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CN112611814B - 一种干血片中1,5-脱水葡萄糖醇的测定方法 - Google Patents

一种干血片中1,5-脱水葡萄糖醇的测定方法 Download PDF

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CN112611814B CN202011365068.1A CN202011365068A CN112611814B CN 112611814 B CN112611814 B CN 112611814B CN 202011365068 A CN202011365068 A CN 202011365068A CN 112611814 B CN112611814 B CN 112611814B
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Abstract

本发明涉及一种测定干血片(DBS)中1,5‑脱水葡萄糖醇的方法，所述方法包括如下步骤：干血片用乙腈溶解，溶解后的上清液经固相萃取前处理，得到净化的样品洗脱溶液，然后用液相色谱‑串联质谱(LC‑MS/MS)分析，采用MRM扫描方式，对待测物进行定性定量，实现对干血片中1,5‑脱水葡萄糖醇浓度的测定。干血片经固相萃取净化，可以去除血液中基质的干扰，提高1,5‑脱水葡萄糖醇的灵敏度。干血片具有制备简单，对患者要求低、取样量少、无创伤性等优点。该方法具有操作简单、分析时间短、灵敏度高、特异性强、精密度和准确度良好、稳定性好等优点。本发明方法可用于临床上糖尿病患者的快速筛查。

Description

一种干血片中1,5-脱水葡萄糖醇的测定方法
技术领域
本发明属于医学检验分析技术领域，具体地说是一种检测干血片中1,5-脱水葡萄糖醇的液相色谱-串联质谱的检测方法。
技术背景
1,5-脱水葡萄糖醇(1,5-AG)，又称1,5-脱水山梨糖醇，是呋喃葡萄糖的C1-脱氧形式，以游离形式广泛分布于全身各组织器官。1,5-脱水葡萄糖醇主要来源于食物，通过肾脏中特定的转运蛋白SGLT4重吸收，但重吸收过程会被葡萄糖竞争性抑制。1,5-AG的性质比较稳定，不参与能量代谢，且人体对1,5-AG的摄取和排泄具有自动调节能力，处于动态平衡状态，故其在血液中的浓度十分稳定。健康状态下，体内各组织间1,5-AG水平相对稳定。当血糖水平超过肾糖阈时，1,5-AG的重吸收减少，导致1,5-AG从尿液中排出，此时血液1,5-AG水平明显减少。因此，1,5-AG可作为糖尿病(DM)诊断的指标之一。目前在临床中被广泛应用的血糖控制指标有糖化血红蛋白(HbA1C)、果糖胺(FA)、毛细血管葡萄糖监测(自我监测血糖，SMBG)和持续血糖监测(CGMS)。但这些指标中缺少短期的血糖监测指标，1,5-AG则弥补了血糖监测指标的不足，它可作为近期(3-7d)血糖控制监测的指标。临床检测血液中1,5-AG，对于治疗糖尿病患者具有重要意义。
目前检测1,5-AG的方法有酶法、液相色谱法、气相色谱串联质谱法和液相色谱串联质谱法。酶法使用的试剂价格昂贵，且易受葡萄糖等内源性物质的干扰。采用液相色谱法和气相色谱串联质谱法测定，样品需要进行衍生化处理。液相色谱-串联质谱应用范围极广，灵敏度高、专属性强、能提供相对分子质量和结构信息，且在较高的准确度和精密度的前提下，做到高通量、定量时间短。但文献中报道的前处理方法均是在血清或唾液中加入甲醇或乙腈溶液提取1,5-AG，然后用液相色谱-串联质谱法测定，采用特殊的氨基(NH2)色谱柱进行分析。唾液样本采集前至少30分钟刷牙或漱口，对患者的要求较高。NH2色谱柱成本高、耐用性差，且分析时间长，不利于高通量筛查糖尿病患者。
发明内容
本发明的目的是提供一种对干血片中1,5-脱水葡萄糖醇的测定方法。干血片用乙腈溶解，然后经固相萃取前处理，得到净化的样品洗脱溶液，同时用选择性高、耐用性好的HSS T3色谱柱进行分析，以实现简单、高效、可行的前处理过程和液相色谱-串联质谱的高灵敏度、高通量检测。
