任选地被巯基或氨基取代；其中连接基(L)通过替代羟基、巯基、氨基、C1-6烷基氨基或-PEG-OH基团的质子连接至CDN。
在某些实施方案中，CDN包含两个核苷，其各自包括核糖，其中核糖之一经由该核糖环的3’-位上取代的乙基连接至连接基(L)，乙基被取代，例如被羟基、巯基、氨基、C1-6烷基氨基或-PEG-OH基团取代；被羟基、巯基、氨基或C1-6烷基氨基取代；被巯基、氨基或C1-6烷基氨基取代；或被巯基或氨基取代；其中连接基(L)通过替代羟基、巯基、氨基、C1-6烷基氨基或-PEG-OH基团的质子连接至CDN。
在某些实施方案中，CDN包含两个核苷，其各自包括核糖，其中核糖之一经由该核糖环的3’-位上取代的乙基连接至连接基(L)，所述取代的乙基选自-CH2CH2-OH、-CH2CH2-SH和-CH2CH2-NH2，特别地选自-CH2CH2-SH和-CH2CH2-NH2；其中连接基(L)通过替代羟基、巯基或氨基的质子连接至CDN。
6.2.2桥基团
由于它们的环状结构，CDN包括两个桥基团，它们连接上述核苷以形成CDN大环。在某些实施方案中，桥基团独立地在核苷的两个糖之间的桥中包括2-5个原子，例如3个原子。例如，-O-P(＝O)(OH)-O-可以为桥基团，其中应当理解，糖键合在末端氧原子上，且桥中存在3个原子。桥基团可以独立地在桥中仅包括杂原子、在桥中包括杂原子和碳原子二者或者在桥中仅包括碳原子。
在某些情况下，桥基团为二价磷酸酯或硫代磷酸酯或它们经修饰的变体，例如-O-P(＝O)(OH)-O-或-O-P(＝O)(SH)-O-。例如，两个桥基团可以独立地选自-O-P(O)Rp-O-、-O-P(S)Rp-O-、-O-P(O)Rp-S-、-O-P(S)Rp-S-、-S-P(O)Rp-O-、-S-P(S)Rp-O-、-S-P(O)Rp-S-或-S-P(S)Rp-S-，其中Rp如下文进一步所定义。在一些实施方案中，上述桥基团中的Rp每次出现时独立地选自羟基或巯基。
应当理解，当两个桥基团都是磷酸酯基团或其修饰的变体时，每个桥基团与上述核苷组合表示核苷酸，两组桥基团和核苷均提供环状二核苷酸。尽管如此，本申请中所公开的CDN不一定限于作为磷酸酯基团的桥基团。
6.2.3.特定的CDN
本公开提供了CDN(D)，其可以作为自身或作为式I的ADC的一部分施用。在某些情况下，CDN具有下式II的结构。应当理解，提及式I也包括提及子式Ia。同样，提及式II也包括提及其子式，例如式IIa、IIb等。式II具有如下结构：
其中
R1为C1-6烷基，例如C2-6烷基或C2-3烷基，其被羟基、巯基、氨基、C1-6烷基氨基或-PEG-OH基团取代；
R3和R4独立地为氢、卤素、C1-6烷基、C2-6烯基或C2-6炔基，其中C1-6烷基、C2-6烯基和C2-6炔基独立地任选地被一个或多个基团取代，所述基团选自卤素、巯基、羟基、羧基、C1-6烷氧基、C1-6羟基烷氧基、-OC(O)C1-6烷基、-N(H)C(O)C1-6烷基、-N(C1-3烷基)C(O)C1-6烷基、氨基、C1-6烷基氨基、二(C1-6烷基)氨基、氧代和叠氮基；
R2、R5和R6独立地为氢、卤素、羟基、叠氮基、氨基、C1-6烷基氨基、二(C1-6烷基)氨基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C2-6烯基、C3-6烯基-O-、C2-6炔基或C3-6炔基-O-，其中C1-6烷基、C1-6烷氧基、C2-6烯基、C3-6烯基-O-、C2-6炔基和C3-6炔基-O-独立地任选地被一个或多个基团取代，所述基团选自卤素、巯基、羟基、羧基、C1-6烷氧基、C1-6羟基烷氧基、-OC(O)C1-6烷基、-N(H)C(O)C1-6烷基、-N(C1-3烷基)C(O)C1-6烷基、氨基、C1-6烷基氨基、二(C1-6烷基)氨基、氧代和叠氮基；或R6和R5一起为＝CH2；或R6和R4一起形成越过包含选自亚乙基、-O-CH2-和-NH-CH2-的V2的环的桥；
V1和V2独立地为O、S或CH2；
从包含V1的环中的碳开始的BG1和从包含V2的环中的碳开始的BG2独立地为-O-P(O)Rp-O-、-O-P(S)Rp-O-、-O-P(O)Rp-S-、-O-P(S)Rp-S-、-S-P(O)Rp-O-、-S-P(S)Rp-O-、-S-P(O)Rp-S-、-S-P(S)Rp-S-、-NH-P(O)Rp-O-、-O-P(O)Rp-NH-、-NH-P(S)Rp-O-、-O-P(S)Rp-NH-或-NH-SO2-NH-；其中
Rp每次出现时独立地为羟基、巯基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C3-6烯基-O-、C3-6炔基-O-、-PEG-OH、硼烷基(-BH3 -)或-NR’R”，其中C1-6烷基、C1-6烷氧基、C3-6烯基-O-和C3-6炔基-O-独立地任选地被一个或多个基团取代，所述基团选自卤素、巯基、羟基、羧基、C1-6烷氧基、C1-6羟基烷氧基、-OC(O)C1-6烷基、-N(H)C(O)C1-6烷基、-N(C1-3烷基)C(O)C1-6烷基、氨基、C1-6烷基氨基、二(C1-6烷基)氨基、氧代和叠氮基；且
R’和R”独立地为氢或C1-6烷基，该C1-6烷基任选地被一个或多个基团取代，所述基团选自卤素、巯基、羟基、羧基、C1-6烷氧基、C1-6羟基烷氧基、-OC(O)C1-6烷基、-N(H)C(O)C1-6烷基、-N(C1-3烷基)C(O)C1-6烷基、氨基、C1-6烷基氨基、二(C1-6烷基)氨基、氧代和叠氮基；或同一氮上的R’和R”一起形成C3-5杂环；
Ra1、Rb1、Ra2和Rb2独立地为氢或C1-3烷基；且
B1和B2独立地选自：
其中
V3为O或S，特别是O；
Z1、Z2、Z3、Z4、Z5和Z6每次出现时独立地为CRz或N；
Za为O(当Z5为N时除外)或NR’；其中
Rz每次出现时独立地为氢、卤素、叠氮基、氨基、C1-6烷基氨基、二(C1-6烷基)氨基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C2-6烯基、C3-6烯基-O-、C2-6炔基、C3-6炔基-O-、-NO2,-CN、-C(O)C1-6烷基、-CO2H、-CO2C1-6烷基、-S(O)C1-6烷基、-S(O)2C1-6烷基、-C(O)NR’,-C(O)NR’R”、-SO2NR’R”、-OC(O)C1-6烷基、-NR’C(O)C1-6烷基、-N(R’)C(O)NR’R”,-N(R’)SO2NR’R”、-N(R)SO2C1-6烷基或-OC(O)NR’R”，其中
C1-6烷基、C1-6烷氧基、C2-6烯基、C3-6烯基-O-、C2-6炔基和C3-6炔基-O-每次出现时独立地任选地被一个或多个基团取代，所述基团选自卤素、巯基、羟基、羧基、C1-6烷氧基、C1-6羟基烷氧基、-OC(O)C1-6烷基、-N(H)C(O)C1-6烷基、-N(C1-3烷基)C(O)C1-6烷基、氨基、C1-6烷基氨基、二(C1-6烷基)氨基、氧代和叠氮基；且
R’和R”每次出现时独立地为氢或C1-6烷基，该C1-6烷基任选地被一个或多个基团取代，所述基团选自卤素、巯基、羟基、羧基、C1-6烷氧基、C1-6羟基烷氧基、-OC(O)C1-6烷基、-N(H)C(O)C1-6烷基、-N(C1-3烷基)C(O)C1-6烷基、氨基、C1-6烷基氨基、二(C1-6烷基)氨基、氧代和叠氮基；或同一氮上的R’和R”一起形成C3-5杂环；
或其药学上可接受的盐。
在一些情况下，当式II的CDN(D)共价键合至式I或Ia的ADC中的连接基(L)时，CDN在R1位的羟基、巯基、氨基、C1-6烷基氨基或-PEG-OH基团上共价键合至连接基。
在某些实施方案中，R1为被羟基、巯基、氨基、C1-6烷基氨基或-PEG-OH基团取代的C2-6烷基。在一些实施方案中，R1为被羟基、巯基、氨基或C1-6烷基氨基取代的C2-6烷基。在某些实施方案中，R1为被巯基、氨基或C1-6烷基氨基取代的C2-6烷基。在一些实施方案中，R1为被巯基或氨基取代的C2-6烷基。在某些实施方案中，R1为被巯基取代的C2-6烷基。在一些实施方案中，R1为被氨基取代的C2-6烷基。对于任一这些实施方案，R1可以为C2-4烷基，例如C2-3烷基，其被羟基、巯基、氨基或C1-6烷基氨基取代，例如被羟基、巯基、氨基或C1-6烷基氨基取代的乙基。
在一些实施方案中，R1为被羟基取代的C2-4烷基。在一些这样的实施方案中，R1为被羟基取代的C2烷基。在其他这样的实施方案中，R1为被羟基取代的C3烷基。在其他这样的实施方案中，R1为被羟基取代的C4烷基。
在一些实施方案中，R1为被氨基(-NH2)取代的C2-4烷基。在一些这样的实施方案中，R1为被氨基取代的C2烷基。在其他这样的实施方案中，R1为被氨基取代的C3烷基。在其他这样的实施方案中，R1为被氨基取代的C4烷基。
在一些实施方案中，R1为被巯基(-SH)取代的C2-4烷基。在一些这样的实施方案中，R1为被巯基取代的C2烷基。在其他这样的实施方案中，R1为被巯基取代的C3烷基。在其他这样的实施方案中，R1为被巯基取代的C4烷基。
在一些实施方案中，R1为被C1-6烷基氨基取代的C2-4烷基。在一些这样的实施方案中，R1为被甲基氨基取代的C2烷基。在其他这样的实施方案中，R1为被甲基氨基取代的C3烷基。在其他这样的实施方案中，R1为被甲基氨基取代的C3烷基。
在一些实施方案中，R3和R4独立地为氢、卤素、C1-6烷基、C2-6烯基或C2-6炔基，其中C1-6烷基、C2-6烯基和C2-6炔基未被取代。在某些实施方案中，R3和R4独立地为氢、C1-6烷基或C2-6炔基，其中C1-6烷基和C2-6炔基未被取代。
在一些实施方案中，R3和R4之一为氢，而另一个为卤素、C1-6烷基、C2-6烯基或C2-6炔基，其中C1-6烷基、C2-6烯基和C2-6炔基独立地任选地被一个或多个基团取代，所述基团选自卤素、巯基、羟基、羧基、C1-6烷氧基、C1-6羟基烷氧基、-OC(O)C1-6烷基、-N(H)C(O)C1-6烷基、-N(C1-3烷基)C(O)C1-6烷基、氨基、C1-6烷基氨基、二(C1-6烷基)氨基、氧代和叠氮基。在一些实施方案中，R3和R4之一为氢，而另一个为卤素、C1-6烷基、C2-6烯基或C2-6炔基，其中C1-6烷基、C2-6烯基和C2-6炔基未被取代。在某些实施方案中，R3和R4之一为氢，而另一个为C1-6烷基或C2-6炔基，其中C1-6烷基和C2-6炔基未被取代。在一些实施方案中，R3和R4均为氢。
在某些实施方案中，R2为氢、卤素、羟基、叠氮基、氨基、C1-6烷基或C1-6烷氧基，其中C1-6烷基和C1-6烷氧基独立地任选地被一个或多个基团取代，所述基团选自卤素、巯基、羟基、羧基、C1-6烷氧基、C1-6羟基烷氧基、-OC(O)C1-6烷基、-N(H)C(O)C1-6烷基、-N(C1-3烷基)C(O)C1-6烷基、氨基、C1-6烷基氨基、二(C1-6烷基)氨基、氧代和叠氮基。在一些实施方案中，R2为氢、卤素、羟基、叠氮基、氨基、C1-6烷基或C1-6烷氧基，其中C1-6烷基和C1-6烷氧基未被取代。在某些实施方案中，R2为氢或卤素，例如氟。在一些情况下，R2为氢。
在一些实施方案中，R5和R6独立地为氢、卤素、羟基、叠氮基、氨基、C1-6烷基或C1-6烷氧基，其中C1-6烷基和C1-6烷氧基独立地任选地被一个或多个基团取代，所述基团选自卤素、巯基、羟基、羧基、C1-6烷氧基、C1-6羟基烷氧基、-OC(O)C1-6烷基、-N(H)C(O)C1-6烷基、-N(C1-3烷基)C(O)C1-6烷基、氨基、C1-6烷基氨基、二(C1-6烷基)氨基、氧代和叠氮基。在某些实施方案中，R5和R6独立地为氢、卤素、羟基、叠氮基、氨基、C1-6烷基或C1-6烷氧基，其中C1-6烷基和C1-6烷氧基未被取代。在一些实施方案中，R5和R6独立地为氢、卤素或羟基。在某些实施方案中，R5和R6一起为＝CH2。
在某些实施方案中，R5为氢，且R6为氢、卤素、羟基、叠氮基、氨基、C1-6烷基氨基、二(C1-6烷基)氨基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C2-6烯基、C3-6烯基-O-、C2-6炔基或C3-6炔基-O-，其中C1-6烷基、C1-6烷氧基、C2-6烯基、C3-6烯基-O-、C2-6炔基和C3-6炔基-O-独立地任选地被一个或多个基团取代，所述基团选自卤素、巯基、羟基、羧基、C1-6烷氧基、C1-6羟基烷氧基、-OC(O)C1-6烷基、-N(H)C(O)C1-6烷基、-N(C1-3烷基)C(O)C1-6烷基、氨基、C1-6烷基氨基、二(C1-6烷基)氨基、氧代和叠氮基。在一些实施方案中，R5为氢，且R6为氢、卤素、羟基、叠氮基、氨基、C1-6烷基或C1-6烷氧基，其中C1-6烷基和C1-6烷氧基独立地任选地被一个或多个基团取代，所述基团选自卤素、巯基、羟基、羧基、C1-6烷氧基、C1-6羟基烷氧基、-OC(O)C1-6烷基、-N(H)C(O)C1-6烷基、-N(C1-3烷基)C(O)C1-6烷基、氨基、C1-6烷基氨基、二(C1-6烷基)氨基、氧代和叠氮基。在某些实施方案中，R5为氢，且R6为氢、卤素、羟基、叠氮基、氨基、C1-6烷基或C1-6烷氧基，其中C1-6烷基和C1-6烷氧基未被取代。在一些实施方案中，R5为氢，且R6为氢、卤素(例如，氟或氯)、羟基或未取代的C1-6烷氧基(例如，甲氧基)。在一些实施方案中，R5为氢，且R6为卤素，例如氟或氯。在某些情况下，R5为氢，且R6为羟基。在其他实施方案中，R5为氢，且R6为未取代的C1-6烷氧基，例如甲氧基。
在某些实施方案中，R6为氢，且R5为氢、卤素、羟基、叠氮基、氨基、C1-6烷基氨基、二(C1-6烷基)氨基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C2-6烯基、C3-6烯基-O-、C2-6炔基或C3-6炔基-O-，其中C1-6烷基、C1-6烷氧基、C2-6烯基、C3-6烯基-O-、C2-6炔基和C3-6炔基-O-独立地任选地被一个或多个基团取代，所述基团选自卤素、巯基、羟基、羧基、C1-6烷氧基、C1-6羟基烷氧基、-OC(O)C1-6烷基、-N(H)C(O)C1-6烷基、-N(C1-3烷基)C(O)C1-6烷基、氨基、C1-6烷基氨基、二(C1-6烷基)氨基、氧代和叠氮基。在一些实施方案中，R6为氢，且R5为氢、卤素、羟基、叠氮基、氨基、C1-6烷基或C1-6烷氧基，其中C1-6烷基和C1-6烷氧基独立地任选地被一个或多个基团取代，所述基团选自卤素、巯基、羟基、羧基、C1-6烷氧基、C1-6羟基烷氧基、-OC(O)C1-6烷基、-N(H)C(O)C1-6烷基、-N(C1-3烷基)C(O)C1-6烷基、氨基、C1-6烷基氨基、二(C1-6烷基)氨基、氧代和叠氮基。在某些实施方案中，R6为氢，且R5为氢、卤素、羟基、叠氮基、氨基、C1-6烷基或C1-6烷氧基，其中C1-6烷基和C1-6烷氧基未被取代。在一些实施方案中，R6为氢，且R5为氢、卤素(例如，氟或氯)、羟基或未取代的C1-6烷氧基(例如，甲氧基)。在一些实施方案中，R6为氢，且R5为卤素，例如氟或氯。在某些情况下，R6为氢，且R5为羟基。在其他实施方案中，R5为氢，且R6为未取代的C1-6烷氧基，例如甲氧基。
在一些实施方案中，R5和R6之一为氢，而另一个为卤素，例如氟。在某些实施方案中，R5为氢，且R6为卤素，例如氟。在某些实施方案中，R6为氢，且R5为卤素，例如氟。
在某些情况下，R5和R6均为氢或卤素，例如R5和R6均为氢或R5和R6均为卤素，例如氟。
在一些实施方案中，R5为氢。在其他实施方案中，R5为羟基。在其他实施方案中，R5为卤素。例如，R5可以为氟、溴或氯。
在一些实施方案中，R6为氢。在其他实施方案中，R6为羟基。在其他实施方案中，R6为甲氧基。在其他实施方案中，R6为卤素。例如，R6可以为氟、溴或氯。
在某些实施方案中，V1和V2独立地为O或S。在一些实施方案中，V1和V2独立地为O或CH2。在一些实施方案中，V1和V2均为O。在某些实施方案中，V1和V2均为S。在某些实施方案中，V1和V2的至少一个为O。在一些实施方案中，V1和V2的至少一个为S。在某些实施方案中，V1和V2的至少一个为CH2。
在一些实施方案中，BG1和BG2独立地为-O-P(O)Rp-O-或-O-P(S)Rp-O-。在某些实施方案中，BG1和BG2的至少一个为-O-P(O)Rp-O-。在一些实施方案中，BG1和BG2的至少一个为-O-P(S)Rp-O-。在某些实施方案中，BG1为-O-P(O)Rp-O-和BG2为-O-P(S)Rp-O-。在一些实施方案中，BG1为-O-P(O)Rp-O-和BG2为-O-P(S)Rp-O-。在某些实施方案中，BG1和BG2均为-O-P(O)Rp-O-。
在某些实施方案中，Rp每次出现时独立地为羟基、巯基、C1-6烷基、硼烷基(-BH3 -)或-NR’R”。在一些实施方案中，Rp每次出现时独立地为羟基或巯基。在某些实施方案中，Rp为羟基。在一些实施方案中，Rp为巯基。在一些实施方案中，一个Rp为羟基，而另一个为巯基。
在一些实施方案中，BG1和BG2均为-O-P(O)Rp-O-，且Rp每次出现时独立地为羟基、巯基、C1-6烷基、硼烷基(-BH3 -)或-NR’R”。在某些实施方案中，BG1和BG2均为-O-P(O)Rp-O-，且Rp每次出现时独立地为羟基或巯基。在一些实施方案中，BG1和BG2均为-O-P(O)Rp-O-，且Rp为羟基。在其他实施方案中，BG1和BG2均为-O-P(O)Rp-O-，且Rp为巯基。在一些实施方案中，BG1为-O-P(O)Rp-O-，其中Rp为羟基，且BG2为-O-P(O)Rp-O-，其中Rp为巯基。在其他实施方案中，BG1为-O-P(O)Rp-O-，其中Rp为巯基，且BG2为-O-P(O)Rp-O-，其中Rp为羟基。
在某些情况下，BG1和BG2的至少一个为-NH-P(O)Rp-O-、-O-P(O)Rp-NH-、-NH-P(S)Rp-O-或-O-P(S)Rp-NH-。在一些情况下，BG1和BG2的至少一个为-NH-P(O)Rp-O-或-O-P(O)Rp-NH-。在某些实施方案中，BG1和BG2均为-NH-P(O)Rp-O-或-O-P(O)Rp-NH-。在某些情况下，BG1和BG2的至少一个为-NH-P(O)Rp-O-、-O-P(O)Rp-NH-、-NH-P(S)Rp-O-或-O-P(S)Rp-NH-；且Rp每次出现时独立地为羟基或巯基。在一些情况下，BG1和BG2的至少一个为-NH-P(O)Rp-O-或-O-P(O)Rp-NH-；且Rp每次出现时独立地为羟基或巯基。在某些实施方案中，BG1和BG2均为-NH-P(O)Rp-O-或-O-P(O)Rp-NH-；且Rp每次出现时独立地为羟基或巯基。在一些实施方案中，BG1和BG2均为-NH-P(O)Rp-O-或-O-P(O)Rp-NH-；且Rp为羟基。在其他实施方案中，BG1和BG2均为-NH-P(O)Rp-O-或-O-P(O)Rp-NH-；且Rp为巯基。
在某些实施方案中，当Rp为-NR’R”时，R’和R”独立地为氢或未取代的C1-6烷基或同一氮上的R’和R”一起形成C3-5杂环，例如吗啉、吡咯烷或哌嗪。
在某些实施方案中，B1和B2为相同的核碱基。在其他实施方案中，B1和B2为不同的核碱基。在一些实施方案中，B1和B2均为嘌呤核碱基。在某些实施方案中，B1和B2均为嘧啶核碱基。在一些实施方案中，B1为嘌呤核碱基，且B2为嘧啶核碱基。在某些实施方案中，B1为嘧啶核碱基，且B2为嘌呤核碱基。
在一些情况下，B1和B2独立地选自腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶和胞嘧啶以及它们经修饰的变体。在某些实施方案中，B1和B2均为腺嘌呤或其经修饰的变体。在一些实施方案中，B1和B2均为鸟嘌呤或其经修饰的变体。在某些实施方案中，B1为鸟嘌呤或其经修饰的变体，且B2为腺嘌呤或其经修饰的变体。在一些实施方案中，B1为腺嘌呤或其经修饰的变体，且B2为鸟嘌呤或其经修饰的变体。
在一些实施方案中，B1和B2独立地选自：
其中
Z1、Z2、Z3、Z4、Z5和Z6每次出现时独立地为CRz或N；
Za为O(当Z5为N时除外)或NR’；其中
Rz每次出现时独立地为氢、卤素、叠氮基、氨基、C1-6烷基氨基、二(C1-6烷基)氨基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、-C(O)C1-6烷基、-CO2H、-CO2C1-6烷基、-C(O)NR’,-C(O)NR’R”,-OC(O)C1-6烷基、-NR’C(O)C1-6烷基、-N(R’)C(O)NR’R”或-OC(O)NR’R”，其中
C1-6烷基和C1-6烷氧基每次出现时独立地任选地被一个或多个基团取代，所述基团选自卤素、巯基、羟基、羧基、C1-6烷氧基、C1-6羟基烷氧基、-OC(O)C1-6烷基、-N(H)C(O)C1-6烷基、-N(C1-3烷基)C(O)C1-6烷基、氨基、C1-6烷基氨基、二(C1-6烷基)氨基、氧代和叠氮基；且
R’和R”每次出现时独立地为氢或C1-6烷基，该C1-6烷基任选地被一个或多个基团取代，所述基团选自卤素、巯基、羟基、羧基、C1-6烷氧基、C1-6羟基烷氧基、-OC(O)C1-6烷基、-N(H)C(O)C1-6烷基、-N(C1-3烷基)C(O)C1-6烷基、氨基、C1-6烷基氨基、二(C1-6烷基)氨基、氧代和叠氮基；或同一氮上的R’和R”一起形成C3-5杂环。
在一些实施方案中，对于B1和B2，一次或两次出现的Z1为CRz(例如，CH或CNH2)。在某些实施方案中，一次或两次出现的Z5为CRz(例如，CH或CNH2)。在一些实施方案中，一次或两次出现的Z1为CRz(例如，CH或CNH2)，且一次或两次出现的Z5为CRz(例如，CH或CNH2)。在某些实施方案中，两次出现的Z1为CRz(例如，CH或CNH2)，且两次出现的Z5为CRz(例如，CH或CNH2)。
