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CN120801576A - 一种基于lc-ms测定生物样本中肉桂酰甘氨酸的方法 - Google Patents

一种基于lc-ms测定生物样本中肉桂酰甘氨酸的方法

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CN120801576A
CN120801576A CN202511299380.8A CN202511299380A CN120801576A CN 120801576 A CN120801576 A CN 120801576A CN 202511299380 A CN202511299380 A CN 202511299380A CN 120801576 A CN120801576 A CN 120801576A
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Abstract

本发明属于分析检测技术领域，具体涉及一种基于LC‑MS测定生物样本中肉桂酰甘氨酸的方法，包括以下步骤：将生物样本与提取液混合，经提取处理后获得上清液；经蒸发浓缩、复溶于乙腈水溶液中，获得待测溶液；用PBS溶液稀释肉桂酰甘氨酸标准品储备液，获得浓度梯度的标准品溶液；将标准品溶液与提取液混合，进行提取处理后获得混标溶液，通过LC‑MS对混标溶液进行测试，获得标准曲线；对待测溶液进行测试，根据标准曲线获得的待测溶液中肉桂酰甘氨酸的含量。该方法能够对样品中的肉桂酰甘氨酸进行精确的定性和定量分析，具有处理简单、通量高、结果可靠的优势，易于临床推广及普及。

Description

一种基于LC-MS测定生物样本中肉桂酰甘氨酸的方法
技术领域
本发明属于分析检测技术领域，具体涉及一种基于LC-MS测定生物样本中肉桂酰甘氨酸的方法。
背景技术
代谢组学（Metabolomics）是系统生物学的重要组成部分，旨在全面分析生物体内小分子代谢物（分子量<1500 Da）的动态变化，揭示生物体在生理、病理或外界刺激下的代谢响应。代谢组学技术包括色谱技术、质谱技术和磁共振技术等多种技术手段，具有检测速度快、仪器自动化程度高、高通量、检测质量可控和重复性良好等优点，常用于代谢组学中小分子代谢物的检测。
近些年，随着代谢组学技术的发展，代谢组学已逐渐成为研究代谢性疾病（包括2型糖尿病和妊娠期糖尿病（GDM））的公认有效研究方法。肉桂酰甘氨酸（CMG）是肉桂酸的甘氨酸共轭体，由肠道微生物产生，在常规小鼠的血清中含量丰富，但在无菌小鼠的血清中浓度极低。肉桂酰甘氨酸的尿清除率远高于肌酐，因此在肾功能减退的条件下会在血浆中积聚。在调整肌酐后，肉桂酰甘氨酸与多样性和临床特征之间的关联不受影响。尽管其在人类中的功能效应未知，但肉桂酰甘氨酸的尿排泄水平已被提出作为艰难梭菌定植抗性的标志物，即作为可以抑制致病微生物生长的健康肠道微生物组的标志物。
液相色谱-质谱联用法因具有高灵敏度、高精密度、高通量的优点在生物样品检测中得到广泛的应用。由于生物样品的成分复杂、干扰因素多，且肉桂酰甘氨酸为内源性代谢物，其在生物样品中的含量极低，不易被检测，限制了肉桂酰甘氨酸作为标志物在糖尿病早期诊断中的应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于LC-MS测定生物样本中肉桂酰甘氨酸的方法，以克服现有技术的不足，建立一种适用于人体内源性代谢物的分析方法，该方法是可满足临床大批量样本检测需求的高效、快速、准确的检测方法，能为代谢组学技术手段在临床疾病筛选或诊断中提供重要支持。