本发明的技术方案是一种对干血片中1,5-脱水葡萄糖醇的测定方法，所述方法包括以下步骤：干血片用乙腈溶解，溶解后的上清液经固相萃取前处理，得到净化的样品洗脱溶液，然后用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)分析，采用MRM扫描方式，对待测物进行定性定量，实现对干血片中1,5-脱水葡萄糖醇浓度的测定。
本发明的技术方案是：
1)血液样品配制：取直径为2.5mm～3.5mm的干血片，加入浓度为0.5μg/mL～5μg/mL的13C-1,5-脱水葡萄糖醇的乙腈溶液50μL～500μL，涡旋震荡3min，于10℃条件下15000g离心5min，上清液即为血液样品溶液；
2)校准工作液配制：取90μL空白基质，加入10μL浓度为10μg/mL～1000μg/mL的1,5-脱水葡萄糖醇乙腈储备液，涡旋混匀，制备成直径约10mm的干血片；
3)校准曲线配制：取直径为2.5mm～3.5mm的校准工作液干血片，加入含有13C-1，5-脱水葡萄糖醇的乙腈溶液100μL，涡旋震荡3min，于10℃条件下15000g离心5min，上清液即为校准曲线溶液；
4)固相萃取柱：固相萃取柱装填有以硅胶为基质的含有氨基或氰基的亲和材料，优选地，所述固相萃取柱是以硅胶为基质的氨丙基萃取柱，更优选地，所述固相萃取柱是Cleanert@NH2，规格为100mg/1mL；
5)固相萃取分离：固相萃取柱先用体积比有机溶剂-水＝80：20～5：95第一混合液进行活化；再加入有机溶剂平衡；血液样品溶液上样后，用有机溶剂淋洗，最后用有机溶剂：水＝80：20～10：90第二混合液洗脱，收集全部的洗脱馏分。所述的第一混合液、第二混合液中的有机溶剂是相对应的，所述的有机溶剂为乙腈、异丙醇、乙醇、丙酮中的一种或几种。
6)高效液相色谱条件：
色谱柱：HSS T32.5μm 2.1μm×100mm；流动相流速0.3mL/min；梯度洗脱条件：0.00-0.50min，流动相B体积分数10％-30％；0.50-0.70min，流动相B体积分数30％-70％；0.70-0.80min，流动相B体积分数70％-90％；0.80-1.30min，流动相B体积分数10％；1.31-2.30min，流动相B体积分数10％；流动相A为水，流动相B为乙腈；柱温40℃；进样量：1μL；
7)质谱条件：
离子化模式：ESI-；喷雾电压：-4.5KV；脱溶剂气温度：450℃；雾化气：60psi；辅助雾化气：60psi；气帘气：30psi；扫描方式：多反应监测(MRM)。
8)将收集的馏分在高效液相色谱质谱联用仪上进样分析，记录色谱图和质谱图；并在色谱图中对1,5-脱水葡萄糖醇及其内标的特征性二级碎片离子进行提取定量。
上述干血片中1,5-脱水葡萄糖醇的测定方法，测得1,5-脱水葡萄糖醇的检测限为0.1μg/mL；1,5-脱水葡萄糖醇的RSD为3.5％。
本发明的有益效果：
(1)干血片制备简单，取样量少、无创伤性、对患者要求低，有利于临床样本的采集。
(2)固相萃取专属性强，可去除生物基质干扰，提高灵敏度。
(3)本发明提供的测定方法，操作简单可靠，分析时间短，只有2.3min，有利于临床样本实现高通量筛选糖尿病患者。
附图说明
图1为实施例1前处理方法一时干血片中1,5-脱水葡萄糖醇的MRM色谱图。
图2为实施例1前处理方法二时干血片中1,5-脱水葡萄糖醇的MRM色谱图。
图3为实施例2色谱条件为a时1,5-脱水葡萄糖醇的MRM色谱图。
图4为实施例2色谱条件为b时1,5-脱水葡萄糖醇的MRM色谱图。
图5为实施例2色谱条件为c时1,5-脱水葡萄糖醇的MRM色谱图。
图6为实施例2色谱条件为d时1,5-脱水葡萄糖醇的MRM色谱图。
图7为实施例3不同类型固相萃取柱对比的1,5-脱水葡萄糖醇的MRM色谱图。
图8为同一来源的干血片和血清中1,5-脱水葡萄糖醇的Passing-Bablok回归曲线。
具体实施方式
下面结合实例，对本发明做进一步说明，实例仅限于说明本发明，而非对本发明的限定。
实施例1
干血片中1,5-脱水葡萄糖醇的前处理方法优化：
1.材料与试剂
色谱柱：(HSS T3，2.5μm 2.1μm×100mm)(美国沃特世公司)