在某些情况下，对于B1和B2，Z3为CRz(例如，CH或CNH2)。在某些实施方案中，Z3为CRz(例如，CH或CNH2)，且一次或两次出现的Z1为CRz(例如，CH或CNH2)。在某些实施方案中，Z3为CRz(例如，CH或CNH2)，且一次或两次出现的Z5为CRz(例如，CH或CNH2)。在某些实施方案中，Z3为CRz(例如，CH或CNH2)，两次出现的Z1为CRz(例如，CH或CNH2)，且两次出现的Z5为CRz(例如，CH或CNH2)。
在一些情况下，对于B1和B2，Za为NR’,例如NH或NC1-6烷基。在其他实施方案中，Za为O。
在实施方案实例中，一次或两次出现的Z2为N。在某些实施方案中，Z4为N。在一些实施方案中，一次或两次出现的Z2为N，且Z4为N。在某些实施方案中，两次出现的Z2为N，且Z4为N。
在实施方案实例中，一次或两次出现的Z6为N。在某些实施方案中，Z4为N。在一些实施方案中，一次或两次出现的Z6为N，且Z4为N。在某些实施方案中，两次出现的Z6为N，且Z4为N。在一些实施方案中，一次或两次出现的Z6为N，且一次或两次出现的Z2为N。在一些实施方案中，两次出现的Z6为N，且两次出现的Z2为N。
在一些实施方案中，B1和B2独立地选自：
其中
Z1、Z3和Z5每次出现时独立地为CRz或N；
Za为O(当Z5为N时除外)或NR’；其中
Rz每次出现时独立地为氢、卤素、叠氮基、氨基、C1-6烷基氨基、二(C1-6烷基)氨基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、-C(O)C1-6烷基、-CO2H、-CO2C1-6烷基、-C(O)NR’,-C(O)NR’R”,-OC(O)C1-6烷基、-NR’C(O)C1-6烷基、-N(R’)C(O)NR’R”或-OC(O)NR’R”，其中
C1-6烷基和C1-6烷氧基每次出现时独立地任选地被一个或多个基团取代，所述基团选自卤素、巯基、羟基、羧基、C1-6烷氧基、C1-6羟基烷氧基、-OC(O)C1-6烷基、-N(H)C(O)C1-6烷基、-N(C1-3烷基)C(O)C1-6烷基、氨基、C1-6烷基氨基、二(C1-6烷基)氨基、氧代和叠氮基；且
R’和R”每次出现时独立地为氢或C1-6烷基，该C1-6烷基任选地被一个或多个基团取代，所述基团选自卤素、巯基、羟基、羧基、C1-6烷氧基、C1-6羟基烷氧基、-OC(O)C1-6烷基、-N(H)C(O)C1-6烷基、-N(C1-3烷基)C(O)C1-6烷基、氨基、C1-6烷基氨基、二(C1-6烷基)氨基、氧代和叠氮基；或同一氮上的R’和R”一起形成C3-5杂环。
在一些实施方案中，B1和B2独立地选自：
其中
Za为NR’；其中
Rz每次出现时独立地为氢、卤素、叠氮基、氨基、C1-6烷基氨基、二(C1-6烷基)氨基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、-C(O)C1-6烷基、-CO2H、-CO2C1-6烷基、-C(O)NR’、-C(O)NR’R”、-OC(O)C1-6烷基、-NR’C(O)C1-6烷基、-N(R’)C(O)NR’R”或-OC(O)NR’R”，其中
C1-6烷基和C1-6烷氧基每次出现时独立地任选地被一个或多个基团取代，所述基团选自卤素、巯基、羟基、羧基、C1-6烷氧基、C1-6羟基烷氧基、-OC(O)C1-6烷基、-N(H)C(O)C1-6烷基、-N(C1-3烷基)C(O)C1-6烷基、氨基、C1-6烷基氨基、二(C1-6烷基)氨基、氧代和叠氮基；且
R’和R”每次出现时独立地为氢或C1-6烷基，该C1-6烷基任选地被一个或多个基团取代，所述基团选自卤素、巯基、羟基、羧基、C1-6烷氧基、C1-6羟基烷氧基、-OC(O)C1-6烷基、-N(H)C(O)C1-6烷基、-N(C1-3烷基)C(O)C1-6烷基、氨基、C1-6烷基氨基、二(C1-6烷基)氨基、氧代和叠氮基；或同一氮上的R’和R”一起形成C3-5杂环。
在某些实施方案中，B1和B2独立地选自：
在某些实施方案中，Ra1、Rb1、Ra2和Rb2均为氢。在一些实施方案中，Ra1、Rb1、Ra2和Rb2的至少一个为C1-3烷基，例如甲基。在某些情况下，Ra1和Ra2为C1-3烷基，例如甲基。在一些实施方案中，Ra1、Rb1、Ra2和Rb2之一为C1-3烷基，例如甲基。
在某些情况下，CDN具有式IIa的结构：
其中R1、R2、R3、R4、R5和R6；V1和V2；BG1和BG2；且B1和B2如上对式II所定义；
或其药学上可接受的盐。
在式IIa的一些实施方案中，R1为C2-4烷基，例如乙基，其被羟基、巯基或氨基取代。在式IIa的某些实施方案中，R1为C2-4烷基，例如乙基，其被巯基或氨基取代。
在某些情况下，CDN具有式IIb的结构：
其中R1、R5和R6；V1和V2；BG1和BG2；且B1和B2如上对式II所定义；
或其药学上可接受的盐。
在式IIb的一些实施方案中，R1为C2-4烷基，例如乙基，其被羟基、巯基或氨基取代。在式IIb的某些实施方案中，R1为C2-4烷基，例如乙基，其被巯基或氨基取代。
在某些情况下，CDN具有式IIc的结构：
其中R1、R5和R6；BG1和BG2；且B1和B2如上对式II所定义；
或其药学上可接受的盐。
在式IIc的一些实施方案中，R1为C2-4烷基，例如乙基，其被羟基、巯基或氨基取代。在式IIc的某些实施方案中，R1为C2-4烷基，例如乙基，其被巯基或氨基取代。
在某些情况下，CDN具有式IId的结构：
其中R1、R5、R6和RP；V1和V2；且B1和B2如上对式II所定义；
或其药学上可接受的盐。
在式IId的一些实施方案中，R1为C2-4烷基，例如乙基，其被羟基、巯基或氨基取代。在式IId的某些实施方案中，R1为C2-4烷基，例如乙基，其被巯基或氨基取代。
在某些情况下，CDN具有式IIe的结构：
其中R1、R5、R6和RP；且B1和B2如上对式II所定义；
或其药学上可接受的盐。
在式IIe的一些实施方案中，R1为C2-4烷基，例如乙基，其被羟基、巯基或氨基取代。在式IIe的某些实施方案中，R1为C2-4烷基，例如乙基，其被巯基或氨基取代。
在某些情况下，CDN具有式IIf的结构：
其中
Y和Z独立地为CH或N；且
R1、R5、R6、RP和B1如上对式II所定义；
或其药学上可接受的盐。
在式IIf的一些实施方案中，R1为C2-4烷基，例如乙基，其被羟基、巯基或氨基取代。在式IIf的某些实施方案中，R1为C2-4烷基，例如乙基，其被巯基或氨基取代。
在某些情况下，CDN具有式IIg的结构：
其中
W和X独立地为CH或N；且
R1、R5、R6、RP和B2如上对式II所定义；
或其药学上可接受的盐。
在式IIg的一些实施方案中，R1为C2-4烷基，例如乙基，其被羟基、巯基或氨基取代。在式IIg的某些实施方案中，R1为C2-4烷基，例如乙基，其被巯基或氨基取代。
在某些情况下，CDN具有式IIh的结构：
其中
W、X、Y和Z独立地为CH或N；且
R1、R5、R6和RP如上对式II所定义；
或其药学上可接受的盐。
在式IIh的一些实施方案中，R1为C2-4烷基，例如乙基，其被羟基、巯基或氨基取代。在式IIh的某些实施方案中，R1为C2-4烷基，例如乙基，其被巯基或氨基取代。
在某些情况下，CDN具有式IIi的结构：
其中
W、X、Y和Z独立地为CH或N；且
R1、R5、R6和RP如上对式II所定义；
或其药学上可接受的盐。
在式IIi的一些实施方案中，R1为C2-4烷基，例如乙基，其被羟基、巯基或氨基取代。在式IIi的一些实施方案中，R1为C2-4烷基，例如乙基，其被巯基或氨基取代。
在某些情况下，CDN具有式IIj的结构：
其中
W、X、Y和Z独立地为CH或N；且
R1、R5、R6和RP如上对式II所定义；
或其药学上可接受的盐。
在式IIj的一些实施方案中，R1为C2-4烷基，例如乙基，其被羟基、巯基或氨基取代。在式IIj的某些实施方案中，R1为C2-4烷基，例如乙基，其被巯基或氨基取代。
在某些情况下，CDN具有式IIk的结构：
其中
W、X、Y和Z独立地为CH或N；且
R1和RP如上对式II所定义；
或其药学上可接受的盐。
在式IIk的一些实施方案中，R1为C2-4烷基，例如乙基，其被羟基、巯基或氨基取代。在式IIk的某些实施方案中，R1为C2-4烷基，例如乙基，其被巯基或氨基取代。
在某些情况下，CDN具有式IIm的结构：
其中
R1为C2-4烷基，例如乙基，其被巯基或氨基取代；
X和Z独立地为CH或N；
RP每次出现时独立地为羟基或巯基；
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，CDN具有式IIn的结构：
其中
X和Z独立地为CH或N；且
RP每次出现时独立地为羟基或巯基；
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，CDN具有式IIo的结构：
其中
X和Z独立地为CH或N；且
RP每次出现时独立地为羟基或巯基；
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，在式IId-k和IIm-o中，两次出现的RP为羟基。在某些实施方案中，在式IId-k和IIm-o中，两次出现的RP为巯基。在一些实施方案中，在式IId-k和IIm-o中，对应于BG1的出现的RP(上左RP)为羟基，且对应于BG2的出现的RP(下右RP)为巯基。在某些实施方案中，在式IId-k和IIm-o中，对应于BG1的出现的RP为巯基，且对应于BG2的出现的RP为羟基。
在一个实施方案中，CDN具有如下结构(CDN-A)：
或其药学上可接受的盐。
在一个实施方案中，CDN具有如下结构：
或其药学上可接受的盐。
在一个实施方案中，CDN具有如下结构：
或其药学上可接受的盐。
在一个实施方案中，CDN具有如下结构：
或其药学上可接受的盐。
在一个实施方案中，CDN具有如下结构(CDN-B)：
或其药学上可接受的盐。
在一个实施方案中，CDN具有如下结构：
或其药学上可接受的盐。
在一个实施方案中，CDN具有如下结构：
或其药学上可接受的盐。
在一个实施方案中，CDN具有如下结构：
或其药学上可接受的盐。
本公开提供了通过经连接基将式II的CDN(例如，CDN-A或CDN-B)缀合至抗体来制备式I的ADC的方法。式II的CDN可以经由可裂解型或不可裂解型连接基与抗体缀合。在特定的实施方案中，CDN在连接基裂解时释放到肿瘤细胞、癌症相关免疫细胞或肿瘤微环境中。
在式I的ADC中，其中CDN(D)具有式II(例如，CDN-A或CDN-B)，CDN可以在式II的CDN的R1的羟基、巯基、氨基、C1-6烷基氨基或-PEG-OH基团上共价键合至连接基(L)。应当理解，式II的CDN也可以不与连接基(L)或ADC结合，且可以在本申请中所述的方法中单独地、与本申请中所述的ADC组合、与其他活性剂(例如，免疫肿瘤学药剂，例如免疫检查点抑制剂，包括抗PD1、抗PD-L1和抗CTLA-4抗体)组合或与本申请中所述的ADC与其他活性剂(例如，免疫肿瘤学药剂)组合施用。
式II的CDN(例如，CDN-A或CDN-B)在单独使用或作为式I的ADC的组分使用时能够激动STING。在特定的实施方案中，CDN可以经由连接基缀合至抗体或抗原结合片段。如本申请中所公开的，CDN可以通过式II的CDN的R1的羟基、氨基、巯基、C1-6烷基氨基或-PEG-OH基团与连接基上的相应基团之间的化学反应共价键合至连接基。换言之，在一些实施方案中，CDN通过CDN的R1上出现的如下键之一连接至连接基(L)：R1-O-L、R1-NH-L、R1-S-L、R1-N(C1-6烷基)-L或R1-PEG-O-L，其中R1表示R1部分的其余部分，不包括R1的羟基、氨基、巯基、C1-6烷基氨基或-PEG-OH基团。下面描述特定的抗体、抗原结合片段和连接基。
6.3.抗体和抗原结合片段
如本申请中所用，术语“抗体”是指特异性结合特定靶抗原的免疫球蛋白分子。抗体可以具有人类来源或非人类来源。抗体可以经由连接基与第6.2节中描述的CDN缀合。事实上抗体可以为多克隆的、单克隆的、基因工程改造的和/或以其他方式修饰的。构成本公开的ADC的抗体适合施用于人，例如作为人源化抗体或完全人抗体。
抗体包含重链和轻链，其具有被称作互补决定区(CDR)的高变区，该区介导抗体与靶抗原的结合。抗体一般包括重链和轻链，重链包含具有三个CDR的可变区(VH)，即VH CDR#1、VH CDR#2和VH CDR#3，轻链包含具有三个CDR的可变区(VL)，即VL CDR#1、VL CDR#2和VLCDR#3。本公开的ADC的具体实施方案包括，但不限于包含抗体和/或抗原结合片段的那些，其包括这些示例性CDR和/或VH和/或VL序列。
构成本公开的ADC的抗体可以为全长抗体的形式，其可以具有或来源于任何抗体同种型，包括例如，IgA、IgD、IgE、IgG、IgM或IgY。在一些实施方案中，构成ADC的抗体为IgG(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)。在一些实施方案中，抗体包含抗体的恒定区的全部或部分。
构成本公开的ADC的抗体可以为双特异性抗体、双可变结构域抗体、多链或单链抗体、单结构域抗体、骆驼化抗体、scFv-Fc抗体、替代抗体(包括替代轻链构建体)等。
本公开的ADC可以包含全长(完整)抗体分子，以及抗原结合片段。如本申请中所用，术语“片段”是指完整抗体的一部分，其包含比完整抗体更少的氨基酸残基。如本申请中所用，术语“抗原结合片段”是指抗体的多肽片段，它介导与抗原的结合或与完整抗体竞争抗原结合。适合的示例性抗原结合片段包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、scFv、dAb、Fd或具有足够结合框架的分离的互补决定区(CDR)。正如本领域技术人员会理解的，可以通过分子工程改造或通过完整抗体或抗体链的化学或酶处理或通过重组方式得到片段。
抗体或其抗原结合片段不限于特定的产生或生产方法，并且可以使用众所周知的技术，例如杂交瘤技术、重组技术、噬菌体展示技术、转基因动物或它们的一些组合进行制备。
6.4.靶抗原和抗体
本公开中所关注的构成ADC的抗体或其抗原结合片段特异性结合一种或多种癌症相关肿瘤或免疫细胞相关抗原。
在某些实施方案中，癌症相关肿瘤或免疫细胞相关抗原为T细胞共抑制分子。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段特异性结合肿瘤相关抗原，该肿瘤相关抗原选自PD-L1、PD-L2、CD47、CD80、CD86、HVEM、UL144、CD155、CD112、CD113、半乳凝集素-1、半乳凝集素-3、半乳凝集素-9、CD48、LIGHT、BTLA和CD160。在一些实施方案中，肿瘤相关抗原为结合T细胞分子的分子，所述T细胞分子选自BTLA、Tim-3、PD-1、CTLA-4、TIGIT、CD244和CD223。
在一些实施方案中，抗体为抗PD-L1抗体，例如阿替珠单抗(atezolizumab)、杜瓦单抗(durvalumab)、阿维鲁单抗(avelumab)或其抗原结合片段或具有与其等同的氨基酸序列的抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，抗体为抗CD47抗体，例如Hu5F9-G4、IBI188、CC-90002、ZL1201、TTI-621、AO-176、SGN-CD47M的抗体、ALX148的抗原结合结构域，或它们的抗原结合片段，或具有与其等同的氨基酸序列的抗体或其抗原结合片段。
在其他实施方案中，抗体或其抗原结合片段特异性结合癌症相关肿瘤抗原，该癌症相关肿瘤抗原为生长因子受体(GFR)。在某些实施方案中，癌症相关肿瘤抗原为EGFR/ErbB/HER家族GFR。在一些实施方案中，癌症相关肿瘤抗原选自EGFR/HER1(ErbB1)、HER2/c-Neu(ErbB2)、Her3(ErbB3)和Her4(ErbB4)受体。在某些实施方案中，癌症相关肿瘤抗原为IGFR家族GFR。在一些实施方案中，癌症相关肿瘤抗原为IGF1R或IGF2R受体。在某些实施方案中，癌症相关肿瘤抗原为TGF-βR(TβR)家族GFR。在一些实施方案中，癌症相关肿瘤抗原为TβR I或TβR II受体。在某些实施方案中，癌症相关肿瘤抗原为VEGFR家族GFR。在一些实施方案中，癌症相关肿瘤抗原为VEGFR1、VEGFR2或VEGFR3受体。在某些实施方案中，癌症相关肿瘤抗原为PDGFR家族GFR。在一些实施方案中，癌症相关肿瘤抗原为PDGFR-α或PDGFR-β受体。在某些实施方案中，癌症相关肿瘤抗原为FGFR家族GFR。在一些实施方案中，癌症相关肿瘤抗原为FGFR1、FGFR2、FGFR3或FGFR4受体。
在一些实施方案中，抗体为抗EGFR/HER1(ErbB1)抗体，例如西妥昔单抗(cetuximab)、帕木单抗(panitumumab)、奈昔木单抗(necitumumab)或它们的抗原结合片段，或具有与其等同的氨基酸序列的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体为抗HER2(ErbB2)抗体，例如曲妥珠单抗(trastuzumab)、培妥珠单抗(pertuzumab)或它们的抗原结合片段，或具有与其等同的氨基酸序列的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体为抗VEGFR2抗体，例如雷莫芦单抗(ramucirumab)或其抗原结合片段或具有与其等同的氨基酸序列的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体为抗PDGFR-α抗体，例如奥拉单抗(olaratumab)或其抗原结合片段或具有与其等同的氨基酸序列的抗体或其抗原结合片段。
在其他实施方案中，抗体或其抗原结合片段特异性结合淋巴瘤相关抗原。在某些实施方案中，淋巴瘤相关抗原为CD20、CD30、CD19/CD3、CD22或CD33。
在一些实施方案中，抗体为抗CD20抗体，例如利妥昔单抗(rituximab)、替伊莫单抗(ibritumomab)、奥法单抗(ofatumumab)、奥妥珠单抗(obinutuzumab)或它们的抗原结合片段，或具有与其等同的氨基酸序列的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体为抗CD30抗体，例如本妥昔单抗(brentuximab)或其抗原结合片段或具有与其等同的氨基酸序列的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体为抗CD19/CD3抗体，例如博纳吐单抗(blinatumomab)或其抗原结合片段或具有与其等同的氨基酸序列的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体为抗CD22抗体，例如奥英妥珠单抗(inotuzumab)或其抗原结合片段或具有与其等同的氨基酸序列的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体为抗CD33抗体，例如吉姆单抗(gemtuzumab)或其抗原结合片段或具有与其等同的氨基酸序列的抗体或其抗原结合片段。
在其他实施方案中，抗体或其抗原结合片段特异性结合骨髓瘤相关抗原。在某些实施方案中，骨髓瘤相关抗原为SLAMF7或CD38。
在一些实施方案中，抗体为抗SLAMF7抗体，例如埃罗妥珠单抗(elotuzumab)或其抗原结合片段或具有与其等同的氨基酸序列的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体为抗CD38抗体，例如达雷木单抗(daratumumab)或其抗原结合片段或具有与其等同的氨基酸序列的抗体或其抗原结合片段。
在其他实施方案中，抗体或其抗原结合片段特异性结合胚细胞瘤相关抗原。在某些实施方案中，胚细胞瘤相关抗原为GD2。
在一些实施方案中，抗体为抗GD2抗体，例如地努妥昔单抗(dinutuximab)或其抗原结合片段或具有与其等同的氨基酸序列的抗体或其抗原结合片段。
在其他实施方案中，抗体或其抗原结合片段特异性结合RANK配体。
在一些实施方案中，抗体为抗RANK配体抗体，例如地诺单抗(denosumab)或其抗原结合片段或具有与其等同的氨基酸序列的抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中，抗体为结合优先在癌细胞中表达或过表达的抗原例如PD-L1和EGFR的抗体。
在一些实施方案中，抗体为结合来源于感染人细胞的微生物的抗原的抗体。
如本申请中所用，“α”和“抗”可以互换使用，例如当描述“抗PD-L1”抗体或“α-PD-L1”抗体时。
如本申请中所用，具有连字符的蛋白质名称可与其非连字符形式互换使用(即“PD-L1”和“PDL1”可互换使用)。
如本申请中所用，除非另有说明，否则免疫球蛋白氨基酸残基的编号根据Eu编号系统进行。
6.5.连接基
在本申请中所述的ADC中，CDN通过多原子连接基连接至抗体或抗原结合片段。连接基通过在连接基上的一个位置形成与CDN的共价键和在连接基上的另一个位置形成与抗体或抗原结合片段的共价键，使CDN连接至抗体或抗原结合片段。连接基相对于CDN可以为单价的(例如，在式Ia中)，使得它们将单一CDN共价连接至抗体或其片段上的单一位点。连接基也可以相对于CDN为多价的(例如，在式I中，当m>1时)，使得它们将多于一个的CDN共价连接至抗体或其片段上的单一位点。如本申请中所用，表述“连接基”预想包括连接基的未缀合、部分缀合(仅与CDN或Ab)和完全缀合(即，与CDN和Ab二者)形式。在具体实施方案中，包含抗体与连接基之间形成共价键的抗体和连接基上的官能团的部分分别具体说明为RX和RY。
事实上使CDN连接至抗体或其片段的连接基可以为长的、短的、柔性的、刚性的、亲水的或疏水的，或者可以包含具有不同特征的区段。在ADC的情况下，可用于将药物与抗体或其片段连接的广泛多样的连接基为本领域中已知。这些连接基以及其他连接基可以用于使CDN连接至本申请中所述ADC的抗体或抗原结合片段。