为了实现上述目的，本发明的技术方案为：
本发明提供一种基于LC-MS测定生物样本中肉桂酰甘氨酸的方法，包括以下步骤：
将生物样本与提取液混合，进行提取处理后获得上清液；将上清液蒸发浓缩、复溶于乙腈水溶液中，过滤后获得待测溶液；
提取液包括内标溶液和溶剂，所述内标溶液包括[2H7]-N-肉桂基甘氨酸和甲醇/水溶液，所述溶剂为甲醇、乙腈、甲醇-乙腈、1 %甲酸-甲醇-水和0.1 %甲酸-乙腈中的一种或多种；
用PBS溶液稀释肉桂酰甘氨酸标准品储备液，获得浓度梯度的标准品溶液；
通过LC-MS对待测溶液进行测试，根据标准曲线获得待测溶液中肉桂酰甘氨酸的含量。
本发明使用液相色谱-串联质谱（LC-MS）定量检测生物样本中肉桂酰甘氨酸的含量，建立了一种适用于人体内源性代谢物的分析方法，该方法是可满足临床对于大批量样本检测需求的高效、快速、准确的检测方法，为代谢组学技术手段在临床疾病的筛选或诊断中提供重要的支持。
在一些其他实施方式中，提取液包括内标溶液和溶剂，内标溶液包括[2H7]-N-肉桂基甘氨酸和甲醇/水溶液，所述溶剂为甲醇、乙腈、甲醇-乙腈、1 %甲酸-甲醇-水、0.1 %甲酸-乙腈。更具体地，甲醇-乙腈（1:1）、甲醇-乙腈（1:9）、1 %甲酸-甲醇:水（9:1）、0.1 %甲酸-乙腈。进一步，溶剂为乙腈。
[2H7]-N-肉桂基甘氨酸作为肉桂酰甘氨酸的同位素内标物，二者结构与理化性质高度一致，氘代（2H7）标记仅替换氢原子，不改变分子结构、极性或色谱行为，确保与目标物（肉桂酰甘氨酸）在保留时间、离子化效率、基质效应上完全一致，避免了传统标记如13C/15N标记因天然同位素峰导致信号干扰，而氘代标记的质谱偏移更大，减少背景噪声影响，避免因结构差异导致的回收率偏差。[2H7]-N-肉桂基甘氨酸和甲醇/水溶液组成内标液，兼具溶解性和稳定性。通过优化浓度和储存条件，可显著提升LC-MS定量的准确性，尤其适用于复杂生物样本（血浆、尿液）中肉桂酰甘氨酸的检测。通过研究发现，使用甲醇、乙腈、甲醇：乙腈 1:1、甲醇：乙腈 1:9、1 %甲酸-甲醇:水 9:1、0.1 %甲酸-乙腈等进行提取，结果表明，当溶剂为乙腈时，肉桂酰甘氨酸的提取效率最高。
在一些其他实施方式中，生物样本为血浆、血清、血液、尿液、粪便和唾液中的一种。
本发明的方法通量高、成本低，有效监测生物体内肉桂酰甘氨酸水平，易于临床推广及普及。
在一些其他实施方式中，生物样本与提取液的混合体积比为1:（3-6）；提取液中内标物的浓度为1-3 ng/mL。该范围内生物样本中的肉桂酰甘氨酸的提取率较高。
在一些其他实施方式中，生物样本与提取液的混合体积比为1:5；提取液中内标物的浓度为2 ng/mL。该比值下生物样本中的肉桂酰甘氨酸的提取率最高。
在一些其他实施方式中，提取处理为依次进行涡旋振荡和离心处理；上清液与乙腈水溶液的体积比为（3-5）:1；乙腈水溶液的体积浓度为35-45%。
示例性地，上清液与乙腈水溶液的体积比为3:1、4:1、5:1；乙腈水溶液的体积浓度为35%、40%、45%。进一步地，上清液与乙腈水溶液的体积比为4:1；乙腈水溶液的体积浓度为40%。该数值范围内的上清液与乙腈水溶液的体积比制得的蛋白沉淀效率、目标物回收率和基质效应最佳。
在一些其他实施方式中，液相色谱分析中采用的色谱柱为采用的色谱柱为C18柱、ADME柱和HILIC柱中的一种或多种，柱温为25-30℃；流速为0.3-0.4 mL/min，进样量为8-12μL；
流动相分为流动相A和流动相B，流动相A为含0.03-0.06%甲酸的乙腈，流动相B为含0.05-0.15 %甲酸的水，采用梯度洗脱分离。