1,5-脱水葡萄糖醇标准品和13C-1,5-脱水葡萄糖醇购自加拿大TRC公司；甲醇、乙腈(色谱纯)；Cleanert@NH2(规格100mg/1mL)固相萃取柱购自天津博纳艾杰尔科技有限公司；超纯水：Mili-Q超纯水机制备。
2.仪器和设备
高效液相色谱-串联质谱仪，配有电喷雾(ESI)电离源(4500MD，美国AB公司)，液相色谱分离模式为亲水作用反相色谱分离，检测器为三重四极杆串联质谱；万分之一电子分析天平。
3.干血片中1,5-脱水葡萄糖醇的前处理方法：
1)方法一：取直径为3.0mm的干血片，加入100μL乙腈，涡旋震荡3min，于10℃条件下15000g离心5min，上清液即为样品溶液。
2)方法二：取直径为3.0mm的干血片，加入100μL乙腈，涡旋震荡3min，于10℃条件下15000g离心5min，取上清液进行固相萃取，固相萃取柱为Cleanert@NH2，规格为100mg/1mL；固相萃取过程如下：300μL 10％乙腈水活化，300μL乙腈平衡，80μL上清液上样，300μL乙腈淋洗，300μL 10％乙腈水洗脱，收集全部的洗脱馏分进行测定。
4.样品的分析
将上述2种方法所得的样品溶液，采用亲水作用反向色谱对待测组分进行分离，三重四极杆串联质谱检测，得到样品谱图，检测1,5-AG负离子：高效液相色谱条件和质谱条件如下：
i.高效液相色谱条件
色谱柱：HSS T32.5μm 2.1μm×100mm；流动相：水(A)-乙腈(B)＝85:15，等度洗脱；柱温40℃，进样体积：1μL。
ii.质谱条件
离子化模式：ESI-；喷雾电压：-4.5KV；脱溶剂气温度：450℃；雾化气(GAS 1)：60psi；辅助雾化气(GAS 2)：60psi；气帘气：30psi；扫描方式：多反应监测(MRM)1,5-脱水葡萄糖醇的定性定量离子对、驻留时间碰撞能量等见表1。
表1 1,5-AG的质谱参数
Figure BDA0002805163580000041
5.结果显示，方法一样品中有干扰峰会影响1,5-脱水葡萄糖醇的测定；方法二样品中1,5-脱水葡萄糖醇无干扰峰，响应明显提高。说明固相萃取过程能够去除生物基质中的干扰，提高灵敏度(参见附图1和2)。
实施例2
1,5-脱水葡萄糖醇色谱条件的优化：
1.材料与试剂
色谱柱：(KINETEX EVO C18，2.6μm 2.1μm×50mm)(美国菲罗门公司)、(HSS T3，2.5μm 2.1μm×100mm)(美国沃特世公司)
1,5-脱水葡萄糖醇标准品和13C-1,5-脱水葡萄糖醇购自加拿大TRC公司；甲酸、甲酸铵、甲醇、乙腈(色谱纯)，超纯水：Mili-Q超纯水机制备。
2.仪器和设备
高效液相色谱-串联质谱仪，配有电喷雾(ESI)电离源(4500MD，美国AB公司)，液相色谱分离模式为亲水作用反相色谱分离，检测器为三重四极杆串联质谱；万分之一电子分析天平。
3.工作液配制
取1,5-脱水葡萄糖醇储备液(5mg/mL)10μL，加入490μL水，涡旋混匀，即得。
4.样品分析
将上述工作液采用亲水作用反向色谱对待测组分进行分离，三重四极杆串联质谱检测，得到样品谱图，检测1,5-AG负离子。高效液相色谱条件和质谱条件如下：
i、高效液相色谱条件优化
a.色谱柱：HSS T32.5μm 2.1μm×100mm；流动相：2mmol/L甲酸铵-乙腈＝85:15，等度洗脱；柱温40℃，进样体积：1μL。
b.色谱柱：HSS T32.5μm 2.1μm×100mm；流动相：0.1％甲酸-乙腈＝85:15，等度洗脱；柱温40℃，进样体积：1μL。
c.色谱柱：KINETEX EVO C18，2.6μm 2.1μm×50mm；流动相：水(A)-乙腈(B)＝85:15，等度洗脱；柱温40℃，进样体积：1μL。
d.色谱柱：HSS T32.5μm 2.1μm×100mm；流动相：水(A)、乙腈(B)，梯度洗脱见表2；柱温40℃，进样体积：1μL。
表2高效液相色谱梯度条件
Figure BDA0002805163580000051
Figure BDA0002805163580000061
ii、质谱条件