在某些实施方案中，连接基在链上包括2-100、2-75、2-50、2-25、2-10、5-100、5-75、5-50、5-25、5-10、10-100、10-75、10-50或10-25个原子，该链使CDN连接至抗体或抗原结合片段(包括可以衍生自CDN或抗体或抗原结合片段的连接基末端的任意原子)。同样，用于CDN-偶联的连接基的连接基(如下所述)也可以在链上包括2-100、2-75、2-50、2-25、2-10、5-100、5-75、5-50、5-25、5-10、10-100、10-75、10-50或10-25个原子，该链使CDN连接至能够偶联至抗体或抗原结合片段上的互补位点的连接基上的位点。
连接基对胞外环境和血清可以是化学稳定的，或者可以包括有意不稳定并且可以在胞外环境或肿瘤微环境中释放CDN的键。
在一些实施方案中，连接基包括被设计用于在细胞内ADC内化时释放CDN的键。在一些具体实施方案中，连接基包括被设计用于在细胞内裂解和/或消除或以其他方式特异性或非特异性降解的键。
与ADC的抗体或其抗原结合片段连接的CDN的数量可变(称作“药物与抗体比”或“DAR”)并且受到抗体或其抗原结合片段上可利用的连接位置的数量和连接至单一连接基的CDN的数量限制。在包括多于一个CDN的ADC中，每个CDN可以相同或不同。只要CDN在使用和/或存储条件下不表现出不可接受的聚集水平，考虑了具有10甚或更高的DAR的ADC。在一些实施方案中，本申请中所述的ADC具有1-10、1-9、1-8、1-7、1-6、1-5或1-4范围中的DAR。在一些实施方案中，本申请中所述的ADC可以具有2-10、2-9、2-8、2-7、2-6、2-5或2-4范围中的DAR。在某些特定的实施方案中，ADC可以具有1、2、3或4的DAR。在其他特定的实施方案，ADC可以具有5、6、7或8的DAR。在一些特定的实施方案中，ADC可以具有1的DAR。
作为实例而非限制，下文描述了可以包括在本申请中所述的ADC中的一些可裂解型和不可裂解型连接基。
6.5.1可裂解型连接基
在某些实施方案中，连接基可通过化学或酶促过程在体内裂解以释放CDN。在某些情况下，CDN从连接基上裂解，以再生相同的CDN，然后与连接基偶联。在其他实施方案中，释放的CDN为从最初与连接基偶联的CDN修饰的CDN，修饰的CDN具有来自连接基的残留官能团，但与原始CDN相比保留了功效，甚或表现出增强的功效。通常，可裂解型连接基内含一个或多个化学或酶可裂解的化学键，而连接基的其余部分是不可裂解的。
在某些实施方案中，可裂解型连接基包含化学上不稳定的基团。化学上不稳定的基团利用血浆与一些细胞质隔室之间的差异特性，例如内体和溶酶体的酸性环境或细胞溶胶中的高巯基浓度(例如，谷胱甘肽)。在某些实施方案中，包含化学上不稳定的基团的连接基的血浆稳定性可以通过使用取代基改变化学上不稳定的基团附近的空间位阻进行增加或减少。
在一些实施方案中，可裂解型连接基的化学上不稳定的基团为对酸不稳定的基团。对酸不稳定的基团可以在血液的中性pH循环期间保持完整，并在酸性条件下进行水解以释放CDN，例如在酸性肿瘤微环境中或内化至内体(pH 5.0-6.5)和溶酶体(pH 4.5-5.0)细胞隔室中时。可裂解型连接基的这种pH依赖性释放机制可以通过化学修饰例如取代来优化，以针对特定的pH精细调节CDN的释放。在一些实施方案中，可裂解型连接基包含对酸不稳定的基团，例如腙、肼、顺-乌头酰基、缩醛、原酸酯或亚胺基团。在一些实施方案中，对酸不稳定的基团在肿瘤微环境中、在肿瘤或免疫细胞的内体中、在肿瘤或免疫细胞的溶酶体中和/或在肿瘤或免疫细胞的酸性胞内隔室中或它们的任意组合中发生裂解。在一些实施方案中，对酸不稳定的基团在肿瘤微环境中、在肿瘤或免疫细胞的内体中、在肿瘤或免疫细胞的溶酶体中和/或在肿瘤或免疫细胞的酸性胞内隔室中不发生裂解。如本申请中所设想的，对酸不稳定的基团的可裂解性可以通过ADC中完整缀合的连接基的pH敏感性进行确定。对酸不稳定的连接基可以包含另外的裂解位点，例如另外的对酸不稳定的裂解位点和/或对酶不稳定的裂解位点。
在某些实施方案中，可裂解型连接基包含二硫基团。设计二硫键以在内化到细胞中时释放药物，在细胞中细胞溶胶提供了比胞外环境更还原性的环境。二硫键的断裂通常需要存在胞质硫醇辅因子，例如(还原型)谷胱甘肽(GSH)，使得包含二硫键的连接基在循环中合理稳定并选择性地在细胞溶胶中释放药物。胞内酶蛋白质二硫化物异构酶或能够裂解二硫键的类似酶也可能促进二硫键裂解。肿瘤细胞因血流不规则可以诱导缺氧状态，导致还原酶活性增强和甚至更高的谷胱甘肽浓度。
ADC，包括示例性含二硫键的连接基，包括下式：
其中
D表示CDN(例如，CDN-A或CDN-B)；
S-D的S来自CDN，Ab-NH的NH来自Ab，Ab-S的S来自Ab；
Ab表示抗体或其结合片段；
“n”表示经由连接基连接至Ab的D出现的次数；且
R每次出现时独立地为氢或C1-3烷基。
在某些实施方案中，连接基包含如下结构：
其中*-NH的NH可以来自Ab，且表示连接基直接或间接与CDN的连接点(例如，在CDN，例如CDN-A或CDN-B的R1的羟基、氨基、巯基等上)。在某些实施方案中，表示连接基与CDN的R1基团的巯基的直接连接点，其中S相邻的为R1基团的巯基的部分。
对所公开的ADC考虑到的另一种类型的可裂解型连接基为酶可裂解型连接基。此类连接基典型地基于肽或包括肽区域，并且在血浆和胞外环境中比化学上不稳定的连接基更稳定。由于与溶酶体相比更高的pH值和溶酶体蛋白水解酶的内源性抑制剂的存在，肽键在血清中通常是稳定的。从ADC中释放CDN可以通过溶酶体蛋白酶例如组织蛋白酶和纤溶酶的作用而发生，该酶可能以升高的水平存在于某些肿瘤细胞中。在一些实施方案中，溶酶体酶裂解可裂解肽。在某些实施方案中，组织蛋白酶(例如，组织蛋白酶B)或纤溶酶裂解可裂解肽。
如本领域技术人员将认识到的，直接连接于CDN的肽连接基的水解裂解可以在酰胺键水解时产生CDN的氨基酸加合物。因此，对于本公开的ADC还关注的是酶可裂解型连接基，其包含自消除型间隔基以在空间上将CDN与可裂解位点分开。使用自消除型间隔基可以消除在酰胺键水解时完全活性的化学未修饰的式II的CDN。
一种所关注的自消除型间隔基为双官能对-氨基苄醇基团，其在一端在苄型羟基上连接至被氨基甲酸酯官能化的CDN上的胺基，而在另一端在氨基上连接以与肽形成酰胺键(即，PABC基团)。在蛋白酶介导的肽裂解时，产生的CDN被活化，导致1,6-消除反应，该反应释放未修饰的CDN、二氧化碳和连接基的其余部分。在一些实施方案中，可裂解型连接基包含PABC基团。另外考虑的自消除型间隔基为已经描述的PABC的杂环变体(参见例如，US7,989,434，其通过引用并入本申请)。
在一些实施方案中，酶可裂解型连接基为非肽连接基。在某些实施方案中，非肽连接基为肽模拟物。在某些实施方案中，非肽连接基被肿瘤特异性蛋白酶裂解。在某些实施方案中，非肽连接基被在肿瘤和/或肿瘤微环境)中具有增加丰度的肿瘤特异性蛋白酶裂解。在某些实施方案中，非肽连接基被组织蛋白酶B裂解。在某些实施方案中，非肽连接基为环丁烷-1,1-二羧酰胺。
在一些实施方案中，酶可裂解型连接基为基于β-葡萄糖醛酸的连接基。β-葡糖苷酸糖苷键的裂解可以通过溶酶体酶β-葡糖醛酸糖苷酶进行，该酶大量存在于溶酶体内，并且在某些肿瘤类型中过表达，而在细胞外具有低活性。
可裂解型连接基可以包括非-可裂解型部分或区段，和/或可裂解型区段或部分可以被包括在其它非-可裂解型连接基中以使其可裂解。作为实例，聚乙二醇(PEG)和相关聚合物可以在聚合物主链中包括可裂解型基团。例如，聚乙二醇或聚合物连接基可以包括一个或多个可裂解型基团，例如二硫化物、肼、腙、二肽或环丁烷-1,1-二羧酰胺。
在某些实施方案中，连接基包含酶可裂解型肽部分，例如包含式VIIIa、VIIIb、VIIIc、VIIId、VIIIe、VIIIf或VIIIg的连接基：
其中：
“肽”表示通过溶酶体酶可裂解的肽或肽模拟物链(示例的N→C，没有显示羧基和氨基“末端”)；
T表示链(例如，聚合物链)，其包含一个或多个乙二醇单元或亚烷基链或其组合；
Ra选自氢、C1-6烷基、磺酸酯和甲基磺酸酯；
Rb选自氢、
n为2-10的整数，例如3-6，特别是5；
p为0-5的整数；
q为0-5的整数，特别是3；
w为0或1，且*-S-的-S-可以来自Ab；
x为0或1，且*-NH的NH可以来自Ab；
y为0或1；且*-NH的NH可以来自Ab；
z为0或1；
表示连接基与CDN的直接或间接连接的点(例如，在CDN，例如CDN-A或CDN-B的R1的羟基、氨基、巯基等上)；且
*表示连接基的其余部分与抗体的直接或间接连接的点；
或其盐。
在一些实施方案中，式VIIIa-d中的可裂解型肽部分或”肽”包含如下结构：
其中末端-NH-可以来自Ab，条件是x、y和w为0。
在一些实施方案中，式VIIIe中的可裂解型肽部分或“肽”包含如下结构：
其中w为1。
在某些实施方案中，式VIIIa-g中的可裂解型肽部分或”肽”包含2-20个氨基酸残基，例如2-15、2-10、2-7或2-5个残基，包括四肽、三肽或二肽。在具体实施方案中，可裂解型肽部分或”肽”包含二肽，例如选自如下的二肽：Ala-Ala、Ala-(D)Asp、Ala-Cit、Ala-Lys、Ala-Val、Asn-Cit、Asp-Cit、Asn-Lys、Asn-(D)Lys、Asp-Val、Cit-Ala,Cit-Asn、Cit-Asp、Cit-Cit、Cit-Lys、Cit-Ser、Cit-Val、Glu-Val、苯基Gly-(D)Lys、His-Val、Ile-Cit,Ile-Pro,Ile-Val、Leu-Cit、Lys-Cit、Me3Lys-Pro、Met-Lys、Met-(D)Lys、Phe-Arg、Phe-Cit、Phe-Lys、Pro-(D)Lys、Ser-Cit,Trp-Cit、Val-Ala、Val-(D)Asp、NorVal-(D)Asp、Val-Cit、Val-Glu、Val-Lys及其盐。在某些实施方案中，二肽为Val-Cit。在某些实施方案中，可裂解型肽部分或”肽”包含三肽，例如Glu-Val-Cit。在某些实施方案中，可裂解型肽部分或“肽”包含四肽，例如Gly-Phe-Leu-Gly或Ala-Leu-Ala-Leu。
在某些实施方案中，连接基具有式VIIIa并且包含如下结构：
其中“肽”为Glu-Val-Cit。
在某些实施方案中，连接基具有式VIIIc并且包含如下结构：
其中“肽”为Val-Cit。
在某些实施方案中，式VIIId中的可裂解型肽部分或”肽”包含二肽，例如选自如下的二肽：Ala-Ala、Ala-(D)Asp、Ala-Cit、Ala-Lys、Ala-Val、Asn-Cit、Asp-Cit、Asn-Lys、Asn-(D)Lys、Asp-Val、Cit-Ala、Cit-Asn、Cit-Asp、Cit-Cit、Cit-Lys、Cit-Ser、Cit-Val、Glu-Val、苯基Gly-(D)Lys、His-Val、Ile-Cit、Ile-Pro、Ile-Val、Leu-Cit、Lys-Cit、Me3Lys-Pro、Met-Lys、Met-(D)Lys、Phe-Arg、Phe-Cit、Phe-Lys、Pro-(D)Lys、Ser-Cit、Trp-Cit、Val-Ala、Val-(D)Asp、NorVal-(D)Asp、Val-Cit、Val-Glu、Val-Lys及其盐。在某些实施方案中，式VIIId中的二肽为Val-Cit。在某些实施方案中，式VIIId中的可裂解型肽部分或“肽”包含三肽，例如Glu-Val-Cit。在某些实施方案中，式VIIId中的可裂解型肽部分或“肽”包含四肽，例如Gly-Phe-Leu-Gly或Ala-Leu-Ala-Leu。
在某些实施方案中，连接基具有式VIIId并且包含如下结构：
其中“肽”为Val-Cit。
在某些实施方案中，连接基具有式VIIIe并且包含如下结构：
其中“肽”为
6.5.2用于将连接基连接至抗体的基团
多种连接基可以用于使连接基-CDN合成子连接至抗体以产生ADC。事实上连接基-CDN合成子上的连接基通常为亲电子的。在一些实施方案中，连接基选自马来酰亚胺基；活化的二硫化物，例如DSDM、SPDB或磺基-SPDB；活性酯，例如NHS酯或HOBt酯；卤代甲酸酯、酰卤和烷基卤或苄基卤，例如卤代乙酰胺。在某些实施方案中，连接基(L)与抗体(Ab)之间产生的键为硫醚、酰胺、酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、脲、二硫化物或醚。
对所公开的ADC还关注的为“自稳定”的马来酰亚胺和“桥接二硫化物”。在US2013/0309256中提供了“自稳定”的马来酰亚胺基团的实例，该文献通过引用并入本申请。Badescu等人,2014,Bioconjugate Chem.25:1124-1136和WO 2013/085925中提供了“桥接二硫化物”的实例，其各自通过引用并入本申请。
6.5.3具有组织蛋白酶可裂解型连接基的ADC
如上所述，在本公开的一些实施方案中，CDN(例如，CDN-A或CDN-B)和构成本公开的ADC的抗体经由组织蛋白酶可裂解型连接基连接。在一个这样的实施方案中，ADC具有式III的结构：
其中变量W、X、Y、Z、RP和n如上对式I和II所定义。在上述方案中，表示组织蛋白酶可裂解型连接基连接抗体或其抗原结合片段(Ab)的共价键。
在一个实施方案中，式III的连接基的吡咯烷-2,5-二酮基团通过巯基在其3-位上连接至抗体(Ab)。例如，吡咯烷-2,5-二酮可以通过抗体上的半胱氨酸残基在其3-位上共价键合至抗体。得到的ADC具有式IIIa的结构：
其中变量W、X、Y、Z、RP和n如上对式I和II所定义。
在一个实施方案中，ADC具有如下结构：
6.54.具有谷胱甘肽可裂解型连接基的ADC
如上所述，在本公开的一些实施方案中，CDN(例如，CDN-A或CDN-B)和构成本公开的ADC的抗体通过谷胱甘肽可裂解型连接基连接。在一个这样的实施方案中，ADC具有式IV的结构：
其中变量W、X、Y、Z、RP和n如上对式I和II中所定义。在上述方案中，表示谷胱甘肽可裂解型连接基连接抗体(Ab)的共价键。
在一个实施方案中，式IV的连接基的羰基可以通过带有含氨基的侧链的抗体上的赖氨酸或其他氨基酸残基与抗体共价连接，例如通过与在连接至羰基的键上的氨基形成酰胺键。得到的ADC具有式IVa的结构：
其中变量W、X、Y、Z、RP和n如上对式I和II中所定义。
在一个实施方案中，ADC具有如下结构：
6.6制备抗体-药物缀合物的方法
一般而言，根据式I的ADC可以根据下方案制备：
Ab-RX+RY-L-(D)m→(式I)Ab-[-L-(D)m]n
其中Ab、L、D、m和n如此前对式I所定义，且RX和RY表示能够彼此形成共价键的互补基团。
相关地，根据式Ia的ADC可以根据下列方案制备：
Ab-RX+RY-L-D→(式Ia)Ab-[-L-D]n
其中Ab、L、D和n如此前对式I所定义，且RX和RY表示如上所述能够彼此形成共价键的互补基团。
基团RX和RY的身份取决于用于连接合成子RY-L-(D)m或RY-L-D至抗体的化学。合成子典型地连接至抗体的氨基酸残基的侧链，包括，例如可利用的半胱氨酸残基的游离巯基或可利用的赖氨酸残基的伯氨基。在一些实施方案中，RX为抗体氨基酸的侧链上的基团，例如氨基或巯基。在某些实施方案中，RX为氨基酸，例如赖氨酸、5-羟基赖氨酸、鸟氨酸或抑胃酶氨酸，特别是赖氨酸，侧链上的氨基。在一些实施方案中，RX为氨基酸，例如半胱氨酸或高半胱氨酸，特别是半胱氨酸，侧链上的巯基。在这类键中，可以通过首先完全或部分还原抗体以破坏半胱氨酸之间的链间二硫键得到游离巯基。许多官能团RY和化学可以用于与巯基形成键，且作为实例，包括，但不限于马来酰亚胺和卤代乙酰基。
对所公开的ADC还考虑的是工程改造的抗体，该抗体具有对一个或多个密码子的突变以破坏一个或多个二硫键，并且作为实例，包括，但不限于将链间二硫键的单个半胱氨酸残基突变为丝氨酸残基以由未配对的半胱氨酸产生游离巯基。对所公开的ADC还考虑了工程改造的抗体，该抗体具有对一个或多个密码子的突变以导入具有用于连接基缀合的巯基的残基，并且例如包括，但不限于一个或多个残基的突变为半胱氨酸残基或将额外的半胱氨酸残基掺入抗体或其抗原结合片段的氨基酸序列。
在某些实施方案中，RX为巯基，例如来自抗体上的半胱氨酸残基，且RY为选自卤代乙酰基、马来酰亚胺、氮丙啶、丙烯酰基、乙烯基砜、吡啶基二硫化物、TNB-硫醇和烷基化剂或芳基化剂的基团。在一些实施方案中，RX为巯基，例如来自抗体上的半胱氨酸残基，且RY为马来酰亚胺基。在一些实施方案中，RX为赖氨酸残基的伯氨基。许多官能团RX和化学可以用于赖氨酸键，且作为实例，包括，但不限于NHS-酯和异硫氰酸酯。
在某些实施方案中，RX为胺，例如来自抗体上的赖氨酸残基，且RY为能够使该胺烷基化或酰化的基团。在一些实施方案中，RX为胺，例如来自抗体上的赖氨酸残基，且RY为选自异硫氰酸酯、异氰酸酯、酰叠氮化物、NHS酯、磺酰氯、醛、乙二醛、环氧化物、环氧乙烷、碳酸酯、芳基卤、亚氨基酯、碳二亚胺、酸酐和氟苯基酯的基团。在某些实施方案中，RX为胺，例如来自抗体上的赖氨酸残基，且RY为NHS酯。
如对本公开的ADC所关注的，缀合化学不限于可利用的侧链基团。抗体还可以被工程改造成包括用于缀合的氨基酸残基，并且作为实例，包括，但不限于通过将适当的小分子连接至胺将侧链例如胺转化为其他有用的基团，例如巯基。例如，氨基酸的含伯胺的侧链可以被转化成含巯基的侧链，例如-NH-C1-6烷基-SH，包括-NH-CH2-CH2-SH，其中-NH-来自伯胺。
正如本领域技术人员会理解的，连接至抗体分子的CDN的数量可变，产生异质ADC制备物，其中一些抗体包含一个连接的CDN、一些抗体包含两个、一些抗体包含三个等(以及有些没有)。异质性的程度将取决于用于连接CDN的化学方法等。例如，当IgG1抗体被还原以得到用于连接的巯基时，通常产生每个分子具有0、1、2、3、4、5、6、7或8个连接的CDN的抗体的异质混合物。此外，通过调整RX与RY的摩尔比，可以生产每分子具有0、1、2、3、4、5、6、7或8个连接的CDN的ADC。因此，将要理解的是，根据上下文，所述的药物与抗体的比率(DAR)可以为ADC集合的平均值。例如“DAR3”是指其中平均药物与抗体比率为3的异质ADC制备物，例如具有相等数量的DAR2和DAR4的ADC的混合物。
如本领域中已知的，可以通过多种方法评估纯度。作为一个具体的实例，可以通过HPLC、疏水交换、离子交换、尺寸排阻或其他色谱法分析ADC制备物，并通过分析所得峰的曲线下面积来评估纯度。
在一些实施方案中，本公开涉及制备ADC的方法，其包括(a)偶联一个或多个本公开的CDN(即，式II的CDN)至连接基(例如，如本申请中所述的L)，生成一个或多个CDN-偶联的连接基；以及(b)使CDN-偶联的连接基的一个或多个偶联至抗体或其抗原结合片段(例如，如本申请中所述的Ab)，生成ADC。
在某些实施方案中，本公开涉及制备ADC的方法，其包括(b)使CDN-偶联的连接基的一个或多个(即，式II的CDN和例如本申请中所述的L)偶联至抗体或其抗原结合片段(例如，如本申请中所述的Ab)，生成ADC。
在某些实施方案中，本公开涉及制备一种或多种CDN-偶联的连接基的方法，其包括(a)偶联一个或多个本公开的CDN(即，式II的CDN)至连接基(例如，如本申请中所述的L)，生成一种或多种CDN-偶联的连接基。
在其他实施方案中，本公开涉及制备ADC的方法，其包括(a)偶联一个或多个连接基(例如，如本申请中所述的L)至抗体或其抗原结合片段(例如，如本申请中所述的Ab)，生成连接基-偶联的抗体；以及(b)偶联一个或多个本公开的CDN(即，式II的CDN)至连接基-偶联的抗体，生成ADC。
在某些实施方案中，本公开涉及制备ADC的方法，其包括(b)偶联一个或多个本公开的CDN(即，式II的CDN)至连接基-偶联的抗体或其抗原结合片段(例如，一个或多个如本申请中所述的L和例如本申请中所述的Ab)，生成ADC。
在某些实施方案中，本公开涉及制备连接基-偶联的抗体的方法，其包括：(a)偶联一个或多个连接基(例如，如本申请中所述的L)至抗体或其抗原结合片段(例如，如本申请中所述的Ab)，生成连接基-偶联的抗体。
在一些实施方案中，本公开涉及制备ADC的方法，其包括(a)偶联本公开的CDN(即，式II的CDN)至连接基(例如，如本申请中所述的L)，生成CDN-偶联的连接基；以及(b)偶联多个CDN-偶联的连接基至抗体或其抗原结合片段(例如，如本申请中所述的Ab)，生成ADC。
在其他实施方案中，本公开涉及制备ADC的方法，其包括(a)偶联多个连接基(例如，如本申请中所述的L)至抗体或其抗原结合片段(例如，如本申请中所述的Ab)，生成连接基-偶联的抗体；以及(b)偶联多个一个或多个本公开的CDN(即，式II的CDN)至连接基-偶联的抗体，生成ADC。
6.6.1.偶联前处置CDN的CDN组合物
如上所述，本公开的CDN(即，式II的CDN，例如CDN-A或CDN-B)可以偶联至连接基(例如，如本申请中所述的L)，生成一种或多种CDN-偶联的连接基，或可以偶联至连接基-偶联的抗体(例如，一种或多种如本申请中所述的L和例如本申请中所述的Ab)，生成ADC。因此，本公开提供了CDN组合物，其促进用于这些偶联步骤的CDN的纯化、干燥或处置。
在上下文中，本公开提供了CDN组合物，其包含式II(包括式II的子式，例如式IIa、IIb等)的CDN和碱，例如胺碱。在一些实施方案中，所述胺碱在室温和压力下为液体，例如吡啶、哌啶、吡咯烷、吗啉、二甲基吡啶(例如，2,6-卢剔啶)、三乙胺(TEA)或二异丙基乙胺(DIPEA)，特别是吡啶。在某些实施方案中，包含CDN和碱的CDN组合物为无水组合物，其具有低于100、50、25或10ppm的水。可以通过高度真空浓缩干燥包含CDN和碱的CDN组合物，然后用于偶联步骤。
在一些实施方案中，CDN组合物包含式II，例如式IIk、IIm、IIn或IIo的CDN和胺碱，例如吡啶。在某些实施方案中，CDN组合物包含在R1位上具有氨基的式II的CDN和胺碱，例如吡啶。在某些实施方案中，CDN组合物包含式IIn或IIo(且任选地在R1位上具有氨基)的CDN和胺碱，例如吡啶。在一些实施方案中，CDN组合物包含如本申请中所述的CDN-A或其药学上可接受的盐和胺碱，例如吡啶，且任选是无水的。在一些实施方案中，CDN组合物包含如本申请中所述的CDN-B或其药学上可接受的盐和胺碱，例如吡啶，且任选是无水的。