更为具体地，液相色谱分析中采用的色谱柱中的C18柱为Agilent RRHD EclipsePlus C18柱或Titank C18柱，ADME柱为APCELL PAK ADME HR柱，HILIC柱为PC HILIC柱；优选地，色谱柱为APCELL PAK ADME HR (S-3），2.1μm×100mm，柱温为25℃、30℃；流速为0.3、0.35、0.4 mL/min，进样量为8、10、12 μL；流动相A为含0.03 %、0.04 %、0.05 %、0.06 %甲酸的乙腈，流动相B：含0.05 %、0.1 %、0.15 %甲酸的水。
在一些其他实施方式中，液相色谱分析中采用的柱温为25℃；流速为0.35 mL/min，进样量为10 μL；流动相A为含0.05%甲酸的乙腈，流动相B为含0.1 %甲酸的水，采用梯度洗脱程序分离为：0-1min，30％A，1-2min，30%-50％A，2-2.5min，50%-90％A，2.5-5min，90％A，5.1-8 min，30％A。
由于血浆中成分复杂，存在干扰物影响，通过比较不同型号色谱柱分离时的优缺点，例如Titank C18、C18-AQ、PC HILIC等，最终确定为APCELL PAK ADME HR色谱柱。由于CMG为负离子，正负同扫有困难，因此在流动相中尝试加入不同比例的氟化铵、甲酸、乙酸，提高CMG的信号响应。分析发现氟化铵会降低CMG的响应，甲酸和乙酸会提高CMG的响应，在流动相中加入甲酸有利于提高分离度，使肉桂酰甘氨酸与干扰物能够较好的分离，进一步摸索分别在AB两相中加入不同比例的甲酸，发现流动相A：含0.05%甲酸的乙腈，流动相B：含0.1%甲酸的水响应最高，且不受干扰物影响。
梯度洗脱条件和流速：流速对分离时间和峰形有影响。通过尝试0.3 mL/min、0.35mL/min、0.4 mL/min等流速，比较不同流速下CMG的响应值和峰形，结果发现当流速为0.35mL/min响应值高，峰形窄。另外摸索梯度洗脱条件，改变流动相初始洗脱比例，最终得到最佳洗脱条件。该条件分析时间短，仅需要5 min，最后平衡3 min，方便多次连续进样。
在一些其他实施方式中，质谱分析中，采用负离子电喷雾离子化的多离子反应监测模式，气帘气：30 -35 kPa，喷雾电压：3700-3900 V，去溶剂温度：550-650 ℃，GS1:25-35kPa，GS2:70-80 kPa；采用的离子对为160/167，130/137，103/109对离子对中的一种。示例性的，气帘气：30、35 kPa，喷雾电压：3700、3800、3900 V，去溶剂温度：550、600、650 ℃，GS1:25、30、35 kPa，GS2:70、75、80 kPa。该范围内的参数的设置对CMG检测的灵敏度、分辨率、准确性和重现性较好。
在一些其他实施方式中，质谱分析中，采用负离子电喷雾离子化的多离子反应监测模式，气帘气：30 kPa，喷雾电压：3800 V，去溶剂温度：600 ℃，GS1:30 kPa，GS2:75 kPa；采用的离子对为103/137离子对。该范围内的参数的设置对CMG检测的灵敏度、分辨率、准确性和重现性最好。
本发明的有益效果：
（1）本发明公开了一种检测血液样品中肉桂酰甘氨酸的方法，通过简单的液液萃取方法对生物样品进行前处理，然后进入色谱分离及质谱检测，选择一对定性离子和定量离子，以肉桂酰甘氨酸的相对保留时间和定性离子对作为定性依据，以标准品制作标准曲线定量。同时，本发明应用三个水平的质控品考察方法的准确性和有效性，避免检测结果失真。该方法操作简便、快速分析时间仅8分钟，具有高通量和成本低等优势，对妊娠期糖尿病的早期诊断具有指导意义，易于临床推广及普及。