离子化模式：ESI-；喷雾电压：-4.5KV；脱溶剂气温度：450℃；雾化气(GAS 1)：60psi；辅助雾化气(GAS 2)：60psi；气帘气：30psi；扫描方式：多反应监测(MRM)
1,5-脱水葡萄糖醇的定性定量离子对、驻留时间碰撞能量等见表1。
5.结果分析
色谱条件为a时，1,5-脱水葡萄糖醇的色谱峰分叉(参见附图3)；色谱条件为b时，1,5-脱水葡萄糖醇的色谱峰形拖尾(参见附图4)；色谱条件为c时，1,5-脱水葡萄糖醇的色谱峰保留较弱(参见附图5)；色谱条件为d时，1,5-脱水葡萄糖醇的色谱峰形对称，保留良好(参见附图6)。因此，采用色谱条件d测定1,5-脱水葡萄糖醇。
实施例3
不同类型固相萃取柱对比：
1、材料与试剂
色谱柱：(HSS T3，2.5μm 2.1μm×100mm)(美国沃特世公司)
1,5-脱水葡萄糖醇标准品和13C-1,5-脱水葡萄糖醇购自加拿大TRC公司；甲醇、乙腈(色谱纯)；Cleanert@NH2(规格100mg/1mL)、Cleanert@CN(规格100mg/1mL)和Cleanert@Silica(规格100mg/1mL)固相萃取柱均购自天津博纳艾杰尔科技有限公司；超纯水：Mili-Q超纯水机制备。
2、仪器和设备
高效液相色谱-串联质谱仪，配有电喷雾(ESI)电离源(4500MD，美国AB公司)，液相色谱分离模式为亲水作用反相色谱分离，检测器为三重四极杆串联质谱；万分之一电子分析天平。
3、不同类型固相萃取柱对比：
1)方法一：取直径为3.0mm的干血片，加入100μL乙腈，涡旋震荡3min，于10℃条件下15000g离心5min，取上清液进行固相萃取，固相萃取柱为Cleanert@Silica，规格为100mg/1mL；固相萃取过程如下：300μL 10％乙腈水活化，300μL乙腈平衡，80μL上清液上样，300μL乙腈淋洗，300μL 10％乙腈水洗脱，收集全部的洗脱馏分进行测定。
2)方法二：取直径为3.0mm的干血片，加入100μL乙腈，涡旋震荡3min，于10℃条件下15000g离心5min，取上清液进行固相萃取，固相萃取柱为Cleanert@CN，规格为100mg/1mL；固相萃取过程如下：300μL 10％乙腈水活化，300μL乙腈平衡，80μL上清液上样，300μL乙腈淋洗，300μL 10％乙腈水洗脱，收集全部的洗脱馏分进行测定。
3)方法三：取直径为3.0mm的干血片，加入100μL乙腈，涡旋震荡3min，于10℃条件下15000g离心5min，取上清液进行固相萃取，固相萃取柱为Cleanert@NH2，规格为100mg/1mL；固相萃取过程如下：300μL10％乙腈水活化，300μL乙腈平衡，80μL上清液上样，300μL乙腈淋洗，300μL 10％乙腈水洗脱，收集全部的洗脱馏分进行测定。
4、样品分析
将上述3种方法所得的样品溶液，采用亲水作用反向色谱对待测组分进行分离，三重四极杆串联质谱检测，得到样品谱图，检测1,5-AG负离子：高效液相色谱条件和质谱条件如下：
i.高效液相色谱条件
色谱柱：HSS T32.5μm 2.1μm×100mm；流动相：水(A)-乙腈(B)，梯度洗脱见表2；柱温40℃，进样体积：1μL。
ii.质谱条件
离子化模式：ESI-；喷雾电压：-4.5KV；脱溶剂气温度：450℃；雾化气(GAS 1)：60psi；辅助雾化气(GAS 2)：60psi；气帘气：30psi；扫描方式：多反应监测(MRM)1,5-脱水葡萄糖醇的定性定量离子对、驻留时间碰撞能量等见表1。
5、结果分析
对比三种不同类型的固相萃取柱，结果显示，采用Cleanert@NH2固相萃取柱1,5-脱水葡萄糖醇响应最高(色谱峰高1.3*105)，其次为Cleanert@Scilica(1,5-脱水葡萄糖醇色谱峰高4.6*104)，Cleanert@CN最低((1,5-脱水葡萄糖醇色谱峰高2.2*104)(见图7)。因此，选择Cleanert@NH2固相萃取柱。
实施例4
干血片中1,5-脱水葡萄糖醇的方法学验证：
1.材料与试剂
色谱柱：(HSS T3，2.5μm 2.1μm×100mm)(美国沃特世公司)