本公开还提供了CDN组合物，其为的水溶液，包含式II(包括式II的子式，例如式IIa，IIb等)的CDN和适合于达到5-10范围内的pH的缓冲剂，所述pH包括5-8，例如5、5.5、5.8、6、6.2、6.5、7、7.5或8的pH，包括通过使用这些pH值作为端点生成的任意pH范围，例如5-7。在某些实施方案中，所述缓冲剂适合于达到6+/-0.2的pH。在一些实施方案中，所述缓冲剂为磷酸盐缓冲剂。在一些实施方案中，CDN组合物为水溶液，其包含在R1位上具有巯基的式II，例如式IIo的CDN和适合于达到6+/-0.2的pH的缓冲剂，例如磷酸盐缓冲剂。在具体实施方案中，CDN组合物为水溶液，其包含式IIo的CDN和适合于达到6+/-0.2的pH的缓冲剂，例如磷酸盐缓冲剂。在一个实施方案中，CDN组合物为水溶液，其包含CDN-B或其药学上可接受的盐和适合于达到6+/-0.2的pH的缓冲剂，特别是磷酸盐缓冲剂。
6.6.2.使CDN偶联至连接基的CDN组合物
如上所述的CDN-偶联的连接基(即，包含式II的CDN，例如CDN-A或CDN-B，其偶联至连接基，例如本申请中所述的L)的制备可以包括使CDN偶联至连接基的一种或多种CDN组合物的制备。
在该上下文中，本公开提供了CDN组合物，其包含式II(包括式II的子式，例如式IIa、IIb等)的CDN和连接基(例如，如本申请中所述的L)或偶联剂或连接基和偶联剂二者，其中偶联剂促进CDN与连接基偶联。在一些实施方案中，偶联剂能够活化连接基以便与CDN偶联，例如提供在连接基上生成活化酯，使得随后CDN能够与连接基的活化酯反应，以使CDN偶联至连接基。适合偶联剂的实例包括羟基苯并三唑(HOBt)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、二环己基碳二亚胺(DCC)、二异丙基碳二亚胺(DIC)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和六氟磷酸氮杂苯并三唑四甲基脲鎓(HATU)。在某些实施方案中，CDN组合物还包含疏质子极性溶剂，例如二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基乙酰胺(DMA)、乙腈或四氢呋喃(THF)，特别是DMF。在某些实施方案中，包含CDN以及连接基和偶联剂的任一种或它们两者的CDN组合物为无水组合物，具有低于100、50、25或10ppm的水。
在某些实施方案中，CDN组合物包含式II，例如式IIk、IIm、IIn或IIo(并且在R1位上具有氨基或巯基)的CDN和连接基(例如，如本申请中所述的L)或偶联剂或连接基和偶联剂二者。在一些实施方案中，CDN组合物包含在R1位上具有氨基或巯基的式II的CDN和连接基或偶联剂或者连接基和偶联剂二者。在某些实施方案中，CDN组合物包含式IIn或IIo(且任选地在R1位上具有氨基或巯基)的CDN和连接基或偶联剂或者连接基和偶联剂二者。在某些实施方案中，CDN组合物包含如本申请中所述的CDN-A或CDN-B或其任一的药学上可接受的盐和连接基或偶联剂或者连接基和偶联剂二者和任选的如上所述的疏质子极性溶剂。在某些实施方案中，CDN组合物包含CDN-A或CDN-B或其任一的药学上可接受的盐、连接基和疏质子极性溶剂。在某些实施方案中，CDN组合物包含CDN-A或CDN-B或其任一的药学上可接受的盐、偶联剂和疏质子极性溶剂。
6.6.3.CDN-偶联的连接基
如上所述，CDN-偶联的连接基可能是制备本申请中所述的ADC中有用的中间体。在一些实施方案中，CDN-偶联的连接基包含偶联至连接基例如本申请中所述的L的式II的CDN(例如，CDN-A或CDN-B)。例如，CDN-偶联的连接基可以具有式L-CDN，其中L包括能够偶联至抗体或抗原结合片段上的互补位点的位点，其中CDN具有式II(包括子式，例如式IIk、IIm、IIn和IIo)，且其中CDN在式II的R1位的羟基、巯基、氨基、C1-6烷基氨基或-PEG-OH基团上共价键合至连接基。
在某些实施方案中，CDN-偶联的连接基的CDN和连接基经由硫醚、酰胺、酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、脲、二硫化物或醚基团，特别是酰胺、氨基甲酸酯或二硫基团偶联。例如，在某些实施方案中，CDN-偶联的连接基的CDN和连接基通过酰胺基团偶联。在这类实施方案中，CDN-偶联的连接基可以具有式L-C(O)NH-CDN或L-C(O)N(C1-6烷基)-CDN，其中CDN具有式II(包括子式，例如式IIk、IIm和IIn)，其中式II的R1为C1-6烷基，例如C2-6烷基或C2-3烷基，其被氨基或C1-6烷基氨基取代，它们中的任一个形成式中酰胺基团的胺部分。在一个这样的实施方案中，CDN-偶联的连接基具有式L-C(O)NH-CDN，其中CDN具有式II(包括子式，例如式IIk、IIm和IIn)，其中式II的R1为C2-3烷基，例如乙基，其被氨基取代，形成式中酰胺基团的胺部分。
在一些实施方案中，CDN-偶联的连接基具有式IXa的结构：
其中RL表示连接基L的其余部分，且变量W、X、Y、Z和RP如上对式I和II所定义。
在其他实施方案中，CDN-偶联的连接基的CDN和连接基通过氨基甲酸酯基团偶联。在这类实施方案中，CDN-偶联的连接基可以具有式L-OC(O)NH-CDN或L-OC(O)N(C1-6烷基)-CDN，其中CDN具有式II(包括子式，例如式IIk、IIm和IIn)，其中式II的R1为C1-6烷基，例如C2-6烷基或C2-3烷基，其被氨基或C1-6烷基氨基取代，它们中的任一个形成式中氨基甲酸酯基团的胺部分。在一个这样的实施方案中，CDN-偶联的连接基具有式L-OC(O)NH-CDN，其中CDN具有式II(包括子式，例如式IIk、IIm和IIn)，其中式II的R1为C2-3烷基，例如乙基，其被氨基取代，形成式中氨基甲酸酯基团的胺部分。
在一些实施方案中，CDN-偶联的连接基具有式IXb的结构：
其中RL表示连接基L的其余部分，且变量W、X、Y、Z和RP如上对式I和II所定义。
在一些实施方案中，CDN-偶联的连接基具有如下结构：
其中变量W、X、Y、Z和RP如上对式I和II所定义。
在其他实施方案中，CDN-偶联的连接基的CDN和连接基通过脲基偶联。在这类实施方案中，CDN-偶联的连接基可以具有式L-NHC(O)NH-CDN或L-NHC(O)N(C1-6烷基)-CDN，其中CDN具有式II(包括子式，例如式IIk、IIm和IIn)，其中式II的R1为C1-6烷基，例如C2-6烷基或C2-3烷基，其被氨基或C1-6烷基氨基取代，它们中的任一个形成式中脲基的最右侧胺部分。在一个这样的实施方案中，CDN-偶联的连接基具有式L-NHC(O)NH-CDN，其中CDN具有式II(包括子式，例如式IIk、IIm和IIn)，其中式II的R1为C2-3烷基，例如乙基，其被氨基取代，形成式中脲基的最右侧胺部分。
在一些实施方案中，CDN-偶联的连接基具有式IXc的结构：
其中RL表示连接基L的其余部分，且变量W、X、Y、Z和RP如上对式I和II所定义。
在其他实施方案中，CDN-偶联的连接基的CDN和连接基通过酯基偶联。在这类实施方案中，CDN-偶联的连接基可以具有式L-C(O)O-CDN，其中CDN具有式II(包括子式，例如式IIk、IIm和IIn)，其中式II的R1为C1-6烷基，例如C2-6烷基或C2-3烷基，其被羟基或-PEG-OH基团取代，它们中的任一个形成式中酯基的醇部分。在一个这样的实施方案中，CDN-偶联的连接基具有L-C(O)O-CDN，其中CDN具有式II(包括子式，例如式IIk、IIm和IIn)，其中式II的R1为C2-3烷基，例如乙基，其被羟基取代，形成式中酯基的醇部分。
在一些实施方案中，CDN-偶联的连接基具有式IXd的结构：
其中RL表示连接基L的其余部分，且变量W、X、Y、Z和RP如上对式I和II所定义。
在其他实施方案中，CDN-偶联的连接基的CDN和连接基通过碳酸酯基团偶联。在这类实施方案中，CDN-偶联的连接基可以具有式L-OC(O)O-CDN，其中CDN具有式II(包括子式，例如式IIk、IIm和IIn)，其中式II的R1为C1-6烷基，例如C2-6烷基或C2-3烷基，其被羟基或-PEG-OH基团取代，它们中的任一个形成式中碳酸酯基团的最右侧醇部分。在一个这样的实施方案中，CDN-偶联的连接基具有式L-OC(O)O-CDN，其中CDN具有式II(包括子式，例如式IIk、IIm和IIn)，其中式II的R1为C2-3烷基，例如乙基，其被羟基取代，形成式中碳酸酯基团的最右侧醇部分。
在一些实施方案中，CDN-偶联的连接基具有IXe的结构式：
其中RL表示连接基L的其余部分，且变量W、X、Y、Z和RP如上对式I和II所定义。
在其他实施方案中，CDN-偶联的连接基的CDN和连接基通过二硫基团偶联。在这类实施方案中，CDN-偶联的连接基可以具有式L-S-S-CDN，其中CDN具有式II(包括子式，例如式IIk、IIm和IIo)，其中式II的R1为C1-6烷基，例如C2-6烷基或C2-3烷基，其被巯基取代，形成式中二硫基团的最右侧部分。在一个这样的实施方案中，CDN-偶联的连接基具有式L-S-S-CDN，其中CDN具有式II(包括子式，例如式IIk、IIm和IIo)，其中式II的R1为C2-3烷基，例如乙基，其被巯基取代，形成式中二硫基团的最右侧部分。
在一些实施方案中，CDN-偶联的连接基具有式IXf的结构：
其中RL表示连接基L的其余部分，且变量W、X、Y、Z和RP如上对式I和II所定义。
在一些实施方案中，CDN-偶联的连接基具有如下结构：
其中变量W、X、Y、Z和RP如上对式I和II所定义。
6.7.药物组合物和药剂
本申请中所述的ADC和/或CDN可以为包含ADC或CDN和一种或多种载体、赋形剂和/或稀释剂的药物组合物的形式。所述组合物可以配制用于人的药物用途，并且可以包括药学上可接受的载体，例如水性的、任选缓冲的溶液、混悬液或分散液。所述组合物也可以是冻干的固体组合物，其可以在使用前重构。
本发明的药物组合物可以为任何适合的形式，并且可以通过多种途径施用于患者，例如通过静脉内、瘤内、皮下、肌内、口服、鼻内、鞘内、透皮、局部或局限性地施用于患者。在任何指定情况下的施用途径可能取决于特定抗体和/或ADC、受试者以及疾病的性质和严重程度以及受试者的身体状况。在某些实施方案中，以液体制剂的形式通过静脉内、瘤内、皮下或肌内施用药物组合物。
在一些实施方案中，本申请中所述的ADC和/或CDN，包括它们的药物组合物通过系统施用，例如皮下施用、腹膜内施用、肌内施用或静脉内施用，特别是静脉内施用。在其他实施方案中，本申请中所述的ADC和/或CDN，包括它们的药物组合物在肿瘤部位局部施用，例如通过瘤内或在肿瘤的微环境中。
本公开还提供式II的CDN(包括式II的子式，例如式IIa、IIb等)，用于制备用于疗法，例如用于促进免疫应答和/或用于治疗受试者中的癌症，包括一种或多种下文所述的各种癌症以及与一种或多种如下所述的另外的治疗剂组合。
6.8.治疗方法
在某些实施方案中，本公开的ADC(即，式I的ADC)或本公开的CDN(即，式II的CDN，例如CDN-A或CDN-B)可以用于疗法中。在一些实施方案中，本公开涉及本申请中所述的包含本公开的ADC(即，式I的ADC)或本公开的CDN(即，式II的CDN)的药物组合物，其用于疗法中。
本申请中所公开的ADC和/或CDN可以单独使用或彼此组合和/或与其他治疗剂组合使用。如以下所讨论的实施例中所示，ADC和CDN在递送至受试者时能够促进免疫应答。例如，本公开的ADC和CDN单独或组合能够在人类受试者中诱导干扰素-β(IFNβ)。本公开的ADC和CDN促进免疫应答的能力部分归因于它们激动STING的能力。ADC能够递送本公开的CDN(例如，式II的化合物)以靶向肿瘤或癌症相关免疫细胞或肿瘤微环境以触发STING的活化和产生的免疫应答。CDN与结合癌症相关肿瘤或免疫细胞抗原的抗体或其抗原结合片段的缀合靶向递送CDN并延长和增强免疫应答。
本公开的ADC能够促进免疫应答，该免疫应答比未缀合的CDN或包含ADC的抗体更大。令人惊讶地，已经发现本公开的ADC可以促进免疫应答，该免疫应答比未缀合的CDN和包含ADC的抗体的加和免疫应答更大。换言之，通过使本公开的CDN与特定的免疫治疗抗体缀合，可以实现协同作用。在其他实施方案中，如本申请中所讨论的，本公开的CDN也可以不作为ADC的一部分施用。
因此，在一方面，本公开提供了在受试者中诱导或促进免疫应答的方法，其包括施用有效量的本公开的ADC(即，式I的ADC)。在另一方面，本公开提供了在受试者中诱导或促进免疫应答的方法，其包括施用有效量的本公开的CDN(即，式II的CDN)。并且在另一方面，本公开提供了在受试者中诱导或促进免疫应答的方法，其包括施用有效量的本公开的ADC与本公开的CDN的组合。在一些实施方案中，将ADC和/或CDN施用于有此需要的哺乳动物。在特定的实施方案中，将ADC和/或CDN施用于有此需要的人。
在具体实施方案中，本公开的ADC或CDN用于治疗癌症。例如，本公开的ADC或CDN可以用于治疗肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头癌、颈癌、子宫癌、卵巢癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、食道癌、小肠癌、肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌腺、甲状旁腺癌、肾上腺癌、尿道癌、前列腺癌、阴茎癌、睾丸癌、输尿管癌、膀胱癌、肾癌或肝癌。本公开的ADC或CDN可治疗的其他癌症包括直肠癌；肛门区癌；输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、肾盂癌和肾细胞癌；软组织肉瘤；粘液瘤；横纹肌瘤；纤维瘤；脂肪瘤；畸胎瘤；胆管上皮癌；肝母细胞瘤；血管肉瘤；血管瘤；肝瘤；纤维肉瘤；软骨肉瘤；骨髓瘤；慢性或急性白血病；淋巴细胞淋巴瘤；原发性CNS淋巴瘤；CNS肿瘤；脊柱肿瘤；鳞状细胞癌；滑膜肉瘤；恶性胸膜间皮瘤；脑干神经胶质瘤；垂体腺瘤；支气管腺瘤；软骨错构瘤；内皮瘤；霍奇金病；或上述癌症的一种或多种的组合。
因此，在一方面，本公开提供了治疗受试者的癌症的方法，其包括施用包含药学上可接受的量的本公开的ADC(即，式I的ADC)的药物组合物。在另一方面，本公开提供了治疗受试者癌症的方法，其包括施用药物组合物，该药物组合物包含药学上可接受的量的本公开的CDN(即，式II的CDN)。在一些实施方案中，施用药物组合物给有此需要的哺乳动物。在特定的实施方案中，将药物组合物施用于有此需要的人。
在另一方面，本公开提供了通过向受试者(例如，人)施用包含药学上可接受的量的本公开的ADC(即，式I的ADC)与至少另一种抗癌剂治疗该受试者的癌症的方法。ADC和一种或多种另外的抗癌剂可以一起或分开施用，并且当分开施用时，施用可以在分开的或组合的药物组合物中通过任何便利的途径以任何顺序同时或依次进行。在一些实施方案中，另外的抗癌剂增强了式I的ADC的抗体或其抗原结合片段的靶抗原表达。为了实现期望的联合治疗效果，将选择ADC和其他药物活性抗癌剂的量以及施用的相对时机。
在一些情况下，本公开提供了通过向受试者(例如，人)施用包含药学上可接受的量的本公开容的CDN(即，式II的CDN)和至少一种另外的抗癌剂的药物组合物治疗该受试者的癌症的方法。CDN和一种或多种另外的抗癌剂可以一起或分开施用，并且当分开施用时，施用可以在分开的或组合的药物组合物中通过任何便利的途径以任何顺序同时或依次进行。为了实现期望的联合治疗效果，将选择CDN和其他抗癌剂的量以及施用的相对时机。
本公开的ADC或CDN与一种或多种抗癌剂的组合可以在单一药物组合物中一起施用。或者，可以分别配制ADC或CDN和一种或多种抗癌剂。当单独配制时，它们可以便利地以本领域中已知用于此类化合物的方式以任何便利的组合物提供。
因此，本公开的ADC或CDN可以与癌症治疗的其他治疗方法，例如在抗肿瘤疗法中、与免疫检查点抑制剂的联合疗法、其他化疗剂、激素、抗体药剂以及手术和//或放射治疗，尤其放射一起使用。
在一个实施方案中，本公开的ADC(即，式I的ADC)或本公开的CDN(即，式II的CDN)为-或本公开的ADC和CDN两者-与免疫检查点抑制剂联合使用以治疗癌症。近期已被证明免疫检查点抑制剂，例如针对PD-1、PD-L1和CTLA4的人源化抗体在治疗多种类型的转移性癌症，包括黑素瘤、非小细胞肺癌、肾细胞癌和膀胱癌方面非常成功(Sharma和Allison,2015,Science 348,56)。然而，仍然只有小百分比的癌症患者从检查点抑制剂治疗中受益，部分原因是产生和/或浸润到肿瘤中的抗肿瘤免疫细胞例如CD8 T细胞的数量不足。如本申请中所述的实施例中所示，本公开的ADC和/或CDN与免疫检查点抑制剂的组合能够协同发挥作用以治疗用免疫检查点抑制剂单一疗法难以治疗的癌症。
在一个实施方案中，本公开提供了通过与PD-L1抑制剂联合施用包含药学上可接受的量的本公开的ADC(即，式I的ADC)或本公开的CDN(即，式II的CDN)或本公开的ADC和CDN二者的药物组合物治疗受试者的癌症的方法。可以与本公开的ADC联用的PD-L1抑制剂的实例包括，但不限于阿替珠单抗阿维鲁单抗杜瓦单抗BMS-936559和CK-301。在某些实施方案中，本公开的ADC和/或CDN不与PD-L1抑制剂，包括上述举出的那些联合施用。
在一个实施方案中，本公开提供了通过与PD-1抑制剂联合施用包含药学上可接受的量的本公开的ADC(即，式I的ADC)或本公开的CDN(即，式II的CDN)或本公开的ADC和CDN二者的药物组合物治疗受试者的癌症的方法。可以与本公开的ADC联用的PD-1抑制剂的实例包括，但不限于帕博利珠单抗纳武单抗西米普利单抗(cemiplimab)AMP-224、AMP-514和PDR001。在某些实施方案中，本公开的ADC和/或CDN不与PD-1抑制剂，包括上述举出的那些联合施用。
在一个实施方案中，本公开提供了通过与CTLA-4抑制剂联合施用包含药学上可接受的量的本公开的ADC(即，式I的ADC)或本公开的CDN(即，式II的CDN)或本公开的ADC和CDN二者的药物组合物治疗受试者的癌症的方法。可以与本公开的ADC联用的CTLA-4抑制剂的实例包括，但不限于伊匹单抗(ipilmumab)和曲美木单抗。在某些实施方案中，本公开的ADC和/或CDN不与CTLA-4抑制剂，包括上述举出的那些联合施用。
在另一个实施方案中，本公开提供了通过与一种或多种如下药剂一起施用包含药学上可接受的量的本公开的ADC(即，式I的ADC)或本公开的CDN(即，式II的CDN)或本公开的ADC和CDN二者的药物组合物治疗受试者的癌症的方法：抗微管剂，例如二萜类化合物和长春花生物碱；铂配位复合物；烷化剂例如氮芥类、氧氮磷杂环己烯类、烷基磺酸酯类、亚硝基脲类和三氮烯类；抗生素药物例如蒽环类、放线菌素类和博来霉素类；拓扑异构酶II抑制剂例如表鬼臼毒素；抗代谢药例如嘌呤和嘧啶类似物和抗叶酸化合物；拓扑异构酶I抑制剂例如喜树碱；激素和激素类似物；信号转导途径抑制剂；非受体酪氨酸血管生成抑制剂；免疫治疗剂；促凋亡剂；以及或细胞周期信号传导抑制剂。
可以与未缀合至抗体或抗原结合片段的STING激动剂联合使用式I的ADC，例如用于治疗癌症或诱导或促进免疫应答。在某些实施方案中，未与抗体或抗原结合片段缀合的STING激动剂为CDN，例如本申请中所述的CDN之一，即2’3’-CDN。在其他实施方案中，STING激动剂为3’3’-CDN、2’2’-CDN或3’2’-CDN。在一些实施方案中，STING激动剂为二苯酮类似物。在另外的实施方案中，STING激动剂为二聚化酰氨基苯并咪唑。可以与本公开的ADC联用的未与抗体或抗原结合片段缀合的STING激动剂的实例包括IMSA101、ADU-S100(MIW815)、BMS-986301、CRD5500、CMA(10-羧甲基-9-吖啶酮)、二ABZI STING激动剂-1(例如，CAS No.:2138299-34-8)、DMXAA(ASA404/伐地美生)、E7766、GSK-532、GSK-3745417,MK-1454、MK-2118、SB-11285、SRCB-0074、TAK-676和TTI-10001。可以在施用式I的ADC之前、与之同时或在其施用之后施用STING激动剂。
可以与“游离”CDN(即未与式I的抗体或抗原结合片段缀合)联合使用式I的ADC，例如用于治疗癌症或诱导或促进免疫应答。游离CDN可以在施用式I的ADC之前、与之同时或在施用其之后施用。在这类情况下，游离CDN可以与缀合至式I的ADC的抗体的CDN相同或不同。游离CDN可以为cGAMP，例如2’3’-cGAMP或其类似物或衍生物或其药学上可接受的盐。在其他实施方案中，游离CDN为3’3’-cGAMP、2’2’-cGAMP、3’2’-cGAMP或它们中任一的类似物或衍生物或其药学上可接受的盐。
因此，本公开提供了通过与至少一种未与抗体缀合的CDN(“游离CDN”)一起施用包含药学上可接受的量的本公开的ADC(即，式I的ADC)治疗受试者的癌症的方法。式I的ADC和游离CDN可以一起或单独地施用，并且在单独施用时，施用可以同时或依次进行，以任意次序进行，通过任意便利的途径单独或合并进行。
在一个实施方案中，与式I的ADC联合施用的游离CDN为下列化合物或其药学上可接受的盐：
在另一个实施方案中，与式I的ADC联合施用的游离CDN为下
列化合物或其药学上可接受的盐：
在另一个实施方案中，与式I的ADC联合施用的游离CDN为下列化合物或其药学上可接受的盐：
在另一个实施方案中，与式I的ADC联合施用的游离CDN为下列化合物或其药学上可接受的盐：
在另一个实施方案中，与式I的ADC联合施用的游离CDN为下列化合物或其药学上可接受的盐：
在另一个实施方案中，与式I的ADC联合施用的游离CDN为下列化合物或其药学上可接受的盐：
在另一个实施方案中，与式I的ADC联合施用的游离CDN为下列化合物或其药学上可接受的盐：
在另一个实施方案中，与式I的ADC联合施用的游离CDN为下列化合物或其药学上可接受的盐：