（2）本发明中使用的提取方法，可以较多的去除杂质，降低检测时的基质效应，减少离子干扰，且操作简单快捷，可以灵敏地检测出人体内含量较低的肉桂酰甘氨酸。肉桂酰甘氨酸的曲线相关性良好（R>0.99），线性范围为0.02-10 ng/mL，检出限为0.02 ng/mL，偏差在±15 %以内。显著地降低了检测成本、节省时间、减少采集被检测人的血量。
综上，本发明首次实现了对血浆样本进行前处理，用LC-MS技术对血浆样本中肉桂酰甘氨酸检测的目的，用两对离子进行定量和定性保证了检测物的特异性，降低了干扰物质的影响且该方法操作简便快速分析时间仅8 min，通量高、成本低，且对方法进行了性能验证，稳定性好，有效监测人体内肉桂酰甘氨酸水平，便于对妊娠期糖尿病的早期诊断，具有指导意义，易于临床推广及普及。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例1中肉桂酰甘氨酸标准品的质谱图；
图2为本发明实施例1中内标[2H7]-N-肉桂基甘氨酸标准品的质谱图；
图3为本发明实施例1中建立的标准曲线图。
具体实施方式
本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用组分未注明生产商者，均为可通过市售获得的常规产品。
针对血液中氨基酸含量常见的测定的方法中，高效液相色谱法、毛细管电泳法存在结果差异大、线性差、衍生化操作复杂、通量小等问题。氨基酸分析仪测定法具有样品用量大和分析时间长的缺点。气相色谱-质谱法的衍生步骤复杂，衍生反应干扰多。肉桂酰甘氨酸在血浆中浓度含量极低不易被检测，本发明采用蛋白沉淀法提取肉桂酰甘氨酸，通过改变流动相的组成、色谱柱及质谱条件，从而对生物样品中肉桂酰甘氨酸进行定性与定量分析。
本发明提供一种基于LC-MS测定生物样本中肉桂酰甘氨酸的方法，包括以下步骤：
将生物样本与提取液混合，进行提取处理后获得上清液；将上清液蒸发浓缩、复溶于乙腈水溶液中，过滤后获得待测溶液；
提取液包括内标溶液和溶剂，所述内标溶液包括[2H7]-N-肉桂基甘氨酸和甲醇/水溶液，所述溶剂为甲醇、乙腈、甲醇-乙腈、1 %甲酸-甲醇-水和0.1 %甲酸-乙腈；
用PBS溶液稀释肉桂酰甘氨酸标准品储备液，获得浓度梯度的标准品溶液；
通过LC-MS对待测溶液进行测试，根据标准曲线获得的待测溶液中肉桂酰甘氨酸的含量。
下面结合具体实施例对本发明的方案进一步说明：
实施例1
一种基于LC-MS测定生物样本中肉桂酰甘氨酸的方法，包括以下步骤：
（1）生物样本前处理：取生物样本（以血浆为例）200 μL，加1 mL含内标溶液的乙腈作为提取液，涡旋5 min，14000 rpm离心5 min，制得上清液。取1 mL上清浓缩干燥，加50 μL40 %乙腈水溶液复溶，采用0.2 μm滤膜过滤后，获得待测生物样品。
其中，提取液的配制：采用[2H7]-N-肉桂基甘氨酸（产品编号：IR-72407）作为同位素内标物（质谱图如图2所示）。将同位素内标物溶于甲醇/水溶液（1:1），配制成浓度为1 μg/mL的内标溶液。用乙腈稀释内标溶液，制成浓度为2 ng/mL的含内标溶液的乙腈作为提取液。
（2）标准工作液的制备：
实际检测的生物样品如血浆中的组成复杂、干扰因素多。由于肉桂酰甘氨酸为内源性代谢物，若采用血浆作为基质，在检测前需要复杂的前处理步骤来去除干扰物质。替代基质能减少对目标分析物检测的干扰。替代基质具有特定的化学或生物特性，能够与目标分析物有特异性的相互作用或者能够特异性地反映目标分析物的存在。