1,5-脱水葡萄糖醇标准品和13C-1,5-脱水葡萄糖醇购自加拿大TRC公司；甲醇、乙腈(色谱纯)；Cleanert@NH2(规格100mg/1mL)固相萃取柱购自天津博纳艾杰尔科技有限公司；超纯水：Mili-Q超纯水机制备。
2.仪器和设备
高效液相色谱-串联质谱仪，配有电喷雾(ESI)电离源(4500MD，美国AB公司)，液相色谱分离模式为亲水作用反相色谱分离，检测器为三重四极杆串联质谱；万分之一电子分析天平。
3.高效液相色谱-串联质谱法检测1,5-脱水葡萄糖醇的方法，步骤为：
1)校准基础工作液的配制：准确配制1,5-脱水葡萄糖醇标准品储备液(5mg/mL)，用乙腈稀释得到浓度为1000μg/mL，分别用乙腈逐级稀释到500μg/mL、200μg/mL、100μg/mL、50μg/mL、20μg/mL和10μg/mL六个浓度水平的1,5-脱水葡萄糖醇校准溶液，备用；
2)内标校准溶液的配制：准确配制13C-1,5-脱水葡萄糖醇标准储备液(1mg/mL)，用乙腈稀释配制成浓度为1.5μg/mL，备用；
3)校准曲线的配制：①分别取步骤1)的1000μg/mL、500μg/mL、200μg/mL、100μg/mL、50μg/mL、20μg/mL和10μg/mL不同浓度校准基础工作液各10μL，加入不含1,5-脱水葡萄糖醇的空白基质溶液90μL，配成校准曲线各浓度点，制备成直径约10mm的干血片，得不同浓度的校准工作液；②取直径为3.0mm的校准工作液干血片，加入浓度为1.5μg/mL的13C-1,5-脱水葡萄糖醇的乙腈溶液100μL，涡旋震荡3min，于10℃条件下15000g离心5min，上清液即为校准曲线溶液；
4)血液样品配制：取直径为3.0mm的样本干血片，加入浓度为1.5μg/mL的13C-1,5-脱水葡萄糖醇的乙腈溶液100μL，涡旋震荡3min，于10℃条件下15000g离心5min，上清液即为血液样品溶液；
5)固相萃取分离：固相萃取柱为Cleanert@NH2，规格为100mg/1mL；固相萃取柱先用300μL 10％乙腈水活化，300μL乙腈平衡，80μL上清液上样，300μL乙腈淋洗，300μL 10％乙腈水洗脱，收集全部的洗脱馏分进行测定；
6)样品的分析：将上述步骤获得的校准曲线和样品溶液上样检测，采用亲水作用反向色谱对待测组分进行分离，三重四极杆串联质谱检测，得到样品谱图，检测1,5-AG负离子；高效液相色谱条件和质谱条件为：
i)高效液相色谱条件
色谱柱：HSS T32.5μm 2.1μm×100mm；流动相：水(A)、乙腈(B)，梯度洗脱见表2；柱温40℃，进样体积：1μL。
ii)质谱条件
离子化模式：ESI-；喷雾电压：-4.5KV；脱溶剂气温度：450℃；雾化气(GAS 1)：60psi；辅助雾化气(GAS 2)：60psi；气帘气：30psi；扫描方式：多反应监测(MRM)蛋氨酸的定性定量离子对、驻留时间碰撞能量等见表3。
表3 1,5-AG的质谱参数
Figure BDA0002805163580000091
注：*为定量离子
4.定量计算结果分析：将校准曲线色谱图中1,5-AG离子色谱峰的峰面积与13C-1,5-AG离子色谱峰的峰面积的比值作为纵坐标，与其相对应的浓度做线性回归方程(如表4所示)，内标法计算血清样品中1,5-AG的浓度，得到血清样品1,5-AG的浓度。
表4 1,5-脱水葡萄糖醇的线性范围
Figure BDA0002805163580000092
5.准确度和精密度
具体操作如下：
取低、中、高待测物质控校准溶液10μL，加入到90μL的人全血中，配成加标血液，制备成干血片。按照实施例3“第3项步骤4)和5)”进行样品处理。求算加标血液样品中待测物各自峰面积As分别和内标峰面积Ai的比值f(f＝As/Ai)，并代入当天随行标曲计算样品浓度C加标。每批每个浓度平行共做6份，连续三天，每天一批。
取甲醇-水(1:1，v/v)10μL，加入到90μL的人全血中，配置成空白血液样品，制备成干血片。按照“第3项步骤4)和5)”进行样品处理。求算空白血液样品中待测物各自峰面积As分别和内标峰面积Ai的比值f(f＝As/Ai)，并代入当天随行标曲计算样品浓度C0。每批平行共做6份，连续三天，每天一批。