在另一个实施方案中，与式I的ADC联合施用的游离CDN为下列化合物或其药学上可接受的盐：
在另一个实施方案中，与式I的ADC联合施用的游离CDN为下列化合物或其药学上可接受的盐：
在另一个实施方案中，与式I的ADC联合施用的游离CDN为下列化合物或其药学上可接受的盐：
在另一个实施方案中，与式I的ADC联合施用的游离CDN为下列化合物或其药学上可接受的盐：
在另一个实施方案中，与式I的ADC联合施用的游离CDN为下列化合物或其药学上可接受的盐：
在另一个实施方案中，与式I的ADC联合施用的游离CDN为下列化合物或其药学上可接受的盐：
在另一个实施方案中，与式I的ADC联合施用的游离CDN为下列化合物或其药学上可接受的盐：
在另一个实施方案中，与式I的ADC联合施用的游离CDN为下列化合物或其药学上可接受的盐：
在另一个实施方案中，与式I的ADC联合施用的游离CDN为下列化合物或其药学上可接受的盐：
在另一个实施方案中，与式I的ADC联合施用的游离CDN为下列化合物或其药学上可接受的盐：
在另一个实施方案中，与式I的ADC联合施用的游离CDN为下列化合物或其药学上可接受的盐：
7.实施例
为了举例说明而非限制的目的，提供以下实施例，它们突出了CDN、ADC和使用这些ADC治疗患者的方法的示例性实施方案的某些特征和特性。
缩写
1H-NMR 质子核磁共振光谱法
19F-NMR 19F核磁共振光谱法
31P-NMR 31P核磁共振光谱法
G 鸟嘌呤
A 腺嘌呤
ABz 6N-苯甲酰腺嘌呤
Gib 2N-异丁酰基
Bz 苯甲酰基
DCA 二氯乙酸
DCM 二氯甲烷
DMOCP 2-氯-5,5-二甲基-1,3,2-二氧磷杂环己烷2-氧化物
DMT 4,4'-二甲氧基三苯甲基
DMTCl 4,4'-二甲氧基三苯甲基氯
PBS 磷酸缓冲盐水
Py. 吡啶
TBS 叔丁基二甲基甲硅烷基
TrCl 三(羟基甲基)氨基甲烷盐酸盐
IBX 2-碘氧基苯甲酸
LAH 氢化铝锂
DMF 二甲基甲酰胺
NMM N-甲基吗啉
Et3N 三乙胺
实施例1.CDN-A的制备
下列方案A1和A2描述了本申请中所公开的CDN(“CDN-A”)的合成。CDN和合成中间体的合成和表征如下所述。
由1合成中间体19
方案A1.中间体19的合成
方案A1.中间体19的合成(接续)
步骤1:(3aR,5R,6S,6aR)-5-(羟基甲基)-2,2-二甲基四氢呋喃并[2,3-d][1,3]二氧杂环戊烯-6-醇的合成
将(2R,4S,5R)-5-(羟基甲基)四氢呋喃-2,3,4-三醇(100g,0.67mol)在包含H2SO4(浓,184.00g,1.88mol,100mL,2.8eq.)的丙酮(2.6L)中的溶液在20℃搅拌1h。在0℃谨慎地加入Na2CO3(130g,1.23mol,1.8eq.)在H2O(600mL)中的溶液。将该混合物再搅拌2.5h，然后加入第二批Na2CO3(70g,0.66mol)。0.5h后，通过过滤采集沉淀，用丙酮(0.5L x 3)洗涤。浓缩滤液，通过柱色谱法纯化(SiO2,DCM:MeOH＝10:1～5:1)，得到(3aR,5R,6R)-5-(羟基甲基)-2,2-二甲基-3a,5,6,6a-四氢呋喃并[2,3-d][1,3]二氧杂环戊烯-6-醇(53.5g,0.28mol,85％收率)，为黄色油状物。(MS:[M+Na]+213.0)。
步骤2:3aR,5R,6S,6aR)-2,2-二甲基-5-((三苯甲氧基)甲基)四氢呋喃并[2,3-d][1,3]二氧杂环戊烯-6-醇的合成
向(3aR,5R,6R)-5-(羟基甲基)-2,2-二甲基-3a,5,6,6a-四氢呋喃并[2,3-d][1,3]二氧杂环戊烯-6-醇(125g,0.66mol)在吡啶(600mL)中的溶液中加入TrCl(219.9g,0.79mol,1.2eq.)。在60℃ 16h后，冷却该混合物，浓缩。使残余物分配在CH2Cl2(400mL)与NaHCO3水溶液(饱和,800mL)之间。用CH2Cl2(600mL x 2)萃取水相。用Na2SO4干燥合并的有机层，过滤，浓缩，通过柱色谱法纯化(SiO2,石油醚/乙酸乙酯＝10:1～5:1)，得到(3aR,5R,6R)-2,2-二甲基-5-(三苯甲氧基甲基)-3a,5,6,6a-四氢呋喃并[2,3-d][1,3]二氧杂环戊烯-6-醇(250g,0.58mol,88％收率)，为白色固体。(MS:[M+Na]+455.0)。
步骤3:(3aR,5R,6aS)-2,2-二甲基-5-((三苯甲氧基)甲基)二氢呋喃并[2,3-d][1,3]二氧杂环戊烯-6(3aH)-酮的合成
向(3aR,5R,6R)-2,2-二甲基-5-(三苯甲氧基甲基)-3a,5,6,6a-四氢呋喃并[2,3-d][1,3]二氧杂环戊烯-6-醇(250g,0.58mol)在CH3CN(1.5L)中的溶液中加入IBX(323g,1.2mol,2.00eq.)。将该混合物在90℃搅拌6h。冷却后，过滤该混合物。浓缩滤液，得到(3aR,5R,6aS)-2,2-二甲基-5-(三苯甲氧基甲基)-3a,6a-二氢呋喃并[2,3-d][1,3]二氧杂环戊烯-6-酮(240g,0.56mol,96.5％收率)，为淡黄色油状物。
(MS:[M+Na]+453.0)。
步骤4:(E)-甲基-2-((3aR,5S,6aR)-2,2-二甲基-5-((三苯甲氧基)甲基)呋喃并[2,3-d][1,3]二氧杂环戊烯-6(3aH,5H,6aH)-亚基)乙酸酯的合成
在0℃向NaH(14.5g,0.36mol,在油中60％,1.3eq.)和THF(1.00L)中的混合物中滴加2-二甲氧基磷酰基乙酸甲酯(66g,0.36mol,52.4mL,1.3eq.)，历时15min。将该混合物在相同温度下搅拌45min，然后滴加(3aR,5R,6aS)-2,2-二甲基-5-(三苯甲氧基甲基)-3a,6a-二氢呋喃并[2,3-d][1,3]二氧杂环戊烯-6-酮(120g,0.28mol,1eq.)在THF(500mL)中的溶液。在25℃ 15h后，在0℃用NH4Cl(饱和,50mL)猝灭反应。浓缩该混合物，使其分配在盐水(500mL)与CH2Cl2(500mL x 3)之间。用Na2SO4干燥合并的有机层，过滤，浓缩，通过柱色谱法纯化(SiO2,石油醚/乙酸乙酯＝15:1～5:1)，得到(2E)-2-[(3aR,5S,6aR)-2,2-二甲基-5-(三苯甲氧基甲基)-3a,6a-二氢呋喃并[2,3-d][1,3]二氧杂环戊烯-6-亚基]乙酸甲酯(65g,0.53mol,96％收率)，为淡黄色油状物。(MS:[M+Na]+509.0)。
步骤5:2-((3aR,5S,6R,6aR)-2,2-二甲基-5-((三苯甲氧基)甲基)四氢呋喃并[2,3-d][1,3]二氧杂环戊烯-6-基)乙酸甲酯的合成
在N2气氛中向(2E)-2-[(3aR,5S,6aR)-2,2-二甲基-5-(三苯甲氧基甲基)-3a,6a-二氢呋喃并[2,3-d][1,3]二氧杂环戊烯-6-亚基]乙酸甲酯(260g,0.53mol)在EtOAc(700mL)中的溶液中加入Pd/C(10％/碳,10g)。给该混悬液脱气，用H2吹扫3次。将该混合物在H2气氛中(20psi)在25℃搅拌16h。通过过滤除去催化剂。浓缩滤液，通过柱色谱法纯化(SiO2,石油醚/乙酸乙酯＝15:1～10:1)，得到2-[(3aR,5S,6S)-2,2-二甲基-5-(三苯甲氧基甲基)-3a,5,6,6a-四氢呋喃并[2,3-d][1,3]二氧杂环戊烯-6-基]乙酸甲酯(210g,0.43mol,80.4％收率)，为白色固体。(MS:[M+Na]+511.1)。
步骤6:2-((3aR,5S,6R,6aR)-2,2-二甲基-5-((三苯甲氧基)甲基)四氢呋喃并[2,3-d][1,3]二氧杂环戊烯-6-基)乙醇的合成
在0℃向LiAlH4(15.5g,0.41mol,2eq.)和THF(500mL)的混合物中缓慢地加入2-[(3aR,5S,6S)-2,2-二甲基-5-(三苯甲氧基甲基)-3a,5,6,6a-四氢呋喃并[2,3-d][1,3]二氧杂环戊烯-6-基]乙酸甲酯(100g,0.20mol)在THF(20mL)中的溶液。在25℃搅拌2.5h后，在0℃用水(15mL)和NaOH(水溶液,15％,15mL)猝灭反应。用Na2SO4干燥粗产物，过滤，浓缩，通过柱色谱法纯化(SiO2,石油醚/乙酸乙酯＝5:1～2:1)，得到2-[(3aR,5S,6S)-2,2-二甲基-5-(三苯甲氧基甲基)-3a,5,6,6a-四氢呋喃并[2,3-d][1,3]二氧杂环戊烯-6-基]乙醇(80g,0.35mol,85％收率)，为淡黄色油状物。
1HNMR(400MHz,CDCl3)δ＝7.43-7.35(m,6H),7.25-7.18(m,6H),7.18-7.11(m,3H),5.82(d,J＝3.8Hz,1H),4.62(t,J＝4.2Hz,1H),3.86(td,J＝3.5,10.2Hz,1H),3.61-3.47(m,2H),3.37(dd,J＝2.8,10.7Hz,1H),3.02(dd,J＝4.1,10.7Hz,1H),2.13(tt,J＝4.8,9.9Hz,1H),1.73-1.62(m,2H),1.42(s,3H),1.40-1.31(m,1H),1.26(s,3H)。MS:[M+Na]+483.2
步骤7:(3aR,5S,6R,6aR)-6-(2-(苄氧基)乙基)-2,2-二甲基-5-((三苯甲氧基)甲基)四氢呋喃并[2,3-d][1,3]二氧杂环戊烯的合成
在-20℃向NaH(27.1g,0.68mol,在油中60％,4.00eq.)和THF(500mL)的混合物中滴加2-[(3aR,5S,6S)-2,2-二甲基-5-(三苯甲氧基甲基)-3a,5,6,6a-四氢呋喃并[2,3-d][1,3]二氧杂环戊烯-6-基]乙醇(78g,0.17mol)在THF(200mL)中的溶液，历时5min。添加后，将该混合物在25℃搅拌2h。滴加BnBr(60.3mL,0.51mol,3.00eq.)。将该混合物在80℃搅拌14h。冷却至0℃后，用NH4Cl水溶液(饱和,20mL)猝灭反应，用H2O(400mL)稀释，用CH2Cl2(400mL x 3)萃取。用Na2SO4干燥合并的有机层，过滤，浓缩，通过柱色谱法纯化(SiO2,石油醚/乙酸乙酯＝15:1～5:1)，得到(3aR,5S,6S)-6-(2-苄氧基乙基)-2,2-二甲基-5-(三苯甲氧基甲基)-3a,5,6,6a-四氢呋喃并[2,3-d][1,3]二氧杂环戊烯(90g,0.16mol,97％收率)，为白色固体。(MS:[M+Na]+＝573.1)。
步骤8:(3aR,5S,6R,6aR)-6-(2-(苄氧基)乙基)-2,2-二甲基四氢呋喃并[2,3-d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)甲醇的合成
向(3aR,5S,6S)-6-(2-苄氧基乙基)-2,2-二甲基-5-(三苯甲氧基甲基)-3a,5,6,6a-四氢呋喃并[2,3-d][1,3]二氧杂环戊烯(90g,0.16mol)在CH2Cl2(300mL)中的溶液中加入CHCl2COOH(30mL,0.16mol,1.00eq.)。在25℃ 3h后，在0℃用NaHCO3水溶液(饱和,500mL)中和该反应混合物至pH～7.0。用CH2Cl2(100mL x 3)萃取粗产物。用MgSO4干燥合并的有机层，过滤，浓缩，通过柱色谱法纯化(SiO2,石油醚/乙酸乙酯＝5:1～2:1)，得到[(3aR,5S,6S)-6-(2-苄氧基乙基)-2,2-二甲基-3a,5,6,6a-四氢呋喃并[2,3-d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基]甲醇(44g,0.14mol,87％收率)，为黄色油状物。
步骤9:苯甲酸(3aR,5S,6R,6aR)-6-(2-(苄氧基)乙基)-2,2-二甲基四氢呋喃并[2,3-d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)甲酯的合成
向[(3aR,5S,6S)-6-(2-苄氧基乙基)-2,2-二甲基-3a,5,6,6a-四氢呋喃并[2,3-d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基]甲醇(62g,0.2mol)在CH2Cl2(200mL)中的溶液中加入BzCl(35mL,0.3mol,1.50eq.)和Et3N(55.7mL,0.4mol,2eq.)。在25℃ 1h后，浓缩该反应混合物，通过柱色谱法纯化(SiO2,石油醚/乙酸乙酯＝15:1～10:1)，得到苯甲酸[(3aR,5S,6S)-6-(2-苄氧基乙基)-2,2-二甲基-3a,5,6,6a-四氢呋喃并[2,3-d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基]甲酯(80g,0.19mol,97％收率)，为淡黄色油状物。(MS:[M+Na]+435.1)。
步骤10:苯甲酸((2S,3S,4R)-3-(2-(苄氧基)乙基)-4,5-二羟基四氢呋喃-2-基)甲酯的合成
向苯甲酸[(3aR,5S,6S)-6-(2-苄氧基乙基)-2,2-二甲基-3a,5,6,6a-四氢呋喃并[2,3-d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基]甲酯(20g,49mmol)和H2O(6mL)的混合物中加入HOAc(28mL,10eq.)。将该混合物在100℃搅拌5h。冷却后，用NaHCO3水溶液(饱和,2L)中和该反应混合物，用CH2Cl2(400mL x 3)萃取。浓缩合并的有机层，得到苯甲酸[(2S,3R,5R)-3-(2-苄氧基乙基)-4,5-二羟基-四氢呋喃-2-基]甲酯(17.5g,47mmol,96％收率)，为淡黄色油状物，其未经纯化被用于下一步。(MS:[M+Na]+395.1)。
步骤11:乙酸(3R,4R,5S)-5-((苯甲酰氧基)甲基)-4-(2-(苄氧基)乙基)四氢呋喃-2,3-二基酯的合成
向苯甲酸[(2S,3R,5R)-3-(2-苄氧基乙基)-4,5-二羟基-四氢呋喃-2-基]甲酯(70g,0.19mol)在吡啶(300mL)中的溶液中加入Ac2O(0.75mol,70.4mL,4.0eq.)。将该混合物在60℃搅拌4h。冷却至25℃后，用NaHCO3水溶液(饱和)中和该反应混合物至pH～7，用CH2Cl2(300mL x 3)萃取。浓缩有机层，通过柱色谱法纯化(SiO2,石油醚/乙酸乙酯＝10:1～5:1)，得到苯甲酸[(2S,3S,5S)-4,5-二乙酰氧基-3-(2-苄氧基乙基)四氢呋喃-2-基]甲酯(80g,93％收率)，为白色固体。(MS:[M+Na]+479.1)。
步骤12:苯甲酸((2S,3R,4R,5R)-4-乙酰氧基-3-(2-(苄氧基)乙基)-5-(2-异丁酰氨基-6-氧代-1H-嘌呤-9(6H)-基)四氢呋喃-2-基)甲酯的合成
在20℃向2-甲基-N-(6-氧代-1,9-二氢嘌呤-2-基)丙酰胺(18.9g,85.4mmol,1.30eq.)在CH3CN(300mL)中的溶液中加入BSA(84.5mL,341.7mmol,5.2eq.)。在65℃搅拌0.5h后，冷却该混合物，浓缩。将残余物溶于MeCN(600mL)，随后在-15℃添加苯甲酸[(2S,3S,5S)-4,5-二乙酰氧基-3-(2-苄氧基乙基)四氢呋喃-2-基]甲酯(30g,65.7mmol)在MeCN(150mL)和TMSOTf(17.8mL,98.6mmol,1.5eq.)中的溶液。将该混合物在65℃搅拌15h。冷却后，浓缩该混合物，通过柱色谱法纯化(SiO2,石油醚/乙酸乙酯＝5:1～1:1)，得到苯甲酸((2S,3R,4R,5R)-4-乙酰氧基-3-(2-(苄氧基)乙基)-5-(2-异丁酰氨基-6-氧代-1H-嘌呤-9(6H)-基)四氢呋喃-2-基)甲酯(30g,48.6mmol,74％收率)，为白色固体。(MS:[M+1]+618.1)。
1HNMR(400MHz,氯仿-d)δ＝12.00(s,1H),9.11(s,1H),7.92-7.84(m,2H),7.82-7.76(m,1H),7.58(t,J＝7.1Hz,1H),7.46-7.37(m,2H),7.27-7.16(m,5H),5.90-5.85(m,1H),5.74(d,J＝5.3Hz,1H),4.78-4.61(m,2H),4.55-4.38(m,3H),3.55(t,J＝5.8Hz,2H),3.23-3.14(m,1H),2.47(spt,J＝6.9Hz,1H),2.22-2.10(m,3H),,1.83(q,J＝6.1Hz,2H),1.17(dd,J＝6.9,8.9Hz,6H)。
步骤13:苯甲酸((2S,3R,4R,5R)-4-乙酰氧基-3-(2-羟基乙基)-5-(2-异丁酰氨基-6-氧代-1H-嘌呤-9(6H)-基)四氢呋喃-2-基)甲酯的合成
在N2气氛中向苯甲酸[(2S,3S,5R)-4-乙酰氧基-3-(2-苄氧基乙基)-5-[2-(2-甲基丙酰基氨基)-6-氧代-1H-嘌呤-9-基]四氢呋喃-2-基]甲酯(25g,40.5mmol)在EtOH(500mL)中的溶液中加入Pd/C(38g,10％/碳)和HOAc(25.00mL,437.1mmol,11eq.)。用H2吹扫该混悬液3次，在H2气氛中(40Psi)在50℃搅拌48h。冷却后，过滤该反应混合物。浓缩滤液，通过柱色谱法纯化(SiO2,石油醚/乙酸乙酯＝5:1～2:1)，得到苯甲酸[(2S,3S,5R)-4-乙酰氧基-3-(2-羟基乙基)-5-[2-(2-甲基丙酰基氨基)-6-氧代-1H-嘌呤-9-基]四氢呋喃-2-基]甲酯(20g,37.9mmol,94％收率)，为白色固体。(MS:[M+1]+528.3)。
步骤14:苯甲酸[(2S,3R,5R)-4-乙酰氧基-3-(2-碘乙基)-5-[2-(2-甲基丙酰基氨基)-6-氧代-1H-嘌呤-9-基]四氢呋喃-2-基]甲酯的合成
向苯甲酸[(2S,3R,5R)-4-乙酰氧基-3-(2-羟基乙基)-5-[2-(2-甲基丙酰基氨基)-6-氧代-1H-嘌呤-9-基]四氢呋喃-2-基]甲酯(3g,5.69mmol,1eq.)在THF(90mL)中的溶液中一次性加入咪唑(1.16g,17.06mmol,3eq.)和三苯膦(4.47g,17.06mmol,3eq.)，然后缓慢地加入I2(2.60g,10.24mmol,1.8eq.)在THF(10mL)中的溶液。将该反应混合物在25℃搅拌16h，用饱和Na2SO3水溶液(8mL)猝灭，蒸发，得到残余物。将残余物乙酸乙酯(80mL)，用水(80mL)洗涤。用EtOAc(150mL x 3)萃取水层。用无水Na2SO4干燥合并的有机层，减压浓缩。通过柱色谱法纯化残余物(SiO2,石油醚/乙酸乙酯＝1:1～1:3)，得到苯甲酸[(2S,3R,5R)-4-乙酰氧基-3-(2-碘乙基)-5-[2-(2-甲基丙酰基氨基)-6-氧代-1H-嘌呤-9-基]四氢呋喃-2-基]甲酯(2.3g,64％收率)，为黄色固体。(MS:[M+1]+638.2)。
步骤15:苯甲酸[(2S,3R,4R,5R)-4-乙酰氧基-3-(2-叠氮基乙基)-5-[2-(2-甲基丙酰基氨基)-6-氧代-1H-嘌呤-9-基]四氢呋喃-2-基]甲酯的合成
向苯甲酸[(2S,3R,4R,5R)-4-乙酰氧基-3-(2-碘乙基)-5-[2-(2-甲基丙酰基氨基)-6-氧代-1H-嘌呤-9-基]四氢呋喃-2-基]甲酯(3.8g,5.96mmol,1eq.)在THF(40mL)中的溶液中加入NaN3(2.52g,38.75mmol,6.5eq.)和H2O(10mL)。将该混合物在50℃搅拌2h。用饱和Na2CO3水溶液(50mL)使该混合物猝灭，用EtOAc(100mL x 3)萃取。用无水Na2SO4干燥合并的有机层，减压浓缩，得到苯甲酸[(2S,3R,4R,5R)-4-乙酰氧基-3-(2-叠氮基乙基)-5-[2-(2-甲基丙酰基氨基)-6-氧代-1H-嘌呤-9-基]四氢呋喃-2-基]甲酯(2g,61％收率)，为黄色固体。(MS:[M+1]+553.1)。
步骤16:N-[9-[(2R,3R,4S,5S)-4-(2-叠氮基乙基)-3-羟基-5-(羟基甲基)四氢呋喃-2-基]-6-氧代-1H-嘌呤-2-基]-2-甲基-丙酰胺的合成
在0℃向苯甲酸[(2S,3R,5R)-4-乙酰氧基-3-(2-叠氮基乙基)-5-[2-(2-甲基丙酰基氨基)-6-氧代-1H-嘌呤-9-基]四氢呋喃-2-基]甲酯(2.55g,4.62mmol,1eq.)在EtOH(220mL)中的溶液中加入NaOH水溶液(2M,23mL,10eq.)。将得到的混合物在环境温度搅拌0.5h。在0℃向该反应混合物中加入HCOOH以便调整pH＝7～8，减压浓缩该混合物，得到残余物。通过制备型-HPLC(0.1％ FA的MeCH和水溶液,0％～70％)纯化残余物，得到N-[9-[(2R,3R,4S,5S)-4-(2-叠氮基乙基)-3-羟基-5-(羟基甲基)四氢呋喃-2-基]-6-氧代-1H-嘌呤-2-基]-2-甲基-丙酰胺(1.6g,3.94mmol,85％收率)，为白色固体。(MS:[M+1]+407.1)。
步骤17:N-[9-[(2R,3R,4S,5S)-4-(2-叠氮基乙基)-5-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-3-羟基-四氢呋喃-2-基]-6-氧代-1H-嘌呤-2-基]-2-甲基-丙酰胺的合成
向N-[9-[(2R,3R,4S,5S)-4-(2-叠氮基乙基)-3-羟基-5-(羟基甲基)四氢呋喃-2-基]-6-氧代-1H-嘌呤-2-基]-2-甲基-丙酰胺(1.6g,3.94mmol)在吡啶(15mL)中的溶液中加入DMTCl(1.60g,4.72mmol,1.2eq.)。将该混合物在25℃搅拌3h。在25℃通过添加MeOH(10mL)使该反应混合物猝灭。减压浓缩该混合物，得到残余物，为黄色油状物。通过柱色谱法纯化残余物(SiO2,石油醚/乙酸乙酯＝1/1至EtOH/乙酸乙酯＝1:250)，得到N-[9-[(2R,3R,4S,5S)-4-(2-叠氮基乙基)-5-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-3-羟基-四氢呋喃-2-基]-6-氧代-1H-嘌呤-2-基]-2-甲基-丙酰胺(950mg,1.34mmol,34％收率)，为黄色固体。(MS:[M+1]+709.4)。