研究过程中，分别采用5 %-20 %牛血清白蛋白（BSA）、0.9 %氯化钠、磷酸盐缓冲盐溶液（PBS）、5 %牛血清白蛋白-磷酸盐缓冲盐溶液（BSA-PBS）作为替代基质。研究发现，BSA、0.9 %氯化钠均有基质效应，而加入PBS可使基质效应降低。因此，最终选择PBS作为替代基质。
具体地，标准工作液的制备如下：将肉桂酰甘氨酸标准品（质谱图如图1所示）加入水中，配制成10 ng/mL肉桂酰甘氨酸标准品储备液。然后，分别用PBS溶液（作为血浆的替代基质）对10 ng/mL肉桂酰甘氨酸标准品储备液分别进行梯度稀释，共制得10个浓度（0.02、0.04、0.08、0.16、0.31、0.625、1.25、2.5、5、10 ng/mL）的标准品溶液。
（3）液相色谱串联质谱（LC-MS）检测：
液相色谱参数设置：色谱柱选择APCELL PAK ADME HR （S-3），2.1μm*100mm，柱温：25℃；流速为0.35 mL/min，进样量为10 μL。流动相分为流动相A和流动相B，其中，流动相A为含0.05%甲酸的乙腈，流动相B为含0.1%甲酸的水。采用梯度洗脱程序分离，具体梯度洗脱程序如表1所示：0-1 min，30％ A，1-2 min，30%-50％ A，2-2.5 min，50%-90％ A，2.5-5min，90％ A，5.1 min，30％ A。该条件分析时间短，仅需要5 min，最后平衡3 min，方便多次连续进样。
表1 梯度洗脱条件
质谱参数设置：采用负离子电喷雾离子化的多离子反应监测模式，质谱参数设置包括离子源参数设置和MRM参数设置（如表2所示）。其中，离子源参数包括：气帘气：30 kPa，喷雾电压：3800 V，去溶剂温度：600 ℃，雾化气（GS1）气压：30 kPa，辅助气（GS2）气压：75kPa。
表2 MRM质谱参数
MRM：多离子反应监测模式。是指其中产生和检测离子的质谱方法。
m/z：指通过将离子的质量数除以其电荷数而形成的无量纲量。长期以来，它一直被称为“质荷比”。
CE：碰撞能量。前体离子接收能量并加速进入碰撞池，在那里它们与气体分子（CAD气体）碰撞并形成碎片离子。碰撞能量越高，引起的碎片就越多。
CXP：碰撞室出口电压。CXP 聚焦、加速并将离子从 Q2 传输到 Q3。
由表2可知，通过对质谱条件进行优化，总共有三对离子对，具体为：160/167、130/137和103/109离子对可以选择。其中，160/167离子对噪声大、基线高，影响低含量的样本检测。103/109离子对虽然基线低，但是有干扰物存在影响目标化合物的检测，最终选择，103/137离子对即肉桂酰甘氨酸选择103，内标选择137进行检测。
（4）标准曲线的绘制：
向步骤（2）中制得的10个浓度（0.02、0.04、0.08、0.16、0.31、0.625、1.25、2.5、5、10 ng/mL）的标准品溶液中，分别加1 mL含内标溶液的乙腈作为提取液，其他制备方法与实施例1相同，制得10个浓度的混标工作液。
使用LC-MS测定各混标工作液的峰面积，以各混标工作液的浓度为x轴，以各混标工作液的峰面积为y轴；通过线性拟合后得到线性范围、标准曲线方程、线性相关系数和检出限，分别见表3所示，标准曲线图如图3所示。
表3 肉桂酰甘氨酸线性范围及方程
由表3可知，肉桂酰甘氨酸的曲线相关性良好（R>0.99），线性范围为0.02-10 ng/mL，检出限为0.02 ng/mL，偏差在±15 %以内。
将待测生物样品的峰面积代入标准曲线方程，反推计算生物样品中肉桂酰甘氨酸的浓度。
（5）重复性
将步骤（2）中的10 ng/mL肉桂酰甘氨酸标准品储备液用PBS平行稀释为6份0.5ng/mL的标准品溶液，分别加1 mL含内标溶液的乙腈作为提取液，其他制备方法与实施例1相同，进样。RSD为1.6 %，RSD小于15.0 %重复性试验符合要求。