最后计算批内、批间精密度(绝对值小于15％为合格)和准确度(85％～115％为合格)。具体结果见表5。
表5 1,5-脱水葡萄糖醇(1,5-AG)的准确度
Figure BDA0002805163580000101
由结果可见，血液中待测物浓度的准确度均在85％～115％之间，血液加标低、中、高浓度批内、批间精密度CV<15％，说明血液样品分析的准确度、精密度良好。
6.实际样品检测
选取30份不同来源的干血片，另取相对应患者的血清制作成干血片。二者均按照实施例3“第3项下步骤4)和5)”进行样品配制，并进行样品分析。将同一来源的干血片和血清中1,5-脱水葡萄糖醇进行Passing-Bablok回归，回归方程为y＝0.0363+0.993x，截距的95％CI为-0.1558～0.1471，斜率的95％CI为0.9782～1.0087，结果见附图8。由结果可见，同一来源的干血片和血清中1,5-脱水葡萄糖醇的浓度无明显差异，检测结果均在线性范围内，该方法可用于临床测定干血片中1,5-脱水葡萄糖醇。
检测同一血清样品中定量分析1,5-AG的浓度为14.6μg/mL、15.0μg/mL、14.0μg/mL，血清样品1,5-脱水葡萄糖醇的RSD为3.5％，说明样品目标化合物稳定性好。
以上描述了本发明优选实施方式，然其并非用以限定本发明。本领域技术人员对在此公开的实施方案可进行并不偏离本发明范畴和精神的改进和变化。

Claims (6)

1.一种干血片中1,5-脱水葡萄糖醇的测定方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：干血片用乙腈溶解，溶解后的上清液经过固相萃取柱处理，得到净化的样品洗脱溶液，然后用液相色谱-串联质谱分析，采用MRM扫描方式，对待测物进行定性定量，实现对干血片中1,5-脱水葡萄糖醇浓度的测定；
其中，所述固相萃取柱是Cleanert@NH2，规格为100mg/1mL；固相萃取过程如下：300µL10%乙腈水活化，300µL乙腈平衡，80µL上清液上样，300µL 乙腈淋洗，300µL 10%乙腈水洗脱，收集全部的洗脱馏分进行测定；
所述液相色谱条件：
色谱柱：Waters，Xselect HSS T3，规格为2.1×100mm，粒径为2.5µm；流动相流速0.3mL/min；流动相为流动相A和流动相B，所述流动相A为水，所述流动相B为乙腈；梯度洗脱条件：0.00-0.50min，流动相B体积分数10%-30%；0.50-0.70min，流动相B体积分数30%-70%；0.70-0.80min，流动相B体积分数70%-90%；0.80-1.30min，流动相B体积分数10%；1.31-2.30min，流动相B体积分数10%；柱温40℃；进样量：1µL；
所述质谱分析条件：
离子化模式：ESI-；喷雾电压：-4.5KV；脱溶剂气温度：450℃；雾化气：60psi；辅助雾化气：60psi；气帘气：30psi；扫描方式：多反应监测MRM。
2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，取直径相同的干血片，加入含有13C-1，5-脱水葡萄糖醇的乙腈溶液，涡旋溶解经离心得到血液样品溶液。
3.根据权利要求2所述的测定方法，其特征在于，所取干血片的直径为2.5mm~3.5mm。
4.根据权利要求2所述的测定方法，其特征在于，13C-1,5-脱水葡萄糖醇的浓度为0.5µg/mL~5µg/mL；含有13C-1，5-脱水葡萄糖醇的乙腈溶液体积为50µL~500µL。
5.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，检测到的1,5-脱水葡萄糖醇的峰面积与其相应的碳代内标峰面积的比值作为Response对其浓度做线性回归方程。
6.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，1,5-脱水葡萄糖醇的检测限为0.1µg/mL； 1,5-脱水葡萄糖醇的检测浓度范围为1-100µg/mL。
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