步骤18:[(2R,3R,4R,5S)-4-(2-叠氮基乙基)-5-(羟基甲基)-2-[2-(2-甲基丙酰基氨基)-6-氧代-1H-嘌呤-9-基]四氢呋喃-3-基]氧基次膦酸的合成
向N-[9-[(2R,3R,4S,5S)-4-(2-叠氮基乙基)-5-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-3-羟基四氢呋喃-2-基]-6-氧代-1H-嘌呤-2-基]-2-甲基-丙酰胺(700mg,988μmol)在吡啶(6mL)中的溶液中加入亚磷酸二苯酯(809.5mg,3.46mmol,664μL,3.5eq.)。在25℃ 1h后，加入DCM(5mL)和Et3N(3mL)，将该混合物在25℃再搅拌1.5h。浓缩该混合物，使残余物分配在DCM(20mL)与NaHCO3水溶液(5％、20mL)之间。蒸发有机相，得到粗的中间体，将其再溶于H2O(3mL)和2,2-二氯乙酸(382mg,2.96mmol,243μL,3eq.)在DCM(10mL)中的混合物。将该混合物在25℃搅拌0.5h。用Et3N(3.0mL)猝灭反应，然后蒸发该混合物，得到残余物。通过反相柱纯化残余物(0.1％ TEA的MeCH和水溶液,0％～70％)，得到[(2R,3R,4R,5S)-4-(2-叠氮基乙基)-5-(羟基甲基)-2-[2-(2-甲基丙酰基氨基)-6-氧代-1H-嘌呤-9-基]四氢呋喃-3-基]氧基次膦酸(400mg,82％收率,95％纯度)，为白色固体。(MS:[M+1]+471.0)。
由中间体19合成CDN-A
方案A2.CDN-A的合成
步骤1:[(2R,3R,4R,5R)-2-[[[(2R,3R,4R,5S)-4-(2-叠氮基乙基)-5-(羟基甲基)-2-[2-(2-甲基丙酰基氨基)-6-氧代-1H-嘌呤-9-基]四氢呋喃-3-基]氧基-(2-氰基乙氧基)磷酰基]氧基甲基]-5-(6-苯甲酰氨基嘌呤-9-基)-4-[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基-四氢呋喃-3-基]氧基次膦酸的合成
向[(2R,3R,4R,5R)-5-(6-苯甲酰氨基嘌呤-9-基)-4-[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基-2-(羟基甲基)四氢呋喃-3-基]氧基次膦酸(400mg,727.8μmol)在CH3CN(3mL)中的溶液中加入四唑溶液(0.45M的MeCN溶液,6.47mL,4eq.)。将该混合物在25℃搅拌5min。加入N-[9-[(2R,3R,4R,5S)-4-(2-叠氮基乙基)-5-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-3-[2-氰基乙氧基-(二异丙基氨基)磷烷基]氧基四氢呋喃-2-基]-6-氧代-1H-嘌呤-2-基]-2-甲基-丙酰胺(595mg,655μmol,0.9eq.)。在25℃ 0.5h后，加入2-氢过氧-2-甲基-丙烷(197mg,2.18mmol,209μL,3eq.)，将该混合物在25℃搅拌0.5h。然后加入在DCM(10mL)中的2,2-二氯乙酸(938mg,7.28mmol,598μL,10eq.)。将该混合物在25℃搅拌25min，用饱和Na2SO3水溶液(2.0mL)猝灭，随后加入吡啶(2.0mL)中和。蒸发该混合物，得到残余物。通过反相柱纯化残余物(0.1％ TEA的MeCH和水溶液,0％～70％)，得到[(2R,3R,4R,5R)-2-[[[(2R,3R,4R,5S)-4-(2-叠氮基乙基)-5-(羟基-甲基)-2-[2-(2-甲基丙酰基氨基)-6-氧代-1H-嘌呤-9-基]四氢呋喃-3-基]氧基-(2-氰基乙氧基)磷酰基]氧基甲基]-5-(6-苯甲酰氨基嘌呤-9-基)-4-[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基-四氢呋喃-3-基]氧基次膦酸(600mg,62％收率,80％纯度)，为白色固体。(MS:[M+1]+1071.5)。
步骤2:N-[9-[(27S,28R,29R,30R,31R,32R,33R,34R)-29-(2-叠氮基乙基)-32-[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基-67,68-二羟基-33-[2-(2-甲基丙酰基氨基)-6-氧代-1H-嘌呤-9-基]-67,68-二氧代-59,60,61,62,63,64-六氧杂-67,68-二磷三环十八烷-34-基]嘌呤-6-基]苯甲酰胺的合成
向[(2R,3R,4R,5S)-4-(2-叠氮基乙基)-5-[[[(2R,3R,4R,5R)-5-(6-苯甲酰氨基嘌呤-9-基)-4-[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基-2-(羟基甲基)四氢呋喃-3-基]氧基-(2-氰基乙氧基)磷酰基]氧基甲基]-2-[2-(2-甲基丙酰基氨基)-6-氧代-1H-嘌呤-9-基]四氢呋喃-3-基]氧基次膦酸(400mg,373.48μmol)在吡啶(9mL)中的溶液中加入2-氯-5,5-二甲基-1,3,2-二氧磷杂环己烷2-氧化物(345mg,1.87mmol,5eq.)。在25℃ 15min后，加入I2(379mg,1.49mmol,4eq.)和H2O(13.5mg,747.0μmol,13.5μL,2eq.)，将该混合物在25℃搅拌0.5h。用饱和NaHCO3水溶液(2.0mL)和饱和Na2SO3水溶液(2.0mL)使该反应体系猝灭。蒸发后，将残余物溶于CH3CN(10mL)，添加2-甲基丙-2-胺(10mL)。将该混合物在25℃搅拌1h。蒸发该反应混合物，得到残余物。通过反相柱纯化残余物(0.1％ TEA的MeCH和水溶液,0％～70％)，得到N-[9-[(27S,28R,29R,30R,31R,32R,33R,34R)-29-(2-叠氮基乙基)-32-[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基-67,68-二羟基-33-[2-(2-甲基丙酰基氨基)-6-氧代-1H-嘌呤-9-基]-67,68-二氧代-59,60,61,62,63,64-六氧杂-67,68二磷三环十八烷-34-基]嘌呤-6-基]苯甲酰胺(350mg,310μmol,83％收率,90％纯度)，为白色固体。(MS:[M+1]+1016.4)。
步骤3:2-氨基-9-[(19S,20R,21R,22R,23R,24R,25R,26R)-26-(6-氨基嘌呤-9-基)-21-(2-叠氮基乙基)-24-[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基-54,55-二羟基-54,55-二氧代-46,47,48,49,50,51-六氧杂-54,55-二磷三环十八烷-25-基]-1H-嘌呤-6-酮的合成
将N-[9-[(27S,28R,29R,30R,31R,32R,33R,34R)-29-(2-叠氮基乙基)-32-[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基-67,68-二羟基-33-[2-(2-甲基丙酰基氨基)-6-氧代-1H-嘌呤-9-基]-67,68-二氧代-59,60,61,62,63,64-六氧杂-67,68二磷三环十八烷-34-基]嘌呤-6-基]苯甲酰胺(300mg,295μmol)溶于MeNH2/EtOH(5M,2.95mL)，将该混合物在25℃搅拌2h。蒸发该混合物，得到残余物。通过反相柱纯化残余物(0.1％ TEA的MeCH和水溶液,0％～35％)，得到2-氨基-9-[(19S,20R,21R,22R,23R,24R,25R,26R)-26-(6-氨基嘌呤-9-基)-21-(2-叠氮基乙基)-24-[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基-54,55-二羟基-54,55-二氧代-46,47,48,49,50,51-六氧杂-54,55二磷三环十八烷-25-基]-1H-嘌呤-6-酮(160mg,52％收率,80％纯度)，为白色固体。(MS:[M+1]+842.3)。
步骤4:2-氨基-9-[(19S,20R,21R,22R,23R,24R,25R,26R)-21-(2-氨基乙基)-26-(6-氨基嘌呤-9-基)-24-[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基-52,53-二羟基-52,53-二氧代-44,45,46,47,48,49-六氧杂-52,53-二磷三环十八烷-25-基]-1H-嘌呤-6-酮的合成
向2-氨基-9-[(19S,20R,21R,22R,23R,24R,25R,26R)-26-(6-氨基嘌呤-9-基)-21-(2-叠氮基乙基)-24-[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基-54,55-二羟基-54,55-二氧代-46,47,48,49,50,51-六氧杂-54,55二磷三环十八烷-25-基]-1H嘌呤-6-酮(100mg,118.8μmol)在MeOH(8mL)中的溶液中一次性加入Pd/C(30mg,10％纯度)，将该混合物在25℃在H2气氛(10psi)中搅拌5h。过滤该混合物，蒸发滤液，得到残余物。通过反相柱纯化残余物(0.1％TEA的MeCH和水溶液,0％～30％)，得到2-氨基-9-[(19S,20R,21R,22R,23R,24R,25R,26R)-21-(2-氨基乙基)-26-(6-氨基嘌呤-9-基)-24-[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基-52,53-二羟基-52,53-二氧代-44,45,46,47,48,49-六氧杂-52,53二磷三环十八烷-25-基]-1H-嘌呤-6-酮(70mg,77.2μmol,65％收率,90％纯度)，为白色固体。(MS:[M+1]+816.5)。
步骤5:2-氨基-9-[(14S,15R,16R,17R,18S,19R,20R,21R)-16-(2-氨基乙基)-20-(6-氨基嘌呤-9-基)-17,45,46-三羟基-45,46-二氧代-39,40,41,42,43,44-六氧杂-45,46-二磷三环十八烷-21-基]-1H-嘌呤-6-酮(CDN-A)的合成
向2-氨基-9-[(19S,20R,21R,22R,23R,24R,25R,26R)-21-(2-氨基乙基)-26-(6-氨基嘌呤-9-基)-24-[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基-52,53-二羟基-52,53-二氧代-44,45,46,47,48,49-六氧杂-52,53二磷三环十八烷-25-基]-1H嘌呤-6-酮(35mg,42.9μmol)在MeOH(3mL)中的溶液中一次性加入NH4F(127mg,3.43mmol,80eq.)，将该混合物在70℃搅拌0.25h。冷却至室温后，蒸发该混合物，得到残余物。通过反相柱纯化残余物(0.1％ HCOOH的MeCH和水溶液,0％～30％)，得到2-氨基-9-[(14S,15R,16R,17R,18S,19R,20R,21R)-16-(2-氨基乙基)-20-(6-氨基嘌呤-9-基)-17,45,46-三羟基-45,46-二氧代-39,40,41,42,43,44-六氧杂-45,46二磷三环十八烷-21-基]-1H-嘌呤-6-酮(CDN-A,8.6mg,11.9μmol,28％收率,97％纯度)，为白色固体。(MS:[M+1]+702.0)。
1H NMR(D2O+缓冲液,400MHz):δ(ppm)8.19(s,1H),8.18(s,1H),7.76(s,1H),6.08(s,1H),5.83-5.81(m,1H),5.71-5.67(m,1H),5.03-5.01(m,1H),4.42-4.37(m,2H),4.30-4.28(m,1H),4.18-4.16(m,1H),4.07-4.01(m,2H),3.13-3.11(m,2H),2.68-2.66(m,1H),2.33-2.30(m,1H),1.85-1.83(m,1H)。31P NMR(D2O+缓冲液):δ(ppm)-1.15,-2.47
实施例2.CDN-B的制备
下面的方案B1和B2描述了本申请中所公开的CDN(“CDN-B”)的合成。该CDN的合成和表征以及所使用的合成中间体如下所述。
由中间体14合成中间体29
方案B1:中间体的29合成
步骤1:苯甲酸[(2S,3R,4R,5R)-4-乙酰氧基-3-(2-氯乙基)-5-[2-(2-甲基丙酰基氨基)-6-氧代-1H-嘌呤-9-基]四氢呋喃-2-基]甲酯的合成
向苯甲酸[(2S,3R,4R,5R)-4-乙酰氧基-3-(2-羟基乙基)-5-[2-(2-甲基丙酰基氨基)-6-氧代-1H-嘌呤-9-基]四氢呋喃-2-基]甲酯(19g,36.0mmol)在DMF(100mL)中的溶液中加入PPh3(23.6g,90.0mmol,2.5eq.)and CCl4(17.3mL,180.1mmol,5eq.)。在25℃搅拌16h后，用饱和NaHCO3水溶液(150mL)猝灭反应，用EtOAc(80mL x 2)萃取。浓缩合并的有机层，通过柱色谱法纯化(SiO2,石油醚/乙酸乙酯＝10:1～1:1)，得到苯甲酸[(2S,3R,4R,5R)-4-乙酰氧基-3-(2-氯乙基)-5-[2-(2-甲基丙酰基氨基)-6-氧代-1H-嘌呤-9-基]四氢呋喃-2-基]甲酯(13g,23.8mmol,66％收率)，为淡黄色固体。(MS:[M+1]+546.2)。
步骤2:苯甲酸[(2S,3R,4R,5R)-4-乙酰氧基-3-(2-乙酰基硫乙基)-5-[2-(2-甲基丙酰基氨基)-6-氧代-1H-嘌呤-9-基]四氢呋喃-2-基]甲酯的合成
向苯甲酸[(2S,3R,4R,5R)-4-乙酰氧基-3-(2-氯乙基)-5-[2-(2-甲基丙酰基氨基)-6-氧代-1H-嘌呤-9-基]四氢呋喃-2-基]甲基酯(15g,27.5mmol)在DMF(100mL)中的溶液中加入AcSK(7.84g,68.7mmol,2.5eq.)。将该反应混合物在50℃搅拌16h。冷却后，用DCM(200mL)稀释该反应混合物，用NaHCO3水溶液(饱和,200mL)洗涤。浓缩有机层，得到苯甲酸[(2S,3R,4R,5R)-4-乙酰氧基-3-(2-乙酰基硫乙基)-5-[2-(2-甲基丙酰基氨基)-6-氧代-1H-嘌呤-9-基]四氢呋喃-2-基]甲酯(16g)，为淡黄色油状物，其未经纯化被用于下一步。(MS:[M+1]+586.3)。
步骤3:N-[9-[(2R,3R,4S,5S)-3-羟基-5-(羟基甲基)-4-(2-硫烷基乙基)四氢呋喃-2-基]-6-氧代-1H-嘌呤-2-基]-2-甲基-丙酰胺的合成
在0℃向苯甲酸[(2S,3R,4R,5R)-4-乙酰氧基-3-(2-乙酰基硫乙基)-5-[2-(2-甲基丙酰基氨基)-6-氧代-1H-嘌呤-9-基]四氢呋喃-2-基]甲基酯(16g,27.3mmol)在EtOH(160mL)中的溶液中加入NaOH(2M,68.3mL,5eq.)。将该反应混合物在0℃搅拌0.5h。用HOAc将pH调整至7。真空浓缩该混合物以除去大部分溶剂。采集棕色沉淀，用DCM/TBME(1/100,V/V,200mL)处理。过滤后，浓缩滤液，得到N-[9-[(2R,3R,4S,5S)-3-羟基-5-(羟基甲基)-4-(2-硫烷基乙基)四氢呋喃-2-基]-6-氧代-1H-嘌呤-2-基]-2-甲基-丙酰胺(11g,粗,～10％二硫化物)，为棕色固体，其未经进一步纯化被用于下一步。(MS:[M+1]+398.1)。
步骤4:N-[9-[(2R,3R,4S,5S)-3-羟基-5-[[(3-甲氧基苯基)-(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-4-[2-[(3-甲氧基苯基)-(4-甲氧基苯基)-苯基-甲基]硫乙基]四氢呋喃-2-基]-6-氧代-1H-嘌呤-2-基]-2-甲基-丙酰胺的合成
向N-[9-[(2R,3R,4S,5S)-3-羟基-5-(羟基甲基)-4-(2-硫烷基乙基)四氢呋喃-2-基]-6-氧代-1H-嘌呤-2-基]-2-甲基-丙酰胺(11g,27.7mmol)在py.(110mL)中的溶液中加入DMTCl(28.1g,83.0mmol,3eq.)。在25℃16h后，用NaHCO3水溶液(饱和,200mL)猝灭反应，用EtOAc(200mL x 2)萃取。用Na2SO4干燥有机相，过滤，通过硅胶色谱法纯化PE:EE(EA:EtOH＝3:1)＝10:1～2:1，得到化合物N-[9-[(2R,3R,4S,5S)-3-羟基-5-[[(3-甲氧基苯基)-(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-4-[2-[(3-甲氧基苯基)-(4-甲氧基苯基)-苯基-甲基]硫乙基]四氢呋喃-2-基]-6-氧代-1H-嘌呤-2-基]-2-甲基-丙酰胺(14g,47.0％收率,93％纯度)，为淡黄色固体。(MS:[M+1]+1002.5)。
步骤5:[(2R,3R,4R,5S)-5-(羟基甲基)-4-[2-[(3-甲氧基苯基)-(4-甲氧基苯基)-苯基-甲基]硫乙基]-2-[2-(2-甲基丙酰基氨基)-6-氧代-1H-嘌呤-9-基]四氢呋喃-3-基]氧基次膦酸的合成
在25℃向N-[9-[(2R,3R,4S,5S)-3-羟基-5-[[(3-甲氧基苯基)-(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-4-[2-[(3-甲氧基苯基)-(4-甲氧基苯基)-苯基-甲基]硫乙基]四氢呋喃-2-基]-6-氧代-1H-嘌呤-2-基]-2-甲基-丙酰胺(12g,8.4mmol)在py.(120mL)中的溶液中加入苯氧基膦酰氧基苯(7.51mL,29.3mmol,3.5eq.)。1h后，加入Et3N/H2O(100mL,1:1)。0.5h后，用EtOAc(200mLx2)萃取该混合物。浓缩有机相，然后溶于AcOH水溶液(80％,120mL)。将该混合物在25℃搅拌1h。通过在0℃添加饱和Na2CO3水溶液中和该反应混合物至pH～7。通过反相柱直接纯化该混合物(CH3CN/H2O,0～60％)，得到[(2R,3R,4R,5S)-5-(羟基甲基)-4-[2-[(3-甲氧基苯基)-(4-甲氧基苯基)-苯基-甲基]硫乙基]-2-[2-(2-甲基丙酰基氨基)-6-氧代-1H-嘌呤-9-基]四氢呋喃-3-基]氧基次膦酸(4.2g,5.5mmol,65％收率)，为白色固体。(MS:[M+1]+764.4)。
由中间体29合成CDN-B
方案B2.CDN-B的合成
步骤1:[(2R,3R,4R,5S)-5-[[[(2R,3R,4R,5R)-5-(6-苯甲酰氨基嘌呤-9-基)-4-[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基-2-(羟基甲基)四氢呋喃-3-基]氧基-(2-氰基乙氧基)磷酰基]氧基甲基]-4-[2-[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲基]硫乙基]-2-[2-(2-甲基丙酰基氨基)-6-氧代-1H-嘌呤-9-基]四氢呋喃-3-基]氧基次膦酸的合成
向[(2R,5S)-4-[2-[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲基]硫乙基]-5-(羟基甲基)-2-[2-(2-甲基丙酰基氨基)-6-氧代-1H-嘌呤-9-基]四氢呋喃-3-基]氧基次膦酸(0.75g,0.98mmol)在1H-四唑(0.45M的MeCN溶液,22.50mL,10eq.)中的溶液中加入N-[9-[(2R,3R,4R,5R)-5-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-3-[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基-4-[2-氰基乙氧基-(二异丙基氨基)磷烷基]氧基-四氢呋喃-2-基]嘌呤-6-基]苯甲酰胺(1.1g,1.1mmol,1.1eq.)。1h后，加入TBHP(0.43ml,65％的癸烷溶液,3eq.)。将该反应混合物在25℃搅拌0.5h。通过在0℃添加亚硫酸氢钠水溶液(33％,4mL)猝灭反应，用EtOAc(100mL x 2)萃取。浓缩有机相，将其溶于AcOH水溶液(80％,20mL)。1h后，在0℃用Na2CO3水溶液(饱和)中和该反应混合物。通过反相柱纯化该混合物(CH3CN/H2O,中性条件,0～60％)，得到[(2R,3R,4R,5S)-5-[[[(2R,3R,4R,5R)-5-(6-苯甲酰氨基嘌呤-9-基)-4-[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基-2-(羟基甲基)四氢呋喃-3-基]氧基-(2-氰基乙氧基)磷酰基]氧基甲基]-4-[2-[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲基]硫乙基]-2-[2-(2-甲基丙酰基氨基)-6-氧代-1H-嘌呤-9-基]四氢呋喃-3-基]氧基次膦酸(0.79g,48％收率,80％纯度)，为白色固体。(MS:[M+1]+1364.0)。