（6）加标回收率
用PBS溶液对10 ng/mL肉桂酰甘氨酸标准品储备液分别进行梯度稀释，共制得10个浓度（0.02、0.04、0.08、0.16、0.31、0.625、1.25、2.5、5、10 ng/mL）的标准品溶液，进样得到标曲。选取较低浓度临床样本作为基础样本，加入标准品，配制成低、中、高浓度的待测样本（0.05，0.5，8 ng/mL），每个浓度样本分5份处理，根据公式（1）计算加标回收率，应符合85%-115 %的要求，分析结果见表4。
公式（1）
R－回收率，C－低浓度临床样本中加标后的平均测定浓度，ng/mL；C 0－低浓度临床样本的平均测定浓度，ng/mL；C s－加标量，ng/mL 。
表4 不同浓度下肉桂酰甘氨酸的回收率
由表4可知，各浓度下的回收率均在 85 % - 115 %范围内，9个回收率数据的相对标准差小于 10.0 %。回收率符合要求。
（7）临床样本检测
选取20份正常人的血浆样本（分别编号样品1-20），按步骤（1）中的生物样本的前处理的步骤，制得待测生物样本，采用步骤（3）中的检测方法对待测样品进行检测，通过步骤（4）中的标准曲线方程，测得各待测样品中的肉桂酰甘氨酸的浓度，检测结果如表5所示。
表5临床样本检测结果
从表5可知，本发明用高效液相色谱-质谱法检测血浆中肉桂酰甘氨酸，特异性强，灵敏性高，通量高，结果客观易于分析，尤其适合临床普及应用。
对比例1
一种基于LC-MS测定生物样本中肉桂酰甘氨酸的方法，与实施例1不同的是，步骤（1）生物样本前处理过程中，分别采用含内标溶液的甲醇、乙腈、甲醇:乙腈（体积比1:1）甲醇：乙腈（体积比1:9）1 %甲酸-甲醇：水（体积比9:1）或0.1 %甲酸-乙腈作为提取液，对生物样本（如血浆）进行提取，其他制备方法与实施例1相同。提取剂、提取剂与生物样品的体积方法、CMG响应值如表6所示。
表6不同提取方法制得的CMG响应值
从表6可以看出，提取液血清、乙腈体积比为1:5时，肉桂酰甘氨酸提取效率最高。
实施例2
一种测定生物样本中肉桂酰甘氨酸的方法，与实施例1不同的是，步骤（3）中，分别选择Agilent RRHD Eclipse Plus C18、APCELL PAK ADME HR、PC HILIC和Titank C18等作为色谱柱，其他条件与实施例1相同。分离结果如表7所示。
表7不同型号色谱柱分离肉桂酰甘氨酸的结果
其中，表7中的“√”表示好，“×”表示差。
由于肉桂酰甘氨酸在血液中的含量极低，在质谱中的响应低，不易检测。由表7比较不同型号色谱柱分离时的保留时间、峰形和响应值，结果发现C18柱均能获得较好的保留时间和峰形，由于APCELL PAK ADME HR耐纯水，流动相可以从0%纯水开始洗脱，并且响应值高，最终确定为APCELL PAK ADME HR柱。
综上，本发明首次实现了应用液相色谱-质谱联用方法对生物样品中肉桂酰甘氨酸检测的目的，减少了干扰物影响，该方法操作具有简便、快速（分析时间仅8 min）、高通量、成本低等优势。同时，本发明采用内标法定量，确保了检测结果的准确性，能够有效监测人体内的肉桂酰甘氨酸水平，对妊娠期糖尿病的早期诊断具有指导意义，该方法易于临床推广及普及。
以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种基于LC-MS测定生物样本中肉桂酰甘氨酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将生物样本与提取液混合，进行提取处理后获得上清液；将上清液蒸发浓缩、复溶于乙腈水溶液中，过滤后获得待测溶液；