步骤2:N-[9-[(47S,48R,49R,50R,51R,52R,53R,54R)-49-[2-[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲基]硫乙基]-52-[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基-87,88-二羟基-53-[2-(2-甲基丙酰基氨基)-6-氧代-1H-嘌呤-9-基]-87,88-二氧代-77,78,79,80,81,82-六氧杂-87,88-二磷三环十八烷-54-基]嘌呤-6-基]苯甲酰胺的合成
向[(2R,3R,4R,5S)-5-[[[(2R,3R,4R,5R)-5-(6-苯甲酰氨基嘌呤-9-基)-4-[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基-2-(羟基甲基)四氢呋喃-3-基]氧基-(2-氰基乙氧基)磷酰基]氧基甲基]-4-[2-[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲基]硫乙基]-2-[2-(2-甲基丙酰基氨基)-6-氧代-1H-嘌呤-9-基]四氢呋喃-3-基]氧基次膦酸(0.79g,0.58mmol)在吡啶(16mL)中的溶液中加入2-氯-5,5-二甲基-1,3,2-二氧磷杂环己烷2-氧化物(0.7g,3.8mmol,6.5eq.)。0.5h后，加入CCl4(3.2g,20.6mmol,1.98mL,35.5eq.)、H2O(0.16mL,8.79mmol)和NMM(0.79mL)。将该反应混合物在25℃搅拌0.5h，然后倾入NaHSO3水溶液(饱和,10mL)。5min后，缓慢地加入NaHCO3水溶液(饱和,20mL)。用EtOAc(30mL x 2)萃取该混合物。浓缩有机相，将其溶于CH3CN(8mL)和t-BuNH2(8mL)。0.5h后，浓缩该混合物，通过反相柱纯化(CH3CN/H2O,中性条件,0～40％)，得到N-[9-[(47S,48R,49R,50R,51R,52R,53R,54R)-49-[2-[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲基]硫乙基]-52-[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基-87,88-二羟基-53-[2-(2-甲基丙酰基氨基)-6-氧代-1H-嘌呤-9-基]-87,88-二氧代-77,78,79,80,81,82-六氧杂-87,88二磷三环十八烷-54-基]嘌呤-6-基]苯甲酰胺(0.5g,60％收率,90.8％纯度)，为白色固体。(MS:[M+1]+1309.8)。
步骤3:2-氨基-9-[(39S,40R,41R,42R,43R,44R,45R,46R)-46-(6-氨基嘌呤-9-基)-41-[2-[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲基]硫乙基]-44-[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基-74,75-二羟基-74,75-二氧代-64,65,66,67,68,69-六氧杂-74,75-二磷三环十八烷-45-基]-1H-嘌呤-6-酮的合成
将N-[9-[(47S,48R,49R,50R,51R,52R,53R,54R)-49-[2-[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲基]硫乙基]-52-[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基-87,88-二羟基-53-[2-(2-甲基丙酰基氨基)-6-氧代-1H-嘌呤-9-基]-87,88-二氧代-77,78,79,80,81,82-六氧杂-87,88二磷三环十八烷-54-基]嘌呤-6-基]苯甲酰胺(500mg,0.38mmol)和甲胺醇溶液(10mL,30％)的混合物在25℃搅拌4h。真空浓缩该反应混合物。通过反相柱纯化残余物(CH3CN/H2O,中性条件,0～30％)，得到2-氨基-9-[(39S,40R,41R,42R,43R,44R,45R,46R)-46-(6-氨基嘌呤-9-基)-41-[2-[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲基]硫乙基]-44-[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基-74,75-二羟基-74,75-二氧代-64,65,66,67,68,69-六氧杂-74,75二磷三环十八烷-45-基]-1H-嘌呤-6-酮(220mg,48％收率,95％纯度)，为白色固体。
步骤4:2-氨基-9-[(19S,20R,21R,22R,23R,24R,25R,26R)-26-(6-氨基嘌呤-9-基)-24-[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基-51,52-二羟基-51,52-二氧代-21-(2-硫烷基乙基)-43,44,45,46,47,48-六氧杂-51,52-二磷三环十八烷-25-基]-1H-嘌呤-6-酮的合成
向2-氨基-9-[(39S,40R,41R,42R,43R,44R,45R,46R)-46-(6-氨基嘌呤
-9-基)-41-[2-[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲基]硫乙基]-44-[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基-74,75-二羟基-74,75-二氧代-64,65,66,67,68,69-六氧杂-74,75二磷三环十八烷-45-基]-1H-嘌呤-6-酮(190mg,0.17mmol)在DCM(4mL)中的溶液中加入2,2-二氯乙酸(0.8mL,9.74mmol,58eq.)。将该混合物在25℃搅拌1h，在0℃用水/Et3N(1:1,V/V,3mL)中和。浓缩该混合物，通过反相柱纯化(CH3CN/H2O,包含0.05％ TEA,0％～40％)，得到2-氨基-9-[(19S,20R,21R,22R,23R,24R,25R,26R)-26-(6-氨基嘌呤-9-基)-24-[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基-51,52-二羟基-51,52-二氧代-21-(2-硫烷基乙基)-43,44,45,46,47,48-六氧杂-51,52二磷三环十八烷-25-基]-1H-嘌呤-6-酮(36mg,25％收率,98％纯度,TEA盐)，为白色固体。(MS:[M+1]+833.3)。
步骤5:2-氨基-9-[(14S,15R,16R,17R,18S,19R,20R,21R)-20-(6-氨基嘌呤-9-基)-17,44,45-三羟基-44,45-二氧代-16-(2-硫烷基乙基)-38,39,40,41,42,43-六氧杂-44,45-二磷三环十八烷-21-基]-1H-嘌呤-6-酮(CDN-B)的合成
向2-氨基-9-[(19S,20R,21R,22R,23R,24R,25R,26R)-26-(6-氨基嘌呤-9-基)-24-[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基-51,52-二羟基-51,52-二氧代-21-(2-硫烷基乙基)-43,44,45,46,47,48-六氧杂-51,52二磷三环十八烷-25-基]-1H-嘌呤-6-酮(36mg,0.043mmol)在MeOH(4mL)中的溶液中加入NH4F(0.16g,4.32mmol,100eq.)。将该混合物在70℃搅拌1h，浓缩，通过反相柱纯化(CH3CN/H2O,包含0.05％ FA,0％～30％)，得到2-氨基-9-[(14S,15R,16R,17R,18S,19R,20R,21R)-20-(6-氨基嘌呤-9-基)-17,44,45-三羟基-44,45-二氧代-16-(2-硫烷基乙基)-38,39,40,41,42,43-六氧杂-44,45二磷酸三环十八烷-21-基]-1H-嘌呤-6-酮(CDN-B,7mg,22.5％收率,99.8％纯度)，为白色固体。
1H NMR(400MHz,D2O)δ＝8.25(s,1H),8.19(s,1H),7.77(s,1H),6.10(s,1H),5.80(d,J＝8.3Hz,1H),5.67(q,J＝8.2Hz,1H),5.05-4.98(m,1H),4.43(d,J＝9.0Hz,1H),4.36(d,J＝12.1Hz,1H),4.31(brs,1H),4.18(d,J＝11.7Hz,1H),4.08-3.97(m,2H),3.11(q,J＝7.2Hz,1H),2.79-2.66(m,2H),2.62-2.51(m,1H),2.28-2.13(m,1H),1.84-1.73(m,1H),1.19(t,J＝7.3Hz,1H)。31P NMR:-0.951、-2.201.MS:[M+1]+718.9。
实施例3靶标结合抗体的制备
抗PD-L1抗体
Ab-A1(鼠-抗PDL1)：通过将编码SEQ ID NO:1的可变重(VH)链和SEQ ID NO:2的可变轻(VL)链的cDNA分别克隆入单独的pFUSEss-CHIg-mG2a(小鼠IgG2a重链恒定区)和pFUSE2ss-CLIg-mk(小鼠κ轻链恒定区)表达载体，制备了编码具有SEQ ID NO:3的重链和SEQ ID NO:5的轻链的鼠抗人PD-L1抗体Ab-A1(鼠-抗PDL1)的表达载体。Ab-A1的VH和VL基于阿替珠单抗。
Ab-A2(鼠-抗PDL1-cys)：使用与Ab-A1类似的技术，制备了编码具有SEQ ID NO:4的重链和SEQ ID NO:5的轻链的鼠抗人PD-L1抗体Ab-A2(鼠-抗PDL1-cys)的表达载体。Ab-A2的VH和VL序列基于阿替珠单抗。Ab-A2的重链恒定区相对于野生型小鼠IgG2a具有两个突变，第一个是CH2结构域中第234位的亮氨酸替换为苯丙氨酸(即L234F，按照与人IgG1序列比对的野生型小鼠IgG2a序列编号，使用Eu编号)，第二个是在CH2结构域中第239位的丝氨酸替换为半胱氨酸，以提供额外的半胱氨酸用于缀合(即S239C，使用相同的编号)。
抗人PD-L1抗体Ab-A1和Ab-A2的重链序列分别如下面SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。在每个序列中重链可变区加有下划线，对于二者，重链可变区是相同的并且相当于SEQ ID NO:1。以粗体显示Ab-A2的SEQ ID NO:4中的L234F和S239C CH2结构域突变。
Ab-A1的重链(SEQ ID NO:3)
Ab-A2的重链(SEQ ID NO:4)
抗人PD-L1抗体Ab-A1和Ab-A2的轻链序列如下面SEQ ID NO:5所示。轻链可变区在序列中加有下划线且相当于SEQ ID NO:2。
Ab-A1和Ab-A2的轻链(SEQ ID NO:5)
Ab-A3(大鼠-抗PDL1)：具有大鼠IgG2b重链恒定区的大鼠抗小鼠PD-L1抗体Ab-A3从BioXcell(BE0101)商购获得。
抗EGFR抗体
Ab-B1(鼠-抗EGFR)：具有小鼠IgG2a重链恒定区的鼠抗人EGFR抗体Ab-B1从BioXcell(BE0279)商购获得。
Ab-B2(μ抗EGFR-cys)：通过将编码SEQ ID NO:6的可变重(VH)链和SEQ ID NO:7的可变轻(VL)链的cDNA分别克隆入单独的pFUSEss-CHIg-mG2a(小鼠IgG2a重链恒定区)和pFUSE2ss-CLIg-mk(小鼠κ轻链恒定区)表达载体，制备了编码具有SEQ ID NO:8的重链和SEQ ID NO:9的轻链的鼠抗人EGFR抗体Ab-B2的表达载体。Ab-B2的VH和VL序列基于西妥昔单抗。Ab-B2重链的CH2结构域的特征在于如上述对Ab-A2所述的突变L234F和S239C，相对于野生型小鼠IgG2a。
抗人EGFR抗体Ab-B2的重链序列如下面SEQ ID NO:8所示。重链可变区加有下划线且相当于SEQ ID NO:6。CH2结构域中的L234F和S239C突变以粗体显示。
Ab-B2的重链(SEQ ID NO:8)
Ab-B2的轻链序列如下面SEQ ID NO:9所示。可变区加有下划线且相当SEQ ID NO:7。
Ab-B2的轻链(SEQ ID NO:9)
Ab-B3(人-抗EGFR):通过将编码SEQ ID NO:10的可变重(VH)链+人IgG1重链恒定区和SEQ ID NO:11的可变轻(VL)链+人Igκ轻链恒定区的cDNA克隆入单独的pcDNA3.4表达载体，制备了编码具有SEQ ID NO:12的重链和SEQ ID NO:13的轻链的鼠-人嵌合抗人EGFR抗体Ab-B3的表达载体。Ab-B2的全长重链和轻链序列基于西妥昔单抗。
抗人EGFR抗体Ab-B3的重链序列如下面SEQ ID NO:12所示。重链可变区加有下划线且相当于SEQ ID NO:10。
Ab-B3的重链(SEQ ID NO:12)
Ab-B3的轻链序列如下面SEQ ID NO:13所示。可变区加有下划线且相当于SEQ IDNO:11。
Ab-B3的轻链(SEQ ID NO:13)
Ab-B4(人-抗EGFR-A/C,V/C):通过将编码SEQ ID NO:14的可变重(VH)链+人IgG1重链恒定区和SEQ ID NO:15的可变轻(VL)链+修饰的人Igκ轻链恒定区的cDNA克隆入单独的pcDNA3.4表达载体，制备了编码具有SEQ ID NO:16的重链和SEQ ID NO:17的轻链的人抗人EGFR抗体Ab-B4的表达载体。Ab-B4的VH和VL基于西妥昔单抗，其中VH在与CH1结构域相邻的109位具有丙氨酸至半胱氨酸突变(即，A109C)。Ab-B4的轻链的特征在于205位的缬氨酸至半胱氨酸突变(即，V205C)。
抗人EGFR抗体Ab-B4的重链序列如下面SEQ ID NO:16所示。重链可变区加有下划线且相当于SEQ ID NO:14。A109C突变以粗体显示。
Ab-B4的重链(SEQ ID NO:16)
Ab-B4的轻链序列如下面SEQ ID NO:17所示。可变区加有下划线且相当于SEQ IDNO:15。V205C突变以粗体显示。
Ab-B4的轻链(SEQ ID NO:17)
抗HER2抗体
Ab-C1(抗HER2)：人源化抗人HER2抗体Ab-C1以曲妥珠单抗商购获得。
抗人HER2抗体Ab-C1的重链序列如下面SEQ ID NO:20所示。重链可变区加有下划线且相当于SEQ ID NO:18。
Ab-C1的重链(SEQ ID NO:20)
Ab-C1的轻链序列如下面SEQ ID NO:21所示。可变区加有下划线且相当于SEQ IDNO:19。
Ab-C1的轻链(SEQ ID NO:21)
抗CD47抗体
Ab-D1(大鼠-抗CD47)：具有大鼠IgG2b重链恒定区的大鼠抗小鼠CD47抗体Ab-D1从BioXcell(BE0270)商购获得。
表达和纯化
根据制造商的方案，使用ExpiFectamineTMCHO转染试剂盒(ThermoFisherScientific,目录号A29129)，将编码靶标结合抗体的重链和轻链的质粒转染到CHO细胞中以表达抗体。用于转染的质粒总量为0.5ug/ml CHO细胞，重链与轻链质粒的比例为2:3。转染后6天，将CHO细胞旋下并过滤培养基，然后加载到蛋白A珠(HiTrap蛋白A HP，GE，目录号：17-0403-01)上并用0.1M甘氨酸(pH 3.0)洗脱。将洗脱的抗体级分合并并浓缩至1ml，并通过尺寸排阻(ENrich Sec650,Bio-Rad,目录号780-1650)将缓冲液交换到PBS中，然后在-80℃储存。
实施例4.CDN-A ADC的制备
CDN-A-连接基的合成
将CDN-A(27mg,0.0385mmol)与Py.(3x 3ml)共蒸发，使用前在高度真空下干燥。加入(4-硝基苯基)碳酸4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)-3-甲基丁酰氨基)-5-脲基戊酰氨基)苄酯(54mg,0.0732mmol,2.0eq.)、HOBt(5.2mg,0.0385mmol,1.0eq.)和DMF(2.5ml)。在搅拌下，加入DIPEA(67μl,0.385mmol,10eq.)。将该混合物在室温在N2气氛中搅拌42小时。用乙酸乙酯(25ml)、叔丁基甲基醚(75ml)和乙酸(30μL,0.521mmol)的溶剂混合物稀释该反应混合物。通过离心采集固体，用叔丁基甲基醚(3x75ml)洗涤，得到44mg粗产物。通过反相柱(CH3CN/H2O,0.1％ FA,0％～30％)进一步纯化20mg粗产物，得到期望的产物(7mg,31％收率,97％纯)。(MS:[M-1]-1298.2)。
抗体与CDN-A的缀合
抗体二硫化物的还原：首先用三-(2-羧乙基)-膦盐酸盐(TCEP)还原靶标结合抗体(2.3摩尔当量的TCEP在室温下1.5小时或40摩尔当量的TCEP在37℃下2小时)。使用脱盐柱(HiTrap脱盐柱,GE,目录号29048684)去除过量TCEP。
铰链半胱氨酸的再氧化：在37℃下用200摩尔当量的脱氢抗坏血酸(DHA，DMSO中0.5M)将还原抗体的铰链半胱氨酸再氧化4小时。在非还原条件下使用SDS-PAGE验证了再氧化。通过30Kd MWCO截留值离心过滤器(Amicon Ultra-15,Merck Millipore,目录号UFC903024)去除过量的DHA。
与CDN-A缀合：(还原抗体的I型)将还原的抗体反应混合物在4℃冷却20min。加入在组氨酸缓冲液(20mM，pH 7.4)中的CDN-A-连接基(与抗体相比4.8摩尔当量)并在4℃下温育80min。(再氧化抗体的II型)将再氧化抗体与10摩尔当量的CDN-A-连接基混合，并且在室温温育4小时。缀合后，用N-乙酰半胱氨酸猝灭反应体系，并在PBS中在FPLC系统控制下用5ml脱盐柱(GE)去除过量的CDN-A-连接基和N-乙酰半胱氨酸。浓缩产生的ADC并在4℃下储存。
DAR测定
为了测定携带CDN-A作为CDN的ADC的DAR，用UV光谱仪测量了OD260/OD280比率并与使用CDN-A和抗体以已知比率的混合物生成的标准曲线进行比较。如下表所示，示例性ADC的DAR值的范围为1至6.3。使用通过替换而具有另外半胱氨酸的Ab-A2抗体(鼠-抗PDL1-cys)的ADC的DAR值显示出比使用野生型Ab-A1抗体(鼠-抗PDL1)更大的DAR值。
表1:示例性CDN-A ADC
ADC ID Ab ID Ab注释 CDN DAR
ADC-IV Ab-B1 鼠-抗EGFR(BioXcell BE0279) CDN-A 1
ADC-V Ab-A3 大鼠-抗PDL1(BioXcell BE0101) CDN-A 1
ADC-VI Ab-A2 鼠-抗PDL1-cys CDN-A 2～4
ADC-VII Ab-B2 鼠-抗EGFR-cys CDN-A 2
ADC-VIII Ab-B3 人-抗EGFR CDN-A 6.3
ADC-IX Ab-B4 人-抗EGFR-A/C,V/C CDN-A 3
ADC-X Ab-C1 人-抗HER2(曲妥珠单抗) CDN-A 4.8
ADC-XI Ab-D1 大鼠-抗CD47(BioXCellBE0270) CDN-A 2.5
实施例5.CDN-B ADC的制备
4-(吡啶-2-基二硫基)戊酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(连接基I)的合成
向4-(吡啶-2-基二硫基)戊酸(24mg,0.1mmol)和NHS(14mg,0.12mmol)在DMA中的溶液中加入EDC(HCl盐,61mg,0.32mmol)。将该溶液在室温搅拌过夜。过滤后，浓缩滤液，用柱纯化(MeOH/DCM＝0％～10％)，得到4-(吡啶-2-基二硫基)戊酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯，为白色固体(8mg,23.5％)。(MS:[M+1]+341.1)。
抗体与CDN-B的缀合
将0.2ml 3mM 2-氨基-9-[(14S,15R,16R,17R,18S,19R,20R,21R)-20-(6-氨基嘌呤-9-基)-17,44,45-三羟基-44,45-二氧代-16-(2-硫烷基乙基)-38,39,40,41,42,43-六氧杂-44,45二磷三环十八烷-21-基]-1H-嘌呤-6-酮在磷酸盐缓冲液pH 6.0中的溶液与0.2ml 2mM 4-(吡啶-2-基二硫基)戊酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯的DMA溶液混合。在室温下温育过夜后，加入3.6mg在2ml PBS中的靶标结合抗体，在室温下再温育2小时。浓缩该混合物，用5ml脱盐柱纯化缀合物，该脱盐柱用PBS平衡的FPLC系统控制。浓缩产生的ADC，在4℃储存。
DAR测定
为了从ADC中释放CDN-B，将DTT添加到ADC中至终浓度为10mM，在95℃下温育5min并通过30KD截留值滤膜。将滤液稀释并添加到用0.5nM产气溶血素(PFO)透化的THP1 LuciaISG细胞中。16小时后，测量萤光素酶活性，通过与标准曲线比较计算从ADC释放的活性化合物的浓度和DAR值。如下表所示，示例性ADC的DAR值的范围在0.33至1.66。
表2:示例性CDN-B ADC
实施例6.CDN-A和CDN-B ADC的细胞活性
IFN刺激活性
两种报道细胞系，即小鼠巨噬细胞RAW-Lucia ISG和人单核细胞THP1-Lucia ISG用于评估ADC的活性。两种细胞系均包含融合至ISG54最小启动子的IFN刺激响应元件(ISRE)。将不同浓度(0.3、1.0和/或3μM)的ADC添加到报道细胞中并温育16h。将代表干扰素表达诱导的萤光素酶活性与标准化合物(cGAMP)的系列稀释液进行比较。
如表3中所概括的，ADC-I至ADC-XI证实了不同效能的有效干扰素刺激活性。将所报告的“cGAMP等效”值定义为诱导相同水平的由1μM ADC诱导的响应所需的cGAMP的浓度(μM)。
表3：报道细胞中IFN刺激活性的效能
所有ADC在小鼠RAW-Lucia ISG报告基因测定法中显示出强效的干扰素刺激活性(表3)。ADC-I和ADC-VI具有最高效能(分别为图1B和6B)，接着是ADC-VIII、ADC-IX(分别为图8B和9B)，然后是ADC-IV、ADC-V和ADC-X(分别为图4B、5B和10)，然后为ADC-III(图3B)、ADC-II(图IIB)和ADC-XI。如图3B、4B、5B和6B中所示，当与单独用抗体或单独用CDN或抗体和激动剂效能二者的组合值相比时，用所公开的ADC的处理证实了干扰素刺激活性的协同作用。
CDN-A抗体缀合物还在使用人单核细胞THP1-Lucia ISG细胞的报告基因测定法中证实了干扰素刺激活性(表3)。在所测试的ADC中，ADC-I具有最高效能(图1C)，接着是ADC-II(图1C)和ADC-III。
在稳定表达人EGFR的THP1-lucia ISG细胞系中进一步测试了ADC-VIII和ADC-IX的活性。这两种ADC在这些细胞中均显示出强烈的干扰素刺激活性(表4)。将所报告的“cGAMP等效”值定义为诱导相同水平的由1nM ADC诱导的响应所需的cGAMP的浓度(nM)。EC50为半数最大有效浓度。
表4:ADC-VIII和ADC-IX在THP1-EGFR-lucia ISG细胞中的活性
ADC ID cGAMP等效 EC50
ADC-VIII 977 11.7nM
ADC-IX 912 8.2nM
实施例7.CDN-A和CDN-B ADC的抗肿瘤功效
在小鼠同基因肿瘤模型B16-F10转移黑素瘤、人EGFR转染的B16F10(B16F10-EGFR)和人HER2转染的Lewis肺癌(LLC1-HER2)中测试了选择的ADC的抗肿瘤功效。简言之，将100μL PBS中的106个对数期肿瘤细胞皮下注入C57BL6小鼠的右胁腹。4-6天后，当肿瘤体积为50-100mm3时，根据其肿瘤大小将小鼠重新分组，并用50-200μg ADC或未缀合的抗体、未缀合的CDN或模拟物PBS作为对照进行腹膜内处理(关于处理细节，参见附图说明)。
监测了肿瘤体积和小鼠存活。ADC-IV、ADC-VI、ADC-VII、ADC-VIII和ADC-IX证实了在消退和存活两方面的强大抗肿瘤功效，并且是治疗人类肿瘤的潜在候选者。证实了ADC-X减缓肿瘤进展。也显示了ADC-I减缓肿瘤进展，但观察到毒性。
肿瘤体积
在携带B16F10肿瘤的小鼠中，与模拟物、单独的抗PDL1抗体、单独的CDN-B以及抗PDL1抗体和未缀合的CDN-B组合相比，用ADC-I(抗PDL1-CDN-B)的处理减缓了肿瘤进展(图1C)。
在携带B16F10-EGFR肿瘤的小鼠中，与模拟物处理或抗PDL1抗体处理相比，用ADC-IV(抗EGFR-CDN-A)的处理减缓了肿瘤进展并且减小了肿瘤体积(图4C和4E)。使用抗EGFR抗体加未缀合的CDN的对比处理未能阻止肿瘤生长(图4C)，这表明使用ADC进行靶向CDN递送时功效改善。当将ADC-IV与抗PDL1抗体组合时，观察到对肿瘤扩大的完全抑制(图4E)，这表明CDN ADC与检查点抑制剂组合时功效改善。
在携带B16F10-EGFR肿瘤的小鼠中，以200μg的剂量腹膜内施用(图6C)或10μg或50μg的剂量瘤内施用(图6D)的ADC-VI(抗PDL1-CDN-A)防止了肿瘤扩大。在ADC-VI处理后两周内，B16F10-EGFR肿瘤显示完全缓解，而单独使用抗PDL1抗体或用模拟物处理未能阻止肿瘤扩大。
在携带B16F10-EGFR肿瘤的小鼠中，与用模拟物处理或用抗PDL1抗体处理相比，ADC-VII(抗EGFR-CDN-A)导致肿瘤扩大显著减小(图7C和7E)。用抗EGFR抗体加未缀合的CDN的对比处理未能阻止肿瘤生长(图7C)，这表明使用ADC进行靶向CDN递送时功效改善。当将ADC-VII与抗PDL1抗体组合时，观察到肿瘤抑制增强，而单独使用抗PDL1抗体处理或用模拟物处理未能阻止肿瘤扩大(图7E)，这表明CDN ADC与检查点抑制剂组合时功效改善。
在携带B16F10-EGFR肿瘤的小鼠中，ADC-VIII(抗EGFR-CDN-A)导致肿瘤扩大显著减小(图8C)。当将ADC-VIII与抗PDL1抗体联用时，这种效果得到增强，而单独使用抗PDL1抗体或用模拟物处理未能阻止肿瘤扩大，这表明当CDN ADC与检查点抑制剂联合使用时，功效改善。
在携带B16F10-EGFR肿瘤的小鼠中，ADC-IX(抗EGFR-CDN-A)导致肿瘤扩大减小，并且当ADC-IX与抗PD-L1抗体组合时观察到类似的效果(图9C)。单独用抗PDL1抗体或用模拟物处理未能阻止肿瘤扩大。
在携带LLC1-HER2肿瘤的小鼠中，ADC-X(抗HER2-CDN-A)在两项单独的小鼠研究(图10C和10E)中减小了肿瘤扩大，而单独用抗PDL1抗体或用模拟物处理未能阻止肿瘤扩大。用抗HER2抗体加未缀合的CDN的对比处理未能阻止肿瘤生长，这表明使用ADC进行靶向CDN递送时功效改善。图10E进一步显示以30μg的剂量瘤内施用ADC-X导致肿瘤完全缓解。
存活
监测了带有B16F10-EGFR或LLC1-HER2肿瘤的小鼠的存活。与单独使用抗PDL1处理(在第26天0/5，图4D；在第29天0/5，图4F)和模拟物(在第23天0/5，图4D；在第20天0/5，图4F)相比，用ADC-IV(抗EGFR-CDN-A)的处理增加了带有B16F10-EGFR肿瘤的小鼠的存活时间(37在第天3/5，图4D；在第39天0/5，图4F)。ADC-IV处理后的存活超过了使用抗EGFR抗体加未缀合的CDN的对比处理的存活(第34天时0/5，图4D)，这表明当使用ADC进行靶向CDN递送时功效改善。ADC-IV与抗PDL1抗体的联合处理将小鼠的存活率改善至80％(第42天时4/5)，这表明CDN ADC与检查点抑制剂组合时功效改善。
与单独使用抗PDL1抗体(第29天0/5)或模拟物(第27天0/5)(图6D)的处理相比，用腹膜内施用的ADC-VI(抗PDL1-CDN-A)处理导致了携带B16F10-EGFR肿瘤的小鼠全部存活(第43天5/5)。同样，瘤内施用的ADC-VI处理产生了携带肿瘤的小鼠全部存活(图6F)。
与单独用抗PDL1抗体(第27天0/5，图7F)或模拟物(第23天0/5，图7D和7F)的处理相比，用ADC-VII(抗EGFR-CDN-A)的处理在终点增加了携带B16F10-EGFR肿瘤的小鼠的存活(第36天2/5，图7D和7F)。ADC-VII处理后的存活超过了使用抗EGFR抗体加未缀合的CDN的对比处理的存活(第22天0/5，图7D)，这表明使用ADC进行靶向CDN递送时功效改善。与ADC-VII相比，ADC-VII与抗PDL1抗体的联合处理将小鼠的存活率改善至60％(第36天3/5，图7F)，这表明CDN ADC与检查点抑制剂组合时功效改善。
与单独用抗PDL1抗体(第27天0/5)或模拟物(第25天0/5)(图8D)的处理相比，用ADC-VIII(抗EGFR-CDN-A)的处理增加了携带B16F10-EGFR肿瘤的小鼠的存活(第35天1/5)。使用ADC-VIII和抗PD-L1抗体联合的处理将小鼠的存活率改善至80％(第35天4/5)，这表明CDN ADC与检查点抑制剂组合时功效改善。
与单独用抗PDL1抗体(第23天0/5)或模拟物(第19天0/5)(图9D)的处理相比，用ADC-IX(抗EGFR-CDN-A)的处理增加了携带B16F10-EGFR肿瘤的小鼠的存活(在第30天3/5)。使用ADC-IX和抗PD-L1抗体的联合的处理将小鼠的存活率改善至60％(第30天3/5)，这表明CDN ADC与检查点抑制剂组合时功效改善。
与用模拟物的处理(在第32天为0/5)相比，用ADC-X(抗HER2-CDN-A)的处理增加了带有LLCl-HER2肿瘤的小鼠的存活时间(在第41天0/5)(图10D)。ADC-X处理后的存活时间超过了使用抗HER2抗体加未缀合的CDN的对比处理的存活时间(第32天0/5)，这表明使用ADC进行靶向CDN递送时功效改善。

Claims (111)

1.具有式Ia的结构的抗体-药物缀合物(ADC)：
(式Ia)Ab-[-L-D]n
其中：
“D”表示具有式IIk的结构的环状二核苷酸(CDN)：
其中
W、X、Y和Z独立地为CH或N；
R1为被巯基、氨基或C1-6烷基氨基取代的C2-4烷基；
Rp每次出现时独立地为羟基、巯基、C1-6烷基、硼烷基(-BH3 -)或-NR’R”，其中R’和R”每次出现时独立地为氢或C1-6烷基，该C1-6烷基任选地被一个或多个基团取代，所述基团选自卤素、巯基、羟基、羧基、C1-6烷氧基、C1-6羟基烷氧基、-OC(O)C1-6烷基、-N(H)C(O)C1-6烷基、-N(C1-3烷基)C(O)C1-6烷基、氨基、C1-6烷基氨基、二(C1-6烷基)氨基、氧代和叠氮基；或同一氮上的R’和R”一起形成C3-5杂环；
或其药学上可接受的盐；
“Ab”表示结合靶抗原的抗体或其结合片段；
“L”每次出现时独立地表示使一次或多次出现的D连接至Ab的连接基；
“n”表示经由连接基(L)连接至Ab的D的出现次数；
其中CDN(D)在CDN的R1位上的巯基、氨基或C1-6烷基氨基上共价键合至连接基(L)。
2.权利要求1的ADC，其中R1为被氨基取代的C2-4烷基。
3.权利要求1的ADC，其中R1为被C1-6烷基氨基取代的C2-4烷基。
4.权利要求1的ADC，其中R1为被甲基氨基取代的C2-4烷基。
5.权利要求1的ADC，其中R1为被巯基取代的C2-4烷基。
6.权利要求1的ADC，其中D为具有式IIm的结构的CDN：
其中
R1为乙基，其被巯基、氨基或C1-6烷基氨基取代；且
RP每次出现时独立地为羟基或巯基；
或其药学上可接受的盐。
7.权利要求6的ADC，其中该ADC衍生自式IIn的结构：
或其药学上可接受的盐。
8.权利要求6的ADC，其中该ADC衍生自式IIo的结构：
或其药学上可接受的盐。
9.权利要求1的ADC，其中该ADC具有式III的结构：
10.权利要求1的ADC，其中该ADC具有式IIIa的结构：
11.权利要求1的ADC，其中该ADC具有式IV的结构：
12.权利要求1的ADC，其中该ADC具有式IVa的结构：
13.权利要求1-12任一项的ADC，其中X和Z为N。
14.权利要求1-12任一项的ADC，其中X和Z为CH。
15.权利要求1-12任一项的ADC，其中X为N，且Z为CH。
16.权利要求1-15任一项的ADC，其中RP每次出现时独立地为羟基或巯基。
17.权利要求16的ADC，其中两次出现的RP为羟基。
18.权利要求16的ADC，其中两次出现的RP为巯基。
19.权利要求16的ADC，其中一次出现的RP为羟基，另一次为巯基。
20.权利要求1的ADC，其中该ADC衍生自具有如下结构的CDN：
或其药学上可接受的盐。
21.权利要求1的ADC，其中该ADC衍生自具有如下结构的CDN：
或其药学上可接受的盐。
22.权利要求1的ADC，其中该ADC衍生自具有如下结构的CDN：
或其药学上可接受的盐。
23.权利要求1的ADC，其中该ADC衍生自具有如下结构的CDN：
或其药学上可接受的盐。
24.权利要求1的ADC，其中该ADC衍生自具有如下结构的CDN：
或其药学上可接受的盐。
25.权利要求1的ADC，其中该ADC衍生自具有如下结构的CDN：
或其药学上可接受的盐。
26.权利要求1-25任一项的ADC，其中L包含一个或多个可裂解型连接基。
27.权利要求26的ADC，其中可裂解型连接基为酸可裂解型连接基。
28.权利要求26的ADC，其中可裂解型连接基为包含腙或肼的连接基。
29.权利要求26的ADC，其中可裂解型连接基为可还原型连接基。
30.权利要求29的ADC，其中可还原型连接基为二硫连接基。
31.权利要求26的ADC，其中可裂解型连接基为酶可裂解型连接基。
32.权利要求31的ADC，其中酶可裂解型连接基选自多肽、四肽、二肽和β-葡糖苷酸连接基。
33.权利要求31或权利要求32的ADC，其中酶可裂解型连接基可被溶酶体酶裂解。
34.权利要求33的ADC，其中溶酶体酶为组织蛋白酶。
35.权利要求34的ADC，其中连接基包含根据结构式VIIIa、VIIIb、VIIIc或VIIId的一个或多个的区段：
(VIIIa)
(VIIIb)
(VIIIc)
(VIIId)
或其盐，其中：
“肽”表示可被组织蛋白酶B裂解的肽；
T表示包含一个或多个乙二醇单元或亚烷基链或其组合的聚合物；
Ra选自氢、C1-6烷基、磺酸酯和甲基磺酸酯；
p为0-5的整数；
x为0或1；
y为0或1；
z为0或1；
表示连接基与D的连接点；且
*表示与连接基其余部分的连接点。
36.权利要求32的ADC，其中酶可裂解型连接基为二肽，其选自Ala-Ala、Ala-(D)Asp、Ala-Cit、Ala-Lys、Ala-Val、Asn-Cit、Asp-Cit、Asn-Lys、Asn-(D)Lys、Asp-Val、Cit-Ala、Cit-Asn、Cit-Asp、Cit-Cit、Cit-Lys、Cit-Ser、Cit-Val、Glu-Val、苯基Gly-(D)Lys、His-Val、Ile-Cit,Ile-Pro,Ile-Val、Leu-Cit、Lys-Cit,Me3Lys-Pro、Met-Lys、Met-(D)Lys、Phe-Arg、Phe-Cit、Phe-Lys、Pro-(D)Lys、Ser-Cit、Trp-Cit、Val-Ala、Val-(D)Asp、NorVal-(D)Asp、Val-Cit、Val-Glu和Val-Lys.
37.权利要求1-36任一项的ADC，其中L包含一个或多个自消除型间隔基。
38.权利要求1-37任一项的ADC，其中L经由马来酰亚胺基团、活化二硫化物、活性酯、卤代甲酸酯、酰卤、烷基卤或苄基卤与Ab偶联。
39.权利要求38的ADC，其中L经由选自DSDM、SPDB和磺基-SPDB的活化二硫化物与Ab偶联。
40.权利要求38的ADC，其中L经由选自NHS酯和HOBt酯的活性酯与Ab偶联。
41.权利要求40的ADC，其中L经由马来酰亚氨基己酰基(mc)或N-琥珀酰亚氨基-4-(2-吡啶基二硫基)丁酸酯(SPDB)基团与Ab偶联。
42.权利要求1-41任一项的ADC，其具有在L与Ab之间与Ab上的巯基或伯氨基形成的共价键。
43.权利要求42的ADC，其中共价键为硫醚。
44.权利要求1的ADC，其中该ADC具有如下结构：
45.权利要求1的ADC，其中该ADC具有如下结构：
46.权利要求1-45任一项的ADC，其中n为1、2、3、4、5、6、7或8。
47.权利要求46的ADC，其中n为2。
48.权利要求46的ADC，其中n为4。
49.权利要求1-48任一项的ADC，其中Ab为结合PD-L1的抗体。
50.权利要求1-48任一项的ADC，其中Ab为结合抗原的抗体，该抗原为生长因子受体(GFR)。
51.权利要求50的ADC，其中GFR为EGFR。
52.权利要求50的ADC，其中GFR为ErbB。
53.权利要求50的ADC，其中GFR为ErbB2。
54.权利要求50的ADC，其中GFR为HER家族受体。
55.权利要求1-48任一项的ADC，其中Ab为结合CD47的抗体。
56.权利要求1-48任一项的ADC，其中Ab为结合优先在癌细胞中表达或过表达的抗原的抗体。
57.权利要求1-48任一项的ADC，其中Ab为结合来源于感染人体细胞的微生物的抗原的抗体。
58.药物组合物，其包含权利要求1-57任一项的ADC。
59.刺激有需要的人类患者的免疫应答的方法，其包括对该患者施用有效量的权利要求58的药物组合物。
60.治疗有需要的人类患者的癌症的方法，其包括对该患者施用有效量的权利要求58的药物组合物。
61.权利要求59或60的方法，其中通过静脉内施用所述药物组合物。
62.权利要求59或60的方法，其中通过皮下施用所述药物组合物。
63.权利要求59或60的方法，其中通过瘤内施用所述药物组合物。
64.权利要求59-63任一项的方法，其还包括向所述患者施用PD-1抑制剂。
65.权利要求59-63任一项的方法，其还包括向所述患者施用PD-L1抑制剂。
66.权利要求59-63任一项的方法，其还包括向所述患者施用CTLA-4抑制剂。
67.权利要求59-63任一项的方法，其还包括向所述患者施用另外的抗癌药。
68.权利要求59-67任一项的方法，其还包括向所述患者施用放射。
69.权利要求59-68任一项的方法，其还包括向所述患者施用第二种CDN，其中第二种CDN不与抗体缀合。
70.化合物，其中该化合物具有式IIk：
其中
W、X、Y和Z独立地为CH或N；
R1为乙基，其被氨基或C1-6烷基氨基取代；
Rp每次出现时独立地为羟基、巯基、C1-6烷基、硼烷基(-BH3 -)或-NR’R”，其中R’和R”每次出现时独立地为氢或C1-6烷基，该C1-6烷基任选地被一个或多个基团取代，所述基团选自卤素、巯基、羟基、羧基、C1-6烷氧基、C1-6羟基烷氧基、-OC(O)C1-6烷基、-N(H)C(O)C1-6烷基、-N(C1-3烷基)C(O)C1-6烷基、氨基、C1-6烷基氨基、二(C1-6烷基)氨基、氧代和叠氮基；或同一氮上的R’和R”一起形成C3-5杂环；
或其药学上可接受的盐。
71.权利要求70的化合物，其中RP每次出现时独立地为羟基或巯基。
72.权利要求70或71的化合物，其中Y和W均为CH。
73.权利要求70-72任一项的化合物，其中X和Z均为N。
74.权利要求70-73任一项的化合物，其中R1为被氨基取代的乙基。
75.权利要求70-73任一项的化合物，其中R1为被C1-6烷基氨基取代的乙基。
76.权利要求75的化合物，其中R1为被甲基氨基取代的乙基。
77.权利要求70-76任一项的化合物，其中至少一次出现的RP为羟基。
78.权利要求77的化合物，其中两次出现的RP为羟基。
79.权利要求77的化合物，其中一次出现的RP为羟基，而另一次为巯基。
80.权利要求70-76任一项的化合物，其中至少一次出现的RP为巯基。
81.权利要求80的化合物，其中两次出现的RP为巯基。
82.权利要求70的化合物，其中该化合物选自：
或其药学上可接受的盐。
83.权利要求的化合物82，其中该化合物为：
或其药学上可接受的盐。
84.组合物，其包含环状二核苷酸(CDN)和碱，其中CDN为权利要求70-83任一项的化合物。
85.权利要求84的组合物，其中该组合物由CDN和碱组成。
86.权利要求84或85的组合物，其中所述碱为胺碱。
87.权利要求86的组合物，其中所述胺碱选自吡啶、哌啶、吡咯烷、吗啉、二甲基吡啶、三乙胺(TEA)和二异丙基乙胺(DIPEA)。
88.权利要求87的组合物，其中所述胺碱为吡啶。
89.组合物，其包含：
环状二核苷酸(CDN)；以及
连接基或偶联剂或者连接基和偶联剂二者；
其中CDN为权利要求70-83任一项的化合物，且偶联剂促进CDN偶联至连接基。
90.权利要求89的组合物，其中偶联剂能够在连接基上生成活化酯。
91.权利要求89或90的组合物，其中该组合物还包含疏质子极性溶剂。
92.权利要求91的组合物，其中疏质子极性溶剂选自二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基乙酰胺(DMA)、乙腈或四氢呋喃(THF)。
93.权利要求84-92任一项的组合物，其中该组合物为无水的。
94.权利要求84-93任一项的组合物，其中CDN具有如下结构：
或其药学上可接受的盐。
95.式L-CDN的化合物，其中
L为连接基，其包含能够偶联至抗体或抗原结合片段上的互补位点的位点；
CDN为具有式IIk的结构的环状二核苷酸：
其中
W、X、Y和Z独立地为CH或N；
R1为C1-6烷基，其被巯基、氨基或C1-6烷基氨基取代；
Rp每次出现时独立地为羟基、巯基、C1-6烷基、硼烷基(-BH3 -)或-NR’R”，其中R’和R”每次出现时独立地为氢或C1-6烷基，该C1-6烷基任选地被一个或多个基团取代，所述基团选自卤素、巯基、羟基、羧基、C1-6烷氧基、C1-6羟基烷氧基、-OC(O)C1-6烷基、-N(H)C(O)C1-6烷基、-N(C1-3烷基)C(O)C1-6烷基、氨基、C1-6烷基氨基、二(C1-6烷基)氨基、氧代和叠氮基；或同一氮上的R’和R”一起形成C3-5杂环；
或其药学上可接受的盐；且
CDN在R1的巯基、氨基或C1-6烷基氨基上偶联至L。
96.权利要求95的化合物，其中CDN经由硫醚、酰胺、酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、脲、二硫化物或醚基偶联至L。
97.权利要求96的化合物，其中该化合物具有式IXb的结构：
其中RL表示连接基L的其余部分。
98.权利要求96的化合物，其中该化合物具有式IXf的结构：
其中RL表示连接基L的其余部分。
99.权利要求95-98任一项的化合物，其中RP每次出现时独立地为羟基或巯基。
100.权利要求95-99任一项的化合物，其中Y和W均为CH。
101.权利要求95-100任一项的化合物，其中X和Z均为N。
102.权利要求95-101任一项的化合物，其中R1为被氨基取代的乙基。
103.权利要求95-101任一项的化合物，其中R1为被C1-6烷基氨基取代的乙基。
104.权利要求103的化合物，其中R1为被甲基氨基取代的乙基。
105.权利要求95-104任一项的化合物，其中至少一次出现的RP为羟基。
106.权利要求105的化合物，其中两次出现的RP为羟基。
107.权利要求105的化合物，其中一次出现的RP为羟基，而另一次为巯基。
108.权利要求95-104任一项的化合物，其中至少一次出现的RP为巯基。
109.权利要求108的化合物，其中两次出现的RP为巯基。
110.权利要求95的化合物，其中CDN具有如下结构：
或其药学上可接受的盐。
111.权利要求95的化合物，其中CDN具有如下结构：
或其药学上可接受的盐。
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