所述提取液包括内标溶液和溶剂，所述内标溶液包括[2H7]-N-肉桂基甘氨酸和甲醇/水溶液，所述溶剂为甲醇、乙腈、甲醇-乙腈、1 %甲酸-甲醇-水和0.1 %甲酸-乙腈中的一种或多种；
用PBS溶液稀释肉桂酰甘氨酸标准品储备液，获得浓度梯度的标准品溶液；
通过LC-MS对待测溶液进行测试，根据标准曲线获得待测溶液中肉桂酰甘氨酸的含量；
液相色谱分析中采用的色谱柱为C18柱、ADME柱和HILIC柱中的一种或多种，流动相为流动相A和流动相B，流动相A为含0.03-0.06%甲酸的乙腈，流动相B为含0.05-0.15%甲酸的水，采用梯度洗脱程序分离：0-1 min，30％ A，1-2 min，30%-50％ A，2-2.5 min，50%-90％A，2.5-5 min，90％ A，5.1-8 min，30％ A；
质谱分析中，采用的离子对为160/167、130/137和103/109离子对中的一种或多种。
2.根据权利要求1所述的基于LC-MS测定生物样本中肉桂酰甘氨酸的方法，其特征在于，所述生物样本为血浆、血清、血液、尿液、粪便和唾液中的一种。
3.根据权利要求1所述的基于LC-MS测定生物样本中肉桂酰甘氨酸的方法，其特征在于，所述生物样本与提取液的混合体积比为1:（3-6）；
所述提取液中[2H7]-N-肉桂基甘氨酸的浓度为1-3 ng/mL。
4.根据权利要求3所述的基于LC-MS测定生物样本中肉桂酰甘氨酸的方法，其特征在于，所述生物样本与提取液的混合体积比为1:5；
所述提取液中[2H7]-N-肉桂基甘氨酸的浓度为2 ng/mL。
5.根据权利要求1所述的基于LC-MS测定生物样本中肉桂酰甘氨酸的方法，其特征在于，所述提取处理为依次进行涡旋振荡和离心处理；
所述上清液与乙腈水溶液的体积比为（3-5）:1；
所述乙腈水溶液的体积浓度为35-45%。
6.根据权利要求5所述的基于LC-MS测定生物样本中肉桂酰甘氨酸的方法，其特征在于，所述上清液与乙腈水溶液的体积比为4:1；
所述乙腈水溶液的体积浓度为40%。
7.根据权利要求1所述的基于LC-MS测定生物样本中肉桂酰甘氨酸的方法，其特征在于，液相色谱分析中采用的色谱柱中的C18柱为Agilent RRHD Eclipse Plus C18柱或Titank C18柱，ADME柱为APCELL PAK ADME HR柱，HILIC柱为PC HILIC柱，柱温为25-30℃；流速为0.3-0.4 mL/min，进样量为8-12 μL。
8.根据权利要求7所述的基于LC-MS测定生物样本中肉桂酰甘氨酸的方法，其特征在于，液相色谱分析中采用的色谱柱为APCELL PAK ADME HR柱，柱温为25℃；流速为0.35 mL/min，进样量为10 μL；流动相A为含0.05%甲酸的乙腈，流动相B为含0.1 %甲酸的水。
9.根据权利要求1所述的基于LC-MS测定生物样本中肉桂酰甘氨酸的方法，其特征在于，质谱分析中，采用负离子电喷雾离子化的多离子反应监测模式，气帘气：30 -35 kPa，喷雾电压：3700-3900 V，去溶剂温度：550-650 ℃，GS1:25-35 kPa，GS2:70-80 kPa。
10.根据权利要求9所述的基于LC-MS测定生物样本中肉桂酰甘氨酸的方法，其特征在于，质谱分析中，采用负离子电喷雾离子化的多离子反应监测模式，气帘气：30 kPa，喷雾电压：3800 V，去溶剂温度：600℃，GS1:30 kPa，GS2:77 kPa；采用的离子对为103/137离子对。
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